KR102292506B1 - Colorimetric detection system by Enzyme-linked immunosorbent assay using adhesive colorant - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 비색계 시약으로 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 방법 및 시스템, 상기 시스템이 구비된 바이오칩에 관한 것으로, 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물이 효소를 통해 올리고머화 및/또는 중합화되면 접착 특성을 가진 발색체를 형성하므로 분석 대상(바이오마커 등)의 주변 확산이나 흩어지는 현상 없이 표면 접착되어 농축된 고민감도의 가시적 정량 신호를 제공할 수 있다. 또한, 이러한 발색체의 접착을 통해 제공되는 공간적 신호는 표적의 위치 정보를 정량 신호와 함께 제공하며, 2차원에 국한되지 않고 3차원의 세포 표면이나 나노/마이크로입자와 같은 표면에서의 신호도 제공될 수 있다.The present invention relates to a method and system for colorimetric detection of an enzyme immunoreaction comprising a phenol compound or a catechol compound as a colorimetric reagent, and a biochip equipped with the system, wherein the phenol compound or catechol compound is oligomerized and/or polymerized through an enzyme Since it forms a chromophore with adhesive properties, it adheres to the surface without the surrounding diffusion or scattering of the analyte (biomarker, etc.), providing a concentrated, highly sensitive visible quantitative signal. In addition, the spatial signal provided through the adhesion of these chromogens provides the target position information together with the quantitative signal, and is not limited to two-dimensional but also provides a three-dimensional signal on the surface of a cell or a surface such as nano/microparticle. can be

Description

접착성 발색체를 이용한 효소 면역반응 비색 검출 시스템{Colorimetric detection system by Enzyme-linked immunosorbent assay using adhesive colorant}TECHNICAL FIELD [0002] Colorimetric detection system by Enzyme-linked immunosorbent assay using adhesive colorant

효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용한 비색 검출 시스템으로서, 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 전구체로 이용한 접착성 발색체를 포함하는 비색 검출 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a colorimetric detection system using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and to a colorimetric detection system including an adhesive chromogen using a phenol compound or a catechol compound as a precursor.

분자 프로브(Molecualr probe)는 분자 진단에 필수적인 바이오 마커의 정성적 및 정량적 평가를 위해 연구되어 왔다. 분자 프로브는 표적을 인식할 수 있을뿐만 아니라, 광학(optical), 압전기(piezoelectric), 전기화학(electrochemical), 중량(gravimetric), 화학 발광 감지(chemiluminescence sensing)를 위해 감지 가능한 증폭된 신호를 제공한다. 그 중에서도 발색체(colorant)는 비색 생체 분석에서 특별한 장비 없이도 편리하게 판독이 가능하다는 주목할 만한 이점이 있어 주목받고 있다. 비색 시각화는 이미 제조된 발색체를 바이오마커에 직접 결합/위치시키거나, 효소로 매개된 발색체를 표적 특이적 방식으로 합성하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 시중에 판매되는 임신 테스트기와 같은 측방 유동 면역 분석(lateral-flow immunoassays)에서는 금이나 은과 같은 금속 나노입자의 강한 소광(light extinction)을 이용하여 표면에 포획된 표적을 직접 표시하는 방식으로 사용되어 왔다. 이러한 금속 나노입자의 크기에 따른 색의 변화는 비색 시각화 방법에서 응집에 기반한 표적 감지를 할 수 있게 하는 또 다른 특성이다. 무기 나노물질뿐만 아니라 유기 나노물질도 사용될 수 있는데, 특히 화학적 결합 교대에 의한 이들의 흡수 스펙트럼 변화로부터 금속 이온과 같은 작은 분자를 검출하는데 주로 사용된다.Molecular probes have been studied for qualitative and quantitative evaluation of biomarkers essential for molecular diagnosis. Molecular probes can not only recognize a target, but also provide a detectable amplified signal for optical, piezoelectric, electrochemical, gravimetric, and chemiluminescence sensing. . Among them, a colorant is attracting attention because it has a remarkable advantage that it can be conveniently read without special equipment in colorimetric bioanalysis. Colorimetric visualization can be achieved by directly binding/locating a previously prepared chromophore to a biomarker, or by synthesizing an enzyme-mediated chromogen in a target-specific manner. For example, lateral-flow immunoassays, such as commercially available pregnancy tests, use light extinction of metal nanoparticles such as gold and silver to directly mark entrapped targets on the surface. has been used in a way The color change according to the size of these metal nanoparticles is another characteristic that enables aggregation-based target detection in a colorimetric visualization method. Inorganic nanomaterials as well as organic nanomaterials can be used, especially for detecting small molecules such as metal ions from changes in their absorption spectra due to chemical bond alternation.

그러나 이러한 종류의 발색체는 표적에 직접적으로 결합하며, 추가적인 신호 증폭 반응이 없기 때문에 눈으로 감지되는 농도 한계인 ~ ng/mL 보다 낮은 농도의 표적 검출이 어려우며, 분석 감도가 좋지 않다. 또한 어떤 경우에는 표적이 결합하여 색이 변한 분자가 표적이 결합되지 않은 분자와 함께 존재하면서 혼합된 색이 생겨 비색 검출에 어려움을 주기도 한다. 한편, 한개의 효소가 수천 개의 유기 발색체를 생성하는 현상을 이용한 효소 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)과 같은 효소 매개 감지법에서는 수천배로 증폭된 비색 신호를 얻을 수 있기 때문에 발색 한계가 ~pg/mL까지 내려갈 수 있다. 효소뿐만 아니라 효소의 활성을 모방한 촉매 나노 입자와 디옥시리보자임(deoxyribozymes, DNAzymes)도 표적-특이적 증폭 방식에서 효소와 마찬가지로 표적 농도에 비해 수천배로 증폭된 농도의 발색체를 합성하는데 활용될 수 있다.However, this type of chromophore directly binds to the target, and since there is no additional signal amplification reaction, it is difficult to detect a target at a concentration lower than the eye-detectable concentration limit of ~ng/mL, and the assay sensitivity is poor. Also, in some cases, a color-changed molecule due to binding of a target exists together with a molecule to which a target is not bound, resulting in a mixed color, which makes colorimetric detection difficult. On the other hand, in enzyme-mediated detection methods such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), which use the phenomenon that one enzyme generates thousands of organic chromogens, colorimetric signals amplified thousands of times can be obtained, so there is a limit to color development. It can go down to ~pg/mL. In addition to enzymes, catalyst nanoparticles that mimic the activity of enzymes and deoxyribozymes (DNAzymes) can also be used in target-specific amplification methods, like enzymes, to synthesize a chromophore at a concentration that is amplified thousands of times compared to the target concentration. .

그러나, 효소나 촉매에 의해 만들어진 발색체는 이들이 포획되지 않는 한 접착 특성을 갖지 않기 때문에 대부분 용액에 용해되거나 분산된다. 이러한 용액에서 염료나 안료의 확산은 가시적 스펙트럼 신호를 희석시키게 되고 게다가 전혈(whole blood)과 같이 고유한 기본 색이 있는 복합 바이오-유체를 갖는 바이오마커는, 분석 전에 바이오마커가 정제되고 무색(colorless)의 배지에 재분산되지 않는 한 용액에 용해된 발색체를 통해 검출될 수 없다. 또한 용액기반 분석은 피펫과 용기와 같은 장치 및 추가적인 용액 전달 단계가 필요하다는 단점이 있다.However, since chromogens made by enzymes or catalysts do not have adhesive properties unless they are captured, they are mostly dissolved or dispersed in solution. Diffusion of dyes or pigments in these solutions will dilute the visible spectral signal and moreover, biomarkers with complex bio-fluids with intrinsic primary colors, such as whole blood, can be purified and colorless prior to analysis. ) cannot be detected through the chromogen dissolved in solution unless redispersed in the medium of Solution-based assays also have the disadvantage of requiring equipment such as pipettes and vessels and additional solution delivery steps.

멜라닌(melanin)은 식물, 미생물 및 인간을 포함하는 동물에서 보편적으로 발견되는 천연 안료이다. 멜라닌은 멜라닌형성(melanogenesis)이라고도 불리는 멜라닌 생합성 과정 동안 생성된 화학적 구조의 변화로 다양한 색이 결정된다. 유멜라닌(eumelanin)은 눈, 머리카락 및 피부에서 적갈색 내지 검은색을 담당하는데, 주로 5,6-dihydroxyindole(DHI)와 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) 서브유닛으로 구성된다. 이들 빌딩 블록은 티로시나아제(tyrosinase), 라카아제(laccase) 및 다른 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidases)를 통한 타이로신(tyrosine), 3,4-hydroxyphenylalanine(DOPA), dopamine(DA)와 같은 전구체 산화로부터 시작되며, 효소에 의해 산화된 이들 전구체는 더 나아가 다양한 화학적 구조로 올리고머화 및/또는 중합화되면서 색을 띠게 된다. 황갈색 페오멜라닌(pheomelanin)의 생합성에서는 효소에 의해 산화된 전구체와 아미노산 시스테인이 무작위로 반응하면서 DHI 및 DHICA를 형성하는 것 외에도 벤조티아진(benzothiazine) 서브유닛을 형성하기 때문에 최종적으로 올리고머화 및/또는 중합화된 멜라닌 화학적 구조의 다양성이 더 크다. 흥미롭게도 전구체 DA로부터 합성된 멜라닌(폴리도파민, pDA)은 이들이 갖는 통상적인 멜라민-유사 특성 외에도 다목적 접착 특성으로 인해 많은 주목을 받고 있다. pDA는 홍합 접착 단백질(mussel adhesive proteins)의 카테콜(catechol)과 아민기의 가설적 시너지효과에 영감을 얻은 표면 생체기능화를 위한 접착성 유기물질로 처음 개발되었다. 그 이후로 pDA는 멜라닌과의 화학적 구조의 유사성이 밝혀짐에 따라 대표적인 인공 멜라닌 모델로 사용되고 있다. 표면 코팅 또는 물-분산 나노입자로서, pDA 및 다른 인공 멜라닌은 염료 및 안료, 생체적합성 자외선 차단제, 바이오 센서의 나노 프로브, 약물 전달 비히클 및 치료제 등으로 널리 사용되어 왔다.Melanin is a natural pigment commonly found in plants, microorganisms and animals including humans. Melanin has various colors due to changes in the chemical structure produced during the process of melanin biosynthesis, also called melanogenesis. Eumelanin is responsible for the reddish-brown to black color in the eyes, hair and skin, mainly composed of 5,6-dihydroxyindole (DHI) and 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) subunits. These building blocks are oxidized to precursors such as tyrosine, 3,4-hydroxyphenylalanine (DOPA) and dopamine (DA) via tyrosinase, laccase and other polyphenol oxidases. , and these precursors oxidized by enzymes are further colored by oligomerization and/or polymerization into various chemical structures. In the biosynthesis of tan pheomelanin, the enzyme-oxidized precursor and amino acid cysteine react randomly to form DHI and DHICA, as well as to form benzothiazine subunits, so finally oligomerization and/or There is greater diversity in the chemical structure of polymerized melanin. Interestingly, melanin (polydopamine, pDA) synthesized from the precursor DA has attracted much attention due to its versatile adhesive properties in addition to the conventional melamine-like properties they possess. pDA was first developed as an adhesive organic material for surface biofunctionalization inspired by the hypothetical synergistic effect of catechol and amine groups in mussel adhesive proteins. Since then, pDA has been used as a representative artificial melanin model as similarities in chemical structure with melanin have been revealed. As surface coatings or water-dispersible nanoparticles, pDA and other artificial melanin have been widely used as dyes and pigments, biocompatible sunscreens, nanoprobes in biosensors, drug delivery vehicles and therapeutics, etc.

본 발명자들은 천연 멜라닌 및 멜라닌-유사 탄소 나노 소재의 가시광선 흡광 및 다용도 접착성의 두가지 특성을 결합하여 바이오 마커의 고감도 육안 검출을 위한 새로운 접착성 발색체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors have completed the present invention by developing a novel adhesive colorant for high-sensitivity visual detection of biomarkers by combining the two characteristics of natural melanin and melanin-like carbon nanomaterials of visible light absorption and versatile adhesion.

본 발명의 일 목적은, 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 비색계 시약으로 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a colorimetric detection system for an enzyme immunoreaction comprising a phenol compound or a catechol compound as a colorimetric reagent.

본 발명의 다른 일 목적은, 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 비색계 시약으로 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템이 칩 위에 구비된 바이오칩을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biochip equipped with a colorimetric detection system for an enzyme immunoreaction comprising a phenol-based compound or a catechol-based compound as a colorimetric reagent.

본 발명의 또 다른 일 목적은, 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 비색계 시약으로 한 효소 면역반응을 통한 비색 검출법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a colorimetric detection method through an enzymatic immune reaction using a phenolic compound or a catechol compound as a colorimetric reagent.

