KR102276122B1

KR102276122B1 - 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR102276122B1
Application number: KR1020190137317A
Authority: KR
Inventors: 박용일; 박기은; 송재경; 람미챤 라마칸타
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2021-07-12
Also published as: KR20210051709A; WO2021085890A1

Abstract

본 발명은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 유효 성분으로 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인슐린 저항성이 유도된 근육세포에서 포도당 운반체 막 단백질인 GLUT-4 인자의 발현을 증가시켜 포도당 흡수를 촉진시키고, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)가 항당뇨 과정에 중요한 전사 인자 (AKT, IRS-1) 들을 효과적으로 조절하고, 현재 2형 당뇨 치료 약물인 아카보즈 (Acarbose) 보다 알파-글루코시다제 (α-Glucosidase)를 저해하는 활성이 더 우수하여 항당뇨 활성이 우수함을 밝혔고, 나아가 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)와 퀘르세틴 (Quercetin)의 복합물이 퀘르세틴-3-O-람노시드를 단독으로 처리했을 때 보다 인슐린 저항성이 유도된 근육세포에서 포도당 흡수율을 더욱 증가시키는 상승효과를 나타내어 항당뇨 효능이 증가한다는 사실을 밝히고, 이에 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside) 또는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)와 퀘르세틴 (Quercetin)의 복합물을 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물을 발명한 것이다.

Description

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물 {Quercetin-3-O-rhamnoside as a potential pharmaceutical component for the prevention and treatment of Type 2 diabetes}

당뇨병은 현재 전세계적으로 사망률의 주요 원인 질병으로 부상하는 대사성질환의 하나이다. 국제당뇨병연맹 (IDF)의 보고서에 따르면 2017년 약 4억2500만 명 (20-79세)이 당뇨병으로 겪고 있으며 2045년에는 6억3500만 명으로 증가할 것으로 예상된다 (IDF, 2017년). 또한 UN의 보고에 따르면, 전 세계적으로 당뇨병으로 인한 사망이 매년 증가하고 있다. 보고에 따르면 사망자 수가 국내에서만 2010년 11,575명에서 2016년 11986명으로 증가했다고 밝히고 있다 (Statistics Korea, 2018-12-20). 이처럼 문제가 되고 있는 당뇨병 환자 증가의 주된 이유는 어린이와 청소년들과 같은 젊은 층의 발병율 증가이다. 선천적으로 인슐린 분비가 되지 않는 제 1형 당뇨와 달리 후천적으로 발병하는 제 2형 당뇨의 경우 환경적인 요인과 유전적인 요인으로 발병하게 되는데 이 중 환경적인 요인은 생활습관을 의미한다. 서구화된 식단, 식생활의 증가를 비롯하여 적은 신체활동량 즉 운동부족 등이 주요 환경적인 요인으로 알려져있다. 따라서 제 2형 당뇨병은 생활양식의 변화 (조절식, 규칙적인 운동 등)에 의해 잘 관리되거나 억제 또는 지연될 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 생활습관 변경 후에도 정상적인 포도당 수준을 유지하지 못할 경우, 치료의 유일한 선택사항으로 의약품을 사용하고 있다 (Tabish, S.A, International journal of health sciences , 2007).

앞서 설명하였듯이 당뇨병은 인체가 충분한 인슐린을 생성하지 못하는 인슐린 결핍, 제 1형 당뇨와 인슐린이 제대로 기능하지 못하는 인슐린 저항성, 제 2형 당뇨로 나뉘는 대사 장애의 일종이다. 제 2형 당뇨의 발병은 여러 가지 기작으로 인해 발생한다. 먼저 췌장의 베타 세포 (β-Cell)의 감소, 또는 기능 저하로 인한 인슐린의 생성 감소, 간 또는 지방조직에서의 지속적인 염증 반응으로 인한 인슐린 저항성(Insulin-Resistance)과 과도한 지방산 대사로 인한 당 대사 장애, 마지막으로 근육조직에서의 인슐린 저항성(Insulin-Resistance)과 인슐린 부족으로 인해 포도당 흡수가 제한되면서 발병한다. 이러한 발병 기작 중에 췌장의 베타세포를 비롯한 췌장의 문제가 아닌 간, 지방 조직, 그리고 근육 조직에서 나타나는 인슐린 저항성 (Insulin-Resistance)을 세포가 띄게 되면 세포가 인슐린에 의해 포도당 (Glucose) 을 세포가 흡수하여야 하는데 그러지 못 하게 되어 혈중에 포도당 (Glucose)가 과도하게 많아지고 이로 인해 다른 합병증 또한 유발하게 된다.

