KR102292853B1 - 이중 선택적 pi3 델타 및 감마 키나아제 억제제 - Google Patents

이중 선택적 pi3 델타 및 감마 키나아제 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중 델타 (δ) 및 감마 (γ) PI3K 단백질 키나아제 조절물질, 이를 제조하는 방법, 이를 함유하는 약제학적 조성물 및 치료 방법, 이를 이용한 Pi3K 키나아제 매개된 질환 또는 장애의 예방 및/또는 개선에 관한 것이다.

Description

이중 선택적 PI3 델타 및 감마 키나아제 억제제{DUAL SELECTIVE PI3 DELTA AND GAMMA KINASE INHIBITORS}
본원은 2013년 6월 7일에 출원된 인도 특허 출원 제2501/CHE/2013호, 및 2013년 12월 3일에 출원된 제5567/CHE/2013호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
본 발명은 이중 델타 (δ) 및 감마 (γ) PI3K 단백질 키나아제 조절물질, 이들을 제조하는 방법, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 이들을 이용한 Pi3K 키나아제 매개된 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선 방법을 제공한다.
포스포이노시티드-3 키나아제 (PI3K)는 포스포이노시티드 지질 (PI)의 이노시톨 고리의 3 위치 하이드록실기를 인산화시켜 지질 2차 메신저를 생성하는 세포내 키나아제의 한 부류에 속한다. 알파 및 베타 동형체는 도처에 분포하지만, 델타 및 감마의 발현은 순환하는 혈행성 세포 및 및 내피 세포에 국한된다. PI3K-알파 또는 베타와 달리, 감마 또는 델타의 발현이 부족한 마우스는 어떤 부정적인 표현형도 나타내지 않는데, 이는 이들 특정 동형체의 표적화가 명백한 독성을 야기하지 않을 것임을 가리킨다.
최근에, 포스포이노시티드-3-키나아제 (PI3K) 경로의 표적화 억제제가 면역조절제로서 제안되어 왔다. 이러한 관심은 PI3K 경로가 주로 막결합된 2차 메신저인 포스파티딜이노시톨 (3,4,5)-트리스포스페이트 (PIP3)의 생성을 통해 면역 세포 신호전달에서 다수의 기능을 한다는 사실에서 비롯된다. PIP3은 단백질 키나아제 및 GTPase를 포함하여, 단백질을 지질 이중층의 세포질 쪽으로 동원하여, 면역 세포 부착, 이동, 및 세포-세포 소통(communication)의 조절에 중요한 하류 신호전달 캐스케이드의 복잡한 네트워크를 개시한다.
4가지 부류 I PI3K 동형체들은 이들의 조직 분포가 상당히 다르다. PI3Kα 및 PI3Kβ는 도처에 존재하며 수용체 티로신 키나아제 (RTK)의 하류에서 활성화되는 반면, PI3K δ 및 PI3K γ는 주로 조혈 및 내피 세포에 제한되며, 각각 RTK, 및 G 단백질 커플링된 수용체 (GPCR)의 하류에서 활성화된다. 마우스 유전적 연구는 PI3Kα 및 PI3Kβ가 정상적인 발달에 필수적인 반면, PI3K δ 및/또는 PI3K γ의 손실이 선택적 면역 결핍을 갖는 생존가능한 자손을 낳는다는 것을 밝혀내었다.
PI3K δ 및 PI3K γ의 발현 패턴 및 기능은 류마티스성 관절염, 알러지, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 및 다발성 경화증을 포함하는 많은 질환을 위한 제제로서 PI3Kδ/γ 억제제를 개발하는데 많은 관심을 일으켜왔다 (Hirsch 등, Pharmacol. Ther ., 118, 192-205, 2008; Marone 등, Biochim . Biophys . Acta ., 1784, 159-185, 2008; Rommel 등, Nat. Rev. Immunol., 7, 191-201, 2007; Ruckle 등, Nat. Rev. Drug Discov ., 5, 903-918, 2006). 약리학적 및 유전적 방법 모두를 이용한 연구들은 이들 2개의 동형체가 종종 서로 상승적인 상호작용을 나타낸다는 것을 보여왔다 (Konrad 등, J. Biol. Chem., 283, 33296-33303, 2008; Laffargue 등, Immunity, 16, 441-451, 2002). 비만 세포에서, 예를 들면, PI3Kδ는 Fc-수용체의 IgE 가교결합에 반응하여 탈과립화 (degranulation)에 필수적이지만 (Ali 등, J . Immunol ., 180, 2538-2544, 2008), PI3Kγ는 상기 반응을 증폭시키는데 중요한 역할을 한다 (Laffargue 등, Immunity, 16, 441-451, 2002). PI3Kγ가 매우 중요한 역할을 하고 PI3Kδ가 각 과정을 증폭시키는, 림프구 회귀 및 중성구 호흡 폭발을 포함하는, 세포 기능에서 유사한 효과가 관찰되어 왔다. 상기 중복되지는 않지만 관련된 PI3Kδ 및 PI3Kγ의 역할들로 인해 상기 2개의 동형체 (단독으로 또는 조합하여) 중 어느 것이 특정한 염증성 장애에서 가장 잘 표적화되는지 결정하기 어려웠다. PI3Kδ 및/또는 PI3Kγ가 부족하거나 또는 PI3Kδ 및 PI3Kγ의 키나아제-사멸 변이체를 발현하는 마우스를 이용한 연구는 이들의 역할을 이해하는데 있어서 귀중한 도구가 되어 왔다. 예를 들면, PI3Kδ 넉아웃 마우스는 감소된 중성구 화학주성, 감소된 항체 생산 (T 세포 의존적 및 독립적) (Jou et 등, Mol . Cell. Biol ., 22, 8580-8591, 2002), 및 더 적은 수의 성숙한 B 세포 (Clayton 등, J. Exp . Med ., 196, 753-763, 2002; Jou 등, Mol. Cell. Biol ., 22, 8580-8591, 2002), 및 항-IgM에 대한 반응으로 이들의 증식의 감소 (Jou 등, 2002)를 입증하였다. 이 표현형은 PI3Kδ 키나아제-사멸 변이체에서 그리고 비만 세포의 감소된 수 및 증식, 및 약화된 알러지 반응과 함께 PI3Kδ 선택적 억제제를 이용하여 복제되었다. 수는 많지만 반응성이 낮은 중성구, 수가 적고 반응성이 낮은 대식세포 및 수지상 세포를 함유한 PI3Kγ 넉아웃은 감소된 비만 세포 탈과립화 (Laffargue 등, 2002), CD4+ 대 CD8+ T 세포의 더 높은 비율), 증가된 흉선세포 세포자멸사, 활성화된 T 세포에 대한 CXCR3의 감소된 유도 및 감소된 심장 수축성을 나타내었다. 심장 조직에 미치는 이러한 후자의 효과는 PI3Kγ 억제제를 환자에게 만성 투여하는데 우려였다. 그러나, 이러한 우려는 PI3Kγ 키나아제- 변이체 (단백질의 손실보다는 키나아제의 억제를 더 잘 모방하는)가 유사한 면역 세포 표현형을 나타내었을 때 크게 완화되었지만, 중요하게는 심장 결함이 없었다. 상기 심장 효과는 이후에 PI3Kγ의 촉매적 활성보다는 스캐폴딩 효과 때문인 것으로 나타났다. 상기 이중 PI3Kδ/PI3Kγ 넉아웃은 생존가능하였지만, T 세포 발달 및 흉선세포 생존에서 심각한 결함을 나타내었다. PI3Kγ 넉아웃/PI3Kδ 키나아제-사멸 조합은 유사한 표현형을 생성하였는데, 이는 적어도 면역계 내에서, PI3Kδ의 역할이 단지 촉매적 역할일 것 같다는 것을 제시한다. 넉아웃 및 키나아제-사멸 마우스를 이용한 연구의 해석은 도전적일 수 있는데, 이들 모델이 면역계의 정상상태 사진만을 제공하고, 일시적 및 용량 제어가 부족하고, 역학적 면역 반응이 가역적 억제에 어떻게 반응할지에 관한 완전한 이해가 가능하지 않기 때문이다. 면역 세포 활성화에 대한 각 PI3K의 상대적인 기여를 평가하기 위해 다양한 프로파일을 갖는 선택적 억제제 (PI3Kδ, PI3Kγ, 및 PI3Kδ/γ)가 백혈구 신호전달의 연구에 필요하다 (본원에 언급된 참조문헌을 포함하여, Olusegon 등, Chemistry & biology, 1, 123-134 (2010))
δ/γ의 이중 억제는 기도의 알러지성 및 비-알러지성 염증 및 다른 자가면역 질환에서 개입 전략으로서 강하게 연루된다. PI3K-δ 및 γ 감마가 천식 및 COPD의 근간이 되는 다양한 세포 과정에 관여한다는 과학적 증거가 억제제 연구 및 유전자-표적화 접근법에서 비롯된다. 또한, 몇 명의 COPD 환자에서 코르티코스테로이드와 같은 종래 요법에 대한 내성은 PI3K δ/γ 경로의 상향조절에 기인해 왔다. 따라서, PI3K- δ/γ 신호전달의 파손은 면역-염증성 반응에 대응하는 것을 목표로 하는 신규 전략을 제공한다. 백혈구 이동 및 활성화, 및 비만 세포 탈과립화와 같은 염증성 세포 기능성을 매개하는데 있어서 PI3K- δ 및 γ에 의해 수행되는 중추적 역할로 인해, 이들 동형체를 차단하는 것은 또한 류마티스성 관절염을 위한 효과적인 전략일 수 있다. 면역 감시에 이들 동형체의 확립된 중요도(criticality)를 고려할 때, δ 및 γ 동형체를 특이적으로 표적화하는 억제제는 기도 염증 및 류마티스성 관절염에서 마주치는 면역 반응의 진행을 약화시킬 것으로 기대될 것이다 (William et.al Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 and Thompson, 등 Chemistry & Biology, 17:101-102, 2010)
PI3K 및 관련 단백질 키나아제 경로에 관한 검토 및 연구가 문헌[Liu et. al., Nature Reviews Drug Discovery, 8, 627-644, 2009); Nathan T. et. al., Mol Cancer Ther., 8(1), 2009; Marone et, al., Biochimica et Biophysica Acta, 1784, 159-185, 2008 and Markman et. al., Annals of Oncology Advance Access, published August 2009]에 제시되어 왔다. 유사하게 PI3K δ 및 γ의 역할에 관한 검토 및 연구가 문헌[William et.al., Chemistry & Biology, 17, 123-134, 2010 and Timothy et.al. J. Med . Chem ., 55 (20), 8559-8581,2012]에 제시되어 왔다. 이들 문헌 개시내용 모두는 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
IPI-145 및 CAL130과 같은 화합물들은 Pi3K δ/γ의 이중 억제제로서 보고되어 왔다. IPI-145는 암, 천식 및 류마티스성 관절염에 대해 임상 조사중이다. IPI-45는 75 mg BID의 최대 용인된 용량 (MTD)을 갖는 것으로 보고되었다 (55th ASH® Annula Meeting New Orleans-LA, Dec 7-10, 2013). CAL-130이 임상 목적을 위해 조사되고 있다는 보고는 없다.
δ/γ PI3K 키나아제-매개된 사건과 연관된 질환 및 장애의 치료를 위해 이중 δ/γ PI3K 조절물질이 여전히 필요하다.
국제공개 제WO 11/055215호 및 제WO 12/151525호 및 미국 공보 제2011/0118257호 및 제2012/0289496호를 추가로 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 PI3K 델타 및 감마 단백질 키나아제의 선택적 이중 억제제에 관한 것이다. 이들 화합물은 PI3K 연관된 질환, 장애 또는 병태, 예를 들면, 암과 같은 증식성 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물에서 사용하는데 적합하다. PI3K 델타 및 감마 단백질 키나아제 모두의 억제는 어떤 질환 및 장애의 치료에서 유익한 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 선택적 이중 억제제는 하기 화합물, 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 이의 전구약물을 포함한다:
(RS)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온. (화합물 A)
(S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온. (화합물 A1)
(R)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온. (화합물 A2)
본 발명의 화합물의 화학 구조가 하기에 나타나 있다.
Figure 112016000775123-pct00001
일 구현예에서, 본 발명은 화합물 (S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 화합물 (S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 (R)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이 실질적으로 없다 (예를 들면, 약 10 중량% 미만, 예컨대 약 5 중량% 미만, 약 2.5 중량% 미만, 약 1 중량% 미만, 약 0.1 중량% 미만을 함유하거나 또는 없음).
또 하나의 구현예에서, 상기 화합물 (S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은 약 90% 초과, 예컨대 약 91% 초과, 약 92% 초과, 약 93% 초과, 약 94% 초과, 약 95% 초과, 약 96% 초과, 약 97% 초과, 약 98% 초과, 약 99% 초과, 약 99.5% 초과, 약 99.9% 초과, 또는 약 99.99% 초과의 거울상이성질체 과잉률을 갖는다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 화합물 (S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온 (화합물 A1)에 관한 것이다.
본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 하나 이상의 화합물 (예컨대 화합물 A1)을 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 활성제 (예컨대 항암제 및 하기 논의된 활성제)를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 화합물의 치료적으로 효과적인 양을 포함한다.
또 하나의 구현예는 본 발명의 적어도 하나의 화합물의 효과적인 양을 환자에게 투여함으로써 환자에서 PI3K 감마 및 델타를 억제하는 방법이다.
또 하나의 구현예는 본 발명의 적어도 하나의 화합물의 효과적인 양을 환자에게 투여함으로써 환자에서 PI3K 단백질 키나아제 매개된 질환, 장애 또는 병태 (예컨대 암 또는 다른 증식성 질환 또는 장애)를 치료하고, 예방하고/하거나 억제하는 방법이다.
본 발명의 또 하나의 구현예는 본 발명의 적어도 하나의 화합물의 효과적인 양을 환자에게 투여함으로써 환자에서 PI3K, 특히 PI3K 델타 및 감마 키나아제를 억제하는 방법이다.
본 발명의 또 하나의 구현예는 본 발명의 적어도 하나의 화합물의 효과적인 양을 그와 같은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 단백질 키나아제 (예컨대 PI3 델타 및 감마 키나아제)의 조절을 통해 염증성, 자가면역 또는 증식성 질환을 치료하는 방법이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 PI3K 델타 및 감마 단백질 키나아제 모두를 억제한다.
본 발명의 또 하나의 구현예는 적어도 하나의 다른 항-염증성, 조절물질 또는 항암제 (또는 이들의 조합)와 조합하여 (동시에 또는 순차적으로), 적어도 하나의 본 발명의 화합물의 효과적인 양을 그와 같은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 단백질 키나아제 (예컨대 PI3 델타 및 감마 키나아제)의 조절을 통해 염증성, 자가면역 또는 증식성 질환을 치료하는 방법이다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 PI3K 델타 및 감마 단백질 키나아제 모두를 억제한다.