상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above object,

본 발명은 효소가 표지된 항체; 및The present invention relates to an enzyme-labeled antibody; and

효소와의 반응에 의해 국소적으로 농축되면서 발색될 수 있는 비색계 시약을 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템으로서,An enzyme immunoreaction colorimetric detection system comprising a colorimetric reagent capable of developing color while being locally concentrated by reaction with an enzyme,

상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 제공한다.The colorimetric reagent provides an enzyme immunoreaction colorimetric detection system, characterized in that it contains a phenol compound or a catechol compound.

또한, 본 발명은 효소와의 반응에 의해 표적 주변에 부착되면서 발색될 수 있는 비색계 시약을 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템이 칩 위에 구비된 바이오칩으로서,In addition, the present invention provides a biochip equipped with an enzyme immunoreaction colorimetric detection system including a colorimetric reagent capable of developing color while attached to the periphery of a target by reaction with an enzyme on a chip,

상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오칩을 제공한다.The colorimetric reagent provides a biochip, characterized in that it contains a phenol compound or a catechol compound.

또한, 본 발명은 분석 대상 항원과, 효소가 표지된 항체를 인식시키는 단계;In addition, the present invention comprises the steps of recognizing an antigen to be analyzed and an enzyme-labeled antibody;

비색계 시약을 첨가하여 상기 효소와 반응시킴으로써 접착성 발색체를 형성하는 단계; 및forming an adhesive colorant by adding a colorimetric reagent to react with the enzyme; and

표적 주위에 부착 및 농축된 발색체의 발광량을 측정하는 단계;measuring the luminescence amount of the chromogen attached and concentrated around the target;

를 포함하는 효소 면역반응을 통한 비색 검출법으로서,As a colorimetric detection method through an enzyme immune reaction comprising:

상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응을 통한 비색 검출법을 제공한다.The colorimetric reagent provides a colorimetric detection method through an enzyme immunoreaction, characterized in that it contains a phenol compound or a catechol compound.

본 발명에 따른 효소 면역반응을 통한 비색 검출 시스템은 페놀류 화합물 또는 카테콜성 화합물을 전구체로 사용하여, 효소를 통해 접착성 있는 발색체를 형성할 수 있는데, 이 접착성 발색체는 합성되는 동시에 확산 현상 없이 표적에 접착됨으로써 농축된 고민감도의 가시적 신호를 제공하므로 기존의 용액 기반의 비색 검출법의 낮은 검출 한계를 극복할 수 있다. 나아가 발색 신호의 세기에 따른 표적의 정량분석과 함께 표적의 위치 정보를 제공할 수 있다.The colorimetric detection system through an enzyme immune reaction according to the present invention uses a phenolic compound or a catecholic compound as a precursor, and can form an adhesive chromogen through an enzyme, which is synthesized and diffused at the same time It provides a concentrated, highly sensitive visible signal by adhering to the target without the need to overcome the low detection limit of the existing solution-based colorimetric detection method. Furthermore, it is possible to provide target location information along with quantitative analysis of the target according to the intensity of the color signal.

도 1은 종래의 비색 검출법과 본 발명에서 제공하는 비색 검출 시스템을 비교하기 위하여 간단한 모식도로 나타낸 도면이다.
도 2는 멜라닌 합성에 사용되는 효소인 티로시나아제, 라카아제와 효소 면역 측정법에서 주요 사용되는 홀스라디시 퍼옥시다제(HRP)를 이용하여 효소를 통한 발색체 생성 조절 분석 실험 결과를 촬영한 사진이다.
도 3은 멜라닌 합성에 사용되는 효소인 티로시나아제, 라카아제와 효소 면역 측정법에서 주요 사용되는 홀스라디시 퍼옥시다제(HRP)를 이용하여 효소를 통한 발색체 생성 조절을 UV-Vis 스펙트로포토미터을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 전구체의 화학적 구조에 따른 발색체 형성 속도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 아민을 포함하는 분자와 카테콜류 화합물의 접착성 시너지 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템의 공간적 접착 과정을 간단한 모식도로 나타낸 도면이다.
도 7은 종래 HRP에 의한 발색을 위해 통상적으로 사용되는 전구체와 본 발명에 따른 비색 검출 시스템에 사용되는 전구체를 이용하여 형성된 발색체의 공간적 접착 효율을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명에 따른 전구체를 이용하여 효소의 농도에 따른 공간적 접착 효율을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 상기 도 8에 따른 실험결과를 설명할 수 있는 도면으로서, 효소에 의해 전환되는 전구체의 화학적 구조에 따른 반응 모식도를 나타낸 도면이다.
도 10은 pH에 따른 전구체의 산화 정도 및 이에 따른 배경색 생성 여부를 확인하기 위하여 서로 다른 3가지 pH 조건에서 효소 면역반응 비색 검출법을 진행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템의 H2O2 농도에 따른 공간적 접착 효율(왼쪽) 및 전구체 농도에 따른 공간적 접착 효율(오른쪽)을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 96 well-plate 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행한 실험의 간단한 모식도를 나타낸 도면이다.
도 13은 96 well-plate 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행할 때, 전구체의 농도(왼쪽) 및 H2O2 농도(오른쪽)에 따른 용액상 및 표면 전체의 발색체 총 생성량(검은색 선) 및 용액을 제거한 후 표면에 접착된 양(적색 선)을 나타낸 도면이다.
도 14는 96 well-plate 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행할 때, AFP의 농도에 따른 용액상 및 표면 전체의 발색체 총 생성량(검은색 선) 및 용액을 제거한 후 표면에 접착된 양(적색 선)을 나타낸 도면이다.
도 15는 나이트로섬유소막 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행할 때, AFP의 농도에 따른 공간접 접착 결과 및 스팟에 접착되어 형성된 발색체의 진하기를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 3차원적 세포 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행한 실험의 간단한 모식도를 나타낸 도면이다.
도 17은 3차원적 세포 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행한 결과로서, 인간 결장 암 세포주 (SW480, SW620)에서 바이오마커 모델인 EpCAM, EGFR, MUC1 및 CD133의 세포 표면 분포를 나타낸 도면이다.
도 18은 3차원적 세포 표면에서 본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 진행한 결과로서, 인간 결장 암 세포주 (SW480, SW620)에서 바이오마커 모델인 EpCAM, EGFR, MUC1 및 CD133의 세포 표면 발현 수준을 UV-Vis 분광광도계를 통해 정량적으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing a simple schematic diagram for comparing the conventional colorimetric detection method and the colorimetric detection system provided in the present invention.
2 is a photograph taken of the results of an assay for controlling chromogen production through enzymes using tyrosinase, laccase, which are enzymes used for melanin synthesis, and horseradish peroxidase (HRP), which is mainly used in enzyme immunoassays. am.
3 is a UV-Vis spectrophotometer to control chromogen production through enzymes using tyrosinase, laccase, which are enzymes used for melanin synthesis, and horseradish peroxidase (HRP), which is mainly used in enzyme immunoassay. A diagram showing the results of the analysis.
4 is a view showing the results of analyzing the chromogen formation rate according to the chemical structure of the precursor.
5 is a view showing the experimental results confirming the adhesive synergistic effect of a molecule containing an amine and a catechol compound.
6 is a schematic diagram showing the spatial adhesion process of the enzyme immunoreactive colorimetric detection system according to the present invention.
7 is a view showing the results of analyzing the spatial adhesion efficiency of a chromogen formed using a precursor commonly used for color development by conventional HRP and a precursor used for a colorimetric detection system according to the present invention.
8 is a view showing the results of analyzing the spatial adhesion efficiency according to the concentration of the enzyme using the precursor according to the present invention.
9 is a diagram illustrating the experimental results according to FIG. 8, and is a view showing a reaction schematic diagram according to the chemical structure of a precursor converted by an enzyme.
10 is a view showing the results of the enzyme immunoreaction colorimetric detection method under three different pH conditions in order to check the oxidation degree of the precursor according to the pH and whether the background color is generated accordingly.
11 is a view showing the results of analyzing the spatial adhesion efficiency according to the H 2 O 2 concentration (left) and the spatial adhesion efficiency according to the precursor concentration (right) of the enzyme immunoreaction colorimetric detection system according to the present invention.
12 is a diagram showing a simple schematic diagram of an experiment performed with an enzyme immunoreaction colorimetric detection system according to the present invention on the surface of a 96 well-plate.
13 shows the total amount of chromogen produced in the solution phase and the entire surface according to the precursor concentration (left) and H 2 O 2 concentration (right) when the enzyme immunoreaction colorimetric detection system according to the present invention is performed on the surface of a 96 well-plate. (black line) and the amount of adhesion to the surface after removing the solution (red line).
14 shows the total amount of chromogen produced (black line) in the solution phase and the entire surface according to the concentration of AFP and the surface after removing the solution when the enzyme immunoreaction colorimetric detection system according to the present invention is performed on the 96 well-plate surface. It is a diagram showing the amount of adhesion (red line).
15 is a view showing the results of analyzing the results of spatial junction adhesion according to the concentration of AFP and the darkness of the chromogen formed by adhering to the spot when the enzyme immunoreaction colorimetric detection system according to the present invention is performed on the surface of the nitrofibrin membrane. am.
16 is a diagram showing a simple schematic diagram of an experiment in which an enzyme immunoreaction colorimetric detection system according to the present invention is performed on a three-dimensional cell surface.
17 is a result of the enzyme immune response colorimetric detection system according to the present invention on a three-dimensional cell surface, and the cell surface distribution of biomarker models EpCAM, EGFR, MUC1 and CD133 in human colon cancer cell lines (SW480, SW620). is a diagram showing
18 is a result of the enzyme immune response colorimetric detection system according to the present invention on a three-dimensional cell surface, and cell surface expression of biomarker models EpCAM, EGFR, MUC1 and CD133 in human colon cancer cell lines (SW480, SW620). It is a diagram showing the result of quantitatively confirming the level through a UV-Vis spectrophotometer.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

한편, 본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.On the other hand, the embodiment of the present invention can be modified in various other forms, the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. In addition, the embodiment of the present invention is provided in order to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art. Furthermore, "including" a certain component throughout the specification means that other components may be further included, rather than excluding other components, unless otherwise stated.

전술한 바와 같이, 발색을 통한 분석물 검출은 복잡한 고가의 장비 활용 없이 색깔 변화를 눈으로 직접 확인할 수 있기 때문에 간편한 현장 검출법(point-of-care testing)으로 널리 사용되고 있다. 종래 다양한 발색의 유기분자 및 무기나노입자 등이 합성되어 왔는데, 이들을 이용한 바이오마커 검출법을 크게 2가지 기술적 접근법으로 구분하여, 1) 검출하고자 하는 분석물(바이오마커)와의 1:1 결합을 통한 발색 표지, 2) 분석물(바이오마커)에 결합한 항체 또는 항체 모사 유무기 촉매를 통한 발색체 합성법으로 나눌 수 있다. 그러나, 상기 1) 방법의 1:1 결합을 통한 발색은 근본적으로 분석물의 양에 해당하는 만큼의 발색 신호가 나타나기 때문에 신호 증폭이 없어서 고민감도 검출이 어렵고, 용액 상에 분석물과 결합된 발색체와 결합되지 않은 발색체가 섞여 있는 경우에는 두 가지 발색체 색깔의 혼합물이 얻어져 신호 확보가 어렵다는 단점이 있다. 상기 2) 방법을 통한 비색 검출법은 항원에 결합된 한 개의 항체-효소에서 수천개에 이르는 다량의 발색체를 형성하므로 신호 증폭의 효과는 있지만, 이때 효소로부터 형성되는 발색체는 분석물에 직접 결합하지 않고 용액상으로 퍼져나가기 때문에 용액의 부피에 따라 신호가 희석되는 문제점이 있고, 이렇게 발색체가 분석물에 직접 결합하지 않고 용액상에 떠다니기 때문에 표적의 위치를 알 수 없으며, 용액상 반응 위해 용액을 담을 용기와 피펫 등의 도구가 필요하다는 단점이 있다.As described above, the detection of an analyte through color development is widely used as a simple point-of-care testing method because the color change can be directly observed without the use of complicated and expensive equipment. Conventionally, organic molecules and inorganic nanoparticles of various colors have been synthesized, and biomarker detection methods using these are divided into two technical approaches: 1) Color development through 1:1 binding with an analyte (biomarker) to be detected It can be divided into labeling, 2) chromophore synthesis using an antibody or antibody mimicking organic-inorganic catalyst bound to an analyte (biomarker). However, since the color development through 1:1 binding in the method 1) essentially shows a color signal corresponding to the amount of the analyte, it is difficult to detect with high sensitivity because there is no signal amplification, and the chromogen bound to the analyte in solution When a chromophore that is not bound to chromogen is mixed, a mixture of two chromophore colors is obtained, which has a disadvantage in that it is difficult to secure a signal. The colorimetric detection method through method 2) forms a large amount of chromophores ranging from one antibody-enzyme bound to an antigen to several thousand, so there is an effect of signal amplification. There is a problem in that the signal is diluted according to the volume of the solution because it spreads into the solution phase without doing so, and the position of the target cannot be known because the chromogen floats in the solution phase without directly binding to the analyte. It has the disadvantage that it requires a container to contain it and tools such as a pipette.

