KR102302931B1 - 인체 갑상선조직에서 단일세포 분리기법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단일 세포 유전체분석(signle cell genomics), 단일 세포 대사체분석(single cell metabolomics) 및 오가노이드(organoid) 제조를 포함하는 새로운 인체 갑상선 연구에 사용할 수 있는 90%이상의 생존율을 갖는 사람 갑상선 세포 및 그 분리 방법에 관한 것이다.

Description

인체 갑상선조직에서 단일세포 분리기법 {The protocol for single cell isolation from human thyroid}

본 발명은 인체 갑상선 조직에서 유래하여 세포 생존율이 90% 이상인 단일세포, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것이다.

갑상선은 앞부분 후두 바로 아래에 위치하여 대사와 성장에 필요한 호르몬을 분비하는 내분비선으로서, 수많은 작은 주머니로 이루어진 여포(follicle)세포로 구성되어 있고 그 바깥을 얇은 막이 싸고 있으며, 막 바깥에는 모세혈관이 그물처럼 덮고 있다. 모세혈관은 막을 통해서 세포에 언제나 충분한 혈장(혈액의 액체 성분)을 일정하게 공급해주며, 여포세포 속에 갑상선호르몬이 티로글로불린이라는 단백질에 결합된 상태로 저장되어 있다.

여포세포에서 만들어지는 갑상선호르몬은 서로 밀접한 관계가 있는 두 화학물질인 티록신(L-thyroxine/T4)과 트리요오드티로닌(L-triiodothyronine/T3)으로 이루어지며, 이 갑상선호르몬을 만드는 데 필요한 원료는 요오드와 티로신이라고 하는 아미노산으로 보통 음식물에 함유되어 있다. 요오드는 능동적으로 체액에서 갑상선여포 속으로 들어가게 되며, 여포세포는 이 요오드를 저장 농축시켜 티로글로불린과 함께 콜로이드 속으로 분비한다. 그 뒤 티로글로불린 분자에 붙어 있는 티로신에 요오드 원자를 차례대로 결합시켜 갑상선호르몬을 만드는데, 이 과정은 콜로이드에 인접해 있는 여포세포의 가장자리에서 이루어진다. 이 요오드화물 2개가 하나로 응축되어 티록신이나 트리요오드티로닌이 만들어지며 이것들은 콜로이드 속에 저장된다.

이러한 갑상선 세포는 갑상선호르몬의 합성에 필요한 원료를 콜로이드로 운반하는 것 말고도 티록신과 트리요오드티로닌을 티로글로불린에서 떼내어 혈액으로 분비하는 역할도 한다. 티로글로불린에서 떨어진 티록신과 트리요오드티로닌은 크기가 작으므로 세포벽을 통과하여 여포 주위의 모세혈관 속으로 들어가 혈류를 따라 온몸에 퍼지게 된다.

또한 이 갑상선호르몬이 성인에게 가장 중요하게 작용하는 것은 세포의 산소 소비, 즉 조직의 대사속도를 조절하는 것이다. 이 밖에도 혈중 콜레스테롤치(値)를 내리는 기능이 있는데, 이러한 성질을 이용하여 콜레스테롤치를 낮추기 위해 갑상선호르몬을 치료제로 사용하기도 한다. 또, 이 호르몬은 아이들의 정상적인 성장과 발달에 필요하며 부족하게 되면 왜소증(난쟁이)이 나타나거나 정신박약이 올 수도 있다.

갑상선 기능 검사방법은 갑상선호르몬이 대사(代謝)에 미치는 영향만을 알아보는 일반적인 갑상선기능검사(기초대사율)와, 호르몬의 합성, 분비 및 운반 등의 특정한 한 가지 측면만 검사하는 특수한 갑상선기능검사로 나눌 수 있으며, 이러한 갑상선 조직세포의 채취과정에서 중요한 것은 가능한 한 신속하게 시술하여야 하며, 검사시 주사바늘의 팁(첨단부)의 움직임이 적어야 하고, 멸균 조작이 이루어져야 하는 조건이 필수적으로 수반되어야 한다

조직 특이적 오가노이드 배양 기술은 현재 줄기세포 연구에서 가장 각광을 받고 있는 최첨단 분야로서 난치성 질환 모델, 환자 맞춤형 약물 스크리닝 플랫폼, 신약 개발을 위한 체외 모델 등 재생의학 및 신약 연구 분야에서 활용성이 무한하게 확장될 수 있다.

