KR102270926B1 - A composition for preventing and treating liver cancer comprising BANF1, PLOD3 or SF3B4 - Google Patents
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Abstract
BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 적용에 관한 것이다. 본 발명의 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 및 치료용 조성물은 간암의 성장과 증식, 이동과 전이를 억제할 수 있어 간암의 새로운 치료제로서 사용 가능하여, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다. It relates to a composition for preventing and treating liver cancer comprising an inhibitor of BANF1, PLOD3 or SF3B4 as an active ingredient, and application thereof. The composition for prevention and treatment of liver cancer comprising an inhibitor of BANF1, PLOD3 or SF3B4 of the present invention as an active ingredient can inhibit the growth, proliferation, migration and metastasis of liver cancer, and thus can be used as a new therapeutic agent for liver cancer It can be usefully used.
Description
BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 적용에 관한 것이다. It relates to a composition for preventing and treating liver cancer comprising an inhibitor of BANF1, PLOD3 or SF3B4 as an active ingredient, and application thereof.
암은 인류의 건강을 위협하는 대표적인 질병으로서 산업화된 국가에서 단일 질병으로는 가장 대표적인 사망 원인이다. 암의 발생원인은 아직도 규명되지 않고 있으나 내적 요인인 유전적 요소와 외적 요인인 암 발생 유발요소로 작용되는 발암화학물질, 계속적인 염증과 손상, 암 유발 바이러스 감염의 복합적 요소가 작용하는 것으로 간주된다. Cancer is a representative disease that threatens human health and is the most representative cause of death as a single disease in industrialized countries. Although the cause of cancer is still unknown, it is considered that complex factors of genetic factors, which are internal factors, carcinogenic chemicals acting as factors that cause cancer, which are external factors, continuous inflammation and damage, and cancer-causing virus infection are acting. .
그러나 암은 불치의 병으로 단정할 만큼 절망적인 것은 아니며 조기진단과 함께 적극적인 치료에 임하면 완치될 수 있다. 따라서 조기발견과 조기진단과 치료가 암치료의 효과를 높이는 데 결정적으로 중요하며, 진행된 암에서도 다각적이고 적극적인 방법들을 동원한다면 완치 내지 생명을 연장시키고 괴로운 증세를 호전시킬 수 있다. However, cancer is not so desperate that it can be concluded that it is an incurable disease, and it can be cured by early diagnosis and active treatment. Therefore, early detection, early diagnosis, and treatment are crucially important to increase the effectiveness of cancer treatment, and even in advanced cancer, if various and active methods are used, a cure or life can be prolonged and painful symptoms can be improved.
암 중에서도 간암은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로 알려져 있으며, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망하고 있는 것으로 보고되고 있다. 간암은 크게 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암 (간세포암; hepatocellular carcinoma)과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 구분할 수 있는데, 간암의 약 90% 이상은 원발성 간암이다. 이러한 간암의 발병 원인 중 대다수는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 급성 또는 만성적인 감염이라는 것이 보고되고 있지만, 간암의 발병 및 진행에 관한 세포 내의 분자적 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 못한 상태이다. 종래의 연구에 따르면 각종 성장인자 유전자와 같은 전-종양형성유전자 (protooncogene)가 다양한 원인에 의하여 종양형성유전자(oncogene)로 돌연변이되어 과발현하거나 과활성을 갖는 경우, 또는 Rb 단백질이나 p53 단백질과 같은 종양형성 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 가 다양한 원인에 의하여 돌연변이 되어 저발현하거나 기능을 잃는 경우 간암을 비롯한 다양한 암의 발병과 진행을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 최근에는 간암을 비롯한 대부분의 암의 발병 및 진행은 특정 몇몇 유전자들에 의하여 이루어지는 것이 아니라 세포주기, 신호전달 등과 관련된 다양한 각종 유전자들의 복합적인 상호작용에 발병하는 것으로 인식되고 있으며, 따라서 개별적인 유전자나 단백질의 발현이나 기능에만 중점을 두는 것에서 벗어나 다양한 유전자나 단백질에 대한 총체적인 연구의 필요성이 대두되고 있다. Among cancers, liver cancer is known as one of the deadliest cancers in the world, and in particular, it is reported that more than half a million people die from liver cancer every year in Asia and sub-Saharan Africa. Liver cancer can be broadly divided into primary liver cancer (hepatocellular carcinoma) arising from hepatocellular carcinoma and metastatic liver cancer in which cancers from other tissues have metastasized to the liver. More than 90% of liver cancers are primary liver cancer. Although it has been reported that most of the causes of liver cancer are acute or chronic infection by the hepatitis B virus or hepatitis C virus, the molecular mechanisms in cells related to the onset and progression of liver cancer are still not clearly understood. . According to prior studies, protooncogenes such as various growth factor genes are mutated into oncogenes for various reasons and overexpressed or overactive, or tumors such as Rb protein or p53 protein When a tumor suppressor gene is mutated by various causes and underexpressed or loses its function, it has been reported to cause the onset and progression of various cancers including liver cancer. Recently, it is recognized that the onset and progression of most cancers, including liver cancer, is caused by complex interactions of various genes related to the cell cycle, signal transduction, etc., rather than by a few specific genes. Therefore, individual genes or proteins Rather than focusing only on the expression or function of , the need for comprehensive research on various genes or proteins is emerging.
한편, 유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 간섭 RNA(RNA interference, 이하 RNAi라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). RNAi는 21-25개의 뉴클레오타이드 크기의 이중나선 구조를 가진 작은 간섭 리보핵산 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA라고 한다)이 상보적인 서열을 가지는 전사체(mRNA transcript)에 특이적으로 결합하여 해당 전사체를 분해함으로써 특정 단백질의 발현을 억제하는 현상이다. 세포 내에서는 RNA 이중가닥이 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의해 프로세싱되어 21 내지 23개의 이중가닥(base pair,bp)의 siRNA로 변환되며, siRNA 는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514). 베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). siRNA를 포함하는 RNAi 기술 기반 치료제 시장은 향후 세계 시장규모가 2020년경에 총 12조원 이상을 형성하는 것으로 분석되었으며, 해당 기술을 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대되어 기존의 항체, 화합물 기반 의약품으로 치료하기 어려운 질병을 치료할 수 있는 차세대 유전자 치료기술로 평가되고 있다. 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)이 특정한 단백질 표적에 최적화되기까지 오랜 동안의 개발 기간 및 개발 비용이 소요되는 것에 비하여, 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있고, 개발 기간이 단축되면서, 의약화가 불가능한 표적 물질을 포함한 모든 단백질 표적에 대하여 최적화된 리드 화합물을 개발할 수 있다는 장점을 가진다 (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670). 이에, 최근 이 리보핵산 매개 간섭현상이 기존의 화학 합성 의약 개발에서 발생되는 문제의 해결책을 제시하면서 전사체 수준에서 특정 단백질의 발현을 선택적으로 억제하여 각종 질병 치료제, 특히 종양 치료제 개발에 이용하려는 연구가 진행되고 있다.On the other hand, the technology of suppressing gene expression is an important tool in the development of therapeutic agents for disease treatment and target validation. RNA interference (hereinafter referred to as RNAi) has been found to act on sequence-specific mRNA in various types of mammalian cells since its role was discovered (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764773). RNAi is a small interfering ribonucleic acid short interfering RNA (small interfering RNA, hereinafter referred to as siRNA) having a double helix structure of 21-25 nucleotides in size is specifically bound to an mRNA transcript having a complementary sequence. It is a phenomenon in which the expression of a specific protein is suppressed by decomposing the transcript. In the cell, RNA double-stranded is processed by an endonuclease called Dicer and converted into 21 to 23 double-stranded (base pair, bp) siRNA, which binds to RISC (RNA-induced silencing complex). Thus, the guide (antisense) strand recognizes and degrades the target mRNA to sequence-specifically inhibit the expression of the target gene (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503 -514). According to Bertrand's research team, siRNA for the same target gene has a superior inhibitory effect on mRNA expression in vitro and in vivo compared to antisense oligonucleotide (ASO), and the effect lasts for a long time. (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). The market for RNAi technology-based therapeutics, including siRNA, has been analyzed to form a total of more than 12 trillion won in the future world market size around 2020. It is being evaluated as a next-generation gene therapy technology that can treat difficult-to-treat diseases. In addition, the mechanism of action of siRNA binds to the target mRNA and regulates the expression of the target gene in a sequence-specific manner. Therefore, it takes a long time for existing antibody-based drugs or small molecule drugs to be optimized for specific protein targets. Compared to the development period and cost of development, the applicable target can be dramatically expanded and the development period shortened, enabling the development of lead compounds optimized for all protein targets, including target substances that cannot be medicated. (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670). Therefore, recently, this ribonucleic acid-mediated interference phenomenon proposes a solution to the problem that occurs in the development of conventional chemical synthesis drugs, while selectively inhibiting the expression of specific proteins at the transcript level, and a study to use them in the development of therapeutic agents for various diseases, especially tumor therapeutics is in progress
이에 본 발명자들은 전암성 병변 부위에서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현수준을 측정하고, 간암을 조기에 정확하게 예방 및 치료할 수 있음을 최초로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by measuring the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 in the precancerous lesion site and confirming for the first time that liver cancer can be accurately prevented and treated at an early stage.
본 발명의 목적은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer, comprising an inhibitor for one or more genes or proteins selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4 as an active ingredient.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer, comprising an inhibitor for one or more genes or proteins selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4 as an active ingredient. .
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, aptamer or antibody specific for BANF1, PLOD3 or SF3B4.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 BANF1는 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 PLOD3은 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 SF3B4는 서열번호 5의 염기서열 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어 질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the BANF1 is composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and the PLOD3 is composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, SF3B4 may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
또한, 본 발명은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis and recurrence of liver cancer, comprising one or more inhibitors selected from the group consisting of BANF1, PLOD3 and SF3B4 as an active ingredient.
또한, 본 발명은 (a) BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 이의 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) contacting a sample to be analyzed with a cell containing a BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or a protein thereof; (b) measuring the expression level of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of the protein, or the activity of the protein; And (c) when the measurement result of step (b), the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of protein or the activity of the protein is reduced, the sample is determined as a substance for the prevention or treatment of liver cancer It provides a method for screening a substance for preventing or treating liver cancer, including.
본 발명의 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 억제제를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 및 치료용 조성물은 간암의 성장과 증식, 이동과 전이를 억제할 수 있어 간암의 새로운 치료제로서 사용 가능하여, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다. The composition for prevention and treatment of liver cancer comprising an inhibitor of BANF1, PLOD3 or SF3B4 of the present invention as an active ingredient can inhibit the growth, proliferation, migration and metastasis of liver cancer, and thus can be used as a new therapeutic agent for liver cancer It can be usefully used.
도 1은 간세포암에서 본 발명의 신규 간암 진단 마커를 동정하는 순서를 나타낸 모식도이다.
도 2는 초기 단계의 간세포암을 진단할 수 있는 마커 동정 결과에 관한 것으로, 2a는 다양한 단계별 간세포암 및 전암성 병변 부위(premalignant lesion)에서 의미있는 발현차이를 보이는 3,628개의 유전자의 히트맵(상단; Welch’s t-test p<0.05이고 정상 시료와 1.5배 발현 차이를 보이는 것을 선정) 및 각 질환의 평균값에 대한 히트맵 및 계통도를 나타낸 것이다(하단). 2b는 LGDN, HGDN, eHCC 및 G1에서 유의하게 발현이상을 나타내는(one way ANOVA p<0.005) 1,730개 유전자의 히트맵을 나타낸 것이고(상단), LGDN, HGDN, eHCC 및 G1의 평균값에 대한 계층분석 결과를 나타낸 것이다(하단). 2c는 특정 그룹 간 발현 차이를 나타내는 유전자를 벤다이어그램 결과로 나타낸 것이고(왼쪽), 모든 그룹에서 차등적 발현을 보이는 690개의 유전자에 대한 히트맵을 나타낸 것이며(중간), 초기 단계의 간세포암에서 점진적으로 상향 조절된 85개 유전자의 동정에 대한 전략적 모델을 나타낸 것이다(오른쪽). 2d는 13개 유전자에 대한 ROC 곡선 분석을 나타낸 것으로, 표준선과 비교하여 AUC의 통계적 유의미한 차이를 나타낸 것이다. 2e는 HCC TMA에서 10개의 후보 유전자 마커에 대한 면역화학적 분석 결과를 사진(상단) 및 발현율(하단)로 나타낸 것이다.
