KR102294207B1 - 인간 백혈병 억제 인자 (ｌｉｆ)를 인식하는 항체, 및 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료에서 항-ｌｉｆ 항체의 용도 - Google Patents

인간 백혈병 억제 인자 (ｌｉｆ)를 인식하는 항체, 및 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료에서 항-ｌｉｆ 항체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 백혈병 억제 인자 (LIF)에 대해 작용하는 항체, 및 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 줄기 세포의 증식을 차단/억제시키는 방법, 및 대상체에서 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 진단하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 상기 질환을 앓는 대상체의 평균 기대 수명을 예후하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 상기 항체의 치료 잠재력은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 치료를 위한 치료 조성물에서 LIF 억제가 사용될 수 있다는 관찰에 기초한다.

Description

인간 백혈병 억제 인자 (ＬＩＦ)를 인식하는 항체, 및 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료에서 항-ＬＩＦ 항체의 용도{ANTIBODY RECOGNIZING HUMAN LEUKEMIA INHIBITORY FACTOR (LIF) AND USE OF ANTI-LIF ANTIBODIES IN THE TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH UNWANTED CELL PROLIFERATION}
본 발명은 일반적으로 인간 백혈병 억제 인자 (LIF)를 인식하는 모노클로날 항체를 생산하기 위한 하이브리드 세포주 (림프구 하이브리도마), 상기 항체로 이루어진 동종 집단, LIF의 수준 또는 활성의 변경과 관련된 질환, 예컨대, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환, 더욱 특히, 암, 및 더욱 더 특히, 신경교종의 예후, 진단 및 치료를 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
최신 기술 동향
백혈병 억제 인자 (LIF)는 다양한 생물학적 활성에 관여하고, 상이한 세포 유형에 영향을 주는 인터류킨 6 (IL-6)-형 시토카인이다. 인간 LIF는 202개 아미노산으로 구성된 폴리펩티드이다.
LIF는 중요한 신호전달 분자로서; 특히, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환, 예컨대, 각종 유형의 종양에서 중요한 역할을 한다. 일부 종양 세포의 자가-재생 능력은 LIF 또는 Sox2의 유도에 의해 증가될 수 있다 (문헌 [Ikushima et al., Cell Stem Cell, 5:504-514, 2009]; [Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009]). LIF는 또한 다른 생리학적 활성, 예컨대, 포배 착상 억제 (문헌 [Sengupta et al., 2006, Contraception, 74, 419-425]) 및 표피 멜라닌 세포 분화 (문헌 [Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326])에도 연루되어 있다.
종양에서, 암 개시 세포 (CIC)는 정상 줄기 세포의 특징을 가지며, 지속적인 자가-재생을 보이고, 원시 종양의 특징과 세포 다양성을 재현하는 속발성 종양을 생성할 수 있는 세포 하위집단이다. CIC가 종양 개시, 증식, 재발 및 약물 내성 및 방사선 내성의 원인이 되는 것으로 간주된다 (문헌 [Bao et al., Nature, 444:7756-760, 2006]; [Dick, Blood, 112:4793-4807, 2008]; [Gupta et al., Nat. Mathods, 15:1010-1012, 2009]; [Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008]; [Zhou et al., Nat. Rev. Drug Discov. 8:806-823, 2009]). 이러한 특징들 모두 CIC가 중요한 치료학상의 표적이 되며, CIC의 생물학적 성질을 이해하는 것이 항암 치료를 개선시키는 데 있어 중요하다는 것을 시사한다. CD133 및 CD44를 비롯한, 다수의 세포 표면 마커는 상이한 종양 유형에서 CIC에 풍부한 세포 하위세트를 단리시키는 데 유용하다는 것이 입증되었다 (문헌 [Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008]).
신경교종은 가장 흔한 뇌 종양이다. 침습성이 가장 큰 형태인 신경교종, 즉, 교모세포종 (GBM)으로도 불리는 IV 등급 신경교종은 중앙 생존기간이 약 14개월 정도인 가장 치명적인 암들 중 하나이다 (문헌 [Stupp et al., N. Engl. J. Med., 352:987-996, 2005]). 신경교종의 발생과 진행에 관여하는 분자 기전에 대한 이해가 진전되었음에도 불구하고, 이러한 유형의 종양의 예후 및 치료는 여전히 효과가 없다. 신경교종 개시 세포 (GIC)는 그의 높은 발암성 잠재능, 그의 자가-재생 능력, 및 그의 다중 세포주로의 분화 능력을 특징으로 한다. 종양에서 줄기 세포 유사 세포의 개수는 그의 자가-재생 능력에 의해 조절된다. GIC, 및 일반적으로 암 줄기 세포는, 줄기 세포가 2개의 동일한 그의 카피를, 또는 줄기 세포 카피와 보다 더 분화된 세포 (비대칭 분열)를 생성하는 것을 수단으로 하여 대칭 및 비대칭 분열을 하게 된다. 암 줄기 세포의 자가-재생 능력은 대칭 및 비대칭 분열 사이의 균형에 의해 조절되고, 상기 자가-재생을 제어하는 기전의 탈조절이 종양 발병에 관여할 가능성이 가장 높다.
GIC가 종양 발병, 증식, 및 재발의 원인이 되는 것으로 간주되며, 이는 가장 효과적인 요법은 신경교종 줄기 세포를 구획화하는 것을 겨냥한 요법으로부터 형성될 수 있다는 것을 시사한다. GIC가 제거되지 않는다면, 종양은 근절되지 않을 것이다.
TGFβ (형질전환 성장 인자 β) 신호전달 경로는 많은 세포 활성, 예컨대, 표적 유전자의 조절을 통한 세포 증식 및 분화를 조절하는 데 관여한다. TGFβ 패밀리의 시토카인은 TGFβ 그 자신 (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3), 및 액티빈 및 골 형태발생 단백질을 포함한다. TGFβ 패밀리의 구성원들은 세포 표면에서 세린/트레오닌 키나제 수용체를 활성화시켜 하류 이펙터 SMAD를 포함하는 세포내 신호전달 경로를 작동시킴으로써, 활성화된 경우에는 직접 핵으로 이동하여 전사를 활성화시키는 것을 통해 작용을 한다. TGFβ는 LIF 또는 Sox2의 유도를 통해 GIC의 자가-재생 능력을 증가시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Ikushima et al., Cell Stem Cell, 5:504-514, 2009]; [Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009]). 암 신호 전달에서의 TGFβ의 중요한 역할 (문헌 [Massague, Cell, 134:215-230, 2008])이 TGFβ에 대한 억제 화합물 디자인에 기초한 항암 전략법의 임상적 개발을 유도하였다 (문헌 [Seoane et al., Clin. Transl. Oncol., 10:14-19, 2008]; [Yingling et al., Nat. Rev. Drug Discov., 3:1011-1022, 2004]). 신경교종에서, 상승된 TGFβ 활성이 환자의 예후를 나쁘게 만들고 (문헌 [Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007]), 혈관형성 유도, 면역억제, 세포 침윤 및 세포 증식을 포함하는 다양한 발암성 반응을 보인다 (문헌 [Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007]; [Rich, Front. Biosci. e245-260, 2003]). TGFβ 패밀리의 구성원들은 DNA 결합 단백질 1의 억제제 (Id1)의 발현을 조절한다. DNA 결합 단백질의 억제제 (Id)는 세포 주기 및 세포 분화를 조절하고, 줄기 세포 자가-재생 제어에서 중요한 역할을 하는 전사 인자이다 (문헌 [Perk et al., Nat. Rev. Cancer, 5:603- 614, 2005]; [Ying et al., Cell, 115:281-292, 2003]). 정상적인 상피 세포에서는 TGFβ가 Id1 전사를 억제시키고, BMP가 Id1 전사를 유도한다 (문헌 [Massague, Cell, 134:215-230, 2008]). 그러나, 내피 세포 및 일부 종양 세포에서는 TGFβ가 Id1 발현을 유도할 수 있다 (문헌 [Goumans et al., EMBO J., 1743-1753, 2002]; [Padua et al., Cell, 133:66-77, 2008]). Id1은 이러한 세포의 자가-재생 능력을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 B1형 성인 신경 줄기 세포에서 발현된다 (문헌 [Nam and Benezra, Cell Stem Cell, 5:515-526, 2009]). 암에서 Id1은 몇몇 종양에서는 상향조절되어 있는 것으로 밝혀졌으며 (문헌 [Perk et al., Cancer Res., 2006:10870-10877, 2006]), 전이에 관여하는 것으로 기술되어 있다 (문헌 [Gupta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:19506-19511, 2007]).
신경교종에 대한 최선의 치료법은 외과적 개입이다. 그럼에도 불구하고, 외과적 치료법은 보통 약리학적 아주반트 치료, 또는 방사선요법을 동반한다. 신경교종 치료용의 최선의 약물로는 프로카르바진, CCNU (로무스틴) 및 빈크리스틴을 포함하는 조합물 (PCV로도 지칭된다), 방사선요법과 병용되는 테모졸로미드를 포함한다.
따라서, 최신 기술 동향으로 알려져 있는 치료법의 단점을 막고, 효과적으로 GIC를 제거할 수 있는 대체 치료법을 보유하는 것이 필요하다.
LIF에 특이적인 수개의 항체가 US 5,654,157A, US 5,654,157, 문헌 [Kim et al., (J. Immunol. Meth., 156: 9-17, 1992)], [Alphonso et al., (J. Leukocyte Biology (Abstracts of the 28th National Meeting of the Society for Leukocyte Biology, vol. 0, no. SP.2 (1991) (NY, N.E., p. 49) (Mabs D4.16.9, D25.1.4, and D62.3.2)], [Sengupta et al., (Contraception 74:419-425, 2010)]에 기술되어 있다. 그러나, LIF의 항체가 결합하게 되는 LIF 단백질 내의 항원성 영역의 특징에 대해서는 상세한 규명이 이루어지지 않은 상태이다. 추가로, 암, 특히, 신경교종, 및 더욱 특히, 교모세포종 치료를 위한 상기 항체의 용도에 대해서는 개시된 바 없다. 당업자가 당업계의 다른 일례들로부터 알 수 있는 바와 같이, 항원의 특정 영역 또는 에피토프에의 항체의 결합이 요법의 성공 여부에 결정적인 변수가 될 수 있다. 예를 들어, 다양한 항-HER2 항체가 알려져 있으며, 그 중 단 하나, 트라스투주맙만이 유방암 치료에 특히 유용한 것으로 입증되었다.
발명의 개요
제1 측면에서, 본 발명은 인간 백혈병 억제 인자 (LIF)에 대해 작용하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 백혈병 억제 인자 (LIF)에 대해 작용하는 동종 항체 집단 (이하 항-LIF 항체로 명명한다)을 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 그의 특정의 실시양태에서, 본 발명은 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 퓌르 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된, 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 면역분석적 검정에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료를 위한 치료 유효량의 항-LIF 항체에 관한 것이다.
더욱 특별한 측면에서, 본 발명은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료를 위한, 치료 유효량의 본 발명에 따른 모노클로날 항-LIF 항체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명에 따른 상기 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료를 위한 제약 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 수준을 정량화하는 단계를 포함하는, 대상체에서 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 진단하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은, 대상체에서 암을 진단하거나, 또는 상기 암을 앓을 대상체의 소인을 측정하거나, 또는 대상체에서 상기 암의 병기 또는 중증도를 측정하거나, 또는 상기 암을 앓는 대상체의 생존 확률 또는 평균 예상 기대 수명을 예측하거나, 또는 상기 암을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하기 위해 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 발현 수준을 정량화하는 시약을 포함하는 키트의 용도에 관한 것이며, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 발현이 증가한 것이 시약을 통해 검출된다면, 상기 대상체는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓고 있을 수 있거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 더 큰 소인을 나타낼 수 있거나, 또는 중증도가 더 큰 상기 질환을 나타낼 수 있거나, 또는 실시된 요법이 효과가 없는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 수준을 정량화하는 단계를 포함하는, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자의 평균 기대 수명의 예후를 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
도 1: 항-LIF 항체 (α-LIF)는 아미노산 160 내지 202에 포함된 인간 LIF 단백질의 C-말단 도메인에 결합한다.
