KR102297395B1 - 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 열빙어 알 또는 도루묵 알의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부세포 재생을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 출원의 조성물은 피부에 안전하면서도, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하고, 콜라게나제 활성을 억제하며, 엘라스타제 활성을 저하시키고, 피부 세포 재생 효과가 우수하다.

Description

열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION COMPRISING EXTRACT OF CAPELIN EGG OR SAILFIN SANDFISH EGG AND METHOD FOR PREPARING THE EXTRACT OF THE SAME}

본 출원은 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물과 그 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

화장품에 사용되는 원료는 약 8,000여종으로 알려져 있으며, 화장품 원료 시장은 국내 시장규모를 3,000억으로 추정되고 있으나, 고가의 기능성 원료의 80% 이상을 수입에 의존하고 있다.

우리나라의 화장품 원료 주요 수입국으로는 일본으로부터 24,546천불, 독일 10,641천불, 미국 9,723천불, 프랑스 9,075천불, 중국 3,036천불 정도 된다.

최근 중국을 비롯한 동남아시아의 고기능성의 화장품 소비가 급격히 증가하여 기능성 원료 및 화장품의 개발이 시급하다. 기능성 화장품 원료 및 화장품 시장에서 원료의 국산화 및 신소재 개발은 엄청난 고부가가치를 창출할 수 있는 산업분야이다.

그동안 화장품 원료의 개발은 주로 육상 식물성 자원에서 추출 및 분리되어 왔다. 육상 식물을 이용한 원료 개발은 오랜 기간 동안 많은 연구가 진행되어 새로운 소재 연구의 한계에 다다랐다.

이러한 문제를 해결하기 위해서 해양자원을 이용한 원료 개발이 매우 절실하고, 남해안의 청정지역을 가진 우리나라에서 해양생물을 이용한 자원연구가 진행되고 있으나 해양 동물을 이용한 자원의 개발기술은 매우 미약하다.

최근에는 항산화 능력이 뛰어난 해조류 같은 해양자원을 이용한 기능성 화장품이 개발되고 있으나, 팩 제품과 같은 몇 가지 제품에만 적용되고 있어, 폭넓은 화장품 소재로서의 산업화는 아직 미미하다. 이러한 문제를 보완하기 위해서 해양자원 유래 소재로 기능성을 가지는 해양자원 소재시장을 개척할 필요가 있다. 태반 화장품시장은 2000년 이후에 국내에서 인기를 몰기 시작하였으며, 대부분의 태반 화장품은 해외(뉴질랜드, 호주 등)의 양 태반이 대부분의 비중을 차지하고 있다. 2006년 이후엔 국내에서 인(人)태반을 화장품 원료로 사용이 불가하게 됨으로써 동물태반에 대한 사업화가 증가되었다.

그러나, 광우병 등으로 동물유래의 인태반 사용을 꺼려하고 있으며, 우리나라는 양태반을 주로 사용하고 있으나 가격이 매우 비싸 활용하기에 어려움이 많아 이를 대체하기 위한 화장품원료 개발 관심이 매우 높다.

태국화장품 시장은 아세안 국가 중 가장 규모가 큰 시장이고 소비 수준도 매우 높다. 게다가 아세안경제공동체 발효가 임박함에 따라 앞으로 더욱 확대될 것으로 기대되는 시장으로 전망인데, 이러한 태국에서 가장 인기 있는 화장품이 태반화장품이다.

최근 3년 동안 해양생물을 활용한 화장품이 큰 인기를 얻고 있으며, 현재까지 지속되고 있는 추세이고, 특히 해양 태반을 활용한 화장품이 급증하고 있다. 그러나, 현재 시장에서 판매되고 있는 해양 태반 화장품들은 태반의 유래가 유사한 해양생물의 먹이의 원천인 플랑크톤을 이용하거나, 태반처럼 영양이 풍부한 원료를 내세운 제품들이다. 태반은 포유동물에서부터 얻을 수 있는 원료로 해양에서 그것을 얻는 것은 불가능하다.

그래서 본 발명자는 포유동물의 태반처럼 영양이 풍부하며 한 생명을 태어나게 하는 원천물질인 어란을 이용하여 마린 플라센타(Marine placenta) 화장품 원료로 개발하고자 한다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제는 열빙어 알 또는 도루묵 알의 추출물을 유효성분으로 포함하여 항산화, 피부 미백, 피부 주름 개선 또는 피부 재생 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 하나의 실시예는 열빙어 알 또는 도루묵 알을 단백질 분해 효소로 가수분해한 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 단백질 분해 효소는 뉴트라제(Neutrase)를 포함하며, 항산화용, 피부주름 개선용 또는 피부 탄력 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 추출물은, 상기 열빙어 알 또는 도루묵 알을 단백질 분해 효소로 가수분해한 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 추출물은, 상기 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물, 식염수 또는 유기용매로 추출한 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 단백질 분해 효소는, 파파인(Papain), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 수미자임(Sumizyme), 코지자임(Kojizyme), 판크레아틴(pancreatin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신(Cathepsin), 써모리신(thermolisin), 서브틸리신(Subtilisin), 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin), 액티니딘(Actinidin), 펩티다제(Peptidase) 및 트랜스글루타미나제(Transglutaminase)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 유효성분은 전체 조성물 총 중량 대비 0.00001 중량% 내지 10 중량% 포함될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 항산화용일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 피부주름 개선 또는 피부 탄력 개선용일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 피부 미백용일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 피부 세포 재생용일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예는 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물 또는 식염수와 혼합한 후 마쇄하는 단계; 상기 마쇄하는 단계 이후에, 단백질 분해 효소로 뉴트라제(Neutrase)를 첨가하여 45℃ 내지 60℃에서 가수분해하는 단계; 가열하여 상기 단백질 분해 효소를 불활성화하는 단계; 및 원심분리 또는 여과를 통하여 추출물을 수득하는 단계; 를 포함하는 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 마쇄하는 단계 이후에, 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해하는 단계; 및 가열하여 상기 효소를 불활성화하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 단백질 분해효소는 마쇄물 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 10 중량%로 첨가될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 가수분해하는 단계는 30℃ 내지 60℃의 온도에서 1시간 내지 10시간 동안 교반하여 수행될 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 마쇄하는 단계 이전에, 열빙어 알 또는 도루묵 알을 유기 용매에 침지하여 지방을 제거한 후 유기 용매를 제거하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.