도 3은 신규한 암 결정(진단) 마커의 발현 프로파일을 나타낸 것으로, 3a는 TCGA_LIHC 데이터셋 유래의 HCC 환자의 비종양 조직 및 종양 조직에 대한 10개 마커 유전자의 발현 정도를 분석한 것을 나타낸 것이며, 3b는 코호트 1 유래의 단계별 HCC 환자 조직에서 10개 마커 유전자의 발현정도를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 전암성 병변부위에서 초기 단계의 HCC 진단 마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 가능성에 대한 분석 결과를 나타낸 것으로, 4a는 초기 단계 HCC의 전체 섹션에서 10개 후보 마커들에 대한 면역조직화학염색 결과의 이미지를 나타낸 것이고, 4b는 기존 마커(CM) 및 본 발명의 신규마커(NM) 각각에 대한 양성 발현정도를 막대그래프로 나타낸 것이며(왼쪽), 면역조직화학염색 결과의 이미지를 나타낸 것이다(오른쪽). 4c는 기존 마커(CM) 및 본 발명의 신규마커(NM) 각각에 대한 양성 발현정도를 나타낸 것이며(왼쪽), 기존마커 음성발현의 HCC에서 본 발명의 신규 마커의 양성 발현율 또는 본 발명의 신규마커 음성발현의 HCC에서 기존마커의 양성 발현율을 막대 그래프로 나타낸 것이고(중간), 모든 종래 마커의 음성 발현 결과를 면역조직화학염색 결과 이미로 나타낸 것이다(오른쪽). 4d는 CM-양성 RN 조직에서의 NM 음성 발현율과 NM-양성 RN 조직에서의 CM 음성 발현율을 그래프로 나타낸 것이다. 4e는 각 마커별 ROC 곡선을 나타낸 것이고, 4f는 간세포암 환자에서 3개의 본 발명의 신규 마커에 대한 단백질 발현율에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 신규한 10개 후보 유전자 마커에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것으로, 코호트 2 HCC 환자군에서의 3개의 기존 마커 및 3개의 신규 마커에 대한 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HCC에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 비정상적인 발현양상 및 in vitro에서 이들의 비활성화에 의한 간세포암의 성장 억제 효과를 확인한 것으로, 6a는 TCGA_LIHC HCC 50쌍에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현수준을 나타낸 것이고(각 왼쪽 도면), 무작위적으로 선별된 13쌍의 HCC 조직에서의 발현 수준을 나타낸 것이다(각 오른쪽 도면). 6b는 6쌍의 조기 간세포암(상단) 및 DL을 갖는 3쌍의 조기 간세포암(하단)에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿 결과로 나타낸 것이다. 6c는 간세포암이 유발된 마우스(상단) 및 쥐(하단)에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현정도를 확인한 결과이다. 6d는 H-ras로 형질전환된 마우스(상단) 및 DEN으로 유도된 간세포암 쥐 모델(하단)에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다. 6e는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포의 세포생존율(왼쪽) 및 세포 성장률(오른쪽)을 MTT 분석 및 BruD 분석으로 각각 측정한 결과를 나타낸 것이다. 6f는 형질감염된 SNU-449 세포의 집락형성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 타겟팅하여 간세포암 세포주의 종양발생 억제 및 전이 억제를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 7a는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포주에 대한 이동 및 침윤정도를 세포 이동(왼쪽) 및 이동 세포수(오른쪽)로 측정한 결과를 나타낸 것이고, 7b는 7a와 동일한 실험군에 대한 상처 치유 분석 결과를 세포 이미지로 나타낸 것이고(왼쪽), 이동율로 나타낸 것이다(오른쪽). 7c는 대조군 si-RNA(si-Cont) 및 각 유전자에 대한 siRNA(si-BANF1, si-PLOD3 및 si-SF3B4)로 형질감염된 SNU-449 세포주에서의 EMT 조절 단백질을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 7d는 대조군 si-RNA 및 si-BANF1, si-PLOD3 또는 si-SF3B4로 형질 감염된 SNU-449 세포주가 이식된 마우스 모델의 마우스 사진 및 종양 크기를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 7e는 H-ras로 형질전환된 마우스에 대한 MSNs의 투여시점을 모식도로 나타낸 것이고(상단), MSNs 단독 및 MSNs_ siRNA를 H-ras로 형질전환된 마우스에 투여 후, 시간별 형성된 종양수를 측정한 결과를 나타낸 것이다(하단). 7f는 H-ras로 형질전환된 마우스의 간 조직에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿 결과로 나타낸 것이다.
도 8은 siRNA를 함유한 메조기공 실리카 나노입자(MSN)를 이용한 결과를 나타낸 것으로, 8a는 각 유전자에 대한 siRNA로 형질감염 후, Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이고, 8b는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)와 각 유전자의 siRNA로 형질감염된 Hepa-1c1c7 마우스 간암 세포에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 나타낸 것이며, 8c는 메조기공 실리카 나노입자(MSN)와 각 유전자의 siRNA로 형질감염된 Hep3B 세포에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현수준을 나타낸 것이다.
도 9는 SF3B4의 간암 마커로서의 가능성에 대한 임상학적 타당성을 분석한 결과로서, 9a는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 mRNA 발현수준을 나타낸 것이고, 9b는 HCC 환자 전체(왼쪽) 및 무병생존 환자(오른쪽)에서 신규 3개의 마커의 mRNA 발현을 갖는 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 9c는 HCC 환자 전체에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 mRNA 발현에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 9d는 HCC 환자 전체(왼쪽) 및 무병생존 환자(오른쪽)에서 SF3B4의 카피수 증폭과 mRNA의 상향조절의 조합에 대한 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고, 9e는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서 SF3B4의 유전자 카피수 변이빈도를 나타낸 것이며(왼쪽), 카피수 변이값과 mRNA 발현값의 상관관계를 나타낸 것이다(오른쪽). 9f는 20쌍의 HCC 환자조직에 대한 SF3B4 의 유전자 카피수(왼쪽) 및 mRNA 발현 수준(오른쪽)을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SF3B4의 파괴에 따른 간암 세포의 세포 주기 억제 및 EMT 진행 억제를 나타낸 것으로, 10a는 TCGA_LIHC 데이터 셋에서 366명의 HCC 환자에서의 SF3b 복합체 서브유닛의 유전적 변이를 나타낸 것이고, 10b는 지정된 HCC GEO 데이터베이스에서 종양과 비종양에 대한 SF3b 복합체 서브유닛의 상대적인 발현수준을 비교한 것을 나타낸 것이고, 10c는 2개의 정상 간세포주 및 8개의 HCC 세포주에서의 SF3B4 mRNA 발현을 qRT-PCR(상단) 및 웨스턴 블럿(하단)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 10d는 342 개의 SF3B4 상관 유전자에 대한 자율적인 계층 클러스터링 분석에 대한 히트맵을 나타낸 것이고(왼쪽), GSE16757 데이터셋의 SF3B4 고클러스터 환자군 및 SF3B4 저클러스터 환자군의 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이다. 10e는 SF3B4와 관련된 GSEA의 유전자 셋트를 나타낸 것이며, 총 11개 유전자 리스트들이 MSigDB에 의해 확인되었고(상단). 성장-관련 유전자 세트(KEGG_CELL_CYCLE)가 SF3B4과 관련된 특징으로 나타났고, 바코드는 유전자의 위치를 나타낸다(하단). 도 10f는 si-SF3B4 로 형질감염 후 2개의 HCC 세포주에 대한 FACS 분석 결과를 나타낸 것으로, 왼쪽은 히스토그램을 나타낸 것이고 오른쪽은 각 세포주기 단계의 퍼센트를 나타낸 것이다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001; t test).
도 11은 HCC 세포주에서 SF3B4의 넉다운이 미치는 영향을 분석한 것으로, 11a는 SNU-449 및 SNU-368 세포주에 대해 si-RNA Cont(대조군) 및 si-RNA SF3B4로 각각 형질감염시킨 후, 세포생존율(왼쪽)과 세포증식율(오른쪽)을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 11b는 세포집락 형성 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이며, 11c는 트랜스웰 이동 및 침윤 분석을 통해 간암 세포의 이동 및 침윤 정도를 이미지화하고(왼쪽) 이동 세포수를(오른쪽) 분석한 것을 나타낸 것이다. 11d는 SF3B4을 넉다운 시킨 후, 0 및 24시간에서의 상처치유 효과를 분석한 결과를 나타낸 것이고, 11e는 EMT 조절 단백질들의 발현정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것을 나타낸 것이며, 11f는 SF3B4을 넉다운 시키고 48시간째에 FASC를 이용하여 PI 염색된 세포에 대한 히스토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 간암 발생과정에서 SF3B4의 조절자들을 분석한 것을 나타낸 것으로, 12a는 SF3B4에 대한 siRNA 및 SSA로 각각 처리된 HeLa 세포 및 간세포암 세포주에서 각 단백질의 발현정도를 웨스턴 블럿으로 분석한 것으로 나타낸 것이고(상단), 해당 유전자들의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 12b는 12a의 각 실험군에 대한 세포주기 조절자들의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이며, 12c는 GSE80861 RNA-seq 데이터 세트를 이용한 유전자 발현 분석 및 선택적인 스플라이싱 이벤트 분석의 파이프 라인을 나타낸 것이고(왼쪽), 원형 차트는 다르게 차등적 발현을 보이는 유전자(DEG, 오른쪽 상단) 및 선택적 스플라이싱 이벤트(AS) 유형의 분포를 나타낸 것이다. 12d는 TCGA_LIHC 데이터셋에서 GRIP1, PLP1, KLF4 및 KRT80의 상대적인 발현 정도를 나타낸 것이고, 12e는 SF3B4 siRNA로 형질감염된 세포에서 KLF4의 발현정도를 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이며, 12f는 Sashimi 플롯은 KLF4의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)을 나타낸 것이고, 스킵된 엑손(SE)을 나타낸 것이다(p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001; t test).
도 13은 간암 세포주에서 SF3B4의 종양억제자인 KLF4 조절능을 분석한 것으로, 13a는 SF3B4 siRNA(왼쪽) 또는 SSA가 처리된(오른쪽) SNU-449 및 SNU-368 세포주들의 세포생존율을 MTT 분석 결과로 나타낸 것이고, 13b는 GSE80861 데이터셋에서 8개의 유전자에 대한 상대적인 발현 변화 및 선택적 스플라이싱(대조군 대비 SF3B4이 넉다운된 세포주 비교)을 나타낸 것이다. 13c는 SF3B4 siRNA로 형질감염된 SNU-449 및 SNU-368 세포주에서 GRIP1, PLP1, KLF4의 발현정도를 분석한 것으로 나타낸 것이고, 13d 및 13e는 TCGA_LIHC 데이터셋(13d) 및 GSE77314 데이터셋(13e) 유래의 50쌍의 HCC 환자군에서 SF3B4와 8개 유전자들 사이의 발현 상관관계를 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 14는 SF3B4의 기능을 규명한 것으로, 14a는 SF3B4 넉다운 또는 KLF4 과발현된 HCC 세포주에서 p27 Kip1 및 Slug 의 발현수준을 나타낸 것이고, 14b는 SF3B4 넉다운 또는 KLF4 과발현된 SNU-449 세포에서 p27 Kip1 또는 Slug 프로모터 서열을 함유한 리포터 플라스미드의 루시퍼라제 활성도를 측정한 것이며, 14c는 SF3B4 넉다운된 세포에서 KLF4 mRNA 및 2개의 KLF4 mRNA isoform에 대한 RT-PCR 산물 이미지를 나타낸 것이고(왼쪽), HCC 세포주에서 확인된 2개의 KLF4 mRNA isoform과 각 다이아그램 하단에는 스플라이싱 사이트를 표기한 것이며(중간), 붉은색 라인은 splicing junction을 나타낸 것이다(오른쪽). 14d는 SF3B4 넉다운된 SNU-449 세포가 이식된 누드 마우스 모델에서 종양의 성장 정도를 종양성장 곡선(왼쪽)과 형광이미지(오른쪽)로 나타낸 것이고, 14e는 14d의 마우스 동물모델로부터 수득한 암 조직에서 SF3B4 및 KLF4의 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이며, 14f는 HCC에서 야생형 KLF4 발현 억제를 통한 SF3B4의 발암 작용 가설 모델을 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing a procedure for identifying a novel liver cancer diagnostic marker of the present invention in hepatocellular carcinoma.
Figure 2 relates to the results of identification of markers capable of diagnosing early stage hepatocellular carcinoma, and 2a is a heat map of 3,628 genes showing significant expression differences in various stages of hepatocellular carcinoma and premalignant lesions (top). ; Welch's t-test p<0.05 and a 1.5-fold difference in expression from a normal sample is selected) and a heat map and phylogenetic diagram for the average value of each disease are shown (bottom). 2b shows a heat map of 1,730 genes showing significantly abnormal expression in LGDN, HGDN, eHCC and G1 (one way ANOVA p<0.005) (top), and hierarchical analysis of the average values of LGDN, HGDN, eHCC and G1 The results are shown (bottom). 2c shows a Venn diagram result of genes showing differences in expression between specific groups (left), and a heat map for 690 genes showing differential expression in all groups (middle), and progressive in early stage HCC A strategic model for the identification of 85 genes up-regulated by . 2d shows the analysis of ROC curves for 13 genes, showing statistically significant differences in AUC compared to the standard line. 2e shows the results of immunochemical analysis of 10 candidate gene markers in HCC TMA as photographs (top) and expression rates (bottom).
3 shows the expression profile of a novel cancer determination (diagnostic) marker, 3a shows the analysis of the expression level of 10 marker genes in non-tumor tissues and tumor tissues of HCC patients derived from the TCGA_LIHC dataset, 3b shows the analysis of the expression level of 10 marker genes in the tissue of each stage of HCC patients derived from
4 shows the results of analysis of the potential of BANF1, PLOD3 and SF3B4 as early stage HCC diagnostic markers in the precancerous lesion site. 4a is immunohistochemical staining for 10 candidate markers in the entire section of early stage HCC. The image of the result is shown, 4b shows the positive expression level for each of the existing marker (CM) and the novel marker (NM) of the present invention as a histogram (left), and the image of the immunohistochemical staining result is shown ( Right side). 4c shows the level of positive expression for each of the existing marker (CM) and the novel marker of the present invention (NM) (left), and the positive expression rate of the new marker of the present invention in HCC of negative expression of the existing marker or the new marker of the present invention The positive expression rate of existing markers in negative HCC is shown as a bar graph (middle), and the negative expression results of all conventional markers are shown as the results of immunohistochemical staining (right). 4d is a graph showing the expression rate of NM negative in CM-positive RN tissues and the expression rate of CM negative in NM-positive RN tissues. 4e shows the ROC curve for each marker, and 4f shows the Kaplan-Meier survival curve analysis results for the protein expression rate for the three novel markers of the present invention in hepatocellular carcinoma patients.
5 shows the results of ROC analysis for 10 new candidate genetic markers, and shows the results of ROC analysis for 3 existing markers and 3 new markers in the
Figure 6 shows the abnormal expression pattern of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in HCC and the growth inhibitory effect of hepatocellular carcinoma by their inactivation in vitro. 6a shows the expression level of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in 50 pairs of TCGA_LIHC HCC. (each left figure), and the expression level in 13 pairs of randomly selected HCC tissues (each right figure). 6b shows the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in 6 pairs of early HCC (top) and 3 pairs of early HCC with DL (bottom) as a result of Western blot. 6c is the result of confirming the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in mice (top) and mice (bottom) induced with hepatocellular carcinoma. 6d is the result of confirming the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in H-ras-transformed mice (top) and DEN-induced hepatocellular carcinoma (bottom) mice by Western blot. 6e shows cell viability (left) and cell growth rate (right) of SNU-449 cells transfected with control si-RNA (si-Cont) and siRNA for each gene (si-BANF1, si-PLOD3 and si-SF3B4). The results measured by MTT analysis and BruD analysis are shown, respectively. 6f shows the results of analyzing the degree of colony formation of the transfected SNU-449 cells.