(A) LIF 유전자의 2차 구조와, LIF-EGFP 융합 단백질에서 수행된 순차적인 결실을 보여주는 개략도. (B) 명시된 구축물을 293T 세포를 형질감염시켰다. 48시간 경과 후, 세포를 용해시키고, 4℃에서 밤새 1 ㎍의 항-LIF 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 이어서, 단백질 A/G를 용해물에 첨가하고, 면역침전물을 용리시켰다. 항-EGFP 항체를 사용한 면역블롯에 의해 LIF 단편을 검출하였다. (C) 항-LIF 항체 결합 도메인을 보여주는 개략도.
도 2: 항-LIF 항체는 신경교종 세포주 U373에서 LIF에 의한 포스포-Stat3의 유도를 차단하고, 환자 유래의 GBM 뉴로스피어에서 기저 수준의 포스포-Stat3을 차단한다.
A) 명시된 모노클로날 항체의 존재 또는 부재하에서 15분 동안 U373 세포를 인간 재조합 LIF로 처리하거나 처리하지 않고, 포스포-Stat3 및 튜불린 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 이소형-매칭된 IgG를 대조군으로서 사용하였다. B) GBM 뉴로스피어를 분리한 후, 처리하지 않고 그대로 두거나, 또는 항-LIF 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 IgG의 존재하에서 밤새 인큐베이션시키고, 포스포-Stat3 및 튜불린의 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
도 3: 환자 유래의 GBM 뉴로스피어는 CD44 고 /Id1 고 세포 구획을 함유한다.
GBM 뉴로스피어에서 CD44 수준에 대한 FACS 분석을 수행하였다 (도 3A). 이소형 대조군을 사용한 염색이 제시된다. FACS에 의해서 GBM 뉴로스피어를 CD44 수준에 따라 분류하고, CD44, ID1, ID2 및 ID3 전사체 수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다 (도 3B 및 3C).
도 4: GBM 뉴로스피어 중 CD44 고 /Id1 고 집단은 신경교종-개시 세포에 풍부하다.
(A) 10일 동안 10% FBS의 존재 또는 부재하에서 배양된 GBM1 뉴로스피어에서 CD44 수준에 대한 FACS 분석을 수행하였다. (B) GBM1 세포를 CD44 수준에 따라 분류하고, 뉴로스피어-형성 검정을 시딩하였다. 7일 경과 후, 뉴로스피어 개수를 측정하였다 (C, D 및 E). 뉴로스피어 세포를 CD44 수준에 따라 분류하고, 면역약화된 마우스의 뇌에 명시된 개수만큼 세포를 접종하였다. (C) 수술 후 40일이 경과하였을 때, 105개의 세포를 접종받은 마우스의 뇌 전체 영상을 MRI를 통해 얻었다 (화살표 표시는 종양을 나타낸다). (D) 종양 발병률이 제시된다. (E) 명시된 단백질의 면역조직화학법 및 종양의 H&E 염색을 수행하였다.
도 5: 항-LIF 항체는 GBM 뉴로스피어 중 CD44 고 /Id1 고 집단의 수준을 감소시킨다.
GBM 뉴로스피어를 해리시키고, EGF 및 FGF의 존재 (A) 또는 부재 (B)하에서 7일 동안 항-LIF 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 IgG의 존재하에 배양하였다. 프로피디움 아이오다이드의 존재하에서 세포를 항-CD44-FITC 모노클로날 항체로 염색하여 사멸 세포를 배제시키고, FACS에 의해 CD44가 높은 세포의 비율을 측정하였다.
도 6: 항-LIF 항체는 환자 유래의 GBM 뉴로스피어 중 CD44 및 Id1의 수준을 감소시킨다.
GBM 뉴로스피어를 해리시키고, EGF 및 FGF의 부재하에서 7일 동안 항-LIF 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 IgG의 존재하에 배양하고, qRT-PCR에 의해 명시된 유전자의 mRNA 수준을 분석하였다. GAPDH를 내부 표준화 대조군으로서 사용하였다.
도 7: 항-LIF 항체를 사용한 생체내 치료는 CD44 고 /Id1 고 세포 구획을 감소시킨다.
(A) 실험 절차를 보여주는 개략도. (B) 면역약화된 마우스의 뇌에 GBM 뉴로스피어를 접종하였다. 접종 후 30일이 경과하였을 때, 종양이 발생하였고, 종양이 형성되었을 때, 10일 동안 매 3일마다 마우스를 PBS 또는 500 ㎍의 항-LIF 모노클로날 항체로 처리하였다. 마우스의 뇌를 해리시키고, MHC-I 양성 세포 분류에 의해 인간 종양 세포를 단리시켰다. qRT-PCR에 의해 ID1 및 CD44 mRNA 발현 수준을 측정하였다. GAPDH를 내부 표준화 대조군으로서 사용하였다.
도 8. 신경교종 환자의 LIF mRNA 수준이 평균 기대 수명과 연관이 있다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선은 로그 순위 검정에 의하면 LIF mRNA 수준이 ≥2배 상향조절되어 있는 신경교종 환자의 전체 생존기간이 나머지 환자보다 유의적으로 더 짧다는 것을 보여준다 (p = 7.2E-8). 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 뇌 신생물 분자 데이터 저장소(REMBRANDT: REpository for Molecular BRAin Neoplasia DaTa) 프로그램으로부터 데이터를 입수하였다.
도 9. 교모세포종 (GBM) 환자의 LIF mRNA 수준이 평균 기대 수명과 연관이 있다. 카플란-마이어 곡선은 로그 순위 검정에 의하면 LIF mRNA 수준이 ≥9배 상향조절되어 있는 GBM 환자의 전체 생존기간이 나머지 환자보다 유의적으로 더 짧다는 것을 보여준다 (p = 6.9E-4). 국립 암 연구소의 뇌 신생물 분자 데이터 저장소 프로그램으로부터 데이터를 입수하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따른 항체
본 발명의 저자는 인간 백혈병 억제 인자 (LIF)에 대한 신규한 모노클로날 항체를 생성하였다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 모노클로날인, 인간 LIF에 대해 작용하는 항체에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"라는 용어는, 최소량으로 존재할 수 있는, 발생 가능한 임의의 천연 돌연변이를 제외하면, 집단을 구성하는 개별 항체 분자들의 친화도 및 특이성이 본질적으로 동일한 것인 실질적으로 동종인 항체 집단을 의미한다.
모노클로날 항체는 항원의 단일 에피토프에 대해 특이적인 동종 항체 집단이다. 본 발명에서, "모노클로날 항체"라는 용어는 광범위하게 해석되어야 하고, LIF를 특이적으로 인식할 수 있는 한, 다중특이적 항체 및 그의 단편 (F(ab')2, Fab) 등도 포함한다. 본 발명에 따른 모노클로날 항체의 단편은 비-제한적인 일례로서, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 등에 도입될 수 있다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 항체의 클로닝 또는 재조합에 의해 구축된 모노클로날 항체이다. 본 발명의 전형적이지만, 비-제한적인 구성에서, 키메라 항체는 일반적으로 항원 인식 및 결합을 위한 부위를 포함한 가변 단편 (Fv)인 본 발명에 따른 모노클로날 항체의 일부와, 일반적으로 불변 영역 및 인접한 불변 영역을 포함하는 일부인 인간 항체에 상응하는 나머지 다른 부분을 포함한다.
인간화된 항체는 본 발명에 따른 뮤린 모노클로날 항체의 초가변 상보성 결정 영역 (CDR)을 클로닝하고, 이를 상기 인간 항체의 초가변 CDR 영역 대신 인간 항체 내로 이식함으로써 구축된 모노클로날 항체이다 .
본원에서 사용되는 바, "인간 항체"는 완전한 인간 모노클로날 항체를 의미할 수 있다. 그러한 인간 항체는 인간 항체를 생산하도록 변형된 것이, 소위 트랜스제닉 마우스라고 명명되는 유전적으로 조작된 마우스에 의해 생산될 수 있는 항체이다. 마우스로부터 인간 항체를 수득하는 기법은 예를 들어, 최초로는 문헌 [McCafferty et al. (1990, Nature 348 (6301): 552-554)]에 설명된 기술을 기초로 하여 문헌 [Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol., 1995; 13 (1): 65-93)]에 기술되어 있다.
추가로, 본 발명의 맥락에서, "항체"라는 용어는 또한 단백질로부터 수득되거나, 또는 재조합 기술에 의해 수득된, 변경된 글리코실화 패턴을 가진 변이체 뿐만 아니라, 글리코실화된 또는 비-글리코실화된 항체 단편을 포함하며, 이는 그의 유사성은 더 크도록, 면역원성은 더 작도록 (인간화), 또는 생물학적 유체 중에서의 안정성은 더 크도록 하기 위한 것으로서, (i) 결합 펩티드에 의해 서로에게 결합된 항체 가변 영역 (scFv), (ii) 시스테인에 의해, 또는 결합 펩티드 및 이황화 결합에 의해 경쇄에 결합된 중쇄의 CH1 불변부 (Fd)를 함께 포함하는 가변 영역 (scFab), (iii) 새로운 변이체, 예컨대, 단일 중쇄, 또는 (iv) 항체 단편에 대해 이루어진 임의의 변형물로 이루어질 수 있으며, 본 발명의 맥락에서 LIF가 그의 기능 (활성)을 수행하지 못하도록, 즉, JAK-STAT 신호전달 경로의 활성화를 유도하지 못하도록 방해할 수 있는 능력을 갖는다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 본 발명과 관련된 항체의 변이체는 종래의 유전적 조작 또는 재조합 기법, 항체 생산 기법, 생물학적 유체 또는 조직으로부터 추출 및 정제하는 기법, 또는 당업자에게 널리 공지되어 있는, 단백질 및 항체를 수득하는 임의의 다른 종래의 기법에 의해 수득될 수 있다. 기법에 대한 예시적인 비-제한적 일례로는 크기, 조성 및 구조가 다른 재조합 항체의 생산을 위해 디자인된 벡터에서 다시 디자인되고 발현될 수 있는 유전 공학 기법이 있다. 항체의 주요 생산 방법 및 정제 방법에 관한 리뷰는 예를 들면, 하기 문헌에서 살펴볼 수 있다:
· ["Handbook of Therapeutic Antibodies", by S. Dubel. Editor: Wiley-VCH, 2007, Vol: I to III (ISBN 978- 3527314539)];
· ["Antibodies: Volume 1: Production and Purification" by G. Subramanian Ed., Editor: Springer, 1st Ed, 2004 (ISBN 978-0306482458)];
· ["Antibodies: Volume 2: Novel Technologies and Therapeutic Use", by G. Subramanian Ed., Editor: Springer, first edition, 2004 (ISBN 978-0306483158)];
· ["Molecular Cloning: a Laboratory manual", by J. Sambrook and D.W. Russel Eds., Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, third edition, 2001 (ISBN 978- 0879695774)].
