KR102290511B1 - Methods for screening anti-cancer drugs inhibiting interactions between AIMP2-DX2 and K-Ras - Google Patents

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Abstract

본 발명은 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계; (c) 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; (d) AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및 (e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 상기 스크리닝 방법에 따라 선별된 K-Ras와 AIMP2-DX2의 결합을 억제하는 화합물은 암에서 K-Ras 단백질의 수준을 낮추고 암의 발생과 진행을 억제하는 효과가 뛰어나다. The present invention relates to an anticancer drug screening method that inhibits the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras, and more particularly, (a) AIMP2-DX2 or a fragment thereof and K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance. contacting; (b) measuring the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras in the presence or absence of a test substance; (c) The change in the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the absence of the test substance judging; (d) selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras; And (e) relates to an anticancer agent screening method comprising the step of confirming the anticancer activity of the selected test substance in cells or animals, and to an anticancer composition comprising the anticancer agent selected by the method as an active ingredient.
In the present invention, the compound that inhibits the binding of K-Ras and AIMP2-DX2 selected according to the screening method in the present invention is excellent in the effect of lowering the level of K-Ras protein in cancer and inhibiting the development and progression of cancer.

Description

AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법{Methods for screening anti-cancer drugs inhibiting interactions between AIMP2-DX2 and K-Ras}Methods for screening anti-cancer drugs inhibiting interactions between AIMP2-DX2 and K-Ras

본 발명은 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 저해하는 항암제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계; (c) 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; (d) AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및 (e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an anticancer drug screening method that inhibits the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras, and more particularly, (a) AIMP2-DX2 or a fragment thereof and K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance contacting; (b) measuring the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras in the presence or absence of a test substance; (c) The change in the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the absence of the test substance judging; (d) selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras; And (e) relates to an anticancer agent screening method comprising the step of confirming the anticancer activity of the selected test substance in cells or animals, and to an anticancer composition comprising the anticancer agent selected by the method as an active ingredient.

정상적인 유전자가 여러 가지 요인으로 인해 발암유전자(oncogene)로 전환될 수 있는 가능성을 지니고 있는 유전자를 원발암유전자(proto-oncogene)라고 한다. 유전자 Ras 또한 이러한 유전자 가운데 하나이다. Ras 유전자에 의해 형성된 Ras 단백질은 21kDa의 분자량을 가지는데 진핵세포에서만 특이적으로 발현되며 모든 동물세포에서는 세 가지 타입의 Ras 단백질인 H-Ras, K-Ras 및 N-Ras 가 존재한다. Ras 단백질은 티로신 인산화효소 수용체(tyrosine kinase receptor)를 활성화 시키는 외부 자극에 대한 반응으로 활성화 된다. 티로신 인산화효소 수용체가 외부자극에 의해 자기인산화(autophosphorylation)가 일어나면, 활성화된 수용체에 시그널 단백질을 연결시켜주는 어댑터 단백질인 Grb2가 SOS 단백질을 불러들여 복합체를 형성하게 된다. SOS 단백질은 활성화된 수용체와 연결되어서 주위의 원형질막(plasma membrane)에 결합해 있는 비활성된 Ras GDP를 GDP/GTP 교환을 일으키고 이를 통해 Ras가 활성화 된다. 활성화 된 Ras는 Raf-MAP 인산화효소 경로(kinase pathway)와 같은 다양한 신호전달 과정을 활성화 시킴으로써 세포의 증식 및 분화를 조절하는 역할을 하게 된다.Genes that have the potential to transform normal genes into oncogenes due to various factors are called proto-oncogenes. The gene Ras is also one of these genes. The Ras protein formed by the Ras gene has a molecular weight of 21 kDa and is specifically expressed only in eukaryotic cells. In all animal cells, three types of Ras proteins, H-Ras, K-Ras and N-Ras, exist. The Ras protein is activated in response to an external stimulus that activates the tyrosine kinase receptor. When the tyrosine kinase receptor undergoes autophosphorylation by an external stimulus, Grb2, an adapter protein that connects the signal protein to the activated receptor, invites the SOS protein to form a complex. The SOS protein is linked to the activated receptor and causes GDP/GTP exchange of inactive Ras GDP bound to the surrounding plasma membrane, thereby activating Ras. Activated Ras plays a role in regulating cell proliferation and differentiation by activating various signaling processes such as the Raf-MAP kinase pathway.

암세포들은 끊임없이 분열 및 증식을 하며, 여러 논문의 보고에 따르면, 실험동물 모델에서 암 증식 및 다른 기관으로 전이 모델을 제시하고 있다. 특히, 발암 유전자인 K-Ras에 의한 암세포들은 암 치료법인 항암제 치료와 방사선 치료에 놀라울 정도로 저항성을 가지고 있다. 정상 조직에서의 K-Ras는 세포 성장과 분화를 조절하지만, 암 세포는 종양세포 주변의 종양 미세환경 인자에 영향을 받아 비정상적인 분열 및 유지경로를 활성화하여 급격히 집적됨으로서 악성화 되고 항암치료에 대한 저항성을 획득하게 되며 궁극적으로 암의 재발을 야기한다고 제시되고 있다. Cancer cells are constantly dividing and proliferating, and according to reports in several papers, a model for cancer proliferation and metastasis to other organs is suggested in an experimental animal model. In particular, cancer cells caused by the oncogene K-Ras are surprisingly resistant to chemotherapy and radiation therapy, which are cancer treatments. In normal tissues, K-Ras regulates cell growth and differentiation, but cancer cells are affected by tumor microenvironmental factors around tumor cells and activate abnormal division and maintenance pathways to rapidly accumulate, resulting in malignancy and resistance to chemotherapy. It is suggested that it ultimately causes cancer recurrence.

한편, AIMP2(ARS-interacting multi-functional protein 2)는 아미노아실-tRNA 합성효소 복합체(Aminoacyl-tRNAsynthetase: ARSs)의 형성에 관련된 단백질 중의 하나로, p38/JTV-1 또는 p38로 불려지기도 한다. AIMP2가 신규한 암 억제자(tumor suppressor)로 Smad2/3과 직접적 상호작용을 통하여 TGF-β의 신호전달을 강화시키는 기능을 함이 보고된 바 있고, 암 세포주 및 조직에서 AIMP2의 엑손 2가 결손된 형태의 변이체인 AIMP2-DX2가 특이적으로 발현되는 것이 알려져 있다(한국 등록특허 10-0762995).On the other hand, AIMP2 (ARS-interacting multi-functional protein 2) is one of the proteins involved in the formation of aminoacyl-tRNA synthetase (ARSs), also called p38/JTV-1 or p38. It has been reported that AIMP2 as a novel tumor suppressor enhances TGF-β signaling through direct interaction with Smad2/3, and exon 2 deletion of AIMP2 in cancer cell lines and tissues It is known that AIMP2-DX2, which is a mutant of the modified form, is specifically expressed (Korean Patent Registration No. 10-0762995).

이상과 같이, AIMP2-DX2 및 K-Ras 각각이 종양세포의 분화 또는 생존과 관련이 되어 있다는 것은 이미 알려져 있지만, 이들의 상호관계가 암과 어떠한 연관성이 있는지에 대해서는 알려진 바 없다.As described above, it is known that each of AIMP2-DX2 and K-Ras is related to the differentiation or survival of tumor cells, but it is not known how their correlation is related to cancer.

이에 본 발명자들은 AIMP2-DX2 및 K-Ras의 상호작용을 연구하던 중 AIMP2-DX2가 K-Ras에 직접 결합하여 K-Ras단백질을 안정화시키고, 결과적으로 암 세포의 생존과 분화에 결정적인 역할을 한다는 것을 확인하였다. 따라서, K-Ras와 AIMP2-DX2의 결합을 억제하면 종양세포 내에서 K-Ras의 안정성이 악화되어 세포의 분열과 증식을 억제할 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하였다. Therefore, while studying the interaction between AIMP2-DX2 and K-Ras, the present inventors found that AIMP2-DX2 directly binds to K-Ras to stabilize the K-Ras protein, and consequently plays a decisive role in the survival and differentiation of cancer cells. confirmed that. Therefore, the present invention was completed by focusing on inhibiting the binding of K-Ras and AIMP2-DX2 to inhibit the division and proliferation of cells by worsening the stability of K-Ras in tumor cells.

따라서, 본 발명의 목적은 Therefore, the object of the present invention is

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;(a) contacting AIMP2-DX2 or a fragment thereof with K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance;

(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계;(b) measuring the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras in the presence or absence of a test substance;

(c) 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; (c) The change in the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the absence of the test substance judging;

(d) AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및(d) selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras; and

(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. (e) to provide an anticancer drug screening method comprising the step of confirming the anticancer activity of the selected test substance in cells or animals.

본 발명의 다른 목적은 상기 항암제 스크리닝 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an anticancer agent selected by the anticancer agent screening method as an active ingredient.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;(a) contacting AIMP2-DX2 or a fragment thereof with K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance;

(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계;(b) measuring the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras in the presence or absence of a test substance;

(c) 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; (c) The change in the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the absence of the test substance judging;

(d) AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및(d) selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras; and

(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. (e) provides an anticancer drug screening method comprising the step of confirming the anticancer activity of the selected test substance in cells or animals.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항암제 스크리닝 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an anticancer agent selected by the anticancer agent screening method as an active ingredient.

이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 the present invention

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;(a) contacting AIMP2-DX2 or a fragment thereof with K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance;

(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계;(b) measuring the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras in the presence or absence of a test substance;

(c) 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계; (c) The change in the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the absence of the test substance judging;

(d) AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및(d) selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras; and

(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다. (e) provides an anticancer drug screening method comprising the step of confirming the anticancer activity of the selected test substance in cells or animals.

