KR102277061B1 - 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 더덕 추출물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1) 및 아트로진-1(atrogin-1)의 발현 증가를 완화시키며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR(phosphorylated mammalian target of rapamycin)의 발현을 증가시킴으로써, 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of muscular disease comprising Codonopsis lanceolata extract as an active ingredient}
본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
골격근은 사람 몸무게의 40 내지 50%를 차지하는 조직으로, 1개의 골격근은 다수의 근섬유와 결합조직으로 구성되고, 가로무늬가 있으며 수의성 운동에 관여한다. 근육은 에너지 항상성 유지 및 열생성 등의 대사 기능에 중요한 역할을 하고, 근육의 크기(size)는 근육 내에서 일어나는 동화작용(anabolism)이나 이화작용(catabolism)을 유도하는 세포 내 신호전달 과정(signalling pathways)에 의해 조절된다.
근위축(muscle atrophy)이란 근육량의 지속적인 감소를 의미하며 근육의 약화 및 퇴행에 의해 발생한다(McKinnell IW et el., Cell, 119(7): 907-910, 2004). 근위축은 활동량의 감소, 산화적 스트레스, 만성 염증에 의해 유도되어 근육 기능과 운동 능력을 약화시키고(Lee CE et el., Clinical Nutrition, 26(5): 524-534, 2007), 단백질 합성보다 분해가 더 많이 일어날 때 발생한다(Nader GA, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 37(10): 1985-1996, 2005).
근육 단백질의 합성에 관여하는 대표적인 인자로는 mTOR(mammalian target of rapamycin)가 있다. mTOR는 단백질의 번역(translation) 개시를 조절하는 중요한 인자로서, 인산화된 형태(phosphorylated mTOR, p-mTOR)가 활성화된 형태이고, 근육을 지속적으로 고정(immobilization)시켰을 때 발현은 크게 변하지 않지만 활성화가 증가하면 근위축을 완화시키는 것으로 알려져 있다. mTOR는 mRNA 번역을 개시하는 4EBP1(4E-binding protein 1)과 p70S6K(phosphorylated 70-kDa ribosomal S6 kinase)를 활성화시킴으로써 근육 단백질의 합성을 유도하여 근육량을 증가시킨다(Bodine et el., SC Nature cell biology, 3(11), 1014, 2001). 한편, 근육 단백질의 분해에 관여하는 대표적인 인자로는 근육 특이적 E3 유비퀴틴 리가아제(muscle specific E3 ubiquitin ligase)인자인 아트로진-1(atrogin-1)과 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1)이 있다. 아트로진-1과 MuRF-1은 활동량이 감소했을 때 발현이 크게 증가되는데(Foletta VC et el., Pflugers Archiv-European Journal of Physiology, 461(3), 325-335, 2011), 이로 인해 프로테오좀-의존적 단백질 분해(proteosome-dependent proteolysis)가 촉진되어 근육량이 줄어들게 된다. 따라서 mTOR의 활성 촉진과 아트로진-1 및 MuRF-1 발현 억제는 근육 단백질의 양을 증가시켜 근육량을 증가시키게 된다. 현재 근위축의 치료 방법으로 미토콘드리아의 생성 증가, 근육 단백질 분해 억제제 및 항염제 등이 제시되고 있으나 뚜렷한 치료제가 없는 실정이다.
한편, 더덕(Codonopsis lanceolata)은 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 식물로, 한국, 중국, 일본 전역의 고산지대의 음습한 곳에 자생하거나 재배되는 다년생초본이다. 더덕은 백삼, 사삼, 행엽, 기덕, 지취 등 여러 가지 이름으로 불리며 예로부터 한방에서 강장, 해열, 진해, 거담, 해독, 배농 등의 약리작용이 탁월한 것으로 알려져 있고, 항비만, 기억력 개선, 항암, 알코올성 간질환 개선, 항염증의 활성도 갖는 것으로 보고되었다(Hossen MJ et el., Phytotherapy research, 30(3), 347-356, 2016). 더덕 뿌리에는 특유의 향을 내는 사포닌이 많이 들어 있어, 기침을 멎게 하고, 가래를 삭이는 효과가 있으며, 기관지염, 편도선염, 인후염 등에 좋은 식품으로 인정받고 있다.