본 출원의 열빙어 알 또는 도루묵 알의 추출물은 DPPH 라디칼과 ABTS 라디칼 소거 활성이 높아 항산화 효과가 우수한 장점이 있다.

또한, 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하므로 피부 미백을 위한 기능성 화장품 조성물, 또는 피부 색소 침착 질환을 예방하거나 개선시킬 수 있는 피부외용제 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

그리고, 콜라겐 합성을 효과적으로 촉진하고, 엘라스타제 활성을 저해하여 주름 개선을 위한 기능성 화장품조성물, 또는 피부 주름을 예방하거나 개선시킬 수 있는 피부외용제 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 피부 세포 재생 활성이 우수하여 피부 세포 재생을 위한 기능성 화장품이나 피부외용제 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1과 도 2는 본 출원의 실시예에 따른 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 3 및 도 4는 본 출원의 실시예에 따른 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸 것이다.
도 5는 본 출원의 실시예에 따른 추출물의 타이로시나제 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 출원의 실시예에 따른 추출물의 엘라스타제 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 본 출원의 실시예에 따른 추출물의 콜라게나제 저해 활성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 출원의 실시예에 따른 추출물의 피부 세포 재생 활성을 나타낸 것이다.

이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.

본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 출원의 하나의 실시예는 열빙어 알 또는 도루묵 알의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물, 증류수, 식염수를 혼합하여 마쇄한 후 수득한 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는 열빙어 알 또는 도루묵 알을 에탄올에 침지한 후 여과하여 수득한 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예는 열빙어 알 또는 도루묵 알을 단백질 분해 효소로 가수분해하여 수득한 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서 상기 추출물의 제조방법은 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물 또는 식염수와 혼합한 후 마쇄하는 단계; 및 원심분리 또는 여과를 통하여 추출물을 수득하는 단계; 를 포함할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서 상기 추출물의 제조방법은 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물 또는 식염수와 혼합한 후 마쇄하는 단계; 상기 마쇄하는 단계 이후에, 단백질 분해 효소로 뉴트라제(Neutrase)를 첨가하여 45℃ 내지 60℃에서 가수분해하는 단계; 가열하여 상기 단백질 분해 효소를 불활성화하는 단계; 및 원심분리 또는 여과를 통하여 추출물을 수득하는 단계; 를 포함하는 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 출원의 하나의 실시예에서 상기 추출물의 제조방법은 열빙어 알 또는 도루묵 알을 유기 용매에 침지하여 지방을 제거한 후 유기 용매를 제거하는 단계; 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물 또는 식염수와 혼합한 후 마쇄하는 단계; 및 원심분리 또는 여과를 통하여 추출물을 수득하는 단계; 를 포함할 수 있다.

상기 유기 용매에 침지하는 시간은 3시간 내지 10시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 단백질 분해 효소는, 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 파파인(Papain), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 알칼라제(Alcalase), 수미자임(Sumizyme), 코지자임(Kojizyme), 판크레아틴(pancreatin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신(Cathepsin), 써모리신(thermolisin), 서브틸리신(Subtilisin), 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin), 액티니딘(Actinidin), 펩티다제(Peptidase) 및 트랜스글루타미나제(Transglutaminase)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase) 또는 파파인(Papain)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 분해 효소로 가수분해시 효소의 활성 범위에 따라 pH와 온도를 조절할 수 있다. 예를 들어 펩신의 경우 pH 2.0 ~ 4.0, 트립신의 경우 pH 7.0 ~ 9.0, 프로타맥스의 경우 pH 5.5 ~ 7.5, 플라보자임은 pH 5.0 ~ 7.0 로 조절할 수 있다. 또한 pH의 조절을 위해서 유기산이 사용될 수 있다. 상기 유기산은 상기 pH를 조절할 수 있는 유기산이라면 무방하며, 예컨대 구연산, 젖산, 아세트산, 포름산, 옥살산, 요산 등에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상을 포함할 수 있다.

또한, 가수분해 온도의 경우 단백질 분해 효소가 높은 활성을 갖는 온도일 수 있으며, 효소의 종류에 따라 적절히 조절될 수 있다. 예컨대 가수분해 온도는 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamex) 또는 뉴트라제(Neutrase)의 경우 45℃ 내지 60℃, 트립신의 경우 35℃ 내지 40℃, 파파인의 경우 35℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다.