본 발명의 화합물은, 비제한적으로 하기를 포함하는 다양한 암의 치료에 유용하다:
비제한적으로, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 소세포 폐암을 포함하는 폐, 식도, 담낭, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 및 편평상피 세포 암종을 포함하는 피부의 암종을 포함하는, 암종;
비제한적으로, 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발 세포 림프종 및 버킷 림프종을 포함하는, 림프성 계통의 조혈 종양;
비제한적으로, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구 백혈병을 포함하는, 골수 계통의 조혈 종양;
비제한적으로, 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는, 간엽 기원의 종양;
비제한적으로, 별아교세포종, 신경교세포종, 신경아교종 및 신경집종을 포함하는, 중추 및 말초 신경계의 종양; 및
비제한적으로, 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포성 암 및 카포시 육종을 포함하는, 다른 종양.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발 세포 림프종, 버킷 림프종, 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구 백혈병을 치료하기 위해 투여된다.
일반적으로 세포성 증식의 조절에서 단백질 키나아제의 핵심적인 역할로 인해, 본 발명의 단백질 키나아제 억제제는 가역적 세포증식억제제로서 작용할 수 있고, 따라서 비정상인 세포 증식을 특징으로 하는 어떤 질환 과정, 예를 들면, 양성 전립선 과다형성, 가족성 선종증 용종증, 신경-섬유종증, 죽상경화증, 폐 섬유증, 관절염, 건선, 사구체신염, 혈관성형술 또는 혈관 수술 후 재협착증, 비대성 반흔 형성, 염증성 장 질환, 이식 거부, 내독소 충격, 및 진균 감염의 치료에 유용할 수 있다.
세포자멸사의 조절물질로서 본 발명의 화합물은 암 (비제한적으로 상기 본원에 언급된 유형들을 포함함), 바이러스성 감염 (비제한적으로, 헤르페스 바이러스, 폭스바이러스, 엡슈타인-바르 바이러스, 신드비스 바이러스 및 아데노바이러스를 포함함), 자가면역 질환 (비제한적으로, 전신 낭창, 홍반성, 자가면역 매개된 사구체신염, 류마티스성 관절염, 건선, 염증성 장 질환, 및 자가면역 진성 당뇨병을 포함함), 신경퇴행성 장애 (비제한적으로, 알츠하이머병, AIDS-관련된 치매, 파킨슨병, 근위축 측삭 경화증, 색소성 망막염, 척수성 근육 위축증 및 소뇌 변성을 포함함), 골수이형성 증후군, 재생불량빈혈, 심근경색증과 연관된 허혈성 부상, 뇌졸중 및 재관류 부상, 부정맥, 죽상경화증, 독소-유도된 또는 알코올 관련된 간 질환, 혈액 질환 (비제한적으로, 만성 빈혈 및 재생불량빈혈을 포함함), 근골격 시스템의 퇴행성 질환 (비제한적으로, 골다공증 및 관절염을 포함함) 아스피린-민감성 비부비동염, 낭포성 섬유증, 다발성 경화증, 신장 질환 및 암 통증의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 HIV-감염된 개인에서 AIDS 발달의 예방, 저해, 또는 억제에 유용하다.
본 발명의 화합물은 세포성 RNA 및 DNA 합성의 수준을 조절할 수 있다. 이들 제제들은 따라서 비제한적으로, HIV, 인간 유두종 바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 엡슈타인-바르 바이러스, 신드비스 바이러스 및 아데노바이러스를 포함하는, 바이러스성 감염의 치료에 유용하다.
본 발명의 화합물은 암의 화학예방에 유용하다. 화학예방은 돌연변이유발 사건을 개시하는 것을 차단하거나 또는 손상을 이미 겪은 전암 세포의 진행을 차단함으로써 침윤성 암의 발달을 억제하는 것 또는 종양 재발을 억제하는 것으로서 정의된다. 본 발명의 화합물은 또한 종양 신생혈관형성 및 전이를 억제하는데 유용하다. 본 발명의 하나의 구현예는 본 발명의 하나 이상의 화합물의 효과적인 양을 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자에서 종양 신생혈관형성 또는 전이를 억제하는 방법이다.
본 발명의 또 하나의 구현예는 면역계-관련된 질환 (예를 들면, 자가면역 질환), 염증을 수반하는 질환 또는 장애 (예를 들면, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 사구체신염, 신경염증성 질환, 다발성 경화증, 포도막염 및 면역계의 장애), 암 또는 다른 증식성 질환, 간질환 또는 장애, 신장 질환 또는 장애를 치료하는 방법이다. 이 방법은 본 발명의 하나 이상의 화합물의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다.
면역 장애의 예는, 비제한적으로, 건선, 류마티스성 관절염, 혈관염, 염증성 장 질환, 피부염, 골관절염, 천식, 염증성 근육 질환, 알러지성 비염, 질염, 간질성 방광염, 경피증, 골다공증, 습진, 동종 또는 이종 이식 (장기, 골수, 줄기세포 및 다른 세포 및 조직) 이식 거부, 이식편대 숙주 질환, 홍반성 낭창, 염증성 질환, I형 당뇨병, 폐 섬유증, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 갑상선염 (예를 들면, 하시모토 및 자가면역 갑상선염), 중증 근무력증, 자가면역 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 낭포성 섬유증, 만성 재발성 간염, 원발성 담도성 간경변증, 알러지성 결막염 및 아토피 피부염을 포함한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 화합물은 이식 거부, 동종 또는 이종 이식 거부 (장기, 골수, 줄기세포, 다른 세포 및 조직), 및 이식편대 숙주 질환에 대한 면역억제제로서 유용하다. 다른 구현예에서, 이식 거부는 조직 또는 장기 이식으로부터 비롯된다. 추가 구현예에서, 이식편대 숙주 질환은 골수 또는 줄기 세포 이식으로부터 비롯된다. 하나의 구현예는 본 발명의 하나 이상의 화합물의 효과적인 양을 투여함으로써 이식 거부, 동종 또는 이종 이식 거부 (장기, 골수, 줄기세포, 다른 및 조직), 또는 이식편대 숙주질환을 예방하거나 이의 위험성을 감소시키는 방법이다.
본 발명의 화합물은 또한 공지된 항암 치료, 예컨대 방사선 요법 또는 세포증식억제제 또는 세포독성제 또는 항암제, 예컨대, 예를 들면, DNA 상호작용제, 예컨대 시스플라틴 또는 독소루비신; 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 에토포사이드; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 CPT-11 또는 토포테칸; 천연 발생 또는 합성인 튜불린 상호작용제, 예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에포틸론 (예를 들면 익사베필론); 호르몬제, 예컨대 타목시펜; 티미딜레이트 합성효소 억제제, 예컨대 5-플루오로우라실; 및 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 다른 티로신 키나아제 억제제 예컨대 이레싸 및 OSI-774; 신생혈관형성 억제제; EGF 억제제; VEGF 억제제; CDK 억제제; SRC 억제제; c-Kit 억제제; Her1/2 억제제 및 어비툭스 (EGF) 및 헤르셉틴 (Her2)과 같이 성장 인자 수용체에 대해 유도된 단클론성 항체 및 다른 단백질 키나아제 조절물질과 조합되어 (함께 또는 순차적으로 투여됨) 유용하다.
본 발명의 화합물은 또한 하나 이상의 스테로이드 항-염증성 약물, 비-스테로이드 항-염증성 약물 (NSAIDs) 또는 면역 선택적 항-염증성 유도체 (ImSAIDs)와 조합되어 (함께 또는 순차적으로 투여됨) 유용하다.
본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 상기 확인된 하나 이상의 활성 성분, 예컨대 다른 항암제를 더 포함할 수 있다.
또 하나의 구현예는 본 발명의 화합물의 치료적으로 효과적인 양을 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종 (HL) 급성 골수 백혈병 (AML), 다발성 골수종 (MM), 소 림프구 림프종 (SLL), 및 지연성 비-호지킨 림프종 (I-NHL)을 치료하는데 효과적이다.
또 하나의 구현예는 본 발명의 화합물의 치료적으로 효과적인 양을 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자에서 백혈병을 치료하는 방법이다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 천식, COPD, 류마티스성 관절염, 건선, 낭창 및 실험적인 자가면역 뇌척수염 (EAE)과 같은 자가면역 장애를 치료하는데 효과적이다.
또 하나의 구현예는 본 발명의 화합물의 치료적으로 효과적인 양을 투여함으로써 이를 필요로 하는 환자에서 알러지성 비염을 치료하는 방법이다.
도면의 간단한 설명
도면의 간단한 설명
도 1은 분석 7에 기재된 지질다당류 유도된 폐 호중구증가증 (neutrophilia) 모델에 따라 0, 0.3, 1, 3, 및 10 mg/kg의 화합물 A1 (po)로 처리된 동물로부터의 기관지폐포 세척액 (BALF)에서 중성구 수의 막대 그래프를 나타낸다.
도 2는 분석 8에 기재된 지질다당류-유도된 랫트 공기 주머니 염증 모델에 따라 0, 1, 3, 및 10 mg/kg의 화합물 A1 (po)로 치료된 동물로부터의 복막 세척액에서 중성구 수의 막대 그래프를 나타낸다.
도 3은 분석 9에 기재된 절차에 따라 0, 1, 3, 및 10 mg/kg의 화합물 A1 (po)의 투여 후 단식한 암컷 위스타 랫트에서 지질다당류-유도된 혈장 TNF-α 농도의 막대 그래프를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 메타콜린 공격 및 분석 10A에서의 절차에 따라 OVA/SAL 또는 OVA/OVA 또는 0.3, 1, 또는 3 mg/kg 화합물 A1 처리 후 감작화된 수컷 기니아 피그에서, 증대된 정지 (enhanced pause; Penh) 또는 PEF/PIF (최대 호기 유속 / 최대 최대 흡기 유속) 비의 그래프를 각각 나타낸다.
도 4c-4e는 난백알부민-감작화된 수컷 기니아 피그 및 분석 10A에서의 절차에 따라 0, 0.3, 1, 또는 3 mg/kg 화합물 A1의 처리에서, BALF에서 호산구 수, BALF에서 총 세포수, 및 백분율 호산구의 막대 그래프를 각각 나타낸다.
도 5a 및 5b는 메타콜린 공격 및 분석 10B에서의 절차에 따라 SAL/SAL, OVA/SAL 또는 OVA/OVA 또는 3 mg/kg 화합물 A1을 이용한 처리 후 난백알부민-감작화된 마우스에서 Penh 또는 PEF/PIF 비의 그래프를 각각 나타낸다.
도 5c-5e는 난백알부민-감작화된 마우스 및 분석 10B에서의 절차에 따라 0 또는 3 mg/kg 화합물 A1으로 처리된 마우스에서, BALF에서의 호산구 수, BALF에서의 총 세포수, 및 백분율 호산구의 막대 그래프를 각각 나타낸다.
도 6a 및 6b는 분석 11에서의 절차에 따라 대조군 또는 15 mg/kg/BID의 화합물 A1으로 처리된 루이스 랫트를 이용하여 콜라겐 유도된 관절염에서, 발목 및 무릎에 대한 개별적인 조직병리적 스코어의 막대 그래프를 각각 나타낸다.
도 6c 및 6d는 분석 11에서의 절차에 따라 비히클 또는 15 mg/kg/BID의 화합물 A1로 처리된 루이스 랫트를 이용한 콜라겐 유도된 관절염 모델에서, 발목 및 무릎에 대한 합산된 조직병리적 스코어의 막대 그래프를 각각 나타낸다.
도 7A 및 7b는 분석 15에서 기재된 바와 같은 담배 연기 유도된 세포 침윤 모델에서 수컷 Balb/c 마우스에서 0.3, 1, 또는 3 mg/kg/BID의 화합물 A1의 투여 후 BALF에서, 대식세포 및 중성구 세포수의 막대 그래프를 각각 나타낸다.
도 8은 분석 3에서의 절차에 따라 화합물 A1에 의한 백혈성 세포주 (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78, 및 HuT-102)에서의 AKT 인산화의 억제를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 9는 분석 4에서의 절차에 따라 화합물 A1에 의해 인간 전혈에서 fMLP 또는 항-FcεR1에 의해 유도된 CD63 양성 세포의 백분율에서의 억제를 보여주는 그래프를 나타낸다.
도 10은 분석 6D에 따라 화합물 A에 의한 항-인간 CD3/CD28-유도된 사이토카인 (TNFα, IFNγ 및 IL2)의 억제를 보여주는 그래프를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본원에서 사용된 바와 같이 하기 정의는 달리 지적되지 않는 한 적용될 것이다. 또한, 본원에 정의된 많은 그룹은 임의로 치환될 수 있다. 상기 정의에서 치환체의 목록은 예시적이며 명세서에서 다른 곳에 정의된 치환체를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 기재된 어떤 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하므로, 절대 입체화학 측면에서 (R)- 또는 (S)-로서 정의될 수 있는 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 다른 입체이성질체 형태를 야기할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 화학적 독립체, 약제학적 조성물 및 방법은 라세미 혼합물, 광학적으로 순수한 형태 및 중간체 혼합물을 포함하는, 모든 그러한 가능한 이성질체를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 중간체 혼합물의 비제한적인 예는 10:90, 13:87, 17:83, 20:80, 또는 22:78의 비의 R:S 또는 S:R 이성질체의 혼합물을 포함한다. 광학 활성 (R)- 및 (S)- 이성질체는 키랄 신톤 또는 키랄 시약을 이용하여 제조되거나, 또는 종래의 기술을 이용하여 분해될 수 있다. 본원에 기재된 화합물이 올레핀성 이중 결합 또는 기하학적 비대칭의 다른 중심을 함유하고, 달리 명시되지 않는 한, 상기 화합물은 E 및 Z 기하 이성질체 모두를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "타우토머"는 평형 상태에서 이성질체 형태들의 상대적으로 쉬운 상호전환을 특징으로 하는 화합물을 지칭한다. 이들 이성질체는 본 발명에 의해 보호되는 것으로 의도된다. "타우토머"는 타우토머화에 의해 상호전환되는 구조적으로 뚜렷이 다른 이성질체이다. "타우토머화"는 이성질체화의 형태이며 양성자성 또는 양성자-이동 타우토머화를 포함하고, 이는 산-염기 화학의 하위부류인 것으로 간주된다. "양성자성 타우토머화" 또는 "양성자-이동 타우토머화"는 결합 차수 변화, 종종 단일 결합을 인접한 이중 결합으로 교체하는 것을 동반한 양성자의 이동을 포함한다. 타우토머화가 가능한 경우(예를 들면 용액에서), 타우토머의 화학적 평형에 이를 수 있다. 타우토머화의 예는 케토-에놀 타우토머화이다. 케노-에놀 타우토머화의 구체적인 예는 펜탄-2,4-디온 및 4-하이드록시펜트-3-엔-2-온 타우토머의 상호전환이다. 타우토머화의 또 하나의 예는 페놀-케토 타우토머화이다. 페놀-케토 타우토머화의 구체적인 예는 피리딘-4-올 및 피리딘-4(1H)-온 타우토머의 상호전환이다.