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 전장의 인간 LIF를 인식하지만, 아미노산 1 내지 72에 상응하는 LIF 단편은 인식하지 못하고, 더욱 바람직하게는, 아미노산 1 내지 127에 상응하는 LIF 단편은 인식하지 못하고, 더욱 더 바람직하게는, 아미노산 1 내지 160에 상응하는 LIF 단편은 인식하지 못하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 상기 모노클로날 항체에 의한 LIF 또는 그의 단편의 인식을 위해서는 인간 LIF의 아미노산 160 내지 202에 포함된 영역이 필요하다 (도 1). 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 인간 LIF의 아미노산 160 내지 202에 포함된 영역 내의 에피토프를 인식하는 항체에 관한 것이다.
더욱 더 특정한 실시양태에서, 상기 항체는 하기 영역, 즉 인간 LIF의 아미노산 160 내지 180에 상응하는 영역, 아미노산 170 내지 190에 상응하는 영역, 아미노산 180 내지 200에 상응하는 영역, 아미노산 182 내지 202에 상응하는 영역으로부터 선택된 영역 중에 포함된 에피토프를 인식한다.
본 발명의 저자는 인간 LIF를 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 생성하였다. 상기 항체는 IgG1 이소형인 것이다. 상기 항체는 아미노산 잔기 1 내지 160으로 이루어진 스트레치 중에는 포함되지 않은 LIF 단편을 인식한다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 상기 항체를 생산하는, 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주는 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁되었다. 따라서, 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주는 본 발명에 포함된다. 상기 하이브리도마 세포주는 또한 유럽 특허 출원 10 380 049.6에 기술되어 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 항원 중 중첩 또는 부분적으로 중첩되는 에피토프에 결합하는 항체는 상기 항원에의 결합에 대해 서로 경쟁한다. 본질적으로 동일한 2개의 항체 분자, 예컨대, 같은 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 2개의 모노클로날 항체 분자가 항원의 에피토프에의 서로의 결합을 경쟁적으로 억제시킬 것이라는 것도 또한 당업자는 이해할 것이다. 따라서, 일례로 본 발명의 하이브리도마 세포주 DSM ACC3054에 의해 생산된 한 항체 분자의 결합은 같은 세포주에 의해 생산된 임의의 다른 개별 항체 분자의 인간 LIF에의 결합을 경쟁적으로 억제시킨다. 이는 또한 DSM ACC3054 이외의 또 다른 공급원으로부터의 임의의 다른 항체 분자가 일반적으로 같은 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합할 수 있는 한, 그러한 항체 분자의 결합을 경쟁적으로 억제시킬 것이다. 본 발명자들은 상기 에피토프를 함유하는 LIF 영역의 특징을 규명하였다. 따라서, 상기 정의된 항체에 의해 그의 인간 LIF에의 결합이 경쟁적으로 억제되는 임의의 항체 또한 본 발명에 따른 항체이다. 특히, 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁된, 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체에 의해 그의 인간 LIF에의 결합이 경쟁적으로 억제되는 임의의 항체 또한 본 발명에 따른 항체인 것으로 간주된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 면역분석적 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA에서의 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 치료 방법
본 발명은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 인간 환자에서 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체의 효과의 바탕이 되는 분자 메카니즘을 이해한다.
본 발명의 맥락에서, "원치않는 세포 증식과 관련된 질환"은 암 및 종양의 성장, 진행 및 전이를 포함한다. 본 발명에 기술된 방법에 따라 치료될 수 있는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 예로는 암, 재협착증, 동맥경화증, 혈관신생 질환, 섬유증, 피부과 질환, 예컨대, 건선 및 염증성 질환이 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환은 암이다. 이러한 실시양태가 바람직하다.
"암" 및 "종양"이라는 용어는 탈조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 병태에 관한 것이다. 암은 세포 집단이 제어되지 않는 성장 또는 원치않는 성장을 보이는 부류의 질환이다. 제어되지 않는 성장으로 인해 상기 세포는 인접한 조직으로 침윤, 침습할 수 있고, 심지어는 상기 조직을 파괴시킬 수 있다. 암 세포는 또한 다른 위치로 확산됨으로써 전이를 형성할 수 있다. 체내에서 암 세포의 확산은 예를 들어, 림프절 또는 혈액을 통해 발생할 수 있다. 제어되지 않는 성장, 침습 및 전이 형성 또한 암의 악성 특성이라고 할 수 있다. 악성 특성은, 전형적으로는 침윤 또는 전이가 없는 양성 종양으로부터 암을 분화시킨다. 본 발명의 화합물은 (이하로 제한하는 것은 아니지만), 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 두부, 경부, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 골, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 정소 및 간의 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하는 데 유용하다. 특히, 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 종양으로는 선종, 선암종, 맥관육종, 성상세포종, 상피 암종, 배아종, 교모세포종, 신경교종, 혈관내피종, 혈관육종, 혈종, 간모세포종, 백혈병, 림프종, 수모세포종, 흑색종, 신경모세포종, 골육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종 및 기형종을 포함한다. 특히, 종양/암은 말단 흑자 흑색종, 광선 각화중, 선암종, 선양 낭성 암종, 선종, 선육종, 선편평세포 암종, 성상세포 종양, 바르톨린선(Bartholin gland) 암종, 기저 세포 암종, 기관지선 암종, 모세관 카르시노이드, 암종, 암육종, 담관암종, 연골육종, 낭선종, 내배엽동종양, 자궁내막 증식증, 자궁내막 간질 육종, 자궁내막양 선암종, 뇌실막 육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 초점성 결절성 과증식, 가스트린종, 배선 종양, 교모세포종, 글루카곤종, 혈관모세포종, 혈관내피종, 혈관종, 간 선종, 간 선종증, 간세포 암종, 인슐린종, 상피내 신생물, 상피내 편평 세포 신생물, 침습성 편평 세포 암종, 대세포 암종, 지방육종, 폐 암종, 림프모구성 백혈병, 림프구성 백혈병, 평활근육종, 흑색종, 악성 흑색종, 악성 중피세포 종양, 신경초 종양, 수모세포종, 수질상피종, 중피종, 점액표피모양 암종, 골수성 백혈병, 신경모세포종, 신경상피 선암종, 결절성 흑색종, 골육종, 난소 암종, 유두상 장액성 선암종, 뇌하수체 종양, 형질세포종, 슈도육종, 전립선 암종, 폐 모세포종, 신세포 암종, 망막모세포종, 횡문근육종, 육종, 장액 암종, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 연조직 암종, 소마토스타틴 분비 종양, 편평 암종, 편평 세포 암종, 미분화 암종, 포도막 흑색종, 사마귀모양 암종, 질/외음부 암종, VIP종, 윌름스 종양(Wilm's tumor)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 화합물로 치료하기 위한 종양/암으로는 뇌암, 두경부암, 결장직장 암종, 급성 골수성 백혈병, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 방광암, 성상세포종, 바람직하게는, II, III 또는 IV 등급 성상세포종, 교모세포종, 바람직하게는, 다형성 교모세포종, 소세포암, 및 비-소세포암, 바람직하게는, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 전이성 흑색종, 안드로겐-비의존성 전이성 전립선 암, 안드로겐-의존성 전이성 전립선 암, 전립선 선암종, 및 유방암, 바람직하게는, 유관암 또는 유방 암종을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 암은 하기, 즉 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장직장 암종, 폐 선암종, 전립선 선암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 신경교종은 IV 등급 신경교종이다.
TGFβ는 LIF의 Smad-의존적 유도를 통해 암 줄기 세포의 자가-재생 능력을 유도할 수 있다. 대신에 LIF는 JAK-STAT 경로의 활성화에 관여하여 세포 증식 과정 및 종양 줄기 세포 (암 줄기 세포) 증가를 유도한다 (문헌 [Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009]). 전형적으로, STAT 패밀리의 구성원, 예컨대, Stat3의 활성화는 그의 인산화를 통해 발생한다.
본 설명을 시작할 때 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 본원에 기술된 본 발명을 이용하는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환, 예컨대, 암 치료에서, 특히, 고 수준의 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체와 관련된 암 치료를 위한 새로운 치료학상의 기회를 열었다. 어떤 이론으로도 제한하고자 하는 것은 아니지만, LIF 및 그의 억제제가 종양 증식에 미치는 효과는 종양 줄기 세포 증식을 촉진시키는 LIF의 능력에 있다고 판단된다. 저자는 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체를 사용한 치료가 세포 배양물 중 Stat3의 LIF-의존적 인산화를 감소시킨다는 것을 제시한다 (도 2). 항-LIF 억제성 항체는 종양 줄기 세포의 증식을 억제시킬 수 있는 바, 줄기 세포 증식을 억제시키는 것이 도움이 될 수 있는 질환을 치료하는 데에 그의 사용은 특히 유용하다. 상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 항체는 인간 LIF의 아미노산 잔기 1 내지 160을 포함하는 영역 중에 포함되어 있지 않은 LIF 단편을 인식하는 특성을 가지는데, 이는 다시 말하면 이들 항체가 LIF의 C-말단 세그먼트에 결합한다는 것을 의미한다. 본 발명자들은 이러한 특성을 가진 항체가 놀랍게도 암을 비롯한 상기 질환을 치료하는 데 특히 유용하다는 것을 밝혔다 (도 2, 도 6).
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환, 예컨대, 암 치료를 위한, 및 특히, LIF의 높은 활성과 관련된 암 치료를 위한 억제성 항체에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서 "억제성 항체"라는 용어는, LIF에 결합할 수 있고, 이로써 LIF가 그의 기능을 수행할 수 없도록 방해하는 항체로서 이해된다. "중화 항체"가 동의어이다.
유방암에서, TGFβ와, 고 수준의 세포 표면 마커 CD44를 특징으로 하는 세포 집단 (CD44고 집단) 사이의 연관성이 기술된 바 있다. TGFβ는 상피-중간엽 이행 (EMT) 유도를 통해 CIC에 풍부한 CD44고 세포 집단을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Gupta et al., Cell, 138, 645-659, 2009]; [Mani et al., Cell, 133:504-715, 2008]). 그러나, 신경교종에서의 CD44고 구획에 대해서는 널리 연구된 바 없다. 본 발명은 신경교종, 더욱 구체적으로, 교모세포종에서 암 줄기 세포의 신규한 마커로서 Id1 및 CD44를 동정하였다 (도 3). 특히, 본 저자들은 CD44고/CD44고 세포 집단이 신경교종-개시 세포 (GIC, 도 4)에 풍부하다는 것을 제시한다.
비-제한적이면서, 단지 예시적인 일례로, 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체는 신경교종 개시 세포 (GIC)에 풍부한 CD44 및 Id1의 발현을 특징으로 하는 세포 집단을 표적으로 한다. 특히, 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체는 Id1 및 Id3의 억제를 통해 CD44고/Id1고 GIC를 표적으로 한다 (도 5). 또한, 이 항체는 CD44고/Id1고 GIC 집단을 고갈시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 저자들은 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체가 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ) 패밀리의 구성원에 의해 조절되는 경로에 대한 억제제로서의 기능을 한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은, 고 수준의 CD44 및 Id1을 특징으로 하는 세포 집단을 감소시킬 수 있는 본 발명의 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 그의 예시적인 일례가 도 5에 제시되어 있다. GBM 뉴로스피어는 고 수준의 CD44 및 Id1을 특징으로 하는 세포 집단의 바람직한 일례이다. 예를 들어, 교모세포종 환자 유래의 세포주에서, 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체는 CD44 및 Id1의 발현 수준을 감소시킨다 (도 6).