이에, 본 발명자들은 근육 기능 조절 활성을 가지는 천연물질을 발굴하던 중, 더덕 추출물이 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키고, 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현에 영향을 미치는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 더덕 추출물의 근육 질환 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 피부외용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 사료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 더덕 추출물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1) 및 아트로진-1(atrogin-1)의 발현 증가를 완화시키며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR(phosphorylated mammalian target of rapamycin)의 발현을 증가시킴으로써, 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 마우스 장딴지근(gastrocnemius)의 단위체중당 근육 무게를 나타낸 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB(beta-hydroxy beta-methlybutyrate) 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물 투여군).
도 2는 마우스 대퇴사두근(quadriceps)의 단위체중당 근육 무게를 나타낸 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕 추출물 투여군).
도 3은 마우스 근섬유 크기를 나타낸 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕 추출물 투여군).
도 4는 마우스 근섬유 단면적을 정량화한 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕 추출물 투여군).
도 5는 마우스 장딴지근에서 MuRF-1 유전자의 발현을 나타낸 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕 추출물 투여군).
도 6은 마우스 장딴지근에서 아트로진-1 유전자의 발현을 나타낸 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕 추출물 투여군).
도 7은 마우스 장딴지근에서 p-mTOR, MuRF-1 또는 아트로진-1 단백질의 발현을 나타낸 도이다(Cont: 무처치 대조군, IM: 근위축 유도군, HMB370: 370 mg/kg의 HMB 투여군, CL200: 200 mg/kg의 더덕 추출물 투여군).
도 8은 근원 세포에서의 더덕 추출물의 세포독성 확인 실험 결과를 나타낸 도이다. 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. *는 unpaired t-test에 의해 * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.도 9는 C2C12 근원세포 근위축 유도 모델에서 더덕 추출물 처리에 따른 세포 근섬유의 지름 변화를 나타낸 도이다.
도 10은 도 9의 지름 변화를 수치화한 그래프이다. 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. #은 unpaired t-test에 의해 ###p < 0.001에서의 정상군과의 유의한 차이를 나타낸다. *는 unpaired t-test에 의해 ** p <0.01, *** p <0.001에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.
도 11은 C2C12 근원세포 근위축 유도 모델에서 아트로진-1 유전자의 발현을 나타낸 도이다(정상군: 무처치 대조군, 유도군: 근위축 유도군, 2.5: 2.5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 5: 5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 10: 10 μg/mL의 더덕 추출물 투여군). 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. #은 unpaired t-test에 의해 ###p < 0.001에서의 정상군과의 유의한 차이를 나타낸다. *는 unpaired t-test에 의해 * p <0.05, ** p <0.01에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.
도 12는 C2C12 근원세포 근위축 유도 모델에서 MuRF-1 유전자의 발현을 나타낸 도이다(정상군: 무처치 대조군, 유도군: 근위축 유도군, 2.5: 2.5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 5: 5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 10: 10 μg/mL의 더덕 추출물 투여군). 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. #은 unpaired t-test에 의해 ###p < 0.001에서의 정상군과의 유의한 차이를 나타낸다. *는 unpaired t-test에 의해 ** p <0.01에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.
도 13은 C2C12 근원세포 근위축 유도 모델에서 MuRF-1 또는 아트로진-1 단백질의 발현을 나타낸 도이다(N: 정상군, C: 근위축 유도군, 2.5: 2.5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 5: 5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 10: 10 μg/mL의 더덕 추출물 투여군)
도 14는 도 11의 결과를 반영한 상대적 발현을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. #은 unpaired t-test에 의해 ##p < 0.01, ###p < 0.001에서의 정상군과의 유의한 차이를 나타낸다. *는 unpaired t-test에 의해 * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.
도 15는 C2C12 근원세포 근위축 유도 모델에서 p-mTOR 또는 mTOR 단백질의 발현을 나타낸 도이다(N: 정상군, C: 근위축 유도군, 2.5: 2.5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 5: 5 μg/mL의 더덕 추출물 투여군, 10: 10 μg/mL의 더덕 추출물 투여군)
도 16은 도 15의 결과를 반영한 상대적 발현을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. *는 unpaired t-test에 의해 ** p <0.01, *** p <0.001에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.