가수분해 시간의 경우 1시간에서 10시간, 더욱 구체적으로 2시간에서 9시간 동안 교반시키면서 반응을 진행시킬 수 있다.

상기 가수분해를 수행한 후, 70℃ 내지 120℃, 구체적으로 80℃ 내지 100℃에서 1분 내지 20분간 가열하여 효소를 불활성화할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 단백질 분해효소는 마쇄물 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 10 중량%로 첨가될 수 있다. 단백질 분해효소가 0.1 중량% 미만일 경우 단백질 분해 효과가 미미하고, 10 중량%를 초과하는 경우 함량 증가에 따른 효과의 차이가 없을 수 있다.

상기 추출물을 수득하는 단계는 통상의 여과 방법 또는 장치를 이용하여 불순물을 제거할 수 있으며, 예를 들어 원심분리 방법을 이용하거나 마이크로 필터를 이용하여 여과하여 불순물이 제거된 추출액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 사용 가능한 마이크로 필터는 0.1 ㎛ 내지 5 ㎛ 크기의 기공을 갖는 필터를 사용할 수 있다. 구체적으로 3㎛ 크기의 기공을 갖는 필터를 사용하여 여과할 수 있다. 다른 예로, 1000rpm 내지 5000rpm에서 5분 내지 60분간 원심분리할 수 있다. 구체적으로 2000rpm 내지 4000rpm에서 10분 내지 20분간 원심분리하여 침전물은 버리고, 상층액만 수거하여 사용할 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 유효성분은 전체 조성물 총 중량 대비 0.00001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다.

본 출원에 있어서, '유효 성분'이라 함은 손상된 피부의 재생을 촉진하거나, 주름을 개선하거나, 탄력을 증진시키거나, 항산화 효과, 미백 효과 또는 피부 재생 효과를 나타낼 수 있는 화합물의 양을 의미한다. 본 출원의 조성물에 포함되는 상기 추출물의 함량은 조성물이 제품화되는 형태, 상기 화합물이 피부에 적용되는 방법 및 피부에 머무르는 시간 등에 따라 달라질 것이다.

화장품으로 제품화되는 경우에 유효성분이 단기간 내에 피부에 머무르게 되는 메이크업 제거제, 세정제 등과 같은 워쉬-오프(wash-off) 타입의 화장품의 경우에는 비교적 높은 농도의 상기 추출물을 포함할 수 있을 것이다. 반면, 유효성분이 장기간 동안 피부에 머무르게 되는 화장수, 유액, 크림, 에센스 등의 리브-온(leave-on) 타입의 화장품의 경우에는 워쉬-오프 타입의 화장품에 비해 낮은 농도의 상기 추출물을 포함해도 무방할 것이다. 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 상기 조성물은 상기 추출물을 전체 조성물 중량에 대하여 0.00001 중량% 내지 10 중량%, 더욱 구체적으로는 0.0001 중량% 내지 1 중량%로 포함할 수 있다. 본 출원의 조성물이 상기 추출물을 0.00001 중량% 미만으로 포함할 경우에는 충분한 피부 재생, 주름 개선, 탄력 증진, 미백 효과를 기대할 수 없고, 10 중량%를 초과하여 포함할 경우에는 알러지 등 원치 않는 반응이 발생하거나 피부 안전성에 문제가 있을 수 있으므로 이를 방지하기 위한 것이다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 항산화용일 수 있다. 본 출원에서 '항산화 효과'라 함은 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반 응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 피부주름 개선 또는 피부 탄력 개선용일 수 있다. 본 출원에서, '피부주름 개선 또는 피부 탄력 개선 효과'라 함은 피부에 대한 탄력성이 증가되는 것으로, 피부 탄력의 손실을 억제 또는 저해하거나, 이미 감소된 탄력을 완화시키는 것을 말한다

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 피부 미백용일 수 있다. 본 출원에서, '미백 효과'라 함은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 말한다.

본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 화장료 조성물은, 피부 세포 재생용일 수 있다.

본 출원의 하나의 실시예에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 출원의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데 이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니 다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으 로 제조될 수 있다.

본 출원의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전 분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등 이 이용될 수 있다.

본 출원의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 출원의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르 가 있다.

본 출원의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르 및 폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.

본 출원의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코 올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코 시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화글리세롤지방산에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예, 비교예, 실험예들을 통해서 본 출원을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 예는 본 출원의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 출원의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1 및 실시예 2> 에탄올 침지 추출물의 제조

열빙어(Mallotus villosus)의 알에 95% 에탄올을 동량으로 가한 후 5시간 침지한 후 와트만 필터 No.1로 여과하여 추출물(실시예 1)을 제조하였다.

도루묵(Arctoscopus japonicus)의 알에 실시예 1과 동일한 방법으로 추출물(실시예 2)을 제조하였다.

<실시예 3 및 실시예 4> 에탄올 침지 식염 추출물의 제조

열빙어의 알에 95% 에탄올을 동량으로 가한 후 5시간 침지한 후 에탄올을 제거하였다. 그 후 멸균한 식염수를 동량으로 가하여 분쇄한 후 와트만 필터 No.1로 여과하여 추출물(실시예 3)을 제조하였다.

도루묵의 알에 실시예 3과 동일한 방법으로 추출물(실시예 4)을 제조하였다.