본 발명자들은 AIMP2-DX2가 돌연변이된 K-Ras에 결합하여 K-Ras단백질을 분해되지 않도록 안정화시키고, 돌연변이된 K-Ras로 인한 종양세포의 분화와 성장을 촉진시키는 작용을 나타냄을 발견하였다. AIMP2-DX2 의 발현을 억제하여 K-Ras와 반응할 수 있는 AIMP2-DX2의 수준을 감소시키거나, K-Ras과 AIMP2-DX2의 반응을 직접 저해할 수 있는 인자들은 K-Ras단백질 수준을 감소시키며, 결과적으로 종양세포의 성장과 분화가 저해되도록 한다. 본 발명자들은 이 같은 K-Ras과 AIMP2-DX2의 기능적인 관계에 대한 발견을 바탕으로 K-Ras과 AIMP2-DX2의 결합을 저해할 수 있는 제제를 스크리닝하여 항암제로 선별할 수 있는 항암제 스크리닝 방법을 본 명세서에서 처음으로 공개한다. The present inventors found that AIMP2-DX2 binds to the mutated K-Ras, stabilizes the K-Ras protein from degradation, and promotes the differentiation and growth of tumor cells due to the mutated K-Ras. Reduce the level of AIMP2-DX2 that can react with K-Ras by suppressing the expression of AIMP2-DX2, or factors that can directly inhibit the response of K-Ras with AIMP2-DX2 reduce the level of K-Ras protein As a result, the growth and differentiation of tumor cells is inhibited. Based on the discovery of the functional relationship between K-Ras and AIMP2-DX2, the present inventors have developed an anticancer drug screening method that can inhibit the binding of K-Ras and AIMP2-DX2 by screening an anticancer agent. It is disclosed for the first time in this specification.

상기 (a)단계는 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계이다. Step (a) is a step of contacting AIMP2-DX2 or a fragment thereof with K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance.

본 발명에서 ‘단백질’은 ‘폴리펩타이드(polypeptide)’또는 ‘펩타이드(peptide)’와 호환성있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 ‘단편’은 단백질의 일부분을 의미한다. 또한 본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’또는 ‘핵산’은 단일- 또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 폴리펩티드를 형성하는 리보솜으로 전달하는 RNA이다. In the present invention, 'protein' is used interchangeably with 'polypeptide' or 'peptide', and, for example, refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in proteins in a natural state. The 'fragment' refers to a portion of a protein. Also, in the present invention, 'polynucleotide' or 'nucleic acid' refers to deoxyribonucleotides (DNA) or ribonucleotides (RNA) in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner analogous to naturally occurring nucleotides are also included. 'mRNA' is an RNA that transfers the genetic information of the base sequence of a specific gene to the ribosome that forms the polypeptide during protein synthesis.

본 발명에서 상기 “AIMP2-DX2”는 AIMP2 단백질 서열(312aa version:AAC50391.1 또는 GI:1215669; 320aa version:AAH13630.1, GI:15489023, BC013630.1) 중 엑손 2의 영역이 결실된 변이체로서, AIMP2 등가물(아미노산 서열의 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의한 변형체로 AIMP2과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물, 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지나 AIMP2와 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 유도체)에서 엑손 2의 영역이 결실된 단백질을 포함한다. 본 발명에서 AIMP2 단백질 서열 중 “엑손 2의 영역이 결실”되었다는 것은 AIMP2 단백질에서 엑손 2 영역의 아미노산 서열이 부분적으로나 전체적으로 상실되어 생긴 변이체가 AIMP2 단백질과 헤테로다이머를 형성하여 AIMP2의 정상적인 기능을 방해하는 것을 의미한다. 따라서 AIMP2-DX2 단백질은 AIMP2 단백질의 엑손 2의 아미노산 서열이 모두 결실되거나 이 영역의 아미노산 서열을 포함하여 엑손 1, 엑손 3, 엑손 4 또는 이들 영역 모두에서 이들 영역의 일부도 결실되거나, 엑손 2의 아미노산 서열의 일부만이 결실된 단백질을 포함한다.In the present invention, the “AIMP2-DX2” is a variant in which the region of exon 2 is deleted in the AIMP2 protein sequence (312aa version: AAC50391.1 or GI: 1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI: 15489023, BC013630.1). , AIMP2 equivalent (a functional equivalent having an activity substantially equivalent to AIMP2 as a variant by substitution, deletion, insertion, or combination of amino acid sequence, or a modification that increases or decreases physicochemical properties, but exhibits substantially equivalent activity to AIMP2 functional derivatives), including proteins in which the region of exon 2 is deleted. In the present invention, "deletion of the region of exon 2" in the AIMP2 protein sequence means that a mutant resulting from the partial or total loss of the amino acid sequence of the exon 2 region in the AIMP2 protein forms a heterodimer with the AIMP2 protein to interfere with the normal function of AIMP2. means that Therefore, the AIMP2-DX2 protein has all of the amino acid sequence of exon 2 of the AIMP2 protein deleted, or a part of these regions in exon 1, exon 3, exon 4 or all of these regions, including the amino acid sequence of this region, or in exon 2 Proteins with only a portion of the amino acid sequence deleted.

본 발명의 방법을 실시하기 위한 AIMP2-DX2 단백질은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간의 AIMP2-DX2 단백질 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. The AIMP2-DX2 protein for carrying out the method of the present invention may preferably be derived from a mammal including a human, and most preferably include the amino acid sequence of the human AIMP2-DX2 protein represented by SEQ ID NO: 1. can

또한 상기 AIMP2-DX2의 단편은 AIMP2-DX2에서 K-Ras와의 결합에 필요한 부분을 포함하는 단편을 의미한다. 본 발명자들은 상기 서열번호 1로 정의되는 아미노산 서열을 갖는 AIMP2-DX2의 단백질에서 152번째 내지 251번째 아미노산 서열을 포함하는 단편이 K-Ras와 직접적으로 결합한다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명을 실시하기 위한 AIMP2-DX2의 단편은 서열번호 1로 표시되는 인간의 AIMP2-DX2 아미노산 서열에서 152 내지 251번째 아미노산을 포함하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, the fragment of AIMP2-DX2 refers to a fragment including a portion necessary for binding to K-Ras in AIMP2-DX2. The present inventors confirmed that the fragment including the 152nd to 251th amino acid sequence in the protein of AIMP2-DX2 having the amino acid sequence defined in SEQ ID NO: 1 directly binds to K-Ras. Therefore, the fragment of AIMP2-DX2 for carrying out the present invention preferably includes the 152 to 251 amino acids in the human AIMP2-DX2 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and most preferably the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 sequence, but is not limited thereto.

K-ras 유전자는 여러 암에서 흔히 돌연변이되는 ras 유전자 가운데 하나로서, K-ras 유전자의 코돈 12 및 13에서의 돌연변이는 이 유전자의 산물인 p21-ras 단백질의 기능적 변화를 초래하게 되고, 그 결과 세포핵에 성장 신호를 필요 이상으로 전달함으로써 세포의 성장과 분열을 촉진하여 발암과정에 관여한다. K-ras의 돌연변이는 췌장암의 약 90%, 대장암의 약 50%, 비소세포성 폐암 (non-small cell lung cancers)의 약 30%에서 나타나는 등 사람의 암에서 매우 흔하게 발견되고 이들 돌연변이들의 대부분은 코돈 12 및 13에 집중되어 있음이 돌연변이 프로파일에서 확인되었다 (Samowitz WS et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9: 1193-7, 2000). The K-ras gene is one of the ras genes commonly mutated in various cancers. Mutations at codons 12 and 13 of the K-ras gene cause functional changes in the p21-ras protein, which is a product of this gene, and as a result, the cell nucleus It is involved in the carcinogenesis process by promoting the growth and division of cells by transmitting the growth signal more than necessary. K-ras mutations are very common in human cancers, appearing in about 90% of pancreatic cancers, about 50% of colorectal cancers, and about 30% of non-small cell lung cancers, and most of these mutations are was confirmed in the mutation profile (Samowitz WS et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 9: 1193-7, 2000).

본 발명의 방법을 실시하기 위한 K-Ras 단백질은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에서 유래한 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 3 내지 6로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. The K-Ras protein for carrying out the method of the present invention may preferably be derived from a mammal including a human, and most preferably include the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 3 to 6.

또한 상기 K-Ras의 단편은 AIMP2-DX2와의 결합에서 필요한 부분을 포함하는 단편을 의미한다. 본 발명자들은 AIMP2-DX2이 K-Ras의 C-말단에 위치하는 hyper-variable region(HVR)부위에 결합하는 것을 확인하였다. 구체적으로는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 단편이 AIMP2-DX2와 결합할 수 있음을 밝혔다. 따라서 본 발명을 실시하기 위한 K-Ras의 단편은 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단편일 수 있다. In addition, the K-Ras fragment refers to a fragment including a portion necessary for binding to AIMP2-DX2. The present inventors confirmed that AIMP2-DX2 binds to the hyper-variable region (HVR) region located at the C-terminus of K-Ras. Specifically, it was revealed that a fragment comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 can bind to AIMP2-DX2. Accordingly, the fragment of K-Ras for carrying out the present invention may preferably be a fragment comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

또한 본 발명에 따른 AIMP2-DX2 또는 이의 단편, 그리고 K-Ras 또는 이의 단편은 이들의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 ‘기능적 동등물’이란 상기 AIMP2-DX2와 이의 단편, 그리고 K-Ras 또는 이들의 단편의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 AIMP2-DX2와, 서열번호 3으로 표시되는 K-Ras의 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서‘실질적으로 동질의 생리활성’이란 야생형 AIMP2-DX2와 야생형 K-Ras 사이의 직접적이고 특이한 결합을 재현할 수 있는 것을 의미한다. 즉, AIMP2-DX2의 단편의 기능적 동등물은 전체 길이의 K-Ras 또는 그 단편에 결합할 수 있는 활성을 갖는 것이며, K-Ras의 단편의 기능적 동등물이란 전체 길이의 AIMP2-DX2 또는 AIMP2-DX2에서 K-Ras에 결합하는 부위에 결합할 수 있는 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실된 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 AIMP2-DX2 또는 K-Ras 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조 변경이 이에 포함된다. In addition, AIMP2-DX2 or a fragment thereof and K-Ras or a fragment thereof according to the present invention include functional equivalents thereof. The 'functional equivalent' means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology to the amino acid sequence of AIMP2-DX2 and its fragments, and K-Ras or fragments thereof ( That is, it refers to a polypeptide having the same identity), and refers to a polypeptide exhibiting physiological activity substantially identical to the AIMP2-DX2 represented by SEQ ID NO: 1 and the K-Ras polypeptide represented by SEQ ID NO: 3. Here, 'substantially homogenous physiological activity' means that direct and specific binding between wild-type AIMP2-DX2 and wild-type K-Ras can be reproduced. That is, a functional equivalent of a fragment of AIMP2-DX2 has activity capable of binding to full-length K-Ras or a fragment thereof, and a functional equivalent of a fragment of K-Ras means full-length AIMP2-DX2 or AIMP2- It means an activity capable of binding to a site that binds to K-Ras in DX2. The functional equivalent may be generated as a result of addition, substitution, or deletion of some of the amino acid sequence. The substitution of amino acids in the above is preferably a conservative substitution. Examples of conservative substitutions for naturally occurring amino acids are; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn) ) and sulfur-containing amino acids (Cys, Met). The functional equivalent also includes a variant in which a part of the amino acid is deleted from the amino acid sequence. The deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region not directly related to the physiological activity of the polypeptide of the present invention. Also, the deletion of the amino acid is preferably located at a portion not directly involved in the physiological activity of AIMP2-DX2 or K-Ras polypeptide. Also included are variants in which several amino acids are added at both ends of the amino acid sequence or in the sequence. Also included in the scope of functional equivalents of the present invention are polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic backbone of the polypeptide according to the present invention and its physiological activity. This includes, for example, structural alterations to alter the stability, shelf life, volatility or solubility of a polypeptide of the invention.