용어 "전구약물"은 정상적인 대사 과정에 의해 체내에서 활성 형태로 변환되는 화합물의 불활성 전구체 화합물을 지칭한다. 전구약물 설계는 문헌[Hardma, 등 (Eds.), Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th ed., pp. 11-16 (1996)]에서 일반적으로 논의된다. 철저한 논의는 문헌[Higuchi, 등, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, ASCD Symposium Series, and in Roche (ed.), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press (1987)]에서 제공된다. 예시를 위해, 전구약물은, 예를 들면, 에스테르 또는 아미드 연결의 가수분해를 통해 약리적 활성 형태로 변환될 수 있고, 그렇게 함으로써 수득된 생성물 상에 작용기를 도입하거나 노출시킨다. 전구약물은 내인성 화합물과 반응하여 화합물의 약리적 특성, 예를 들면, 순환 반감기 증가를 더 향상시키는 수용성 콘주게이트를 형성하도록 설계될 수 있다. 대안적으로, 전구약물은, 예를 들면, 글루쿠론산, 설페이트, 글루타티온, 아미노산, 또는 아세테이트를 이용하여 작용기 상에서 공유 변형을 겪도록 설계될 수 있다. 수득한 콘주게이트는 불활성화되어 소변으로 배출되거나, 모 화합물보다 더 효능이 강하게 될 수 있다. 고분자량 콘주게이트는 또한 담즙 내로 배출되고, 효소에 의해 절단되며, 순환 내로 다시 방출될 수 있으며, 그렇게 함으로써 본래 투여된 화합물의 생물학적 반감기를 효과적으로 증가시킬 수 있다.
용어 "에스테르"는 물이 제거되면서 산과 알코올 사이의 반응에 의해 형성된 화합물을 지칭한다. 에스테르는 일반식 RCOOR' (여기서 R은 약물이고 R'는 화학적 그룹이다)로 표시될 수 있다.
이들 전구약물 및 에스테르는 본 발명의 범위 내에서 보호되는 것으로 의도된다.
추가로 본 발명은 또한 하나 이상의 동위원소적으로 농축된 원자의 존재만이 상이한 화합물, 예를 들면 수소를 중수소 또는 삼중수소로 대체, 또는 탄소를 13C- 또는 14C-농축된 탄소로 대체만이 상이한 화합물을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 그러한 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에 비천연 비율의 원자 동위원소를 함유할 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 예를 들면 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I) 또는 탄소-14 (14C)와 같은 방사성 동위원소로 방사성 표지될 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 동위원소적 변화는 방사성이든 아니든 간에, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 약제학적으로 허용가능한 염 형성 부분은 Li, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, 및 Mn과 같은 무기 염기로부터 유래된 염; N,N'-디아세틸에틸렌디아민, 글루카민, 트리에틸아민, 콜린, 하이드록사이드, 디사이클로헥실아민, 메트포르민, 벤질아민, 트리알킬아민, 및 티아민과 같은 유기 염기의 염; 알킬페닐아민, 글리시놀, 및 페닐 글리시놀과 같은 키랄 염기; 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 노르류신, 티로신, 시스틴, 시스테인, 메티오닌, 프롤린, 하이드록시 프롤린, 히스티딘, 오미틴, 라이신, 아르기닌, 및 세린과 같은 천연 아미노산의 염; MeI 및 (Me)2SO4와 같은 알킬 할라이드, 알킬 설페이트를 이용한 본 발명의 화합물의 사급 암모늄 염; D-이성질체 또는 치환된 아미노산과 같은 비-천연 아미노산; 구아니딘; 및 치환된 구아니딘을 포함하고, 여기서 상기 치환체는 니트로, 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 암모늄 또는 치환된 암모늄 염 및 알루미늄 염으로부터 선택된다. 염은 산 부가염을 포함할 수 있고, 이는 설페이트, 니트레이트, 포스페이트, 퍼클로레이트, 보레이트, 하이드로할라이드, 아세테이트, 타르트레이트, 말레에이트, 시트레이트, 푸마레이트, 석시네이트, 팔모에이트, 메탄설포네이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 벤젠설포네이트, 아스코르베이트, 글리세로포스페이트, 및 케토글루타레이트일 수 있다.
분자량과 같은 물리적 특성, 또는 화학식과 같은 화학적 특성에 대해 본원에서 범위가 사용될 때, 범위 및 특정 구현예의 모든 조합 및 하위조합이 포함되는 것으로 의도된다. 수 또는 수치 범위에 대해 언급될 때 용어 "약"은 상기 언급된 수 또는 수치 범위가 실험적인 가변성 이내 (또는 통계적 실험 오차 이내)의 근사치임을 의미하며, 따라서 상기 수 또는 수치 범위는, 예를 들면, 상기 언급된 수 또는 수치 범위의 1% 내지 15% 사이로 달라질 수 있다. 용어 "포함하는" (및 "포함하다" 또는 "갖는"과 같은 관련 용어들)은, 상기 구현예들, 예를 들면 상기 기재된 특징으로 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 물질의 어느 조성, 조성물, 방법, 또는 공정 등의 구현예를 포함한다.
하기 약어 및 용어들은 전반적으로 명시된 의미를 갖는다: PI3-K = 포스포이노시티드 3-키나아제; PI = 포스파티딜이노시톨; AIDS = 후천성 면역 결핍 증후군; HIV = 인간 면역결핍 바이러스; MeI = 메틸 아이오다이드; ND: 결정되지 않음.
본원에 사용된 약어는 화학 및 생물학 분야 내에서 종래의 의미를 갖는다.
용어 "세포 증식"은 분할 결과 세포 수가 변화된 현상을 지칭한다. 이 용어는 또한 증식성 신호와 일치하게 세포 형태학이 변화된 (예를 들면, 크기가 증가된) 세포 성장을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "공-투여," "병용 투여된," 및 그것의 문법적 동등물은 제제 및/또는 그것의 대사물 모두가 동물 내에 동시에 존재하도록 동물에게 2 이상의 제제를 투여하는 것을 포함한다. 공-투여는 개별적인 조성물로 동시 투여, 개별적인 조성물로 상이한 시간에 투여, 또는 두 제제가 존재하는 조성물로 투여를 포함한다.
용어 "효과적인 양" 또는 "치료적으로 효과적인 양"은 아래 정의된 바와 같은 질환 치료를 비제한적으로 포함하는 의도된 적용을 달성하는데 충분한 본원에 기재된 화합물의 양을 지칭한다. 상기 치료적으로 효과적인 양은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료될 대상체 및 질환 상태, 예를 들면, 상기 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서 특정한 반응, 예를 들면 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소를 유도할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 화합물, 뒤따를 투여 레지멘, 다른 화합물과 병용 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여될 조직, 및 전달되는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료," "치료하는," 또는 "개선하는"은 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어들은 비제한적으로, 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 치료적 이점은 치료될 기저 장애의 박멸 또는 개선을 의미한다. 또한, 치료적 이점은 환자가 상기 기저 장애로 여전히 괴로울 수 있음에도 불구하고, 환자에서 개선이 관찰되도록, 기저 장애와 연관된 하나 이상의 생리적 증상의 박멸 또는 개선으로 달성된다. 예방적 이점의 경우, 이 질환의 진단이 이뤄지지 않았을 수 있음에도 불구하고, 상기 조성물은 특정 질환이 생길 위험성이 있는 환자에게, 또는 질환의 하나 이상의 생리적 증상을 보고하는 환자에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "치료 효과"는 상기에서 기재된 바와 같은 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함한다. 예방적 효과는 질환 또는 병태의 출현을 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 병태의 증상의 개시를 지연시키거나 제거하는 것, 질환 또는 병태의 진행을 늦추거나, 멈추게 하거나, 또는 역전시키는 것, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 동물 (예를 들면, 개, 고양이, 말, 또는 돼지), 예컨대 포유동물, 예를 들면 인간을 지칭한다. 본원에서 기재된 방법은 인간 치료학 및 수의적 적용 모두에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 환자는 포유동물이고, 일부 구현예에서, 상기 환자는 인간이다.
"방사선 요법"은 의사에게 공지된 일상적인 방법 및 조성물을 이용하여 환자를 방사선 에미터, 예컨대 α-입자 발광 방사선핵종 (예를 들면, 악티늄 및 토륨 방사선핵종), 저 선형 에너지 전달 (LET) 방사선 에미터 (즉 베타 에미터), 전환 전자 에미터 (예를 들면 스트론튬-89 및 사마륨- 153-EDTMP), 또는 비제한적으로, x-선, 감마선, 및 중성자를 포함하는 고-에너지 방사선에 노출시키는 것을 의미한다.
"신호 전달"은 자극 또는 억제 신호가 세포 내로 전달되어 세포내 반응을 유발하는 과정이다. 신호 전달 경로의 조절물질은 동일한 특정 신호 전달 경로에 맵핑된 하나 이상의 세포성 단백질의 활성을 조절하는 화합물을 지칭한다. 조절물질은 신호전달 분자의 활성을 증가시키거나 (작용제) 또는 억제 (길항제)할 수 있다.
생물학적 활성제에 적용된 용어 "선택적 억제" 또는 "선택적으로 억제하다"는 표적과의 직접 또는 간접적 상호작용을 통해, 부정확한 신호전달 활성과 비교하여 표적 신호전달 활성을 선택적으로 감소시키는 제제의 능력을 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는, 비제한적으로, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 하나 이상의 적합한 희석제, 충전제, 염, 붕해제, 결합제, 윤활제, 활제, 습윤제, 제어 방출 매트릭스, 착색제/풍미제, 담체, 부형제, 버퍼, 안정제, 가용화제, 및 이들의 조합을 포함한다. 활성 성분과 양립하지 않는 임의의 종래의 매질 또는 제제를 제외하는 한, 본 발명의 치료적 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분들이 또한 상기 조성물 내로 포함될 수 있다.
어떤 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물들은 PI3 키나아제 또는 mTor, DNA-의존적 단백질 키나아제 (Pubmed protein accession number (PPAN) AAA79184), AbI 티로신 키나아제 (CAA52387), Bcr-Abl, 조혈 세포 키나아제 (PPAN CAI19695), Src (PPAN CAA24495), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (PPAN ABB82619), 표피 성장 인자 수용체 (PPAN AG43241), EPH 수용체 B4 (PPAN EAL23820), 줄기세포 인자 수용체 (PPAN AAF22141), 티로신-단백질 키나아제 수용체 TIE-2 (PPAN Q02858), fms-관련된 티로신 키나아제 3 (PPAN NP_004110), 혈소판-유도된 성장 인자 수용체 알파 (PPAN NP_990080), RET (PPAN CAA73131), 및 임의의 다른 관련된 단백질 키나아제로부터 선택된 단백질 키나아제뿐만 아니라 이의 어떤 기능적 변종에 특이적으로 결합한다.
다른 구현예에서, pi 10α, pi 10β, pi 10γ, 또는 pi 10δ에 대해 본원에서 기재된 화합물의 IC50은 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 10 nM 미만, 1 nM 미만 또는 약 0.5 nM 미만이다. 일부 구현예에서, mTor에 대해 본원에서 기재된 화합물의 IC50은 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 10 nM 미만, 1 nM 미만 또는 약 0.5 nM 미만이다. 일부 다른 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물은 이중 결합 특이성을 나타내고 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 10 nM 미만, 1 nM 미만 또는 약 0.5 nM 미만의 IC50 값으로 PI3 키나아제 (예를 들면, 클래스 I PI3 키나아제) 뿐만 아니라 단백질 키나아제 (예를 들면, mTor)를 억제할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 화합물은 본원에 개시된 하나 이상의 기능적 특성을 나타낸다. 예를 들면, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물은 PI3 키나아제에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, pi 10α, pi 10β, pi 10γ, 또는 pi 10δ에 대해 본원에서 기재된 화합물의 IC50은 약 1 μM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 0.5 nM 미만, 약 100 pM 미만, 또는 약 50 pM 미만이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 시험관내 키나아제 분석에서 측정된 바와 같이 약 100 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하, 약 100 pM 이하, 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하의 IC50 값으로 유형 I 또는 클래스 I 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3-키나아제)의 하나 이상의 멤버를 선택적으로 억제한다.
또 하나의 측면에서, 유형 I PI3-키나아제의 하나 이상의 멤버를 선택적으로 억제하는 억제제, 또는 하나 이상의 유형 I PI3-키나아제 매개된 신호전달 경로를 선택적으로 억제하는 억제제는, 대안적으로 다른 유형 I PI3 -키나아제의 나머지에 대해 억제제의 IC50보다 적어도 10-배 더 낮거나, 적어도 20-배 더 낮거나, 적어도 50-배 더 낮거나, 적어도 100-배 더 낮거나, 적어도 1000-배 더 낮은, 주어진 유형 I PI3-키나아제에 대해 50% 억제 농도 (IC50)를 나타내는 화합물을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 PI3-키나아제 δ / γ 억제제" 및 "이중 PI3-키나아제 δ / γ 선택적 억제제"는 PI3K 패밀리의 다른 동질효소보다 더 효과적으로 PI3-키나아제 δ 및 γ 동질효소 모두의 활성을 억제하는 화합물을 지칭한다. 따라서, 이중 PI3-키나아제 δ / γ 억제제는 비선택적 PI3K 억제제인 CAL-130, 보르트만닌 및 LY294002와 같은 종래의 PI3K 억제제보다 PI3-키나아제 δ 및 γ에 대해 더 선택적이다.