줄기세포나 장기세포에서 분리한 세포를 배양하거나 재조합해서 만든 생체외 조직체 구조물(미니장기, 오가노이드 등)이 개발되고 있다. 특히 환자의 갑상선 조직으로부터 제조한 생체외 조직체 구조물은 환자를 대신하여 생체외 조직체 구조물에 먼저 시험치료를 시행하고, 그 결과를 바탕으로 개별 환자별로 유용한 치료 효과를 보이는 약물을 선택하는 방식의 맞춤형 정밀치료를 가능하게 하므로 임상적 유용성이 매우 크다고 할 수 있으나, 종래의 생체외 조직체 구조물 제조 방법은 단일세포의 분리과정에서 세포의 생존율이 낮아 제조 성공률이 매우 낮은 문제점이 있었다.

이에 본 발명에서는 인체 갑상선 조직에서 유래하여 세포의 생존율이 90% 이상인 단일세포 분리방법을 수립하여 오가노이드(organoid) 제조와 같은 갑상선 재생의학 및 단일 세포 유전체분석(signle cell genomics) 및 단일 세포 대사체분석(single cell metabolomics)과 같은 난치성 갑상선 기전연구에 활용하고자 하였다.

한국공개특허 제2019-0118702호 한국공개특허 제2019-0143698호

Primary Cell Culture Systems for Human Thyroid Studies, Thyroid. 2016 Aug 1; 26(8): 1131-1140.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인체 갑상선 조직에서 유래하여 세포 생존율이 90% 이상인 단일 세포 추출법을 발견하여본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 분리된 갑상선 조직을 저온 보관액에 담근채 실험실로 이동하는 단계; 2) 배양접시에서 조직을 잘게 자른 후, 이동 용기로 옮기는 단계; 3) 효소반응을 위해 무혈청 배지에 0.1 내지 0.15%의 트립신과 50 내지 400 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액과 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 30분 내지 90분간 반응시키는 단계; 4) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 5) 분리된 세포 덩어리를 1 mL의 10% FBS(우태아혈청)가 혼합된 배지에서 파이펫으로 기계적 소화(mechanical digestion)하는 단계; 6) 70um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하는 단계; 7) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 8) 적혈구 제거 완충액을 반응시키는 단계; 9) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 10) 무혈청 배지로 세척한 후 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 11) 40um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하여 최종 세포를 획득하는 단계;를 포함하는 생존율이 향상된 갑상선 세포 분리 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 분리된 갑상선 조직을 저온 보관액에 담근채 실험실로 이동하는 단계; 2) 배양접시에서 조직을 잘게 자른 후, 이동 용기로 옮기는 단계; 3) 효소반응을 위해 무혈청 배지에 0.1 내지 0.15%의 트립신과 50 내지 400 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액과 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 30분 내지 90분간 반응시키는 단계; 4) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 5) 분리된 세포 덩어리를 1 mL의 10% FBS(우태아혈청)가 혼합된 배지에서 파이펫으로 기계적 소화(mechanical digestion)하는 단계; 6) 70um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하는 단계; 7) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 8) 적혈구 제거 완충액을 반응시키는 단계; 9) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 10) 무혈청 배지로 세척한 후 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 11) 40um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하여 최종 세포를 획득하는 단계;를 포함하는 갑상선 세포 분리 방법에 따라 획득한 생존율이 향상된 갑상선 세포를 제공한다.

또 다른 예로, 본 발명은 생존율이 향상된 분리된 갑상선 세포를 포함하는 갑상선 오가노이드를 제공한다.

본 발명은 생존율이 향상된 분리된 갑상선 세포를 포함하는 갑상선 오가노이드를 포함하는 재생의학용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 생존율이 향상된 분리된 갑상선 세포에 약물을 투여하는 단계; 갑상선 세포의 유전체 또는 대사체를 측정하는 단계;를 포함하는 갑상선 질환 치료 약물 스크리닝방법을 제공한다.