상기 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 자연에 존재하는 카테콜 소재의 두 가지 역할인 접착성 및 발색을 접목하여 바이오마커의 고감도 육안 검출을 위한 접착성 발색 시스템을 완성하였다. 표적에 부착된 효소에 의해 대량으로 합성된 카테콜성 발색체는 접착성으로 인해 표적 주위에 달라붙음으로써, 강하게 농축 및 국소화된 신호를 통해 바이오마커의 정량적이고 공간적인 정보를 줄 수 있다. 이는 기존의 측방 유동 면역 분석(lateral-flow immunoassays) 및 ELISA와 같은 통상적 비색 바이오 분석 방법에서 사용되는 발색체의 단점을 극복할 수 있으며, 더 나아가 2차원 표면 뿐만 아니라 3차원적 표면의 표적 검출에 활용되거나 세포막과 같이 유동적이며 다양한 분자가 혼합되어 존재하는 표면에서도 수행될 수 있는 새로운 생물학적 분석방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present inventors have completed the adhesive color development system for highly sensitive visual detection of biomarkers by combining the two roles of adhesion and color development of catechol materials that exist in nature. Catecholic chromophores synthesized in large quantities by enzymes attached to the target can give quantitative and spatial information of biomarkers through strongly concentrated and localized signals by sticking around the target due to their adhesion. This can overcome the disadvantages of chromophores used in conventional colorimetric bioassay methods such as conventional lateral-flow immunoassays and ELISA, and furthermore, it is suitable for target detection of 3D surfaces as well as 2D surfaces. It provides a novel biological analysis method that can be utilized or performed on a surface where various molecules are mixed and fluid, such as cell membranes.

본 발명은 효소가 표지된 항체; 및 효소와의 반응에 의해 발색될 수 있는 비색계 시약;을 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템으로서,The present invention relates to an enzyme-labeled antibody; and a colorimetric reagent capable of developing color by reaction with an enzyme; an enzyme immunoreaction colorimetric detection system comprising:

상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템을 제공한다.The colorimetric reagent provides an enzyme immunoreaction colorimetric detection system, characterized in that it contains a phenol compound or a catechol compound.

상기 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물은 상기 효소를 통해 산화된 후 올리고머화 반응 및/또는 중합반응에 의해 발색체를 형성한다. 이때 형성된 발색체는 강한 접착 특성을 가지므로 효소 면역반응이 일어나는 플레이트(plate) 즉, 분석대상(바이오마커 등)의 주변 표면에 국소적으로 접착되어 스팟을 형성할 수 있다.The phenolic compound or the catechol compound is oxidized through the enzyme, and then forms a colorant by oligomerization and/or polymerization. Since the formed chromophore has a strong adhesive property, it can form a spot by locally adhering to the peripheral surface of a plate on which an enzyme immune reaction occurs, that is, an analyte (biomarker, etc.).

이때, 상기 플레이트 또는 표면은 2차원적인 종이일 수도 있고, 나이트로섬유소막일 수도 있고, 96 well-plate일 수도 있는데 효소 면역 측정법 등에서 통상적으로 사용되는 막, 표면, 기질이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 세포막과 같은 3차원적 막에도 적용될 수 있다.In this case, the plate or surface may be a two-dimensional paper, may be a nitrofibrin membrane, may be a 96 well-plate, but any membrane, surface, or substrate commonly used in enzyme immunoassays, etc. may be used without limitation. In addition, it can be applied to three-dimensional membranes such as cell membranes.

상기 효소는 홀스래디쉬퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 키모트립신(chymotrypsin), 트립신(trypsin), 서브틸리신(subtilisin), 리파아제(lipase), 소이빈페록시다아제 (soybean peroxidase), 클로로페록시다아제(chloroperoxidase), 망가네이즈페록시다아제(manganese peroxidase), 티로시나아제(tyrosinase), 라카아제(laccase), 셀룰로오즈(cellulose), 자일라네이즈(xylanase), 락타아제(lactase), 수크로오즈(sucrose), 오가노포스포하이드로라아제(organophosphate hydrolase), 클로리네스테라아제(cholinesterase), 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 알코올 데하이드로제나아제(alcohol dehydrogenase), 글루코스 디하이드로제나아제(glucose dehydrogenase), 히이드로제나아제(hydrogenase) 및 글루코스 이소머라아제(glucose isomerase)로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.The enzyme is horseradish peroxidase (HRP), chymotrypsin (chymotrypsin), trypsin (trypsin), subtilisin (subtilisin), lipase (lipase), soybean peroxidase (soybean peroxidase), chloroperoxy Chloroperoxidase, manganese peroxidase, tyrosinase, laccase, cellulose, xylanase, lactase, sucrose (sucrose), organophosphate hydrolase, cholinesterase, glucose oxidase, alcohol dehydrogenase, glucose dehydrogenase , It may be selected from the group consisting of hydrogenase (hydrogenase) and glucose isomerase (glucose isomerase).

상기 카테콜류 화합물은 피로카테콜(pycatechol, PC), 피로갈롤(pyrogallol, PG), 3,4-하이드록시페닐알라닌(3,4-hydroxyphenylalanine, DOPA), 도파민(dopamine), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine, 5-HODA), 6-하이드록시도파민(6-hydroxydopamine, 6-HODA), 노르에피네프린(norepinephrine) 및 3,4-다이하이드록시신남산(3,4-dihydroxycinnamic acid, DHCA)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.The catechol compounds are pycatechol (PC), pyrogallol (PG), 3,4-hydroxyphenylalanine (DOPA), dopamine (dopamine), chlorogenic acid (Chlorogenic acid), 5-hydroxydopamine (5-HODA), 6-hydroxydopamine (6-HODA), norepinephrine and 3,4-dihydroxycinnamic acid (3,4- dihydroxycinnamic acid, DHCA).

상기 페놀류 화합물은 타이로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 옥토파민(octopamine), 시네프린(synephrine), 5-하이드록시트립토판(5-hydroxytryptophan) 및 세로토닌(serotonin)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.The phenolic compound may be selected from the group consisting of tyrosine, tyramine, octopamine, synephrine, 5-hydroxytryptophan and serotonin.

상기 비색계 시약은 아민기(-NH2 또는 -NH-)를 함유하는 분자를 더 포함할 수 있는데, 상기 아민기를 포함하는 분자는, 다이에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA), 에틸렌다이아민(ethylenediamine, EDA), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine, TETA), 트리스아미노에틸아민(tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) 및 다이에틸렌트리아민우레아(diethylenetriamineurea, UDETA)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.The colorimetric reagent may further include a molecule containing an amine group (-NH 2 or -NH-), the molecule containing the amine group, diethylenetriamine (DETA), ethylenediamine (ethylenediamine, EDA), triethylenetetramine (TETA), trisaminoethylamine (tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), polyethyleneimine (Polyethyleneimine, PEI) and diethylenetriamineurea (diethylenetriamineurea, UDETA) group consisting of can be selected from

상기 효소 면역반응 비색 검출 시스템에서 효소에 의한 전구체 산화 및 중합반응이 일어날 때의 pH는 10 이하이거나, 9 이하이거나, 8 이하이거나, 7.4일 수 있는데 염기성에서는 효소가 없는 환경에서도 전구체가 산화 또는 중합되어 배경색이 생성될 수 있으므로 바람직하게는 pH를 8 이하로 조절하는 것이 적절하다.In the enzyme immunoreaction colorimetric detection system, the pH when the precursor oxidation and polymerization reaction occurs by the enzyme may be 10 or less, 9 or less, 8 or less, or 7.4. Therefore, it is preferable to adjust the pH to 8 or less because the background color may be generated.

상기 비색계 시약은 과산화물을 더 포함할 수 있는데, 과산화물의 농도는 1 mM 내지 80 mM일 수 있고, 1 mM 내지 70 mM일 수 있고, 2 mM 내지 60 mM일 수 있고, 2 mM 내지 50 mM일 수 있고, 2 mM 내지 40 mM일 수 있고, 2 mM 내지 30 mM일 수 있고, 2 mM 내지 20 mM일 수 있고, 2 mM내지 15 mM일 수 있고, 3 mM 내지 15 mM 일 수 있고, 3 mM 내지 12 mM 일 수 있고, 4 mM 내지 12 mM 일 수 있고, 5 mM 내지 12 mM 일 수 있고, 바람직하게는 2 mM 내지 15 mM일 수 있고, 80 mM 이상일 때는 발색이 나타나지 않을 수 있다.The colorimetric reagent may further include a peroxide, and the concentration of the peroxide may be 1 mM to 80 mM, 1 mM to 70 mM, 2 mM to 60 mM, 2 mM to 50 mM. 2 mM to 40 mM, 2 mM to 30 mM, 2 mM to 20 mM, 2 mM to 15 mM, 3 mM to 15 mM, 3 mM to It may be 12 mM, 4 mM to 12 mM, 5 mM to 12 mM, preferably 2 mM to 15 mM, and when it is 80 mM or more, color development may not appear.

상기 효소 면역반응은 직접 효소 면역반응, 간접 효소 면역반응, 직접 샌드위치 효소 면역반응 또는 간접 샌드위치 효소 면역반응일 수 있다.The enzyme immune response may be a direct enzyme immune response, an indirect enzyme immune response, a direct sandwich enzyme immune response, or an indirect sandwich enzyme immune response.

상기 비색 검출 시스템에서 발색체는 검출 대상인 표적 주위에만 접착되므로 표적의 위치 정보와 정량 정보를 동시에 또는 함께 제시할 수 있다.In the colorimetric detection system, since the chromogen adheres only around the target to be detected, location information and quantitative information of the target can be presented simultaneously or together.

본 발명은, 효소와의 반응에 의해 발색될 수 있는 비색계 시약을 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템이 칩 위에 구비된 바이오칩으로서,The present invention provides a biochip provided on a chip with an enzyme immunoreaction colorimetric detection system comprising a colorimetric reagent capable of developing color by reaction with an enzyme,

상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오칩을 제공한다. 상기 바이오칩에 관한 상세한 설명은 상기 비색 검출 시스템에 관해 설명한 것과 같다.The colorimetric reagent provides a biochip, characterized in that it contains a phenol compound or a catechol compound. The detailed description of the biochip is the same as the description of the colorimetric detection system.

본 발명은, 분석 대상 항원과, 효소가 표지된 항체를 인식시키는 단계;The present invention comprises the steps of recognizing an antigen to be analyzed and an enzyme-labeled antibody;

비색계 시약을 첨가하여 상기 효소와 반응시킴으로써 발색체를 형성하는 단계; 및forming a chromophore by adding a colorimetric reagent to react with the enzyme; and

발색체의 발광량을 측정하는 단계;measuring the amount of light emitted by the chromogen;

를 포함하는 효소 면역반응을 통한 비색 검출법으로서,As a colorimetric detection method through an enzyme immune reaction comprising:

상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응을 통한 비색 검출법을 제공한다.The colorimetric reagent provides a colorimetric detection method through an enzyme immunoreaction, characterized in that it contains a phenol compound or a catechol compound.

상기 발색체의 발광량을 측정하는 단계는 효소 면역반응이 일어나는 플레이트(plate)에 접착된 발색체의 발광량을 측정한다. 상기 비색 검출법에 관한 상세한 설명은 상기 비색 검출 시스템에 관해 설명한 것과 같다.In the step of measuring the luminescence amount of the chromogen, the luminescence amount of the chromogen adhered to a plate on which an enzyme immune reaction occurs is measured. The detailed description of the colorimetric detection method is the same as that of the colorimetric detection system.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명에 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, Examples and Experimental Examples of the present invention will be specifically illustrated and described below. However, the Examples and Experimental Examples to be described below are merely illustrative of a part of the present invention, and are not limited thereto.