도 17은 p-mTOR와 mTOR의 단백질 발현량 비율을 나타낸 그래프이다. 세번의 독립적인 실험으로부터 얻은 데이터는 평균 ± SD로 표현되었다. *는 unpaired t-test에 의해 * p <0.05, ** p <0.01에서의 대조군과의 유의한 차이를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 더덕은 생 더덕, 건조 더덕 등을 모두 포함할 수 있고, 구체적으로 건조 더덕일수 있다. 또한, 상기 더덕은 통 더덕, 세절 더덕, 더덕의 분말 등을 모두 포함할 수 있고, 구체적으로 더덕의 분말일 수 있다. 또한, 상기 건조 더덕은 풍건(air drying), 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 동결건조 또는 열풍건조에 의해 건조될 수 있고, 구체적으로 풍건에 의해 건조될 수 있다.
상기 더덕 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 더덕에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과된 여과물을 감압농축한 후 건조하는 단계.
상기 제조방법에서, 더덕은 더덕의 잎, 줄기, 뿌리, 열매 등 모든 부위를 포함할 수 있고, 구체적으로, 뿌리일 수 있다.
또한, 상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 알코올은 C1 내지 C2의 저급 알코올 수 있고, 구체적으로, 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 추출용매는 물일 수 있다. 상기 추출용매는 추출에 사용되는 더덕의 중량 1 g당 1 내지 15 mL의 양으로 첨가될 수 있고, 구체적으로 10 mL의 양으로 첨가될 수 있다. 추출온도는 30 내지 100℃일 수 있고, 구체적으로 60-85℃일 수 있다.
상기 추출방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 시간은 1 내지 10시간, 또는 3 내지 6시간일 수 있고, 구체적으로 4-5시간일 수 있다. 상기 추출은 1 내지 5회일 수 있고, 구체적으로 3회일 수 있다.
한편, 상기 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있고, 구체적으로 동결건조일 수 있다.
상기 근육 질환은 근육 소모 또는 퇴화로 인한 질환을 의미하고, 근육감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증(myotonic dystrophy), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 근무력증(myasthenia) 및 악액질(cachexia)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 근육 소모는 근육량의 점진적 손실과, 골격근과 같은 수의근 또는 심장근과 같은 불수의근의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등에 의해 발생한다.
본 발명의 약학적 조성물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키는 것일 수 있고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자인 MuRF-1 또는 아트로진-1의 유전자 또는 단백질의 발현 증가를 완화시키는 것일 수 있으며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자인 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 더덕 추출물을 제조한 뒤, 근위축을 유발한 마우스에 상기 더덕 추출물을 경구 투여하면 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소가 완화되고(도 1 내지 4 참조), 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 또는 아트로진-1의 유전자 또는 단백질의 발현 증가가 완화되며(도 5 내지 7 참조), 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR 단백질의 발현이 증가함을(도 7 참조) 확인하였다. 또한, 근원세포 근위축 유도 모델에서, 상기 더덕 추출물을 처리하였을 ??, 근섬유세포의 크기가 증가(도 9 내지 10 참조)하고, 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함(도 11 내지 17 참조)을 확인하였다. 따라서, 상기 더덕 추출물은 근육 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 더덕 추출물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크 등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 500 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 300 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 내지 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 더덕 또는 더덕 추출물은 상기 서술한 바와 같다. 본 발명의 일 실시예에서, 추출물은 더덕의 뿌리 추출물일 수 있고, 물을 용매로 하여 추출될 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키는 것일 수 있고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자인 MuRF-1 또는 아트로진-1의 유전자 또는 단백질의 발현 증가를 완화시키는 것일 수 있으며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자인 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 더덕 추출물을 제조한 뒤, 근위축을 유발한 마우스에 상기 더덕 추출물을 경구 투여하면 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소가 완화되고(도 1 내지 4 참조), 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함을(도 5 내지 7 참조) 확인하였다. 또한, 근원세포 근위축 유도 모델에서, 상기 더덕 추출물을 처리하였을 ??, 근섬유세포의 크기가 증가(도 9 내지 10 참조)하고, 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함(도 11 내지 17 참조)을 확인하였다. 따라서, 상기 더덕 추출물은 근육 질환의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조한 식품으로, 인체의 건강을 유지하는데 도움을 주는 식품을 의미하나 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 모두 포함하는 의미로 사용한다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명의 더덕 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 함량은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없다면 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 더덕 또는 더덕 추출물은 상기 서술한 바와 같다. 본 발명의 일 실시예에서, 추출물은 더덕의 뿌리 추출물일 수 있고, 물을 용매로 하여 추출될 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키는 것일 수 있고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자인 MuRF-1 또는 아트로진-1의 유전자 또는 단백질의 발현 증가를 완화시키는 것일 수 있으며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자인 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 더덕 추출물을 제조한 뒤, 근위축을 유발한 마우스에 상기 더덕 추출물을 경구 투여하면 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소가 완화되고(도 1 내지 4 참조), 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함을(도 5 내지 7 참조) 확인하였다. 또한, 근원세포 근위축 유도 모델에서, 상기 더덕 추출물을 처리하였을 ??, 근섬유세포의 크기가 증가(도 9 내지 10 참조)하고, 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함(도 11 내지 17 참조)을 확인하였다. 따라서, 상기 더덕 추출물은 근육 질환의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 더덕 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 크림, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록시드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체로서 용매, 용매화제, 유탁화제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르설페이드, 알칼아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린 유도체, 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도, 보조제로서 항산화제, 안정화제, 용해화제, 보습제, 안료, 향료, 자외선 차단제, 발색제, 계면활성제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 물질이라면 모두 사용가능하다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 피부외용제를 제공한다.
