KR102283508B1 - 골형성 단백질-2를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 - Google Patents

골형성 단백질-2를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 골형성 단백질-2를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 형태를 유지하면서 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키는 효과가 있으므로, 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키고자 할 때 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물이 유용하게 이용될 수 있다.

Description

골형성 단백질-2를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물{Composition for Facilitating Osteogenic Differentiation of Stem Cell Spheroids Comprising Bone Morphogenetic Protein-2 As Active Ingredient}
본 발명은 골형성 단백질-2를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
골수 유래 중간엽 줄기세포는 다중 계통 분화 가능성을 갖는 것으로 알려져 있으며 다양한 치료 목적으로 사용된다.
골형성 단백질-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)는 파괴된 뼈의 재생을 위해 널리 적용되고 있다. 보다 최근에는 BMP-2가 줄기세포의 골분화에 활용되고 있다. BMP-2의 적용은 인 비트로(in vitro) 광물화를 향상시켰다. 또한, 제 2 형 당뇨병은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 분화를 저해시킬 수 있다고 보고되었다. BMP-2는 Wnt 신호 전달 경로를 통해 제 2 형 당뇨병 랫트(rats)에서 골수 유래 중간엽 줄기세포의 골형성을 촉진시켰다.
보다 최근에는, 3 차원 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포가 골형성 평가를 위해 시험되었다.
하지만, BMP-2에 의한 골수 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 골분화 및 광물화에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
대한민국 등록특허 제 10-1972988호(등록일자: 2019.04.22)
본 발명자들은 골수 유래 중간엽 줄기세포 스페로이드의 골분화에 골형성 단백질-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)를 사용할 수 있는지 연구하였고, BMP-2를 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처리함으로써 줄기세포 스페로이드의 형태가 잘 유지되었고 BMP-2를 골분화 유도 배지에 첨가할 경우에는 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진하는 것으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 BMP-2를 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 BMP-2를 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 골형성 단백질-2 (bone morphogenetic protein-2)를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드(spheroid)의 골분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 유효성분인 “골형성 단백질-2”는 파괴된 뼈의 재생을 위해 널리 적용(Fan, J., et al., 2015. Tissue Eng Part A 21: 2053-2065)되고 있고 줄기세포의 골분화에 활용(Lee, Y.H., et al., 2019. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 107(2):286-294)되고 있으며, 인 비트로(in vitro) 광물화를 향상시키는 물질(Wongwitwichot, P., et al., 2017. Adv Med Sci 62: 266-272)로 알려져 있다.
본 발명에서 “줄기세포”는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도 다능성 줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
상기 용어 “배아줄기세포”는 배아줄기세포는 남성의 생식세포인 정자와 여성의 생식세포인 난자가 결합하여 생성된 수정란에서 유래한다. 그리고 배아줄기세포는 착상 전 배반포기배의 내부 세포괴로부터 획득되며 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 능력을 지녔으나 배양조건만 주어진다면 분화되지 않은 상태로 무한대로 증식이 가능한 아직 분화되지 않은 세포를 말한다. 다시 말해서 특수 분화 배양 환경에서는 원하는 방향으로 세포 분화가 유도되어 신경, 당뇨, 혈액과같은 질환의 세포 치료제로 이용될 수 있어서 한 개의 배아줄기세포주만으로도 수많은 환자의 치료에 이용될 수 있다고 기대되는 만능세포를 의미한다.
상기 용어 “유도 다능성 줄기세포”는 분화된 세포들이 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서, 역분화 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)이라고도 한다.
상기 용어 “성체줄기세포”는 인간을 포함한 포유동물의 조직에서 분리해 낸, 분화되기 직전의 원시세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 형태의 세포(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포등)로 분화할 수 있는 줄기세포이다.