PI3-키나아제 δ 및 γ의 억제는 다양한 병태, 예를 들면, 비제한적으로, 자가면역 질환, 알러지성 질환, 및 관절염 질환을 포함하는 염증성 반응을 특징으로 하는 병태의 치료에 치료적 이점이 있을 수 있다. 중요하게, PI3-키나아제 δ 및 γ 기능의 억제는 생존력 및 생식능력과 같은 생물학적 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
본원에서 사용된 바와 같이 "염증성 반응"은 적열상태, 열, 팽윤 및 통증 (즉, 염증)을 특징으로 하며 전형적으로 조직 손상 또는 파괴를 수반한다. 염증성 반응은 일반적으로 조직의 손상 또는 파괴에 의해 유발된 국재화된 보호 반응이며, 이는 손상 제제 및 손상된 조직 모두를 파괴하거나, 분리시키는 (격리시키는) 역할을 한다. 염증성 반응은 백혈구의 유입 및/또는 백혈구 (예를 들면, 중성구) 화학주성과 현저히 연관된다. 염증성 반응은 병원체 유기체 및 바이러스로 감염, 비감염성 수단, 예컨대 심근경색증 또는 뇌졸중 후 외상 또는 재관류, 외래 항원에 대한 면역 반응, 및 자가면역 질환으로부터 야기될 수 있다. 본 발명에 따른 방법 및 화합물을 이용한 치료를 잘 받아들이는 염증성 반응은 특이적 방어 시스템의 반응과 연관된 병태 뿐만 아니라 비-특이적 방어 시스템의 반응과 연관된 병태를 포함한다.
본 발명의 치료 방법은 염증 세포 활성화와 연관된 병태의 개선을 위한 방법을 포함한다. "염증 세포 활성화"는 염증 세포 (비제한적으로 단핵구, 대식세포, T 림프구, B 림프구, 과립구 (중성구, 호염기구, 및 호산구를 포함하는 다형핵 백혈구) 비만 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 및 내피 세포를 포함함)에서 증식성 세포성 반응의 자극 (비제한적으로, 사이토카인, 항원 또는 자가-항체를 포함함), 가용성 매개체 (비제한적으로 사이토카인, 산소 라디칼, 효소, 프로스타노이드, 또는 혈관활성 아민을 포함함)의 생산, 또는 새로운 또는 증가된 수의 매개체의 세포 표면 발현 (비제한적으로, 주 조직적합성 항원 또는 세포 부착 분자)에 의한 유도를 지칭한다. 이들 세포에서 이들 표현형 중 하나 또는 조합의 활성화가 염증성 병태의 개시, 영속화, 또는 악화에 기여할 수 있다는 것이 당해분야의 숙련가에 의해 인식될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이 "자가면역 질환"은 조직 손상이 몸의 구성요소에 대한 체액성 또는 세포-매개성 반응과 연관된 장애의 어느 그룹을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "이식 거부"는 그라프팅된 조직 (그라프팅된 주변 조직의 기능의 손실, 통증, 팽윤, 백혈구증가증, 및 혈소판감소증을 특징으로 하는, 기관 또는 세포 (예를 들면, 골수)를 포함함)에 대해 유도된 임의의 면역 반응을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "알러지성 질환"은 알러지로부터 비롯되는 임의의 증상, 조직 손상, 또는 조직 기능의 손실을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "관절염 질환"은 다양한 원인론에 기인하는 관절의 염증성 병변을 특징으로 하는 임의의 질환을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 "피부염"은 다양한 원인론에 기인하는 피부의 염증을 특징으로 하는 피부의 질환의 임의의 거대한 패밀리를 지칭한다.
이전에 기재된 바와 같이, 용어 "이중 PI3-키나아제 δ / γ 선택적 억제제"는 일반적으로 PI3K 패밀리의 다른 동질효소보다 더 효과적으로 PI3-키나아제 δ 및 γ 동질효소의 활성을 억제하는 화합물을 지칭한다. 효소 활성 (또는 다른 생물학적 활성)의 억제제로서 화합물의 상대적인 효능은 각각의 화합물이 미리 정의된 정도까지 활성을 억제하는 농도를 결정한 다음 그 결과를 비교함으로써 확립될 수 있다. 전형적으로, 상기 바람직한 결정은 생화학적 분석에서 활성의 50%를 억제하는 농도, 즉, 50% 억제 농도 또는 "IC50"이다. IC50 결정은 본 기술분야에서 공지된 종래의 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 일반적으로, IC50은 실험하에 일정한 범위의 농도의 억제제의 존재하에 주어진 효소의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 그리고 나서, 상기 실험적으로 수득된 효소 활성값이 사용된 억제제 농도에 대해 플롯팅된다. 50% 효소 활성을 나타내는 억제제의 농도 (임의의 억제제의 부재시 활성과 비교하여)는 IC50 값으로서 간주된다. 유사하게, 다른 억제 농도는 활성의 적절한 결정을 통해 정의될 수 있다. 예를 들면, 일부 설정에서는, 90% 억제 농도, 즉, IC90 등을 확립하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서, 이중 PI3-키나아제 δ / γ 선택적 억제제는 대안적으로 임의의 또는 모든 다른 클래스 I PI3K 패밀리 멤버에 대한 IC50 값보다 적어도 10-배 낮거나, 적어도 20-배 낮거나, 또는 적어도 30-배 낮은, PI3-키나아제 δ 및 γ에 대해 50% 억제 농도 (IC50) 를 나타내는 화합물을 지칭하는 것을 이해될 수 있다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 용어 이중 PI3-키나아제 δ / γ 선택적 억제제는 임의의 또는 모든 다른 PI3K 클래스 I 패밀리 멤버에 대한 IC50보다 적어도 30-배 낮거나, 적어도 50-배 낮거나, 적어도 100-배 낮거나, 적어도 200-배 낮거나, 또는 적어도 500-배 낮은 PI3-키나아제 δ 및 γ에 대한 IC50을 나타내는 화합물을 지칭하는 것으로 이해될 수 있다. 이중 PI3-키나아제 δ / γ 선택적 억제제는 상기에서 기재된 바와 같이 PI3-키나아제 δ 및 γ 활성 모두를 선택적으로 억제하는 양으로 전형적으로 투여된다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 화합물은 거의 동등하게 (~ 1:1) 또는 1:5의 최대 비율로 PI3-키나아제 δ 및 γ 억제를 나타내며, 즉, 본 발명의 화합물은 PI3-키나아제 δ 및 γ 효소 모두에 대해 거의 동일한 IC50 값, 또는 상기 둘 사이에 최대 3 내지 8배 차이를 나타낸다
본 발명의 방법은 생체내 또는 생체외에서 세포 집단에 적용될 수 있다. "생체내"는 동물 또는 인간 내에서 또는 대상체의 몸에서와 같이, 살아있는 개체 내에서를 의미한다. 이 맥락에서, 본 발명의 방법은 개체에서 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다. "생체외" 또는 "시험관내"는 살아있는 개체의 외부를 의미한다. 생체외 세포 집단의 예는 시험관내 세포 배양 및 비제한적으로 개체로부터 수득된 유체 또는 조직 샘플을 포함하는 생물학적 샘플을 포함한다. 그와 같은 샘플은 당해분야에서 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예시적인 생체액 샘플은 혈액, 뇌척수액, 소변, 및 타액을 포함한다. 예시적인 조직 샘플은 종양 및 이의 생검을 포함한다. 이 맥락에서, 본 발명은 치료적 및 실험적인 목적을 포함하는, 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 주어진 적응증, 세포 유형, 개인, 및 다른 파라미터에 대해 PI3-키나아제 δ 선택적 억제제의 투여의 최적의 계획 및/또는 투여를 결정하기 위해 생체외 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 그러한 사용으로부터 얻은 정보는 생체내 치료를 위한 프로토콜을 설정하기 위해 실험 또는 진단 목적을 위해 또는 병원에서 사용될 수 있다. 본 발명이 적합할 수 있는 다른 생체외 용도가 하기에 기재되어 있으며, 이는 당해분야의 숙련가에게 명백해질 될 것이다.
본 발명의 화합물은 당해분야에서 공지된 방법, 예컨대 국제공개 제WO 2011/055215호, 제WO 2012/151525호, 및 제WO 2013/164801호에 기재된 것에 의해 제조될 수 있으며, 이들 모두가 참고로 편입되어 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물의 치료적으로 효과적인 양을 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 추가의 활성 성분을 포함할 수 있다.
상기 약제학적 담체 및/또는 부형제는 희석제, 충전제, 염, 붕해제, 결합제, 윤활제, 활제, 습윤제, 제어 방출 매트릭스, 착색제, 풍미제, 버퍼, 안정제, 가용화제, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 약 0.1 mg 내지 약 1,000 mg, 예컨대 약 1 mg 내지 약 1,000 mg 또는 약 20 mg 내지 약 800 mg 또는 50 mg 내지 약 600 mg 또는 50 mg 내지 약 600 mg의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함한다. 100 mg 내지 약 400 mg의 본 발명의 하나 이상의 화합물을 함유한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여되거나 하나 이상의 다른 활성제와 병용하여 투여될 수 있다. 원하는 경우, 상기 대상 화합물 및 다른 제제(들)은 조제물 내로 혼합될 수 있거나 또는 두 성분들은 이들을 별개로 또는 동시에 병용하여 사용하기 위해 개별적인 조제물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물은 경구로, 비강내로, 국소로 (예를 들면, 경피로), 십이지장내로, 비경구로 (정맥내로, 동맥내로, 근육내로, 혈관내로, 복강내로 또는 주사로 또는 주입을 포함함), 진피내로, 유선내에 의해, 척추강내로, 안구내로, 안구뒤로, 폐내 (예를 들면, 에어로졸화된 약물) 또는 피하로 (장기간 방출을 위해 데포 투여, 예를 들면, 비장 캡슐 하에 포매된, 뇌, 또는 각막 내를 포함), 설하로, 항문으로, 직장으로, 질로, 또는 수술적 이식에 의해 (예를 들면, 비장 캡슐 하에 포매된, 뇌, 또는 각막 내를 포함)서와 같이, 화합물을 작용 부위로 전달할 수 있는 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.
상기 조성물은 고체, 반-고체, 액체 또는 가스 형태로 투여될 수 있거나, 동결건조된 형태와 같은 건조 분말일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은, 예를 들면, 캡슐, 샤세트, 카셰, 젤라틴, 종이, 정제, 좌약, 펠렛, 알약, 트로키, 및 로젠지와 같은 고형 투여 형태를 포함하는, 전달에 편리한 형태로 포장될 수 있다. 포장의 유형은 일반적으로 원하는 투여 경로에 좌우될 것이다. 경피 제형과 마찬가지로, 이식가능 지속 방출 제형이 또한 고려된다.
치료 방법
투여될 화합물의 양은 치료될 포유동물, 장애 또는 병태의 중증도, 투여 속도, 화합물의 성향 및 처방의의 재량에 좌우된다. 그러나, 효과적인 투여량은 단일 또는 분할 용량으로, 1일당 약 0.001 내지 약 100 mg/kg 체중, 바람직하게는 약 1 내지 약 35 mg/kg/일의 범위이다. 70 kg 인간의 경우, 이는 약 0.05 내지 7 g/일, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 2.5 g/일에 이를 것이다. 본 발명의 화합물의 효과적인 양은 단일 또는 다중 용량 (예를 들면, 1일에 2회 또는 3회)으로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 항암제 (예를 들면, 화학치료제), 치료 항체, 및 방사선 치료와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 뇌척수염, 천식, 및 본원에 기재된 다른 질환과 같은 염증성 병태의 증상을 경감시키는 작용을 하는 다른 제제와 함께 제형화되거나 투여될 수 있다. 이들 제제들은 비-스테로이드 항-염증성 약물 (NSAIDs)을 포함한다.
실시예
하기 제공된 실시예 및 제조는 본 발명의 화합물 및 상기 화합물의 제조 방법을 추가 설명하고 예시한다. 본 발명의 범위는 하기 실시예 및 제조의 범위에 의해 어떤 식으로든 제한되지 않는 것으로 이해된다. 하기 예에서, 단일 키랄 중심을 갖는 분자는, 달리 지적되지 않는 한, 라세미 혼합물로서 존재한다. 2 이상 키랄 중심을 갖는 분자는, 달리 지적되지 않는 한, 부분입체이성질체의 라세미 혼합물로서 존재한다. 단일 거울상이성질체/부분입체이성질체는 당해분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 위첨자 1은 국제공개 제WO 11/055215호를 지칭하고 위첨자 2는 국제공개 제WO 12/151525호를 지칭한다. 이들 참조문헌은 다양한 중간체가 제조되는 방법을 기술한다.
중간체
중간체 1: 3 -(3- 플루오로페닐 )-2-(1- 하이드록시프로필 )-4H- 크로멘 -4-온: DMSO (85 ml) 중의 2-(1-브로모프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온1 (8.80 g, 24.36 mmol)의 용액에, n-부탄올 (5 ml)을 부가하고 3시간 동안 120℃로 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 실온 (RT)으로 냉각하고, 물로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 (2.10 g, 29 %)로서 표제 화합물을 수득하였고, 이를 다음 단계에서 추가 정제없이 사용하였다.
중간체 2: 3 -(3- 플루오로페닐 )-2- 프로피오닐 -4H- 크로멘 -4-온: DMSO (1.90 ml, 26.82 mmol)를 디클로로메탄 (70 ml)에 부가하고 -78℃로 냉각하였다. 그리고 나서, 옥살릴 클로라이드 (1.14 ml, 13.41 mmol)를 부가하였다. 10분 후, 디클로로메탄 (20 ml) 중의 중간체 1 (2.00 g, 6.70 mmol)을 적가하고 20분 동안 교반하였다. 트리에틸아민 (7 ml)을 부가하고 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 상기 유기층을 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켰다. 상기 조 생성물을 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 액체 (1.20 g, 60%)로서 표제 화합물을 수득하였고, 다음 단계에서 그대로 사용하였다.
중간체 3: (+)/(-)-3-(3- 플루오로페닐 )-2-(1- 하이드록시프로필 )-4H- 크로멘 -4-온: 질소 퍼징 하에 DMF (7.65 ml) 중의 중간체 2 (0.600 g, 2.02 mmol)의 용액에, 포름산 : 트리에틸아민 5 : 2 공비혼합물 (1.80 ml)을 부가한 다음, [(S,S)tethTsDpenRuCl] (3.0 mg)을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 연속적 질소 퍼징 하에 80℃에서 1.5 시간 동안 가열하였다. 상기 반응 혼합물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고 농축하였다. 상기 조 생성물을 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 (0.450 g, 74%)로서 표제 화합물을 수득하였다. 질량: 299.0 (M+). 거울상이성질체 과잉률: 78%, 키랄팩(chiralpak) AD-H 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정된 바와 같이 늦은 용출 이성질체 (정체 시간: 9.72분)가 농축됨.
중간체 4: (+)/(-)-3-(3- 플루오로페닐 )-2-(1- 하이드록시프로필 )-4H- 크로멘 -4-온 : 중간체 2 (0.600 g, 2.02 mmol), DMF (7.65 ml), 포름산 : 트리에틸아민 5 : 2 공비혼합물 (1.80 ml) 및 [(R,R)tethTsDpenRuCl] (3.0 mg)을 이용하여, 중간체 3에 대해 기재된 것과 유사한 절차를 이용하여, 표제 화합물을 황색 고체 (0.500 g, 83%)로서 수득하였다. 질량: 298.9 (M+). 거울상이성질체 과잉률: 74.8%, 키랄팩(chiralpak) AD-H 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정된 바와 같이 빠른 용출 이성질체 (정체 시간: 8.52분)가 농축됨.