추가로, 본 저자는 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체를 사용한 생체내 치료가 CD44고/Id1고 세포 구획을 감소시킨다는 것을 제시한다 (도 7). 따라서, 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체를 투여하면 종양 개시를 예방할 수 있고, 종양 재발을 예방할 수 있을 것으로 여겨진다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 암 또는 암에 존재하는 종양을 형성하는 세포는 고 수준의 LIF를 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 맥락에서, LIF가 "고 수준"이라는 것은 LIF의 농도가 대조군 샘플 중에 존재하는 것보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150% 또는 그 초과 만큼 더 크다는 것으로 이해하여야 한다.
대조군 샘플은 시험 샘플 중의 LIF의 상대적인 수준을 측정하기 위한 기준으로서 사용되는 LIF 수준을 갖는 샘플로서 이해된다. 기준 샘플은 전형적으로는 임상적 관점에서 문서상으로 잘 입증되어 있고, 어떤 질환도 보이지 않는 환자로부터 수득된다. 상기 샘플 중, 바이오마커 농도는 예를 들어, 기준 집단에서의 평균 농도의 측정을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 마커에 대한 기준 농도를 측정할 때에는 샘플 유형의 몇몇 특징들, 예컨대, 환자의 연령, 성별, 건강 상태 등을 고려하여야 한다. 예를 들어, 기준 샘플은, 집단이 통계학상 유의적이도록 적어도 2명, 적어도 10명, 적어도 100명 내지 1,000명을 초과하는 개체로 이루어진 동일한 양의 군으로부터 수득할 수 있다.
LIF의 농도는 세포내에서, 간질 간극에서 또는 세포내 단백질 및 간질 간극에서 발견되는 단백질, 둘 모두가 포함되어 있는 추출물 중에서 결정될 수 있다. LIF의 수준은 면역학적 방법을 사용하여 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
더욱 특정의 실시양태에서, LIF 수준을 결정하는 면역학적 방법은 항-LIF 항체를 포함하고, 더욱 더 특정의 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 항체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명에 따른 억제성 작용제를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 치료를 위한 제약 조성물에 관한 것이다. 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 예는 본 명세서 중 상기에 언급되어 있다.
본 발명의 맥락에서, "치료 유효량"이란 원하는 효과, 이 구체적인 사례에서는, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 치료인 효과를 달성하는 데 필요한, LIF의 발현 및/또는 활성을 억제시키는 작용제의 양으로서 이해된다. 일반적으로, 투여되는 본 발명에 따른 항체의 치료 유효량은 다른 인자들 중에서도 치료하고자 하는 개체, 상기 개체가 앓고 있는 질환의 중증도, 선택된 투여 형태 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 이유에서, 본 발명에서 언급된 용량은 당업자를 위한 가이드라인으로서만 고려되어야 하며, 당업자는 상기 언급된 변수들에 따라 용량을 조정하여야 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따란 항체는 1일 1회 이상, 예를 들어, 1일 1, 2, 3, 또는 4회 투여될 수 있다.
본 명세서의 맥락에서, "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 본 발명에 따른 항체를 투여하여 상기 질환 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 완화, 또는 제거하는 것을 의미한다. "치료"는 또한 상기 질환의 생리학상 후유증을 예방, 완화 또는 제거하는 것을 포함한다. 본 발명의 맥락에서, "완화"라는 용어는 주관적으로 (환자의 느낌 또는 환자에 대한 느낌), 및 객관적으로 (파라미터 측정으로), 이 둘 모두에 의해 치료받는 환자의 상태의 임의의 개선을 의미하는 것으로서 이해된다.
"비히클, 아주반트 및/또는 담체"라는 용어는 활성 성분 투여시 함께 투여되는 분자 실체 또는 물질에 관한 것이다. 그러한 제약상 비히클, 아주반트 또는 담체는 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일 (석유인 것, 또는 동물, 식물, 또는 합성 기원인 것, 예컨대, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일 등 포함), 부형제, 붕해제, 습윤제 또는 희석제일 수 있다. 적합한 제약상 담체는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기술되어 있다.
본 발명의 맥락에서, "제약상 허용되는"이라는 용어는 생리학상 용인되고, 전형적으로는, 인간에게 투여되었을 때, 알레르기 반응 또는 유사한 부작용, 예컨대, 위 장애, 어지러움증 등을 유발하지 않는 분자 실체 및 조성물에 관한 것이다. "제약상 허용되는"이라는 용어는 바람직하게 연방 정부 또는 주 정부 규제 기관에 의해 승인을 받았다는 것을 의미하거나, 동물, 및 더욱 특히 인간에서 사용하기 위한 US 약전 또는 일반적으로 알려져 있는 다른 약전에 포함되어 있는 것을 의미한다.
항체 뿐만 아니라, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 치료에 유용한 다른 추가 약물과 함께 사용될 수 있다. 상기 추가 약물은 동일한 제약 조성물의 일부를 형성할 수 있거나, 별법으로 상기 항체를 포함하는 제약 조성물의 것과 동시 투여되거나 또는 동시 투여되지 않을 수 있는 별도의 조성물 형태로 제공될 수 있다.
원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 치료에 유용한 다른 추가 약물의 예로는 알킬화제, 예컨대, 시클로포스파미드, 카르무스틴, 다우노루비신, 메클로레타민, 클로람부실, 니무스틴, 멜팔란 등; 안트라시클린, 예컨대, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신 등; 탁산 화합물, 예컨대, 파클리탁셀, 도세탁셀 등; 토포이소머라제 억제제, 예컨대, 에토포시드, 테니포시드, 툴리포시드, 이리노테칸 등; 뉴클레오티드 유사체, 예컨대, 아자시티딘, 아자티오프린, 카페시타빈, 시타라빈, 독시플루리딘, 플루오로우라실, 젬시타빈, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 티오구아닌, 프토라푸르 등; 백금-기반 작용제, 예컨대, 카르보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴 등; 항신생물제, 예컨대, 빈크리스틴, 류코보린, 로무스틴, 프로카르바진 등; 호르몬 조절 인자, 예컨대, 타목시펜, 피나스테라이드, 5-α-리덕타제 억제제 등; 빈카 알카로이드, 예컨대, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈노렐빈 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 화학요법제는 예컨대, 문헌 [The Merck Index in CD-ROM, 13th edition]과 같은 문헌에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 제약 조성물은 항체-함유 제제를 투여하는 데 적합한 임의의 경로에 의해, 예컨대, 피하, 복강내, 정맥내, 근육내 등에 의해 투여될 수 있다.
투여되는 제약 투여 형태의 예시적인 일례로는 적합한 투여 형태로 예컨대, 멸균 용액, 현탁액, 또는 동결건조된 제품의 형태일 수 있고; 이러한 경우, 상기 제약 조성물은 적합한 부형제, 예컨대, 완충제, 시약 등을 포함할 수 있다. 임의 경우에 있어서, 부형제는 선택된 제약 투여 형태에 따라 선택될 것이다.
단백질의 기능성에 대해 중요하지 않은 위치에서 아미노산의 보존적 치환을 일으키는, LIF를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 중의 돌연변이는 그의 구형인 전반적인 구조 또는 기능성에는 영향을 미치지 않는 진화상 중성인 돌연변이라는 것을 당업자는 이해한다. 상기 변이체는 본 발명의 범주내 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바, "기능적 등가물" 또는 "그의 기능적 등가 변이체"라는 것은 그로부터 변이체가 유도된 분자 (즉, 변이체가 그의 유도체인 것)와 기능상 관계를 지닌 분자를 기술한다. 더욱 전형적으로, 그로부터 변이체가 유도된 분자와의 기능상 및 구조상의 관계, 둘다를 가진다. 기능상/구조상의 관계는 하기와 같이 이해하여야 한다:
A. 기능상의 관계: 본원에서 사용되는 바, LIF와 기능상 관계가 있는 분자는 LIF 활성에 대한 시험관내 검정에서 LIF의 효과와 비교하여 50 내지 200% 범위, 더욱 바람직하게는, LIF의 효과와 비교하여 80 내지 120% 범위, 및 가장 바람직하게는 LIF의 95 내지 105% 범위, 예컨대, 본질적으로는 100%의 효과를 가진다. LIF 활성에 대한 다양한 시험관내 검정이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326]에 제시된 바와 같이, LIF 또는 그의 기능적 등가물 첨가시 멜라닌 세포의 분화를 측정할 수 있다. 더욱 특히, 문헌 [Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326]의 도 2A에 제시된 바와 같이, LIF 첨가시 멜라닌 세포의 백분율을 측정할 수 있다.
B. 구조상의 관계: (1) 분자가 당업자에게 공지된 바와 같이, 표준 트리스/글리신 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 LIF와 본질적으로 동일하게 이동할 수 있고/거나, 분자가 상이한 글리코실화 패턴을 가진 분자이고/거나, 분자가 그의 아미노산 서열이 인간 LIF로 유도되는 분자이며, 즉, 인간 LIF의 하나 이상의 (즉, 1 내지 5개, 1 내지 10개 또는 1 내지 20개) 아미노산이 변형, 치환, 부가 또는 결실된 것이다. 따라서, LIF와 비교하여 상기와 같은 하나 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 변형을 가지며, 추가로 LIF와 동일한 기능을 보존하는 것인 LIF의 기능적 등가 변이체가 본 발명의 범주내 포함된다. 바람직한 실시양태에서, "기능적 등가물" 또는 "그의 기능적 등가 변이체"는 LIF와 본질적으로 동일한 기능을 수행할 수 있는 분자를 기술한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "기능적 등가물" 또는 "그의 기능적 등가 변이체"는 또한 LIF의 임의의 기능적 등가 단편을 포함한다. LIF의 기능적 등가 변이체에 대해 본원에 기술된 것과 동일한 것이 다른 단백질, 예컨대, CD44, Id1 및 Id3의 기능적 등가 변이체에도 적용된다.
"단편"이라는 용어는 단백질의 일부를 포함하는 펩티드에 관한 것이다. 이 경우, LIF의 기능적 등가 단편은 LIF의 일부를 포함하고, LIF와 본질적으로 동일한 기능을 가진 펩티드 또는 단백질이다. 이펙터, 예컨대, LIF와 본질적으로 동일한 기능은 상기 "A: 기능상의 관계" 표제하에 기술된 것과 같이 측정될 수 있다.
"항체의 단편"은 항체의 일부를 포함하는 하나의 펩티드 또는 복수개의 펩티드 (예컨대, 전형적으로는 2개, 3개, 또는 4개의 펩티드)이다. 이러한 펩티드는 임의로 분자간 또는 분자내 이황화 가교를 포함한다. 따라서, 항체의 단편은 임의로 이황화 가교에 의해 연결된, 하나 또는 2개의 경쇄 또는 그의 단편들 및/또는 하나 또는 2개의 중쇄 또는 그의 단편(들)을 포함할 수 있다. 하나의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편(들), 또는 2개의 중쇄 및 경쇄 또는 그의 단편(들)과의 조합이 가장 전형적인 것이다. 관련된 항체의 단편, 또는 더욱 특히, 경쇄 및 중쇄의 단편은 항체/쇄의 가변 도메인 (VH)을 포함하고, 더욱 특히, 항체/쇄의 항원 결합 영역을 포함하는 단편인 것이 바람직하다.
화학요법에 대해 내성을 띠는 종양 줄기 세포의 능력이 공지되어 있다는 것을 고려해 볼 때, 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체는 또한 잠재적으로는 화학요법에 대해 내성을 띠는 종양을 치료하기 위한 것으로 관심의 대상이 된다. 또한, 본 저자는 항-LIF 항체, 바람직하게는, 본 발명에 따른 항-LIF 항체를 사용하는 것이 또한 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 재발 발생을 방지하는 데 적합하다는 것을 제시한다 (도 7).