이와 같은 당뇨병을 치료하기 위해 현재까지 개발된 주요 약물들은 인슐린 저항성을 완화하거나 췌장으로부터 더 많은 인슐린을 향상시키는 것을 목표로 하고 있다. 대표적으로 메트포르민(Metformin)이 있으며 인슐린 의존성 (Insulin dependent) 또는 인슐린 독립 포도당 섭취 (Insulin independent glucose uptake) 경로에 관여하는 다양한 단백질을 통해 다른 근육 세포에서 포도당 이동을 가속화하고 조직을 적응시킨다. 이와 유사하게 알파-글루코시다제 (α-gltcosidase) 효소 또한 항당뇨제로 알려져 있으며 대표적으로 아카보즈 (Acarbose)가 알려져 있다. 또한 다양한 유형의 DPP-4 억제제는 항당뇨 약물로 이용되고 있으며 대표적으로 시타글립틴 (Sitagliptin)이 있다 (Miyazaki 그 외, 2012). 그러나 현재까지 나온 치료제들은 체중 증가, 흉부 기능 상실, 메스꺼움 등과 같은 심각한 부작용을 가지고 있다. 이와 같은 여러 부작용들로 인해 최근에 약용식물 (medicinal herb)의 치료효과에 대한 관심이 높아지면서 천연물에 대한 수요가 증대되고 있으며 최근에는 약용식물을 이용한 항 당뇨제의 연구에 대한 관심이 집중되어 왔다. 당뇨치료제의 다양한 부작용으로 인해 최근에는 인체에 최소한의 부작용을 가지는 식물로부터 분리한 화합물, 미생물 유래 천연물질, 플라보노이드 등 천연물을 이용한 당뇨치료제 개발을 위한 연구가 이루어지고 있다. 그 중 항산화, 항암, 면역 등 다양한 방면에 플라보노이드 계열의 퀘르세틴 (Quercetin)은 효능이 있다고 알려져 있다. 하지만 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 경우 퀘르세틴 (Quercetin)과 마찬가지로 항산화를 비롯하여 다양한 방면에 연구 되고 알려졌지만 항당뇨 효능에 대해서는 아직 잘 알려진 바가 없다. 본 발명은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 유효 성분으로 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인슐린 저항성이 유도된 근육세포에서 포도당 운반체 막 단백질인 GLUT-4 인자의 발현을 증가시켜 포도당 흡수를 촉진시키고, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)가 항당뇨 과정에 중요한 전사 인자 (AKT, IRS-1) 들을 효과적으로 조절하고, 현재 2형 당뇨 치료 약물인 아카보즈 (Acarbose) 보다 알파-글루코시다제 (α-Glucosidase)를 저해하는 활성이 더 우수하여 항당뇨 활성이 우수함을 밝혔고, 나아가 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)와 퀘르세틴 (Quercetin)의 복합물이 퀘르세틴-3-O-람노시드를 단독으로 처리했을 때 보다 인슐린 저항성이 유도된 근육세포에서 포도당 흡수율을 더욱 증가시키는 상승효과를 나타내어 항당뇨 효능이 증가한다는 사실을 밝히고, 이에 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside) 또는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)와 퀘르세틴 (Quercetin)의 복합물을 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물을 발명한 것이다.

본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 천연 플라보노이드 배당체인 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 항당뇨 활성을 규명하여 본 물질을 포함하는 신규의 당뇨 예방 및 치료용 조성물과 제조방법 및 이를 이용한 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 알파-글리코시다제 억제 (α-Glycosidase inhibition) 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 GLUT, AKT 및 IRS-1 (Insulin receptor substrate)으로 이루어진 군 중 1종 이상의 단백질 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 10 내지 30 μM의 농도로 포함할 수 있다.

또한 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 2형 당뇨 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 몰비는 1:10 (mole : mole) 내지 10:1 (mole : mole)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 1 내지 100 μM의 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하는 당뇨 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 건강기능성 식품 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내재 30 μM 의 농도로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 종래 합성 약제 조성물과 달리 유발하는 부작용들이 적으며, 근육세포의 인슐린 저항에 의한 포도당 흡수 저해를 개선시켜, 항당뇨 활성을 가지는 Quercetin-3-O-rhamnoside 또는 Quercetin과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 각각 10 μM의 농도로 함유한 1:1 (mole : mole) 복합물을 포함하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 항당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