본 발명의 방법에서 ‘접촉(contacting)’은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다.In the method of the present invention, 'contacting' has a general meaning, and refers to binding two or more agents (eg, two polypeptides) or binding an agent to a cell (eg, a protein and a cell). say Contact may occur in vitro. For example, combining two or more agents in a test tube or other container, or combining a test agent with a cell or cell lysate and a test agent. Contact may also occur in cells or in situ. For example, contacting two polypeptides in a cell or cell lysate by coexpression in the cell of a recombinant polynucleotide encoding the two polypeptides. In addition, a protein chip or a protein array in which a protein to be tested is arranged on the surface of a stationary phase may be used.

본 발명의 방법을 세포 안에서 실시할 때에는 AIMP2-DX2와 K-Ras은 세포 내재적으로 발현되는 것을 이용하거나, AIMP2-DX2나 이의 단편, K-Ras 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현 되도록 하여 실시할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 시험관 내 또는 단백질 어레이와 같은 in situ로 실시할 때에는 AIMP2-DX2 또는 이의 단편, 그리고 K-Ras 또는 이의 단편은 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의하여 제작하여 준비할 수 있다. 예를 들어 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산과 재조합 발현 벡터를 제작하고 적절한 숙주세포에서 발현시켜 수득할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 상기 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법으로도 제작될 수 있다. When the method of the present invention is carried out in a cell, AIMP2-DX2 and K-Ras are expressed internally in the cell, or AIMP2-DX2 or a fragment thereof, or a nucleic acid encoding K-Ras or a fragment thereof is introduced into the cell to transform It can be carried out so as to be overexpressed by converting. In addition, when the method of the present invention is performed in vitro or in situ such as a protein array, AIMP2-DX2 or a fragment thereof, and K-Ras or a fragment thereof may be extracted from nature or prepared by genetic engineering. For example, it can be obtained by constructing a nucleic acid encoding the polypeptide or a functional equivalent thereof and a recombinant expression vector according to a conventional method and expressing it in an appropriate host cell. In addition, the polypeptide necessary for carrying out the method of the present invention can be prepared by chemical synthesis methods known in the art.

또한 본 발명의 방법에서 ‘시험 물질’은 시험 제제(test agent) 또는 제제(agent)와 호환가능하게 사용할 수 있는 것으로, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. In addition, in the method of the present invention, the 'test substance' can be used interchangeably with a test agent or agent, and any substance, molecule, element, compound ( compound), an entity, or a combination thereof. Examples include proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It may also be a natural product, a synthetic compound or a chemical compound or a combination of two or more substances.

구체적으로 본 발명의 방법을 통해 선별되는 항암제는 AIMP2-DX2와 K-Ras의 단백질 결합을 저해하거나, K-Ras와 결합할 수 있는 AIMP2-DX2 단백질 발현 수준을 낮출 수 있는 것이라면 물질의 특성에 제한 받지 않으며, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질 등일 수 있다. 바람직하게는 AIMP2-DX2의 발현을 낮출 수 있는 shRNA, siRNA 또는 화학물질일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. Specifically, if the anticancer agent selected through the method of the present invention can inhibit the protein binding of AIMP2-DX2 and K-Ras or lower the expression level of the AIMP2-DX2 protein capable of binding to K-Ras, the properties of the substance are limited. It may be, for example, siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA (peptide nucleic acid), antisense oligonucleotide, antibody, aptamer, peptide, natural extract, and chemical substance. Preferably, it may be shRNA, siRNA, or a chemical that can lower the expression of AIMP2-DX2, but is not limited thereto.

상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 접촉시킨 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계이다. Step (b) is a step of measuring the binding between AIMP2-DX2 and K-Ras contacted in the presence or absence of the test substance in step (a).

상기 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계는 두 단백질의 결합 정도를 측정하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 투 하이브리드(two hybrid) 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay, co-IP), 조직면역염색과 공동국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay, SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis, BIA), 질량 분석법(mass spectrometry, MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관 내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 단백질 칩(protein chip) 또는 어레이(array), Venus BiFC(biomolecular fluorescence complementation, BiFC) 등에서 적절히 선택하여 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정할 수 있다. The step of measuring the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras can be used without limitation as long as it is commonly used in the art to measure the degree of binding of the two proteins. For example, two hybrid method, co-immunoprecipitation assay (co-IP), tissue immunostaining and co-localization assay, scintillation proximity assay (SPA) ), UV or chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), fluorescence polarization assays (FPA) and in vitro AIMP2-DX2 and AIMP2-DX2 by appropriately selecting from in vitro pull-down assay, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), protein chip or array, Venus BiFC (biomolecular fluorescence complementation, BiFC), etc. Binding of K-Ras can be measured.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 세포 내에 HA, Strep , 방사성 동위원소 등으로 적절하게 표지된 DX2와 K-Ras를 과발현시켜 co-IP 실험을 실시하거나, GST pull-down 실험을 이용하여 AIMP2-DX2에 결합하고 있는 K-Ras 단백질의 수준을 측정하거나, 반대로 K-Ras에 결합하고 있는 AIMP2-DX2의 단백질의 수준을 측정하였다. In a specific embodiment of the present invention, co-IP experiments are performed by overexpressing DX2 and K-Ras appropriately labeled with HA, Strep, radioactive isotopes, etc. in cells, or AIMP2-DX2 using GST pull-down experiments. The level of the binding K-Ras protein was measured, or, conversely, the level of the AIMP2-DX2 protein binding to K-Ras was measured.

상기 (c)단계는 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계이다. In step (c), the binding level of AIMP2-DX2 and K-ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-ras in the absence of the test substance It is a step in determining the change in

즉, (b) 단계에서 도출된 시험 물질 존재 또는 부존재하에서 접촉시킨 AIMP2-DX2와 K-Ras의 단백질의 결합 수준의 차이를 파악하여 시험 물질이 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합에 미치는 영향을 판단하는 단계이다. That is, the effect of the test substance on the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras by determining the difference in the binding level of the protein of AIMP2-DX2 and K-Ras contacted in the presence or absence of the test substance derived in step (b) It is the judgment stage.

상기 (d) 단계는 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계이다. Step (d) is a step of selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras.

본 발명자들은 구체적인 실시예에서 AIMP2-DX2와 K-Ras는 세포 안에서 특이적으로 직접 결합하며, AIMP2-DX2와의 결합을 통하여 K-Ras는 분해되지 않도록 안정화되고, 결과적으로 K-Ras에 의한 세포의 증식과 분화가 유지되는 것을 확인하였다. K-Ras 단백질의 안정화는 AIMP2-DX2 단백질과의 직접적인 결합을 통하여 이루어지는 것으로, K-Ras 단백질이 AIMP2-DX2 단백질에서 해리되면 K-Ras 단백질이 불안정해지고 분해되어 그 수준이 감소하게 되고, 결과적으로 K-Ras에 의한 세포의 증식과 분화가 저해된다. 이 같은 효과는 AIMP2-DX2 의 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 확인할 수 있었다. AIMP2-DX2와 K-Ras 사이의 결합을 억제함으로써 비정상적으로 세포 분열하는 암세포의 발생과 증식을 억제할 수 있음을 알 수 있다. According to the present inventors, in a specific embodiment, AIMP2-DX2 and K-Ras bind specifically and directly in the cell, and through the binding with AIMP2-DX2, K-Ras is stabilized so as not to be degraded, and as a result, the cell by K-Ras It was confirmed that proliferation and differentiation were maintained. Stabilization of K-Ras protein is achieved through direct binding to AIMP2-DX2 protein. When K-Ras protein is dissociated from AIMP2-DX2 protein, K-Ras protein is destabilized and degraded, resulting in a decrease in its level. Cell proliferation and differentiation by K-Ras are inhibited. This effect was confirmed using siRNA that suppresses the expression of AIMP2-DX2. It can be seen that by inhibiting the binding between AIMP2-DX2 and K-Ras, the generation and proliferation of abnormally dividing cancer cells can be suppressed.

이상의 본 발명자들의 발견을 통하여 당업자는 AIMP2-DX2와 K-Ras 사이의 결합을 억제 또는 결합 수준을 감소시키는 물질이 K-Ras를 불안정하게 하여 암 세포의 증식과 분화를 억제할 수 있음을 알 수 있다. 상기 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 물질은 대표적으로 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 자체를 저해하는 물질 또는 AIMP2-DX2와 결합 가능한 K-Ras 단백질의 양을 감소시키는 물질일 수 있다. 본 발명의 항암제 스크리닝 방법에 따라 선별된 항암제에 대한 구체적인 예는 본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 설명에 서술되어 있다.Through the above findings of the present inventors, those skilled in the art can see that a substance that inhibits or reduces the binding level between AIMP2-DX2 and K-Ras can destabilize K-Ras and inhibit the proliferation and differentiation of cancer cells. there is. The substance for reducing the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras is typically a substance that inhibits the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras itself or a substance that reduces the amount of K-Ras protein that can bind with AIMP2-DX2. can Specific examples of the anticancer agent selected according to the anticancer agent screening method of the present invention are described in the description of the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention.

상기 (e) 단계는 (d) 단계에서 선별된 물질의 항암 활성을 세포 또는 동물에서 확인하는 단계이다. Step (e) is a step of confirming the anticancer activity of the substance selected in step (d) in cells or animals.