중간체 5: (R)-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시프로필)-4H-크로멘-4-온:
단계 1 : (R)-2-(1-(벤질옥시)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온: 디클로로메탄 (20 ml) 중의 2-(3-플루오로페닐)-1-(2-하이드록시페닐)에타논 (2.15 g, 9.36 mmol )에, HATU (4.27 g, 11.23 mmol), R-(+)2-벤질옥시부티르산 (2.00 g, 10.29 mmol)을 부가하고 10분 동안 교반한 다음, 트리에틸아민 (14.0 ml, 101.1 mmol)을 적가하고 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물로 켄칭하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고 감압하에서 농축하였다. 상기 조 생성물을 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 (1.65 g, 45%)로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H-NMR (δ ppm, CDCl3, 400 MHz): 8.24 (dd, J = 7.9,1.5 Hz, 1H), 7.74 (dt, J = 7.1,1.7 Hz, 1H), 7.58 (dd, J = 8.3,0.4 Hz, 1H), 7.44-7.06 (m, 10H), 4.51 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 7.8,6.2 Hz, 1H), 2.17-1.90 (m, 2H), 0.95 (t, J = 7.5 Hz, 3H). 질량: 389.0 (M+).
단계 2: (R)-3-(3-플루오로페닐)-2-(1-하이드록시프로필)-4H-크로멘-4-온 : 디클로로메탄 (15 ml) 중의 (R)-2-(1-(벤질옥시)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온 (1.50 g, 3.86 mmol)을 0℃로 냉각하고 알루미늄 클로라이드 (1.00 g, 7.72 mmol)를 나누어 부가하고 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 2N HCl 용액으로 켄칭하고, 디클로로메탄으로 추출하고, 나트륨 설페이트 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켰다. 상기 조 생성물을 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체 (0.552 g, 48%)로서 표제 화합물을 수득하였다. 1H-NMR (δ ppm, CDCl3, 400 MHz): . 8.24 (dd, J = 8.0,1.6 Hz, 1H), 7.72 (m, , 1H), 7.52 (dd, J = 8.4,0.5 Hz, 1H), 7.44 (m, 2H), 7.12-7.01(m,3H), 4.49 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 1.94 (m, 2H), 0.93 (t, J = 7.5 Hz, 3H). 질량: (299.0(M+). 순도: 96.93%. [α]25 D -14.73 (c = 1, CHCl3). 거울상이성질체 과잉률: 85.92%, 키랄팩(chiralpak) AS-3R 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정된 바와 같이 빠른 용출 이성질체 (정체 시간: 8.57분)가 농축됨.
화합물 A
( RS )-2-(1-(9H-퓨린-6- 일아미노 )프로필)-3-(3- 플루오로페닐 )-4H- 크로멘 -4-온
THF (25 ml) 중의 중간체 1 (2.50 g, 8.41 mmol)의 용액에, tert-부틸 9-트리틸-9H-퓨린-6-일카바메이트 (4.81 g, 10.09 mmol) 및 트리페닐포스핀 (3.31 g, 12.62 mmol)을 부가하고 실온에서 5분 동안 교반하였다. 디이소프로필아조디카복실레이트 (2.5 ml, 12.62 mmol)를 부가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하고 에틸 아세테이트 : 석유 에테르를 이용하여 칼럼 크로마토그래프에 의해 정제하여 황색을 띤 중간체를 수득하였다. 상기 중간체에, 디클로로메탄 (65 ml) 및 트리플루오로아세트산 (7.9 ml)을 부가하고 수득한 혼합물을 실온에서 12시간 교반하였다. 그리고 나서, 상기 반응 혼합물을 수성 나트륨 바이카보네이트 용액으로 염기성화하고, 디클로로메탄으로 추출하고 나트륨 설페이트 상에서 건조시켰다. 상기 조 생성물을 메탄올: 디클로로메탄을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연갈색 고체 (1.05 g, 30 %)로서 표제 화합물을 수득하였다. MP: 148-150℃. 질량: 415.6 (M+).
화합물 A1
(S)-2-(1-(9H-퓨린-6- 일아미노 )프로필)-3-(3- 플루오로페닐 )-4H- 크로멘 -4-온
방법 A: THF (5ml) 중의 중간체 3 (0.250 g, 0.838 mmol)의 용액에, tert-부틸 9-트리틸-9H-퓨린-6-일카바메이트 (0.479 g, 1.00 mmol) 및 트리페닐포스핀 (0.329 g, 1.25 mmol)을 부가하고 수득한 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 그리고 나서, 디이소프로필아조디카복실레이트 (0.25 ml, 1.25 mmol)를 부가하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하고 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용하여 칼럼 크로마토그래피하여 황색을 띤 중간체를 수득하였다. 디클로로메탄 (6 ml) 중의 상기 중간체에, 트리플루오로아세트산 (1.2 ml)을 부가하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 수성 나트륨 바이카보네이트 용액으로 염기성화하고, 디클로로메탄으로 추출하고 나트륨 설페이트 상에서 건조하였다. 상기 조 생성물을 메탄올: 디클로로메탄을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황백색 고형물 (0.015 g, 4 %)로서 표제 화합물을 수득하였다. MP: 137-140℃. 1H-NMR (δ ppm, DMSO-d 6, 400 MHz): 12.94 (s, 1H), 8.12-8.10 (m, 4H), 7.84-7.80 (m, 1H), 7.61 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.50-7.41 (m, 2H), 7.28-7.18 (m, 3H), 5.20-5.06 (m, 1H), 2.10-1.90 (m, 2H), 0.84 (t, J = 3.7 Hz, 3H). 거울상이성질체 과잉률: 키랄팩(chiralpak) AD-H 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정된 바와 같이 77.4%, 빠른 용출 이성질체 (정체 시간 = 7.90분)가 농축됨.
방법 B : THF (52 ml) 중의 중간체 5 (2.60 g, 8.68 mmol)의 용액에, tert-부틸 9-트리틸-9H-퓨린-6-일카바메이트 (4.96 g, 10.42 mmol) 및 트리페닐포스핀 (2.76 g, 13.03 mmol)을 부가하고 수득한 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 그리고 나서, 디이소프로필아조디카복실레이트 (0.25 ml, 1.25 mmol)를 부가하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 농축하고 에틸 아세테이트: 석유 에테르를 이용하여 칼럼 크로마토그래피하여 황색을 띤 중간체를 수득하였다. 디클로로메탄 (55 ml) 중의 상기 중간체에, 트리플루오로아세트산 (14.2 ml)을 부가하고 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 수성 나트륨 바이카보네이트 용액으로 염기성화하고, 디클로로메탄으로 추출하고 나트륨 설페이트 상에서 건조하였다. 상기 조 생성물을 메탄올: 디클로로메탄을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연황색 고체 (1.00 g, 27 %)로서 표제 화합물을 수득하였다. MP: 168-170℃. 질량: 416.5(M++1) 거울상이성질체 과잉률: 키랄팩(chiralpak) AD-H 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정된 바와 같이 86.5%, 빠른 용출 이성질체 (정체 시간 = 7.90분)가 농축됨.
방법 C : 상기 표제 화합물을 80 g/분의 유속으로 이동상으로서 메탄올 : CO2 (35:65)를 이용하여 키랄팩(CHIRALPAK) AY-H 칼럼 (250 x 30 mm; 5 μm) 상에서 화합물 A (1.090 g)로부터 분취 SFC 조건에 의해 분리하였다. 황백색 고체 (0.378 g). e.e. 100%. Rt: 2.37분. 질량: 416.1(M++1). MP: 149-152℃.
화합물 A2
(R)-2-(1-(9H-퓨린-6- 일아미노 )프로필)-3-(3- 플루오로페닐 )-4H- 크로멘 -4-온
방법 A: tert-부틸 9-트리틸-9H-퓨린-6-일카바메이트 (0.479 g, 1.00 mmol), 중간체 4 (0.250 g, 0.838 mmol), 트리페닐포스핀 (0.329 g, 1.25 mmol), THF (5 ml) 및 디이소프로필아조디카복실레이트 (0.25 ml, 1.25 mmol)를 이용하여 화합물 A1에 대해 기재된 것과 유사한 절차 (방법 A)를 이용하여 표제 화합물을 황백색 고체 (0.015 g, 4 %)로서 수득한 다음, 트리플루오로아세트산 (1.2 ml) 및 디클로로메탄 (6 ml)을 이용하여 상기 중간체를 절단하였다. MP: 139-141℃. 질량: 415.6 (M+). 거울상이성질체 과잉률: 키랄팩(chiralpak) AD-H 칼럼 상에서 HPLC에 의해 결정된 바와 같이 81.6%, 늦은 용출 이성질체 (정체 시간 = 10.81분)가 농축됨.
방법 B : 상기 표제 화합물을 80 g/분의 유속으로 이동상으로서 메탄올 : CO2 (35:65)를 이용하여 키랄팩(CHIRALPAK) AY-H 칼럼 (250 x 30 mm; 5 μm) 상에서 화합물 A (1.090 g)로부터 분취 SFC 조건에 의해 분리하였다. 황백색 고체 (0.434 g). e.e. 98%. Rt: 3.71분. 질량: 416.1(M++1). MP: 162-164℃.
생물학적 분석
본원에 기재된 화합물의 약리적 특성은 수많은 약리적 분석에 의해 확인될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물 및/또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 이용하여 수행된 약리적 분석이 하기에 예시되어 있다
분석 1: PI3 키나아제 효소 활성의 형광 결정
포스포이노시티드 3 키나아제 (PI3K)는 몇 가지 핵심적인 세포 과정의 조절에서 매우 중요한 역할을 하는 지질 키나아제 부류에 속한다. 상기 PI3K는 포스포이노시톨의 3-하이드록시 위치를 인산화함으로써 다운스트림 신호전달 사건에 관여하는 2차 메신저를 생성할 수 있다. 균일 시간 분해 형광 (HTRF) 분석은 α, β, γ 또는 δ와 같은 PI3K 동형체에 의한 포스포티딜이노시톨 4,5-바이포스페이트 (PIP2)의 인산화의 결과로서 형성된 3,4,5-삼인산 (PIP3)의 검출을 허용한다.
변형된 PI3K 인간 HTRF™ 분석 키트 (밀리포어, Billerica, MA)를 이용하여 α, β, γ 또는 δ에 대한 PI3K 동형체 활성을 결정하였다. 모든 배양은 실온에서 수행하였다. 요약하면, 0.5 μl의 40X 억제제 (100% DMSO 중에) 또는 100% DMSO를 효소가 있거나 효소가 없는 14.5 μl 1X 반응 완충제 /PIP2 (10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1.38 μM PIP2) 믹스를 함유하는 384-웰 흰색 플레이트 (Greiner Bio-One, Monroe, NC)의 각 웰에 부가한 다음, 5 μl/웰의 400 μM ATP를 부가하고 추가 30분간 배양하였다. 5 μl/웰 정지 용액 (Millipore, Billerica, MA)을 부가하여 반응을 종료시켰다. 그리고 나서, 5 μl의 검출 믹스 (Millipore, Billerica, MA)를 각 웰에 부가하고, 6-18 시간 동안 어둠 속에서 배양하였다. 50 msec의 지연을 카운팅하는 400 msec의 적분 시간으로 337 nm의 여기 파장 및 665 및 615 nm의 방출 파장에서 마이크로플레이트 판독기 (BMG Labtech., Germany) 상에서 HRTF 비율을 측정하였다. 화합물 A1 및 A2에 대한 결과가 하기 표 1에 나타나 있다. 화합물 A1 및 WO 11/055215의 실시예 47에 대한 비교 데이타가 표 2에 제공되어 있다.
표 1
Figure 112016000775123-pct00002
표 2
Figure 112016000775123-pct00003
분석 2: 백혈성 세포주에서 시험관내 세포 증식 분석
성장 억제 분석을 10% FBS 보강된 배지를 이용하여 수행하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 5000 - 20,000 세포/웰의 농도로 시딩하였다. 0.01 내지 10000 nM 농도 범위의 시험 화합물을 24시간 후 부가하였다. 0시간 (시험 화합물의 부가 전) 및 시험 화합물의 부가 후 72시간에, 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 염료 감소 시험을 이용하여 성장을 평가하였다. 450 nm의 파장에서 Fluostar Optima (BMG Labtech, Germany) 상에서 흡광도를 판독하였다. 데이타를 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism)을 이용하여 분석하고 대조군 대비 시험 화합물의 퍼센트 억제를 계산하였다.
화합물 A1은 시험된 용량 범위에 대해 1-5 μM 범위의 GI50 값으로 T-림프종 (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78 & HuT-102) 세포 생존력을 감소시켰다. 또한, 상기 화합물은 72시간 배양 기간 동안 10 μM까지 어떤 분명한 세포독성도 나타내지 않았다.
분석 3: 백혈성 세포주에서 AKT 인산화의 억제
MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78, HuT-102, Sez4 및 HH 세포를 원하는 농도의 화합물과 함께 48시간 동안 배양하였다. 세포를 용해시키고 pAKT를 웨스턴 블랏팅에 의해 결정하였다. 밴드를 ImageJ를 이용하여 정량하고 액틴에 대해 정규화하였다.
화합물 A1은 시험된 용량 범위에 대해 0.5-2 μM 범위의 EC50 값으로 T-림프종 (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78 & HuT-102) 세포주에서 pAKT 발현을 감소시켰다. 상기 결과가 도 8에 나타나 있다.