본 발명에서 “세포 스페로이드”는 세포 배양시 세포들이 3차원 형태로 뭉쳐서 형성된 세포의 집합체이다. 최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid)의 배양이 주목을 받고 있다. 암을 모사하기 위한 세포 응집(cell aggregation)을 유도하기도 하고, 당뇨 치료를 위한 인슐린의 정상분비를 유도하기 위해서 췌도 세포를 이식함에 있어 응집된 세포를 이식하는 방법 등이 쓰이고 있어 스페로이드의 대량 생산이 요구되고 있다. 또한, 줄기세포 연구가 성숙됨에 따라 배아 줄기세포를 3차원 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러 가지 방법이 시도되고 있다.
본 발명에서 “분화”는 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 상기 분화는 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.
발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물에는 상기 골형성 단백질-2가 0.0001 내지 500 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 300 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 100 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세로(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 골형성 단백질-2를 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법은 줄기세포에 상기 골형성 단백질-2를 처리하는 단계 및 상기 골형성 단백질-2가 처리된 줄기세포를 배양하는 단계를 포함한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에서 상기 골형성 단백질-2가 0.0001 내지 500 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있고, 바람직하게는 0.0005 내지 300 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 100 ng/ml의 함량으로 포함될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포 및 각종 분화 세포를 초기화시킨 유도 다능성 줄기세로(ips 세포)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 성체줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에서 상기 줄기세포 스페로이드는 오목한 표면에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 효과 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다.
(ii) 본 발명의 골형성 단백질-2를 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 형태를 유지하면서 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키는 효과가 있다.
(iii) 본 발명의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키고자 할 때 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드 배양 및 분석방법에 대한 개략도이다.
도 2는 배양 1, 3, 7, 14 및 21 일자의 줄기세포 스페로이드의 형태를 나타낸다. 스케일바는 200 μm를 나타낸다.
도 3a는 배양 1 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead/Merged 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 3b는 배양 3 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead/Merged 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 3c는 배양 5 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead/Merged 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 3d는 배양 7 일자의 줄기세포 스페로이드의 Live/Dead/Merged 세포 이미지를 나타낸다. 스케일바는 50 μm를 나타낸다.
도 4는 배양 1, 3, 5 및 7 일자의 Cell Counting Kit-8 분석에 의한 세포 생존도를 나타내는 그래프이다.
* 배양 3 일자의 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(P < 0.05).
도 5는 배양 14 일자의 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)의 활성을 나타내는 그래프이다.
* 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(P < 0.05).
도 6a는 배양 7, 14 및 21 일자의 알리자린 레드 S(Alizarin Red S) 염색 결과를 현미경으로 관찰한 이미지이며, 스케일바는 200 μm를 나타낸다.
도 6b는 배양 21 일자의 알리자린 레드 S 염색의 정량분석을 나타내는 그래프이다.
* 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(P < 0.05).
도 7a는 배양 7 일자의 정량적 중합효소 연쇄반응에 의한 Runx2 발현에 대한 정량분석을 나타내는 그래프이다.
* 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(P < 0.05).
도 7b는 배양 7 일자의 정량적 중합효소 연쇄반응에 의한 collagen I(Col1) 발현에 대한 정량분석을 나타내는 그래프이다.
* 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다(P < 0.05).
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실험 재료 및 방법
1. 골수 유래 중간엽 줄기세포를 사용한 세포 스페로이드 형성
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(가톨릭 MASTER 세포)를 가톨릭 세포 치료 사업단(CIC, 서울, 한국)에서 입수하였다. 가톨릭 세포 치료 사업단에서 상기 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포가 90% 이상 CD73 및 CD90을 발현하는 것으로 확인하였다. 배양 배지를 2일 또는 3일마다 교환하고, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 95% O2 및 5% CO2의 37℃ 배양기에서 증식시켰다.
도 1은 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드 배양 및 분석방법의 개요를 보여준다. 줄기세포 스페로이드 형성을 위해, 시판되는 오목한(concave) 마이크로 웰 (H389600, StemFIT 3D; MicroFIT, 성남, 한국)을 사용하였다. 각 웰에 총 1 x 106 개의 세포를 올려놓고 상기 세포의 반응을 평가했다. 본 발명자들은 0, 10 및 100 ng/ml의 미리 결정된 농도로 BMP-2를 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처리하였다. 역상 현미경(inverted microscope, Leica DM IRM, Leica Microsystems, Wetzlar, 독일)을 사용하여 줄기세포 스페로이드의 형태학적 특성을 평가하였다. 줄기세포 스페로이드의 형태학적 평가는 배양 1, 3, 7, 14 및 21 일자에 수행되었다.