(e) 단계는 (d) 단계에서 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 것으로 선별된 시험 물질이 구체적으로 암 또는 종양 모델의 세포 또는 동물에서 K-Ras 단백질의 불안정화로 예측되는 항암 활성을 갖는지 확인하는 단계이다. 상기 항암 활성은 비정상적인 세포 분열의 증가, 정상 세포에서 암 세포로의 전환, 암 세포의 세포 분열과 증식, 종양의 발생과 성장 등을 억제하는 것을 의미한다. In step (e), the test substance selected as reducing the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras in step (d) is specifically predicted as destabilization of K-Ras protein in cells or animals of cancer or tumor models. It is a step to check whether it has activity. The anticancer activity refers to inhibiting the increase in abnormal cell division, conversion of normal cells to cancer cells, cell division and proliferation of cancer cells, and the occurrence and growth of tumors.

상기 암 또는 종양 모델의 세포 또는 동물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이면 적절히 선택하여 (d) 단계에서 선별된 물질의 항암 활성을 확인해 볼 수 있다.If the cells or animals of the cancer or tumor model are conventionally used in the art, the anticancer activity of the substance selected in step (d) can be checked by appropriately selecting it.

본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법은 상기 (d)와 (e) 단계 사이에 추가적으로 The anticancer drug screening method according to the present invention is additionally performed between steps (d) and (e).

(1) 시험 물질을 K-Ras를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계; (1) contacting the test substance with a cell expressing K-Ras;

(2) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 K-Ras 단백질 수준을 측정하는 단계; 및(2) measuring the K-Ras protein level in a control cell that has not been contacted with the cell and the test substance; and

(3) 대조군 세포와 비교하여 K-Ras 단백질 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 실시할 수 있다.(3) selecting a test substance that reduces the K-Ras protein level compared to the control cells may be performed.

본 발명에 따르면 K-Ras가 분해되지 않도록 안정화하는 데에는 AIMP2-DX2와의 직접적인 결합이 필요하기 때문에 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준이 감소하면 K-Ras의 단백질 수준이 감소할 것임을 이해할 수 있다. 상기 (1) 내지 (3)의 단계는 (d) 단계에서 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 것으로 선별된 시험 물질이 K-Ras 단백질 수준을 감소시키는지 여부를 추가적으로 확인하는 것이다. 상기 추가적인 단계는 (d) 단계에서 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 제제로서 선별되었으나 위음성(false-positive)인 경우, 또는 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 저해하는 수준이 K-Ras의 불안정화를 야기하는데 부족한 경우를 판단하여 제거하기 위하여 실시할 수 있다. According to the present invention, since direct binding with AIMP2-DX2 is required to stabilize K-Ras so that it is not degraded, it can be understood that if the binding level between AIMP2-DX2 and K-Ras decreases, the protein level of K-Ras will decrease. . Steps (1) to (3) above are to further confirm whether the test substance selected to reduce the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras in step (d) reduces the K-Ras protein level. . The additional step is selected as an agent that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras in step (d), but is false-positive, or the level inhibiting the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras is It can be carried out to determine and eliminate cases that are insufficient to cause destabilization of K-Ras.

상기 (1) 단계에서는 (d) 단계에서 선별된 시험 물질을 K-Ras를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계이다.In step (1), the test substance selected in step (d) is brought into contact with cells expressing K-Ras.

상기 K-Ras를 발현하는 세포는 K-Ras를 내재적으로 발현하는 세포일 수도 있고, K-Ras를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 K-Ras를 과발현하는 세포일 수도 있다. 예를 들어, K-Ras를 발현하는 다양한 암 세포주 중에서 적절하게 선택하여 시험 물질의 K-Ras 불안정화 효과를 검증할 수 있다. 상기 ‘접촉’의 의미는 앞서 설명한 바와 같다.The K-Ras-expressing cell may be a cell endogenously expressing K-Ras, or it may be a cell overexpressing K-Ras by being transformed with a recombinant expression vector containing a polynucleotide encoding K-Ras. . For example, the K-Ras destabilizing effect of a test substance can be verified by appropriately selecting from various cancer cell lines expressing K-Ras. The meaning of 'contact' is the same as described above.

상기 (2) 단계는 (1) 단계에서 시험 물질과 접촉한 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 K-Ras 단백질 수준을 측정하는 단계이다. Step (2) is a step of measuring the K-Ras protein level in cells contacted with the test substance in step (1) and control cells not contacted with the test substance.

상기 K-Ras 단백질 수준을 측정하기 위하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 단백질 검출 방법을 제한없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침강법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등을 사용할 수 있다. In order to measure the K-Ras protein level, a protein detection method commonly used in the art can be selected and used without limitation, for example, western blotting, dot blotting, enzyme Immunoassay (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion method, Oukteroni immunodiffusion method, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation, complement fixation assay , flow cytometry (FACS) or a protein chip method may be used.

상기 (3) 단계는 대조군 세포와 비교하여 K-Ras 단백질 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계이다. Step (3) is a step of selecting a test substance that reduces the level of K-Ras protein compared to control cells.

상기 (3) 단계는 앞서 (2) 단계에서 측정한 시험 물질을 접촉한 세포와 접촉하지 않은 대조군 세포에서 측정한 K-Ras 단백질 수준을 비교하고, K-Ras 단백질 수준이 실제로 감소한 것으로 나타난 시험 물질을 추가적으로 선별하게 된다. In the step (3) above, the K-Ras protein level measured in the cell contacting the test substance measured in the step (2) and the control cell not in contact with the test substance measured in the step (2) are compared, and the K-Ras protein level is actually decreased. will be additionally selected.

본 발명에서 상기 암은 유방암, 폐암, 결장암, 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 자궁경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 경구암, 중피종, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 신장암, 위암, 피부암, 기저세포암, 흑색종, 편평세포암종, 구강편평세포암종, 대장직장암, 교모세포종, 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the cancer is breast cancer, lung cancer, colon cancer, anal cancer, astrocytoma, leukemia, lymphoma, head and neck cancer, liver cancer, testicular cancer, cervical cancer, sarcoma, hemangioma, esophageal cancer, eye cancer, laryngeal cancer, oral cancer, mesothelioma, myeloma, oral cancer , rectal cancer, throat cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, stomach cancer, skin cancer, basal cell cancer, melanoma, squamous cell carcinoma, oral squamous cell carcinoma, colorectal cancer, glioblastoma, uterus It may be selected from the group consisting of endometrial cancer and malignant glioma, but is not limited thereto.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항암제 스크리닝의 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an anticancer agent selected by the anticancer agent screening method according to the present invention as an active ingredient.

본 발명의 방법에 따라 선별된 항암제는 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키고, AIMP2-DX2 단백질을 불안정화하여 암 세포의 증식과 분화를 억제할 수 있는 것이라면 물질의 특성에 특별한 제한을 받지 않으나, 작용 기작에 따라 대표적으로 AIMP2-DX2와 K-Ras두 단백질의 결합 자체를 저해하는 물질 또는 AIMP2-DX2의 발현을 억제하여 AIMP2-DX2과 결합 가능한 K-Ras 단백질의 수준을 낮추는 물질을 생각해 볼 수 있다. The anticancer agent selected according to the method of the present invention reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras and destabilizes the AIMP2-DX2 protein to inhibit the proliferation and differentiation of cancer cells. However, depending on the mechanism of action, representatively, substances that inhibit the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras two proteins, or substances that suppress the expression of AIMP2-DX2 to lower the level of K-Ras protein capable of binding with AIMP2-DX2 can think about it

본 발명의 방법으로 선별된 항암제는 구체적으로는 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.The anticancer agent selected by the method of the present invention is specifically selected from the group consisting of siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, peptide nucleic acid (PNA), antisense oligonucleotide, antibody, aptamer, peptide, natural extract, and chemical substance. it could be

본 발명자들은 AIMP2-DX2에 특이적인 siRNA(si-AIMP2-DX2)를 사용하여 암 세포에서 AIMP2-DX2의 발현을 억제하면 AIMP2-DX2에 결합한 K-Ras의 수준이 감소하고, K-Ras 단백질이 분해되어 감소하며, 결과적으로 AIMP2-DX2에 의한 암 세포의 증식과 분화가 억제될 수 있다는 것을 확인하였다.The present inventors found that suppressing the expression of AIMP2-DX2 in cancer cells using siRNA (si-AIMP2-DX2) specific for AIMP2-DX2 reduces the level of K-Ras bound to AIMP2-DX2, and the K-Ras protein It is decomposed and decreased, and as a result, it was confirmed that the proliferation and differentiation of cancer cells by AIMP2-DX2 can be inhibited.

이는 AIMP2-DX2에 대한 siRNA 또는 AIMP2-DX2 저해제 등 AIMP2-DX2의 발현을 억제할 수 있는 제제는 암 질환의 예방과 치료에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여주는 것이다. This shows that agents capable of inhibiting the expression of AIMP2-DX2, such as siRNA for AIMP2-DX2 or an AIMP2-DX2 inhibitor, can be effectively used for the prevention and treatment of cancer diseases.

따라서 본 발명에 따른 항암제 스크리닝으로 선별된 항암제는 AIMP2-DX2 특이적인 siRNA, shRNA 또는 AIMP2-DX2 저해제일 수 있다. 상기 siRNA 또는 shRNA는 AIMP2-DX2 mRNA에 특이적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유도할 수 있는 10 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 당업계에서 공지된 방법에 따라 통상의 기술자가 용이하게 제작할 수 있다. Therefore, the anticancer agent selected by the anticancer drug screening according to the present invention may be an AIMP2-DX2-specific siRNA, shRNA, or AIMP2-DX2 inhibitor. The siRNA or shRNA consists of 10 to 30 nucleotide sequences capable of inducing degradation of mRNA by specifically binding to AIMP2-DX2 mRNA, and can be easily prepared by those skilled in the art according to methods known in the art. .

본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있으며, 바람직하게는 혈관 내 투여일 수 있다. The pharmaceutical composition for preventing or treating cancer according to the present invention may be administered orally or parenterally. Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, or rectal administration. and, preferably, intravascular administration.

또한 본 발명에 따른 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성 성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다. In addition, the composition for preventing or treating cancer diseases according to the present invention may be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier. 'Pharmaceutically acceptable' refers to a non-toxic composition that is physiologically acceptable and does not inhibit the action of the active ingredient when administered to humans and does not normally cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness, or similar reactions. . The carrier includes all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.