본 발명의 진단 방법
본 발명의 저자는, LIF가 JAK/STAT 캐스캐이드에 관여함으로써 세포 증식 과정과 종양 줄기 세포 (암 줄기 세포)의 증가를 유도한다는 것을 밝혀냈다. 더욱 특히, 본 저자는 CD44 및 Id1이 신경교종의 신규한 마커라는 증거를 제공한다. 추가로, 본 저자는 고 수준의 CD44 발현을 특징으로 하는 GIC에 풍부한 세포 하위집단에서 Id1이 차별적으로 발현되고, ID1 및 ID3이 항체-매개성 LIF-억제의 시그너쳐에 포함되는 유전자라는 것을 밝혀냈다. 따라서, LIF, CD44, Id1, Id3 또는 그의 임의의 조합이 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 진단하는 진단 방법에 사용될 수 있다. 진단 방법은 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 수준을 결정하는 것에 기초한다. 바람직하게는, 진단 방법은 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체의 수준을 결정하는 것에 기초한다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 발현 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기서, 대조군 샘플 중의 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합을 코딩하는 유전자의 발현 수준과 비교하여 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합을 코딩하는 유전자의 발현이 증가하였다면, 이는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 나타내는 것이거나, 또는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 상기 대상체의 더 큰 소인을 나타내는 것이거나, 또는 상기 대상체에게 투여된 요법에 무반응이라는 것을 나타내는 것인, 대상체에서 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 진단하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 시험관내 방법은 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정량화하여 대조군 샘플 중의 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체를 코딩하는 유전자의 발현 수준과 비교하는 것을 포함한다.
따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적 등가 변이체"라는 용어는 또한 상기 마커 단백질의 임의의 기능적 등가 단편을 포함한다. "단편"이라는 용어는 상기 마커 단백질의 일부를 포함하는 펩티드에 관한 것이다. 이러한 경우, 기능적 등가 단편은 상기 마커 단백질의 일부를 포함하고, 상기 단백질과 본질적으로 동일한 기능을 가진 펩티드 또는 단백질이다. "마커 단백질"은 바람직하게는 LIF, CD44, Id1 및 Id3을 지칭하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 진단은 대상체가 질환을 앓을 확률을 평가하는 것에 관한 것이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 그러한 것이 바람직하기는 하지만, 상기와 같은 평가가 보통 진단받는 대상체들 100% 모두에 대하여 정확할 수는 없다. 그러나, 상기 용어는 대상체 중 통계학상 유의적인 일부가 질환을 앓거나, 또는 그에 대한 소인을 가지는 것으로 확인할 수 있어야 하는 것을 필요로 한다. 당업자는 간단하게는 예를 들어, 신뢰 구간 결정, p-값 결정, 스튜던츠 t-검정(Student's t-test), 맨-휘트니 검정(Mann-Whitney test) 등과 같은, 하나 또는 수개의 주지된 통계학적 평가 도구를 사용함으로써 일부가 통계학상 유의적인지 여부를 결정할 수 있다. 문헌 [Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983]에서 상세한 설명을 살펴볼 수 있다. 바람직한 신뢰 구간은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다. p-값은 0.2, 0.1, 0.05인 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바, "소인"이라는 용어는 대상체에서 상기 언급한 질환, 또는 상기 언급한 질환의 증상들 중 어느 것 또는 다른 진단학상 기준도 여전히 발생하지 않은 상태이지만, 추후에 상기 질환이 발병될 특정의 확률이 있다는 것을 의미한다. 상기 확률은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환이 발병될 통계학상의 확률과는 유의적으로 상이할 것이다. 원치않는 세포 증식과 관련된 질환이 발병될 수 있는 확률이 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%의 소인인 것으로 진단되는 것이 바람직하다. 소인 진단은 종종 대상체에서 질환이 발병될 수 있는 확률에 대한 예후 또는 예측으로 언급될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "대조군 샘플"은 본 발명에서 사용되는 유전자 및 단백질의 발현 수준의 변동을 측정하는 데 사용되는 기준 샘플로서 이해된다. 한 실시양태에서, 기준 값은 건강한 개체로부터 수득된 조직 샘플을 사용하여 제공받은 신호로부터 수득된다. 바람직하게는, 여러 명의 건강한 개체의 동일한 조직으로부터 샘플을 채취하고, 이를 조합하여 샘플 중 폴리펩티드의 양이 집단에서의 상기 분자에 대한 평균 값을 반영하도록 한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, LIF 또는 CD44 또는 Id1 또는 Id3의 발현 수준을 정량화할 수 있다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 단백질의 발현 수준은 임의의 종래 방법에 의해 정량화할 수 있다. 비-제한적인 일례로, 단백질 수준은 예를 들어, 상기 단백질 (또는 항원 결정기를 함유하는 그의 단편)에 결합할 수 있는 능력을 가진 항체를 사용한 후, 형성된 복합체를 정량화함으로써 정량화할 수 있다. 이러한 검정에서 사용되는 항체는 표지될 수 있거나, 또는 표지되지 않을 수 있다. 사용될 수 있는 마커의 예시적인 일례로는 방사성 동위원소, 효소, 형광단, 화학발광성 시약, 효소 기질 또는 보조 인자, 효소 억제제, 입자, 염료 등을 포함한다. 비-표지된 항체 (1차 항체) 및 표지된 항체 (2차 항체)를 사용하는 것으로서, 본 발명에서 사용될 수 있는 매우 다양한 검정이 공지되어 있으며; 이러한 기법으로는 웨스턴 블롯, ELISA (효소-결합 면역흡착 검정), RIA (방사면역검정), 경쟁적 EIA (경쟁적 효소 면역검정), DAS-ELISA (이중-항체 샌드위치 ELISA), 면역세포화학적 및 면역조직화학적 기법, 특이적인 항체를 포함하는 단백질로 이루어진 바이오칩 또는 마이크로어레이를 사용하는 것에 기반한 기법, 또는 예컨대, 딥 스틱과 같은 포맷으로의 콜로이드성 침전에 기반한 검정을 포함한다. 또 다른 특정의 실시양태에서, 면역분석적 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA에 의해 단백질 수준을 정량화한다. 더욱 더 특정의 실시양태에서, 상기 면역분석적 방법은 본 발명의 맥락에서 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 진단 방법은 상기 정의된 원치않는 세포 증식과 관련된 질환 중 임의의 것에 적용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환은 암, 바람직하게는, LIF를 고 수준으로, 또는 하기, 즉 Id1, Id3, CD44 중 임의의 것을 고 수준으로 가지는 암이다.
본 발명의 방법을 실행하는 것은 연구하고자 하는 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 것을 포함한다. 상기 샘플의 비-제한적인 일례로는 상이한 유형의 생물학적 유체, 예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 복수, 대변, 소변 및 타액 뿐만 아니라, 조직 샘플을 포함한다. 생물학적 유체 샘플은 조직 샘플과 같이 임의의 종래 방법에 의해 수득할 수 있으며; 일례로, 상기 조직 샘플은 외과적 절제술에 의해 수득된 생검 샘플일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 진단하거나, 또는 상기 암을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 상기 암의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 암을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하기 위해 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 발현 수준을 정량화하는 시약을 포함하는 키트에 관한 것이며, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 상기 유전자 또는 상기 단백질 또는 그의 기능적 등가 변이체의 발현이 증가한 것이 시약을 통해 검출된다면, 상기 대상체는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓고 있을 수 있거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 더 큰 소인을 나타낼 수 있거나, 또는 중증도가 더 큰 상기 질환을 나타낼 수 있거나, 또는 실시된 요법이 효과가 없는 것이다. 그의 바람직한 실시양태에서, 키트는 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체의 발현 수준을 정량화하는 시약을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 키트의 용도에 관한 것이다.
키트의 용도를 정의하는 데 사용된 모든 용어 및 표현은 본 발명의 다른 발명상의 측면 및 특정 실시양태와 관련하여 상기 기술되어 있고 설명되어 있으며, 이는 또한 본원에 기술된 키트의 용도에 적용될 수 있다.
맞춤형 요법을 디자인하는 방법 및 항-LIF 항체에 기초한 요법으로부터 유익을 얻을 수 있는 환자를 선택하는 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자에서 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계, 및
(b) 상기 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서, 상기 환자에서의 LIF의 발현 수준이 대조군 값보다 크다면, LIF에 대해 작용하는 항체를 상기 환자에게 투여하는 것인, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자에 대한 맞춤형 요법을 디자인하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자에서 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계, 및
(b) 상기 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서, 상기 환자에서의 LIF의 발현 수준이 대조군 값보다 크다면, 상기 환자를 LIF에 대해 작용하는 항체를 사용하는 치료법을 받도록 선택하는 것인, LIF에 대해 작용하는 항체를 사용하여 치료받도록 하기 위해 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자를 선택하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
두 측면 모두에서, 바람직한 실시양태는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환이 원치않는 줄기 세포 증식과 관련이 있는 것이다.
원치않는 세포 증식을 나타내는 질환은 상기 기술된 것이다. 바람직한 실시양태에서, 원치않는 세포 증식을 나타내는 상기 질환은 암이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 암은 JAK-STAT 신호전달 경로의 높은 활성에 의해 유발되는 것이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 암은 하기, 즉 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 결장직장 암종, 폐 선암종, 전립선 선암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나이다. 더욱 더 바람직하게는, 상기 신경교종은 IV 등급 신경교종이다.
본 발명의 예후 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자의 평균 기대 수명을 예측하는 시험관내 예후 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 예를 들어, 신경교종인 경우, 더 높은 LIF 발현 수준을 보이는 환자에서의 평균 기대 수명이 대조군 환자에서보다 더 단축되어 있다는 관찰 결과에 기초한다. 본 저자는 CD44 및 Id1이 GIC의 마커라는 증거를 제공한다. 이러한 마커는 GBM 환자의 예후를 나쁘게 만든다. 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체에서, 상기 언급한 바와 같은 보다 높은 수준의 LIF와, 보다 높은 수준의 Id1 및 CD44 각각 간의 연관성이 예후 방법이 의존할 수 있는 신규한 마커를 제공한다.
본 발명은
a) 상기 환자에서 LIF 또는 CD44 또는 Id1 또는 Id3의 발현 수준을 정량화하는 단계; 및
b) 상기 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계
에 기초하고, 여기서, 상기 환자에서의 LIF 또는 CD44 또는 Id1 또는 Id3의 발현 수준이 같은 질환을 앓는 대조군 환자에서의 값보다 더 크다면, 이는 상기 환자의 기대 수명이 대조군보다 더 짧을 가능성이 높음을 나타낸다.
더욱 구체적인 측면에서, 예후 목적으로, 즉, 상기 질환을 앓는 개체의 평균 기대 수명을 예측하기 위해, LIF 또는 CD44 또는 Id1 또는 Id3, 또는 이들 마커들 중 임의의 것의 기능적 등가 변이체의 농도를 측정할 수 있다. 바람직하게는, LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체의 농도를 측정한다. 이러한 목적을 위해, 종양 환자로부터 유래된, LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합의 농도를 같은 마커의 기준 농도와 비교한다. 본원에서 사용되는 바, LIF, CD44, Id1 및 Id3, 또는 LIF, CD44, Id1 및 Id3의 기능적 등가물이 "마커"이다. 바람직하게는, 종양 환자로부터 유래된, LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체의 농도를 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체의 기준 농도와 비교하며, 즉, 마커는 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체이다. 기준 샘플은 기준 환자군으로부터 채취한다. 기준 환자군은 전형적으로 문서상으로 잘 입증되어 있고, 같은 질환을 앓는 환자로 이루어진다. 예를 들어, 기준 샘플은, 상기 질환을 앓는 환자 집단이 통계학상 유의적이도록 적어도 2명, 적어도 10명, 적어도 100명 내지 1,000명을 초과하는 개체로 이루어진 동일한 양의 군으로부터 수득할 수 있다. 기준군은 하기 환자들 중 하나 이상으로 이루어질 수 있다:
a) 상기 질환을 앓는 모든 환자,
b) LIF의 수준이 유의적으로 상향조절되지 않은 것을 나타내는, 상기 질환을 앓는 모든 환자,
c) LIF의 수준이 유의적으로 하향조절된 것을 나타내는, 상기 질환을 앓는 모든 환자.