<비색 검출법을 위한 접착성 <Adhesiveness for colorimetric detection method 발색체의chromophore 전구체> Precursor>

실시예 1: 피로카테콜(pyrocatechol, PC) Example 1 : pyrocatechol (PC)

실시예 2: 피로갈롤(pyrogallol, PG) Example 2 : pyrogallol (PG)

실시예 3: 피로카테콜(pyrocatechol, PC) + 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA) Example 3 : pyrocatechol (PC) + diethylenetriamine (DETA)

실시예 4: 피로갈롤(pyrogallol, PG) + 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA) Example 4 : pyrogallol (PG) + diethylenetriamine (DETA)

실시예 5: 3,4-하이드록시페닐알라닌(3,4-hydroxyphenylalanine, DOPA) Example 5 : 3,4-hydroxyphenylalanine (DOPA)

실시예 6: 도파민(dopamine, DA) Example 6 : dopamine (DA)

실시예 7: 도파민(dopamine, DA) + 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA) Example 7 : dopamine (DA) + diethylenetriamine (DETA)

실시예 8: 티라민(tyramine) Example 8 : Tyramine

실시예 9: 타이로신(tyrosine) Example 9 : Tyrosine

실시예 10: 클로로겐산(Chlorogenic acid) Example 10 : Chlorogenic acid

실시예 11: 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine, 5-HODA) Example 11 : 5-hydroxydopamine (5-hydroxydopamine, 5-HODA)

비교예 1: TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) Comparative Example 1 : TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)

<< 실험예Experimental example 1> 효소 활성 비교 실험 1> Enzyme activity comparison experiment

멜라닌 합성에 사용되는 효소인 티로시나아제(tyrosinase) 및 라카아제(laccase)와 효소 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)에서 흔히 사용되는 홀스라디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)를 이용하여 효소로 산화된 DA(dopamine, 도파민) 전구체의 올리고머화/고분자화 반응에 따른 색 변화를 관찰함으로써 효소의 활성을 비교 분석하였다. 구체적으로, 500 mU의 HRP, 라카아제(Laccase), 티로시나아제(Tyrosinase)를 50 μL 1xPBS, pH 7.4에 녹인 효소 용액을 만든 후, 0.5 μmol의 상기 실시예 6(도파민)을 0.5 μmol의 H2O2가 포함된 1xPBS 100μL에 녹인 후 pH를 7.4로 맞추고, 위의 효소 용액과 혼합하여 총 150 μL의 용액을 96well-plate에 넣었다. 이때 두 개의 용액을 혼합 후 즉시, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분 이후 각각의 색깔 변화를 사진을 찍어 기록하고, 230-900 nm 범위에서 UV-Vis 스펙트로포토미터를 측정하여 가시광선 영역의 흡광도 변화를 모니터링 하였다.Using tyrosinase and laccase, enzymes used for melanin synthesis, and horseradish peroxidase (HRP) commonly used in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) By observing the color change according to the oligomerization/polymerization reaction of the enzyme-oxidized DA (dopamine, dopamine) precursor, the activity of the enzyme was comparatively analyzed. Specifically, after making an enzyme solution in which 500 mU of HRP, Laccase, and Tyrosinase were dissolved in 50 μL 1xPBS, pH 7.4, 0.5 μmol of Example 6 (dopamine) was added to 0.5 μmol of H After dissolving in 100μL of 1xPBS containing 2 O 2 , the pH was adjusted to 7.4, mixed with the above enzyme solution, and a total of 150 μL of the solution was placed in a 96 well-plate. At this time, immediately after mixing the two solutions, and after 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, and 60 minutes, each color change was recorded by taking pictures, and UV-Vis spectrophotometer in the range of 230-900 nm. was measured to monitor the change in absorbance in the visible region.

그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 이를 통해 바이오마커에 표지되는 효소를 통한 발색체 생성은 자연에서 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 티로시나아제, 라카아제보다 ELISA에 주로 사용되는 HRP에 의해 가장 효과적으로 조절되는 것을 확인하였다.The results are shown in FIGS. 2 and 3 . Through this, it was confirmed that the chromogen production through the enzyme labeled with the biomarker is most effectively regulated by HRP, which is mainly used for ELISA, rather than tyrosinase and laccase, which are enzymes involved in melanin synthesis in nature.

<< 실험예Experimental example 2> 전구체의 화학적 구조에 따른 2> According to the chemical structure of the precursor 발색체chromophore 형성 속도 분석 Formation rate analysis

전구체의 화학적 구조에 따른 효소 전환율(enzymatic turnover rate) 및 그에 따른 발색체 형성 속도를 확인하기 위하여 상기 실시예 1, 2, 5, 6, 8 내지 11에 따른 전구체를 이용하여 아래와 같이 발색 속도를 비교 분석하였다. 구체적으로, 500 mU의 HRP를 50 μL 1xPBS, pH 7.4에 녹인 효소 용액을 만든 후 0.5 μmol의 페놀류 화합물 및 카테콜류 화합물성 전구체로서 상기 실시예 1, 2, 5, 6, 8 내지 11을 각각 0.5 μmol의 H2O2가 포함된 1xPBS 100μL에 녹인 후 pH를 7.4로 맞추고, 위의 효소 용액과 혼합하여 96well-plate에 준비하였다. 이때 두 개의 용액을 혼합 후 즉시, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분 이후 용액의 색을 사진을 찍어 기록하였으며, 색 변화가 매우 빠른 전구체 후보군 (실시예 1 및 실시예 2)의 경우에는 추가로 1분 동안 동영상을 찍어 10초 간격으로 색 변화를 캡쳐하였다. 또한 230-900 nm 범위에서 UV-Vis 스펙트로포토미터를 측정하여 가시광선 영역의 흡광도 변화를 모니터링하였다.In order to confirm the enzymatic turnover rate according to the chemical structure of the precursor and the resulting chromogen formation rate, the color development rate was compared using the precursors according to Examples 1, 2, 5, 6, 8 to 11 as follows. analyzed. Specifically, after preparing an enzyme solution in which 500 mU of HRP was dissolved in 50 μL 1xPBS, pH 7.4, 0.5 μmol of Examples 1, 2, 5, 6, 8 to 11 were respectively 0.5 μmol of phenolic compounds and catechol compounds as precursors. After dissolving in 100μL of 1xPBS containing μmol of H 2 O 2 , the pH was adjusted to 7.4, mixed with the above enzyme solution, and prepared in a 96 well-plate. At this time, the color of the solution was recorded by taking pictures immediately after mixing the two solutions, after 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, and 60 minutes, and a precursor candidate group with a very rapid color change (Example 1 and Implementation). In the case of Example 2), a video was additionally recorded for 1 minute to capture color changes at 10-second intervals. In addition, the change in absorbance in the visible light region was monitored by measuring a UV-Vis spectrophotometer in the range of 230-900 nm.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 천연 멜라닌의 주요 전구체인 실시예 5 및 실시예 6은 용액에서 최대 1시간 동안 상대적으로 색 변화가 느리게 나타났고, 실시예 1 및 실시예 2는 30초 내에서 상대적으로 빠르게 색의 변화가 완료되었다. 페놀류 화합물(실시예 8 및 실시예 9)의 경우 모두 가시광선 흡광이 크지 않아 색이 옅게 나타났으며, 카테콜류 화합물 중에 크기가 큰 실시예 5, 6, 10 및 11 역시 색 변화가 느리게 나타났다. 이를 통해, 페놀류 및 카테콜류 화합물의 화학적 구조에 따라 효소 전환율이 다른데, 크기가 작은 분자일수록 효소 활성부위와의 결합 및 확산이 빠르기 때문에 발색체 형성 속도가 빠르며, 페놀류에 비해 카테콜류의 발색이 강하다는 것을 확인하였다.The results are shown in FIG. 4 . Examples 5 and 6, which are the main precursors of natural melanin, showed relatively slow color change for up to 1 hour in solution, and Example 1 and Example 2 completed the color change relatively quickly within 30 seconds. . In the case of the phenolic compounds (Example 8 and Example 9), the visible light absorption was not large, so the color appeared pale, and Examples 5, 6, 10 and 11, which had a large size among the catechol compounds, also showed a slow color change. Through this, the enzyme conversion rate is different depending on the chemical structure of the phenols and catechol compounds. The smaller the molecule, the faster the binding and diffusion with the enzyme active site, the faster the chromogen formation rate, and the color development of the catechols is stronger than the phenols. was confirmed.

<< 실험예Experimental example 3> 3> 아민amine -포함 분자와 카테콜류 화합물의 접착성에의 시너지 효과 확인-Confirmation of synergistic effect on adhesion between containing molecules and catechol compounds

카테콜류 화합물과 아민 작용기를 포함하는 분자의 시너지 효과를 확인하기 위하여, 실시예 3 및 실시예 4의 전구체를 이용하여 형성된 발색체의 가시광선 역역 흡광도를 관찰하였다. 실시예 3 및 실시예 4에 따른 발색체 형성에서 DETA를 각각 PC 및 PG 농도에 대해 0.5 equiv, 1 equiv, 2 equiv로 첨가하여 발색체를 형성하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.In order to confirm the synergistic effect of the catechol compound and the molecule containing the amine functional group, the absorbance in the visible light region of the chromogen formed using the precursors of Examples 3 and 4 was observed. In the chromogen formation according to Examples 3 and 4, DETA was added at 0.5 equiv, 1 equiv, and 2 equiv to PC and PG concentrations, respectively, to form a chromophore, and the results are shown in FIG. 5 .

실시예 3을 통한 발색체 형성에서, DETA를 함께 넣으면 400 nm 내지 800 nm 영역의 광범위한 가시광선 영역 흡수를 증가시키는 것을 알 수 있었는데, 실시예 4를 통한 발색체 형성에서는 DETA를 혼합함에 따른 가시광선 영역 흡광도 변화가 상대적으로 적은 것으로 관찰되었다. 이를 통해, 카테콜류 화합물인 실시예 3을 통한 발색체 형성에서 DETA를 첨가함으로써 더욱 진한 발색 신호를 형성할 수 있음을 확인 할 수 있었다. 효소에 의해 산화된 카테콜류 화합물은 올리고머화 및 고분자화 반응에 의해 분자량이 커지면서 발색 및 접착성을 나타내게 되는데, 이때 아민 작용기를 포함하는 분자가 카테콜류 화합물과 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction) 또는 시프 염기 반응(Schiff base reaction) 등에 의해 결합하면서 카테콜간의 가교를 도와 고분자화를 촉진하게 될 것이다. 이때 분자의 결합에 따라 파이 컨쥬게이션 길이가 증가하면서 전체적인 가시광선 영역의 흡광도가 높아질 것으로 예상된다.In the formation of the chromophore in Example 3, it was found that when DETA was added together, the absorption of a wide range of visible light in the 400 nm to 800 nm region was increased. A relatively small change in area absorbance was observed. Through this, it was confirmed that a more intense color development signal could be formed by adding DETA in the formation of the chromogen through Example 3, which is a catechol compound. The catechol-type compound oxidized by the enzyme exhibits color development and adhesiveness as the molecular weight increases by oligomerization and polymerization reaction. While binding by a Schiff base reaction, etc., it will help cross-linking between catechols and promote polymerization. At this time, it is expected that the absorbance of the entire visible light region will increase as the pi-conjugation length increases according to the molecular bonding.

<< 실험예Experimental example 4> 4> 발색체의chromophore 공간적 접착 효율 분석 Spatial Adhesion Efficiency Analysis

상기 실험예 2 및 실험예 3을 통해 실시예의 전구체 화학구조에 따라 다양한 색 신호가 얻어짐을 확인하였으며, 첨가물을 통해 더욱 강한 색의 발색체가 형성될 수 있음을 확인하였다. 이에 실험예 4에서는 본 발명에 따라 효소에 의해 형성된 발색체의 표면 접착 특성에 대해 확인하기 위하여 아래와 같이 분석하였다.Through Experimental Example 2 and Experimental Example 3, it was confirmed that various color signals were obtained according to the precursor chemical structure of Examples, and it was confirmed that a color developing body of a stronger color could be formed through an additive. Accordingly, in Experimental Example 4, the following analysis was performed to confirm the surface adhesion properties of the chromogen formed by the enzyme according to the present invention.

먼저, 본 발명에 따른 실시예 3의 전구체로 형성한 접착성 발색체와 HRP에 의한 발색을 위해 통상적으로 사용되는 비교예 1의 전구체를 이용하여 발색체가 중합된 후 용액으로의 확산 없이 표면 국소부위에 부착되는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 먼저 HRP를 나이트로섬유소막(nitrocellulose membrane)에 스팟 형태로 고정화시키고, 상기 실시예 3 및 비교예 1의 전구체를 포함하는 용액에 담그는 방식으로 표면에서 효소에 의한 발색체 형성 반응을 개시하였다(도 6). 이때 HRP는 각각 0, 10, 33, 100, 330, 1000 mU/mL의 농도로 0.1%의 BSA가 포함된 PBS에 녹여서 1 μL를 사용하였으며 (결과적으로 표면에는 0, 10, 33, 100, 330, 1000 μU이 고정화됨), 표면에 위치한 HRP 양에 따른 발색체 형성 및 부착 정도를 확인할 수 있도록 하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.First, the adhesive colorant formed from the precursor of Example 3 according to the present invention was polymerized using the precursor of Comparative Example 1, which is commonly used for color development by HRP, and then localized on the surface without diffusion into the solution. It was checked whether it was attached to the To this end, HRP was first immobilized in the form of a spot on a nitrocellulose membrane, and a chromogen-forming reaction was initiated on the surface by immersion in a solution containing the precursors of Example 3 and Comparative Example 1. (Fig. 6). At this time, 1 μL of HRP was dissolved in PBS containing 0.1% BSA at a concentration of 0, 10, 33, 100, 330, and 1000 mU/mL, respectively (resulting in 0, 10, 33, 100, 330 on the surface) , 1000 μU is immobilized), and the degree of chromogen formation and adhesion can be confirmed according to the amount of HRP located on the surface. The results are shown in FIG. 7 .

