KR102279343B1 - 탯줄중간엽줄기세포인자 동결분말, 제작법 및 그 활용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탯줄중간엽줄기세포인자 냉동분말, 제작법 및 그 활용을 제공하고, 이 방법으로 탯줄중간엽줄기세포 조건 배지를 수집함과 동시에, 만니톨을 동결건조 보호제를 사용하여, 낸동건조 공법을 사용하여 냉동건조하여 제작된 탯줄중간엽줄기세포인자 냉동분말은 장기적이고 안정적인 보존에 유익하고, 양호한 항노화 효능을 가진다.

Description

탯줄중간엽줄기세포인자 동결분말, 제작법 및 그 활용

본 발명은 생물기술분야에 관한 것으로서, 특히는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결분말, 제작법 및 그 활용에 관한 것이다.

중간엽줄기세포(MSC)는 안정적인 성장중, 여러가지 세포인자를 분비하게 된다. MSC로 부터 분비되는 TGF-β (변환성장인자-β), VEGF (혈관내피성장인자), FGF、HGF (간장성장인자), SOD (과산화물불균등화효소), IL-6 (인터루킨-6), EGF (표피성장인자), 콜라겐 (COL I，COL III), 피브로넥틴（FN), PDGF (혈소판파생인자) 등은 산화손상을 효과적으로 방지할 수 있고, 피부노화 방지, 주름방지, 피부미백, 상처유합 등 방면에서 현저한 효과를 가진다. MSC로 부터 분비되는 TGF-β1는 TYR (TYR)의 활성에 대한 억제를 통해 치로시나제 관련 프로틴의 표현을 줄여주고, 멜라닌의 합성을 억제하는 등 과정중에서 미백역할을 하게 된다. 줄기세포의 수집처리 배양을 거친 상청액(MSC-CM)으로 부터, 대량의 세포인자를 얻을 수 있다.

액체상태의 MSC-CM는 실온하에서의 보존기간이 짧고, 운수에 불리하다. 그에 대한 냉동 불말화 처리를 통해, 냉동분말로 제작함으로써, 세포인자의 활성을 보존할 수 있고, 저장 운수가 편리해 진다.

본 발명은 탯줄중간엽줄기세포인자 냉동분말의 제작법을 제공하여, 장기적으로 활성을 보존할 수 있고, 양호한 항노화 효능을 가지는 탯줄중간엽줄기세포인자 냉동분말을 신속하게 제작하려는데 목적을 둔다.

바람직하게, 아래 단계:

(1) 탯줄으로 부터 워튼연육을 취하여, 체외 배양을 통해 탯줄중간엽줄기세포를 얻어, P0대로 표기하고,

(2) 계대 3 ~ 5차, 즉 P3 ~ P5후, 무혈청 공배지로 바꾸며,

(3) 계속하여 24 h ~ 96 h 배양하고,

(4) 세포상청액 수집, 원심분리, 투석을 거쳐, 잔류액을 수집하여, 탯줄중간엽줄기세포 인자를 얻어, 동결건조 하는,

단계를 포함하는 탯줄중간엽줄기세포인자 제작법을 제공한다.

단계(2)중의 계대는 MSC배지를 사용한다.

단계(4)중의 원심분리: 상청액을 2 ~ 6℃ 조건하에서, 800 ~ 2000 rpm/min로 5 ~ 15 min 원심 분리하여 상청액을 취한다.

단계(4)중의 투석: 상청액을 3 ~ 50 KD 투석봉지내에 넣고, 투석봉지를 PBS용액에 넣어, 0 ~ 6℃ 조건하에서, 24 ~ 48 h 투석한 후, 투석액을 수집한다.

단계(4)의 동결건조 조건: 동결건조 보호제는 넣어 동결건조하여 얻는다.

상기 동결건조 보호제: 100 ㎖당 상기 탯줄중간엽줄기세포인자에 0 ~ 15 g의 만니톨을 넣는다. 예를 들어, 0.5 ~ 6 g의 만니톨을 넣는다.

그중, 일부 실시예중, 바람직한 상기 동결건조 프로세스: (1) 샘플을 5 ㎖의 바이엘병중에 넣어, 1.5 ㎖/병으로 하고, (2) 콜드히드라진 온도를 -80℃로 내리고, 체임버의 온도를 -40℃로 내리며, (3) 바이엘병을 헐렁이 막아 진공 냉동 건조기중에 넣어, 냉동상태를 4h 유지하고, (4) 압력을 25 Pa로 내리며, (5) 0.5℃/min의 속도로 온도를 -20℃로 올려, 16.5 h 유지하고, (6) 압력을 5 Pa로 내리며, (7) 0.5℃/min의 속도로 온도를 25℃로 올리고, 6.5 h 유지하여, 동결건조를 완료시키고, (8) 바이엘병의 마개를 막아서 꺼낸다.