도 1은 Quercetin 및 Quercetin-3-O-rhamnoside의 화학적 구조이다.
도 2는 실시예 1에서 확인한 Quercetin-3-O-rhamnoside의 처리에 따른 α-Glucosidase 저해 활성을 현재 2형 당뇨 치료 약물인 아카보즈 (Acarbose)를 양성대조군으로 하여 알파-글루코시다제 (α-Glucosidase)를 저해하는 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 실시예 2에서 확인한 Quercetin-3-O-rhamnoside의 Hep G2 세포 내 생존력 측정 결과이다.
도 4는 실시예 3에서 확인한 Quercetin-3-O-rhamnoside 처리에 의한 Hep G2 세포에서의 DPP-4 억제 활성 측정 결과이다.
도 5는 실시예 2에서 확인한 Quercetin-3-O-rhamnoside의 근육세포 내 생존력 측정 결과이다.
도 6은 실시예 5에서 확인 한 Quercetin-3-O-rhamnoside의 근육세포 내 포도당 흡수율 측정 결과이다.
도 7은 실시예 5에서 확인한 근육세포에서의 IRS-1, AKT, GLUT-4 단백질 발현량 측정 결과이다.
도 8은 실시예 6에서 확인한 Quercetin-3-O-rhamnoside와 Quercetin 두 물질의 1:1 (mole : mole) 복합물 처리에 의한 인슐린 저항성 근육세포에서의 포도당 흡수 상승효과에 대한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 종래 합성 약제는 체중 증가, 흉부 기능 상실, 메스꺼움 등 여러 부작용이 나타났으며, 매해마다 세계적으로 증가하는 당뇨로 인한 사망자 수에 따라 이에 대한 새로운 대안이 필요한 실정이었다.

이에 본 발명은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였으며 이를 통해 종래 약학적 조성물에서 나타났던 부작용인 체중 증가, 흉부 기능 상실, 메스꺼움 등 여러 부작용이 없으면서, 종래 생약제 추출물에서는 확인이 힘들었던 근육세포의 인슐린 저항성을 저해하고 근육세포 내 포도당의 흡수율을 상승시키는 효과가 있는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 효과가 있다.

상기 Quercetin-3-O-rhamnoside는 플라보노이드 (flavonoid) 계열의 물질로서 항산화작용뿐만 아니라 항바이러스 및 항염증 등의 활성이 있다고 알려져 있다. 그러나 본 발명에서는 Quercetin-3-O-rhamnoside의 제 2형 당뇨에 대한 예방 및 치료 효과를 확인하였다. 본 발명의 Quercetin-3-O-rhamnoside는 통상적으로 제조 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 Quercetin으로부터 유래한 것일 수 있다. Quercetin에서 유래된 Quercetin-3-O-rhamnoside의 신규한 생리활성인 당뇨 예방 및/또는 치료 활성을 발견하였다. 구체적으로 실시예 1에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 퀘르세틴 (Quercetin)에 당 유도체 중 하나인 Rhamnoside를 붙여 생성되었다.

또한, 실시예 2에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 알파-글루코시다제 (α-Glucosidase) 저해 활성이 현재 2형 당뇨 치료 약물인 아카보즈 (Acarbose) 보다 더 우수함을 확인하였다. 실시예 3에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 Hep G2 세포의 세포 생존력에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 4에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 Hep G2 세포에서 DPP-4 효소를 저해하여 당뇨를 예방 및 치료하는 활성을 확인하였다. 또한, 실시예 5에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 근육세포의 세포 생존력에는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 6에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 근육세포 내의 포도당 축적을 증가 시켜 당뇨를 예방 및 치료하는 활성을 확인하였다. 또한, 실시예 6에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 근육세포 내 인슐린 저항성을 감소시켜 당뇨를 예방 및 치료하는 활성을 확인하였다. 나아가, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 AKT 및 IRS-1 (Insulin receptor substrate)로 이루어진 군 중 1종 이상의 단백질 발현을 감소 또는 증가시켜 항당뇨 활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 실시예 7에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 p-AKT 및 p-IRS-1 (ser), GLUT4의 발현을 감소 또는 증가시켜 항당뇨 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 나아가, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 또한, 실시예 8에서 확인되는 바와 같이, 상기 퀘르세틴 (Quercetin)와 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 1:1 (mole : mole) 복합물이 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside) 단일 물질에 비하여 포도당 흡수율을 더욱 증가시키는 상승효과를 통해 항당뇨 효능이 증가한다는 사실을 확인하였다. 또한, 실시예 8에서 확인되는 바와 같이, 상기 Quercetin과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 유효성분으로 포함한 1:1 (mole : mole) 복합물이 근육세포 내 인슐린 저항성을 감소시켜 포도당 흡수율을 더욱 증가시키는 상승효과를 통해 당뇨를 예방 및 치료하는 활성을 확인하였다.