그 결과, 실시예 3의 전구체로 형성한 발색체는 확산 없이 나이트로섬유소막의 HRP가 고정된 위치에 접착되는 것은 물록, 용액으로 확산되지 않기 때문에 용액의 색 변화를 일으키지 않았으며, 10분 이내의 시간에서 발색이 완료되어 표면에 위치한 HRP의 정량적, 공간적 정보를 제공하였다. 반면 HRP에 의한 발색을 위해 통상 사용되는 비교예 1의 경우에는 표면에 고정화된 HRP에 의해 발색된 직후 접착력이 없어 용액으로 확산되면서 용액 전체의 색깔이 바뀌게 되었으며, 이렇게 색이 변한 용액이 나이트로섬유소막에 다시 무작위로 흡수되었고, 결과적으로 표면에 고정화된 HRP 위치를 확인할 수도 없었다.As a result, the chromogen formed from the precursor of Example 3 did not cause a color change in the solution because it did not diffuse into the solution, let alone adhere to the fixed position of the HRP of the nitrocellulose film without diffusion. Color development was completed in time, providing quantitative and spatial information of HRP located on the surface. On the other hand, in the case of Comparative Example 1, which is usually used for color development by HRP, there was no adhesive force immediately after color development by HRP immobilized on the surface, so the color of the entire solution was changed as it diffused into the solution. It was re-absorbed randomly into the membrane, and as a result, the location of the HRP immobilized on the surface could not be identified.

다음으로, 실시예 1, 2, 3, 4, 6, 7을 전구체로 사용할 때에 HRP에 의한 발색 및 접착성 분석을 위해 다음과 같이 실험하였다. 1μL의 HRP를 나이트로섬유소막(nitrocellulose membrane)에 스팟으로 고정화하고, 상기 실시예 1, 2, 3, 4, 6, 7에 따른 전구체를 포함하는 용액에 각각 담그는 방식으로 표면에서 개시되는 발색체 형성 반응을 유도하였다. 이때, HRP 각각 30, 100, 300, 1000 μU로 (30, 100, 300, 1000 mU/mL 농도로 0.1%의 BSA가 포함된 PBS에 녹여서 1 μL를 막에 고정화하였음) 사용하며 표면에 고정화된 효소의 양에 따라 HRP 스팟에 접착되어 국소적으로 형성되는 발색체의 진하기를 측정하였으며, 발색체의 진하기는 사진으로 기록한 후에 Image J 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.Next, when using Examples 1, 2, 3, 4, 6, and 7 as precursors, the following experiments were performed for color development and adhesion analysis by HRP. 1 μL of HRP was immobilized as a spot on a nitrocellulose membrane and immersed in a solution containing the precursor according to Examples 1, 2, 3, 4, 6, and 7, respectively. A formation reaction was induced. At this time, 30, 100, 300, and 1000 μU of HRP were used (dissolved in PBS containing 0.1% BSA at a concentration of 30, 100, 300, and 1000 mU/mL and 1 μL was immobilized on the membrane) and immobilized on the surface. According to the amount of the enzyme, the depth of the chromogen locally formed by adhesion to the HRP spot was measured, and the depth of the chromophore was recorded with a photograph and then analyzed using Image J software. The results are shown in FIG. 8 .

그 결과, 실시예 6 보다는 실시예 1 내지 4가 빠르게 효소에 의해 전환되어 진한 발색체를 형성하였으며, 실시예 1 내지 4의 경우에는 전구체의 화학 구조에 따라 표면에 접착된 양에 큰 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다. DETA를 포함하거나 포함하지 않는 전구체 DA(실시예 6)를 포함하는 용액에 담근 막에서는 모두 HRP가 1000 μU로 매우 높은 농도일 경우 희미한 발색을 나타냈다(도 8, 왼쪽). 반면 PC(실시예 1)는 적은 농도의 효소에 의해서도 빠르게 전환되어 국소적으로 접착된 진한 발색을 나타냈고, DETA가 존재할 때(실시예 3)는 더 강한 신호를 보이는 것을 확인했다. 또한, PC와 DETA를 조합했을 때(실시예 3)는 100 μU의 낮은 농도의 HRP에서도 발색체가 진하게 형성되면서 표면에 접착되는 것을 확인하였다(도 8, 중간). PG(실시예 2) 및 PG와 DETA를 조합(실시예 4)하여 전구체로 합성한 경우에는, 효소에 의해 빠르게 전환되었지만, 용액 전체에 발색이 퍼지면서 이러한 색이 막 전체에 흡수되는 것으로 보아, 형성되는 발색체의 접착력이 낮은 것으로 보인다(도 8, 오른쪽).As a result, Examples 1 to 4 were converted by the enzyme faster than Example 6 to form a dark chromophore, and in the case of Examples 1 to 4, there was a large difference in the amount of adhesion to the surface depending on the chemical structure of the precursor. could confirm that The membranes immersed in a solution containing the precursor DA (Example 6) with or without DETA showed faint color development when HRP was at a very high concentration of 1000 μU (Fig. 8, left). On the other hand, it was confirmed that PC (Example 1) was rapidly converted even by a small concentration of the enzyme to show a locally adhered deep color, and showed a stronger signal when DETA was present (Example 3). In addition, when PC and DETA were combined (Example 3), even at a low concentration of 100 μU of HRP, it was confirmed that the chromogen was formed and adhered to the surface (FIG. 8, middle). When PG (Example 2) and PG and DETA were combined (Example 4) and synthesized as a precursor, it was rapidly converted by an enzyme, but it is seen that this color is absorbed throughout the film as the color develops throughout the solution, It seems that the adhesion of the formed chromophore is low (FIG. 8, right).

이를 통해, 접착성 발색체의 합성을 위해서는 효소에 의해 전환되는 전구체의 화학 구조가 중요한 요인인 것을 알 수 있었다. 구체적으로는, 실시예 6은 실시예 1과 2에 비해 효소에 의한 전환이 느리기 때문에 분자량이 접착력을 가질 정도로 충분히 증가하지 못했고(도 9, 왼쪽), 표면에 접착되기 위해 발색 중간체는 용액 상에서 근처의 물 분자와의 친화력보다 표면에 대한 친화력이 강해야 하는데, PG-유래 발색체(실시예 2, 실시예 4)의 경우와 같이 물 분자와의 친화력이 강한 경우 중간체가 수화되면서 표면에 접착하기 어려워진다는 것을 알 수 있었다(도 9, 오른쪽). 최종적으로, PC와 DETA의 조합(실시예 3)이 충분한 올리고머화 및 고분자화를 통한 진한 발색 뿐만 아니라 카테콜과 아민 작용기의 시너지 효과를 통한 표면 접착성을 달성하기에 가장 효과적임을 알 수 있었다(도 9, 중간).Through this, it was found that the chemical structure of the precursor converted by the enzyme is an important factor for the synthesis of the adhesive chromogen. Specifically, Example 6 did not increase the molecular weight sufficiently to have adhesive force because the conversion by the enzyme was slower than in Examples 1 and 2 (FIG. 9, left), and in order to adhere to the surface, the chromogenic intermediate was nearby in solution. The affinity for the surface should be stronger than the affinity for the water molecule of PG-derived chromogen (Example 2, Example 4). It was found that there is (Fig. 9, right). Finally, it was found that the combination of PC and DETA (Example 3) was most effective in achieving not only deep color development through sufficient oligomerization and polymerization, but also surface adhesion through the synergistic effect of catechol and amine functional groups ( Fig. 9, middle).

<< 실험예Experimental example 5> pH, 5> pH; HH 22 OO 22 및 전구체 농도에 따른 and depending on the precursor concentration 발색체의chromophore 공간적 접착 효율 분석 Spatial Adhesion Efficiency Analysis

5.1. 효소가 아닌 pH에 따른 전구체의 산화 정도 및 이에 따른 배경색 생성 여부 확인5.1. Check the oxidation degree of the precursor according to the pH, not the enzyme, and whether the background color is generated

본 발명에 따른 효소 면역반응 비색 검출 방법에서 배경색이 나타내지 않는 pH 조건을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다. 먼저 DETA를 PBS에 혼합하여 50 mM의 DETA 용액을 만든 후 1 M HCl 또는 1 M NaOH를 사용하여 pH를 4.4, 7.4 또는 10.4로 맞추었다. 3 mL의 pH를 조절한 용액에 300 μmol의 실시예 1(PC)와 60 μmol의 H2O2를 섞은 다음 1000, 300, 100, 30, 10, 0 mU/mL의 HRP를 각각 0.1% BSA가 포함된 PBS에 준비한 뒤에 1 μL를 나이트로섬유소막에 각각 고정화한 후 5분 동안 실온 건조하였다(표면에 부착된 HRP의 최종 양은 1000, 300, 100, 30, 10, 0 μU이 됨). 건조된 나이트로섬유소막을 위의 각기 다른 pH를 가지는 세가지 DETA+PC+H2O2 용액에 각각 담그었다. HRP가 아닌 pH에 따른 카테콜류 화합물 자체의 산화 정도를 확인하기 위해, HRP가 고정화되지 않은 일반 나이트로섬유소막을 같은 방식으로 3가지 다른 pH의 용액에 담근 후 30분 후에 HRP가 존재하거나 존재하지 않는 막이 각각 담지된 서로 다른 pH의 용액의 색깔 변화를 사진으로 찍어서 기록하였다. 막을 용액에서 꺼낸 뒤에 증류수로 세척하여 HRP가 고정화된 스팟 위치와 막 전체에 흡수된 배경색을 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.In order to confirm the pH condition in which the background color does not appear in the method for colorimetric detection of an enzyme immunoreaction according to the present invention, an experiment was performed as follows. First, DETA was mixed with PBS to make a 50 mM DETA solution, and then the pH was adjusted to 4.4, 7.4, or 10.4 using 1 M HCl or 1 M NaOH. 300 μmol of Example 1 (PC) and 60 μmol of H 2 O 2 were mixed in 3 mL of pH-adjusted solution, and then 1000, 300, 100, 30, 10, 0 mU/mL of HRP was added with 0.1% BSA, respectively. 1 μL of each was immobilized on the nitrofibrin membrane after preparation in PBS containing The dried nitrocellulose membrane was immersed in each of the above three DETA+PC+H 2 O 2 solutions having different pHs. In order to check the degree of oxidation of catechol compounds itself according to the pH, not HRP, after immersing the normal nitrofibrin membrane to which HRP is not immobilized in solutions of 3 different pHs in the same way, 30 minutes later, the presence or absence of HRP The color change of the solutions of different pH on which each membrane was supported was recorded by taking pictures. After the membrane was removed from the solution, it was washed with distilled water to confirm the spot position where HRP was immobilized and the background color absorbed throughout the membrane. The results are shown in FIG. 10 .

그 결과, pH 4.4 및 pH 7.4에서는 HRP의 유무에 관계없이 모두 배경색이 나타나지 않았으나 pH 10.4의 염기조건에서는 HRP 유무에 관계없이 배경색이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 염기 조건에서는 HRP가 존재하지 않는 나이트로섬유소막에서도 전구체가 스스로 고분자화되어 발색 신호가 생성될 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 발색체를 이용한 비색 검출법에서는 pH 조건을 신중히 고려하여 선택하여야 한다.As a result, at pH 4.4 and pH 7.4, the background color did not appear regardless of the presence or absence of HRP, but it was confirmed that the background color appeared regardless of the presence or absence of HRP in the basic condition of pH 10.4. That is, it can be seen that in the basic condition, even in the nitrofibrin film in which HRP does not exist, the precursor itself polymerizes and a color development signal can be generated. Therefore, in the colorimetric detection method using the chromogen according to the present invention, the pH condition should be carefully considered and selected.

5.2. 5.2. HH 22 OO 22 농도 및 전구체 농도에 따른 공간적 접착 효율 분석 Analysis of spatial adhesion efficiency according to concentration and precursor concentration

5.2.1. 5.2.1. HH 22 OO 22 농도에 따른 공간적 접착 효율 분석 Analysis of spatial adhesion efficiency according to concentration

본 발명에 따른 비색 검출법에서 H2O2의 농도에 따른 공간적 접착 효율을 분석하기 위하여 아래와 같이 실험하였다. 먼저 DETA를 PBS에 녹여 50 mM DETA 용액을 만든 후 1 M HCl을 사용해 pH를 7.4로 맞추었다. 그 다음 15, 30, 60, 120, 240 μmol의 H2O2를 3 mL의 DETA 용액에 각각 넣은 뒤에 모두 300 μmol의 실시예 1(PC)를 첨가한 후, 100 mU/mL의 HRP를 0.1% BSA가 포함된 PBS에 준비한 뒤에 1 μL를 나이트로섬유소막에 각각 고정화한 후 5분 동안 실온 건조하였다(표면에 부탁된 HRP의 최종 양은 100 μU이 됨). 건조된 나이트로섬유소막을 위의 각기 다른 H2O2 농도(5, 10, 20, 40 또는 80 mM)의 DETA+PC+H2O2 용액에 각각 담근 후, 10분 후에 막이 들어 있는 용액 전체의 사진을 찍어 기록한 뒤에 HRP 스팟 주위에 접착된 발색체의 진하기(spot intensity)를 Image J 소프트웨어를 이용하여 수치화하였다. 그 결과를 도 11(왼쪽)에 나타내었다.In order to analyze the spatial adhesion efficiency according to the concentration of H 2 O 2 in the colorimetric detection method according to the present invention, an experiment was conducted as follows. First, DETA was dissolved in PBS to make a 50 mM DETA solution, and then the pH was adjusted to 7.4 using 1 M HCl. Then, 15, 30, 60, 120, 240 μmol of H 2 O 2 was added to 3 mL of DETA solution, respectively, and then 300 μmol of Example 1 (PC) was added, and then 100 mU/mL of HRP was 0.1 After preparing in PBS containing % BSA, 1 μL of each was immobilized on a nitrofibrin membrane and dried at room temperature for 5 minutes (the final amount of HRP attached to the surface was 100 μU). After immersing the dried nitrocellulose membrane in each of the above DETA+PC+H 2 O 2 solutions of different H 2 O 2 concentrations (5, 10, 20, 40 or 80 mM), after 10 minutes, the entire solution containing the membrane After taking a photograph of , the spot intensity of the chromogen adhered around the HRP spot was quantified using Image J software. The results are shown in FIG. 11 (left).