본 발명에 따른 더덕 또는 더덕 추출물은 상기 서술한 바와 같다. 본 발명의 일 실시예에서, 추출물은 더덕의 뿌리 추출물일 수 있고, 물을 용매로 하여 추출될 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 피부외용제는 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키는 것일 수 있고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자인 MuRF-1 또는 아트로진-1의 유전자 또는 단백질의 발현 증가를 완화시키는 것일 수 있으며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자인 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 더덕 추출물을 제조한 뒤, 근위축을 유발한 마우스에 상기 더덕 추출물을 경구 투여하면 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소가 완화되고(도 1 내지 4 참조), 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함을(도 5 내지 7 참조) 확인하였다. 또한, 근원세포 근위축 유도 모델에서, 상기 더덕 추출물을 처리하였을 ??, 근섬유세포의 크기가 증가(도 9 내지 10 참조)하고, 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함(도 11 내지 17 참조)을 확인하였다. 따라서, 상기 더덕 추출물은 근육 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 피부외용제는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제는 방부제, 안정화제, 수화제, 유화 촉진제 및 완충제 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 부형제는 유당, 덱스트린, 전분, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 사카로스, 미세결정 셀룰로스, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 피부외용제는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 적절히 제조될 수 있다. 상기 피부외용제는 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 및 에어로졸의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 사료용 조성물을 제공한다.
본 명세서의 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다. 상기 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분 함량, 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 상기 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하나, 이에 한정하지 않는다.
본 명세서의 "사료 첨가제"란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 더덕 또는 더덕 추출물은 상기 서술한 바와 같다. 본 발명의 일 실시예에서, 추출물은 더덕의 뿌리 추출물일 수 있고, 물을 용매로 하여 추출될 수 있다.
상기 근육 질환은 근육감소증, 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근육 퇴화, 근경직증, 근위축성 축삭경화증, 근무력증 및 악액질 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제 또는 사료용 조성물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키는 것일 수 있고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자인 MuRF-1 또는 아트로진-1의 유전자 또는 단백질의 발현 증가를 완화시키는 것일 수 있으며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자인 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 더덕 추출물을 제조한 뒤, 근위축을 유발한 마우스에 상기 더덕 추출물을 경구 투여하면 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소가 완화되고(도 1 내지 4 참조), 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함을(도 5 내지 7 참조) 확인하였다. 또한, 근원세포 근위축 유도 모델에서, 상기 더덕 추출물을 처리하였을 ??, 근섬유세포의 크기가 증가(도 9 내지 10 참조)하고, 근육 단백질의 합성 또는 분해에 관여하는 인자의 발현이 변함(도 11 내지 17 참조)을 확인하였다. 따라서, 상기 더덕 추출물은 근육 질환의 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 근육 질환의 예방 또는 개선 효능을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 근육 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 근육 질환을 개선시킬 수 있다.
또한, 상기 사료 첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 상기 사료 첨가제에 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있고, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
본 발명의 사료용 조성물은 근육 질환의 예방 또는 개선 효능을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 근육 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 근육 질환을 개선시킬 수 있다.
또한, 상기 사료용 조성물은 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 더덕 추출물을 첨가하여 제조 가능하다.