분석 4: 인간 전혈로부터의 호염기구에서 PI3K δ 및 γ 신호전달의 억제
항-FcεR1 또는 fMLP 유도된 CD63 발현의 변화에 의해 나타난 호염기구에서의 PI3K δ 및 γ 신호전달은 Flow2CAST® 키트 (Buhlmann Laboratories, Switzerland)를 이용하여 결정된 유용한 약동학적 마커이다. 요약하면, 이는 하기 단계를 포함한다:
● 정맥천자 튜브를 몇 번 뒤집어 혈액 응고가 방지된 혈액 샘플을 섞는다;
● 유세포측정 측정에 적합한 신선하고 발열성물질이 없는 3.5 ml 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌 튜브를 준비한다;
● 49 μl의 환자의 전혈을 각 튜브에 넣는다;
● 1 μl의 10% DMSO (백그라운드) 또는 화합물 (10% DMSO)을 할당된 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 실온에서 15분 동안 배양한다;
● 50 μl의 자극 버퍼 (백그라운드) 또는 항-FcεRI Ab 또는 fMLP를 각 튜브에 피펫팅한다;
● 100 μl의 자극 버퍼를 각 튜브에 넣는다;
● 부드럽게 섞는다. 20 μl 염색 시약 (FITC-CD63 및 PE-CCR3의 1:1 믹스)을 각 튜브에 넣는다;
● 부드럽게 섞고, 튜브를 덮고 37℃ 수조에서 15분 동안 배양한다. (배양기를 이용하면 낮은 열 전달 효율로 인해 약 10분 더 배양 시간이 걸릴 것이다);
● 2 ml 미리 데운 (18-28℃) 용해 시약을 각 튜브에 넣고, 부드럽게 섞는다;
● 18-28℃에서 5-10분간 배양한다;
● 500 x g에서 5분간 튜브를 원심분리한다;
● 블롯팅 종이를 이용하여 상청액을 버린다;
● 세포 펠렛을 300-800 μl의 세척 완충제를 이용하여 재현탁시킨다;
● 부드럽게 볼텍싱하고 같은 날에 유세포분석기 상에서 데이터를 획득한다.
게이트된 호염기구 집단 내의 퍼센트 CD63 양성 세포를 상이한 치료 그룹에서 결정하고 비히클 대조군에 대해 정규화하였다.
화합물 A1은 FcεR1 (PI3K δ)에 대해 < 40 nM의 EC50 및 fMLP ( PI3K γ)에 대해 < 40 nM의 IC50을 나타내었다 ( n=10). 상기 결과가 도 9에 나타나 있다.
분석 4A: PI3K 델타 및 PI3K 감마 동형체에 대한 화합물 A1의 선택성을 입증하는 세포성 활성
분석 4A1: 항- IgM 유도된 B-세포 증식 ( PI3Kδ 선택성에 대해)
이 연구의 목적은 항-IgM 유도된 인간 B-세포 증식에 대한 화합물 A1의 억제 잠재성을 평가하는 것이었다.
플레이팅 및 처리
● 단리된 B-세포를 ml 당 1.0 x 106 세포로 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 부가하였다. 삼반복을 유지하였다.
● 50 μl의 약물 희석을 부가하고 잘 섞어 주었다. DMSO 블랭크 및 유도제 블랭크를 유지하였다.
● 처리된 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 30분간 배양한 다음 50 μl의 4X 유도제를 부가하고 피펫팅에 의해 섞어 주었다.
● 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다.
● 배지를 흡인하고 150 μl의 DMSO를 부가하여 포르마잔 결정을 용해시켰다.
● 흡광도를 A560 및 A640 nm에서 판독하였다.
상기 데이타는 인간 B-세포 증식의 PI3Kδ 매개된 유도에 대한 화합물 A1의 억제 잠재성을 입증한다. 예를 들면, 문헌[Baeker 등 Journal of Immunology, 134: 3532-3538, 1985]을 참고한다.
분석 4A2: 3T3 섬유아세포에서 LPA 유도된 AktS473 인산화 ( PI3Kβ 선택성에 대해)
이 연구의 목적은 3T3 섬유아세포에서 PI3Kβ 키나아제 매개된 LPA 유도된 AktS473 인산화에 대한 화합물 A1의 효과를 입증하는 것이었다.
● 3T3 세포를 원하는 농도의 시험 화합물로 15분간 처리하였다. 1 ml의 2X LPA를 최종 농도가 5 μM이 되도록 부가하고 5분 동안 배양하였다.
● 배지를 버리고 1 ml의 차가운 1X PBS로 세정하였다.
● 250 μl의 세포 용해 완충제를 부가하고 얼음 위에서 30분간 배양하였다.
● 샘플을 원심분리하고 상청액을 분석시까지 -80℃에 두었다.
● 샘플을 일차 항체로서 pAKT (S473) 및 2차 항체로서 항-토끼 IgG-HRP를 이용하여 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하였다.
● 밴드의 세기를 ImageJ 1.42q (NIH, USA)를 이용하여 결정하고 액틴 (로딩 대조군)에 대해 정규화하였다. 데이타를 그래프패드 프리즘 (버전 5.02)을 이용하여 플롯팅하였다.
상기 결과는 PI3K의 베타 동형체 대비 화합물 A1의 선택성을 입증한다. 문헌[Albuquerque 등, J. Biol. Chem . 278, 39830-39838, 2003]을 참고한다.
분석 4A3: RAW 264.7 대식세포에서 c5a 유도된 AktS473 인산화 ( PI3Kγ 선택성에 대해)
이 연구의 목적은 RAW 264.7 대식세포에서 PI3Kγ 키나아제 매개된 c5a 유도된 AktS473 인산화에 대한 화합물 A1의 효과를 결정하는 것이었다.
● RAW 264.7 세포를 원하는 농도의 시험 화합물로 15분간 처리하였다. 1 ml의 2X c5a를 최종 농도가 50 ng/ml이 되도록 부가하고 15분간 배양하였다.
● 배지를 버리고 1 ml의 차가운 1X PBS로 세정하였다.
● 250 μl의 세포 용해 완충제를 부가하고 얼음 위에서 30분간 배양하였다.
● 샘플을 원심분리하고 상청액을 분석시까지 -80℃에서 보관하였다.
● 샘플을 일차 항체로서 pAKT (S473) 및 2차 항체로서 항-토끼 IgG-HRP를 이용하여 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하였다.
● 밴드의 세기를 ImageJ 1.42q (NIH, USA)를 이용하여 결정하고 액틴 (로딩 대조군)에 대해 정규화하였다. 데이타를 그래프패드 프리즘 (버전 5.02)을 이용하여 플롯팅하였다.
PI3Kδ 신호전달의 다운스트림 마커인 pAktS473의 억제는 c5a 유도된 RAW 264.7 세포에서 Akt에 의해 조절된 종양발생 경로에서 화합물 A1에 대한 역할을 제시한다. 문헌[To 등 Am. J. Respir . Crit . Care Med ., 182, 897-904, 2010]을 참고한다.
분석 4A4: 3T3 세포에서 PDGF 유도된 Akt 인산화 ( PI3K α 선택성에 대해)
이 연구의 목적은 PDGF 유도된 3T3 섬유아세포에서 PI3Kα 키나아제 매개된 AktS473 인산화에 대한 화합물 A1의 효과를 결정하는 것이었다.
● 3T3 세포를 원하는 농도의 시험 화합물로 15분간 처리하였다. 1 ml의 2X PDGF를 최종 농도가 20 ng/ml가 되도록 부가하고 10분간 배양하였다.
● 배지를 버리고 1 ml의 차가운 1X PBS로 세정하였다.
● 250 μl의 세포 용해 완충제를 부가하고 얼음 위에서 30분간 배양하였다.
● 샘플을 원심분리하고 상청액을 수집하고 분석시까지 -80℃에서 보관하였다.
● 샘플을 일차 항체로서 pAKT (S473) 및 2차 항체로서 항-토끼 IgG-HRP를 이용한 웨스턴 블랏팅에 의해 분석하였다.
● 밴드의 세기를 ImageJ 1.42q (NIH, USA)를 이용하여 결정하고 액틴 (로딩 대조군)에 대해 정규화하였다. 데이타를 그래프패드 프리즘 (버전 5.02)을 이용하여 플롯팅하였다.
10 μM의 화합물 A1에서 억제가 관찰되지 않았으며, 이는 PI3K의 알파 동형체 대비 화합물 A1의 선택성을 입증한다. 문헌[Albuquerque 등, J. Biol . Chem . 278, 39830-39838, 2003]을 참고한다.
하기 표는 분석 4A1-4A4로부터의 결과를 요약한다.
Figure 112016000775123-pct00004
분석 5: 백혈병 세포주에서 세포자멸사의 억제
백혈병 세포에서의 세포자멸사를 아래에 요약한 바와 같이 원위치(in-situ) 카스파제 3 키트 (밀리포어, US)를 이용하여 결정하였다:
● 백혈병 세포를 6 웰 플레이트에 1X106 세포/웰의 밀도로 시딩한다
● 시험 화합물/DMSO를 원하는 농도로 부가한다
● 상기 플레이트를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 배양한다.
● 세포를 2ml 원심분리 튜브에서 수집한다
● 1.6 μl의 새로 준비한 5X FLICA 시약을 부가하고 튜브를 조금 튕겨 세포를 섞는다.
● 튜브를 5% CO2 하에 37℃에서 1시간 동안 배양한다
● 2 ml의 1X 세척 완충제를 각 튜브에 부가하고 섞는다
● <400 x g에서 5분간 실온에서 원심분리한다.
● 상청액을 조심스레 제거하고 버리고, 어떤 세포간 군집(clumping)을 파괴하기 위해 세포 펠렛을 조심스레 볼텍싱한다.
● 펠렛을 300ul의 1X 세척 완충제에 재현탁시킨다
● 100 μl의 각 세포 현탁액을 검정색 미세적정 플레이트의 2개의 웰 각각에 넣는다. 거품 생성을 피한다.
● 490 nm의 여기 파장 및 520 nm의 방출 파장을 이용하여 각 마이크로웰의 흡광도를 판독한다
● 대조군 블랭크와 비교하여 형광 증가에 의해 나타나는 카스파제-3 활성에서의 퍼센트 증가를 계산한다.
화합물 A1은 T-림프종 (MOLT-4, Jurkat, CCRF-CEM, Hut-78 & HuT-102) 세포주에서 카스파제-3 활성에서 용량-의존적 유도를 야기하였다.
분석 6: 인간 일차 CTCL 세포에서 pAKT 억제에 대한 스크리닝
pAKT 억제의 유세포측정 분석: 정제된 악성 T 세포를 공여체로부터 분리하고 RPMI/1% BSA 중에서 밤새 배양하였다. 세포를 시험 화합물과 함께 1.5시간 동안 배양하고, 사이토카인 믹스를 최종 30분간 부가하였다. 상기 사이토카인 믹스의 조성은 20 ng/ml IL2 + 5 ng/ml IL7 + 10 ng/ml IL15 + 10% FBS였다. AKT 인산화를 유세포측정에 의해 결정하였다.
화합물 A1 처리는 40-300 nM 범위의 EC50 (% 억제 데이타)으로 AKT 인산화의 용량 의존적 감소를 야기하였다.
분석 6A: 인간 CLL 세포에서 항암 활성에 대한 스크리닝
일차 CLL 세포를 Stem Cell Technology사의 Rosette-Sep B 세포를 이용하여 농축하여, 일반적으로 > 97%의 순도의 B 세포/CLL 세포를 생성하였다. 세포를 원하는 농도의 시험 화합물의 존재하에 무혈청 배지 (SFM) 또는 SFM + 10% 열-불활성화된 우태아 혈청 (부피 100 마이크로리터)와 함께 96 웰에 2.5 x 105/웰로 시딩하고 이산화탄소 배양기에서 37℃에서 3일간 배양하였다. 세포독성을 MTS 분석을 이용하여 결정하였다.
화합물 A1은 무혈청 배지에서 < 100 nM 및 10% FBS 배지에서 < 700 nM의 중앙 EC50으로 CLL 세포에서 세포독성을 유도한다.
분석 6B: 환자 유도된 B-림프종 세포에서 항암 활성에 대한 스크리닝
림프모양 종양 유래의 1차 세포를 시험 화합물 [화합물 A1]에 노출시켜 세포 사멸의 유도를 평가하였다. 세포는 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 비장 변연부 림프종 (SMZL), 외부결절성 변연부 림프종 (EMZL), 또는 만성 림프구성 백혈병 (CLL, no.=1)으로부터 유래하였다. 세포를 원하는 농도의 화합물로 처리하고 세포자멸사 (아넥신 V/PI)를 48시간 배양 기간 후 유세포분석법에 의해 평가하였다.
B-세포 림프종으로부터 유래된 거의 모든 1차 세포들은 4 μM의 농도의 시험 화합물 (화합물 A1)에 노출될 때 세포 사멸의 증가를 겪었다. 상기 현상은 소세포 림프종 (MZL, MCL, 및 CLL)으로부터 유래된 1차 세포 중에서 더 분명하게 나타났다.
분석 6C: B-림프종 세포주에서 AKT 인산화의 억제
LY-1, LY-10, Daudi, JEKO, REC 및 MAVER 세포를 원하는 농도의 [화합물 A1]과 함께 48시간 동안 배양하였다. 세포를 용해시키고 pAKT를 웨스턴 블랏팅에 의해 결정하였다. 밴드를 ImageJ를 이용하여 정량하고 액틴에 대해 정규화하였다.
화합물 A1은 시험된 B-림프종 세포주에 대해 20 - 200 nM의 EC50을 나타내었다.
분석 6D: 항-인간 CD3 및 CD28 Vo -자극된 일차 T-세포에서 사이토카인 분석
이 연구의 목적은 항-인간 CD3/CD28 공-자극된 일차 T-세포에 의해 생산된 사이토카인에 대한 화합물 A1의 억제 잠재성을 평가하는 것이었다.
플레이팅 및 처리
● 플레이트를 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 2시간 동안 100 ng/ml 농도의 50 μl의 항-인간 CD3으로 코팅하였다. 배양 후, 플레이트를 멸균된 PBS로 2회 세정하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다.
● 단리된 인간 T-세포를 1.5ml 튜브에 ml 당 0.625 x 106 세포로 재현탁시키고 1μl의 약물 희석 (1000X)을 부가하였다. DMSO 블랭크 및 유도되지 않은 블랭크를 유지하였다.
● 세포를 실온에서 30분간 화합물과 함께 배양한 다음 각각 240 μl를 96-웰 플레이트의 항-인간 CD3 코팅된 웰에 부가하였다. 항-인간 CD28을 웰당 10 μl (25X)로 즉시 부가하였다.
● 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 배양하였다.
● 플레이트를 실온에서 4000 rpm에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고 -20℃에서 보관하였다.
● 사이토카인을 450 및 570 nm에서 흡광도 판독으로 상업적 ELISA 키트를 이용하여 결정하였다.
IC50 값을 8개의 독립적인 실험으로부터 계산하였다. 화합물 A1은 TNFα, IFNγ 및 IL2 각각에 대해 24, 9.54 및 20.6 nM의 IC50으로 항-인간 CD3-CD28 유도된 T 세포 사이토카인을 억제하였다. 상기 결과가 도 10에 나타나 있다.