7 shows the results of analysis of tumorigenesis inhibition and metastasis inhibition of hepatocellular carcinoma cell lines by targeting BANF1, PLOD3 and SF3B4. 7a is a control si-RNA (si-Cont) and siRNA for each gene (si-BANF1 , si-PLOD3 and si-SF3B4) shows the results of measuring the degree of migration and invasion of the SNU-449 cell line transfected with cell migration (left) and the number of migrating cells (right), 7b shows the same experimental group as 7a. The results of the wound healing analysis for the patient are shown as a cell image (left) and as a migration rate (right). 7c shows EMT regulatory proteins in SNU-449 cell line transfected with control si-RNA (si-Cont) and siRNAs for each gene (si-BANF1, si-PLOD3 and si-SF3B4) by Western blot, 7d shows the results of measuring mouse photos and tumor size of a mouse model transplanted with the control si-RNA and the SNU-449 cell line transfected with si-BANF1, si-PLOD3 or si-SF3B4. 7e is a schematic diagram showing the administration time of MSNs to H-ras-transformed mice (top), and after administration of MSNs alone and MSNs_ siRNA to H-ras-transformed mice, the number of tumors formed over time was measured. The results are shown (bottom). 7f shows the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in liver tissues of mice transfected with H-ras as a result of Western blot.
8 shows the results of using mesoporous silica nanoparticles (MSN) containing siRNA, and 8a shows western BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression levels in Hepa-1c1c7 mouse liver cancer cells after transfection with siRNA for each gene. It was confirmed by blot, 8b shows the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in Hepa-1c1c7 mouse liver cancer cells transfected with mesoporous silica nanoparticles (MSN) and siRNA of each gene, and 8c shows the mesoporous silica nanoparticles ( MSN) and BANF1, PLOD3 and SF3B4 expression levels in Hep3B cells transfected with siRNA of each gene are shown.
9 is a result of analyzing the clinical feasibility of SF3B4 as a marker for liver cancer. 9a shows the expression levels of BANF1, PLOD3 and SF3B4 mRNA in the TCGA_LIHC data set, and 9b shows all HCC patients (left) and disease-free survival. Kaplan-Meier survival curves with mRNA expression of three novel markers in a patient (right) are shown. 9c shows Kaplan-Meier survival curves for BANF1, PLOD3 and SF3B4 mRNA expression in all HCC patients. 9d shows the Kaplan-Meier survival curves for the combination of copy number amplification and mRNA upregulation of SF3B4 in total HCC patients (left) and disease-free patients (right), 9e gene copy number of SF3B4 in the TCGA_LIHC data set. The mutation frequency is shown (left), and the correlation between the copy number mutation value and the mRNA expression value (right) is shown. 9f shows the results of qRT-PCR analysis of the gene copy number (left) and mRNA expression level (right) of SF3B4 in 20 pairs of HCC patient tissues.
Figure 10 shows the cell cycle inhibition and EMT progression inhibition of liver cancer cells according to the disruption of SF3B4, 10a shows the genetic variation of the SF3b complex subunit in 366 HCC patients in the TCGA_LIHC data set, 10b shows the designated HCC A comparison of the relative expression levels of SF3b complex subunits for tumors and non-tumors in the GEO database is shown, and 10c shows the expression of SF3B4 mRNA in two normal hepatocytes and eight HCC cell lines by qRT-PCR (top) and Western The results of analysis by blot (bottom) are shown. 10d shows a heat map for autonomous hierarchical clustering analysis for 342 SF3B4 correlated genes (left), and Kaplan-Meier survival curves for SF3B4 high-cluster and SF3B4 low-cluster patients in the GSE16757 dataset. 10e shows the gene set of GSEA related to SF3B4, and a total of 11 gene lists were identified by MSigDB (top). A set of growth-related genes (KEGG_CELL_CYCLE) appeared as a feature related to SF3B4, and the barcode indicates the location of the gene (bottom). Figure 10f shows the FACS analysis results of two HCC cell lines after transfection with si-SF3B4, the left shows the histogram and the right shows the percentage of each cell cycle stage (p < 0.05, p < 0.01, p <0.001; t test).
11 is an analysis of the effect of knockdown of SF3B4 in HCC cell lines. 11a shows cell viability after transfection with si-RNA Cont (control) and si-RNA SF3B4 for SNU-449 and SNU-368 cell lines, respectively. (Left) and cell proliferation rate (right) analysis results, 11b shows the results of analyzing the degree of cell colony formation, 11c shows the degree of migration and invasion of liver cancer cells through transwell migration and invasion analysis and (left) analysis of the number of migrating cells (right). 11d shows the results of analyzing the wound healing effect at 0 and 24 hours after knocking down SF3B4, 11e shows the confirmation of the expression level of EMT regulatory proteins by Western blot, 11f shows SF3B4 knockdown 48 hours The first shows the histogram results for PI-stained cells using FASC.
Figure 12 shows the analysis of the modulators of SF3B4 in the development of liver cancer, and Figure 12a shows the expression level of each protein in HeLa cells and hepatocellular carcinoma cell lines treated with siRNA and SSA for SF3B4, respectively, analyzed by Western blot. (top), shows the results of analyzing the mRNA levels of the corresponding genes by qRT-PCR. 12b shows the expression level of cell cycle regulators for each experimental group of 12a by Western blot, and 12c shows the pipeline of gene expression analysis and selective splicing event analysis using the GSE80861 RNA-seq data set ( Left), pie charts show the distribution of genes (DEG, top right) and selective splicing event (AS) types with differentially differential expression. 12d shows the relative expression levels of GRIP1, PLP1, KLF4 and KRT80 in the TCGA_LIHC dataset, 12e shows the results of qRT-PCR analysis of the expression level of KLF4 in cells transfected with SF3B4 siRNA, and 12f is a Sashimi plot. shows the alternative splicing of KLF4, and the skipped exon (SE) (p < 0.05, p < 0.01, p <0.001; t test).
13 is an analysis of the ability of SF3B4 to regulate the tumor suppressor KLF4 in liver cancer cell lines, 13a shows the cell viability of SF3B4 siRNA (left) or SSA-treated (right) SNU-449 and SNU-368 cell lines as a result of MTT analysis. is shown, and 13b shows the relative expression change and selective splicing (comparison of cell lines in which SF3B4 is knocked down compared to the control group) for 8 genes in the GSE80861 dataset. 13c shows the analysis of the expression levels of GRIP1, PLP1, and KLF4 in SNU-449 and SNU-368 cell lines transfected with SF3B4 siRNA, and 13d and 13e are derived from the TCGA_LIHC dataset (13d) and GSE77314 dataset (13e). This shows the analysis of expression correlations between SF3B4 and 8 genes in 50 pairs of HCC patients.
Figure 14 is to elucidate the function of SF3B4, 14a is SF3B4 knockdown or p27 Kip1 in KLF4 overexpressed HCC cell line and the expression level of Slug , 14b is p27 Kip1 in SNU-449 cells overexpressing SF3B4 knockdown or KLF4 Alternatively, the luciferase activity of a reporter plasmid containing the Slug promoter sequence was measured, and 14c shows RT-PCR product images for KLF4 mRNA and two KLF4 mRNA isoforms in SF3B4 knockdown cells (left), and in HCC cell lines. The two identified KLF4 mRNA isoforms and splicing sites are indicated at the bottom of each diagram (middle), and the red line indicates splicing junctions (right). 14d shows the tumor growth curve (left) and fluorescence image (right) in a nude mouse model implanted with SF3B4 knockdown SNU-449 cells, and 14e is a cancer tissue obtained from the mouse animal model of 14d. Shows the results of analyzing the expression levels of SF3B4 and KLF4, and 14f shows a hypothetical model for the carcinogenic action of SF3B4 through inhibition of wild-type KLF4 expression in HCC.
본 발명은 BANF1(barrier to autointegration factor 1), PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) 및 SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 유전자 또는 단백질에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides an inhibitor for one or more genes or proteins selected from the group consisting of BANF1 (barrier to autointegration factor 1), PLOD3 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3), and SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4). It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating liver cancer, comprising as an active ingredient.
상기 BANF1(barrier to autointegration factor 1)은 보존된 인간 염색질 단백질로서 핵 어셈블리(nuclear assembly) 및 염색질 탈응축(chromatin decondensation)에 주로 관여하는 것으로 알려져 있고, BANF1는 분자들 간의 통합으로부터 레트로바이러스를 보호할 수 있는 단백질로 처음 규명되었고, 숙주 세포게놈으로 분자간의 통합을 촉진시킨다는 기능이 알려져 있다. 그러나 아직까지 BANF1과 암과의 관련성에 대한 내용은 밝혀진 바 없다.The BANF1 (barrier to autointegration factor 1) is a conserved human chromatin protein and is known to be mainly involved in nuclear assembly and chromatin decondensation, and BANF1 is a conserved human chromatin protein. It was first identified as a capable protein, and its function is known to promote intermolecular integration into the host cell genome. However, the relationship between BANF1 and cancer has not been elucidated yet.
PLOD3(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3)은 프로콜라겐 분자간 가교결합 및 섬유의 초분자 콜라겐 구조의 안정화에 중요한 갈락토실- 및 글루코실-트랜스퍼라제의 활성 때문에 하이드록시라이신-결합의 탄수화물을 생성하는 유일한 이소 효소라고 알려져 있다. 또한, PLOD3은 MMP9를 모집하는데 관여하는 것으로 알려져 있을 뿐, 암의 진행 및 암과의 관련성에 대해 알려진 바가 없다. SF3B4(splicing factor 3b subunit 4)는 포유동물 SF3b 복합체의 핵심 단백질을 암호화하며, U2-type 스플라이소솜(spliceosome)의 일부분으로 U2 snRNP를 연결 부위에 묶는 역할에 대해 알려져 있을 뿐, SF3B4 역시 암과의 관련성에 대해서는 알려진 바가 없다. PLOD3 (procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3) is a hydroxylysine-linked carbohydrate due to the activity of galactosyl- and glucosyl-transferases, which are important for procollagen intermolecular crosslinking and stabilization of the supramolecular collagen structure of fibers. It is known to be the only isoenzyme that produces In addition, PLOD3 is only known to be involved in the recruitment of MMP9, and nothing is known about the relationship with cancer progression and cancer. SF3B4 (splicing factor 3b subunit 4) encodes a key protein of the mammalian SF3b complex, is part of the U2-type spliceosome and is known for its role in binding U2 snRNP to the junction site. Nothing is known about the relevance of
본 발명에서 BANF1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고 BANF1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, PLOD3 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이고 PLOD3 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, SF3B4 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 것이고 SF3B4 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.In the present invention, the BANF1 gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the BANF1 protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the PLOD3 gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, and the PLOD3 protein consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 The SF3B4 gene may consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and the SF3B4 protein may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
본 발명의 일실시예에 의하면, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 억제제로서 이들 유전자들의 발현을 억제하는 siRNA를 이용하여 넉다운 시킨 후, 간세포암의 성장 및 증식을 분석한 결과, 이들 유전자의 발현 또는 활성 억제시 암세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고, 세포주기 이상이 초래되고 세포사멸이 유도되어 궁극적으로 간암을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.According to an embodiment of the present invention, as a BANF1, PLOD3 or SF3B4 inhibitor, an siRNA that inhibits the expression of these genes was knocked down, and as a result of analyzing the growth and proliferation of hepatocellular carcinoma, the expression or activity of these genes was inhibited. It was found that the growth and proliferation of cancer cells was inhibited, and cell cycle abnormalities were caused and apoptosis was induced, thereby ultimately preventing and treating liver cancer.
따라서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 활성 및 발현을 억제할 수 있는 물질은 간암 치료제로 사용할 수 있으며, 본 발명은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. Therefore, a substance capable of inhibiting the activity and expression of BANF1, PLOD3 or SF3B4 can be used as a therapeutic agent for liver cancer, and the present invention provides a pharmaceutical for inhibiting metastasis and recurrence of liver cancer, comprising an inhibitor of BANF1, PLOD3 or SF3B4 as an active ingredient compositions can be provided.