본 발명은 기존의 갑상선 세포 분리방법을 대체하여 개발한 최적화된 효소 반응법을 사용하여 생존율이 향상된 갑상선 세포 분리방법에 대한 것으로서, 분리된 갑상선 세포는 단일 세포의 유전체 및 대사체 분석과 함께 오가노이드 제조를 통한 재생의학 용도 및 신약 개발을 위한 시험에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 기존 primary cell culture 과정으로 인간 갑상선 세포를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 기존 primary culture 방법에서 12시간 incubation을 삭제한 modification 방법 A 과정으로 인간 갑상선 세포를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 기존 primary culture 방법에서 12시간 incubation을 삭제한 modification 방법 B 과정으로 인간 갑상선 세포를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 기존 primary culture 방법에서 12시간 incubation을 삭제한 modification 방법 C 과정으로 인간 갑상선 세포를 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따라 수립된 primary cell culture 방법으로 수행한 생존율이 향상된 인간 정상 갑상선 세포 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따라 수립된 primary cell culture 방법으로 수행한 생존율이 향상된 인간 갑상선 암 조직 세포 분리 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 분리된 갑상선 조직을 저온 보관액에 담근채 실험실로 이동하는 단계; 2) 배양접시에서 조직을 잘게 자른 후, 이동 용기로 옮기는 단계; 3) 효소반응을 위해 무혈청 배지에 0.1 내지 0.15%의 트립신과 50 내지 400 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액과 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 30분 내지 90분간 반응시키는 단계; 4) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 5) 분리된 세포 덩어리를 1 mL의 10% FBS(우태아혈청)가 혼합된 배지에서 파이펫으로 기계적 소화(mechanical digestion)하는 단계; 6) 70um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하는 단계; 7) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 8) 적혈구 제거 완충액을 반응시키는 단계; 9) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 10) 무혈청 배지로 세척한 후 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 11) 40um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하여 최종 세포를 획득하는 단계;를 포함하는 생존율이 향상된 갑상선 세포 분리 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 분리된 갑상선 조직은 포유류 동물에서 분리한 것이고, 바람직하게는 사람, 흰쥐(rat), 생쥐(mouse) 또는 토끼로부터 분리한 것이며, 더욱 바람직하게는 사람으로부터 분리한 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 분리된 갑상선 조직은 갑상선 질환이 발생하거나 정상 갑상선 조직을 포함하는 다양한 갑상선 조직으로부터 분리할 수 있고, 갑상선 정상 조직 혹은 암 조직 모두에서 결과 도출이 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 갑상선 세포는 갑상선 특이적 세포 또는 갑상선 특이적 기능을 수행하는 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포는 시험관내 배지에서 측정가능한 양의 티록신(thryoxine), 트리아이오도티로닌(triiodothyronine) 또는 칼시토닌을 생산하는 세포를 포함한다. 또한, 티록신(thryoxine), 트리아이오도티로닌(triiodothyronine) 또는 칼시토닌을 생산하도록 유전적으로 가공된 세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 저온 보관액은 4℃에 있는 다양한 세포 완충액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 PBS(phosphate buffered solution), HBSS (Hank's balanced salt solution), 식염수 또는 무혈청 배지에서 선택할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 HBSS인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 효소반응은 갑상선 조직 분해에 유용한 다양한 효소를 개별적으로 또는 혼합하여 37℃에서 30 내지 90분간 사용할 수 있고, 바람직하게는 트립신과 콜라게나아제의 혼합 용액을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트립신과 콜라게나아제 타입 4를 사용할 수 있으며, 그 함량에 있어 0.1 내지 0.15%의 트립신과 50 내지 400 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.125% 트립신과 100 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액을 60분간 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 원심분리는 세포의 수거, 분리 또는 세척을 위하여 다양한 방법으로 사용될 수 있고, 바람직하게는 4℃에서 4,000 rpm으로 수행되는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 배지는 이 분야에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지인 DMEM, MEM, F12, Ham's F12 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 RPMI1640인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 세포 스트레이너는 사전에 완충액으로 적신 후 사용하는 것이 바람직하고, 완충액은 100 내지 600 ㎕을 사용하는 것이 바람직하며, 세포를 투여한 후 다시 100 내지 600 ㎕을 사용하여 목적하는 세포를 수거하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 기계적 소화(mechanical digestion)은 파이펫의 왕복운동을 위한 세포의 분리를 위해 사용되는 것으로, 파이펫의 크기가 감소할수록 압력이 증가되어 세포의 분리에 용이하나, 압력의 증가를 위한 세포의 생존율 감소를 함께 고려하여 선택함이 바람직하다. 본 발명에서는 5 mL 파이펫으로 1분간 수행하는 것이 바람직하나, 세포나 조직의 상태를 고려하여 조절할 필요가 있으므로, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 1) 분리된 갑상선 조직을 저온 보관액에 담근채 실험실로 이동하는 단계; 2) 배양접시에서 조직을 잘게 자른 후, 이동 용기로 옮기는 단계; 3) 효소반응을 위해 무혈청 배지에 0.1 내지 0.15%의 트립신과 50 내지 400 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액과 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 30분 내지 90분간 반응시키는 단계; 4) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 5) 분리된 세포 덩어리를 1 mL의 10% FBS(우태아혈청)가 혼합된 배지에서 파이펫으로 기계적 소화(mechanical digestion)하는 단계; 6) 70um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하는 단계; 7) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 8) 적혈구 제거 완충액을 반응시키는 단계; 9) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계; 10) 무혈청 배지로 세척한 후 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및 11) 40um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하여 최종 세포를 획득하는 단계;를 포함하는 갑상선 세포 분리 방법에 따라 획득한 생존율이 향상된 갑상선 세포를 제공한다.