<실시예 5 및 실시예 6> 식염 추출물의 제조

열빙어의 알을 멸균한 식염수로 세척한 후 멸균한 식염수를 알과 동량으로 가한 후 분쇄한 후 와트만 필터 No.1로 여과하여 추출물(실시예 5)을 제조하였다.

도루묵의 알에 실시예 5와 동일한 방법으로 추출물(실시예 6)을 제조하였다.

<실시예 7 및 실시예 8> 증류수 추출물의 제조

열빙어의 알을 증류수로 세척한 후 증류수를 알과 동량으로 가한 후 분쇄한 후 와트만 필터 No.1로 여과하여 추출물(실시예 7)을 제조하였다.

도루묵의 알에 실시예 7과 동일한 방법으로 추출물(실시예 8)을 제조하였다.

<실시예 9 내지 실시예 12> 열빙어 알의 단백질 가수분해 추출물의 제조

열빙어의 알을 멸균한 증류수로 세척한 후 동량의 증류수를 가하여 10분 중탕 후 마쇄하였다. 그 후 플라보자임(Flavourzyme)을 마쇄물 중량의 1% 첨가하여 55℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 그 후 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 후 와트만 필터로 여과하여 추출물(실시예 9)을 제조하였다.

실시예 9에서 플라보자임(Flavourzyme) 대신 프로타멕스(Protamex)를 첨가하여 추출물(실시예 10)을 제조하였다.

실시예 9에서 플라보자임(Flavourzyme) 대신 뉴트라제(Neutrase)를 첨가하여 추출물(실시예 11)을 제조하였다.

실시예 9에서 플라보자임(Flavourzyme) 대신 파파인(Papain)을 첨가하고 가수분해 온도를 35℃로 하여 추출물(실시예 12)을 제조하였다.

<실시예 13 내지 실시예 16> 열빙어 알의 단백질 가수분해 추출물의 제조

열빙어의 알을 멸균한 증류수로 세척한 후 95% 에탄올을 동량으로 가한 후 5시간 침지한 후 에탄올을 제거하였다. 그 후 증류수를 동량으로 가하여 마쇄하였다. 그 후 플라보자임(Flavourzyme)을 마쇄물 중량의 1% 첨가하여 55℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 그 후 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 후 와트만 필터로 여과하여 추출물(실시예 13)을 제조하였다.

실시예 13에서 플라보자임(Flavourzyme) 대신 프로타멕스(Protamex)를 첨가하여 추출물(실시예 14)을 제조하였다.

실시예 13에서 플라보자임(Flavourzyme) 대신 뉴트라제(Neutrase)를 첨가하여 추출물(실시예 15)을 제조하였다.

실시예 13에서 플라보자임(Flavourzyme) 대신 파파인(Papain)을 첨가하고 가수분해 온도를 35℃로 하여 추출물(실시예 16)을 제조하였다.

<비교예 1 내지 비교예 3>

비교예 1로 양태반 추출물, 비교예 2로 알부틴, 비교예 3으로 알란토인을 사용하였다.

<실험예 1> DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH assay를 Yoshida et al. (1989)이 사용한 방법에 따라 측정하였다. 96well plate에 control에는 용매 100㎕, 시험군에는 실시예의 추출물의 희석액 100㎕씩 각각 넣었다. 모든 웰에 100㎕씩 넣고 50㎕의 DPPH(0.5 mM 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl(DPPH)/ethanol) 용액을 가하여 혼합한 후 25℃의 실온에서 30분 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 용매 대조군에 대한 각각의 라디칼 소거능을 하기 수학식 1에 따라 백분율로 계산하여 하기 표 1과 도 1 및 도 2에 나타내었다. 실시예 1 내지 8 및 실시예 12의 DPPH 라디칼 소거능을 도 1과 도 2에 나타내었고, 실시예 9 내지 12를 표 1에 나타내었다.

하기 표 1을 참조하면, 뉴트라제를 사용한 실시예 11이 가장 우수한 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내어 뉴트라제를 사용한 실시예 11을 농도를 달리하여 시험하였다. 실시예 11의 IC50은 28.6%이었다. 비교예 1의 양태반 추출물은 DPPH 라디칼 소거활성이 거의 없음을 확인할 수 있었다.

	시료명 (%)	DPPH Radical Scavenging Activity (%)
무처리	용매	81.4 ±2.4
실시예 9 (Flavourzyme)	100	20.7 ±11.4
실시예 10 (Protamex )	100	79.1 ±0.8
실시예 11 (Neutrase )	100	90.0 ±8.7
실시예 12 (Papain)	100	89.7 ±1.5
실시예 11 (Neutrase )	0.025	9.7 ±0.2
	0.05	9.7 ±0.4
	0.25	15.4 ±0.4
	0.5	18.8 ±0.2
	2.5	18.6 ±1.1
	5	22.5 ±0.7
비교예 1 (양태반 추출물)	0.025	4.4 ±1.1
	0.05	4.9 ±0.6
	0.25	2.2 ±1.2
	0.5	4.0 ±1.1
	2.5	7.6 ±0.5
	5	11.7 ±1.0

<실험예 2> ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS assay 를 Re et al.(1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 7 mM ABTS 5 mL와 140 mM potassium persulfate 88 μL를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰다. 이후 이 용액을 414 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 PBS로 희석하였다. 조제된 희석용액 190 μl와 시료 10 μl를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 용매 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 하기 수학식 2에 따라 백분율로 계산하여 하기 표 2와 도 3 및 도 4에 나타내었다. 실시예 1 내지 8 및 실시예 12의 ABTS 라디칼 소거능을 도 3과 도 4에 나타내었고, 실시예 9 내지 12를 표 2에 나타내었다. 도 3을 참조하면, 추출공정을 달리하여 제조한 추출물에서도 모두 높은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보여주어 화장품 원료로서의 활용가능성을 확인하였고, 도 4를 참조하면, 실시예 12의 단백질 가수분해 추출물의 라디칼 소거능이 더 우수한 효과를 보임을 확인하였다.