LIF의 농도는 세포내에서, 간질 간극에서 또는 세포내 단백질 및 간질 간극에서 발견되는 단백질 둘 모두가 포함되어 있는 추출물 중에서 결정될 수 있다.
상기 측면에서, 바람직한 실시양태는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환이다. 더욱 특정의 실시양태에서, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환은 암이다. 더욱 더 바람직하게는, 암 유형은 상기 암 환자의 하위세트에서 LIF가 비정상적으로 고 수준인 것과 관련이 있다. 더욱 특정의 실시양태에서, 암은 하기, 즉 백혈병, 신경교종, 결장직장 암종, 방광암, 유방암 중 하나이다. 더욱 특정의 실시양태에서, 백혈병은 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병이고, 유방암은 유관암 또는 유방 암종이다.
통계학적 방법을 통해 상기 단백질 또는 그의 기능적 등가 변이체의 수준에 기초한 환자의 평균 기대 수명을 예측할 수 있을 것이다. 상기 단백질은 바람직하게는 LIF이다.
본원에서 사용되는 바, "기능적 등가 변이체"라는 용어는 또한 상기 마커 단백질 LIF의 임의의 기능적 등가 단편을 포함한다. "단편"이라는 용어는 상기 마커 단백질의 일부를 포함하는 펩티드에 관한 것이다. 이 경우, 기능적 등가 단편은 상기 마커 단백질의 일부를 포함하고, 상기 단백질과 본질적으로 동일한 기능을 가진 펩티드 또는 단백질이다.
더욱 특정의 실시양태에서, 면역분석적 방법, 예컨대, 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA에 의해 단백질 수준을 정량화한다. 더욱 더 특정의 실시양태에서, 상기 면역분석적 방법은 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체를 포함한다.
실시예:
본 발명은 하기 실시예에 의해 하기에서 설명될 것이며, 실시예는 단지 그의 예시적이며 비-제한적인 일례로서만 간주되어야 한다
물질 및 방법
세포주 및 1차 세포 배양물
PCTC 및 GBM 뉴로스피어를 앞서 기술된 바와 같이 생성하였다 (문헌 [Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007]; [Gunther et al., Oncogene, 2007]). 간략하면, 외과적 절제술을 수행한 후 30 min 내에 종양 샘플을 프로세싱하였다. 일정한 속도로 왕성하게 교반시키면서 분쇄된 인간 GBM 샘플 조각을 37℃에서 2 hr 동안 PBS 중 200 U/ml 콜라게나제 I (시그마(Sigma)) 및 500 U/ml의 DNase I (시그마)로 소화시켰다. 단일 세포 현탁액을 70 μm 세포 여과기 (BD 팔콘(BD Falcon))를 통해 여과하고, PBS로 세척하였다. 마지막으로, 세포를 재현탁시킨 후, 이어서 (PCTC 배양물인 경우에) 10% FBS를 함유하는 DMEM 중에서 배양하거나, 또는 (GBM 뉴로스피어인 경우에) 뉴로스피어 배지 중에서 배양하였다. 뉴로스피어 배지는 B27 (기브코(GIBCO)), L-글루타민 (기브코), 페니실린/스트렙토마이신, 및 성장 인자 (20 ng/mL EGF 및 20 ng/mL FGF-2 [페프로테크(Peprotech)])로 보충된 뉴로베이살(Neurobasal) 배지 (기브코)로 이루어졌다. 인간 GBM 표본은 발 데브론 하스피탈(Vall d'Hebron Hospital)로부터 입수하였다.
임상 프로토콜은 발 데브론 임상 시험 심사 위원회(Vall d'Hebron Institutional Review Board) (CEIC)로부터 승인을 받은 것이었고, 대상체 모두로부터 사전 동의서를 받았다.
두개내 종양 검정
모든 마우스 실험은 유럽 연합(European Union) 및 국가 지침에 따라 발 데브론 연구소의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care Committee of the Vall d'Hebron Research Institute)의 승인을 받았고, 그의 가이드라인에 따라 수행하였다. 9주령된 NOD/SCID 마우스 (찰스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories)) 뇌의 우반구의 선조체 (1 mm 전방, 1.8 mm 외측 (정수리 기준); 2.5 mm 실질내)에 세포를 정위적인 방식으로 접종하였다. 마우스가 신경 증상을 보이거나, 상당한 체중 감소가 일어났을 때, 마우스를 희생시켰다. 체중 1 kg당 0.25 mmol 가돌리늄의 용량으로 가돌리늄 디에틸렌트리아민 펜타아세트산을 복강내로 주사맞은 마우스에서 자기 공명 영상화 (MRI)를 수행하였다. 앞서 기술된 바와 같이 스핀 에코 시퀀스를 이용하여 아반스(AVANCE) 400 시스템 (브루커(Bruker))에 인터페이스된 9.4T 수직 보어 자석 중에서 뇌 전체로부터 T1W 자기 공명 영상을 획득하였다 (문헌 [Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009]). 제조사 (브루커)가 제공한 소프트웨어를 사용하여 각 영상에서 종양 조직에 상응하는 픽셀의 수를 측정함으로써 종양 부피를 정량화하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석을 위해 스튜던트 T 검정을 수행하였다. 그래프 상의 데이터는 평균 ± SD로 제시되어 있다.
플라스미드 및 시약
TGFβ1 (R&D), TβRI 억제제 LY2109761 (일라이 릴리(Eli Lilly)) 및 SB431542 (토크리스(Tocris))는 명시된 농도로 사용하였다. 면역블롯팅을 위해 p-Smad2, Smad2 (셀 시그날링(Cell Signaling)); α-튜불린 (시그마) 및 Id1 (C20, 산타 크루즈 바이오테크놀러지(Santa Cruz Biotechnology))에 대한 특이적인 항체를 사용하였다. 렌티바이러스 구축물을 제조하고, 앞서 기술된 바와 같이 패킹하였다 (문헌 [Zufferey et al., Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997]). 뉴로스피어를 성장 배지 중에 해리시키고, 바이러스와 혼합하고, 플레이팅하였다. 폴리브렌 (시그마)을 8 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 세포를 12시간 동안 바이러스와 함께 인큐베이션시키고, PBS로 세척하고, 앞서 기술된 바와 같이 새로운 배지 중에서 인큐베이션시켰다 (문헌 [Zufferey et al., Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997]).
유동 세포측정법에 의한 CD44-양성 집단 분석
뉴로스피어를 해리시키고, 개개의 세포를 15 min 동안, 10 □g/ml 인간 IgG를 함유하는 차단 용액 중에서 인큐베이션시킨 후, 이어서, 항-CD44 항체 또는 대조군 IgG2b 이소형 (둘 모두 FITC-접합된 형태임) (BD 파르밍겐(BD Pharmingen))을 함유하는 차단 용액 중에서 인큐베이션시켰다. 세포를 차광된 상태하에 얼음 상에서 20 min 동안 인큐베이션시키고, PBS 중에서 세척하고, 염색된 세포을 식별할 수 있도록 프로피디움 아이오다이드 (시그마)로 염색하였다. 이어서, 세포를 CD44-FITC로 염색한 후 분류하거나 (MoFlo; 다코(DAKO)); 유동 세포측정법 (FACS캘리부르(FACSCalibur; 벡톤 딕킨슨(Beckton Dickinson))에 의해 분석하였다.
마우스 뇌 중 동소 이종이식편으로부터의 인간 세포 단리
뉴로스피어를 접종받은 마우스로부터 뇌를 해리시키고, 범(pan)-MHC 클래스 I 특이 mAb HP-1F7 (산타 크루즈 바이오테크놀러지)로 염색한 후, 이어서, 인간 MHC-I 양성 세포 (MoFlo-다코)에 대한 후속 세포 분류를 위해 2차 PE-접합된 mAb (다코 시토메이션(Dako Cytomation))로 염색하였다. 수득한 세포를 세척하고, 즉시 후속 실험에 사용하였다.
뉴로스피어-형성 검정
같은 개수의 세포를 저 세포 밀도로 (1 ㎕당 4개의 세포) 96-웰 플레이트의 웰에 시딩하였다. 세포를 명시된 화합물로 처리하고, 배양물 중에서의 7일이 경과한 후, 새로 형성된 뉴로스피어의 총 개수를 계수하였다 (문헌 [Lee, et al. Cancer Cell, 13:69-80, 2008]; [Reynolds and Weiss, Dev. Biol. 175:1-13, 1996]).
자가-재생 검정
1 ㎕당 100개의 세포로 플레이팅된 명시된 GBM 뉴로스피어로부터의 세포를 7일 동안 명시된 화합물로 처리하였다. 이어서, 뉴로스피어를 해리시키고, 어떤 처리도 하지 않고 다시 플레이팅하고, 추가로 7일 동안 인큐베이션시켰다. 새로 형성된 뉴로스피어의 총 개수를 계수하였다.
정량적 실시간 PCR
제조사의 권고에 따라 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수한 택맨(Taqman) 프로브를 사용하여 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하였다. ABI 7900 시퀀스 검출기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에서 반응을 수행하고, 결과는 ΔΔCt 방법에 의해 계산된, 대조군 샘플에 대한 상대적인 변화 배수로서 표시하였다. GAPDH를 내부 표준화 대조군으로서 사용하였다.
면역조직화학법, 면역세포화학법
조직 마이크로어레이 제작을 위해, 별개의 영역으로부터 0.6 mm 코어 3개를 취하고, 각각을 1 mm씩 이격된 그리드 중 수령 블록 내에 어레이시켰다. 단백질 검출을 위해 하기 항체를 사용하였다: 항-Id1 (바이오체크(BioCheck)), 항-CD44 (Ab-4, 네오마커(Neomarker)), 항-CD31 (클론 JC70A, 다코). Id1의 정량적 분석을 위해, 광학 현미경을 사용하여 조직 절편 상의 대표적인 고배율 시야 (x 400)에서 염색된 종양 세포의 백분율 및 염색 강도를 평가하였다. 결과는 H-스코어 또는 양성 세포의 백분율로 표시하였다.
문헌 [Geschwind et al., Neuron, 29:325-329, 2001]에 앞서 기술된 바와 같이 뉴로스피어의 Id1 (산타 크루즈 바이오테크놀러지) 면역세포화학법을 수행하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 사용하여 핵을 대조 염색시켰다.
미세해부
냉동된 샘플의 헤마톡실린에오신으로 염색된 10 ㎛의 절편 상에서 괴사성 병소로부터 떨어져 위치하는 대표적인 종양 부위가 확인되었다. 마이크로다이섹터 레이카 LMD6000(Microdisector Leica LMD6000)을 사용하여 종양 세포를 미세해부하고, 제조사의 권고에 따라 RNA이지 마이크로 키트(RNAeasy Micro Kit)(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 프로세싱하여 RNA를 수득하였다.