본 발명에 따른 약학적 조성물에는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 siRNA를 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may include any substance capable of inhibiting the expression or activity of BANF1, PLOD3 or SF3B4, and preferably a chemical substance, nucleotide, antisense, siRNA oligonucleotide, or a natural extract as an active ingredient. It may include, more preferably, an antisense or small interference RNA (siRNA) oligonucleotide having a sequence complementary to the nucleotide sequence of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene of the present invention as an active ingredient, and even more preferably siRNA can be used.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 mRNA에 상보적이고 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.In the present invention, the term "antisense oligonucleotide" refers to DNA or RNA or derivatives thereof containing a nucleic acid sequence complementary to a specific mRNA sequence, and binds to a complementary sequence in mRNA to form BANF1, PLOD3 or SF3B4. The antisense sequence of the present invention is complementary to BANF1, PLOD3 or SF3B4 mRNA and refers to a DNA or RNA sequence capable of binding to BANF1, PLOD3 or SF3B4 mRNA, and BANF1, PLOD3 or SF3B4 It can inhibit mRNA translation, translocation into the cytoplasm, maturation or any other essential activity for overall biological functions.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.In addition, the antisense nucleic acid may be modified at one or more bases, sugars or backbone positions to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5, 3, 343-55, 1995). ). The nucleic acid backbone may be modified with phosphorothioates, phosphotriesters, methyl phosphonates, short chain alkyls, cycloalkyls, short chain heteroatomics, heterocyclic intersugar linkages, and the like. Antisense nucleic acids may also include one or more substituted sugar moieties. Antisense nucleic acids may include modified bases. Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-methylpyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosyl HMC, 2-aminoadenine, 2 -Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. There is this. In addition, the antisense nucleic acid of the present invention may be chemically bound to one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cell adsorption properties of the antisense nucleic acid. Cholesterol moiety, cholesteryl moiety, cholic acid, thioether, thiocholesterol, fatty chain, phospholipid, polyamine, polyethylene glycol chain, adamantane acetic acid, palmityl moiety, octadecylamine, hexylamino-carbonyl-oxy fat soluble moieties such as cholesterol moieties, and the like. Oligonucleotides comprising a fat-soluble moiety and methods of preparation are well known in the art (US Pat. Nos. 5,138,045, 5,218,105 and 5,459,255). The modified nucleic acid may increase the stability to nucleases and increase the binding affinity between the antisense nucleic acid and the target mRNA.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by a conventional method and administered in vivo, or antisense oligonucleotides can be synthesized in vivo. An example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is using RNA polymerase I. One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to use a vector with the origin of the recognition site (MCS) in the opposite direction to allow the antisense RNA to be transcribed. Such antisense RNA preferably has a translation stop codon in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
본 발명에서 "siRNA”용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. In the present invention, the term "siRNA" refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (International Patent Publication Nos. 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 and 00 /44914) Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knock-down method or as a gene therapy method.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(TCIRG1 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(TCIRG1 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 TCIRG1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. The siRNA molecule of the present invention may have a structure in which the sense strand (sequence corresponding to the TCIRG1 mRNA sequence) and the antisense strand (sequence complementary to the TCIRG1 mRNA sequence) are positioned opposite to each other to form a double-stranded structure. siRNA molecules may have a single-stranded structure having self-complementary sense and antisense strands. Furthermore, siRNA is not limited to the complete pairing of double-stranded RNA portions that are paired with each other, but pairs are formed by mismatch (the corresponding bases are not complementary), bulges (there is no base corresponding to one chain), etc. There may be parts that are not achieved. In addition, as long as the siRNA end structure can suppress the expression of TCIRG1 gene by the RNAi effect, both a blunt end or a cohesive end are possible, and the cohesive end structure includes a 3'-end protrusion structure and a 5'-end structure. Both protrusion structures are possible.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.In addition, the siRNA molecule of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence is inserted between self-complementary sense and antisense strands. In this case, the siRNA molecule formed by the expression of the nucleotide sequence is used for intramolecular hybridization. Thus, a hairpin structure is formed, and as a whole, a stem-and-loop structure is formed. This stem-and-loop structure can be processed in vitro or in vivo to generate active siRNA molecules capable of mediating RNAi.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다. Methods for producing siRNA include direct synthesizing siRNA in a test tube and introducing it into cells through a transformation process, and transfecting an siRNA expression vector or PCR-derived siRNA expression cassette prepared so that siRNA is expressed in cells into the cell. There is a method of converting or infecting.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.In addition, the composition of the present invention comprising a gene-specific siRNA may include an agent that promotes siRNA influx into cells. In general, an agent that promotes nucleic acid influx can be used for the agent that promotes siRNA entry into cells, for example, using liposomes or lipophilic one of a number of sterols including cholesterol, cholate and deoxycholic acid. It can be formulated with a carrier. In addition, poly-L-lysine (poly-L-lysine), spermine (spermine), polysilazane (polysilazane), polyethylenimine (PEI: polyethylenimine), polydihydroimidazolenium (polydihydroimidazolenium), polyallylamine (polyallylamine) ), a cationic polymer such as chitosan may be used, and succinylated PLL (succinylated PLL), succinylated PEI (succinylated PEI), polyglutamic acid, polyaspartic acid may be used. (polyaspartic acid), polyacrylic acid (polyacrylic acid), polymethacylic acid (polymethacylic acid), dextran sulfate (dextran sulfate), heparin (heparin), anionic polymers such as hyaluronic acid (hyaluronic acid) Available.
또한, 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.In addition, when using an antibody specific for BANF1, PLOD3 or SF3B4 protein as a substance that reduces the expression and activity of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 protein, the antibody is directly or indirectly coupled with an existing therapeutic agent through a linker ( for example, covalently). The therapeutic agent that can be bound to the antibody includes, but is not limited to, a radionuclide such as 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In, etc. ); biological response modifiers or drugs such as methotrexate, adriamycin, and lymphokines such as interferon; toxins such as ricin, abrin, diphtheria, and the like; Heterofunctional antibodies, i.e. antibodies that bind to other antibodies so that the complex binds to both cancer cells and effector cells (e.g., K cells such as T cells; and natural, i.e. non It can be associated with -associated or non-conjugated antibodies.
또한, 본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). In addition, in the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, "pharmaceutically acceptable" refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or similar reactions when administered to humans. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid, and the like, and carriers for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like. and the like, and may further include a stabilizer and a preservative. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives are benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. As other pharmaceutically acceptable carriers, reference may be made to those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral dosage forms according to known methods, and as a representative dosage form for parenteral administration, an isotonic aqueous solution or suspension is preferred as an injectable dosage form. Formulations for injection may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component may be formulated for injection by dissolving it in saline or buffer. In addition, formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills and capsules.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 “투여”란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition formulated in the above manner may be administered in an effective amount through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular. The “administration” refers to introducing a predetermined substance into a patient by any suitable method. and the route of administration of the substance may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
또한, 상기에서 “유효량” 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. In addition, as used herein, the term “effective amount” refers to an amount exhibiting a prophylactic or therapeutic effect when administered to a patient. The dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the type and severity of the patient's disease, age, sex, weight, sensitivity to drugs, the type of current treatment, administration method, target cell, etc. can be easily determined by experts in In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with a conventional therapeutic agent, may be administered sequentially or simultaneously with the conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. Preferably, taking all of the above factors into consideration, an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects may be administered, more preferably from 1 to 10000 μg/weight kg/day, even more preferably from 10 to 1000 mg It can be administered repeatedly several times a day at an effective dose of /kg body weight /day.
본 발명은 (a) BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 이의 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention comprises the steps of (a) contacting a sample to be analyzed with a cell containing a BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or a protein thereof; (b) measuring the expression level of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of the protein, or the activity of the protein; And (c) when the measurement result of step (b), the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of protein or the activity of the protein is reduced, the sample is determined as a substance for the prevention or treatment of liver cancer It can provide a method of screening a substance for preventing or treating liver cancer, including.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자 또는 이의 단백질을 포함 또는 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기“시료”는 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, BANF1, PLOD3 또는 SF3B4 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.According to the method of the present invention, a sample to be analyzed may be contacted with cells containing or expressing the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene or a protein thereof first. Here, the “sample” refers to an unknown substance used in screening to examine whether it affects the expression level of BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of protein, or the activity of the protein. The sample may include, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNA, small interference RNA (siRNA), and natural product extracts. Thereafter, the expression level of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of the protein, or the activity of the protein can be measured in the sample-treated cells, and as a result of the measurement, the expression level of the BANF1, PLOD3 or SF3B4 gene, the amount of the protein, or the protein When it is determined that the activity is decreased, the sample may be determined as a substance capable of treating or preventing liver cancer.
상기에서 활성 측정 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.In the above activity measurement method can be performed through various methods known in the art, for example, but not limited to, reverse transcriptase-polymerase chain reaction (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), real-time polymerase chain reaction ( Real time-polymerase chain reaction), Western blot, Northern blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion and immunoprecipitation assay can do.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of Examples. However, these Examples are for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.
<준비예><Preparation example>
시료준비Sample preparation
하기 실험을 위해 3개의 독립적인 간질환 환자 코호트를 사용하였다. 코호트 1(107 tissues from 81 patients, snap-frozen tissue)은 유전자 발현 마이크로어레이에 사용되었고, 코호트 2(546 tissues from 546 patients, tissue microarray)는 조직 마이크로어레이에 사용되었으며, 코호트 3((160 tissues from 70 patients, full section)은 면역조직화학법에 사용하였다. 이들 3개 군의 코호트에 대한 임상 병리학적 특징은 하기 표 1에 나타내었다.Three independent cohorts of liver disease patients were used for the following experiments. Cohort 1 (107 tissues from 81 patients, snap-frozen tissue) was used for gene expression microarray, Cohort 2 (546 tissues from 546 patients, tissue microarray) was used for tissue microarray, and Cohort 3 ((160 tissues from 70 patients, full section) were used for immunohistochemistry The clinical pathological characteristics of the cohorts of these three groups are shown in Table 1 below.
[표 1][Table 1]
생존율(Progression free survival)은 수술 날짜와 특정 형태의 재발이 진단된 날짜 사이의 간격으로 정의하였다. 또한 모든 피험자로부터는 선언에 기초하여 서면 동의를 얻었고, 본 연구는 가톨릭대학교 의과대학((IRB 승인 번호 : MC12EISI0106, MC12SNMI0184)의 IRB(Institutional Review of Board) 승인을 받아 진행하였다. Progression free survival was defined as the interval between the date of surgery and the date of diagnosis of a specific type of recurrence. In addition, written consent was obtained from all subjects based on the declaration, and this study was conducted with the approval of the Institutional Review of Board (IRB) of the Catholic University of Korea (IRB approval number: MC12EISI0106, MC12SNMI0184).
<실험방법><Experiment method>
① 조직 마이크로어레이 및 면역조직화학염색① Tissue microarray and immunohistochemical staining
조직 마이크로어레이(TMA; tissue microarray) 구축을 위해, 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀으로 임베드한 코호트 2(n=546) 환자군의 간암 조직을 병리학자가 점수를 체크할 수 있도록 매핑하였다. 간 조직은 각각의 블록을 펀칭하였고 0.6mm 직경의 스틸레토(stylet)를 이용하여 5mm 두께의 섹션이 되도록 잘라 파라핀 블록에 넣었다. 섹션을 접착성 전사테이프 방법을 이용하여 슬라이드에 접착시켰고 자외선 조사로 교차결합 시켰다. 각 단백질 수준을 조사하기 위해 TMA 및 전체 절편 시료에 대해 하기 표 2의 항체들을 이용하여 면역조직염색을 수행하였다.For the construction of a tissue microarray (TMA), liver cancer tissues of a group of patients from Cohort 2 (n=546), which were fixed with formalin and then embedded with paraffin, were mapped so that a pathologist could check the score. Liver tissue was punched out of each block and cut into sections with a thickness of 5 mm using a 0.6 mm diameter stylet and placed in a paraffin block. Sections were adhered to slides using an adhesive transfer tape method and crosslinked by UV irradiation. To investigate the level of each protein, immunohistochemistry was performed using the antibodies in Table 2 below for TMA and whole section samples.
[표 2][Table 2]
웨스턴블럿 및 조직마이크로 어레이에 사용된 항체 목록List of Antibodies Used for Western Blot and Tissue Microarray
② TCGA 및 NCBI GEO 데이터 분석② TCGA and NCBI GEO data analysis
HCC에서 HCC 마커의 발현수준을 재구성하기 위해, 데이터는 TCGA 간 간세포 암종 프로젝트와 NCBI GEO 데이터베이스 (수탁 번호 : GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE44106, GSE45436, GSE54236, GSE80861, GSE89377 및 GSE93392)로부터 수득하였다. TCGA RNA-seq 데이터는 먼저 모든 RPKM 값을 교체 한 후 log2로의 변형이 적용되도록 분석하였다.To reconstruct the expression level of HCC markers in HCC, data were obtained from the TCGA hepatocellular carcinoma project and the NCBI GEO database (accession numbers: GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE44106, GSE45436, GSE54236, GSE80861, GSE89377 and GSE93392). . TCGA RNA-seq data were first analyzed so that all RPKM values were replaced and then the transformation to log2 was applied.
③ 마이크로어레이 분석③ Microarray analysis
대규모 유전자 발현 프로파일링을 위해 코호트 1 환자군의 냉동된 간 조직을 유전자 발현 마이크로 어레이 분석에 사용하였다. 코호트 1 환자군의 시료로부터 3개의 독립적인 세트를 선택하고 TRIzol 시약을 이용하여 총 RNA를 추출한 다음, Illumina Total-Prep RNA 증폭 Kit 컬럼(Ambion Inc., Austin, TX)을 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA의 품질 조절은 ExperionTM 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 수행하였고, 마이크로어레이 분석은 HumanHT-12 V4 Expression BeadChips (Illumina, Inc., San Diego, CA)을 이용하여 분석하였다. 바이오틴화된 cRNA는 MessageAmp kit (Ambion, Inc.)를 이용하여 정제하였으며, 칩(chips)의 혼성과 스캐닝은 Illumina의 표준방법에 따라 수행하였다. 일차 마이크로어레이 데이터는 GEO 데이터베이스에서(GSE89377)에서 이용할 수 있다. For large-scale gene expression profiling, frozen liver tissues from
④ 웨스턴블럿 분석④ Western blot analysis
환자의 냉동 조직 및 세포들은 단백질 추출버퍼((50 mM HEPES, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Na2P2O7, 1 mM Na3VO4, 100 x Halt protease inhibitor cocktail)로 용해시켰다. 동량의 단백질을 함유한 용해물들은 SDS-PAGE 상에서 전기 영동하였고, PVDF 막으로 전기이동시킨 후, 블록킹 버퍼(5% skimmed milk in Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20)로 블록킹 반응을 수행한 다음, 상기 표 2의 항체들을 이용하여 반응시켜 웨스턴블럿을 수행하였다.The patient's frozen tissues and cells were prepared in protein extraction buffer (50 mM HEPES, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 10 mM Na2P2O7, 1 mM Na3VO4, 100 x Halt protease inhibitor cocktail). Lysates containing the same amount of protein were electrophoresed on SDS-PAGE, electrophoresed on a PVDF membrane, and blocked with a blocking buffer (5% skimmed milk in Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20). After performing a reaction using the antibodies of Table 2, Western blotting was performed.