본 발명의 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강흡입제의 형태로 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아, 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다. When the pharmaceutical composition of the present invention is parenterally administered, the composition of the present invention may be formulated according to a method known in the art in the form of an injection, transdermal administration, and nasal inhalation, together with a suitable parenteral carrier. . In the case of the injection, it must be sterilized and protected from contamination of microorganisms such as bacteria and fungi. For injection, examples of suitable carriers include, but are not limited to, water, ethanol, polyols (eg, glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycol, etc.), mixtures thereof, and/or a solvent or dispersion medium containing vegetable oil. can More preferably, suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanolamine or isotonic solutions such as sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. can be used In order to protect the injection from microbial contamination, it may further include various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In addition, in most cases, the injection may further contain isotonic agents such as sugars or sodium chloride.

경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다. In the case of transdermal administration, forms such as ointments, creams, lotions, gels, external solutions, pasta agents, liniment agents, and air rolls are included. In the above, 'transdermal administration' means that the composition of the present invention is topically administered to the skin and an effective amount of the active ingredient contained in the composition is delivered into the skin. For example, the composition of the present invention may be administered by preparing an injectable dosage form and lightly pricking the skin with a 30-gauge thin injection needle or applying it directly to the skin. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, a commonly known recipe in pharmaceutical chemistry.

흡입투여제의 경우, 본 발명에 따른 조성물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.In the case of administration by inhalation, the composition according to the invention can be dispensed from a pressurized pack or nebulizer using a suitable propellant, for example, dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be conveniently delivered in the form of an aerosol spray. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit may be determined by providing a valve to deliver a metered amount. For example, gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or insufflators may be formulated to contain a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.

그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).As other pharmaceutically acceptable carriers, reference may be made to those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 수크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition according to the present invention may contain one or more buffers (eg, saline or PBS), carbohydrates (eg, glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostats, chelating agents ( eg EDTA or glutathione), adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and/or preservatives.

또한 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양하게 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 암 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be variously formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. The composition of the present invention may also be administered in combination with a known compound having an effect of preventing or treating cancer diseases.

본 발명은 AIMP2-DX2가 암 발생의 주요 원인 단백질 중의 하나인 K-Ras와 직접 결합하여 안정화시킨다는 발견을 바탕으로 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 이용하여 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 물질을 항암제로 선별하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라 선별된 K-Ras와 AIMP2-DX2의 결합을 억제하는 화합물은 암에서 K-Ras 단백질의 수준을 낮추고 암의 발생과 진행을 억제하는 효과가 뛰어나다. The present invention uses AIMP2-DX2 or a fragment thereof and K-Ras or a fragment thereof based on the discovery that AIMP2-DX2 directly binds to K-Ras, one of the main causative proteins of cancer, and stabilizes AIMP2-DX2 and K -Provides an anticancer agent screening method for selecting a substance that reduces the binding level of Ras as an anticancer agent, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the anticancer agent selected by the method as an active ingredient. The compound that inhibits the binding of K-Ras and AIMP2-DX2 selected according to the present invention has an excellent effect of lowering the level of K-Ras protein in cancer and inhibiting the development and progression of cancer.

도 1은 K-Ras 4A 야생형(WT), K-Ras 4B WT, N-Ras WT, H-Ras WT 단백질의 안정성이 AIMP2-DX2에 의해 영향 받는지를 pulse chase assay를 통해 확인한 결과이다(CHX: cycloheximide).
도 2는 K-Ras 4A WT, K-Ras 4B WT, N-Ras WT, H-Ras WT 단백질의 ubiquitination이 AIMP2-DX2에 의해 영향 받는지를 확인한 결과이다(HA-Ub: HA-Ubiquitin, 4A: K-Ras 4A, 4B: K-Ras 4B, N: N-Ras, H: H-Ras).
도 3은 AIMP2-DX2에 의한 K-Ras의 조절을 확인하기 위해, strep-AIMP2-DX2의 과발현시킨 세포와 si-AIMP2-DX2를 통해 AIMP2-DX2의 발현을 감소시킨 세포에서 K-Ras의 단백질과 mRNA 발현을 확인한 결과이다(WB: 웨스턴블롯, RT: RT-PCR).
도 4는 다양한 Ras와 AIMP2-DX2 발현에 의한 세포활성을 MTT assay를 통해 측정한 결과이다(WT: 야생형, MT: 돌연변이형).
도 5는 AIMP2-DX2에 의한 여러가지 Ras의 발현 조절을 Western blot, RT-PCR을 통해 관찰한 결과이다. (G12C, G12D, Q61R, G112V: 아미노산 돌연변이 위치)
도 6은 Doxycycline 처리에 의해 AIMP2-DX2 발현을 유도할 수 있는 H460 세포주에 Doxycycline 처리한 결과 K-Ras의 발현이 따라서 증가하는 것을 확인한 결과이다(Dox: doxycycline).
도 7은 AIMP2-DX2의 단백질과 여러가지 Ras의 결합을 in vitro GST-pull down assay를 통해 확인한 결과로, K-Ras 4A, 4B만 AIMP2-DX2와 직접적으로 결합하는 것을 확인하였다(K-4A: K-Ras 4A, K-4B: K-Ras 4B, N: N-Ras, H: H-Ras).
도 8은 AIMP2-DX2 단백질과 K-Ras HVR peptide간의 결합을 SPR 장비를 통해 분석한 결과이다.
도 9는 VN-AIMP2-DX2, VC-K-Ras가 함께 과발현된 293T 세포에 EGF(endothelial growth factor)를 시간별로 처리한 후 두 단백질의 결합을 BiFC asssay를 통해 관찰하였다(붉은색). Nanoluciferase-K-Ras가 발현되는 293T 세포에 EGF를 시간별로 처리한 후 K-Ras 단백질의 발현변화를 Nanoluciferase assay로 측정하였다(파란색).
도 10은 여러가지 GFP-Ras와 Strep-AIMP2-F 또는 Strep-AIMP2-DX2를 293T 세포에 발현시킨 후, GFP 특이적 항체를 이용하여 세포의 lysate를 면역침강하여 AIMP2-DX2 또는 AIMP2-F와 각각의 Ras가 결합하는지 여부를 관찰한 결과이다.
도 11은 AIMP2-DX2(붉은색)와 K-Ras (파란색)의 결합 모식도를 나타낸 것이다.
도 12는 AIMP2-DX2의 어떤 부분이 K-Ras와 결합하는지를 확인한 결과이다.
도 13은 K-Ras의 어떤 부분이 AIMP2-DX2와 결합하는지를 확인한 결과이다. 1 is a result of confirming whether the stability of K-Ras 4A wild-type (WT), K-Ras 4B WT, N-Ras WT, and H-Ras WT proteins is affected by AIMP2-DX2 through pulse chase assay (CHX: cycloheximide).
2 is a result of confirming whether ubiquitination of K-Ras 4A WT, K-Ras 4B WT, N-Ras WT, and H-Ras WT proteins is affected by AIMP2-DX2 (HA-Ub: HA-Ubiquitin, 4A: K-Ras 4A, 4B: K-Ras 4B, N: N-Ras, H: H-Ras).
3 is a protein of K-Ras in cells overexpressing strep-AIMP2-DX2 and cells in which the expression of AIMP2-DX2 is reduced through si-AIMP2-DX2 to confirm the regulation of K-Ras by AIMP2-DX2. and mRNA expression (WB: Western blot, RT: RT-PCR).
4 is a result of measuring the cell activity by the expression of various Ras and AIMP2-DX2 through MTT assay (WT: wild type, MT: mutant type).
5 is a result of observation of various Ras expression regulation by AIMP2-DX2 through Western blot and RT-PCR. (G12C, G12D, Q61R, G112V: amino acid mutation positions)
6 is a result confirming that the expression of K-Ras increases accordingly as a result of Doxycycline treatment in the H460 cell line capable of inducing AIMP2-DX2 expression by Doxycycline treatment (Dox: doxycycline).
7 is a result of confirming the binding of AIMP2-DX2 protein and various Ras in vitro GST-pull down assay, confirming that only K-Ras 4A and 4B directly bind to AIMP2-DX2 (K-4A: K-Ras 4A, K-4B: K-Ras 4B, N: N-Ras, H: H-Ras).
8 is a result of analyzing the binding between AIMP2-DX2 protein and K-Ras HVR peptide using SPR equipment.
FIG. 9 shows that 293T cells overexpressed with VN-AIMP2-DX2 and VC-K-Ras were treated with endothelial growth factor (EGF) over time, and the binding of the two proteins was observed through BiFC assay (red). Nanoluciferase-K-Ras-expressing 293T cells were treated with EGF for each hour, and the expression change of K-Ras protein was measured by Nanoluciferase assay (blue).
10 shows various GFP-Ras and Strep-AIMP2-F or Strep-AIMP2-DX2 expression in 293T cells, followed by immunoprecipitation of cell lysate using a GFP-specific antibody to AIMP2-DX2 or AIMP2-F, respectively. It is the result of observing whether or not Ras of .
Figure 11 shows a schematic diagram of the binding of AIMP2-DX2 (red) and K-Ras (blue).
12 is a result of confirming which part of AIMP2-DX2 binds to K-Ras.
13 is a result of confirming which part of K-Ras binds to AIMP2-DX2.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1><Example 1>

AIMP2-DX2에 의한 K-Ras의 안정성 증가Increased stability of K-Ras by AIMP2-DX2

K-Ras 4A 야생형(WT), K-Ras 4B WT, N-Ras WT, H-Ras WT 단백질의 안정성이 AIMP2-DX2에 의해 영향 받는지를 pulse chase assay를 통해 확인하고자 하였다. We tried to check whether the stability of K-Ras 4A wild-type (WT), K-Ras 4B WT, N-Ras WT, and H-Ras WT proteins is affected by AIMP2-DX2 through pulse chase assay.

구체적으로, 293T 세포에 각각의 GFP-Ras를 발현시킨 후, Strep-EV, Strep-AIMP2-DX2를 과발현 시켰다. 24시간 후에 cycloheximide를 시간별로 처리한 세포를 lysis buffer (50mM Tris(pH7.4), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 1mM EDTA, 0.5% TritonX-100, PBS)로 30분간 4℃에서 lysis 시켰다. Lysate에서 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 통해 GFP-Ras 단백질의 양을 확인하였다. Specifically, after expressing each GFP-Ras in 293T cells, Strep-EV and Strep-AIMP2-DX2 were overexpressed. After 24 hours, cycloheximide-treated cells were lysed with lysis buffer (50mM Tris (pH7.4), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 1mM EDTA, 0.5% TritonX-100, PBS) at 4°C for 30 minutes. The amount of GFP-Ras protein in the lysate was confirmed through SDS-PAGE and Western blot.