하기 표 2에서 뉴트라제를 사용한 실시예 11이 가장 우수한 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타내어 뉴트라제를 사용한 실시예 11의 농도를 달리하여 시험하였다. 그 결과 비교예 1의 양태반 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성에 대한 IC50은 3.8%이었으나 실시예 11의 IC50은 0.2%이었다.

	시료명 (%)	ABTS Radical Scavenging Activity (%)
무처리	용매	41.3 ±0.7
실시예 9 (Flavourzyme)	100	77.4 ±1.1
실시예 10 (Protamex )	100	84.1 ±0.1
실시예 11 (Neutrase )	100	87.5 ±0.7
실시예 12 (Papain)	100	73.8 ±0.7
실시예 11 (Neutrase )	0.025	25.0 ±0.4
	0.05	33.2 ±0.7
	0.25	66.9 ±1.0
	0.5	81.1 ±0.7
	2.5	97.7 ±0.6
	5	97.7 ±0.3
비교예 1 (양태반 추출물)	0.025	8.6 ±1.2
	0.05	12.8 ±6.7
	0.25	11.2 ±2.7
	0.5	16.7 ±1.9
	2.5	38.0 ±2.3
	5	61.1 ±8.0

<실험예 3> B16F0 세포독성 측정

시료의 멜라닌 생성 저해능을 보기 위하여 멜라닌 세포인 B16F0를 KCTC에서 분양받아 사용하였다. 세포 배양용 플라스크에 B16F0 세포주를 DMEM에 10% FBS를 첨가한 배지로 37℃, 습도 95%, CO₂ 5% 조절된 CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 생물의 오염이나 증식을 억제하기 위해 배지용 항생제(Penicillin streptomycin, Gibco, CA, USA)를 사용하였다. 세포가 80% 정도 dish를 덮으면 phosphated-buffered saline-EDTA (PBS-EDTA)로 세척한 후 0.05% Trypsin EDTA를 1 ml 처리하여 dish 바닥에 부착되어있는 세포를 떼어내 계대 배양하였다. 배지는 48 시간마다 교환하여 세포를 배양하였다.

세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이후 시료를 농도별로 처리하여(Table 1) 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 72시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시약 1 ml에 배지(DMEM (21063-029, fee phenol red, GIBCO, Grand Island, NY), free FBS) 9 ml을 넣어 희석한 후 시료처리 완료된 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하여 표 3에 나타내었다.

하기 표 3에서 실시예 11의 추출물은 0.05~1%의 농도에서 B16F0 세포 독성을 나타내지 않음을 확인하였으나, 비교예 2인 알부틴의 경우 1%의 농도에서 세포 독성이 확인되어 0.05~0.5% 농도의 알부틴을 미백 세포실험에 사용하였다.

	시료명 (%)	B16F0 세포에 대한 독성 (%)
실시예 11 (Neutrase )	Control	100.0 ±5.7
	0.05	109.3 ±11.4
	0.1	110.6 ±7.5
	0.5	105.7 ±10.5
	0.1	102.3 ±4.3
	0.2	98.6 ±2.1
	0.5	96.3 ±4.4
	1	99.8 ±7.8
비교예 2 (알부틴)	Control	100.0 ±4.2
	0.05	99.2 ±3.5
	0.1	97.7 ±9.1
	0.5	103.5 ±8.8
	0.1	102.7 ±8.7
	0.5	101.8 ±6.9
	1	88.3 ±5.9*

* P<0.05, Control 군과 비교

<실험예 4> 세포외 멜라닌 함량 측정

6-well plate에 well당 1×10⁵ 개로 접종한 후 세포배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 검액 및 2% FBS가 포함된 새로운 배지를 넣고 배양하였다. 이때, 배지에 100 nM α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성 과정을 촉진하였다. 세포의 배지는 다른 용기에 옮기고, 남은 세포는 PBS로 세척한 후 cell lysis buffer를 이용하여 단백질 양을 구하였다. 배지는 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 합성 멜라닌을 이용한 검량선으로부터 멜라닌의 양을 구하였다. 멜라닌 양은 세포 일정 수 당 멜라닌 양 또는 일정 단백질 당 멜라닌 양으로 환산하였고, 시료를 녹인 용매를 처리한 공시료액의 결과와 비교하여 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4에서 실시예 11의 1% 농도에서 비교예 2의 0.1% 농도와 유사한 멜라닌 생성량을 나타내었다.