그 결과, 같은 농도의 PC, DETA 그리고 HRP를 사용하여 발색체를 형성할 때, 10 mM의 H2O2 농도에서 가장 진한 발색체가 100 μU의 HRP가 고정된 위치에 접착되어 형성됨을 확인하였으며, H2O2의 농도가 5 mM일 때도 발색체의 진하기가 10 mM일 때와 유사한 정도로 높게 나타났으며, H2O2의 농도가 80 mM일 때는 발색이 나타나지 않는 것으로 나타났다(spot intensity = 0, n.d.(not detected)).As a result, it was confirmed that when a chromogen was formed using the same concentrations of PC, DETA and HRP, the chromogen, which was the darkest at a concentration of 10 mM H 2 O 2 , was formed by adhering 100 μU of HRP to a fixed position, Even when the concentration of H 2 O 2 was 5 mM, the color development was found to be as high as that when the concentration was 10 mM, and when the concentration of H 2 O 2 was 80 mM, no color development was observed (spot intensity = 0, nd(not detected)).

5.2.2. 전구체 농도에 따른 공간적 접착 효율 분석5.2.2. Analysis of spatial adhesion efficiency according to precursor concentration

본 발명에 따른 비색 검출법에서 전구체의 농도에 따른 공간적 접착 효율을 분석하기 위하여 아래와 같이 실험하였다. 먼저 15, 50, 150, 500, 1500 μmol DETA를 각각 3 mL PBS에 녹인 뒤에 1 M HCl을 사용해 pH를 모두 7.4로 맞춘 후 60 μmol의 H2O2를 3 mL의 DETA 용액에 모두 넣은 뒤에 DETA 몰농도의 2배가 되도록 실시예 1(PC) 30, 100, 300, 1000, 3000 μmol를 의 서로 다른 농도의 DETA 용액에 첨가하였다. 그 다음 100 mU/mL의 HRP를 0.1% BSA가 포함된 PBS에 준비한 뒤에 1 μL를 나이트로섬유소막에 각각 고정화한 후 5분 동안 실온 건조하였다(표면에 부착된 HRP의 최종 양은 100 μU이 됨). 건조된 나이트로섬유소막을 위의 각기 다른 DETA 및 PC 농도의 DETA+PC+H2O2 용액에 각각 담근 후 (모든 용액에서 DETA:PC는 항상 1:2 몰농도비를 가짐) 10분 후에 막이 들어있는 용액 전체의 사진을 찍어 기록한 뒤에, HRP 스팟 주위에 접착된 발색체의 진하기(spot intensity)를 Image J 소프트웨어를 이용하여 수치화하였다. 그 결과를 도 11(오른쪽)에 나타내었다.In order to analyze the spatial adhesion efficiency according to the concentration of the precursor in the colorimetric detection method according to the present invention, an experiment was conducted as follows. First, 15, 50, 150, 500, 1500 μmol of DETA was dissolved in 3 mL PBS, and then the pH was adjusted to 7.4 with 1 M HCl. Then, 60 μmol of H 2 O 2 was added to 3 mL of DETA solution, and then DETA 30, 100, 300, 1000, and 3000 μmol of Example 1 (PC) were added to the DETA solutions of different concentrations to double the molar concentration. Then, 100 mU/mL of HRP was prepared in PBS containing 0.1% BSA, 1 μL of each was immobilized on a nitrofibrin membrane, and dried at room temperature for 5 minutes (the final amount of HRP attached to the surface was 100 μU) ). After immersing the dried nitrocellulose membrane in each of the above DETA+PC+H 2 O 2 solutions of different DETA and PC concentrations (DETA:PC always has a molar ratio of 1:2 in all solutions), the membrane is lifted after 10 minutes After taking a photograph of the whole solution and recording it, the spot intensity of the chromogen adhered around the HRP spot was quantified using Image J software. The results are shown in FIG. 11 (right).

그 결과, 같은 농도의 H2O2와 HRP를 사용하여 발색체를 형성할 때, 100 mM의 PC 농도에서 (DETA는 항상 PC 농도의 1/2로 고정됨 즉, 50 mM) 가장 진한 발색체가 100 μU의 HRP가 고정된 위치에 접착되어 형성됨을 확인하였으며, 다음으로는 30 mM의 PC 농도에서 진한 발색체가 형성되었고, PC의 농도가 1000일 때는 발색이 나타나지 않는 것으로 나타났다(spot intensity = 0, n.d.(not detected)).As a result, when a chromogen is formed using the same concentration of H 2 O 2 and HRP, at a PC concentration of 100 mM (DETA is always fixed at 1/2 of the PC concentration, i.e., 50 mM), the darkest chromogen is 100 It was confirmed that μU of HRP was adhered to a fixed position and formed. Next, a dark chromophore was formed at a PC concentration of 30 mM, and no color development was observed when the PC concentration was 1000 (spot intensity = 0, nd). (not detected)).

<< 실험예Experimental example 6> 6> 접착성 adhesive 발색체를a chromophore 이용한 효소면역 비색 검출법 Enzyme-immune colorimetric detection method using

본 발명에 따른 접착성 발색체를 이용하여 비색 검출법을 통한 바이오 마커 분석에 아래와 같이 적용하였다.The biomarker analysis using the colorimetric detection method using the adhesive chromogen according to the present invention was applied as follows.

6.1. 96 well-plate 표면에서의 비색 검출법6.1. Colorimetric detection on the surface of 96 well-plates

96 well-plate에서 통상적인 ELISA-type bioassay를 적용하여 바이오 마커 모델인 알파태아단백(α-fetoprotein, AFP)을 정량 분석하였다. 구체적으로, 1xPBS에 용해된 0, 3, 10, 30, 100, 300 ng/mL 농도의 α-fetoprotein (AFP) 100 μL를 통상적으로 사용하는 96-well ELISA plate에 넣은 뒤에 4 ℃에서 12시간 이상 배양하였다. 그 다음 AFP 용액 제거 후 플레이트 표면을 0.05% tween 20을 함유한 PBS로 3번 세척한 뒤에 1% BSA를 함유하는 1xPBS (1% BSA/PBS) 100 μL를 넣고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 1% BSA/PBS 용액 제거 후, 1% BSA/PBS에 희석된 1 μg/mL 농도의 1차 항체(mouse anti-human AFP BioLegend) 100 μL를 넣고 2시간 동안 실온에서 다시 배양하였다. 1차 항체 용액을 제거한 뒤에 플레이트 표면을 0.05% tween 20을 함유한 PBS로 3번 세척한 후, 1% BSA/PBS에 희석된 1 μg/mL 농도의 HRP가 결합되어 있는 2차 항체 100 μL를 넣고 1시간 동안 실온에서 추가 배양하였다. 마지막으로 다시 플레이트를 0.05 tween 20을 함유하는 1xPBS로 3번 세척한 후 25 mM PC와 12.5 mM DETA, 그리고 2.5 mM H2O2가 녹아있는 pH 7.4로 조정된 PBS 100 μL를 넣고 30분 동안 실온에서 반응시킨 뒤에 전체 용액의 흡광도를 측정하여 360 nm에서의 값을 기록하였다(용액상+표면에 부착된 전체 발색체 양). 이후 1xPBS로 플레이트를 3번 세척하고 1xPBS 100 μL를 첨가한 뒤에 다시 흡광도를 측정하여 360 nm에서의 값을 확인하였다(표면에 부착된 발색체의 양).By applying a conventional ELISA-type bioassay in 96 well-plate, α-fetoprotein (AFP), a biomarker model, was quantitatively analyzed. Specifically, 100 μL of α-fetoprotein (AFP) at a concentration of 0, 3, 10, 30, 100, or 300 ng/mL dissolved in 1xPBS was placed in a conventional 96-well ELISA plate, and then at 4°C for 12 hours or more. cultured. Then, after removing the AFP solution, the plate surface was washed 3 times with PBS containing 0.05% tween 20, then 100 μL of 1xPBS (1% BSA/PBS) containing 1% BSA was added and incubated at room temperature for 1 hour. After removing the 1% BSA/PBS solution, 100 μL of a primary antibody (mouse anti-human AFP BioLegend) at a concentration of 1 μg/mL diluted in 1% BSA/PBS was added and incubated again at room temperature for 2 hours. After removing the primary antibody solution, the plate surface was washed 3 times with PBS containing 0.05% tween 20, and then 100 µL of HRP-conjugated secondary antibody at a concentration of 1 µg/mL diluted in 1% BSA/PBS was added. and incubated for 1 hour at room temperature. Finally, after washing the plate 3 times with 1xPBS containing 0.05 tween 20, add 100 µL of PBS adjusted to pH 7.4 in which 25 mM PC, 12.5 mM DETA, and 2.5 mM H 2 O 2 are dissolved, and then at room temperature for 30 minutes. After reacting in , the absorbance of the entire solution was measured and the value at 360 nm was recorded (solution phase + total amount of chromogen adhering to the surface). Thereafter, the plate was washed 3 times with 1xPBS, 100 μL of 1xPBS was added, and the absorbance was again measured to confirm the value at 360 nm (the amount of chromogen attached to the surface).

바이오 마커 AFP는 먼저 1차 항체(1st Ab)에 의해 인식된 후 HRP가 연결되어 있는 2차 항체(2nd Ab-HRP)에 의해 표지되며, 이후 전구체가 AFP에 표지된 HRP에 의해 전환된 후 바이오 마커를 둘러싸는 국소 영역에 발색체가 형성된다(도 12). 효소에 의해 산화된 카테콜성 서브 유닛의 총량, 즉 용액상에 과량으로 존재하는 카테콜류 화합물과 표면에 접착된 발색체의 총량의 합은 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 360 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 흡광도는 일차 항체 없이 수행된 음성 대조군의 값을 통해 보정되었다.The biomarker AFP is first recognized by the primary antibody (1 st Ab) and then labeled by the secondary antibody (2 nd Ab-HRP) to which HRP is linked, and then the precursor is converted by HRP labeled AFP After that, a chromophore is formed in the local area surrounding the biomarker (FIG. 12). The total amount of catecholic subunits oxidized by the enzyme, that is, the sum of the total amount of catechol compounds present in excess in solution and the chromogen adhering to the surface, was evaluated by measuring the absorbance at 360 nm using a UV-Vis spectrophotometer. and the absorbance was corrected through the value of the negative control performed without the primary antibody.

실험은 먼저 전구체 PC의 농도에 따른 정량 평가를 위하여 2.5 mM H202 조건에서 PC 농도가 각각 6.25, 25, 100 mM일 때 형성되는 발색체의 흡광도를 측정하여 도 13의 왼쪽 도면에 나타냈으며, 다음으로 H2O2 농도에 따른 정량 평가를 위하여 25 mM PC 조건에서 H2O2 농도가 각각 0.625, 2.5, 10 mM일 때의 흡광도를 측정하여 도 13의 오른쪽 도면에 나타내었다. 모두 100 ng/mL AFP 조건에서 실험하였다. 효소에 의해 산화된 용액상 및 표면 전체의 카테콜성 발색체의 총 생성량(검은색)과 용액을 제거한 후 표면에 접착된 양(적색)을 상대적으로 나타내었다.In the experiment, the absorbance of the chromogen formed when the PC concentration was 6.25, 25, and 100 mM, respectively, under 2.5 mM H 2 O 2 condition was measured for quantitative evaluation according to the concentration of the precursor PC, and is shown in the left figure of FIG. 13 . , then a is shown in the right drawing of Fig. 13, H 2 O 2 concentration from 25 mM PC conditions for the quantitative evaluation of the H 2 O 2 concentration is measured the absorbance of each of 0.625, 2.5 and when 10 mM days. All were tested under 100 ng/mL AFP conditions. The total amount (black) of the catecholic chromogen oxidized by the enzyme and the entire surface of the solution and the amount of adhesion to the surface after removal of the solution (red) are shown relative to each other.