이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 각각의 측정된 GFP의 양을 그래프로 표시한 것이다. EV는 empty vector를 의미한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, K-Ras 4A, 4B 두 단백질만 AIMP2-DX2에 의해 단백질 안정성이 증가된 것을 확인할 수 있었다. The results for this are shown in FIG. 1 . 1 is a graph showing the amount of each measured GFP. EV stands for empty vector. As shown in FIG. 1 , it was confirmed that only the K-Ras 4A and 4B proteins had increased protein stability by AIMP2-DX2.

그 다음으로, K-Ras 4A WT, K-Ras 4B WT, N-Ras WT, H-Ras WT 단백질의 유비퀴틴화가 AIMP2-DX2에 의해 영향을 받는지를 확인하였다. Next, it was confirmed whether the ubiquitination of K-Ras 4A WT, K-Ras 4B WT, N-Ras WT, and H-Ras WT proteins was affected by AIMP2-DX2.

구체적으로, 293T 세포에 각각의 GFP-Ras를 발현시킨후, Strep-EV, Strep-AIMP2-DX2를 과발현 시키고, HA-Ubiquitin(Ub)을 발현시켰다. 24시간 후에 세포를 lysis buffer (50mM Tris(pH7.4), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 1mM EDTA, 0.5% TritonX-100, PBS)로 30분간 4℃에서 lysis 시켰다. Lysate를 GFP 항체를 이용하여 면역침강 시킨 후, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 통해 GFP의 유비퀴틴화 정도를 측정하였다. 유비퀴틴화된 Ras의 양은 HA 특이적 항체 (Santacruz)를 이용하여 확인하였다. Specifically, after expressing each GFP-Ras in 293T cells, Strep-EV, Strep-AIMP2-DX2 were overexpressed, and HA-Ubiquitin (Ub) was expressed. After 24 hours, the cells were lysed with lysis buffer (50mM Tris (pH7.4), 100mM NaCl, 10% Glycerol, 1mM EDTA, 0.5% TritonX-100, PBS) at 4°C for 30 minutes. After immunoprecipitation of lysate using GFP antibody, the degree of ubiquitination of GFP was measured through SDS-PAGE and Western blot. The amount of ubiquitinated Ras was confirmed using an HA-specific antibody (Santacruz).

이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 WCL은 whole cell lysate를 의미한다. 도 2에 나타낸 바와 같이 AIMP2-DX2에 의해 K-Ras 4A, 4B만 유비퀴틴화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.The results for this are shown in FIG. 2 . In FIG. 2, WCL means whole cell lysate. As shown in FIG. 2 , it was confirmed that only K-Ras 4A and 4B ubiquitination was reduced by AIMP2-DX2.

그 다음으로, AIMP2-DX2에 의한 K-Ras의 조절을 확인하기 위해, strep-AIMP2-DX2의 과발현시킨 세포와 si-AIMP2-DX2를 통해 AIMP2-DX2의 발현을 감소시킨 세포에서 K-Ras의 단백질과 mRNA 발현을 확인하였다.Next, to confirm the regulation of K-Ras by AIMP2-DX2, the expression of K-Ras in cells overexpressing strep-AIMP2-DX2 and cells in which AIMP2-DX2 expression was reduced through si-AIMP2-DX2 Protein and mRNA expression was confirmed.

구체적으로, H460 세포에 Strep-AIMP2-DX2의 과발현을 통해 AIMP2-DX2 발현을 증가시키거나 si-AIMP2-DX2를 이용하여 AIMP2-DX2 발현을 감소시킨 후, 세포안의 각 단백질의 양을 세포의 lysate를 이용하여 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. K-Ras (Santacruz), Actin (Sigma)은 특이적 항체를 통해 확인하였다. 동일한 조건으로 실험한 H460 세포의 K-Ras, AIMP2-DX2, Actin mRNA 양은 RT-PCR을 통해 확인하였다.Specifically, after increasing AIMP2-DX2 expression through Strep-AIMP2-DX2 overexpression in H460 cells or decreasing AIMP2-DX2 expression using si-AIMP2-DX2, the amount of each protein in the cell was measured by lysate was confirmed through SDS-PAGE and Western blot. K-Ras (Santacruz) and Actin (Sigma) were identified through specific antibodies. The amounts of K-Ras, AIMP2-DX2, and Actin mRNA in H460 cells tested under the same conditions were confirmed by RT-PCR.

AIMP2-DX2 primer 서열은 F: CCG GAA TTC ATG CCG ATG TAC CAG GTA AAG, R: CCG CTC GAG TTA AAA AGG AGC CAG GTT TTC이며, Actin을 특이적으로 인식할 수 있는 primer 서열은 F: CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA, R: AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC이다.AIMP2-DX2 primer sequence is F: CCG GAA TTC ATG CCG ATG TAC CAG GTA AAG, R: CCG CTC GAG TTA AAA AGG AGC CAG GTT TTC, and the primer sequence that can specifically recognize Actin is F: CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA, R: AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC.

이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, AIMP2-DX2에 의해 K-Ras 단백질이 증가하는 것을 알 수 있었다.The results for this are shown in FIG. 3 . As shown in FIG. 3 , it was found that the K-Ras protein was increased by AIMP2-DX2.

그 다음으로, K, N 또는 H-Ras와 AIMP2-DX2 발현에 의한 세포활성을 MTT assay를 통해 측정하였다. Next, cell activity by K, N or H-Ras and AIMP2-DX2 expression was measured by MTT assay.

구체적으로, K, N 또는 H-Ras를 발현시킨 CCD18CO 세포에 각각 Strep-EV, Strep-AIMP2-DX2를 발현시키고 24시간 후에 세포 생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다.Specifically, Strep-EV and Strep-AIMP2-DX2 were expressed in CCD18CO cells expressing K, N or H-Ras, respectively, and cell viability was measured 24 hours later by MTT assay.

이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, K-Ras가 발현된 세포의 경우 mutation에 상관없이 AIMP2-DX2와 함께 세포생존율이 증가하는 반면, N, H-Ras가 발현된 세포의 경우 AIMP2-DX2와 함께 세포생존율이 증가한 현상을 관찰할 수 없었다.The results for this are shown in FIG. 4 . As shown in FIG. 4 , in the case of K-Ras-expressing cells, the cell viability increases with AIMP2-DX2 regardless of mutation, whereas in the case of N, H-Ras-expressing cells, the cell viability together with AIMP2-DX2 This increase could not be observed.

AIMP2-DX2 에 의한 K, N 또는 H-Ras 의 발현 조절을 웨스턴블롯, RT-PCR을 통해 확인하고자 하였다.The expression control of K, N or H-Ras by AIMP2-DX2 was to be confirmed through Western blot and RT-PCR.

구체적으로, 293T 세포에 K, N 또는 H-Ras의 GFP-Ras와 AIMP2-DX2를 과발현시키고 24시간 후에, 세포안의 각 단백질의 양을 세포의 lysate를 이용하여 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. GFP(Santacruz)는 특이적 항체를 통해 확인하였다. 동일한 조건으로 실험한 293T 세포의 K-Ras, AIMP2-DX2, Actin mRNA 양은 상기한 RT-PCR 방법으로 확인하였다.Specifically, GFP-Ras and AIMP2-DX2 of K, N or H-Ras were overexpressed in 293T cells, and 24 hours later, the amount of each protein in the cell was confirmed through SDS-PAGE and Western blot using the cell lysate. did. GFP (Santacruz) was identified through a specific antibody. The amounts of K-Ras, AIMP2-DX2, and Actin mRNA in 293T cells tested under the same conditions were confirmed by the above-described RT-PCR method.

이에 대한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, mutation에 상관없이 K-Ras의 단백질 발현이 AIMP2-DX2에 의해 증가하였으며, N, H-Ras의 경우 영향이 없는 것을 확인하였다.The results for this are shown in FIG. 5 . As shown in FIG. 5 , regardless of the mutation, the protein expression of K-Ras was increased by AIMP2-DX2, and it was confirmed that there was no effect in the case of N and H-Ras.

그 다음으로, Doxycycline 처리에 의해 strep-AIMP2-DX2 발현을 유도할 수 있는 H460 세포주에 Doxycycline을 시간별로 처리한 후, 세포내의 K-Ras, AIMP2-DX2, AIMP2-F, Actin의 양을 Western blot을 통해 확인하였다. AIMP2-DX2는 StrepMAB-Classic-HRP (IBA)를 이용하여 확인하였다.Next, the H460 cell line capable of inducing strep-AIMP2-DX2 expression by treatment with Doxycycline was treated with Doxycycline for each hour, and the amounts of K-Ras, AIMP2-DX2, AIMP2-F, and Actin in the cells were measured by Western blot. was confirmed through AIMP2-DX2 was confirmed using StrepMAB-Classic-HRP (IBA).

이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, doxycyclin을 처리함에 따라 AIMP2-DX2의 발현과 함께 K-Ras의 발현이 함께 증가하는 것을 확인할 수 있었다. The results for this are shown in FIG. 6 . As shown in FIG. 6 , it was confirmed that the expression of K-Ras increased together with the expression of AIMP2-DX2 as the doxycyclin was treated.

이상의 결과를 통해, 돌연변이된 K-Ras가 AIMP2-DX2와의 결합을 통해 안정성이 증가한다는 것을 확인할 수 있었으며, 세포 내에서 AIMP2-DX2의 발현이 증가함에 따가 K-Ras의 발현 또한 동일한 경향으로 증가하는 것을 알 수 있었다. AIMP2-DX2에 의한 안정화는 K-Ras에 국한된 것일 뿐, N-Ras 또는 H-Ras는 이러한 안정화 현상이 나타나지 않았다. Through the above results, it was confirmed that the stability of the mutated K-Ras increased through binding to AIMP2-DX2, and as the expression of AIMP2-DX2 in the cell increased, the expression of K-Ras also increased in the same way could see that Stabilization by AIMP2-DX2 was only limited to K-Ras, and N-Ras or H-Ras did not show this stabilization phenomenon.