	시료명 (%)	세포 외 멜라닌 생성량 (mg/g protein)	세포 외 멜라닌 생성 저해 활성 (%)
실시예 11 (Neutrase )	(-)Control	15.5 ± 0.8*	-
	(+)Control	104.6 ±9.4	0.0 ±8.9
	0.1	68.3 ±7.4*	34.7 ±7.0
	0.2	44.1 ±3.1*	57.8 ±3.0
	0.5	17.2 ±1.5*	83.6 ±1.4
	1	16.3 ±2.3*	84.4 ±2.2
비교예 2 (알부틴)	0.01	50.0 ±0.5*	52.7 ±0.4
	0.1	16.3 ±4.7*	84.6 ±4.4

* P<0.05, (+)Control 군과 비교

<실험예 5> 세포내 멜라닌 함량 측정

6-well plate에 well당 1×10⁵ 개(1×10⁵ cells/1.2ml/well)로 접종하고 세포배양조건에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거하고 검액 및 2% FBS가 포함된 새로운 배지를 넣고 배양하였다. 이때, 배지에 100 nM α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성 과정을 촉진하였다. 배지를 제거하고 pellet에 1N 수산화나트륨용액 100 ㎕를 넣고 60℃ 항온조에서 1시간 용해 후 원심분리하였다. 상층액을 가지고 microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하고, 합성 멜라닌을 이용한 검량선으로부터 멜라닌의 양을 구하였다. 멜라닌 양은 일정 단백질 당 멜라닌 양으로 환산하였고, 시료를 녹인 용매를 처리한 공시료액의 결과와 비교하여 하기 표 5에 나타내었다. 하기 표 5에서 실시예 11의 1% 농도에서 비교예 2의 0.1% 농도에 비해 1.2배 높은 멜라닌 저해 활성을 나타내었다.

	시료명 (%)	세포 내 멜라닌 생성량 (mg/g protein)	세포 내 멜라닌 생성 저해 활성 (%)
실시예 11 (Neutrase )	(-)Control	92.0 ±2.6*	-
	(+)Control	179.6 ±3.2	0.0 ±1.1
	0.1	148.2 ±9.0*	17.5 ±3.3
	0.2	118.6 ±11.7*	34.0 ±4.3
	0.5	105.5 ±8.6*	41.2 ±3.1
	1	70.2 ±7.6*	60.9 ±2.8
비교예 2 (알부틴)	0.01	151.2 ±4.2*	15.8 ±1.5
	0.1	88.5 ±4.3*	50.7 ±1.6

* P<0.05, (+)Control 군과 비교

< 실험예 6> 타이로시나제 ( Tyrosinase ) 저해 활성 측정

시료는 에탄올이나 적당한 용매에 녹이고, 타이로시나제 활성 저해를 확인할 수 있는 농도범위를 설정하여 희석하되 최소 5개의 농도가 되도록 처리하고, 시험관에 0.1 M 인산염완충액(pH 6.5) 220 μL, 시료액 20 μL, 머쉬룸 타이로시나제액(1500 U/mL～2000 U/mL)(혹은 휴먼 타이로시나제) 20 μL를 순서대로 넣었다. 이 액에 1.5 mM 타이로신액 40 μL를 넣고 37 ℃에서 10～15분 동안 반응시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성저해율이 50%일 때의 시료 농도(IC50)를 적절한 프로그램을 이용하여 산출하였고, 시료액 용매를 공시료액으로 하여 보정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 실시예 5와 실시예 8은 비교예의 알부틴 5% 농도보다 뛰어난 타이로시나제 저해 활성을 보임을 확인하였다.

<실험예 7> 엘라스타제(Elastase) 생성 저해 활성 측정

엘라스타제 저해활성은 Invitrogen사의 EnzChek®Elastase Assay Kit (600 assays) 시약을 구입하여 사용하였다. 먼저 1 mg DQ elastin vial에 0.5 ml의 DW를 가해 DQ elastin stock solution (1 mg/ml)을 제조했다. 10 x reaction buffer 2 ml에 DDW 18 ml를 가해 reaction buffer를 희석했다. 다음으로 elastase vial에 1 x reaction buffer를 0.5 ml 가하여 100 U/ml로 제조하였다. 효소의 working solution으로 최종 농도가 0.1~0.2 U/ml이 되도록 1 x reaction buffer로 희석했다. 시료를 96well plate에 50 ㎕씩 triple로 진행하였다. 시료를 넣은 후 elastase 효소 100 ㎕를 control과 Test sample에 처리하고 나머지 control blank와 sample blank에는 DW를 처리하였다. 잘 섞어준 뒤 DQ elastin 50 ㎕를 모든 well에 가하였다. 빛을 차단한 상태로 실온에서 1 시간 반응 후 강도 excitation wavelength 485 nm 및 emission wavelength 535 nm에서 ELISA plate reader (VICTOR X3™, PerkinElmer, US)로 형광강도를 측정하여 하기 수학식 3에 따라 계산하여 그 결과를 도 6과 하기 표 6에 나타내었다.

도 6에서 실시예 5와 실시예 8의 경우 농도 증가에 따라 엘라스타제 저해 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

하기 표 6에서 실시예 11에서의 IC50은 18.6%이었고, 비교예 1에서의 IC50은 41.3%이었다. 비교예 1은 실시예 11 대비 동일 농도에서 약 1.9배 효과가 저조하였다.