본 발명은 탯줄중간엽줄기세포인자 동결분말을 제공하며, 구체적인 기술수단은 아래와 같다.

바람직하게, 상기 제작법으로 제작하여 얻는다.

본 발명은 탯줄중간엽줄기세포인자 동결분말의 활용을 제공하며, 구체적인 기술수단은 아래와 같다.

탯줄중간엽줄기세포인자 동결분말은 피부미백, 항노화, 탈모방지 등에 사용된다.

본 발명은 탯줄중간엽줄기세포 조건 배지를 통해, 탯줄중간엽줄기세포인자를 얻는다. 그중, 탯줄중간엽줄기세포를 사용함으로 인하여, 사회윤리 분쟁을 회피할 수 있고, 증식이 빠르며, 면역배척반응이 적다. 본 발명의 상기 방법으로 탯줄중간엽줄기세포를 배양하여 얻어지는 줄기세포인자와 적합한 동결건조 보호제로 제작한 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말은 줄기세포인자의 장기적 및 안정한 보존에 유익하고, 항노화 효능을 가진다.

도면1은 동결건조 샘플형태에 대한 각 농도 동결건조 보호제의 영향을 나타내는 도면.
도면2는 동결건조 샘플(MSC-CM + 6% 만니톨)의 DSC 검출도.
도면3은 각 샘플군이 생쥐 피부중 수분 함량에 대한 영향을 나타내는 도면.
도면4는 각 샘플군이 생쥐 피부중 히드록시프롤린 함량에 대한 영향을 나타내는 도면.
도면5는 각 샘플군이 생쥐 피부중 SOD 활성에 대한 영향을 나타내는 도면.
도면6은 생쥐 피부 HE염색도.
도면7은 각 샘플이 생쥐피부 진피 두께에 대한 영향을 나타내는 도면.
도면8은 생쥐 피부 MASSON 염색도.
도면9는 각 샘플이 생쥐피부 콜라겐 함량에 대한 영향을 나타내는 도면.

본 발명은 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법을 제공하는 바, 본 발명의 과제, 기술수단 및 효과를 더욱 뚜렷하게 하기 위하여, 아래에는 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 다 알다시피, 여기에서 설명되는 실시형태들은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 실시예중에 사용되는 각종 시약들은 모두 시판의 제품들이다.

아래에는 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명에 대해 전면적으로 설명히기로 한다.

실시예1

본 실시예에서는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법을 제공하는데, 구체적으로 아래 단계로 구성된다.

(1) 탯줄중간엽줄기세포인자의 제작

탯줄으로 부터 워튼연육을 취하여, 체외 배양을 통해 탯줄중간엽줄기세포를 얻어, P0대로 표기한다. 계대5번, 즉 P5대후, 세포가 75 ~ 85% 성장됐을 때, 무혈청 공배지로 바꾸고, 계속하여 72 h 배양한 후, 상청액을 수집한다. 상청액을 4℃ 조건하에서 1000 rpm/min로 5 min 원심분리하고, 상청액을 취하여, 0.22㎛ 필터로 여과한다. 상청액을 3 KD 투석봉지안에 넣고, 투석봉지를 PBS 용액중에 넣어, 4℃ 조건하에서 36 h 투석하고, 투석액을 수집하여, 탯줄중간엽줄기세포인자를 얻는다.

(2) 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말

100 ㎖ 당 탯줄중간엽줄기세포인자에 6 g의 만니톨을 넣고, 아래 단계에 따라 동결건조한다. (1) 샘플을 5 ㎖의 바이엘병중에 넣어, 1.5 ㎖/병으로 하고, (2) 콜드히드라진 온도를 -80℃로 내리고, 체임버의 온도를 -40℃로 내리며, (3) 바이엘병을 헐렁이 막아 진공 냉동 건조기중에 넣어,냉동상태를 4h 유지하고, (4) 압력을 25 Pa로 내리며, (5) 0.5℃/min의 속도로 온도를 -20℃로 올려, 16.5 h 유지하고, (6) 압력을 5 Pa로 내리며, (7) 0.5℃/min의 속도로 온도를 25℃로 올리고, 6.5 h 유지하여, 동결건조를 완료시키고, (8) 바이엘병의 마개를 막아서 꺼낸다.