그 결과, ELISA에서 통상적으로 사용되는 96 well-plate에서 AFP 100 ng/mL를 검출할 때, 효소에 의해 산화된 용액상 및 표면 전체의 카테콜성 발색체의 총량은 전구체인 PC의 농도가 높아짐에 따라 증가하였지만(도 13, 왼쪽, 검은색), 표면에 부착된 양의 경우에는 고농도의 PC(100 mM)에서 표면 부착된 발색체의 양이 급격하게 감소하는 것으로 나타났다(도 13, 왼쪽, 적색). 또한, H2O2 농도의 경우에는 2.5 mM에서 효소에 의해 산회된 용액상 및 표면 전체의 카테콜성 발색체의 총량과 표면에 부착된 것의 양이 모두 가장 높은 발색을 보였다(도 13, 오른쪽).As a result, when 100 ng/mL of AFP was detected in a 96 well-plate commonly used in ELISA, the total amount of catecholic chromogen in the solution phase and the entire surface oxidized by the enzyme increased as the concentration of the precursor PC increased. (Fig. 13, left, black), but in the case of the amount attached to the surface, it was shown that the amount of the surface-attached chromophore rapidly decreased at a high concentration of PC (100 mM) (Fig. 13, left, red). ). In addition, in the case of H 2 O 2 concentration, the total amount of catecholic chromogen and the amount of attached to the surface of the solution phase oxidized by the enzyme at 2.5 mM and the surface showed the highest color development (Fig. 13, right). .

카테콜성 발색체의 접착성은 효소에 의해 산화된 전구체가 더 긴 올리고머/폴리머 사슬로 올리고머화/고분자화됨에 따라 증가하는데, 이때 너무 많은 양의 전구체를 사용하게 되면 효소에 의해 산화된 고농도의 건구체로부터 동시 다발적으로 올리고머화/고분자화가 진행되면서 오히려 낮은 분자량의, 즉 낮은 접착성의 발색체가 형성되면서 용액 상에는 이들 저분자성 발색체가 높은 농도로 존재하지만, 표면에는 낮은 양만 접착되는 것을 확인하였다(도 13, 왼쪽, PC 100mM).The adhesion of catecholic chromophores increases as the enzymatically oxidized precursor oligomerizes/polymerizes into longer oligomer/polymer chains. In this case, if too much of the precursor is used, a high concentration of enzymatically oxidized dry spheres Simultaneous oligomerization/polymerization from , left, PC 100 mM).

또한 PC 농도뿐만 아니라 H2O2의 농도도 표면 위에 합성된 접착성 발색체의 양을 결정하는데 영향을 미치는 것을 알 수 있다. HRP는 PC를 산화시키기 위해 H2O2를 소비하므로 H2O2의 농도는 HRP 효소 활성을 결정할 수 있고 이를 통해 발색체 생성 정도를 조절할 수 있는데, H2O2의 농도가 낮으면 불충분한 양의 전구체가 산화되어 용액상과 표면에서 모두 충분하지 못한 발색체가 생성될 것이다(도 13, 오른쪽, H2O2 0.625 mM).한편 고농도 H2O2는 올리고머화/고분자화된 카테콜성 화합물을 산화를 통해 분해(oxidative cleavage)하는 것으로 알려져 있으며, 도 13 오른쪽, 10 mM H2O2 조건은 이러한 이유 때문에 용액상과 표면에서 모두 낮은 양의 발색체가 측정된 것으로 생각된다. 이러한 두가지 이유 때문에 도 13 오른쪽에서 H2O2가 2.5 mM 사용되었을 때 용액상과 표면에 부착된 발색체의 양이 모두 최대인 것으로 보인다. In addition, it can be seen that the concentration of H 2 O 2 as well as the PC concentration influences the amount of the adhesive chromogen synthesized on the surface. HRP is one consumes the H 2 O 2 concentration of the H 2 O 2 can be determined the HRP enzyme activity may be adjusted to color scheme generated degree through which, when the concentration of H 2 O 2 is low sufficient to oxidize the PC The positive precursor will be oxidized to produce insufficient chromogen in both the solution phase and the surface (Fig. 13, right, H 2 O 2 0.625 mM). On the other hand, high concentrations of H 2 O 2 are oligomerized/polymerized catecholic compounds is known to oxidatively cleavage, and it is thought that a low amount of chromogen was measured in both the solution phase and the surface in the condition of 10 mM H 2 O 2 in the right side of FIG. 13 for this reason. For these two reasons, in the right side of FIG. 13 , when 2.5 mM H 2 O 2 was used, the amount of the chromogen attached to the solution phase and the surface seemed to be the maximum.

도 14에는 상기 실험을 통해 확인한 최적의 조건인 25 mM PC, 2.5 mM H2O2일 때 용액상 및 표면에 형성된 전체 발색체의 총량의 합(도 14, 검은색)과 용액 제거 후에 표면에 접착된 발색체(도 14, 적색)의 흡광도를 측정하여 그 결과를 나타내었다. 이를 통해, 30 ng/mL의 AFP부터 표면 접착된 발색체가 검출 가능한 신호를 생성하는 것을 확인하였다.14 shows the sum of the total amount of the total chromogens formed on the solution phase and the surface under 25 mM PC, 2.5 mM H 2 O 2 , which are the optimal conditions confirmed through the above experiment (FIG. 14, black), and the surface after removal of the solution. The absorbance of the adhered chromophore (Fig. 14, red) was measured, and the results are shown. Through this, it was confirmed that the surface-adhered chromophore from 30 ng/mL of AFP produced a detectable signal.

6.2. 6.2. 나이트로섬유소막nitrofibrous membrane 표면에서의 at the surface 바이오마커biomarker 비색 검출법 colorimetric detection

본 발명에 따른 접착성 발색체는 96 well-plate의 표면에서 뿐만 아니라 웨스턴블랏에서 통상적으로 사용되는 나이트로섬유소막의 표면에서도 수행될 수 있는데 예시로 아래와 같이 실험하였다. 먼저 1xPBS에 용해된 80, 160, 320, 640, 1280, 2560 ng/mL α-fetoprotein (AFP) 100 μL를 미세 여과 장치를 이용해 나이트로섬유소막에 일정한 크기의 점으로 스팟팅하여 실온에서 5분 동안 건조한 뒤 (결과적으로 8, 16, 32, 64, 128, 256 ng/dot) 1% BSA를 함유하는 1xPBS (1% BSA//PBS)에 AFP가 고정화된 막을 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 1% BSA/PBS에 희석된 1 μg/mL에 AFP가 고정화된 막을 담그고 2시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 다음 0.05% tween 20을 함유하는 1xPBS로 막을 3번 세척한 후 섬유소막을 1% BSA/PBS에 희석된 1 μg/mL 농도의 HRP가 결합된 2차 항체 1 mL에 넣어 1시간 동안 실온에서 추가 배양하였다. 0.05% tween 20을 함유하는 1xPBS로 다시 막을 3번 세척한 후 12.5 mM DETA, 25 mM, H2O2를 포함하는 pH 7.4로 조정된 PBS 용액에 담구고 30분 동안 실온에서 배양한 뒤에 용액에 담겨있는 막을 꺼내서 PBS로 세척한 뒤 사진을 찍어 기록하고 막의 각각 AFP 스팟에 접착되어 형성된 발색체의 진하기를 Image J 소프트웨어를 이용하여 정량분석하였다.The adhesive chromophore according to the present invention can be performed not only on the surface of a 96 well-plate, but also on the surface of a nitrofibrin membrane commonly used in Western blotting. As an example, the experiment was conducted as follows. First, 100 μL of 80, 160, 320, 640, 1280, 2560 ng/mL α-fetoprotein (AFP) dissolved in 1xPBS was spotted on the nitrofibrin membrane using a microfiltration device as dots of a certain size, followed by 5 minutes at room temperature. After drying for a while (resulting in 8, 16, 32, 64, 128, 256 ng/dot), the AFP-immobilized membrane in 1xPBS (1% BSA//PBS) containing 1% BSA was incubated for 1 hour at room temperature. AFP-immobilized membrane was immersed in 1 μg/mL diluted in 1% BSA/PBS and incubated at room temperature for 2 hours. Then, after washing the membrane 3 times with 1xPBS containing 0.05% tween 20, add the fibrin membrane to 1 mL of HRP-conjugated secondary antibody at a concentration of 1 μg/mL diluted in 1% BSA/PBS for 1 hour at room temperature. cultured. After washing the membrane 3 times again with 1xPBS containing 0.05% tween 20, it is immersed in a PBS solution adjusted to pH 7.4 containing 12.5 mM DETA, 25 mM, H 2 O 2 , incubated at room temperature for 30 minutes, and then immersed in the solution. The membrane was taken out, washed with PBS, photographed and recorded, and the thickness of the chromogen formed by adhesion to each AFP spot of the membrane was quantitatively analyzed using Image J software.

AFP가 나이트로섬유소막 위에 스팟된 후 일차 항체에 의한 인식 및 접착성 발색체 생성을 포함하는 모든 과정은 마이크로유체칩 등의 틀을 이용하여 AFP의 위치를 특정하지 않고 나이트로섬유막 전체를 용액에 넣었다가 꺼내는 방식으로 수행된다.After AFP is spotted on the nitrofibrous membrane, all processes including recognition by the primary antibody and the generation of adhesive chromophores are performed without specifying the location of AFP using a microfluidic chip, etc. This is done by putting in and taking out.

도 15에서 볼 수 있듯이, 서로 다른 농도로 표면에 스팟된 AFP가 접착성 발색체에 의해 훌륭하게 시각화 되었으며, 스팟의 끝 부분도 번짐 없이 선명하게 나타났다. 표면에 생성된 발색체의 진하기는 AFP의 농도에 직접적으로 관련되어 AFP의 농도가 증가할수록 진하게 나타났다.As can be seen in FIG. 15 , AFPs spotted on the surface at different concentrations were excellently visualized by the adhesive chromophore, and the tip of the spot appeared clearly without smearing. The depth of the chromogen produced on the surface was directly related to the concentration of AFP, and as the concentration of AFP increased, it appeared darker.

6.3. 세포 표면에서의 6.3. at the cell surface 바이오마커biomarker 비색 검출법 colorimetric detection

표적 특이적인 발색체의 접착성이 표적을 2차원적 표면뿐만 아니라 세포막과 같은 3차원적 표면에서도 검출할 수 있게 하는지 여부를 확인하기 위하여 대장암 세포주 모델인 SW480 및 SW620에 특정 막 단백질을 시각화는 발색체 생성을 진행하였다(도 16).Visualization of specific membrane proteins in colorectal cancer cell line models SW480 and SW620 was performed to determine whether the adhesion of target-specific chromophores enables the detection of targets not only on two-dimensional surfaces but also on three-dimensional surfaces such as cell membranes. The generation of chromophores proceeded (FIG. 16).

구체적으로, 인간 결장 암 세포주 (SW480과 SW620)은 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지를 사용해 세포 배양용 24well-plate에서 배양하였다. 24well-plate의 각 well에 각각 10x105개의 세포를 넣은 뒤에 37 ℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 12시간 동안 배양하였다. 이후 well에 부착되어 자라는 세포는 세포 배양액 제거 후 1xPBS로 1번 세척된 뒤에 실온에서 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS와 30분 동안 반응하여 well-plate 표면에서 고정화된다. 이후 1xPBS로 1번 세척한 뒤에 H2O2를 PBS에 희석해 3% H2O2를 만들어 다시 well에 넣고 반응시켜 세포에 혹시 남아있을지 모르는 산화력을 소멸시킨 후 다시 1xPBS로 1번 세척하였다. 이후 well의 모든 용액을 제거한 뒤에 세포가 부착된 well-plate 표면을 1% BSA/PBS로 30분 동안 반응시키고, 다시 용액을 제거한 뒤 1% BSA/PBS에 희석된 1 μg/mL 농도의 1차 항체 (항-EpCAM, 항-EGFR, 항-MUC 1, 항-CD133)를 넣고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 세포가 고정화된 well-plate를 0.05% tween 20이 함유된 PBS로 3번 세척한 후 1% BSA/PBS에 희석된 1 μg/mL 농도의 HRP가 결합된 2차 항체 100 μL와 1시간 동안 실온에서 반응시킨다. well-plate를 다시 0.05% tween 20이 함유된 PBS로 3번 세척 후 용액을 모두 제거하고 DETA 12.5 mM, PC 25 mM, H2O2 2.5 mM를 포함하는 pH 7.4로 조정된 PBS 용액을 넣어 30분 동안 실온에서 반응시킨다. 1xPBS로 well-plate를 두번 세척한 후, 광학 현미경을 통해 형성된 발색체의 진하기를 기록하고, 360 nm에서 흡광도를 측정한다. 1차 항체 없이 수행된 음성 대조군의 값을 함께 측정하여 발색체의 흡광도 값을 보정하였다.Specifically, human colon cancer cell lines (SW480 and SW620) were cultured in a 24-well-plate for cell culture using RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin. After putting 10x10 5 cells in each well of a 24-well-plate, they were cultured for 12 hours in an incubator at 37 °C and 5% CO 2 conditions. Thereafter, the growing cells attached to the wells are washed once with 1xPBS after removal of the cell culture medium, and then reacted with PBS containing 4% paraformaldehyde at room temperature for 30 minutes to be immobilized on the surface of the well-plate. After washing once with 1xPBS, H 2 O 2 was diluted in PBS to make 3% H 2 O 2 , put back into the well and reacted to extinguish the oxidative power that may remain in the cells, and then washed once again with 1xPBS. After removing all solutions from the wells, the surface of the well-plate to which the cells are attached is reacted with 1% BSA/PBS for 30 minutes, the solution is removed again, and the primary concentration of 1 μg/mL diluted in 1% BSA/PBS is Antibodies (anti-EpCAM, anti-EGFR, anti-MUC 1, anti-CD133) were added and incubated for 1 hour at room temperature. After washing the cell-immobilized well-plate with PBS containing 0.05% tween 20 three times, 100 µL of HRP-conjugated secondary antibody at a concentration of 1 µg/mL diluted in 1% BSA/PBS and 1 hour at room temperature react in After washing the well-plate 3 times with PBS containing 0.05% tween 20 again, remove all the solutions, and add PBS solution adjusted to pH 7.4 containing 12.5 mM DETA, 25 mM PC, and 2.5 mM H 2 O 2 30 React at room temperature for minutes. After washing the well-plate twice with 1xPBS, the density of the formed chromophore is recorded through an optical microscope, and the absorbance is measured at 360 nm. The value of the negative control performed without the primary antibody was also measured to correct the absorbance value of the chromogen.