	시료명 (%)	Elastase Inhibitory (%)
실시예 11 (Neutrase )	1.25	10.3 ±1.1
	2.5	18.8 ±0.9
	12.5	41.9 ±0.5
	25	60.8 ±0.9
비교예 1 (양태반 추출물)	1.25	13.7 ±7.7
	2.5	15.6 ±5.4
	12.5	28.7 ±6.2
	25	32.6 ±6.5

< 실험예 8> 섬유아세포(CCD- 986sk )의 세포 독성 측정

섬유아세포(CCD-986sk)를 배양접시의 바닥에 접종한 후 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 ㎍/mL), 10% FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지 혹은 동등 이상의 성장력을 갖는 배지를 넣고 37℃를 유지하여 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기내에서 배양하였다.

세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이 후 시료를 농도별로 처리하여 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시약 1 ml에 배지(DMEM, free FBS) 9 ml을 넣어 희석한 후 시료처리 완료된 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였고 세포 독성이 없는 농도에서 프로콜라겐 생성 활성을 확인하였다.

<실험예 9> 섬유아세포 내 프로콜라겐 생성 활성 측정

Procollagen type I peptide EIA kit (Takara Biomedical Co.) 시약을 사용하였다. Antibody-PoD conjugate solution 100 ㎕를 well에 넣은 다음 1/5로 희석한 배양액 및 표준액 20 ㎕를 넣고 37℃에서 3시간 배양하고, well에서 배양액을 제거한 다음 인산염완충액(PBS) 400 ㎕로 4회 씻었다. 발색시약 100 ㎕를 넣고 상온에서 15분간 배양하고 1 N 황산 100 ㎕을 넣은 다음 450nm에서 ELISA reader로 측정하였다. 콜라겐 표준품에 물을 넣어 녹여 각각 0,10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ng/mL가 되도록 희석한 후 검량선을 작성하여 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 실시예 11의 1% 농도는 비교예 1의 1%와 비교시 2.5배 높은 프로콜라겐 생성 활성을 나타내었고, 실시예 11의 1% 농도는 비교예 1의 1%와 비교시 2배 높은 프로콜라겐 생성 활성을 나타내었다.

	시료명 (%)	Procollagen Contents (pg/g protein)	Procollagen Contents (%)
Control		26.2 ±3.1	100.0 ±11.8
실시예 11 (Neutrase )	0.05	96.0 ±3.6*	366.2 ±13.8*
	0.1	147.7 ±5.2*	563.2 ±19.8*
	0.5	153.1 ±0.8*	584.0 ±3.1*
	1	192.7 ±1.5*	734.7 ±5.6*
비교예 1 (양태반 추출물)	0.1	65.5 ±7.0*	249.7 ±26.5*
	1	75.6 ±4.5*	288.4 ±17.1*

* P<0.05, (+)Control 군과 비교

< 실험예 10> 콜라게나제 저해 활성 측정

콜라게나제 저해활성은 Invitrogen사의 EnzChek®Gelatinase/Collagenase Assay Kit (250-2000 Assays) 시약을 구입하여 사용하였다. 먼저 1 mg DQ collagen vial에 1.0 ml의 water를 가해 DQ collagen stock solution (1 mg/ml)을 제조했다. 10xreaction buffer 2 ml에 water 18 ml를 가해 reaction buffer를 희석했다. 다음으로 collagenase 효소 시약을 제조하였다. Working solution으로 최종 농도가 0.2 U/ml이 되도록 reaction buffer로 희석했다. 시료를 96well plate에 50 ㎕씩 triple로 준비한다. DQ collagen 20 ㎕와 sample blank에는 reaction buffer 30 ㎕, sample에는 working solution 30 ㎕를 시료에 가하고, 빛을 차단한 상태로 실온에서 1~2 시간 동안 방치한 후 형광 강도 excitation wavelength 485 nm 및 emission wavelength 535 nm에서 ELISA plate reader (VICTOR X3™, PerkinElmer, US)로 형광강도를 측정하여 도 7과 하기 표 8에 나타내었다. 도 7에서는 실시예 5와 실시예 8에서 동일 농도의 아데노신보다 콜라게나제 저해 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 하기 표 8에서는 실시예 15의 경우가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

	시료명 (%)	Collagenase 저해 활성 (%)
무처리	용매	0.6 ±1.0
실시예 13 (Flavourzyme)	100	15.0 ±0.9
실시예 14 (Protamex )	100	29.5 ±0.8
실시예 15 (Neutrase )	100	31.0 ±1.0
실시예 16 (Papain)	100	18.1 ±1.6

< 실험예 11> 인간 유래 피부각질세포(HaCaT) 의 세포 독성 측정

인간 유래의 표피세포인 HaCaT 세포를 통해 세포의 독성을 측정하였다. 즉, 세포 배양용 플라스크에 배양한 HaCaT 세포주를 10 ml 피펫으로 세포를 플라스크에서 떼어내어 계대하였고, 세포는 10% FBS가 함유된 DMEM/LOW 배지로 배양하였다. 세포주의 생존율 측정은 MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega, USA)시약을 이용하여 세포의 생존율을 측정하였다. 96 well plate에 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주 후 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 안정화하였다. 이 후 시료를 농도별로 처리하여(Table 1) 습도 95%, 5% CO₂, 37℃로 조절된 배양기에서 24시간 배양하였다. 배지를 제거한 후 시약 1 ml에 배지(DMEM, free FBS) 9 ml을 넣어 희석한 후 시료처리 완료된 well 당 100 ㎕씩 처리하였다. 37℃에서 60 분간 반응 후 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 독성이 없는 농도에서 재생 활성을 확인하였다.