실시예2

본 실시예에서는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법을 제공하는데, 실시예1에 비해, 단계(2)중 100 ㎖ 당 탯줄중간엽줄기세포인자에 0 g의 만니톨을 넣는 점에서 다르다.

그외에는 실시예1과 같다.

실시예3

본 실시예에서는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법을 제공하는데, 실시예1에 비해, 단계(2)중 100 ㎖ 당 탯줄중간엽줄기세포인자에 0.5 g의 만니톨을 넣는 점에서 다르다.

그외에는 실시예1과 같다.

실시예4

본 실시예에서는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법을 제공하는데, 실시예1에 비해, 단계(2)중 100 ㎖ 당 탯줄중간엽줄기세포인자에 1 g의 만니톨을 넣는 점에서 다르다.

그외에는 실시예1과 같다.

실시예5

본 실시예에서는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법을 제공하는데, 실시예1에 비해, 단계(2)중 100 ㎖ 당 탯줄중간엽줄기세포인자에 2 g의 만니톨을 넣는 점에서 다르다.

그외에는 실시예1과 같다.

실시예6

각기 다른 만니톨 농도에 따른 효과 평가

실시예1 ~ 5 중의 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 외관, 색깔, 재수화성은 표1의 표준에 따라 평가한다.

탯줄중간엽줄기세포인지 동결건조 분말의 외관, 색깔, 재수화성 표준

점수	외관	색깔	재수화성/s
0 ~ 2	위축++	분층, 상하 색차가 현저함+++ 분층, 상하 색차가 현저함++	>120
3 ~ 5	위축++		90 ~ 120
6 ~ 8	위축+	상하 색차가 현저하지 않음	60 ~ 90
9 ~ 10	포만	균일, 색차 없음	0 ~ 60

도면1과 표2에 표시되는 바와 같이, 동결건조 보호제 만니톨 농도가 0%, 0.5%,1%일때, 동결건조 제품의 형태는 안 좋고, 분층 현상이 나타나고, 샘플이 위축되고, 포만도가 낮고, 재수화 시간이 모두 120 s 이상으로서, 샘플이 재수화된 후, 무색, 청징, 투명상이고, 점수가 낮으며, 각기 2, 2, 3점이다. 만니톨 농도가 2%와 6%일 때, 동결건조 제품의 형태가 좋고, 동결건조 분말의 포만도가 좋으며, 분층 현상이 없고, 샘플의 재수화 시간이 짧아 약 60s이며, 샘플 재수화 후, 무색, 청징, 투명상이고, 점수가 높으며, 각기 16점, 16점이다.

각기 다른 만니톨 함량이 외관, 색깔, 재수화성 종합평가 결과

만니톨 함량/%	외관과 색깔	재수화성	종합평가
0	1	1	2
0.5	1	1	2
1	2	1	3
2	8	8	16
6	8	8	16

실시예7

동결건조 샘플의 공융점 검측

100 ㎖ 당 실시예2에서 얻은 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말에 6 g의 만니톨을 넣는다. 도가니를 십만분의일 천칭위에 놓고, 천칭을 리셋한 후, 소량의 샘플용액을 도가니안에 넣고, 샘플의 무게를 정확하게 측정하여, 도가니를 시차주사열량분석계의 검측처에 놓는다. 검측조건을 설정하고, 시스템 온도를 점차 -50℃로 올려 검측을 완료시키며, 그 결과는 표2와 같이 샘플의 공융점은 -17℃이다.

실시예8

탯줄중간엽줄기세포인자와 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 항노화 효능에 대한 연구

ICR생쥐를 블랭크군, 모델군, MSC-CM, 동결건조불말제군, 양성약물군으로, 무작위로 8마리씩 5군으로 나눈다. 동물용 보통사료를 먹여 일주일간 환경에 적응시킨다.