암 세포 주 표면에 시각화된 4개의 바이오마커의 광학현미경 이미지를 도 17에 나타내었으며, 각각의 정량 측정된 흡광도를 도 18에 나타내었다.The optical microscope images of the four biomarkers visualized on the cancer cell main surface are shown in FIG. 17 , and the quantitatively measured absorbance of each is shown in FIG. 18 .

그 결과, 접착성 발색체는 용액 상에서 분산 현상 없이 세포막에 성공적으로 접착되어 바이오 마커 모델인 EpCAM, EGFR, MUC1 및 CD133의 세포 표면 분포를 육안으로 관찰할 수 있을 뿐만 아니라(도 17) UV-Vis 분광광도계를 통해 이들의 발현 수준을 정량적으로 측정할 수 있었다(도 18).As a result, the adhesive chromophore was successfully adhered to the cell membrane without dispersion in the solution phase, so that the cell surface distribution of the biomarker models EpCAM, EGFR, MUC1 and CD133 could be observed with the naked eye (FIG. 17) and UV-Vis Their expression levels could be quantitatively measured through a spectrophotometer (FIG. 18).

이상, 본 발명을 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특성 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다.As mentioned above, although the present invention has been described in detail through preferred preparation examples, examples and experimental examples, the scope of the present invention is not limited to the characteristic examples, and should be interpreted by the appended claims. In addition, those skilled in the art should understand that many modifications and variations are possible without departing from the scope of the present invention.

Claims (17)

효소가 표지된 항체; 및
효소와의 반응에 의해 발색될 수 있는 비색계 시약;을 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템으로서,
상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하고,
상기 비색계 시약은 아민기(-NH2 또는 -NH-)를 함유하는 분자를 더 포함하며,
상기 아민기를 포함하는 분자는, 다이에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA), 에틸렌다이아민(ethylenediamine, EDA), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine, TETA), 트리스아미노에틸아민(tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) 및 다이에틸렌트리아민우레아(diethylenetriamineurea, UDETA)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
enzyme-labeled antibody; and
An enzyme immunoreaction colorimetric detection system comprising; a colorimetric reagent capable of developing color by reaction with an enzyme,
The colorimetric reagent includes a phenol compound or a catechol compound,
The colorimetric reagent further comprises a molecule containing an amine group (-NH2 or -NH-),
Molecules containing the amine group are diethylenetriamine (diethylenetriamine, DETA), ethylenediamine (EDA), triethylenetetramine (TETA), trisaminoethylamine (tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), polyethyleneimine (Polyethyleneimine, PEI), and diethylenetriamineurea (diethylenetriamineurea, UDETA) characterized in that at least one selected from the group consisting of, enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 제1항에 있어서,
상기 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물은 상기 효소와의 반응으로 중합되어 발색체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The phenolic compound or catechol compound is polymerized by reaction with the enzyme to form a chromophore, an enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 제2항에 있어서,
상기 형성된 발색체는 접착성을 갖는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
3. The method of claim 2,
The formed chromophore is characterized in that it has adhesiveness, an enzyme immunoreactive colorimetric detection system.
 제1항에 있어서,
상기 효소는 홀스래디쉬퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 키모트립신(chymotrypsin), 트립신(trypsin), 서브틸리신(subtilisin), 리파아제(lipase), 소이빈페록시다아제 (soybean peroxidase), 클로로페록시다아제(chloroperoxidase), 망가네이즈페록시다아제(manganese peroxidase), 티로시나아제(tyrosinase), 라카아제(laccase), 셀룰로오즈(cellulose), 자일라네이즈(xylanase), 락타아제(lactase), 수크로오즈(sucrose), 오가노포스포하이드로라아제(organophosphate hydrolase), 클로리네스테라아제(cholinesterase), 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 알코올 데하이드로제나아제(alcohol dehydrogenase), 글루코스 디하이드로제나아제(glucose dehydrogenase), 히이드로제나아제(hydrogenase) 및 글루코스 이소머라아제(glucose isomerase)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The enzyme is horseradish peroxidase (HRP), chymotrypsin (chymotrypsin), trypsin (trypsin), subtilisin (subtilisin), lipase (lipase), soybean peroxidase (soybean peroxidase), chloroperoxy Chloroperoxidase, manganese peroxidase, tyrosinase, laccase, cellulose, xylanase, lactase, sucrose (sucrose), organophosphate hydrolase, cholinesterase, glucose oxidase, alcohol dehydrogenase, glucose dehydrogenase , Hydrogenase (hydrogenase) and glucose isomerase (glucose isomerase) characterized in that any one or more selected from the group consisting of, enzyme immune response colorimetric detection system.
 제1항에 있어서,
상기 카테콜류 화합물은 피로카테콜(pycatechol), 피로갈롤(pyrogallol), 3,4-하이드록시페닐알라닌(3,4-hydroxyphenylalanine, DOPA), 도파민(dopamine), 클로로겐산(Chlorogenic acid), 5-하이드록시도파민(5-hydroxydopamine, 5-HODA), 6-하이드록시도파민(6-hydroxydopamine, 6-HODA), 노르에피네프린(norepinephrine) 및 3,4-다이하이드록시신남산(3,4-dihydroxycinnamic acid, DHCA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The catechol compounds are pycatechol, pyrogallol, 3,4-hydroxyphenylalanine (DOPA), dopamine, chlorogenic acid, 5-hydroxy Dopamine (5-hydroxydopamine, 5-HODA), 6-hydroxydopamine (6-HODA), norepinephrine and 3,4-dihydroxycinnamic acid (DHCA) ), characterized in that any one or more selected from the group consisting of, enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 제1항에 있어서,
상기 페놀류 화합물은 타이로신(tyrosine), 티라민(tyramine), 옥토파민(octopamine), 시네프린(synephrine), 5-하이드록시트립토판(5-hydroxytryptophan) 및 세로토닌(serotonin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The phenolic compound is at least one selected from the group consisting of tyrosine, tyramine, octopamine, synephrine, 5-hydroxytryptophan and serotonin. Characterized in, Enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 효소 면역반응을 위한 pH가 10 이하인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The enzyme immunoreaction colorimetric detection system, characterized in that the pH for the enzyme immune reaction is 10 or less.
 제1항에 있어서,
상기 비색계 시약은 과산화물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The colorimetric reagent further comprises a peroxide, enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 제10항에 있어서,
상기 과산화물의 농도는 2 mM 내지 60 mM인 것을 특징으로 하는, 효소 면역 반응 비색 검출 시스템.
11. The method of claim 10,
The concentration of the peroxide is characterized in that 2 mM to 60 mM, enzyme immune reaction colorimetric detection system.
 제1항에 있어서,
상기 효소 면역반응은 직접 효소 면역반응, 간접 효소 면역반응, 직접 샌드위치 효소 면역반응 또는 간접 샌드위치 효소 면역반응인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The enzyme immune response is a direct enzyme immune response, an indirect enzyme immune response, a direct sandwich enzyme immune response or an indirect sandwich enzyme immune response, an enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 제3항에 있어서,
상기 발색체는 효소 면역반응이 일어나는 국소 부위에 접착되는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
4. The method of claim 3,
The colorimetric detection system for enzyme immune response, characterized in that the chromogen is adhered to a local site where an enzyme immune response occurs.
 제1항에 있어서,
상기 비색 검출 시스템은 검출 대상의 위치 정보 및 정량 정보를 함께 제시하는 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응 비색 검출 시스템.
According to claim 1,
The colorimetric detection system is characterized in that the position information and quantitative information of the detection target are presented together, the enzyme immunoreaction colorimetric detection system.
 효소가 표지된 항체; 및
효소와의 반응에 의해 발색될 수 있는 비색계 시약;을 포함하는 효소 면역반응 비색 검출 시스템이 칩 위에 구비된 바이오칩으로서,
상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하고,
상기 비색계 시약은 아민기(-NH2 또는 -NH-)를 함유하는 분자를 더 포함하며,
상기 아민기를 포함하는 분자는, 다이에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA), 에틸렌다이아민(ethylenediamine, EDA), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine, TETA), 트리스아미노에틸아민(tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) 및 다이에틸렌트리아민우레아(diethylenetriamineurea, UDETA)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 바이오칩.
enzyme-labeled antibody; and
A biochip comprising an enzyme immunoreaction colorimetric detection system comprising a colorimetric reagent capable of developing color by reaction with an enzyme, the biochip comprising:
The colorimetric reagent includes a phenol compound or a catechol compound,
The colorimetric reagent further comprises a molecule containing an amine group (-NH2 or -NH-),
Molecules containing the amine group are diethylenetriamine (diethylenetriamine, DETA), ethylenediamine (EDA), triethylenetetramine (TETA), trisaminoethylamine (tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), polyethyleneimine (Polyethyleneimine, PEI) and diethylenetriamineurea (diethylenetriamineurea, UDETA), characterized in that at least one selected from the group consisting of, the biochip.
 분석 대상 항원과, 효소가 표지된 항체를 인식시키는 단계;
비색계 시약을 첨가하여 상기 효소와 반응시킴으로써 발색체를 형성하는 단계; 및
발색체의 발광량을 측정하는 단계;
를 포함하는 효소 면역반응을 통한 비색 검출법으로서,
상기 비색계 시약은 페놀류 화합물 또는 카테콜류 화합물을 포함하고,
상기 비색계 시약은 아민기(-NH2 또는 -NH-)를 함유하는 분자를 더 포함하며,
상기 아민기를 포함하는 분자는, 다이에틸렌트리아민(diethylenetriamine, DETA), 에틸렌다이아민(ethylenediamine, EDA), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine, TETA), 트리스아미노에틸아민(tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine, PEI) 및 다이에틸렌트리아민우레아(diethylenetriamineurea, UDETA)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 효소 면역반응을 통한 비색 검출법.
Recognizing the antigen to be analyzed and the enzyme-labeled antibody;
forming a chromophore by adding a colorimetric reagent to react with the enzyme; and
measuring the amount of light emitted by the chromogen;
As a colorimetric detection method through an enzyme immune reaction comprising:
The colorimetric reagent includes a phenol compound or a catechol compound,
The colorimetric reagent further comprises a molecule containing an amine group (-NH2 or -NH-),
Molecules containing the amine group are diethylenetriamine (diethylenetriamine, DETA), ethylenediamine (EDA), triethylenetetramine (TETA), trisaminoethylamine (tris(2-aminoethyl)amine, TAEA), polyethyleneimine (Polyethyleneimine, PEI) and diethylenetriamineurea (diethylenetriamineurea, UDETA) characterized in that at least one selected from the group consisting of, colorimetric detection method through an enzyme immune reaction.
 제16항에 있어서,
상기 발색체의 발광량을 측정하는 단계는 효소 면역반응이 일어나는 국소 부위에 접착된 발색체의 발광량을 측정하는 것인, 효소 면역반응을 통한 비색 검출법.17. The method of claim 16,
The step of measuring the luminescence amount of the chromogen is to measure the luminescence amount of the chromogen adhered to the local site where the enzyme immune reaction occurs, a colorimetric detection method through an enzyme immune reaction.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3819612B2 (en) 1998-09-30 2006-09-13 大日精化工業株式会社 Method for immunological measurement of β-hCG
JP2001349893A (en) 2000-06-07 2001-12-21 Sekisui Chem Co Ltd Immunoassay reagent
US20160223530A1 (en) * 2013-05-23 2016-08-04 Yyz Pharmatech, Inc. Methods and compositions for enzyme linked immuno and hybridization mass spectrometric assay

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Polymer Science and Technology, 2012, Vol. 23, pp 396-406.

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