상기 사료용 조성물은 근육 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소,양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류, 또는 어류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 더덕 추출물의 제조 1
품질이 양호하고 변질되지 않은 더덕 뿌리를 구입하여 더덕 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 구입한 더덕을 4일 동안 풍건한 후 분쇄하여 그 건조분말을 물로 순환세척 및 탈수시키고, 탈수시킨 더덕 분말 100g에 1000mL의 증류수를 넣은 뒤 85℃에서 4시간 동안 3회 추출한 추출액을 상온으로 냉각한 후 여과 및 농축하여 더덕 추출물을 제조하였다. 제조된 추출물은 동결건조시켜 파우더로 만들어 준비하였다.
실시예 2. 더덕 추출물의 제조 2
품질이 양호하고 변질되지 않은 더덕 뿌리(경기도 양평 용문산 조남상 명품 산더덕)를 구입하여 더덕 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 구입한 더덕을 4일 동안 풍건한 후 분쇄하여 그 건조분말을 물로 순환세척 및 탈수시키고, 탈수시킨 더덕 분말 100g에 1000mL의 증류수를 넣은 뒤 60℃에서 5시간 동안 진탕하고, 3회 추출한 추출액을 상온으로 냉각한 후 여과 및 농축하여 더덕 추출물을 제조하였다. 제조된 추출물은 동결건조시켜 파우더로 만들어 준비하였다.
실험예 1. 더덕 추출물 투여에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 변화 확인
더덕 추출물이 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 개선시키는지를 동물실험으로 확인하였다.
1-1. 근육 무게 감소의 완화 확인
더덕 추출물이 근위축에 따른 근육 무게 감소를 완화시키는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 5주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 7일 동안 동물실험실 환경에 적응시킨 뒤 실험 조건에 따라 5가지의 군으로 나누었다. 구체적으로, 실험군은 무처치 대조군(정상군, Cont), 근위축 유도군(유도군, IM), 근위축 유도 및 370 mg/kg의 베타-하이드록시 베타-메틸부틸레이트(beta-hydroxy beta-methlybutyrate, HMB)를 투여한 양성 대조군(HMB 투여군, HMB 370), 및 근위축 유도 및 200 mg/kg의 더덕 추출물(실시예 1)을 투여한 실험군(더덕 추출물 투여군, CL 200)으로 구분하였다. 근위축은 'Disease models & mechanisms, 8(9), 1059-1069, 2015'에 따라 1.5 mL 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube), 클립 및 벨크로 테이프로 제작한 고정 기구를 마우스 한쪽 뒷다리에 적용하는 다리고정(immobilization)을 이용해 유도하였다. HMB 및 더덕 추출물은 0.5%의 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)에 용해하여 다리 고정 적용 당일부터 14일 동안 경구로 1일 1회 투여하였다. 14일 후 뒷다리의 장딴지근(gastrocnemius)과 대퇴사두근(quadriceps)을 적출하여 무게를 측정한 뒤 체중을 기준으로 표준화시켰다.
그 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 유도군에서 근위축이 유발되어 정상군에 비해 장딴지근은 약 40%, 대퇴사두근은 약 33%만큼 중량이 감소하였고, HMB 투여군에서 정상군에 비해 장딴지근은 약 24%, 대퇴사두근은 약 17%만큼 중량이 감소하여 HMB는 각각 약 16%씩의 근위축 보호능을 나타냈으며, 더덕 추출물 투여군에서 정상군에 비해 장딴지근은 약 27%, 대퇴사두근은 약 18%만큼 중량이 감소하여 더덕 추출물은 각각 약 13% 및 15%의 근위축 보호능을 나타냈다. 이로부터, 더덕 추출물은 근위축에 따른 근육 무게 감소를 완화시키고, 양성 대조군인 HMB보다 단위용량당 근위축 보호 효과가 우수함을 알 수 있었다.