더불어, 상기 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 5 내지 30 μM의 농도로 포함할 수 있다. 만약, 10 μM의 농도 이하의 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함할 경우, 충분한 항당뇨 활성 효과를 볼 수 없을 수 있으며, 30 μM의 농도를 초과하는 양의 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함할 경우, 세포독성 증가에 대한 문제가 발생할 수 있다. 좀 더 구체적으로 설명하면, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 10 내지 30 μM의 농도로 포함할 수 있다. 만약, 10 μM 의 농도 이하의 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함할 경우, 충분한 항당뇨 활성 효과를 볼 수 없을 수 있으며, 30 μg/mL의 농도를 초과하는 양의 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함할 경우, 세포독성 증가에 대한 문제가 발생할 수 있다.

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60 μM의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 Hep G2 세포와 비교하여, Hep G2 세포의 생존율을 0 내지 20%로 저해시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 성장을 0 내지 21%로 억제시킬 수 있다. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60 μM의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포의 생존율을 0 내지 20%로 저해시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 성장을 0 내지 22 %로 억제시킬 수 있다.

또한 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 0 내지 200 μM의 농도로 포함할 때 알파-글리코시다제 (α-Glycosidase) 저해 활성 측정 결과 IC50 0.397mM을 나타낼 수 있다.

또한 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 0 내지 30 μM의 농도로 포함할 때 DPP-4 효소 저해 활성 측정 결과 0 내지22%로 DPP-4 효소활성을 저해 할 수 있다.

나아가, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM 의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 20 내지 100%로 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 20 내지 40 μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 23 내지 101%로 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM 의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 인슐린 저항성을 유도한 근육세포와 비교하여, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 30내지 80%로 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 39 내지 83%까지 증가시킬 수 있다.

게다가, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM의 농도로 포함할 때, Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포 내 p-AKT 발현을 201%까지 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 20 내지 40μM의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포 내 p-IRS-1 (ser) 발현을 9%로 감소시킬 수 있다.

또한 본 발명의 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 몰비는 1:10 (mole : mole) 내지 10:1 (mole : mole)일 수 있다.

상기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 1 내지 100 μM의 농도로 포함할 수 있다.

Quercetin과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 각각 10 μM의 농도로 함유한 1:1 (mole : mole) 복합물을 포함할 때, Quercetin-3-O-rhamnoside와 비교하여, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 1내지 31%로 상승시키는 효과를 보였으며, 바람직하게는 Quercetin-3-O-rhamnoside 단일물질을 10 μM의 농도로 포함할 때와 비교하여 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 0 내지 31.6%로 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 Quercetin-3-O-rhamnoside에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하는 당뇨 예방 및 치료용 약학적 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 50 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하는 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 더불어, 상기 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 10 내지 30 μM의 농도로 포함할 수 있다. 만약, 10 μM 의 농도 이하의 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함할 경우, 충분한 항당뇨 활성 효과를 볼 수 없을 수 있으며, 30 μg/mL의 농도를 초과하는 양의 Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함할 경우, 세포독성 증가에 대한 문제가 발생할 수 있다.

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60 μM의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 Hep G2 세포와 비교하여, Hep G2 세포의 생존율을 0 내지 20%로 저해시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 성장을 0 내지 21%로 억제시킬 수 있다. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60 μM의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포의 생존율을 0 내지 20%로 저해시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 60μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 성장을 0 내지 22 %로 억제시킬 수 있다. 또한 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 0 내지 200 μM의 농도로 포함할 때 알파-글리코시다제 (α-Glycosidase) 저해 활성 측정 결과 IC 50 0.397mM을 나타낼 수 있다. 또한 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 0 내지 30 μM의 농도로 포함할 때 DPP-4 효소 저해 활성 측정 결과 0 내지22%로 DPP-4 효소활성을 저해 할 수 있다.

나아가, 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM 의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 20 내지 100%로 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 20 내지 40 μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 23 내지 101%로 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM 의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 인슐린 저항성을 유도한 근육세포와 비교하여, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 30내지 80%로 증가시킬 수 있으며, 바람직하게는 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM 의 농도로 포함할 때, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 39 내지 83%로 증가시킬 수 있다.

게다가, 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내지 30 μM의 농도로 포함할 때, Quercetin-3-O-rhamnoside를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포 내 p-AKT 발현을 201%로 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 20 내지 40 μM의 농도로 포함할 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 포함하지 않는 근육세포와 비교하여, 근육세포 내 p-IRS-1 (ser) 발현을 9%로 감소시킬 수 있다.