⑤ 세포 이동 및 침윤 분석(Motilityand invasion assay)⑤ Cell migration and invasion assay (Motility and invasion assay)
In vitro 상에서 세포 이동 및 침윤 분석을 수행하였는데, 세포 이동은 수정된 Boyden chamber 분석(BD Bioscience)으로 수행하였고, 침윤 분석은 Matrigel (BD Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 침윤 분석을 위해 Matrigel을 0.3mg/ml의 농도가 되도록 코팅 버퍼로 희석하였다. 이후 100ul로 분주한 희석된 Matrigel 용액을 트랜스웰 세포 배양 삽입물의 일부분으로 덮었고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 삽입물(인서트)을 시드할 준비를 하였다. si-SF3B4로 세포를 형질감염시킨 후, 세포들을 트랜스웰 인서트에 도포하였고 화학유인물질로서 5%의 FBS가 함유된 혈청이 없는 배지를 사용하여 배양하였다. 각 분석을 위한 세포 배양 후(세포이동: 시간 배양, 침윤 분석: 12시간)이동되었거나 침윤된 세포들을 Diff-Quik staining kit (Sysmex, Japan)을 이용하여 염색하였으며, Axiovert 200 인버티드 현미경(Zeiss, Jena, Germany)으로 200배 배율로 관찰하였다.Cell migration and invasion assays were performed in vitro. Cell migration was performed using a modified Boyden chamber assay (BD Bioscience), and invasion assays were performed using Matrigel (BD Biosciences). For infiltration analysis, Matrigel was diluted with a coating buffer to a concentration of 0.3 mg/ml. Then, 100ul of diluted Matrigel solution was covered with a portion of the transwell cell culture insert, and after culturing at 37° C. for 1 hour, the insert (insert) was prepared for seeding. After transfection of cells with si-SF3B4, cells were applied to transwell inserts and cultured using serum-free medium containing 5% FBS as a chemoattractant. After cell culture for each assay (cell migration: time culture, invasion assay: 12 hours), migrated or infiltrated cells were stained using a Diff-Quik staining kit (Sysmex, Japan), and an
⑥ 메조포러스 실리카 나노입자의 형질감염⑥ Transfection of mesoporous silica nanoparticles
BANF1, PLOD3 및 SF3B4에 대한 특이적 si-RNA는 80 ul InViVojectionTM RNAi-나노 시약(mesoporous silica nanoparticle, Cat. No. DHMSN-vivoRNA; Lemonex Inc., Seoul, Korea)에 3nmol의 농도로 첨가하였고, 200ul의 PBS 용액을 준비하였다. MSNs 및 si-RNA 의 혼합물을 H-ras 형질전환된 HCC 마우스 모델에 9~23주 동안 매주 꼬리에 정맥주사하였다. 이후 초음파 장비를 이용하여 17주, 19주 및 21일 주째에 각각 초음파 영상 촬영을 하여 영상이미지를 수집하였다. Specific si-RNA for BANF1, PLOD3 and SF3B4 was added to 80 ul InViVojection™ RNAi-nano reagent (mesoporous silica nanoparticles, Cat. No. DHMSN-vivoRNA; Lemonex Inc., Seoul, Korea) at a concentration of 3 nmol, and 200 ul of PBS solution was prepared. A mixture of MSNs and si-RNA was intravenously injected into the tail every week for 9 to 23 weeks in H-ras transgenic HCC mouse models. Then, using an ultrasound device, ultrasound images were taken at 17 weeks, 19 weeks, and 21 days, respectively, and image images were collected.
세포들은 밤새도록 배양한 후, Diff-Quik 염색 키트(Sysmex, Chuo-ku, Cobe, Japan)를 이용하여 염색하였다. 세포 이미지는 ×200배 배율로 Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였고, 3개의 무작위 이미지 필드에서 세포수를 카운팅하였다. Cells were cultured overnight, and then stained using a Diff-Quik staining kit (Sysmex, Chuo-ku, Cobe, Japan). Cell images were observed using an
⑦ 간암 이식 마우스 모델제조⑦ Manufacture of liver cancer transplantation mouse model
이종이식 종양 형성 분석을 위해, 1 × 107 세포의 형질감염용 세포를 0.2For xenograft tumorigenesis assays, 1 × 10 7 cells for transfection were
ml PBS (pH 7.4) 및 30 % (v / v) 마트리겔 매트릭스 (BD Biosciences)와 혼합하였다. 상기 세포 현탁액을 6 주령 수컷 Balb / c 누드 마우스에 피하 주사 하였다. 마우스를 일주일에 2번씩 주사 부위에서의 종양 형성 여부를 관찰하였다. 종양부피는 0.5 × 길이 (L) × 너비2 (W2)로 계산하였다. 각 실험군은 10 마리의 마우스로 구성하였고, 종양 성장은 캘리퍼스를 사용하여 세 직교 방향으로 종양 크기를 측정하였다. 결과는 평균 종양 부피 및 95%의 신뢰구간으로 표시하였다. H-ras12V가 활성화된 동형접합 형질전환 마우스는 유대열 박사(인간 유전체 연구실, 한국 연구실, 한국 생명 공학 연구소, 대전)로부터 입수하여 사용하였다. 형질전환 마우스는 H-ras12V가 활성화된 마우스이다. 수컷 마우스는 15주령부터 HCC가 자발적으로 발달되기 시작하였다. 이에 본 발명자들은 5마리의 35주령된 마우스로부터 비종양 조직과 HCC 조직을 절제하여 수득하였고, 3쌍의 HCC 조직을 선택하여 병리학적 조사를 수행하였다. 이때 HCC의 유도는 DEN(Diethylnitrosamine)를 이용하여 수행하였다. ml PBS (pH 7.4) and 30% (v/v) Matrigel matrix (BD Biosciences). The cell suspension was injected subcutaneously into 6-week-old male Balb/c nude mice. Mice were observed twice a week for tumor formation at the injection site. Tumor volume was calculated as 0.5 × length (L) × width 2 (W 2 ). Each experimental group consisted of 10 mice, and tumor growth was measured in three orthogonal directions using calipers. Results were expressed as mean tumor volume and 95% confidence intervals. Homozygous transgenic mice with H-ras12V activation were obtained from Dr. Yoo-Yeol Yoo (Human Genome Lab, Korea Lab, Korea Biotechnology Research Institute, Daejeon) and used. Transgenic mice are mice in which H-ras12V is activated. In male mice, HCC began to develop spontaneously from the age of 15 weeks. Accordingly, the present inventors obtained by excising non-tumor and HCC tissues from 5 35-week-old mice, and selected 3 pairs of HCC tissues for pathological investigation. At this time, the induction of HCC was performed using DEN (Diethylnitrosamine).
⑧ 통계 분석⑧ Statistical analysis
생존 곡선은 Kaplan-Meier 제품 한계 법을 사용하여 플롯되도록 하였고, 생존 곡선의 차이는 log-rank test를 사용하여 결정하였다. 모든 실험은 적어도 3 회 수행하였고, 모든 샘플은 3 중으로 분석하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD) 또는 평균의 표준 에러(SEM)로 나타내었다. Graphpad ™ 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 unpaired 양측 스튜던트 t- 테스트에 의해 그룹 간의 통계적 차이를 평가하였다. p < 0.05인 것에 대해 통계적으로 유의미한 것으로 판단하였으며, 카이 제곱 검정 (2-양면)은 매개 변수 간의 연관을 결정하는데 사용하였다.Survival curves were plotted using the Kaplan-Meier product limit method, and differences in survival curves were determined using the log-rank test. All experiments were performed at least in triplicate, and all samples were analyzed in triplicate. Results are expressed as mean ± standard deviation (SD) or standard error of mean (SEM). Statistical differences between groups were assessed by unpaired two-tailed Student's t-test using Graphpad™ 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA). Those with p < 0.05 were judged to be statistically significant, and a chi-square test (two-sided) was used to determine the association between parameters.
⑨ RNA 및 DNA 분리, RT-PCR 및 qRT-PCR 분석 ⑨ RNA and DNA isolation, RT-PCR and qRT-PCR analysis
총 RNA는 동결된 조직 및 세포주로부터 TRIzol 시약을 이용하여 분리하였다.총 RNA의 1ug은 Tetro cDNA Synthesis Kit (Bioline, London, UK)을 이용한 역전사 반응으로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 반응은 nTaq DNA polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 수행하였고, Gel Doc XR image system (Bio-Rad, Hercules, CA)로 ethidium bromide 반응에 의한 DNA 여부를 확인하였다. qRT-PCR은 SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline)를 이용하여 수행하였고 iQ™-5 (Bio-Rad)를 이용하여 실시간 모니터링 하였다. 3중 분석에 의한 평균 Ct는 추가 계산에 사용하였다. 정상화 된 유전자 발현은 상대적인 정량화 방법을 사용하여 결정하였다. 결과는 3 회의 실험 평균값으로 나타내었다. 조직 및 세포의 게놈 DNA는 DNAzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 설명서에 따라 추출 및 분리하였다. 카피수 변이분석을 위해, SF3B4 게놈 DNA 영역은 Genbank accession No. NC_000001.11의 게놈서열에 따라 엑손 -1에서 인트론 1까지를 커버하는 프라이머 세트를 이용하여 20쌍(비종양 및 종양)의 HCC 조직으로부터 증폭하였다. qRT-PCR은 상기 기술한 방법과 같이 반응시켰고, 글리세롤 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소는 내인성 로딩 대조군으로 사용하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표에 나타내었다.Total RNA was isolated from frozen tissues and cell lines using TRIzol reagent. 1 ug of total RNA was synthesized by reverse transcription using Tetro cDNA Synthesis Kit (Bioline, London, UK). RT-PCR reaction was performed using nTaq DNA polymerase (Enzynomics, Daejeon, Korea), and DNA by ethidium bromide reaction was confirmed with Gel Doc XR image system (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT-PCR was performed using SensiFAST SYBR No-ROX Kit (Bioline) and real-time monitoring was performed using iQ™-5 (Bio-Rad). The mean Ct from triplicate analysis was used for further calculations. Normalized gene expression was determined using relative quantification methods. The results are presented as the average value of three experiments. Genomic DNA of tissues and cells was extracted and isolated using DNAzol reagent (Invitrogen) according to the instructions. For copy number variation analysis, the SF3B4 genomic DNA region was identified as Genbank accession No. According to the genome sequence of NC_000001.11, using a primer set covering exon-1 to
[표 3][Table 3]
프라이머 서열primer sequence
⑩ 세포배양⑩ Cell culture
인간 HCC 세포주(Hep3B, PLC/PRF/5, SK-Hep-1, SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-423, SNU-449) 및 Hepa-1c1c7 마우스 간안 세포주는 한국세포주 은행 (Seoul, South Korea)으로부터 입수하여 사용하였다. 불멸화된 간 세포주인 MIHA 및 L-02는 Dr. Jayanta Roy-Chowdhury (Albert Einstein College of Medicine, New York, NY)가 제공하여 사용하였다. 각 세포주들은 10% FBS, 100units/mL penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 함유된 EMEM (American Type Culture Collection, Manassas, VA), RPMI-1640 또는 DMEM 배지에서 배양하였고, 모든 배양은 5% 이산화탄소 및 37℃의 온도가 유지되는 조건에서 배양하였다.Human HCC cell lines (Hep3B, PLC/PRF/5, SK-Hep-1, SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-423, SNU-449) and Hepa-1c1c7 mouse liver cell lines were obtained from the Korea Cell Line Bank ( Seoul, South Korea) was obtained and used. Immortalized liver cell lines MIHA and L-02 were developed by Dr. Jayanta Roy-Chowdhury (Albert Einstein College of Medicine, New York, NY) provided and used. Each cell line was cultured in EMEM (American Type Culture Collection, Manassas, VA), RPMI-1640 or DMEM medium containing 10% FBS, 100 units/mL penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA), and all cultures were 5% It was cultured under conditions in which carbon dioxide and a temperature of 37°C were maintained.
⑪ 형질감염(transfection)⑪ Transfection
형질감염을 위한 siRNA들은 Genolution (Seoul, Korea)에서 합성하여 사용하였거나 바이오니아(대전, 한국)에 의뢰하여 합성한 것을 사용하였다. si-RNA의 염기서열은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다. 1.4Kb human KLF4 ORF (NM_004235)가 pcDNA3.1+/C-(K)-DYK 플라스미드에 서브클로닝된 KLF4 발현 플라스미드는 GenscriptTM (Piscataway, NJ)로부터 구입하여 사용하였다. 형질감염은 Lipofectamine RNAiMAX 또는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. SF3b 복합체 억제제인 Spliceostatin A(SSA)는 AdooQ Bioscience (Cat No. A12700; Irvine, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. siRNAs for transfection were either synthesized by Genolution (Seoul, Korea) or synthesized by Bioneer (Daejeon, Korea). The nucleotide sequence of the si-RNA is shown in Table 4 below. A KLF4 expression plasmid in which 1.4Kb human KLF4 ORF (NM_004235) was subcloned into pcDNA3.1+/C-(K)-DYK plasmid was purchased from Genscript™ (Piscataway, NJ) and used. Transfection was performed using Lipofectamine RNAiMAX or Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen). Spliceostatin A (SSA), an SF3b complex inhibitor, was purchased from AdooQ Bioscience (Cat No. A12700; Irvine, CA, USA).
[표 4][Table 4]
siRNA 서열siRNA sequence
⑫ 세포성장 및 세포증식 분석⑫ Cell growth and cell proliferation analysis
세포성장 분석을 위해 먼저 12웰 플레이트에 세포가 30%정도 차도록 분주하였다. 형질감염 및 억제제를 처리한 후, 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 포르마잔 크리스탈은 DMSO로 용해시키고 VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. For cell growth analysis, cells were first aliquoted in a 12-well plate so that the cells were filled to about 30%. After transfection and treatment with the inhibitor, 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) was treated and reacted for 1 hour. Formazan crystals were dissolved in DMSO and absorbance was measured at 570 nm using a VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA).