<실험예 12> 인간 유래 피부각질세포(HaCaT) 의 재생 활성 측정

HaCaT 세포주를 2×10³ cells/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하고, 24시간 동안 37℃, 습도 95%, CO₂ 5%로 조절된 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 새로운 배지에 각 시료를 세포독성이 나타나지 않는 알맞은 농도 범위로 세포에 처리한 후 1, 2, 3 일 동안 배양하였다. 세포주의 생존율을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Mol. Tech., Rockville., MD, USA)를 이용하여 microplate reader (Molecular Devices, VersaMax ELISA Microplate Reader, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 재생효능은 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 흡광도로 표시하여 도 8과 하기 표 9와 표 10에 나타내었다. 도 8에서 실시예 5와 실시예 8의 경우 비교예 3의 알란토인 대비 유사하거나 높은 재생 활성을 보이는 것을 확인하였다.

하기 표 9에서 증식활성 3일차에서 실시예 11의 0.5% 농도는 1 ㎍/㎖ 알란토인 대비 약 1.2배 높은 재생 활성을 보이는 것을 확인하였다.

	시료	피부세포(HaCaT) 재생 활성 (%)
		1 일차	2 일차	3 일차
Control			100.0 ±4.5
실시예 11 (Neutrase ) 농도(%)	0.01	99.5 ±7.7	99.2 ±4.4	119.0 ±4.7*
	0.05	98.6 ±7.3	104.4 ±5.2	121.9 ±4.9*
	0.1	92.7 ±2.8	102.6 ±5.1	126.7 ±3.6*
	0.2	94.0 ±3.2	106.2 ±9.9	131.1 ±6.6*
	0.5	98.7 ±5.1	111.1 ±9.7	144.5 ±11.1*
비교예 3 (알란토인) (μg/ml)	0.1	97.1 ±5.8	104.2 ±8.1	119.9 ±6.8*
	1	98.4 ±7.9	115.1 ±7.1*	121.1 ±7.6*

* p<0.05, Control 군과 비교

하기에 본 출원에 따른 화장료 조성물의 제형예를 설명하나, 하기 예시 이외에도 여러 가지 제형으로 응용 가능하며, 이는 본 출원을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제형예 1> 유연 화장수( 스킨 로션 )

하기 표 10에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 유연 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 11의 추출물	0.25
글리세린	3.5
올레일알코올	1.5
에탄올	5.5
폴리솔베이트 80	3.2
카르복실비닐폴리머	1.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

< 제형예 2> 영양 화장수( 밀크 로션)

하기 표 11에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 화장수를 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 11의 추출물	0.25
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	5.0
스쿠알란	5.0
솔비타세스퀴올레이트	1.5
세테아릴 알코올	1.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

< 제형예 3> 영양 크림

하기 표 12에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양 크림을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
실시예 11의 추출물	0.25
글리세린	3.5
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
카프릴릭/카프릭 리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
트리에탄올아민	0.1
방부제, 향료	적량
정제수	잔량
계	100

이상, 본 출원을 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 출원은 상기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 않고, 본 출원의 기술적 사상 및 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형 및 변경이 가능하다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 열빙어 알 또는 도루묵 알을 단백질 분해 효소로 가수분해한 추출물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 단백질 분해 효소는 뉴트라제(Neutrase)를 포함하며,
   항산화용, 피부주름 개선용 또는 피부 탄력 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출물은,
   상기 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물, 식염수 또는 유기용매로 추출한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 단백질 분해 효소는,
   파파인(Papain), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 수미자임(Sumizyme), 코지자임(Kojizyme), 판크레아틴(pancreatin), 칼리크레인(kallikrein), 카텝신(Cathepsin), 써모리신(thermolisin), 서브틸리신(Subtilisin), 브로멜라인(Bromelain), 피신(Ficin), 액티니딘(Actinidin), 펩티다제(Peptidase) 및 트랜스글루타미나제(Transglutaminase)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 더 포함하는 화장료 조성물.
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 추출물은 전체 조성물 총 중량 대비 0.00001 중량% 내지 10 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은, 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 화장료 조성물은, 피부 세포 재생용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
10. 열빙어 알 또는 도루묵 알을 물 또는 식염수와 혼합한 후 마쇄하는 단계;
    상기 마쇄하는 단계 이후에, 단백질 분해 효소로 뉴트라제(Neutrase)를 첨가하여 45℃ 내지 60℃에서 가수분해하는 단계;
    가열하여 상기 단백질 분해 효소를 불활성화하는 단계; 및
    원심분리 또는 여과를 통하여 추출물을 수득하는 단계;
    를 포함하는 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물의 제조방법.
11. 삭제
12. 청구항 10에 있어서,
    상기 단백질 분해 효소는 마쇄물 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 10 중량%로 첨가하는 것을 특징으로 하는 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물의 제조방법.
13. 청구항 10에 있어서,
    상기 마쇄하는 단계 이전에,
    열빙어 알 또는 도루묵 알을 유기 용매에 침지하여 지방을 제거한 후 유기 용매를 제거하는 단계; 를 더 포함하는 열빙어 알 또는 도루묵 알 추출물의 제조방법.

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