또 다른 예로, 본 발명은 생존율이 향상된 분리된 갑상선 세포를 포함하는 갑상선 오가노이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 오가노이드는 조직의 1차 배양한 세포 또는 전분화능줄기에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다. 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함하는 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(성장인자 등) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다. 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 3차원 배양 또는 메트리겔 등 당해 기술분야에서 널리 활용되는 하이드로겔 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서 갑상선 오가노이드는 본 발명의 당 분야에서 일반적인 방법으로 제조된 갑상선 오가노이드를 의미하는 것이고, 그 형태는 직사각형 블록, 큐브, 구, 회전 타원체, 막대, 원기둥, 사다리꼴, 피라미드형 또는 원환체 형태이거나 실질적으로 이러한 형태일 수 있다. 일면에서 오가노이드는 세포의 유입 또는 배출이 가능할 정도로 큰 공극을 포함하거나 포함하지 않는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 생존율이 향상된 분리된 갑상선 세포를 포함하는 갑상선 오가노이드를 포함하는 재생의학용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 갑상선 오가노이드는 갑상선의 기능을 대체할 수 있는 재생의학 용도로 사용될 수 있다. 특히, 티록신, 트리아이오도티로닌 또는 칼시토닌을 필요로 하는 개체에게 복수의 오가노이드르르 투여하는 것을 포함하는 개체의 치료방법이 추가로 포함된다. 개체는 지적 장애, 왜소증, 허약, 무기력, 추위 민감증, 만월안모(moon face), 골다공증 또는 만성 자가면역 갑상선 기능저하증을 갖는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 재생의학용은 원상태 갑상선에 대해 이점을 제공하는 효과를 의미할 수 있다. 당해 효과는 원상태 갑상선에 대한 손상의 정도에 있어서의 감소 또는 원상태 갑상선 기능에 있어서의 개선, 회복 또는 안정화를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 분리된 갑상선 세포는 유전자를 삽입 또는 제거하거나 갑상선 기능 강화 약물 등을 투여하는 방법 등을 통해 강화된 세포집단을 형성할 수 있고, 이를 통해 생성된 갑상선 오가노이드는 더욱 강화된 갑상선 기능에 있어서의 개선, 회복 또는 안정화 효과를 유발할 수 있다.