분석 7: 암컷 위스타 랫트 모델에서 지질다당류 유도된 폐 호중구
중성구의 과장된 동원 및 차후의 활성화는 기도 및 폐에서 몇 가지 염증성 질환, 예컨대 중증 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 낭포성 섬유증, 및 급성 호흡곤란 증후군의 발달 및 과정에 중요한 것으로 보인다. 중성구가 이들 질환의 원인이 되는 기전은 중성구 엘라스타제와 같은 단백분해 효소, 및 자유 산소 라디칼의 방출을 수반할 수 있다. 방출될 때, 이들 화합물은 기도에서 기관지수축, 기관지 과반응성, 과도-분비, 상피성 손상, 및 조직 리모델링을 야기할 수 있다.
검역 기간 후, 단식한 동물을 무작위화하고 체중에 따라 다양한 그룹으로 나누었다. 상기 시험 화합물 [화합물 A1]을 현탁화제로서 트윈 80을 함유하는 0.5% 메틸셀룰로오스로 구성된 비히클 중에 현탁액으로서 제조하였다. 상기 화합물 또는 비히클을 10mL/kg의 부피로 경구 위관영양법에 의해 투여하였다. 암컷 위스타 랫트를 케타민으로 마취시키고 LPS 용액을 1 mg/kg의 용량으로 화합물 투여 1시간 후에 기관내로 투여하였다. LPS 점적주입 6시간 후, 동물을 마취 하에 방혈시킨 다음, 기관에 캐뉼라를 삽입하고 폐를 기관 캐뉼라 (총 용적 20 ml)를 통해 5-ml 분취량의 헤파린화된 PBS (1 unit/ml)로 4회 세척하였다. 기관지폐포 세척 (BAL) 액을 총 세포 및 백분율 백혈구 계수를 위해 분석시까지 2-8℃에서 보관하였다. 기관지폐포 세척액을 원심분리하고 (10분간 500×g), 수득한 세포 펠렛을 0.5 ml의 헤파린화된 염수에 재현탁시켰다. 백혈구의 총 수를 혈구 계수기를 이용하여 BAL 액 또는 혈액에서 결정하고 1×106 세포/ml로 조정하였다. 백분율 세포 계수를 수작업으로 계산하였다. 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리하여 세포 도말표본을 제조하였다. 상기 세포 도말표본을 분화용 혈액 염색 용액으로 염색하고 슬라이드를 현미경으로 관찰하여 그의 형태적 특성에 따라 호산구를 확인하였다. 세포 도말표본 내의 300개의 백혈구 중에 각 세포 유형의 수를 결정하고 백분율로 표시하였다. 각 BALf 또는 혈액에서의 호산구의 수를 계산하였다.
화합물 A1은 6.5 mg/kg의 ED50으로 폐 내로의 중성구 침윤의 용량-의존적 감소를 나타내었는데, 이는 염증성 장애에서 치료적 역할을 제시한다. 상기 결과가 도 1에 나타나 있다.
분석 8: 염증의 지질다당류 -유도된 랫트 공기 주머니 모델
백혈구 동원 및 상이한 사이토카인을 포함하는 전-염증 매개체의 형성은 염증성 반응의 특징이다. 공기 주머니 모델은 본래 류마티스성 관절염 (RA)에서 일어나는 염증성 과정을 연구하기 위한 복제 활막(facsimile synovium)으로서 개발되었다. 상기 모델은 공기 주머니 벽 (조직)에서 축적되는 백혈구 종 뿐만 아니라 공기 주머니 공동 (세척)으로 이전하는 백혈구 종의 백분율 정량화를 허용하며, 그것은 다양한 염증성 자극에 의해 유도된 누출 (diapedesis)을 담당하는 케모카인 및 부착 분자의 규명을 허용한다.
암컷 위스타 랫트 (175-200 g)를 실험 시작 전 7일간 적응시켰다. 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위 분배하였다. 동물을 에테르로 마취시키고 20 ml의 멸균된 공기를 견갑골내 영역 (0일째) 내의 피부 아래로 주입하고 4일에 멸균 여과된 공기를 2차로 10-ml 주사하여 유지시킴으로써 피하 공기 주머니를 만들었다. 6일에, LPS 용액의 s.c. 주사에 의해 염증을 유도하기 1시간 전에 경구 처리를 시작하였다. 멸균된 염수에 용해된 5-ml 부피의 LPS 용액 (100μg/kg)을 각 주머니 내로 주사하였다. 5 ml의 멸균된 염수로 주머니를 씻어내고 4 ml의 액을 뽑아 LPS 투여 후 6시간에 주머니 액의 샘플을 취하였다. 주머니 액 내에 존재하는 백혈구의 수를 혈구계를 이용하여 현미경으로 결정하였다. 백분율 세포 함량을 Diff-Quik으로 염색된 액 도말표본의 현미경적 시험에 의해 결정하였다.
화합물 A1은 2.6 mg/kg의 ED50으로 랫트 공기 주머니 내로의 중성구 이동을 용량-의존적으로 감소시켰는데, 이는 류마티스성 관절염에서의 치료적 역할을 제시한다. 상기 결과가 도 2에 나타나 있다.
분석 9: 지질다당류 유도된 TNF -α 생산
단식한 암컷 위스타 랫트를 체중에 따라 상이한 그룹으로 무작위 배분하였다. 시험 화합물 (화합물 A1)을 0.5% 메틸셀룰로오스로 이루어진 비히클 중의 현탁액으로서 제조하였다. 상기 화합물 또는 비히클을 10mL/kg의 부피로 경구 위관영양법에 의해 투여하였다. LPS 용액을 0.3 mg/kg의 용량으로 화합물 투여 1시간 후에 복강내로 투여하였다. 혈액을 LPS 주사 90분 후 심장 천자를 통해 혈청 원심분리 튜브에 수집하였다. 혈청을 분리하여 -20℃에 보관하고 ELISA에 의해 TNFα에 대해 분석할 것이다.
화합물 A1은 혈장 TNFα 농도를 감소시켰는데, 이는 염증성 장애에서의 치료적 역할을 제시한다 (1, 3 및 10 mg/kg에서 관찰된 퍼센트 억제는 각각 5%, 15%, 및 40%였음). 상기 결과가 도 3에 나타나 있다.
분석 10A: 수컷 기니아 피그에서 난백알부민 유도된 폐 호산구증가증
기도 염증 및 과반응성 (AHR)은 기관지 천식의 특징이자 구별되는 특징이다. 동일한 알레르겐으로 미리 감작화된 마우스의 자극은 우선적으로 호산구성 침윤을 갖는 기도 염증과 그 결과 AHR을 유도한다. 기도 긴장의 변화된 신경 제어 및 기도 상피성 박리와 함께 폐 호산구증가증 및 기도 재모델링은 천식에서 AHR의 원인이 될 수 있다.
검역 기간 후, 0.3 mL의 혈액 샘플을 각 개별 동물로부터 안와정맥총 (retro-orbital plexus) 방법에 의해 안정맥 (orbital vein)으로부터 수집하고, 세포 분석기 (ADVIA 2120, Siemens) 상에서 분석하였다. 그것의 총 세포수에 기초하여, 기니아 피그를 무작위화하고 다양한 그룹으로 나누었다. 귓바퀴를 확인을 위해 지워지지 않는 마킹펜으로 표시하였다. 0일째에, 체중을 기록하고 동물을 복강 내로 50μg의 난백알부민 (OVA) 및 10 mg의 명반 (alum) 용액 (1 mL)을 이용하여 감작시켰다. 7일 및 14일에, 상기 감작 프로토콜을 반복하였다. 동물을 19일까지 상기 감작에 대해 병 또는 반응의 어떤 증상에 대해 관찰하고, 상기 증상이 있으면 기록하였다. 19일, 20일, 및 21일에, 경구 위관영양법에 의해 시험 화합물로 처리 후, 30분 후 동물을 0.5 % w/v, 0.5% 및 1% 난백알부민 공격에 각각 노출시켰다. 대조군 및 허위 (Sham) 그룹 동물을 0.5% w/v 메틸 셀룰로오스 (비히클)로 처리하였다. 허위 대조군 그룹을 0일, 7일 및 14일에 10 mg의 명반으로 감작시키고 19일, 20일 및 21일에 동일한 분무 속도로 염수 용액 (SAL)에 노출시켰다. 마지막 OVA 공격 20시간 후, 누적 용량의 메타콜린 공격 (75, 100, 125 & 150 μg/ml)에 대한 몸 전체 체적변동기록계에 의해 기도 과반응성을 측정하고, 기도 반응을 측정한 후, 혈액 샘플 및 BAL 액을 수집하였다. 샘플을 현미경 하에 노이바우어 챔버 (neubauer chamber)를 이용하여 총 세포수에 대해 분석하고 백분율 백혈구 계수를 수작업으로 수행하였다.
도 4a 및 4b에 묘사된 바와 같이, 화합물 A1은 감작화된 기니아 피그의 메타콜린 공격에 대한 기도 과반응성에서 유의미한 용량 의존적 감소를 야기하였다.
도 4c-4e에 묘사된 바와 같이, 화합물 A1은 감작화된 기니아 피그의 기관지폐포 세척액 내로의 호산구 침윤의 유의미한 용량 의존적 감소를 야기하였다.
분석 10B: 쥣과 천식 모델
기도 염증 및 과반응성 (AHR)은 기관지 천식의 특징이자 구별되는 특징이다. 동일한 알레르겐으로 미리 감작화된 마우스의 자극은 우선적으로 호산구성 침윤을 갖는 기도 염증과 그 결과 AHR을 유도한다. 기도 긴장의 변화된 신경 제어 및 기도 상피성 박리와 함께 폐 호산구증가증 및 기도 재모델링은 천식에서 AHR의 원인이 될 수 있다. 검역 기간 후, 그것의 체중에 기초하여, 마우스를 무작위하고 4개의 그룹 (n=7)으로 나누었다. 꼬리를 확인을 위해 지워지지 않는 마킹펜으로 표시하였다. 0일째에, 체중을 기록하고 동물을 복강내로 100μg의 난백알부민 및 10 mg의 명반 용액 (0.2 mL)으로 감작화시켰다. 7일 및 14일에, 상기 감작 프로토콜을 반복하였다. 동물을 24일까지 상기 감작에 대해 병 또는 반응의 어떤 증상에 대해 관찰하고, 상기 증상이 있으면 기록하였다. 24일, 25일, 및 26일에, 경구 위관영양법에 의해 시험 화합물로 처리 후, 30분 후 동물을 10 % w/v 난백알부민 공격에 노출시켰다. 대조군 및 허위 그룹 동물들을 0.5% w/v 메틸 셀룰로오스 (비히클)로 처리하였다. 허위 대조군 그룹을 0일, 7일 및 14일에 10 mg의 명반으로 감작시키고 24일, 25일 및 26일에 동일한 분무 속도로 염수 용액에 노출시켰다. 마지막 OVA 공격 48시간 후에, 누적 용량의 메타콜린 공격 (2.5, 10, 50 및 100 mg/ml)에 대한 몸 전체 체적변동기록계에 의해 기도 과반응성을 측정하고, 기도 반응을 측정한 후, 혈액 샘플 및 BAL 액을 수집하였다. 샘플을 현미경 하에 노이바우어 챔버 (neubauer chamber)를 이용하여 총 세포수에 대해 분석하고 백분율 백혈구 계수를 수작업으로 수행하였다. 도 5a 및 5b에 묘사된 바와 같이, 3 mg/kg의 용량의 화합물 A1은 난백알부민 감작화된 마우스의 메타콜린 공격에 대해 기도 과반응성에서 유의미한 감소를 야기하였다.
도 5c-5E에 묘사된 바와 같이, 3 mg/kg의 용량의 화합물 A1은 난백알부민 감작화된 마우스의 기관지폐포 세척액 내로의 호산구 침윤의 유의미한 억제를 야기하였다.
분석 11: 루이스 랫트에서 콜라겐 유도된 관절염
암컷 위스타 랫트를 실험 시작 전 7일간 적응시키고 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위로 분배하였다. 0일째에, 동물을 꼬리 아래에 전달되는 MTB (4 mg/mL)를 함유하는 완전 프로인드 보조제 (IFA)로 유화된 소 콜라겐 II형 500 μg을 진피내 주사하여 처리하였다. 일차 면역화 후 7일째에, 동물을 꼬리 아래에 진피내 주사에 의해 불완전 프로인트 보조제 중의 300 μg CII의 부스터 주사에 의해 처리하였다. 족관절에서의 관절염의 개시는 보통 12일과 14일 사이에 시각적으로 분명해졌다. 치료 그룹으로서 동물에게 실험 (28일) 말기까지 관절염의 개시 후 일자로부터 시험 화합물 또는 비히클 (경구로 투여된)을 처리하였다. 연구 기간 내내 정기적으로 관절 염증의 징후에 대해 시각적으로 조사하여 관절염 스코어를 구하였다. 체중 및 발 용적, 발 두께를 0, 3, 7, 10, 12, 14, 17 21, 24 및 28일에 구하였다. 28일에, 연구 말기에, 부검하여 혈액을 채혈하고 혈청 또는 혈장으로 가공하고, 모든 관절을 취하고, 각 관절로부터 작은 조직 조각을 취한 후 조직병리 분석을 위해 10% 포르말린에서 고정화시키고, 조직 균질물에서 사이토카인을 분석하기 위해 -80℃에서 보관하였다. 앞발 및 뒷발에 대한 임상 평점 기준: 0 = 정상; 1 = 하나의 뒷발 또는 앞발 관절 손상 또는 최소 확산 홍반 및 팽윤; 2 = 2개의 뒷발 또는 앞발 관절 손상 또는 약한 확산 홍반 및 팽윤; 3 = 3개의 뒷발 또는 앞발 관절 손상 또는 중간 정도의 확산 홍반 및 팽윤; 4 = 뚜렷한 확산 홍반 및 팽윤, 또는 = 4개의 발가락 관절 손상; 5 = 중증 확산 홍반 및 중증 팽윤 전체 발, 발가락을 굽힐 수 없음.
랫트 CIA 모델에서 치료적으로 투여된 화합물 A1은 무릎 뿐만 아니라 발목 팽윤의 감소에서 유의미한 효능을 입증한다.
연구 말기에 관절의 조직학적 분석은 15 mg/kg 화합물 A1에서 완전한 구조적 보존을 입증한다. 비교를 위해 비히클-투여된 동물은, 도 6a-6d에 묘사된 바와 같이, 활막 (S) 염증 및 골 흡수, 판누스 형성, 및 연골 저하의 유의미한 증거를 나타내고, 화합물 A1은 개체에서 유의미한 감소 및 무릎과 발목에 대해 합쳐진 조직병리적 스코어를 나타낸다.