세포증식 분석을 위해, 24웰 플레이트에 세포가 30%정도 차도록 분주하였다. 형질감염 후, 세포에 BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)를 처리하고 2시간 동안 반응시킨 후, 상온에서 30분 동안 고정시켰다. 세포들을 anti-BrdU에 대한 항체로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 미반응된 항체들은 세척 버퍼로 세척하여 제거하였다. Horseradish peroxidase-결합된 2차 항체를 각 웰에 첨가하고, 이후 기질 용액을 첨가하여 반응시킨 후, 반응정지 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 최종 반응산물을 VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer)를 이용하여 490nm의 흡광도에서 측정하였다. For cell proliferation analysis, the cells were aliquoted to about 30% of the cells in a 24-well plate. After transfection, the cells were treated with BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) and reacted for 2 hours, and then fixed at room temperature for 30 minutes. Cells were reacted with an anti-BrdU antibody for 1 hour at room temperature. Unreacted antibodies were removed by washing with a wash buffer. Horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody was added to each well, and then a substrate solution was added to react, and then a reaction stop solution was added to terminate the reaction. The final reaction product was measured at absorbance at 490 nm using a VICTOR3™ multilabel plate reader (PerkinElmer).
⑬ 집락형성 분석(Clonogenic assay)⑬ Clonogenic assay
6웰 플레이트에 세포들을 분주하고((1000 cells/well) si-대조군 및 si-SF3B4로 세포들을 형질감염 시켰다. 2주 후 형성된 세포 콜로니를 포름알데히드(1% v/v)로 30분 동안 상온에서 고정시키고 크리스탈 바이올렛(0.5% v/v)으로 염색하였다. 형성된 콜로니의 수는 클론 카운터 프로그램을 이용하여 분석하였다.in 6 well plate Cells were aliquoted ((1000 cells/well) and transfected with si-control and si-SF3B4. After 2 weeks, the formed cell colonies were fixed with formaldehyde (1% v/v) at room temperature for 30 minutes and crystals. Stained with violet (0.5% v/v) The number of colonies formed was analyzed using a clone counter program.
⑭ 상처 치유 분석⑭ wound healing analysis
형질감연된 세포들을 6웰 플레이트에 분주하고 세포들이 100%가 되도록 플레이트를 가득채우면, micropipette tip을 이용하여 스크래치를 내었다. 이후 스트래치가 있는 영역의 이미지를 시간별로 IX70 fluorescence inverted microscope (Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다. The transfected cells were aliquoted into a 6-well plate, and when the plate was filled so that the cells were 100%, a scratch was made using a micropipette tip. Thereafter, images of the stretched region were observed using an IX70 fluorescence inverted microscope (Olympus, Tokyo, Japan) for each time period.
⑮ 세포사멸 분석⑮ apoptosis assay
세포사멸 정도를 분석하기 위해 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하였다. 형질감염 후, 간암 세포들을 차가운 PBS 버퍼로 세척하였고 1× 바인딩버퍼로 현탁하였다. 1×105 세포들을 5ml 배양 튜브로 옮기고 5ul의 annexin V-FITC 및 10 ul propidium iodide 용액을 첨가하여 혼합하였다. 20분 동안 상온에서 암 조건하에 반응시키고 400ul의 1× 바인딩버퍼를 각 튜브에 첨가한 후, FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 세포사멸이 발생된 분획을 분석하였다.Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Jose, CA) was used to analyze the degree of apoptosis. After transfection, liver cancer cells were washed with cold PBS buffer and suspended in 1× binding buffer. 1×10 5 cells were transferred to a 5ml culture tube, and 5 ul of annexin V-FITC and 10 ul propidium iodide solution were added and mixed. After reacting under dark conditions at room temperature for 20 minutes, 400ul of 1× binding buffer was added to each tube, and apoptotic fractions were analyzed using a FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences).
세포주기 분석cell cycle analysis
간암 세포주를 si-SF3B4로 형질감염 시키고, 48시간 동안 배양한 다음 트립신 처리로 형질감염된 세포를 수집하였다. 이후 차가운 PBS 버퍼로 세척하고 70% 에탄올로 고정시킨 후, 1mg/ml RNase가 함유된 200ul의 PBS로 현탁한 후, 암 조건에서 37℃의 온도로 30분 동안 반응시켰다. 핵은 50 ug/ml propidium iodide (BD Biosciences)로 염색하였고, 염색된 세포 분획들은 Cell-Quest FACS analysis software (BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. The liver cancer cell line was transfected with si-SF3B4, cultured for 48 hours, and then the transfected cells were collected by trypsinization. After washing with cold PBS buffer, fixed with 70% ethanol, suspended in 200ul of PBS containing 1mg/ml RNase, and reacted at a temperature of 37°C in dark conditions for 30 minutes. Nuclei were stained with 50 ug/ml propidium iodide (BD Biosciences), and the stained cell fractions were analyzed using Cell-Quest FACS analysis software (BD Biosciences).
<실시예 1><Example 1>
전암성 병변에서 잠재적 간암 진단 마커의 동정Identification of potential liver cancer diagnostic markers in precancerous lesions
전암성 병변(premalignant lesion)에서 간세포암(HCC)과 관련된 유전자의 발현 특성을 확인하기 위해 임상 병리학 데이터와 유전자 발현을 다음과 같은 비 편향분석 방법으로 분석하였다. 여기서 전암성 병변은 간암으로 넘어가기 전 단계를 말하는 것으로 간암에 준하는 치료를 요구하지 않는 상태이다. To confirm the expression characteristics of HCC-related genes in premalignant lesions, clinical pathology data and gene expression were analyzed using the following non-biased analysis method. Here, a precancerous lesion refers to a stage prior to liver cancer and does not require treatment equivalent to liver cancer.
먼저, 전체 전사체학(transcriptome) 발현 마이크로어레이를 이용하여 정상 간조직(13개 조직); 8개의 저등급 섬유증(LGCH; low-grade fibrosis) 및 12개의 고등급 섬유증(HGCH;high-grade fibrosi)를 포함하는 만성 간염 조직; 간 경화 조직 12개; 11개의 저등급 이형성 노드(LGDN; low-grade DN) 및 11개의 고등급 이형성 노드(HGDN; high-grade DN)을 포함하는 이형성 노드(DN; dysplastic nodule); 조기 간세포암 조직(eHCC) 5개; Edmonson Grade 1(G1) 9개, G2 12개 및 G3 14개를 포함하는 간세포암 조직;을 분석하였다. 상기와 같은 본 발명에 따른 잠재적 암 진단 마커의 동정 순서에 대한 모식도는 도 1에 나타내었다. First, normal liver tissues (13 tissues) using whole transcriptome expression microarray; chronic hepatitis tissue, including 8 low-grade fibrosis (LGCH) and 12 high-grade fibrosis (HGCH); 12 pieces of liver cirrhosis; a dysplastic nodule (DN) comprising 11 low-grade DN (LGDN) and 11 high-grade DN (HGDN); 5 early hepatocellular carcinoma tissue (eHCC); Hepatocellular carcinoma tissues including Edmonson Grade 1 (G1) 9,
계층적 클러스터링 분석 결과, 만성 간 질환(LGCH, HGCH, 간경변증 및 LGDN), 초기 간암 (HGDN, eHCC 및 G1) 및 간암 HCC (G2 및 G3)과 같이 3개의 구별된 서브클러스터로 구분되는 계통도를 나타내었다(도 2a 참조). 또한 LGDN, HGDN, eHCC 및 G1에 대한 재분석 결과, LGDN은 간세포암의 초기 단계인 것으로 확인 되었다(도 2b 참조). 따라서 HGDN은 초기 단계의 간세포암의 시작을 나타내는 특징이라는 것을 알 수 있었으며, 전암성 병변(precancerous lesion)은 드라이버 유전자(driver gene) 활성의 시작 부위가 될 수 있으며 이후 간세포암으로 발전될 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 전암 병변, 즉 HGDN 내에서 잠재적 간세포암을 예측하는 유전자 세트를 확인하기 위한 유전자의 선택 전략을 디자인했다. Hierarchical clustering analysis revealed a phylogenetic tree divided into three distinct subclusters: chronic liver disease (LGCH, HGCH, cirrhosis and LGDN), early liver cancer (HGDN, eHCC and G1), and liver cancer HCC (G2 and G3). was (see Fig. 2a). In addition, as a result of re-analysis of LGDN, HGDN, eHCC and G1, it was confirmed that LGDN is an early stage of hepatocellular carcinoma (see FIG. 2b ). Therefore, it was found that HGDN is a characteristic indicative of the initiation of HCC at an early stage, and a precancerous lesion can be a starting site for driver gene activity, which can later develop into HCC. Based on these results, the present inventors designed a gene selection strategy to identify a set of genes predicting potential hepatocellular carcinoma within precancerous lesions, i.e., HGDN.
LGDN에서 G1 HCC까지의 각 분자 특성은 LGDN vs HGDN, LGDN vs eHCC /G1 HCC, HGDN vs eHCC / G1 HCC에 대해 분석하였다. 690개의 유전자들 중에서 8개의 유전자가 LGDN에서 간세포암(HCC)으로 진행될수록 점진적으로 발현이 증가되는 것으로 나타났다(도 2c 참조).Molecular characteristics from LGDN to G1 HCC were analyzed for LGDN vs HGDN, LGDN vs eHCC /G1 HCC, and HGDN vs eHCC / G1 HCC. Of the 690 genes, 8 genes showed a progressive increase in expression as they progressed from LGDN to hepatocellular carcinoma (HCC) (see FIG. 2c ).
다음으로, HCC로의 진행을 전암성 병변인 HGDN에서 확인할 수 있는 분자를 선택하기 위해 ROC(receiver operating characteristic) 곡선의 비교 분석을 수행하였다(도 2d 참조).Next, a comparative analysis of the ROC (receiver operating characteristic) curve was performed to select molecules that can confirm progression to HCC in HGDN, a precancerous lesion (see FIG. 2D ).
분석 결과, 85개의 유전자 중에서 13개가 0.8 이상인 AUC(area under the curve) 값을 나타내어 특이성 및 민감성이 있는 마커들로의 사용 가능함을 예측할 수 있었고(하기 표 5 참조), Cancer Genome Atlas 간세포 암종 (TCGA_LIHC) 데이터 수집 및 National Biotechnology Information Center (NCBI)의 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스에서 제공되는 HCC 환자의 대규모 코호트에서 13 가지 유전자의 발현을 분석하였다. As a result of the analysis, 13 out of 85 genes showed an area under the curve (AUC) value of 0.8 or higher, so it could be predicted that they could be used as markers with specificity and sensitivity (see Table 5 below), and Cancer Genome Atlas hepatocellular carcinoma (TCGA_LIHC). ) data collection and analysis of the expression of 13 genes in a large cohort of HCC patients provided from the Gene Expression Omnibus (GEO) database of the National Biotechnology Information Center (NCBI).
[표 5][Table 5]
ROC 분석 결과에 따른 13개의 후보 유전자 13 candidate genes according to ROC analysis results
그 결과, 3 개의 유전자(ALKBH2, HSD3B7, PARP10)는 비종양과 비교하여 HCC에서 지속적인 과발현(>1.5배)을 보이지 않았기 때문에 제외시켰다(6개의 테스트 코호트에서 <50%, 하기 표 6 참조)).As a result, three genes (ALKBH2, HSD3B7, PARP10) were excluded because they did not show persistent overexpression (>1.5-fold) in HCC compared to non-tumor (<50% in 6 test cohorts, see Table 6 below)) .
[표 6][Table 6]
간암 환자의 대규모 코호트에서 초기 HCC 드라이버 유전자 후보들의 발현수준Expression levels of early HCC driver gene candidates in a large cohort of liver cancer patients
이후, TCGA_LIHC 데이터 코호트와 107개의 HCC 세트 모두에서 과발현되는 것으로 나타나는 10 개의 후보 마커 유전자를 확인하였다(도 3a 및 3b 참조). Then, 10 candidate marker genes that appeared to be overexpressed in both the TCGA_LIHC data cohort and the 107 HCC set were identified (see FIGS. 3A and 3B ).
그런 뒤, 주위의 비종양 조직과 비교하여 HCC에서 이들 10개 유전자의 과발현을 확인하기 위해, 546개의 HCC(140개 G1, 297개 G2 및 109개 G3)를 함유하는 조직 마이크로 어레이 (TMA)를 사용하여 면역조직화학분석(IHC)을 수행하였다. Then, to confirm the overexpression of these 10 genes in HCC compared to the surrounding non-tumor tissue, a tissue microarray (TMA) containing 546 HCCs (140 G1, 297 G2 and 109 G3) was constructed. Immunohistochemical analysis (IHC) was performed using
그 결과, 10개 마커 후보 유전자 중에서 정상 간 조직 (NL)에 비해 CYC1, FAM83H, MAD3 및 MELK는 간세포 암에서 유의하게 과발현되지 않는 것으로 나타났고(도 2e 참조), HCC 환자의 임상 병리학 데이터 및 발현의 다변량 분석을 바탕으로 BANF1, PLOD3 및 SF3B4를 후보 마커로 선택했다(하기 표 7 참조).As a result, compared to normal liver tissue (NL) among 10 marker candidate genes, CYC1, FAM83H, MAD3 and MELK were not significantly overexpressed in hepatocellular carcinoma (see Fig. 2e), and clinical pathology data and expression of HCC patients BANF1, PLOD3 and SF3B4 were selected as candidate markers based on the multivariate analysis of (see Table 7 below).
[표 7][Table 7]
코호트 2에서(n=546) 10개 유전자에 대한 임상병리학적 특징과 발현 분석결과 Clinicopathological characteristics and expression analysis results for 10 genes in cohort 2 (n=546)
<실시예 2><Example 2>
전암성 병변에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4에 대한 간세포암 결정 마커로서의 검증Validation as hepatocellular carcinoma determinant markers for BANF1, PLODS3 and SF3B4 in precancerous lesions
전암성 병변에서 간세포암에 대한 결정 마커로서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4의 사용 가능성을 검증하기 위해, HGDN으로부터 전이된(transitioning) 6개의 조기 간세포암 전체 섹션을 이용하여 면역조직화학분석(IHC)을 수행하였다. To validate the feasibility of using BANF1, PLODS3 and SF3B4 as definitive markers for hepatocellular carcinoma in precancerous lesions, immunohistochemical analysis (IHC) was performed using whole sections of six early hepatocellular carcinoma transitioning from HGDN. did.