2. 세포 생존도 측정
본 발명자들은 골분화 유도 배지에서 줄기세포 스페로이드를 배양하였다.
본 발명자들은 배양 1, 3, 5 및 7 일자에 줄기세포 스페로이드의 정성분석을 위해, 원형질막 완전성(plasma membrane integrity) 및 에스테라제 활성(esterase activity)를 기반으로 하는, 시판되는 2 색(two-color) 분석키트(Live/Dead Kit assay, Molecular Probes, Eugene, OR, 미국)를 사용하였다. Live/Dead Kit 분석에서는 살아있는 세포는 강하고, 단일한 녹색 형광을 나타내고, 죽은 세포는 적색 형광을 나타낸다. 또한 수용성 테트라졸륨염(tetrazolium salt)을 기반으로 하는, 분석키트(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Tokyo, 일본)를 사용하여 정량적 세포 생존도 테스트를 수행하였다.
3. 알칼리 포스파타제 활성 수준 및 칼슘 침착
알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성 수준 및 칼슘 침착 평가를 위한 안트라퀴논 염료 분석에 의해 골분화능을 평가하였다. 골분화 유도 배지와 함께 배양 플레이트상에서 성장한 세포 스페로이드를 배양 14 일자에 수득하였다. 알칼리 포스파타제 활성 수준의 평가를 위해 시판되는 키트 (K412-500, BioVision, Inc., Milpitas)를 사용하였다. 배양 7, 14 및 21 일자에 골분화능을 평가하기 위해 칼슘 침착 평가를 위한 안트라퀴논 염료분석법을 사용하였다. 줄기세포 스페로이드를 세척 및 고정 절차 후 실온에서 30 분 동안 알리자린 레드 S(Alizarin Red S)로 염색하였다. 결합된 염료의 정량분석은 21 일자에 수행되었다.
4. 정량적 중합효소 연쇄반응에 의한 Runx2 및 Col1의 평가
배양 7 일자에 수득한 세포로부터 분리정제 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RNA는 SuperiorScript II 역전사 효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)를 사용하여 역전사를 위한 주형으로 사용되었으며, RNA 양은 260 nm 및 280 nm에서 분광 광도계 (ND-2000, Thermo Fisher Scientific, Inc.) 흡광도의 비율 내에 있다고 결정했다.
정량적 중합효소 연쇄반응에 의해 mRNA 발현을 검출하였다. GenBank를 기반으로 센스 및 안티센스 프라이머를 설계했고, 프라이머의 염기서열은 하기 표 1에 기재하였다. 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene)로서 β-actin을 적용하여 정규화를 수행하였다.
프라이머
명칭		 방향 서열
Runx2 F 5'-AAT GAT GGT GTT GAC GCT GA-3’ (서열번호 1)
R 5'-TTG ATA CGT GTG GGA TGT GG-3’ (서열번호 2)
Col1 F 5'-CCA GAA GAA CTG GTA CAT CAG CAA-3' (서열번호 3)
R 5'-CGC CAT ACT CGA ACT GGA ATC-3' (서열번호 4)
β-actin F 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3' (서열번호 5)
R 5'-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3' (서열번호 6)
5. 통계 분석
실험 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 정규성 및 분산에 대한 검정을 수행했다. 농도와 시점의 영향을 평가하기 위해 이원 분산 분석을 수행했다. Tukey의 사후 검증(post hoc test)을 포함하는 일원 분산 분석을 적용하여 그룹 간의 차이를 테스트했다(SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, 미국)(P < 0.05).