루시퍼라제 검정
리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000) (인비트로젠(Invitrogen))을 사용하여 상이한 ID1 프로모터 리포터 구축물, 및 표준화 대조군으로서 pRL-TK 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 플라스미드 (프로메가(Promega))로 GBM 뉴로스피어 세포를 일시적으로 형질감염시켰다.
실시예 1: 인간 LIF에 대해 작용하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주
인간 LIF에 대해 작용하는 항체 생산을 목적으로 하이브리도마 세포주를 당업자에게 주지된 방법에 의해서 생성하였다. 이러한 하이브리도마 세포주로부터 한 세포주를 선택하고, 이를 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁하였다. 수탁 번호 DSM ACC3054를 배정받았다. 이에 따라서, 또한 상기 세포주에 의해 생산된 동종 항체 집단을 선택하였다. 이어서, 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁된 하이브리도마 세포주 DSM ACC3054에 의해 생산된 항-인간 LIF 모노클로날 항체 (α-LIF)의 결합 특이성을 면역침전법에 의해 측정하였다. 이를 위해, C-말단이 EGFP-태깅된 버전의 인간 LIF 단백질 (도 1A)로 형질감염된 293T 세포를 용해시키고, 모노클로날 항-LIF 항체로 면역침전시킨 후, 단백질 A/G를 용해물에 첨가하고, 면역침전물을 용리시켰다. 항-EGFP 항체를 사용하여 면역블롯에 의해 LIF 단편을 검출하였다. 단, 아미노산 160 내지 202에 포함된, 인간 LIF 단백질의 C-말단 도메인이 존재한다면, 상기 항체는 LIF 및 그의 변이체를 인식한다는 것이 상기 분석을 통해 밝혀졌다. 아미노산 1 내지 72, 1 내지 127 또는 1 내지 160에 상응하는, EGFP-태깅된 LIF 단편을 제외한, EGFP-태깅된 전장의 LIF가 모노클로날 항체에 의해 인식되었다 (도 1B). 따라서, 항-LIF 항체에 의한 인식을 위해서는 아미노산 160 내지 202에 포함된, 인간 LIF 단백질의 C-말단 도메인이 필요하다 (도 1C).
실시예 2: 모노클로날 항-LIF 항체는 세포 배양물 중에서, 및 환자 유래의 교모세포종 뉴로스피어 중에서 LIF에 의한 포스포-Stat3의 유도를 차단한다.
LIF 하류의 효과를 차단하는 데 있어서의, 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항-LIF 항체의 유효성에 관하여 그의 효과를 시험하기 위해 명시된 모노클로날 항체의 존재 또는 부재하에서, 또는 대조군으로서 이소형-매칭된 IgG의 존재하에서 U373 세포를 인간 재조합 LIF로 처리하거나 처리하지 않았다. 이어서, 웨스턴 블롯에 의해 포스포-Stat3 수준을 측정한 결과, LIF-매개된 포스포-Stat3의 유도는 모노클로날 항-LIF 항체 투여에 의해서 효과적으로 차단될 수 있는 것으로 나타났다 (도 2A).
상기 항체가 환자 유래의 암 세포에 미치는 효과를 시험하기 위해, 환자 유래의 GBM 뉴로스피어를 통합(desegregate)시키고, 임의로 상기 항체 또는 이소형-매칭된 대조군 IgG의 존재하에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 웨스턴 블롯에 의해 포스포-Stat3 수준을 측정한 결과, 환자 유래의 세포에서 LIF-매개된 포스포-Stat3의 유도는 모노클로날 항-LIF 항체 투여에 의해서 효과적으로 차단될 수 있는 것으로 나타났다 (도 2B).
실시예 3: 환자 유래의 GBM 뉴로스피어는 CD44 고 /Id1 고 세포 구획을 함유한다.
CD44는 특정 종양의 CIC에서 고도로 발현되는 것으로 기술된 단백질이다 (문헌 [Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008]). 이에 따라, 본 연구의 저자들은 GBM 뉴로스피어 중에 상이한 수준의 CD44를 발현하는 별개의 두 집단이 존재하는 것을 관찰하였다 (도 3A). 그러나, 현재까지 신경교종에서의 CD44고 구획에 대해서는 널리 연구된 바 없다. 환자 뉴로스피어로부터 유래된 세포에서 CD44의 발현이 Id1의 발현과 상관관계가 있는지 시험하기 위해, "물질 및 방법"에 기술된 바와 같이 세포 염색시 유동 세포측정법에 의해 다른 환자 4명으로부터 유래된 뉴로스피어의 CD44고 집단을 분류하였다. 이어서, CD44고 및 CD44저 집단에서 각각 Id1 발현 수준을 측정하였다. 흥미롭게도, Id1 단백질 및 RNA는 CD44저 구획보다는 CD44고에서 훨씬 더 높은 수준으로 검출되었다 (도 3B 및 3C). 흥미롭게도, Id3 또한 CD44고 집단에서 더 높은 수준으로 존재하였지만, 전사 인자 중 Id 패밀리의 또 다른 구성원인 Id2의 경우에는 그렇지 않았다 (도 3B). 따라서, 고 수준의 CD44는 고 수준의 Id1 및 Id3과 상관관계가 있다.
실시예 4: GBM 뉴로스피어 중 CD44 고 /Id1 고 집단이 신경교종-개시 세포에 풍부하다
본 저자는 혈청을 사용한 처리를 통해 환자 유래의 뉴로스피어의 분화를 유도하였을 때, CD44고 구획이 소실되었다는 것을 관찰하였다 (도 4A). 이어서, CD44고 및 CD44저 세포를 분류하고, 저밀도로 플레이팅하였다. CD44고 세포가 CD44저 구획보다 더 많은 뉴로스피어를 생성하였는데 (도 4B), 이는 CD44고 세포가 CD44저 세포보다 뉴로스피어-형성 능력이 더 높다는 것을 시사하는 것이다. 이어서, CD44고의 종양 개시 능력을 CD44저 구획과 비교 분석하였다. CD44 발현에 기초하여 종양 세포를 분류하고, 본 발명자들은 NOD-SCID 마우스의 우측 선조체에서 세포의 양을 감소시켜가며 이식하면서 생체내 제한 희석을 수행하였다. 자기 공명 영상화 (MRI)에 의해 종양 진행을 모니터링하였다. 고 수준의 CD44를 발현하는 세포가 CD44저 발현 세포보다 종양발생성이 훨씬 더 컸다. 100,000개의 CD44저 세포를 접종받은 7마리의 마우스 중 단 1마리에서만 종양이 발생한 반면, 같은 개수의 CD44고 세포를 접종받았을 때에는 9마리의 마우스 중 9마리에서 종양이 발생하였다 (도 4C 및 4D). 또한, 10,000개 또는 1,000개의 CD44고 세포를 접종받은 마우스에서는 종양이 발생한 반면, 같은 개수의 CD44저에서는 종양이 발생하지 않았다. 또 다른 환자, GBM2로부터 얻은 세포를 사용하였을 때에도 유사한 결과를 얻었다 (도 4D). CD44고 구획에 의해 발생된 종양은 동일한 세포 이종성을 비롯한, 환자의 종양의 조직병리학적 특징들을 재현하였다 (도 4E). 예를 들어, 마우스에서 발생된 종양은 환자 종양과 같은 백분율 (약 70%)의 Sox2 양성 및 음성 세포를 함유하였다 (도 4E). 상기 결과들은 모두 다른 종양 유형에서 나타난 바와 같이, CD44고 구획이 GIC에 풍부하다는 것을 시사하였다.
실시예 5: 항-LIF 항체는 GBM 뉴로스피어 중 CD44 고 /Id1 고 집단의 수준을 감소시킨다.
GBM 뉴로스피어를 해리시키고, EGF 및 FGF의 존재 (A) 또는 부재 (B)하에서 7일 동안 세포주 DSM ACC3054로부터의 항-LIF 모노클로날 항체 또는 이소형-매칭된 대조군 IgG의 존재하에 배양하였다. 놀랍게도, 항-LIF 항체로 처리된 뉴로스피어가 CD44고 구획을 감소시켰다. 따라서, TGFβ는 고 수준의 Id1을 발현하고, GIC에 풍부한 CD44고 구획을 조절한다.
실시예 6: 항-LIF 항체는 환자 유래의 GBM 뉴로스피어 중 CD44 및 Id1의 수준을 감소시킨다.
GBM 뉴로스피어를 해리시키고, EGF 및 FGF의 부재하에서 7일 동안 항-LIF 모노클로날 항체 또는 이소형 대조군 IgG의 존재하에 배양하고, qRT-PCR에 의해 명시된 유전자의 mRNA 수준을 분석하였다. 이소형-매칭된 대조군 IgG와 비교한 결과, Id1 mRNA 수준 뿐만 아니라, CD44 mRNA 수준도 환자 유래의 GBM 뉴로스피어 중 항-LIF 항체 적용시 유의적으로 감소하였다.
실시예 7: 항-LIF 항체를 사용한 생체내 치료가 CD44 고 /Id1 고 세포 구획을 감소시킨다.
모노클로날 항-LIF 항체 적용에 대한 반응으로 나타난 종양 중 GIC 집단의 감소가 종양 재발에 영향을 주는지 여부를 평가하기 위해, 본 발명의 저자는 먼저 GBM1 뉴로스피어의 접종을 통해 마우스에서 종양을 발생시켰다. 세포 접종 후 1개월이 경과하였을 때, 마우스는 MRI에 의해 검출되는 종양을 보유하고 있었다. 이 시점에서, 10일 동안 마우스를 모노클로날 항-LIG 항체 또는 이소형-매칭된 IgG로 처리하고, 희생시켰다. 인간 MHC-I 양성 세포 분류를 통해 마우스의 뇌로부터 인간 종양 세포를 단리시켰다 (도 7A).
qRT-PCR에 의해 측정한 바, TβRI 억제제로 처리된 마우스로부터 수득된 세포가 보다 더 낮은 수준의 ID1, ID3 및 CD44 전사체를 나타내었다 (도 7B).
실시예 8
상향조절된 LIF 수준을 보이는 신경교종 또는 교모세포종 환자는 더 짧은 전체 기대 수명을 갖는다
전체 신경교종 환자의 하위세트에서, LIF 수준이 ≥2배 상향조절되어 있다. 정해진 일정 기간 동안에 걸쳐, 상기 환자의 생존 확률은 대조군 환자와 비교하였을 때 유의적으로 감소하였다. 예를 들어, 1,000일 후 생존 확률은 전체 신경교종 환자와 비교하였을 때에는 대략 50%로 감소하였고, LIF 수준이 ≥2배 상향조절되지 않은 신경교종 환자와 비교하였을 때에는 대략 35%로 감소하였다 (도 8). 데이터는 국립 암 연구소의 뇌 신생물 분자 데이터 저장소 (REMBRANDT) 프로그램으로부터 입수하였다.
전체 교모세포종 환자의 하위세트에서, LIF 수준이 ≥9배 상향조절되어 있다. 정해진 일정 기간 동안에 걸쳐, 상기 환자의 생존 확률은 대조군 환자와 비교하였을 때 유의적으로 감소하였다. 예를 들어, 500일 후 생존 확률은 전체 교모세포종 환자와 비교하였을 때에는 대략 50%로 감소하였다 (도 9). 데이터는 국립 암 연구소의 뇌 신생물 분자 데이터 저장소 (REMBRANDT) 프로그램으로부터 입수하였다.