<실시예 2><Example 2>

AIMP2-DX2와 K-Ras의 직접적인 결합의 확인Confirmation of direct binding of AIMP2-DX2 to K-Ras

AIMP2-DX2와 K, H 또는 N-Ras가 직접으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여 GST-Pull down assay를 수행하였다. A GST-Pull down assay was performed to determine whether AIMP2-DX2 and K, H or N-Ras directly bind.

구체적으로, GFP-tag이 fusion된 K, H 또는 N-Ras가 발현된 293T 세포 lysate와 GST-AIMP2-DX2 단백질을 섞어주었다. 섞어준 후, glutathione-sepharose (GE Healthcare)를 이용하여, AIMP2-DX2 단백질을 pull down 하였다. AIMP2-DX2 단백질과 함께 pull down된 Ras를 SDS-PAGE를 통해 분리하였고, GFP 특이적 항체 (Santacruz)를 이용한 Western blot을 통해 확인되었다. 동량의 GST-AIMP2-DX2 단백질이 사용되었음을 coomassie staining 을 통해 확인하였다.Specifically, 293T cell lysate expressing GFP-tag fused K, H or N-Ras was mixed with GST-AIMP2-DX2 protein. After mixing, AIMP2-DX2 protein was pulled down using glutathione-sepharose (GE Healthcare). Ras pulled down together with AIMP2-DX2 protein was isolated through SDS-PAGE, and confirmed by Western blot using a GFP-specific antibody (Santacruz). It was confirmed through coomassie staining that the same amount of GST-AIMP2-DX2 protein was used.

이에 대한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, K-Ras 4A, 4B만 AIMP2-DX2와 직접적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다. The results for this are shown in FIG. 7 . As shown in FIG. 7 , it was confirmed that only K-Ras 4A and 4B directly bind to AIMP2-DX2.

그 다음으로, AIMP2-DX2 단백질과 K-Ras HVR peptide간의 결합을 SPR 장비를 통해 분석하였다. TRX-AIMP2-DX2, TRX 단백질을 고정시킨 후, K-Ras HVR peptide를 농도별로 흘려 각 단백질과 peptider간의 결합, 분리값을 얻은 후, KD 값을 계산하였다. TRX 단백질에 비특이적인 결합을 보정해주기 위해 TRX 단백질을 이용하였다.Next, the binding between AIMP2-DX2 protein and K-Ras HVR peptide was analyzed using SPR equipment. After TRX-AIMP2-DX2 and TRX proteins were immobilized, K-Ras HVR peptide was flowed by concentration to obtain binding and separation values between each protein and peptider, and then KD values were calculated. TRX protein was used to correct for non-specific binding to TRX protein.

이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 정제된 AIMP2-DX2 단백질과 K-Ras 4B HVR peptide가 KD값 2.5 ×10-5 수준으로 직접 결합하는 것을 SPR assay를 통해 관찰하였다.The results for this are shown in FIG. 8 . As shown in FIG. 8 , direct binding of purified AIMP2-DX2 protein and K-Ras 4B HVR peptide with a KD value of 2.5 × 10 -5 was observed through SPR assay.

그 다음으로, VN-AIMP2-DX2, VC-K-Ras가 함께 과발현된 293T 세포에 EGF(endothelial growth factor)를 시간별로 처리한 후 두 단백질의 결합을 BiFC asssay를 통해 관찰하였다 (붉은색). Nanoluciferase-K-Ras가 발현되는 293T 세포에 EGF를 시간별로 처리한 후 K-Ras 단백질의 발현변화를 Nanoluciferase assay로 측정하였다 (파란색). 각 실험은 독립적으로 3회 반복하였고 결과는 그래프로 표현하였다.Next, 293T cells overexpressed with VN-AIMP2-DX2 and VC-K-Ras were treated with endothelial growth factor (EGF) over time, and the binding of the two proteins was observed through BiFC assay (red). Nanoluciferase-K-Ras-expressing 293T cells were treated with EGF for each hour, and the expression change of K-Ras protein was measured by Nanoluciferase assay (blue). Each experiment was independently repeated three times, and the results were expressed in a graph.

이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타낸 바와 같이 EGF 시간별 처리에 의해 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합이 증가하는 것을 NanoBit assay를통해 확인하였고 (붉은색), K-Ras의 단백질 발현이 결합과 함께 증가하는 것을 Nanoluciferase assay를 통해 확인할 수 있었다.The results for this are shown in FIG. 9 . As shown in FIG. 9 , it was confirmed by NanoBit assay that the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras was increased by EGF time-dependent treatment (red), and it was confirmed that the protein expression of K-Ras increased with the binding by Nanoluciferase assay could be verified through

그 다음으로, GFP-K-Ras, GFP-N-Ras 또는 GFP-H-Ras와 Strep-AIMP2-F 또는 Strep-AIMP2-DX2를 293T 세포에 발현시킨 후, 세포를 lysis하였다. GFP 특이적 항체를 이용하여 lysate를 면역침강(IP)하였다. Ras와 함께 결합하는 단백질들은 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. AIMP2 또는 AIMP2-DX2의 결합여부는 StrepMAB-Classic-HRP (IBA)을 이용한 웨스턴 블롯 수행으로 확인하였다.Next, after expressing GFP-K-Ras, GFP-N-Ras or GFP-H-Ras and Strep-AIMP2-F or Strep-AIMP2-DX2 in 293T cells, the cells were lysed. Lysates were immunoprecipitated (IP) using a GFP-specific antibody. Proteins that bind together with Ras were confirmed by SDS-PAGE and Western blot. The binding of AIMP2 or AIMP2-DX2 was confirmed by Western blotting using StrepMAB-Classic-HRP (IBA).

이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, AIMP2-DX2가 mutation에 상관없이 K-Ras와 결합하며, N, H-Ras와는 결합하지 않는 것을 IP를 통해 확인하였으며, AIMP2-F는 모든 Ras와 결합하지 않는다는 것을 알 수 있었다. The results for this are shown in FIG. 10 . As shown in Figure 10, it was confirmed through IP that AIMP2-DX2 binds to K-Ras regardless of mutation and does not bind to N, H-Ras, and AIMP2-F does not bind to all Ras. could

이상의 결과를 통해, AIMP2-DX2가 K-Ras와 직접적으로 결합한다는 것을 알 수 있었으며, AIMP2-DX2와의 결합은 K-Ras에 국한된 것일 뿐, N 또는 H-Ras 와는 결합이 일어나지 않는다는 것을 알 수 있었다. Through the above results, it could be seen that AIMP2-DX2 directly binds to K-Ras, and it was found that the binding of AIMP2-DX2 was limited to K-Ras and did not occur with N or H-Ras. .

<실시예 3><Example 3>

AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합부위 확인Confirmation of binding site between AIMP2-DX2 and K-Ras

상기 실시예 1 및 2를 통해 AIMP2-DX2와 K-Ras가 직접적으로 결합하여 K-Ras의 안정성이 증가한다는 것을 확인한 후, AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합부위를 확인하는 실험을 진행하였다. After confirming that AIMP2-DX2 and K-Ras directly bind to increase the stability of K-Ras through Examples 1 and 2, an experiment was conducted to confirm the binding site of AIMP2-DX2 and K-Ras.

K-Ras와 결합하는 AIMP2-DX2의 위치를 규명하기 위하여, AIMP2-DX2를 DM1 내지 DM3로 나누어 K-Ras와의 결합을 확인하였다. In order to elucidate the position of AIMP2-DX2 binding to K-Ras, AIMP2-DX2 was divided into DM1 to DM3 to confirm binding to K-Ras.

구체적으로, GFP-tag이 fusion된 DX2 단백질 조각들 (도 11 참조)이 발현된 293T 세포 lysate와 GST-K-Ras4B 단백질을 섞어주었다. 섞어준 후, glutathione-sepharose (GE Healthcare)를 이용하여, K-Ras4B 단백질을 pull down 하였다. K-Ras4B 단백질과 함께 pull down된 AIMP2-DX2 단백질 조각들을 SDS-PAGE를 통해 분리하였고, GFP 특이적 항체 (Santacruz)를 이용한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. Specifically, 293T cell lysate expressing GFP-tag fused DX2 protein fragments (see FIG. 11) was mixed with GST-K-Ras4B protein. After mixing, K-Ras4B protein was pulled down using glutathione-sepharose (GE Healthcare). AIMP2-DX2 protein fragments pulled down together with K-Ras4B protein were separated by SDS-PAGE, and confirmed by Western blot using a GFP-specific antibody (Santacruz).

이에 대한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, AIMP2-DX2 단편 중 DM3 (아미노산 152 내지 251번째)가 K-Ras와 결합하는 것을 in vitro GST-pull down assay를 통해 확인하였다.The results for this are shown in FIG. 12 . As shown in FIG. 12 , binding of DM3 (amino acids 152 to 251) among AIMP2-DX2 fragments with K-Ras was confirmed through an in vitro GST-pull down assay.

그 다음으로 AIMP2-DX2와 결합하는 K-Ras의 위치를 규명하기 위하여, Strep-AIMP2-DX2를 발현하는 293T 세포 lysate와 GST-tag이 fusion된 K-Ras 단백질 조각들 (Full, G, HVR, 도 11 참고)을 섞어주었다. 섞어준 후, glutathione-sepharose (GE Healthcare)를 이용하여, K-Ras 단백질 조각들을 pull down 하였다. K-Ras4B 단백질 조각들과 함께 pull down된 AIMP2-DX2를 SDS-PAGE를 통해 분리했고, StrepMAB-Classic-HRP (IBA) 를 이용한 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 동량의 GST-K-Ras 단백질 조각이 사용되었음을 coomassie staining 을 통해 확인하였다.Next, in order to identify the location of K-Ras binding to AIMP2-DX2, Strep-AIMP2-DX2 expressing 293T cell lysate and GST-tag fused K-Ras protein fragments (Full, G, HVR, 11) was mixed. After mixing, K-Ras protein fragments were pulled down using glutathione-sepharose (GE Healthcare). AIMP2-DX2 pulled down together with K-Ras4B protein fragments was isolated through SDS-PAGE, and confirmed by Western blot using StrepMAB-Classic-HRP (IBA). It was confirmed through coomassie staining that the same amount of GST-K-Ras protein fragment was used.