또한, 본 발명은 분리된 갑상선 세포에 약물을 투여하는 단계; 갑상선 세포의 유전체 또는 대사체를 측정하는 단계;를 포함하는 갑상선 질환 치료 약물 스크리닝방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 유전체 또는 대사체를 측정하는 방법은 달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 갑상선 질환은 이 분야에 알려진 갑상선에서 발생하는 모든 질환을 포함할 수 있고, 바람직하게는 갑상선 기능 항진증, 갑상선 기능 저하증, 갑상선 염, 그레이브스병(Grave's disease) 또는 갑상선 암인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 약물은 이 분야에 알려진 갑상선 질환을 선택적으로 조절할 수 있는 모든 약물 또는 향후 개발되는 갑상선 질환 치료용 후보약물을 포함할 수 있고, 바람직하게는 갑상선 기능 조절제, 항염제 또는 항암제인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> 기존 primary culture 방법으로 분리한 세포의 생존율

A. HBSS와 0.25% trypsin solution에 12시간 이상 incubation

B. 2일째, 1% trypsin (Life Technologies) 과 300 unit/ml collagenase type 4 (Worthington Biochemical) solution 에 90분 동안 37℃ incubation

C. Nylon mesh (100 um; FALCON)에 조직이 녹혀진 용액을 2번 이상 거름.

D. 1000 g로 5분동안 incubation하고 supernatant제거

E. 1 mL red blood cell lysing buffer (Sigma) 를 2분간 incubation

F. HBSS에 2번 wash후 1000g로 5분간 centrifuge함. (PMID: 27296473, Primary Cell Culture Systems for Human Thyroid Studies, Thyroid. 2016 Aug 1; 26(8): 1131-1140.)

상기 primary culture 방법으로 인간 갑상선 세포주를 분리한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포의 생존율은 43.1%로 나타났다.

<실시예 2> 기존 primary culture 방법에서 12시간 incubation을 삭제한 modification 방법 A.

A. 1% trypsin (Life Technologies) 과 300 unit/ml collagenase 4 (Worthington Biochemical) solution 에 90분 동안 37℃ incubation

C. Nylon mesh (100 um; FALCON)에 조직이 녹혀진 용액을 2번 이상 거름.

D. 1000 g로 5분동안 incubation하고 supernatant제거

E. 1 mL red blood cell lysing buffer (Sigma) 를 2분간 incubation

F. HBSS에 2번 wash후 1000g로 5분간 centrifuge함.

상기 primary culture 방법으로 인간 갑상선 세포주를 분리한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포의 생존율은 44.4%로 나타났다.

<실시예 3> 기존 primary culture 방법에서 12시간 incubation을 삭제한 modification 방법 B.

A. 1% trypsin (Life Technologies) 과 100 unit/ml collagenase 4 (Worthington Biochemical) solution 에 90분 동안 37℃ incubation

C. Nylon mesh (100 um; FALCON)에 조직이 녹혀진 용액을 2번 이상 거름.

D. 1000 g로 5분동안 incubation하고 supernatant제거

E. 1 mL red blood cell lysing buffer (Sigma) 를 2분간 incubation

F. HBSS에 2번 wash후 1000g로 5분간 centrifuge함.

상기 primary culture 방법으로 인간 갑상선 세포주를 분리한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포의 생존율은 56.2%로 나타났다.

<실시예 4> 기존 primary culture 방법에서 12시간 incubation을 삭제한 modification 방법 C.

A. 1% trypsin (Life Technologies) 과 100 unit/ml collagenase 4 (Worthington Biochemical) solution 에 30분 동안 37℃ incubation

C. Nylon mesh (100 um; FALCON)에 조직이 녹혀진 용액을 2번 이상 거름.

D. 1000 g로 5분동안 incubation하고 supernatant제거

E. 1 mL red blood cell lysing buffer (Sigma) 를 2분간 incubation

F. HBSS에 2번 wash후 1000g로 5분간 centrifuge함.

상기 primary culture 방법으로 인간 갑상선 세포주를 분리한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포의 생존율은 64.3%로 나타났다.

<실시예 5> 본 발명에서 수립된 primary culture 방법으로 분리한 세포의 생존율

1) 수술방에서 human thyroid fresh tissue를 4℃ Hanks’ balanced salt solution (Life Technologies) 에 담근채 실험실로 이동.