본 발명의 바람직한 실시양태
하기는 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 그러나, 본 발명이 이러한 바람직한 실시양태로 제한되는 것으로 이해해서는 안된다:
1. 전장의 인간 LIF를 인식하지만, 아미노산 1 내지 72에 상응하는 LIF 단편은 인식하지 못하고, 더욱 바람직하게는, 아미노산 1 내지 127에 상응하는 LIF 단편은 인식하지 못하고, 더욱 더 바람직하게는, 아미노산 1 내지 160에 상응하는 LIF 단편은 인식하지 못하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
2. 실시양태 1에 있어서, 인간 LIF의 아미노산 160 내지 202에 상응하는 영역 중에 포함된 인간 LIF의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체.
3. 실시양태 1에 있어서, 하기 영역, 즉 인간 LIF의 아미노산 160 내지 180에 상응하는 영역, 아미노산 170 내지 190에 상응하는 영역, 아미노산 180 내지 200에 상응하는 영역, 아미노산 182 내지 202에 상응하는 영역으로부터 선택된 영역 중에 포함된 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체.
4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 항체의 인간 LIF에의 결합이, 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체에 의해 경쟁적으로 억제되는 것인 모노클로날 항체.
5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, IgG1 이소형인 모노클로날 항체.
6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁된, 수탁 번호 DSM ACC3054의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체.
7. 발 데브론 종양학 연구소에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 기탁된 하이브리도마.
8. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는, 인간 LIF의 측정에 사용되는 면역분석용 시약.
9. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 종양 줄기 세포의 자가-재생 억제를 통해 작용하는 모노클로날 항체 또는 그의 단편.
10. 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 치료하기 위한, 인간 LIF에 대해 작용하는 항체 또는 그의 단편.
11. 실시양태 1 내지 6, 및 9 중 어느 하나에 있어서, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 치료하기 위한 항체 또는 그의 단편.
12. 치료 유효량의 실시양태 1 내지 6, 및 9 중 어느 하나의 항체 또는 그의 단편을 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물.
13. 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체 또는 이들 분자의 임의의 조합의 발현 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기서, 대조군 샘플 중의 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합을 코딩하는 유전자의 발현과 비교하여 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 이들 분자의 임의의 조합을 코딩하는 유전자의 발현이 증가하였다면, 이는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 나타내는 것이거나, 또는 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 상기 대상체의 더 큰 소인을 나타내는 것이거나, 또는 상기 대상체에게 투여된 요법에 무반응이라는 것을 나타내는 것인, 대상체에서 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 진단하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하는 시험관내 방법.
14. 대상체에서 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 진단하거나, 또는 상기 질환을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 상기 질환의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 질환을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하기 위해 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체 또는 이들 분자의 임의의 조합의 발현 수준을 정량화하는 시약을 포함하는 키트의 용도이며, 여기서, 대조군 샘플과 비교하여 상기 유전자 또는 상기 단백질 또는 그의 기능적 등가 변이체의 발현이 증가한 것이 시약을 통해 검출된다면, 상기 대상체는 상기 질환을 앓고 있을 수 있거나, 또는 상기 질환을 앓을 더 큰 소인을 나타낼 수 있거나, 또는 중증도가 더 큰 상기 질환을 나타낼 수 있거나, 또는 실시된 요법이 효과가 없는 것일 수 있는 것인 용도.
15. (a) LIF 수준 증가와 관련된 질환을 앓는 환자에서 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계, 및
(b) 상기 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서, 상기 환자에서의 LIF의 발현 수준이 대조군 값보다 크다면, LIF의 항체를 상기 환자에게 투여하는 것인, LIF 수준 증가와 관련된 질환을 앓는 환자에 대한 맞춤형 요법을 디자인하는 시험관내 방법.
16. (a) 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자에서 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계, 및
(b) 상기 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서, 상기 환자에서의 LIF의 발현 수준이 대조군 값보다 크다면, 상기 환자를 실시양태 1 내지 6 및 9 내지 12 중 어느 하나에 따른 항체 또는 그의 단편을 사용하는 치료를 받도록 선택하는 것인, LIF에 대해 작용하는 항체를 사용하여 치료받도록 하기 위해 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 환자를 선택하는 시험관내 방법.
17. 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF 또는 그의 기능적 등가물의 발현 수준을 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서, 대조군 샘플 중 LIF 발현 또는 그의 기능적 등가물과 비교하여 LIF 발현 또는 그의 기능적 등가물이 증가하였다면, 이는 기대 수명의 단축을 나타내는 것인, 원치않는 세포 증식과 관련된 질환을 앓는 대상체의 기대 수명 또는 생존 확률의 예후를 위한 시험관내 방법.
18. 실시양태 10 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 원치않는 세포 증식을 나타내는 질환이 고 수준의 LIF를 나타내는 것을 특징으로 하는 것인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물, 또는 방법 또는 키트.
19. 실시양태 10 또는 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 원치않는 세포 증식을 나타내는 질환이 고 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단을 특징으로 하는 것인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물, 또는 방법 또는 키트.
20. 실시양태 10 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 원치않는 세포 증식을 나타내는 질환이 암인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물, 또는 방법 또는 키트.
21. 실시양태 18 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 하기, 즉 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 폐 선암종, 전립선 선암종, 결장직장 암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물, 또는 방법 또는 키트.
22. 실시양태 21에 있어서, 상기 신경교종이 IV 등급 신경교종인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물, 또는 방법 또는 키트.
23. 실시양태 13 내지 22 중 어느 하나에 있어서, LIF의 수준을 정량화하는 것이 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA를 이용하여 실시되는 것인, 방법 또는 키트.
24. 실시양태 13 내지 23 중 어느 하나에 있어서, LIF의 발현 수준을 측정하기 위한 방법 또는 키트가 실시양태 1 내지 6, 및 9 중 어느 하나에 따른 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것인, 방법 또는 키트.
25. 실시양태 1 내지 6, 실시양태 9 내지 12, 및 실시양태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 또는 그의 단편이 고 수준의 CD44 및 Id1을 특징으로 하는 세포 집단을 감소시킬 수 있는 것인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물.
26. 실시양태 1 내지 6, 실시양태 9 내지 12, 및 실시양태 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 종양 줄기 세포의 자가-재생 억제를 통해 작용하는 것인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물.
27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, "LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 CD44 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id1 또는 그의 기능적 등가 변이체, 또는 Id3 또는 그의 기능적 등가 변이체"라는 용어가 LIF 또는 그의 기능적 등가 변이체로 제한되는 것인, 항체 또는 그의 단편, 또는 제약 조성물, 또는 키트, 또는 방법.
Figure 112020104862917-pat00001
DSMZ DSMACC3054 20100401

Claims (27)

  1. 발 데브론 종양학 연구소(Vall d'Hebron Institute of Oncology)에 의해 2010년 4월 1일자로 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 수탁번호 DSM ACC3054의 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, IgG1 이소형인 모노클로날 항체.
  3. 제1항에 있어서, 인간화된 항체인 모노클로날 항체.
  4. a. 높은 수준의 LIF 또는
    b. 높은 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단
    을 포함하는 암의 치료를 위한, 치료 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 및 제약상 허용되는 비히클을 포함하는 제약 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 모노클로날 항체가 종양 줄기 세포의 자가-재생 억제를 통해 작용하는 것인 제약 조성물.
  6. 대상체에서 암을 진단하거나, 또는 상기 암을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 상기 암의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 암을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하기 위해 LIF의 발현 수준을 정량화하기 위한, 제1항에 따른 모노클로날 항체를 포함하는 키트이며, 여기서 대조군 샘플과 비교하여 LIF 또는 LIF를 코딩하는 유전자의 발현이 증가한 것이 모노클로날 항체를 통해 검출된다면, 상기 대상체가 상기 질환을 앓고 있을 수 있거나, 또는 상기 질환을 앓을 더 큰 소인을 나타낼 수 있거나, 또는 더 큰 상기 질환의 중증도를 나타낼 수 있거나, 또는 투여된 요법이 효과가 없는 것인 키트.
  7. (a) 암을 앓는 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계, 및
    (b) 상기 발현 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 정량화는 제1항에 따른 모노클로날 항체를 사용하여 수행되고, 상기 환자로부터 수득한 생물학적 샘플에서의 LIF의 발현 수준이 대조군 값보다 큰 경우, 상기 환자를 상기 모노클로날 항체를 사용하여 치료를 받도록 선택하는 것인,
    상기 모노클로날 항체를 사용하여 치료를 받도록 하기 위해 암을 앓는 환자를 선택하는 시험관내 방법.
  8. 암을 앓는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 정량화는 제1항에 따른 모노클로날 항체를 사용하여 수행되고, 대조군 샘플 중 LIF 발현과 비교하여 LIF 발현이 증가하였다면, 이는 기대 수명의 단축을 나타내는 것인, 암을 앓는 대상체의 기대 수명 또는 생존 확률을 예측하기 위한 시험관내 방법.
  9. 대상체에서 암을 진단하거나, 또는 상기 암을 앓을 대상체의 소인을 결정하거나, 또는 대상체에서 상기 암의 병기 또는 중증도를 결정하거나, 또는 상기 암을 앓는 대상체에게 투여된 요법의 효과를 모니터링하기 위해 정보를 제공하는 시험관내 방법이며, 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 LIF의 발현 수준을 정량화하는 단계를 포함하고, 여기서 정량화는 제1항에 따른 모노클로날 항체를 사용하여 수행되며, 대조군 샘플과 비교하여 LIF를 코딩하는 유전자의 발현이 증가하였다면, 이는 암을 나타내는 것이거나, 또는 암을 앓을 상기 대상체의 소인이 더 큰 것을 나타내는 것이거나, 또는 상기 대상체에게 투여된 요법에 무반응이라는 것을 나타내는 것인 시험관내 방법.
  10. 제4항에 있어서, 암이 높은 수준의 LIF를 나타내는 것인 제약 조성물.
  11. 제4항에 있어서, 암이 높은 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단을 포함하는 것인 제약 조성물.
  12. 제4항에 있어서, 암이 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 폐 선암종, 전립선 선암종, 결장직장 암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나인 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 신경교종이 IV 등급 신경교종인 제약 조성물.
  14. 제7항에 있어서, LIF의 발현 수준의 정량화가 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA로부터 선택된 기술을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  15. 제7항에 있어서, 암이 높은 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  16. 제7항에 있어서, 암이 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 폐 선암종, 전립선 선암종, 결장직장 암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 신경교종이 IV 등급 신경교종인 방법.
  18. 제6항에 있어서, LIF의 발현 수준의 정량화가 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA로부터 선택된 기술을 수행하는 것을 포함하는 것인 키트.
  19. 제6항에 있어서, 암이 높은 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단을 포함하는 것인 키트.
  20. 제6항에 있어서, 암이 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 폐 선암종, 전립선 선암종, 결장직장 암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나인 키트.
  21. 제20항에 있어서, 신경교종이 IV 등급 신경교종인 키트.
  22. 제8항에 있어서, LIF의 발현 수준의 정량화가 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA로부터 선택된 기술을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제8항에 있어서, 암이 높은 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  24. 제8항에 있어서, 암이 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 폐 선암종, 전립선 선암종, 결장직장 암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나인 방법.
  25. 제9항에 있어서, LIF의 발현 수준의 정량화가 웨스턴 블롯, 면역조직화학법 또는 ELISA로부터 선택된 기술을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제9항에 있어서, 암이 높은 수준의 CD44 및 Id1을 발현하는 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
  27. 제9항에 있어서, 암이 신경교종, 전구-B 세포 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 폐 선암종, 전립선 선암종, 결장직장 암종, 방광암, 유관암 또는 유방 암종 중 하나인 방법.
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