그 결과, 예상한 바와 같이 10개 후보 마커 중에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4이 조기 간세포암(eHCC) 및 HGDN에서 모두 강하게 과발현 또는 양성 발현되는 것으로 나타났다. 반면 비종양 부위에서는 1개만 양성발현되는 것으로 나타났다(도 4a 참조). 또한 나머지 6개의 마커는 재생 결절(regenerating nodules (RNs)) 내에서 비종양 조직 주변과 eHCC에서 유의한 차이를 보이지 않았다. As expected, BANF1, PLODS3 and SF3B4 among the 10 candidate markers were strongly overexpressed or positively expressed in both early hepatocellular carcinoma (eHCC) and HGDN. On the other hand, only one was found to be positively expressed in the non-tumor site (see FIG. 4a ). In addition, the remaining 6 markers did not show a significant difference in the non-tumor tissue periphery and eHCC within the regenerating nodules (RNs).
또한, 3개의 유전자인 GPC3, GS 및 HSP70은 DN, 간세포 선종 및 국소 결절 증식을 포함하는 다른 종양 병소와 eHCC의 구별이 가능한 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 55 명의 조기 간암과 105 명의 RN을 포함한 70 개의 전체 섹션을 대상으로 3 개의 기존 마커 (CMs; GPC3, GS 및 HSP70)와 본 발명에서 새롭게 동정한 신규 마커 (NMs; BANF1, PLOD1, SF3B4)에 대해 비교 IHC 분석을 수행하였다.In addition, three genes, GPC3, GS and HSP70, are known to be capable of differentiating eHCC from other tumor lesions including DN, hepatocellular adenoma, and focal nodular proliferation. Accordingly, the present inventors studied three existing markers (CMs; GPC3, GS and HSP70) and a novel marker newly identified in the present invention (NMs; BANF1, PLOD1, Comparative IHC analysis was performed for SF3B4).
그 결과, HCC에서 2개 이상의 종래 마커 유전자의 발현 양성율(≥2 (+) / 3 CM 이상)은 50.9 % (28/55)로 나타났고, 반면 HCC에서 본 발명에서 규명한 2개 이상의 신규 마커 유전자의 발현 양성율(2개 이상 (+) / 3 NM)은 72.7 % (40/55)로 나타났다(도 4b 및 표 8 참조). 또한 HCC에서 종래 마커의 음성 발현율(≤1 (+) / 3 CM)은 49.1 % (27/55) 였고, 본 발명의 신규 마커의 음성 발현율(≤1 (+) / 3 NMs)은 27.3 % (15/ 55)인 것으로 나타났다.As a result, the positive expression rate (≥2 (+) / 3 CM or more) of two or more conventional marker genes in HCC was 50.9% (28/55), whereas the two or more novel markers identified in the present invention in HCC The gene expression positive rate (2 or more (+) / 3 NM) was 72.7% (40/55) (see Fig. 4b and Table 8). In addition, the negative expression rate (≤1 (+) / 3 CM) of the conventional marker in HCC was 49.1% (27/55), and the negative expression rate (≤1 (+) / 3 NMs) of the novel marker of the present invention was 27.3% ( 15/55).
[표 8][Table 8]
기존마커와 본 발명의 신규마커에 대한 조기 간세포암에서의 발현양상 분석 결과 Results of analysis of expression patterns in early hepatocellular carcinoma for the existing markers and the novel markers of the present invention
또한, 특히 종래마커의 음성발현을 보인 HCC에서 신규 마커의 양성 발현율은 59.3%(16/27)인 것으로 나타났고, 신규마커의 음성 발현을 보인 HCC에서 종래 마커의 양성 발현율은 26.6%(4/15)인 것으로 나타났다(도 4c 참조). 그러나 RNs에서 종래마커와 신규 마커들 간의 음성적인 비율에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 4d 참조).Also, in particular, the positive expression rate of the new marker was found to be 59.3% (16/27) in HCC showing negative expression of the conventional marker, and the positive expression rate of the conventional marker in HCC showing negative expression of the new marker was 26.6% (4/27). 15) (see Fig. 4c). However, there was no significant difference in the negative ratio between the old markers and the new markers in RNs (see FIG. 4d ).
나아가 ROC 곡선 비교 분석 결과, 본원의 신규 마커들이(BANF1, PLOD1, SF3B4) 기존 마커(GPC3, GS 및 HSP70)에 비해 더 우수한 마커라는 것을 확인할 수 있었다(표 9 및 도 5 참조).Furthermore, as a result of ROC curve comparison analysis, it was confirmed that the novel markers of the present application (BANF1, PLOD1, SF3B4) were superior markers compared to the existing markers (GPC3, GS and HSP70) (see Table 9 and FIG. 5).
[표 9][Table 9]
ROC 곡선평가에 의한 조기 HCC 진단용 6개 마커의 진단 성능 분석결과Diagnostic performance analysis result of 6 markers for early HCC diagnosis by ROC curve evaluation
뿐만 아니라, 특히 2세트의 조합 (HSP70, GPC3, BANF1 및 SF3B4)을 사용한 경우, 전암성 병변에서 가장 민감하고 특이적으로 간세포암의 조기 진단이 가능함을 알 수 있었다(하기 표 10 및 도 4e 참조).In addition, it was found that, in particular, when a combination of two sets (HSP70, GPC3, BANF1 and SF3B4) was used, the most sensitive and specific early diagnosis of hepatocellular carcinoma was possible in precancerous lesions (see Table 10 and Fig. 4e below). ).
[표 10][Table 10]
기존마커, 본 발명의 신규마커 및 조합마커에 대한 조기 간암과 재생 결절 간의 ROC 분석 결과 ROC analysis results between early liver cancer and regenerative nodules for existing markers, novel markers of the present invention, and combination markers
환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선 (코호트 2) 분석을 통해, 본 발명의 신규 마커 유전자들의 높은 발현을 보인 간세포암 환자의 무병 생존율이 본 발명의 신규 마커 유전자들의 발현 수준이 낮은 환자보다 유의하게 낮은 것으로 나타났고(도 4f), 이를 통해 본 발명의 신규 마커 유전자들이 HCC의 초기 단계를 유도할 수 있음을 알 수 있었다. Through Kaplan-Meier survival curve (cohort 2) analysis of patients, the disease-free survival rate of HCC patients who showed high expression of the novel marker genes of the present invention was significantly lower than that of patients with low expression levels of the novel marker genes of the present invention. appeared (Fig. 4f), and it was found that the novel marker genes of the present invention can induce the initial stage of HCC.
<실시예 3><Example 3>
간세포암에서의 BANF1, PLODS3 및 SF3B4의 과발현과 이들의 활성 억제를 통한 항암 효과 분석Analysis of anticancer effect through overexpression of BANF1, PLODS3 and SF3B4 and inhibition of their activity in hepatocellular carcinoma
<3-1> 간세포암에서의 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 과발현 확인<3-1> Confirmation of overexpression of BANF1, PLODS3 and SF3B4 in hepatocellular carcinoma
HCC에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 비정상적인 조절은 TCGA_LIHC 데이터 세트 코호트에서 HCC 환자 50쌍과 일치된 쌍으로 확인되었고, 추가로 HCC 조직에서 무작위로 선택된 13 세트를 추가로 qRT-PCR 분석하였다(도 6a 참조). Abnormal regulation of BANF1, PLOD3 and SF3B4 in HCC was identified as matched pairs with 50 HCC patients in the TCGA_LIHC data set cohort, and 13 sets randomly selected from HCC tissues were further analyzed by qRT-PCR (Fig. 6a). Reference).
그 결과, PLOD3과 SF3B4는 인접한 비종양 간 조직 (NL)과 비교하여 13개의 HCC 중에서 9-12개에서 (69-92 %)에서 과발현 되었다 (> 2 배 이상으로 과발현됨). 또한 NL을 가진 eHCC 6 쌍과 인접한 DN 및 NL을 갖는 3 쌍의 eHCC에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과, eHCC에서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 단백질이 월등히 높은 발현 수준을 나타내었다(도 6b 참조).As a result, PLOD3 and SF3B4 were overexpressed (>2-fold or more overexpressed) in 9-12 out of 13 HCCs (69-92%) compared to adjacent non-tumor liver tissue (NL). In addition, as a result of Western blot analysis of 6 pairs of eHCCs with NL and 3 pairs of eHCCs with adjacent DNs and NLs, BANF1, PLOD3 and SF3B4 proteins showed significantly higher expression levels in eHCCs (see FIG. 6b ).
다음으로, GEO 데이터베이스에서 이용 가능한 화학적으로 유도된 마우스 및 쥐 HCC 모델에서 Banf1, Plod3 및 Sf3b4 발현을 재구성하였다. Next, Banf1, Plod3 and Sf3b4 expression was reconstructed in chemically induced mouse and murine HCC models available in the GEO database.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, Banf1, Plod3 및 Sf3b4의 발현은 마우스 및 쥐 모델 모두 상피 종양 (AD), eHCC 및 진행성 HCC (aHCC)에서 상응하는 NL의 상향 조절을 나타내었다. As a result, as shown in Fig. 6c, the expression of Banf1, Plod3 and Sf3b4 showed upregulation of the corresponding NL in epithelial tumors (AD), eHCC and advanced HCC (aHCC) in both mouse and murine models.
이러한 결과 검증을 위해, H-ras 형질 전환 마우스와 DEN(diethylnitrosamine)으로 유도 쥐 HCC 모델을 제조한 후, 웨스턴 블럿을 통해 이들 동물 군에서의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4 발현을 조사하였다.To verify these results, H-ras transgenic mice and DEN (diethylnitrosamine)-induced mouse HCC models were prepared, and BANF1, PLOD3 and SF3B4 expressions in these animal groups were investigated through Western blot.
그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 이들 모두 3가지 마커들의 발현이 증가된 것으로 나타났다.As a result, as shown in FIG. 6D , it was found that the expression of all three markers was increased.
<3-2> BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 암세포의 증식 및 집락형성 억제 다음으로, 간암 발생 과정에서 BANF1, PLOD3, SF3B4의 생물학적 기능을 알아보기 위해 RNAi와 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 이용하여 각 유전자를 넉다운 시키고, 세포 성장 속도를 측정하였다. 또한, BrdU(bromodeoxyuridine) 도입 및 집락형성 분석(clonogenic assay)은 SNU-449 HCC 세포의 증식 속도를 측정하기 위해 수행하였다. <3-2> Inhibition of cancer cell proliferation and colony formation by inhibition of BANF1, PLODS3, and SF3B4 Next, to investigate the biological functions of BANF1, PLOD3, and SF3B4 in the development of liver cancer, RNAi and 3-(4,5-dimethylthiazol- Each gene was knocked down using 2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysis, and the cell growth rate was measured. In addition, BrdU (bromodeoxyuridine) introduction and colonogenic assay were performed to measure the proliferation rate of SNU-449 HCC cells.
그 결과, 각각 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 넉다운 시킨 경우, SNU-449 HCC 세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고(도 6e 및 6f), BANF1, PLOD3 및 SF3B4은 간세포암의 임상병리학적 특성에서 혈관침윤 및 분화와 같은 암 전이성과 관련되어 있는 것으로 나타났다(표 1 참조).As a result, when BANF1, PLOD3 and SF3B4 were knocked down, respectively, it was found that the growth and proliferation of SNU-449 HCC cells was inhibited ( FIGS. 6e and 6f ), and BANF1, PLOD3 and SF3B4 were found to be in the clinical pathological characteristics of HCC It has been shown to be associated with cancer metastasis, such as vascular invasion and differentiation (see Table 1).
<3-3> BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 암 전이 억제효과 분석<3-3> Analysis of cancer metastasis inhibition effect according to BANF1, PLODS3 and SF3B4 inhibition
인 비트로에서 세포이동성 및 침윤 분석을 수행하여 이들 본 발명에 따른 신규 마커들이 HCC의 암 전이에 영향을 미치는지 분석하였다.Cell migration and invasion assays were performed in vitro to analyze whether these novel markers according to the present invention affect cancer metastasis of HCC.
그 결과, 각각 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 넉다운시킨 군에 대한 변형된 Boyden chamber 분석 결과, SNU-449 세포의 혈청 자극에 의한 세포 이동 및 침윤 현상이 유의적으로 억제되는 것으로 나타났고(도 7a), 유사하게 상처 치유 분석에서도 BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 각각 넉다운시킨 군의 경우, 혈청 자극에 의한 SNU-449 세포의 상처치유 효과가 감소되는 것으로 나타났다(도 7b 참조). As a result, as a result of the modified Boyden chamber analysis of the group in which BANF1, PLOD3 and SF3B4 were knocked down, respectively, it was found that the cell migration and invasion by the serum stimulation of SNU-449 cells was significantly inhibited (Fig. 7a), Similarly, in the wound healing assay, the wound healing effect of SNU-449 cells by serum stimulation was reduced in the group in which BANF1, PLOD3 and SF3B4 were each knocked down (see FIG. 7b ).
나아가 본 발명에 따른 신규 마커들이 EMT에도 영향을 미치는지 확인하기 위해, EMT 조절인자들에 대한 발현 변화를 웨스턴 블럿을 통해 분석하였다. EMT의 전형적인 마커인 N-cadherin, Fibronectin, Snail 및 Slug들이 본 발명의 유전자를 각각 넉다운 시킨 결과, 현저하게 이들 발현이 감소된 것으로 나타났다. 반면, 상피세포 마커인 Ecadherin은 동일 세포에서 증가한 것으로 나타났다(도 7c 참조). 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 BANF1, PLOD3 및 SF3B4이 간세포암에서 EMT 조절인자들의 발현을 선택적으로 조절하며 암 전이능을 갖는다는 것을 알 수 있었다.Furthermore, in order to confirm whether the novel markers according to the present invention also affect EMT, expression changes for EMT regulators were analyzed through Western blot. N-cadherin, Fibronectin, Snail and Slug, which are typical markers of EMT, each knocked down the gene of the present invention, and their expression was significantly reduced. On the other hand, Ecadherin, an epithelial cell marker, was increased in the same cells (see FIG. 7c ). Through these results, the present inventors found that BANF1, PLOD3 and SF3B4 according to the present invention selectively regulate the expression of EMT regulators in hepatocellular carcinoma and have cancer metastasis.