또한 본 발명은 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다. 상기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 몰비는 1:10 (mole : mole) 내지 10:1 (mole : mole)일 수 있다. 상 기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 1 내지 100 μM의 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 당뇨 예방 및 개선용 건강기능성 식품은 Quercetin과Quercetin-3-O-rhamnoside를 각각 10 μM의 농도로 함유한 1:1 (mole : mole) 복합물을 포함할 때, Quercetin-3-O-rhamnoside와 비교하여, 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 1내지 31%로 상승시키는 효과를 보였으며, 바람직하게는 Quercetin-3-O-rhamnoside 단일물질을 10 μM의 농도로 포함할 때와 비교하여 근육세포의 세포 내 포도당 흡수율을 0 내지 31.6%로 증가시킬 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 건강 기능성 식품들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Quercetin 및 Quercetin-3-O-rhamnoside의 화학적 구조

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 Flavone 기본 골격을 가지며 3번 탄소 자리에 O 원소와 함께 람노시드 (Rhamnoside)를 가진 구조를 띄고 있다.

실시예 2. α-Glucosidase inhibitor assay

알파-글루코시다아제 (α-Glucosidase) 저해 활성 측정을 위해 알파-글루코시다아제 (α-Glucosidase/Sharomyces, Sigma, USA)는 0.2 M 인산염 완충제 (pH 7.0)를 사용하여 0.3 U/mL로 희석하였다. 기질 파라-니트로페닐 글루코피라노사이드 (pNPG, Sigma, USA)는 같은 완충용액을 사용하여 0.3 mM 농도로 희석하였다. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)는 0.2 M 인산염 완충제(pH 7.0)에 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 또는 200 μM 농도까지 희석하였다. Positive control로 α-Glucosidase 억제 활성이 있다고 알려진 아카보즈 (Acarbose, WAKO, Japan) 또한 0.2 M 인산염 완충제 (pH 7.0)에 0, 125, 250, 500 , 1000, 2000, 3000, 4000 또는 8000 μM의 농도로 희석 하였다.

그 후 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 완충용액 10 μL, Quercetin-3-O-rhamnoside 또는 아카보즈 시료 20 μL와 20 μL의 α-Glucosidase 효소액을 혼합하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 15분간 배양하였다. 또한 pNPG와 α-Glucosidase 효소액이 반응하여 흡광도의 차이가 발생할 수 있기에 정확도를 높이고자 Control 군으로 설정하였다. 그리고 시료 자체의 발색으로 인해 흡광도에 차이가 날 수 있으므로 Blank 군을 설정하였다.

그 후 20 μL의 pNPG 용액을 각 샘플과 혼합, Control 및 Blank에 첨가한 후 5% CO2, 37℃ 인큐베이터 (incubator)에서 15분 동안 다시 배양했다. 이 반응은 0.2 M 탄산나트륨용액 130 μL를 첨가하여 종료하였다. Blank에서 α-Glucosidase 효소 용액은 완충 용액으로 대체하였다. Control에서 시료는 완충 용액으로 대체되었다. 그 후 ELISA reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과는 하기 도 2와 같다.

실시예 3. HepG2 세포에서의 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 세포독성 측정

HepG2 ( human liver cancer cell line )세포에 대한 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 세포 생존률을 측정하기 위해 MTT 어세이 (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide assay)를 실시하였다. HepG2 세포를 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 0.5*10⁴cells/well로 분주하여 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터 (incubator)에서 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Welgene, USA)에 10% FBS (Welgene, USA), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin)을 첨가한 배지에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 DMEM HG medium과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 농도별로(0, 20, 30, 40, 또는 60 μM) 24시간 동안 처리하였다. 이후 용매 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 5 mg/mL로 용해한 MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)용액을 각 웰 (well) 마다 120 μL씩 처리하여 20분 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터 (incubator)에서 배양하였다. 배양 이후 배양액을 제거한 뒤 각 웰마다 디메틸 설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide) 200 μL/well로 넣으면서 피펫을 이용해 잘 교반하였다. 그 후 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, Quercetin-3-O-rhamnoside를 0, 20, 30, 40, 또는 60 μM 의 농도로 처리하였을 때, 세포 생존력에는 큰 변화가 없는 것으로 보아 퀘르세틴-3-O-람노시드는 60 μM 농도까지는 세포 독성은 없는 것으로 나타났다.