분석 12: 수컷 Balb /c 마우스에서 급성 CSE 유도 세포 침윤
동물 (수컷 Balb/c 마우스)을 실험 시작 전 7일간 적응시킨다. 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위로 분배한다. 1일에, 마우스에게 경구/비강내 경로에 의해 시험 화합물 또는 비히클을 투여하고, 시험 화합물 투여 1시간 후 동물을 에테르로 마취시키고, 담배 연기 추출물을 50μl/마우스의 부피로 비강내 경로에 의해 투여하고, 4일간 (d1 내지 d4) 시험 화합물 투여 후 매일 동물에 CSE 노출시키는 것을 반복하였다. 5일에, 마지막 CSE 노출 24시간 후, 동물을 마취 하에 은 방혈시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 폐를 기관 캐뉼라(총 용적 2 ml) 를 통해 0.5-ml 분취량의 헤파린화된 PBS (1 unit/ml)로 4회 세척한다. 총 세포 및 백분율 백혈구 계수를 위해 분석시까지 BAL을 2-8℃에서 보관한다. 기관지폐포액을 원심분리하고 (10분간 500×g), 수득한 세포 펠렛을 0.5 ml의 헤파린화된 염수에 재현탁시킨다. 백혈구 세포의 총 수를 혈액 세포 계수기를 이용하여 BAL 액과 혈액에서 결정하고 1×106 세포/ml로 조정한다. 백분율 세포 계수를 수작업으로 계산한다. 40 μl의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리하여 세포 도말표본을 제조한다. 세포 도말표본을 분화용 혈액 염색 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 그것의 형태적 특성에 따라 호산구를 확인한다. 세포 도말표본에서 300개의 백혈구 세포 중 각 세포 유형의 수를 결정하고, 백분율로 표시하며, 각 BALf에서 중성구 및 대식세포의 수를 계산한다.
분석 13: 수컷 Balb /c 마우스에서 아만성 (Sub-chronic) CSE 유도 세포 침윤
동물 (수컷 Balb/c 마우스)을 실험 시작 전 7일간 적응시킨다. 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위 분배한다. 1일에, 동물을 에테르로 마취시키고, 담배 연기 추출물을 50μl/마우스의 부피로 비강내 경로에 의해 투여하고, 동물을 8일 동안 (d1 내지 d8) 매일 CSE에 노출시키는 것을 반복한다. 9일에, 마우스에게 경구/비강내 경로에 의해 시험 화합물 또는 비히클을 투여하고 시험 화합물 투여 1시간 후 동물을 에테르로 마취시키고, 담배 연기 추출물을 50μl/마우스의 부피로 비강내 경로에 의해 투여하고, 동물을 다음 3일 동안 (d9 내지 d11) 시험 화합물 투여 후 매일 CSE에 노출시키고, 12일에, 마지막 CSE 노출 24시간 후, 동물을 마취 하에 방혈시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 폐를 기관 캐뉼라 (총 용적 2 ml)를 통해 0.5-ml 분취량의 헤파린화된 PBS (1 unit/ml)로 4회 세척한다. BAL을 총 세포 및 백분율 백혈구 계수를 위해 분석시까지 2-8℃에서 보관하여야 한다. 기관지폐포액을 원심분리하고 (10분간 500×g), 수득한 펠렛을 0.5 ml의 헤파린화된 염수에 재현탁시킨다. 백혈구 세포의 총 수를 혈액 세포 계수기를 이용하여 BAL 액과 혈액에서 결정하고 1×106 세포/ml로 조정한다. 백분율 세포 계수를 수작업으로 계산한다. 40 μl의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리하여 세포 도말표본을 제조한다. 세포 도말표본을 분화용 혈액 염색 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 그것의 형태적 특성에 따라 호산구를 확인한다. 세포 도말표본에서 300개의 백혈구 세포 중 각 세포 유형의 수를 결정하고, 백분율로 표시하며, 각 BALf에서 중성구 및 대식세포의 수를 계산한다.
분석 14: 담배 연기 추출물 유도된 폐 염증 ( COPD ) 모델에서 코르티코스테로이드 무감각의 반전
암컷 Balb/c 마우스를 실험 시작 전 7일간 적응시킨다. 그리고 나서, 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위 분배한다. 1일에, 동물을 에테르로 마취시키고, 담배 연기 추출물을 50μl/마우스의 부피로 비강내 경로에 의해 투여하고, 동물을 다음 5일 동안 (d1 내지 d6) 매일 CSE에 노출시키는 것을 반복한다. 7일에, 마우스에게 경구 위관영양법에 의해 10 mg/kg으로 덱사메타존을 투여하고, 60분 후, 마우스에게 비강내 경로에 의해 CSE를 투여하고, 이를 다음 4일 동안 (d7 내지 d11) 반복한다. 9일부터 11일까지, 동물에게 경구/비강내 경로에 의해 시험 화합물 또는 비히클을 투여하고, 덱사메타존 투여 30분 후 및 30분 후 동물을 에테르로 마취시키고, 담배 연기 추출물을 50μl/마우스의 부피로 비강내 경로에 의해 투여하고, 동물을 다음 2일 동안 (d9 내지 d11) 시험 화합물 투여 후 매일 CSE에 노출시키고, 12일에, 마지막 CSE 노출 24시간 후, 동물을 마취 하에 방혈시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 폐를 기관 캐뉼라 (총 용적 2 ml)를 통해 0.5-ml 분취량의 헤파린화된 PBS (1 unit/ml)로 4회 세척한다. BAL은 총 세포 및 백분율 백혈구 계수를 위해 분석시까지 2-8℃에서 보관하여야 한다. 기관지폐포액을 원심분리하고 (10분간 500×g), 수득한 세포 펠렛은 0.5 ml의 헤파린화된 염수에 재현탁시켜야 한다. 백혈구 세포의 총 수를 혈액 세포 계수기를 이용하여 BAL 액과 혈액에서 결정하고 1×106 세포/ml로 조정한다. 백분율 세포 계수를 수작업으로 계산한다. 40 μl의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리하여 세포 도말표본을 제조한다. 세포 도말표본을 분화용 혈액 염색 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 그것의 형태적 특성에 따라 호산구를 확인한다. 세포 도말표본에서 300개의 백혈구 세포 중 각 세포 유형의 수를 결정하고, 백분율로 표시하며, 각 BAL 액에서 중성구 및 대식세포의 수를 계산한다.
분석 15: 수컷 Balb /c 마우스에서 급성 담배 연기 유도된 세포 침윤
동물 (male Balb/c 마우스)을 실험 시작 전 7일간 적응시킨다. 그리고 나서, 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위 분배한다. 1일에, 마우스에게 경구/비강내 경로에 의해 시험 화합물 또는 비히클을 투여하고, 시험 화합물 투여 1시간 후 동물을 몸 전체 노출 상자에 넣는다. 1일과 2일에, 마우스를 6개 담배의 주류 연기에 노출시키고, 3일에 8개 담배, 및 4일에 10개 담배에 노출시킨다. 각 담배 연기에의 노출은 10분간 지속한다 (담배는 처음 2분 이내에 완전 연소되며, 이후 동물 환기장치를 이용하여 송풍하고 다음 20분간 신선한 실내 공기로 노출시킨다). 매 2번째 담배 이후, 신선한 실내 공기에 의노출로 20분의 부가적인 휴식을 수행한다. 대조군 동물은 실내 공기 챔버에 노출시킨다. 1일부터 4일까지 동물에게 경구 또는 비강내 경로로 시험 화합물을 투여한다. 5일에, 마지막 담배 연기 (CS) 노출 24시간 후, 동물을 마취 하에 방혈시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하고, 폐를 기관 캐뉼라 (총 용적 2 ml)를 통해 0.5-ml 분취량의 헤파린화된 PBS (1 unit/ml)로 4회 세척한다. 수집된 기관지폐포 (BAL)를 총 세포 및 백분율 백혈구 계수를 위해 분석시까지 2-8℃에서 보관한다. BAL 유체를 원심분리하고 (10분간 500×g), 수득한 세포 펠렛을 0.5 ml의 헤파린화된 염수에 재현탁시킨다. 백혈구 세포의 총 수를 혈액 세포 계수기를 이용하여 BAL 액과 혈액에서 결정하고 1×106 세포/ml로 조정한다. 백분율 세포 계수를 수작업으로 계산한다. 40 μl의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리하여 세포 도말표본을 제조한다. 세포 도말표본을 분화용 혈액 염색 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 그것의 형태적 특성에 따라 호산구를 확인한다. 세포 도말표본에서 300개의 백혈구 세포 중 각 세포 유형의 수를 결정하고, 백분율로 표시하며, 각 BAL 액에서 중성구 및 대식세포의 수를 계산한다.
결과: 도 7A 및 7b에 묘사된 바와 같이, 화합물 A1은 BALF 내로의 대식세포 및 중성구 침윤을 감소시켰고, 이로써 만성 폐쇄성 폐질환에서의 치료적 역할을 나타내었다.
분석 16: 마우스에서 난백알부민 -유도된 코 호산구 및 중성구 축적
동물 (마우스)을 실험 시작 전 7일간 적응시킨다. 그리고 나서, 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위로 분배한다. 1일 및 5일에 동물을 OVA (40 μg/kg i.p.)로 면역화시킨다. 코에서 국소적인 염증 반응을 유발하기 위해, 마우스에 OVA (염수 중의 3% OVA)를 12-19일에 비강내로 (10μL/콧구멍) 반복적으로 투여한다.
19일에 단식하지 않은 마우스에게 최종 OVA 공격 시작 2시간 전에 비히클 또는 시험 화합물을 비강내로 (10μL/콧구멍) 투여한다. 2시간 후, 각 동물에게 최종 비강내 OVA (3%) 공격을 투여한다. 추가 8시간 후, 각 동물을 마취시키고, 후비공 앞 약 1 mm에 있는 위치까지 연장하는 부리모양으로 이식된 기관 캐뉼라를 통해 후비공 내로 1 ml의 PBS를 주입함으로써 코 세척을 수행한다. 이 절차는 대략 2 ml의 세척액을 생성할 때까지 반복되어야 한다. 코 세척액 샘플 내의 총 세포수를 혈구계를 이용하여 측정한다. 실온에서 2분간 1200 rpm에서 원심분리하여 코 세척액 샘플의 사이토스핀 도말표본을 제조하고, 백분율 세포 계수를 위해 Diff-Quik 염색 시스템 (Dade Beh)을 이용하여 염색한다. 세포를 액침 현미경검사를 이용하여 계수한다.
분석 17: 마우스에서 폴리 - l:C -유도된 세포 축적
특정 병원균이 없는 A/J 마우스 (수컷, 5주령)를 실험 시작 전 7일간 적응시킨다. 그리고 나서, 동물을 체중에 기초하여 다양한 그룹으로 무작위 분배한다. 동물에게 3% 이소플루란으로 마취 하에 3일간 매일 2회씩 비강내로 폴리 (l:C)-LMW (폴리-IC; 1 mg/mL, 40 μL)를 투여한다. 동물에게 각 폴리-l:C 처리 2시간 전 비강내로 시험 화합물 (50% DMSO/PBS 중의 35 μl의 용액)을 처리한다. 마지막 폴리-l:C 공격 24시간 후, 동물을 마취시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하고, BALF를 수집한다. BALF 내의 폐포 대식세포 및 중성구의 농도를 혈구 계수기를 이용하여 결정하고 1×106 세포/ml로 조정한다. 백분율 세포 계수를 수작업으로 계산한다. 40 μl의 세포 현탁액을 사이토스핀 3을 이용하여 원심분리하여 세포 도말표본을 제조한다. 세포 도말표본을 분화용 혈액 염색 용액으로 염색하고 현미경으로 관찰하여 그것의 형태적 특성에 따라 호산구를 확인한다. 세포 도말표본에서 300개의 백혈구 세포 중 각 세포 유형의 수를 결정하고, 백분율로 표시하며, 각 BAL 액에서 중성구 및 대식세포의 수를 계산한다.
본원에서 본 발명이 특정한 구현예를 참조하여 기재되었음에도 불구하고, 이들 구현예는 본 발명의 원리 및 적용을 단지 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상기 예시적인 구현예에 수많은 변형이 이뤄질 수 있으며, 상기 기재된 본 발명의 취지 및 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다른 배열이 고안될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 첨부된 청구항들은 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구항 및 이들의 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 보호되는 것으로 의도된다.
화합물 A1의 약제학적 조성물
실시예 I
5 또는 10 mg의 화합물 A1을 함유하는 하기 기재된 캡슐이 제조된다.
Figure 112016000775123-pct00005
실시예 II
25, 50, 또는 100 mg의 화합물 A1을 함유하는 하기 기재된 캡슐이 제조된다.
Figure 112016000775123-pct00006
본 출원에 인용된 모든 공보 및 특허 및/또는 특허 출원은 각각의 개별적인 공보 또는 특허 출원이 참고로 본원에 편입된 것으로 명시적으로 그리고 개별적으로 나타낸 것과 같은 정도로 참고로 본원에 편입된다.

Claims (21)

  1. 2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 화합물.
  2. (S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 화합물은 (R)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온, 및 이의 약제학적 허용가능한 염이 없는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 화합물은 95%보다 큰 거울상이성질체 과잉률을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. (S)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 화합물은 (R)-2-(1-(9H-퓨린-6-일아미노)프로필)-3-(3-플루오로페닐)-4H-크로멘-4-온이 없는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 화합물은 95%보다 큰 거울상이성질체 과잉률을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 세포를 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 효과적인 양과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내에 존재하는 PI3 δ 키나아제의 촉매적 활성을 억제하는 방법:
    여기서 세포는 인체 내 존재하는 것이 아님.
  9. 세포를 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 효과적인 양과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내에 존재하는 PI3 γ 키나아제의 촉매적 활성을 억제하는 방법:
    여기서 세포는 인체 내 존재하는 것이 아님.
  10. 세포를 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 효과적인 양과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내에 존재하는 PI3 δ 키나아제 및 PI3 γ의 촉매적 활성을 억제하는 방법:
    여기서 세포는 인체 내 존재하는 것이 아님.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 백혈병 치료용 약제학적 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 치료용 약제학적 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 류마티스성 관절염, 건선, 낭창 또는 실험적인 자가면역 뇌척수염 (EAE) 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종 (HL), 급성 골수 백혈병 (AML), 다발성 골수종 (MM), 소 림프구 림프종 (SLL), 또는 지연성 비-호지킨 림프종 (I-NHL) 질환 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, PI3K 연관된 질환, 장애 또는 병태의 치료용 약제학적 조성물:
    여기서, PI3K 연관된 질환, 장애 또는 병태는 급성 림프구 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B-세포 림프종, T- 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구 백혈병, 골관절염, 알러지성 비염 및 홍반성 낭창으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임.
  17. 제 15 항에 있어서, 적어도 하나의 다른 항암제를 더 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  18. 삭제
  19. 삭제
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  21. 삭제
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