이에 대한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이 K-Ras 단편 중 HVR (도 11 참고)이 AIMP2-DX2와 결합하는 것을 in vitro GST-pull down assay를 통해 확인하였다.The results for this are shown in FIG. 13 . As shown in FIG. 13 , it was confirmed through an in vitro GST-pull down assay that HVR (refer to FIG. 11) of the K-Ras fragment binds to AIMP2-DX2.

이상 확인한 바와 같이, Ras family 들 중에서 K-Ras는 AIMP2-DX2와 직접적으로 결합하여 단백질 안정성이 증대가 되는 것으로 확인되었으며, K-Ras와 AIMP2-DX2 결합의 구체적인 결합위치를 도 11에 나타내었다. 즉, 종양 억제유전자인 K-Ras가 종양세포에서 돌연변이되고, AIMP2-DX2와의 직접적인 결합에 의해 단백질 안정성이 증대되어 그 활성이 장기간 유지되기 때문에, 종양세포의 분화와 증식이 활성화되는 결과가 나타난다고 할 수 있다. 따라서, AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 차단하는 약물은 돌연변이된 K-Ras의 단백질 안정성을 악화시켜 결과적으로 종양세포의 분화와 증식을 저해할 수 있다. As confirmed above, in the Ras family, K-Ras directly binds to AIMP2-DX2 and increases protein stability, and the specific binding position of K-Ras and AIMP2-DX2 binding is shown in FIG. 11 . That is, the tumor suppressor gene K-Ras is mutated in tumor cells, and protein stability is increased by direct binding to AIMP2-DX2 and its activity is maintained for a long time, resulting in activation of tumor cell differentiation and proliferation. can do. Therefore, drugs that block the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras may deteriorate the protein stability of the mutated K-Ras and consequently inhibit the differentiation and proliferation of tumor cells.

본 발명은 AIMP2-DX2가 암 발생의 주요 원인 단백질 중의 하나인 K-Ras와 직접 결합하여 안정화시킨다는 발견을 바탕으로 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 이용하여 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 물질을 항암제로 선별하는 항암제 스크리닝 방법과 상기 방법으로 선별된 항암제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라 선별된 K-Ras와 AIMP2-DX2의 결합을 억제하는 화합물은 암에서 K-Ras 단백질의 수준을 낮추고 암의 발생과 진행을 억제하는 효과가 뛰어나 산업상 이용가능성이 매우 우수하다. The present invention uses AIMP2-DX2 or a fragment thereof and K-Ras or a fragment thereof based on the discovery that AIMP2-DX2 directly binds to K-Ras, one of the main causative proteins of cancer, and stabilizes AIMP2-DX2 and K -Provides an anticancer agent screening method for selecting a substance that reduces the binding level of Ras as an anticancer agent, and a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the anticancer agent selected by the method as an active ingredient. The compound that inhibits the binding of K-Ras and AIMP2-DX2 selected according to the present invention has excellent industrial applicability because it lowers the level of K-Ras protein in cancer and inhibits the occurrence and progression of cancer.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Methods for screening anti-cancer drugs inhibiting interactions between AIMP2-DX2 and K-Ras <130> NP16-0081 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AIMP2-DX2 protein <400> 1 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu 85 90 95 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 2 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of Human AIMP2-DX2 protein <400> 2 Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser 1 5 10 15 Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro 35 40 45 Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser 50 55 60 Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val 65 70 75 80 Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala 85 90 95 Leu Lys Leu Leu Lys 100 <210> 3 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4B wild type protein <400> 3 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 180 185 <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4B mutant protein <400> 4 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 180 185 <210> 5 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4A wild type protein <400> 5 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys 165 170 175 Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 180 185 <210> 6 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4A mutant protein <400> 6 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys 165 170 175 Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 180 185 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4B HVR <400> 7 Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys 1 5 10 15 Cys Val Ile Met 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4A HVR <400> 8 Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Cys Ile Ile Met 20 <110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Methods for screening anti-cancer drugs inhibiting interactions between AIMP2-DX2 and K-Ras <130> NP16-0081 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AIMP2-DX2 protein <400> 1 Met Pro Met Tyr Gln Val Lys Pro Tyr His Gly Gly Gly Ala Pro Leu 1 5 10 15 Arg Val Glu Leu Pro Thr Cys Met Tyr Arg Leu Pro Asn Val His Gly 20 25 30 Arg Ser Tyr Gly Pro Ala Pro Gly Ala Gly His Val Gln Asp Tyr Gly 35 40 45 Ala Leu Lys Asp Ile Val Ile Asn Ala Asn Pro Ala Ser Pro Pro Leu 50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu His Arg Leu Leu Cys Glu His Phe Arg Val Leu 65 70 75 80 Ser Thr Val His Thr His Ser Ser Val Lys Ser Val Pro Glu Asn Leu 85 90 95 Leu Lys Cys Phe Gly Glu Gln Asn Lys Lys Gln Pro Arg Gln Asp Tyr 100 105 110 Gln Leu Gly Phe Thr Leu Ile Trp Lys Asn Val Pro Lys Thr Gln Met 115 120 125 Lys Phe Ser Ile Gln Thr Met Cys Pro Ile Glu Gly Glu Gly Asn Ile 130 135 140 Ala Arg Phe Leu Phe Ser Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 2 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of Human AIMP2-DX2 protein <400> 2 Leu Phe Gly Gln Lys His Asn Ala Val Asn Ala Thr Leu Ile Asp Ser 1 5 10 15 Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys Glu Gly Ser Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser Ala Leu Gly Lys Ser Pro 35 40 45 Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala Asp Val Val Leu Trp Ser 50 55 60 Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val Thr Val Pro Ala Asn Val 65 70 75 80 Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu Ala Pro Phe Asn Thr Ala 85 90 95 Leu Lys Leu Leu Lys 100 <210> 3 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4B wild type protein <400> 3 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 180 185 <210> 4 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4B mutant protein <400> 4 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 180 185 <210> 5 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4A wild type protein <400> 5 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys 165 170 175 Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 180 185 <210> 6 <211> 189 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4A mutant protein <400> 6 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys 165 170 175 Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met 180 185 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4B HVR <400> 7 Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys 1 5 10 15 Cys Val Ile Met 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> K-Ras 4A HVR <400> 8 Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys 1 5 10 15 Lys Cys Ile Ile Met 20

Claims (11)

(a) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서 AIMP2-DX2 또는 이의 단편과 K-Ras 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계;
(b) 시험 물질의 존재 또는 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 측정하는 단계;
(c) 시험 물질 존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합과 시험 물질 부존재하에서의 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합을 비교하여 시험 물질에 의한 AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준의 변화를 판단하는 단계;
(d) AIMP2-DX2와 K-Ras의 결합 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계; 및
(e) 선별된 시험 물질의 항암 활성을 세포 또는 인간을 제외한 동물에서 확인하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
(a) contacting AIMP2-DX2 or a fragment thereof with K-Ras or a fragment thereof in the presence or absence of a test substance;
(b) measuring the binding of AIMP2-DX2 to K-Ras in the presence or absence of a test substance;
(c) The change in the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras by the test substance by comparing the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the presence of the test substance and the binding of AIMP2-DX2 and K-Ras in the absence of the test substance judging;
(d) selecting a test substance that reduces the binding level of AIMP2-DX2 and K-Ras; and
(e) an anticancer drug screening method comprising the step of confirming the anticancer activity of the selected test substance in cells or animals other than humans.
 제1항에 있어서, 상기 항암제 스크리닝 방법은 상기 (d)와 (e) 사이에
(1) 시험 물질을 K-Ras를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(2) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 K-Ras 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(3) 대조군 세포와 비교하여 K-Ras 단백질 수준을 감소시키는 시험 물질을 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the anticancer drug screening method is performed between (d) and (e).
(1) contacting the test substance with a cell expressing K-Ras;
(2) measuring the K-Ras protein level in a control cell that has not been contacted with the cell and the test substance; and
(3) The method further comprising the step of selecting a test substance that reduces the K-Ras protein level compared to the control cell.
 제1항에 있어서, 상기 AIMP2-DX2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the AIMP2-DX2 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
 제1항에 있어서, 상기 AIMP2-DX2의 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1, wherein the fragment of AIMP2-DX2 comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
 제1항에 있어서, 상기 K-Ras는 서열번호 3 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the K-Ras comprises an amino acid sequence represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6.
 제1항에 있어서, 상기 K-Ras의 단편은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the K-Ras fragment comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 결합을 측정하는 방법은 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(massspectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays,FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
According to claim 1, wherein the method for measuring the binding in step (b) is a two-hybrid method, a co-immunoprecipitation assay (co-immunoprecipitation assay), co-localization assay (co-localization assay), scintillation proximity assay (scintillation) proximity assay: SPA), UV or chemical crosslinking method, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), fluorescence polarization assays (FPA) And in vitro pull-down assay (in vitro pull-down assay) characterized in that carried out by any one or more methods selected from the group consisting of.
 제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 결장암, 항문암, 성상세포종, 백혈병, 림프종, 두경부암, 간암, 고환암, 자궁경부암, 육종, 혈관종, 식도암, 안암, 후두암, 경구암, 중피종, 골수종, 구강암, 직장암, 인후암, 방광암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 신장암, 위암, 피부암, 기저세포암, 흑색종, 편평세포암종, 구강편평세포암종, 대장직장암, 교모세포종, 자궁내막암 및 악성뇌교종으로 이루어진 군에서 선택된 암인 것을 특징으로 하는 방법.
According to claim 1, wherein the cancer is breast cancer, lung cancer, colon cancer, anal cancer, astrocytoma, leukemia, lymphoma, head and neck cancer, liver cancer, testicular cancer, cervical cancer, sarcoma, hemangioma, esophageal cancer, eye cancer, laryngeal cancer, oral cancer, mesothelioma, Myeloma, oral cancer, rectal cancer, throat cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, kidney cancer, stomach cancer, skin cancer, basal cell cancer, melanoma, squamous cell carcinoma, oral squamous cell carcinoma, colorectal cancer, glioma A method, characterized in that the cancer is selected from the group consisting of blastoma, endometrial cancer, and malignant glioma.
 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, PNA(peptide nucleic acid), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 펩티드, 천연추출물 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the anticancer agent is siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme, peptide nucleic acid (PNA), antisense oligonucleotide, antibody, aptamer, peptide, natural extract and chemical substance. A method, characterized in that selected from the group consisting of.
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