실시예 4. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 DPP-4 효소 억제력 측정

HepG2 (human liver cancer cell line )세포에 대한 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 DPP-4 효소 억제력을 측정하기 위해 DPP-4 inhibition 어세이(DPP-4 inhibition assay) 를 실시하였다. HepG2 세포를 6-웰 플레이트 (6-well plate)에 1*10⁵ cells/well로 분주하여 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터 (incubator)에서 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Welgene, USA)에 10% FBS (Welgene, USA), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin)을 첨가한 배지에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 DMEM HG medium과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 농도별로(0, 10, 20, 또는 30 μM) 24시간 동안 처리하였다. 이후 배지를 제거하고 인산완충식염수 (phosphate buffered saline; PBS buffer)로 세척하였다. 세척 후 웰 당 100 μL의 용해 버퍼 (lysis buffer)를 첨가 후 스크래퍼로 세포를 긁어 E.p. tube에 모은 후, 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고, 13,000 rpm에서 15분 동안 원심분리 하여 단백질을 수득하였다. 수득한 단백질 30 μL와 20 μL의 50 mM Tris-HCl,pH 8.0 ( biosesang, Republic of Korea), 50μL의 5 mM Gly-pro-pNA solution (Sigma aldrich, USA)을 섞어 준 후 실온에서 30분 동안 반응 시켰다. 이 후 피펫을 이용해 잘 교반한 후 ELISA reader로 405 nm에서 흡광도를 1차 측정, 30분 후 2차 측정하였다. 그 후 수득한 단백질을 브래드퍼드 분석법 (Bradford 분석법)을 이용하여 단백질을 정량하여 측정값을 보정하였다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, Quercetin-3-O-rhamnoside를 0 μM, 10 μM, 20 μM, 또는 30 μM의 농도로 처리하였을 때, 퀘르세틴-3-O-람노시드가 DPP-4 효소를 30 μM의 농도에서 22%까지 억제하는 것으로 나타났다.

실시예 5. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 C2C12 근육세포에미치는 세포독성 여부 측정

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 C2C12 (Mouse myoblast cell line) 근육세포에 미치는 세포 독성 여부를 측정하기 위해 시료 처리 후 MTT 어세이로 세포 생존률 (cell viability)을 측정하였다. MTT 어세이 (methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide assay)의 경우 근육세포를 분화유도 전과 분화유도 후로 나누어 실시하였다. 분화 유도 전의 경우 C2C12 근육세포를 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 0.5*10⁴cells/well로 분주하여 24시간 동안 5% CO₂, 37℃인큐베이터 (incubator)에서 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Hyclone, USA)에 10% FBS (Welgene, USA), 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin)을 첨가한 배지에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 DMEM HG medium과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 농도별로(0, 10, 20, 30, 40, 또는 60 μM) 24시간 동안 처리하였다. 이후 용매 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 5 mg/mL로 용해한 MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)용액을 각 웰 (well) 마다 120 μL씩 처리하여 20분 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 이후 배양액을 제거한 뒤 각 웰마다 디메틸 설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide) 200 μL/well로 넣으면서 피펫을 이용해 잘 교반하였다. 그 후 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 분화 유도후의 세포생존률 확인은 앞선 분화 유도 전의 경우와 마찬가지로 C2C12 근육세포를 96-웰 플레이트 (96-well plate)에 0.5*10⁴cells/well로 분주하여 24시간 동안 5% CO₂, 37℃인큐베이터 (incubator)에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 배지를 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin), 2% Horse serum (Gibco, USA) 이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Hyclone, USA)으로 바꾸어 7일 동안 분화 유도 하였다. 그 후에 DMEM HG medium과 Quercetin-3-O-rhamnoside를 농도별로(0, 10, 20, 30, 40, 또는 50 μM) 24시간 동안 처리하였다. 이후 용매 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 5 mg/mL로 용해한 MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)용액을 각 웰 (well) 마다 120 μL씩 처리하여 20분 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 이후 배양액을 제거한 뒤 각 웰마다 디메틸 설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide) 200 μL/well로 넣으면서 피펫을 이용해 잘 교반하였다. 그 후 ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 5 a에서 확인되는 바와 같이, Quercetin-3-O-rhamnoside를 0, 10, 20, 30, 40, 또는 60 μM의 농도로 처리하였을 때, 30 μM 까지는 세포 생존력에 큰 변화가 없으며 도 5 b에서 확인 되는 바와 같이, Quercetin-3-O-rhamnoside를 7일 분화 후 0, 10, 20, 30, 40, 또는 50 μM 의 농도로 처리하였을 때, 세포 생존력에 변화가 거의 없는 것으로 보아 퀘르세틴-3-O-람노시드는 30 μM 농도까지는 세포 독성은 없는 것으로 나타났다.