1-2. 근섬유 단면적 감소의 완화 확인
더덕 추출물이 근위축에 따른 근섬유 단면적 감소를 완화시키는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 구체적으로, 실험예 1-2에서 적출한 장딴지근 조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 뒤, 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하였고, 이미지 J 소프트웨어(image J softwar)를 이용해 근섬유 단면적을 정량화하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 유도군에서 근위축이 유발되어 정상군에 비해 장딴지근의 근섬유 크기가 매우 감소했고, HMB 투여군 및 더덕 추출물 투여군에서 이러한 근섬유 크기의 감소가 완화되었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 근섬유 단면적은 정상군에 비해 유도군에서 약 50%, HMB 투여군에서 약 33%, 더덕 추출물 투여군에서 약 35% 감소하여 HMB 및 더덕 추출물은 각각 약 17% 및 15%의 근위축 보호능을 나타냈다. 이로부터, 더덕 추출물은 근위축에 따른 근섬유 단면적 감소를 완화시키며, 양성 대조군인 HMB보다 단위용량당 근위축 보호 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 2. 더덕 추출물 투여에 따른 근육 단백질의 분해 또는 합성 인자 발현의 변화 확인
더덕 추출물이 근위축에 따른 근육 단백질의 분해 또는 합성에 관여하는 인자의 발현을 변화시키는지를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
2-1. 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1) 및 아트로진-1(atrogin-1) 유전자 발현 증가의 완화 확인
더덕 추출물이 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 유전자발현 증가를 완화시키는지를 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실험예 1-2에서 적출한 장딴지근 조직으로부터 RNA RED(인트론, 한국)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 mRNA를 추출하고, cDNA 합성 키트(TaKaRa, 일본)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 cDNA를 합성한 뒤, 하기 표 1의 프라이머와 ABI Step One Plus TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems, 미국)을 이용해 통상의 공지된 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하였다.
프라이머 이름 프라이머 서열(5'→3') 서열번호
MuRF-1 forward AAG ACT GAG CTG AGT AAC TG 1
MuRF-1 reverse TAG AGG GTG TCA AAC TTC TG 2
Atrogin-1 forward AGA AAG AAA GAC ATT CAG AAC A 3
Atrogin-1 reverse GCT CCT TCG TAC TTC CTT 4
그 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, MuRF-1 유전자는 정상군에 비해 유도군에서 약 3배, HMB 투여군에서 약 1.3배, 더덕 추출물 투여군에서 약 0.8배만큼 발현되었고, 아트로진-1 유전자는 정상군에 비해 유도군에서 약 3배, HMB 투여군에서 약 1.7배, 더덕 추출물 투여군에서 약 1.1배만큼 발현되었다. 이로부터, 더덕 추출물은 근위축에 따른 MuRF-1 및 아트로진-1 유전자의 발현 증가를 완화시키며, 양성 대조군인 HMB보다 근위축 보호 효과가 더 우수함을 알 수 있었다.
2-2. 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 단백질 발현 증가의 완화, 및 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR(phosphorylated mammalian target of rapamycin) 단백질 발현의 증가 확인
더덕 추출물이 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 단백질의 발현 증가를 완화시키고, 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는지를 웨스턴블롯(Western blot)을 이용해 확인하였다.
구체적으로, 실험예 1-2에서 적출한 장딴지근 조직으로부터, cOmpleteTM 프로테아제 인히비터 칵테일 타블렛(cOmpleteTM protease inhibitor cocktail tablets, Roche Diagnostics, 미국) 4개, 수크로오스(sucrose) 17.115 g, 1 M의 트리스 버퍼(tris buffer, Trizma base, pH 7.4) 2 mL, 0.5 M의 EDTA(pH 8.0) 0.2 mL, 및 증류수(distilled water, DW)를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)을 이용해 제조사 프로토콜에 따라 단백질을 추출하였다. PierceTM BCA 단백질 분석 키트(PierceTM BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 단백질 농도를 확인해 일정 농도로 조정한 뒤, 동일한 농도의 단백질을 7.5%의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)-polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 일렉트로블롯팅(electroblotting)을 통해 폴리비닐이딘 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 이동(transfer)시켰다. 상기 막을 5%의 탈지유(skim milk)를 이용해 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)한 후, 4℃에서 MuRF-1, 아트로진-1, 또는 p-mTOR 단백질의 1차 항체와 밤새 인큐베이션하였고, 다음날 2차 항체와 2시간 동안 인큐베이션한 후, LAS3000 발광 이미지 분석기(LAS3000 luminescent image analyzer, 후지 필름사, 일본)로 현상하였다. 항체로는 항-MuRF-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-아트로진-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국), 항-p-mTOR 항체(Cell Signaling Technology, 미국), 및 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2 차항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 사용하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, p-mTOR 단백질은 정상군에 비해 유도군에서 발현의 차이가 없었으나, HMB 투여군 및 더덕 추출물 투여군에서 발현이 증가하였고, MuRF-1 및 아트로진-1 단백질은 정상군에 비해 유도군에서 발현이 크게 증가하였으나, HMB 투여군 및 더덕 추출물 투여군에서 발현이 정상군 수준으로 완화되었다. 이로부터, 더덕 추출물은 근위축에 따른 MuRF-1 및 아트로진-1 단백질의 발현 증가를 완화시키고, p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키며, 양성 대조군인 HMB보다 근위축 보호 효과가 더 우수함을 알 수 있었다.