실험결과
1. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 세포 스페로이드의 형성
구형의 줄기 세포 응집체가 배양 1일자에 확인되었다(도 2 참조). BMP-2의 첨가에 의한, 골분화 유도 배지에서 배양된 세포 스페로이드의 유의한 형태학적 변화는 관찰되지 않았다. 배양 3, 7, 14 및 21 일자의 세포 스페로이드의 형상은 도 2에 도시되어 있으며, 더 긴 배양시간에서 현저한 변화가 관찰되지 않았다.
2. 세포 생존도
세포 스페로이드의 생존도에 대한 정성적인 결과를 도 3a에 도시된 바와 같이, 배양 1일자에 Live/Dead Kit assay로 분석하였다. 모든 경우에, 세포 스페로이드 내의 대부분의 세포는 세포가 살아있음을 나타내는 녹색 형광을 나타내었다. 더 긴 배양시간에서 현저한 변화가 발견되지 않았다(도 3b 내지 3d 참조).
배양 1, 3, 5 및 7 일자의 세포 생존도에 대한 정량적 값은 도 4에 도시되어 있다. 배양 1 일자에 BMP-2를 0, 10 및 100 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 450 nm 흡광도 값은 각각 0.247 ± 0.005, 0.241 ± 0.011 및 0.251 ± 0.006으로 나타났다(P > 0.05).
3. 알칼리 포스파타제 활성 수준 및 칼슘 침착
배양 14 일자의 알칼리 포스파타제 활성 분석결과가 도 5에 도시되어 있다. 배양 14 일자에 BMP-2를 0, 10 및 100 ng/ml의 농도로 처리한 경우, 405 nm 흡광도 값은 각각 0.081 ± 0.001, 0.084 ± 0.007 및 0.103 ± 0.006으로 나타났다. 대조군(0 ng/ml)과 비교했을 때 BMP-2를 100 ng/ml 농도로 처리한 경우 흡광도 값이 유의하게 더 높았다(P < 0.05).
배양 7, 14 및 21 일자의 광물화 분석결과가 도 6a에 도시되어 있다. 광물화된 세포외 침착물이 각 그룹에서 고르게 관찰되었다. 배양 21 일자의 정량분석 결과는 대조군과 비교했을 때 BMP-2를 100 ng/ml 농도로 처리한 경우, 흡광도 값이 유의하게 더 높았음을 보여 주었다 (P < 0.05)(도 6b 참조).
4. 정량적 중합효소 연쇄반응에 의한 Runx2 및 Col1의 평가
정량적 중합효소 연쇄반응을 이용하여 mRNA 발현수준을 분석한 결과, 대조군과 비교했을 때 BMP-2를 100 ng/ml 농도로 처리한 경우 Runx2의 mRNA 발현수준이 유의하게 더 높음을 관찰하였다(P < 0.05)(도 7a 참조). BMP-2를 100 ng/ml의 농도로 처리할 경우에서 대조군과 비교했을 때 collagen I(Col1) mRNA 발현에서의 유의한 변화가 나타나지 않았음을 확인하였다(P > 0.05)(도 7b 참조).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> The Catholic University of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for Facilitating Osteogenic Differentiation of Stem Cell Spheroids Comprising Bone Morphogenetic Protein-2 As Active Ingredient <130> DPC193736 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for Runx2 gene <400> 1 aatgatggtg ttgacgctga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for Runx2 gene <400> 2 ttgatacgtg tgggatgtgg 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for Col1 gene <400> 3 ccagaagaac tggtacatca gcaa 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for Col1 gene <400> 4 cgccatactc gaactggaat c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for beta actin gene <400> 5 tggcacccag cacaatgaa 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for beta actin gene <400> 6 ctaagtcata gtccgcctag aagca 25

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법에 있어서,
    골형성 단백질-2를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하고,
    상기 줄기세포는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포이고,
    상기 줄기세포 스페로이드는 오목한 표면에서 배양하고,
    상기 골형성 단백질-2가 처리된 줄기세포에서 Runx2의 mRNA 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 골형성 단백질-2는 0.0001 내지 500 ng/ml의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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