실시예 6. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)가 근육세포에서 포도당 흡수 (Glucose uptake)에 미치는 영향 조사

C2C12 근육세포를 96-웰 블랙 플레이트 (96-well black plate)에 0.5 ×10⁴cells/well 밀도로 분주하고 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin), 2% Horse serum (Gibco, USA) 이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Hyclone, USA)으로 배지를 갈아서 7일 동안 근육세포를 분화시키고 Dexamethasone (Sigma aldrich, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose (DMEM LG medium; Welgene, USA)에 1 μM의 농도로 16시간 처리하여 인슐린 저항성 (Insulin-resistance)을 유도 하였다. 유도 후 배양액을 제거 한 뒤 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 1시간 Starvation 시켰다. DPBS를 제거 한 후 Dexamethasone (Sigma aldrich, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Glucose Free (DMEM GF medium; Welgene, USA)에 1 μM의 농도로 만들고 Quercetin-3-O-rhamnoside를 0, 10, 20, 또는 30 μM 의 농도로 3시간 30분 처리하였다. Quercetin-3-O-rhamnoside 처리 이후 insulin (Sigma aldrich, USA)을 1 μM 농도로 30분 처리하였다. 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG : Invitrogen, USA) 을 50 μM 농도로 2시간 처리하였다. 인산완충식염수로 세척한 후 형광분광광도계(기기 제조사)로 485 nm (exitation), 535 nm (emission) 에서 세포 내 2-NBDG 함량을 측정하였다. 측정 결과는 하기 도면 6에 나타내었다. 도 6a에서 확인 되는 것처럼 분화 전 근육세포에서의 세포 내 포도당 흡수율과 도 6b에서 확인되는 인슐린 저항성이 유도 된 근육세포에서의 세포 내 포도당 흡수율 두 가지 모두 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)가 포도당 흡수율을 촉진하며 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 항당뇨 활성을 나타낸다.

실시예 7. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)처리가 근육세포 신호전달 단백질 발현에 미치는 영향조사

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 항당뇨 관련 기전을 조사하기 위해 C2C12 근육세포에 대해 AKT, IRS-1 (Insulin receptor substrate), GLUT-4 (Glucose transporter type 4 )의 신호 전달에 의한 근육세포의 단백질 발현 감소 또는 증가를 웨스턴 블렛 (Western blot) 방법으로 조사하였다. 구체적으로, C2C12 근육세포를 6-웰 플레이트 (6-well plate)에 1 ×10⁵ cells/well의 농도로 시딩 (seeding) 후 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin), 2% Horse serum (Gibco, USA) 이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Hyclone, USA)으로 배지를 갈아서 7일 동안 근육세포를 분화시켰다. 그 후Dexamethasone (Sigma aldrich, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose (DMEM LG medium; Welgene, USA)에 1μM의 농도로 16시간 처리하여 인슐린 저항성(Insulin-resistance)을 유도 하였다. 유도 후 배양액을 제거 한 뒤 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 1시간 Starvation 시켰다. DPBS를 제거 한 후 Dexamethasone (Sigma aldrich, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Glucose Free (DMEM GF medium; Welgene, USA)에 1 μM의 농도로 만들고 Quercetin-3-O-rhamnoside를 0, 10, 20, 또는 30 μM 의 농도로 3시간 30분 처리하였다. Quercetin-3-O-rhamnoside 처리 이후 insulin (Sigma aldrich, USA)을 1 μM 농도로 30분 처리하였다. 처리 후 인산완충식염수 (phosphate buffered saline; PBS buffer)로 세척하고 각 웰에 50 μL의 용해 버퍼 (lysis buffer)를 첨가 후, 스크래퍼로 세포를 긁어 모은 후 30분 동안 얼음 상에서 반응시키고, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 단백질을 수득하였다. 이후 수득한 단백질을 브래드퍼드 분석법 (Bradford 분석법)을 이용하여 단백질을 정량 후 샘플 버퍼 (sample buffer)를 넣고 95℃에서 5분 동안 변성시킨 뒤에 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 겔을 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 폴리 비닐 다이플루오라이드 막 (poly-vinyl difluoride membrane)에 옮긴 후, 1차 항-phospho AKT, 항-phospho IRS-1 (Ser), 항-total AKT, 항-total IRS-1, 항-total GLUT-4, 항-베타 액틴 항체 (CST, USA) (1:1000, v/v)를 5% 탈지분유 (skim milk)에 희석하여 폴리 비닐 다이플루오라이드 막에 넣고 4℃에서 24시간 반응시켰다. 이후 TBST (Tris-Buffered Saline와 Tween 20의 혼합액, 0.1% Tween 20)로 10분마다 3번 세척하고 HRP (horeseradish peroxidase)-conjugated 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:2000(v/v)으로 희석하여 5 μL 첨가한 후 25 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 TBST를 이용하여 3차례 세척한 후 ECL (enchanced chemiluminescence) 기질 용액을 막아 1분 동안 반응시킨 후에 X-ray 필름에 현상하였다. 얻어진 결과를 이미지 J 프로그램을 이용하여 수치화하였다. 측정 결과는 도면 7에 나타내었다. 도 7a, b에서 확인되는 것과 같이, 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 처리한 후 Dexamethason에 Insulin 처리 군과 비교했을 때, Quercetin-3-O-rhamnoside를 처리한 근육세포에서의 p-IRS-1 (Ser)의 발현량이 감소하는 것을 볼 수 있으며 이로 인해 인슐린 저항성을 퀘르세틴-3-O-람노시드가 억제 하는 효능이 있음을 알 수 있다. 또한 도 7a, c에서 확인 되는 것과 같이 p-AKT의 발현량이 증가하는 것을 보아 퀘르세틴-3-O-람노시드가 근육세포에서 포도당 흡수율 증가에 효능이 있음을 알 수 있는 결과를 보여준다. 결과적으로 도 7을 통해 퀘르세틴-3-O-람노시드가 항당뇨 활성이 있음을 나타낸다.