실험예 3. 더덕 추출물의 근원 세포 세포독성 확인
더덕 추출물의 근원세포에서의 세포독성을 확인하기 위하여 마우스 유래 근원 세포 (Myoblast)인 C2C12 세포주를 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구입하여 사용하여 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실험군은 정상군, 유도군(dexamethasone(Sigma Aldrich Co.) 처리), 실시예 2의 더덕 추출물 처리군(5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 μg/mL) 총 7개 농도로 설정하여 C2C12 근원세포의 세포 독성을 확인하였다. 세포독성은 Cell counting kit-8 (Dojindo Laboratories, Japan)를 사용하여 측정하였다. 실험에서 얻어진 결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군에 대한 통계학적 유의성 검증은 SPSS를 이용하여 one-way ANOVA를 시행하였고, 실험군 간의 차이는 Bonferroni correction으로 p < 0.05의 수준에서 유의성을 검증하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 10μg/mL까지는 독성이 없는 것으로 확인되었다. 이에, 이후 세포 실험에서는 2.5, 5, 10μg/ml 농도로 효능 및 작용 기전 연구를 수행하였다.
실험예 4. 더덕 추출물 투여에 따른 근위축 개선 효과 확인
더덕 추출물의 근위축 개선 효과를 확인하기 위하여 마우스 유래 근원 세포 (Myoblast)인 C2C12로 근위축 모델을 만들어, 근위축 개선 효과를 확인하였다.
먼저, C2C12 세포(ATCC No. CRL-1772??)를 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin 조성을 포함하는 DMEM 배지 하에 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하고 2% horse serum, 1% penicillin/streptomycin 조성을 포함하는 DMEM 배지 하에 근섬유(myotube)로 분화시켰다. 상기 분화된 근섬유세포를 해당 세포를 6 well plate에 well 당 105 개씩 seeding한 후에 80% 정도 세포가 성장하면, 2% horse serum이 포함된 분화 배지로 교환하여 9일간 배양하였으며, 매 2일마다 분화배지로 교환하였다. 분화 9일차에 dexamethasone 50μM을 48 시간 동안 처리하여 근위축 모델을 만들었다. 더덕 추출물을 농도별로 dexamethasone과 동시에 48시간동안 처리하여 근위축 억제 효과를 확인하였다. 광학현미경을 사용하여 30배율로 사진 촬영하여 도 9에 나타내었으며, 사진으로부터 무작위로 8개의 근섬유를 선택하여 Image J program을 사용하여 그 길이를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 실험에서 얻어진 결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 각 실험군에 대한 통계학적 유의성 검증은 SPSS를 이용하여 one-way ANOVA를 시행하였고, 실험군 간의 차이는 Bonferroni correction으로 p < 0.05의 수준에서 유의성을 검증하였다. 하기 표 2에 실험군을 정리하여 나타내었다.
번호 실험군 dexamethasone 실시예 2의 더덕 추출물
1 정상군 - -
2 유도군 50μM -
3 더덕
추출물 처리군		 50μM 2.5 μg/mL
4 50μM 5 μg/mL
5 50μM 10 μg/mL
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 더덕 추출물의 처리 농도 의존적으로 근섬유의 길이가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 근섬유의 지름 길이를 정량한 결과, 정상군에 비해 유도군에서 58% 감소하고, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 유도군 대비 약 34%, 62%, 79%로 줄어든 근섬유의 길이가 증가한 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명의 더덕 추출물은 근위축을 개선하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다.
실험예 5. 더덕 추출물 투여에 따른 근원세포 근위축 유도 모델에서 근육 단백질 관련 인자의 발현 변화 확인
더덕 추출물이 근원세포 근위축 유도 모델에서 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 단백질의 발현 증가를 완화시키고, 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는지를 웨스턴블롯(Western blot)을 이용해 확인하였다.