2) 100파이 패트리디쉬(Petridish)에 500ul의 HBSS와 조직을 놓고서 5분동안 최대한으로 가장 잘게 자른 (mincing)후, 15mL 플라스틱 튜브(Cornical tube)에 옮김.

3) Enzyme digestion을 RPMI media에 0.125% Trypsin (GIbcoBRL Cat.No 17073-016) + 100 unit/ml Collagenase type 4 (Worthington Code: CLS-4)를 mix한 solution에 담근 후 37℃에 rotator incubator를 활용하여, 60분 시행함.

4) 4,000 rpm에서 5분 4도씨에서 원심분리 후 supernat 제거.

5) 1mL의 10% FBS가 mix 된 RPMI에 넣어서 mechanical digestion을 파이펫을 활용하여 1분간 시행.

6) Cell strainer (70um)위에 RPMI 미디어를 뿌리면서 적신 후, 그 위에 sample을 로딩 한 후 다시 RPMI 600uL를 뿌림.

7) 4,000 rpm에서 5분 4℃에서 원심분리 후 supernat 제거.

8) Red blood cell lysing buffer를 추가로 넣고 10분간 4℃에서 incubation

9) 4,000 rpm에서 5분 4℃에서 원심분리 후 supernat 제거.

10) RPMI1640(FBS-) wash 하고 4000rpm에서 5분 4℃ centrifuge하고 supernat 제거

11) Cell strainer (40um) 에 RPMI1640(FBS-) 100 ul 먼저 적시고, 그 위에 샘플 로딩한 뒤, 다시 RPMI1640(FBS-) 100 ul 뿌려서 suspension

상기 primary culture 방법으로 인간 갑상선 세포를 별도의 조직으로 2회 분리한 결과, 도 5 (정상 갑상선) 및 도 6 (갑상선암조직) 에 나타낸 바와 같이, 갑상선 세포의 생존율은 각각 90.8%와 95.8%로 나타나 기존의 primary culture 방법으로 분리한 갑상선 세포와 비교하여 현저한 세포 생존율 상승 효과가 나타남을 확인하였다.

Claims (13)

1) 분리된 갑상선 조직을 저온 보관액에 담근채 실험실로 이동하는 단계;
2) 배양접시에서 조직을 잘게 자른 후, 이동 용기로 옮기는 단계;
3) 효소반응을 위해 무혈청 배지에 0.1 내지 0.15%의 트립신과 50 내지 400 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액과 37℃ 쉐이킹 인큐베이터에서 30분 내지 90분간 반응시키는 단계;
4) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계;
5) 분리된 세포 덩어리를 1 mL의 10% FBS(우태아혈청)가 혼합된 배지에서 파이펫으로 기계적 소화(mechanical digestion)하는 단계;
6) 70um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하는 단계;
7) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계;
8) 적혈구 제거 완충액을 반응시키는 단계;
9) 원심분리 후 상층액을 제거하는 단계;
10) 무혈청 배지로 세척한 후 원심분리하여 상층액을 제거하는 단계; 및
11) 40um의 세포 스트레이너(cell strainer)에서 불순물을 제거하여 최종 세포를 획득하는 단계;를 포함하고, 효소반응은 0.125% 트립신과 100 unit/ml의 콜라게나아제 타입 4의 혼합 용액에서 60분간 반응시키는 것을 특징으로 하는 생존율이 향상된 갑상선 세포 분리 방법

제1항에 있어서, 분리된 갑상선 조직은 사람, 흰쥐(rat), 생쥐(mouse) 또는 토끼로부터 분리한 것을 특징으로 하는 갑상선 세포 분리 방법

제1항에 있어서, 분리된 갑상선 조직은 정상 갑상선 또는 갑상선 암 조직인 것을 특징으로 하는 갑상선 세포 분리 방법

제1항에 있어서, 저온 보관액은 4℃ HBSS인 것을 특징으로 하는 갑상선 세포 분리 방법

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제1항에 있어서, 원심분리는 4,000 rpm에서 수행되는 것을 특징으로 하는 갑상선 세포 분리 방법

제1항에 있어서, 배지는 RPMI1640인 것을 특징으로 하는 갑상선 세포 분리 방법

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