실시예 8. 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnloside)와 퀘르세틴 (Quercetin)의 1:1 (mole : mole) 복합물이 인슐린 저항성이 유도된 근육세포에서 포도당 흡수 (Glucose uptake) 상승에 미치는 영향 조사

C2C12 근육세포를 96-웰 블랙 플레이트 (96-well black plate)에 0.5 ×104 cells/well 밀도로 분주하고 1% 페니실린 스트렙토마이신 (penicillin streptomysin), 2% Horse serum (Gibco, USA) 이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium High glucose (DMEM HG medium; Hyclone, USA)으로 배지를 갈아서 7일 동안 근육세포를 분화시키고 Dexamethasone (Sigma aldrich, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose (DMEM LG medium; Welgene, USA)에 1μM의 농도로 16시간 처리하여 인슐린 저항성 (Insulin-resistance)을 유도 하였다. 유도 후 배양액을 제거 한 뒤 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 1시간 Starvation 시켰다. DPBS를 제거 한 후 Dexamethasone (Sigma aldrich, USA)을 Dulbecco's Modified Eagle's Medium Glucose Free (DMEM GF medium; Welgene, USA)에 1 μM의 농도로 만들고 Quercetin-3-O-rhamnoside, Quercetin을 10 μM 농도로 3시간 30분 처리하였다. 또한 Quercetin-3-O-rhamnoside와 Quercetin-3-O-xyloside를 각각 10 μM 농도로 1:1 (mole : mole) Mixture를 제조하여 3시간 30분 처리하였다. Quercetin-3-O-rhamnoside, Quercetin, Mixture 처리 이후 insulin (Sigma aldrich, USA)을 1 μM 농도로 30분 처리하였다. 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG : Invitrogen, USA) 을 50 μM 농도로 2시간 처리하였다. 인산완충식염수로 세척한 후 형광분광광도계(기기 제조사)로 485 nm (exitation), 535 nm (emission) 에서 세포 내 2-NBDG 함량을 측정하였다. 측정한 2-NBDG 의 함량은 도면 8에 나타냈다.

Claims

퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서
상기 약학적 조성물은 알파-글리코시다제 억제 (α-Glycosidase inhibition) 활성을 가지는, 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 GLUT, AKT 및 IRS-1 (Insulin receptor substrate)으로 이루어진 군 중 1종 이상의 단백질 발현을 감소 또는 증가시키는, 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내재 30 μM 의 농도로 포함하는, 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 2형 당뇨 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 약학적 조성물은 알파-글리코시다제 억제 (α-Glycosidase inhibition) 활성을 가지는, 제 2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)의 몰비는 1:10 (mole : mole) 내지 10:1 (mole : mole)인, 2형 당뇨 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 1 내지 100 μM의 농도로 포함하는, 2형 당뇨 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 제 2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물로서
상기 건강기능성 식품 조성물은 알파-글리코시다제 억제 (α-Glycosidase inhibition) 활성을 가지는, 제 2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 건강기능성 식품 조성물은 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)를 10 내재 30 μM 의 농도로 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
퀘르세틴 (Quercetin) 및 퀘르세틴-3-O-람노시드 (Quercetin-3-O-rhamnoside)을 포함하는 2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물로서,
상기 건강기능성 식품 조성물은 알파-글리코시다제 억제 (α-Glycosidase inhibition) 활성을 가지는, 제 2형 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.