5-1. 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1) 및 아트로진-1(atrogin-1) 유전자 발현 증가의 완화 확인
더덕 추출물이 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 유전자발현 증가를 완화시키는지를 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 이용해 확인하였다. 구체적으로, 실험예 4의 세포로부터 mRNA를 추출하고, 이를 분석하였으며, 구체적인 실험방법은 실험예 2-1과 동일하게 수행하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 아트로진-1 유전자는 정상군에 비해 유도군에서 약 3배 증가하였고, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 발현이 약 33.3, 37.0, 55.2% 감소되었고, 도 12에 나타낸 바와 같이, MuRF-1 유전자는 정상군에 비해 유도군에서 약 6배 증가하였으나, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 발현이 40.2, 44.3, 50.3% 감소되었다. 이로부터, 더덕 추출물은 근위축에 따른 MuRF-1 및 아트로진-1 유전자의 발현 증가를 완화시키며, 근육 분해 억제 효과가 우수한 것을 알 수 있다.
5-2. 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 단백질 발현 증가의 완화, 및 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR(phosphorylated mammalian target of rapamycin) 단백질 발현의 증가 확인
더덕 추출물이 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 및 아트로진-1 단백질의 발현 증가를 완화시키고, 근육 단백질의 합성에 관여하는 p-mTOR 단백질의 발현을 증가시키는지를 웨스턴블롯(Western blot)을 이용해 확인하였다. 구체적으로, 실험예 4의 세포로부터 단백질을 추출하고, 이를 분석하였으며, 구체적인 실험방법은 실험예 2-2과 동일하게 수행하였다. 아울러, mTOR가 p-mTOR로 인산화되어 활성화 됨으로써 근육 합성에 관여하기 때문에 p-mTOR와 mTOR의 비율을 측정하였다.
그 결과, 도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, 아트로진-1의 단백질 발현량이 정상군에 비해 유도군에서 2배 가량 증가하였고, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 35.8, 45.8, 50.3% 감소되었고, MuRF-1의 단백질 발현량은 정상군에 비해 유도군에서 2배 가량 증가하였고, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 28.0, 41.7, 57.4% 감소되었다. 이로부터, 본 발명의 더덕 추출물은 근육 분해 억제 효과가 우수한 것을 알 수 있다.
또한, 도 15 및 16에 나타낸 바와같이, p-mTOR를 정량한 결과 정상군과 유도군이 유사한 발현량을 나타내었으며, 비슷했고, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 유도군 대비 50.0, 66.9, 139.7%로 발현이 증가된 것을 확인하였다. mTOR를 정량한 결과 정상군, 유도군, 더덕 추출물 처리군에서 유사한 발현량을 나타내었다. 또한, 도 17에 나타낸 바와 같이, p-mTOR와 mTOR의 비율을 정량한 결과, 정상군과 유도군이 비슷한 값을 나타내었고, 더덕 추출물을 각각 2.5, 5, 10 μg/ml로 처리한 군에서 41.1, 67.7, 126.9%가 증가된 것을 확인하였다. 이로부터, 본 발명의 더덕 추출물은 mTOR의 인산화를 통한 p-mTOR(활성형)의 증가로 근육 합성을 촉진하는 효과가 우수한 것을 알 수 있다.
<110> JUNG, Woo Jae <120> Pharmaceutical composition for prevention or treatment of muscular disease comprising Codonopsis lanceolata extract as an active ingredient <130> 2019P-09-020 <150> KR 10-2018-0096863 <151> 2018-08-20 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF-1 forward <400> 1 aagactgagc tgagtaactg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuRF-1 reverse <400> 2 tagagggtgt caaacttctg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 forward <400> 3 agaaagaaag acattcagaa ca 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atrogin-1 reverse <400> 4 gctccttcgt acttcctt 18

Claims (10)

  1. 더덕(Codonopsis lanceolata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy) 및 근육 퇴화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 추출물은 더덕의 잎, 줄기, 뿌리, 또는 열매 추출물인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이의 혼합물로 추출되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 약학적 조성물은 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1) 또는 아트로진-1(atrogin-1)의 유전자 또는 단백질의 발현 증가를 완화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 약학적 조성물은 p-mTOR(phosphorylated mammalian target of rapamycin) 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육감소증, 근위축증, 근이영양증 및 근육 퇴화의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육감소증, 근위축증, 근이영양증 및 근육 퇴화의 예방 또는 개선용 사료 첨가제 또는 사료용 조성물.
KR1020190101957A 2018-08-20 2019-08-20 더덕 추출물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR102277061B1 (ko)

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