생쥐의 배부털을 바리깡으로 깍고, 탈모제로 털을 깨끗이 처리한 후, 생쥐의 뒷덜미 부위에 D-Gal의 PBS용액(1000mg/kg)을 매일 한번씩 연속 42d 피하주사 하며, 주사 체적을 약200㎕로 하고, 6일마다 한번씩 체중을 달아보며, 체중에 따라 투여량을 조절한다. 마감차 처리 24h 후, 목을 잘라 죽이고, 신속히 생쥐 배부의 탈모부분 피부를 취한다. 실험중에 사용되는 제재들은 모두 무균상태에서 조제되고, 기기들은 모두 사전에 소독처리를 거친것이다. (1) 블랭크군: 매일 생리식염수를 100㎕/10g/마리 씩 주사하고, 0.5 ㎖의 생리식염수를 바른다. (2) 모델군: 매일 10%의 D-Gal를 100㎕/10g/마리 씩 주사하고, 생쥐 배부 피부에 0.5 ㎖의 생리식염수를 바른다. （3）MSC-CM군: 매일 10%의 D-Gal를 100㎕/10g/마리 씩 주사하고, 생쥐 배부 피부에 0.5 ㎖의 MSC-CM를 바른다. (4) 동결건조 샘플군: 매일 10%의 D-Gal를 100㎕/10g/마리 씩 주사하고, 동결건조 샘플에 1.5㎖의 일차증류수를 넣어 용해시켜, 생쥐의 배부 피부에 0.5 ㎖의 동결건조 용액을 바른다. (5) 양성대조군: 매일 10%의 D-Gal를 100㎕/10g/마리 씩 주사하고, 생쥐의 배부 피부에 0.5 ㎖의 10 g/L 염산 아미노구아니딘 (AG)용액을 바른다. 건조법으로 피부의 함수량을 측정하고, 시약 키트로 피부의 SOD 활성과 히드록시프롤린의 함량을 측정한다. 피부 절편에 대한 HE 염식과 MASSON염색을 진행한다.

그 측정결과는 도면 3 ~ 9와 같다. 모델군중, 생쥐 피부 함수량, SOD 활성 및 HYP 함량은 모두 현저히 저하되어 있다. 약물 투여후, MSC-CM과 동결건조 제제군은 모델군의 손상에 대해 모두 개선 작용이 있었다. 모델군의 진피두께는 극히 현저하게 감소(p<0.001) 되었고, 컬라겐 함량은 현저히 감소(p<0.05)되었다. 모델군에 비해, MSC-CM와 동결건조 제제군은 생쥐 진피 두께와 콜라겐 함량을 극히 현저히 증가(p<0.01)시켰다. 생쥐 체내 실험에 따르면, 탯줄중간엽줄기세포인자와 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말은 모두 일정한 항노화작용이 있다는 것이 발견되었다.

Claims (10)

1. (1) 탯줄로부터 워튼연육을 취하여, 체외 배양을 통해 탯줄중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)를 얻어, P0대로 표기하는 단계;
   (2) MSC배지를 사용하는 3~5차 계대, 즉 P3 ~ P5대 후, 상기 탯줄중간엽줄기세포가 75%~85%성장했을 때, 무혈청 공배지로 바꾸는 단계;
   (3) 계속하여 72시간 동안 배양하는 단계; 및
   (4) 다음의 i) 내지 iii) 과정을 거쳐서 동결건조 분말을 취하는 단계
   i) 과정: 세포상청액을 섭씨 4도의 조건하에서 1000 rpm/min의 속도로 5분동안 원심분리하여 상청액을 취하고, 0.22 마이크로미터의 필터로 여과하는 단계;
   ii) 과정: 상청액을 3 KD 투석봉지내에 넣고, 투석봉지를 PBS 용액에 넣어, 섭씨 4도의 조건하에서, 36시간동안 투석하여 투석액을 수집하는 단계;
   iii) 과정: 상기 수집된 투석액을 동결건조하여 동결건조 분말을 획득하는 단계
   를 포함하고,
   단계(4)에 속하는 iii) 과정의 동결건조 프로세스는
   A. 샘플을 5 ㎖의 바이엘병 중에 넣어, 1.5 ㎖/병으로 하고,
   B. 콜드히드라진 온도를 섭씨 -80도로 내리고, 체임버의 온도를 섭씨 -40도로 내리며,
   C. 바이엘병을 헐렁하게 막아 진공 냉동 건조기중에 넣어, 냉동 상태를 4시간 동안 유지하고,
   D. 압력을 25 Pa로 내리며,
   E. 0.5℃/min의 속도로 온도를 -20℃로 올려, 16.5 시간 유지하고,
   F. 압력을 5 Pa로 내리며,
   G. 0.5℃/min의 속도로 온도를 25℃로 올리고, 6.5h 유지하여, 동결건조를 완료시키고,
   H. 바이엘병의 마개를 막아서 꺼내는 것
   을 포함하고,
   단계(4)에 속하는 iii) 과정의 동결조건 조건은 동결건조 보호제를 넣어 동결건조하여 얻는 것으로서, 상기 동결건조 보호제는 100 ㎖당 상기 탯줄중간엽줄기세포인자에 6 g의 만니톨을 넣는 것이고,
   상기 단계 (1) 내지 (4)를 통해 제조된 동결건조 분말의 공융점은 섭씨 -17도인 것을 특징으로 하는 탯줄중간엽줄기세포인자 동결건조 분말의 제작법.
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