<3-4> In vivo에서 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 항암 활성 분석 BANF1, PLODS3 및 SF3B4 억제에 따른 항암 활성 여부를 확인하기 위해, BANF1, PLODS3 및 SF3B4 유전자들이 각각 넉다운 시킨 종양 세포를 가슴샘이 없는 누드 마우스에 피하 주입시키고, 이후 종양의 성장과 종양의 부피를 측정하였는데, 그 결과, BANF1, PLODS3 및 SF3B4를 각각 넉다운 시킨 세포를 주입한 군이 대조군인 si-Cont를 처리한 세포를 주입한 군에 비해 종양의 성장과 종양의 부피가 월등히 감소한 것으로 나타났다. <3-4> In vivo anticancer activity analysis according to BANF1, PLODS3 and SF3B4 inhibition In order to check whether anticancer activity is caused by BANF1, PLODS3 and SF3B4 inhibition, tumor cells in which the BANF1, PLODS3 and SF3B4 genes are knocked down, respectively, are analyzed by the thymus. After subcutaneous injection into nude mice, tumor growth and tumor volume were measured. As a result, the group injected with BANF1, PLODS3 and SF3B4 knock-down cells, respectively, was injected with the control group, si-Cont-treated cells. Tumor growth and tumor volume were significantly reduced compared to the group.
또한, 대조군 세포주를 쥐에 주입 후, 50일이 경과한 시점에서 분석한 결과, 10마리 중, 6마리가 종양이 형성된 것으로 나타난 반면, BANF1, PLODS3 또는 SF3B4이 넉다운된 세포주를 쥐에 주입한 군에서는 10마리 중 0~2마리만이 종양이 미약하게 발생한 것으로 나타났다(도 7d). In addition, as a result of analysis at 50 days after injection of the control cell line into mice, 6 out of 10 mice showed tumor formation, whereas the group injected with a cell line knocked down BANF1, PLODS3 or SF3B4 into mice It was found that only 0-2 out of 10 mice had weak tumors ( FIG. 7d ).
또한, BANF1, PLOD3 및 SF3B4에 대한 특이적인 si-RNA 전달을 통해 항암 효과를 유도하기 위한 방법으로, 매우 큰 기공을 갖는 메조 포러스 실리카 나노 입자 (MSNs)를 사용하였다. 먼저 12~15주령의 간세포암이 자발적으로 발달된 H-ras 형질전환 마우스를 준비하였다. BANF1, PLOD3 및 SF3B4을 타겟으로 하는 si-RNAs 들을 함유한 메조 포러스 실리카 나노 입자 (MSN_si-RNA)를 상기 준비한 마우스에 주입하고 확인하였으며, 이때 대조군으로는 si-RNA가 없는 MSN만이 주입된 마우스군을 사용하였고, 마우스 간에서의 간세포암은 출생 후 16 주부터 희생되는 시점인 23 주까지 초음파 검사를 통해 분석하였다.In addition, mesoporous silica nanoparticles (MSNs) with very large pores were used as a method for inducing an anticancer effect through specific si-RNA delivery for BANF1, PLOD3 and SF3B4. First, 12 to 15-week-old H-ras transgenic mice in which hepatocellular carcinoma spontaneously developed were prepared. Mesoporous silica nanoparticles (MSN_si-RNA) containing si-RNAs targeting BANF1, PLOD3, and SF3B4 were injected into the prepared mice and confirmed. In this case, as a control group, only MSN without si-RNA was injected. was used, and hepatocellular carcinoma in mouse liver was analyzed by ultrasound from 16 weeks after birth to 23 weeks at the time of sacrifice.
그 결과, MSN만이 주입된 대조군은 17주째에 4마리 중 3마리에서 간세포암이 발견되었으며, 반면 MSN_si-RNA를 주입한 군은 19주째에 4마리 중 2마리에서 작은 간세포암이 발견되었다(도 7e 참조). 웨스턴 블럿 결과, MSN_si-RNA를 주입한 군에서는 BANF1, PLOD3 및 SF3B4이 대조군에 비해 각각 넉다운 되어 있음을 확인함으로써, MSN_si-RNA에 의해 타겟 유전자들이 정확하게 발현 억제됨을 알 수 있었다(도 7f 참조).As a result, in the control group injected with MSN only, hepatocellular carcinoma was found in 3 out of 4 mice at 17 weeks, whereas in the group injected with MSN_si-RNA, small hepatocellular carcinoma was found in 2 out of 4 mice at 19 weeks (Fig. see 7e). As a result of Western blotting, it was confirmed that BANF1, PLOD3, and SF3B4 were knocked down in the group injected with MSN_si-RNA, respectively, compared to the control group, indicating that the target genes were accurately suppressed by MSN_si-RNA (see FIG. 7f ).
따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질들은 간암, 특히 간세포암의 치료제로 사용 가능함을 알 수 있었다.Therefore, through these results, the present inventors found that substances capable of inhibiting the expression or activity of BANF1, PLOD3 and SF3B4 can be used as a therapeutic agent for liver cancer, particularly hepatocellular carcinoma.
<실시예 4><Example 4>
SF3B4의 억제에 따른 간세포암 종양 발생 억제분석Analysis of inhibition of hepatocellular carcinoma tumorigenesis according to SF3B4 inhibition
HCC에서의 임상적 관련성을 조사하기 위해 TCGA_LIHC에서 360명의 HCC 환자의 BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 변화 빈도를 평가했다. BANF1, PLOD3 및 SF3B4의 과발현은 360명 환자 중에서 140명에게 나타났다(도 9a 참조). Kaplan-Meier 생존 곡선은 BANF1, PLOD3 및 SF3B43의 상향 조절을 가진 HCC 환자의 전반적인 생존율 (OS)과 무병 생존율 (DFS)이 모두 정상 발현을 보이는 간세포암 환자 군에 비해 낮게 나타났다(OS; Logrank P = 0.002, DFS; Logrank P = 0.001, 도 9b 참조). To investigate the clinical relevance in HCC, we evaluated the frequency of changes in BANF1, PLOD3 and SF3B4 in 360 HCC patients in TCGA_LIHC. Overexpression of BANF1, PLOD3 and SF3B4 was seen in 140 out of 360 patients (see FIG. 9A ). The Kaplan-Meier survival curve showed that the overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) of HCC patients with upregulation of BANF1, PLOD3 and SF3B43 were lower than those of HCC patients with normal expression (OS; Logrank P = 0.002, DFS; Logrank P = 0.001, see Figure 9b).
또한, 흥미롭게도 이들 유전자 중에서 오로지 SF3B43만 과발현되는 군은 HCC 환자의 전반적인 생존율 (OS)과 무병 생존율 (DFS)이 매우 낮은 것으로 나타났다(도 9c 참조). SF3B43의 증폭은 OS 및 DFS의 간세포암 환자에 매우 나쁜 결과를 초래하는 것으로 나타났고, 이는 SF3B43의 증폭이 간암 발생에서 SF3B43의 기작을 활성화시킨다는 것을 예상할 수 있었다(도 9d~9f).Also, interestingly, the group overexpressing only SF3B43 among these genes showed very low overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) of HCC patients (see FIG. 9c ). Amplification of SF3B43 was shown to lead to very bad results in patients with hepatocellular carcinoma of OS and DFS, which could be expected to activate the mechanism of SF3B43 in the development of hepatocellular carcinoma ( FIGS. 9d to 9f ).
SF3B4는 6개의 SF3b(splicing factor 3b) 복합체 중에 하나로, U2 snRNP super-complex에서 중요한 단백질이다. TCGA_LIHC and GEO databases에서 SF3b(splicing factor 3b) 복합체의 6개 서브유닛에 대한 발현 수준 및 변화 빈도를 분석한 결과, SF3B4만이 간세포암에서 특이적으로 과발현되어 있고 유전자 카피수가 증폭되어 있는 것으로 나타났다(도 10a 및 10b).SF3B4 is one of six SF3b (splicing factor 3b) complexes, and is an important protein in the U2 snRNP super-complex. As a result of analyzing the expression level and change frequency of 6 subunits of the SF3b (splicing factor 3b) complex in the TCGA_LIHC and GEO databases, it was found that only SF3B4 was overexpressed specifically in HCC and the gene copy number was amplified (Fig. 10a and 10b).
또한 10개의 다른 종류의 간 세포주, MIHA 불멸화 정상 간세포주 및 8개의 인간 간세포암 세포주를 대상으로 qRT-PCR로 SF3B4의 발현수준을 분석하였는데, 그 결과, MIHA 세포주에 비해 간세포암의 세포주에서 SF3B4의 mRNA와 단백질이 모두 과발현되어 있는 것으로 나타났다(도 10c 참조). 나아가 SF3B4의 발현 억제 결과, SNU-449 and SNU-368 HCC 세포의 세포 성장 및 증식은 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 11a , 11b). In addition, the expression level of SF3B4 was analyzed by qRT-PCR in 10 different types of liver cell lines, MIHA immortalized normal hepatocytes, and 8 human hepatocellular carcinoma cell lines. It was found that both mRNA and protein were overexpressed (see FIG. 10c ). Furthermore, as a result of suppressing the expression of SF3B4, both cell growth and proliferation of SNU-449 and SNU-368 HCC cells were inhibited ( FIGS. 11a , 11b ).
변형된 Boyden chamber 분석 및 상처 치유 분석의 결과에서도 SF3B4 넉다운 시, 동일 세포주의 암전이성 특징이 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 11c 및 11d).The results of the modified Boyden chamber analysis and wound healing analysis also showed that when SF3B4 was knocked down, all metastatic characteristics of the same cell line were suppressed ( FIGS. 11c and 11d ).
EMT에 관여하는 단백질들의 발현에 미치는 영향을 웨스턴블럿을 통해 확인한 결과, 간세포암 세포주에서 SF3B4 넉다운 시 N-cadherin, Fibronectin, Snail 및 Slug이 모두 억제되는 것으로 나타났고, E-cadherin만이 과발현되는 것으로 나타났다(도 11e).As a result of confirming the effect on the expression of proteins involved in EMT through western blot, it was found that N-cadherin, Fibronectin, Snail and Slug were all inhibited during SF3B4 knockdown in hepatocellular carcinoma cell line, and only E-cadherin was overexpressed. (FIG. 11e).
앞서 실험 결과에 의하면, 간세포암에서는 SF3B4의 유전자 및 단백질이 과발현되고 있는 것으로 나타남에 따라, 100명의 HCC 환자의 코호트(GSE16757)에서 SF3B4의 발현과 예후에 대한 관련성을 분석하였다. According to the previous experimental results, as the gene and protein of SF3B4 were overexpressed in hepatocellular carcinoma, the relationship between SF3B4 expression and prognosis was analyzed in a cohort of 100 HCC patients (GSE16757).
SF3B4 발현과 높은 상관 관계를 보이는 발현 패턴을 가진 유전자 (n = 342)를 군집 분석을 위해 선택하였다 (P <0.001, r> 0.5 또는 r <-0.5). 환자들은 SF3B4 high cluster (SF3B4_high) 그룹 또는 SF3B4 low cluster (SF3B4_low) 그룹으로 나누었다. HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 SF3B4 발현이 높은 환자의 5 년 OS 비율이 SF3B4 발현이 낮은 환자보다 유의하게 낮았다 (P = 0.014, 도 10d).Genes (n = 342) with an expression pattern highly correlated with SF3B4 expression were selected for cluster analysis (P <0.001, r> 0.5 or r <-0.5). Patients were divided into SF3B4 high cluster (SF3B4_high) group or SF3B4 low cluster (SF3B4_low) group. The Kaplan-Meier survival curve of HCC patients showed that the 5-year OS ratio of patients with high SF3B4 expression was significantly lower than that of patients with low SF3B4 expression (P = 0.014, Fig. 10d).
다음으로, SF3B4 관련 유전자 표지의 생물학적 관련성을 조사하기 위해 Molecular Signatures Database (MsigDB)에서 SF3B4 관련 유전자 표지와 관련된 신호 전달 경로를 확인하기 위해 GSEA(gene set enrichment analysis)을 수행하였다. Next, to investigate the biological relevance of the SF3B4-related gene marker, GSEA (gene set enrichment analysis) was performed to identify the signaling pathway related to the SF3B4-related gene marker in the Molecular Signatures Database (MsigDB).
KEGG_CELL_CYCLE은 매우 의미있는 유전자 세트로 확인되었다(도 10e). 또한 유세포분석 결과에 의하면, SF3B4이 넉다운된 간세포암 세포주에서는 G1기의 세포수가 현저하게 증가하였고, 동시에 S 기와 G2 / M 기의 세포수는 감소한 것으로 나타났다. 반면 SF3B4의 넉다운은 세포 사멸 과정에는 영향을 미치지 않았다(도 10f 및 도 11f).KEGG_CELL_CYCLE was identified as a highly significant gene set (Fig. 10e). In addition, according to the flow cytometry results, in the hepatocellular carcinoma cell line in which SF3B4 was knocked down, the number of cells in the G1 stage was significantly increased, and at the same time, the number of cells in the S and G2 / M stages was decreased. On the other hand, knockdown of SF3B4 did not affect the apoptosis process ( FIGS. 10f and 11f ).
<실시예 5><Example 5>
SF3B4의 KLF4에 대한 비정상적인 스플라이싱 작용 및 간세포암 유도Abnormal splicing action of SF3B4 on KLF4 and induction of hepatocellular carcinoma
간세포암 발생과정에서 SF3B4의 생물학적 역할 규명을 위해 SF3B4 넉다운에 의한 spliceosome 활성을 조사하였다. SF3B4 넉다운 SF3b 복합체에 의해 조절되는 대표적인 분자인 VEGF의 발현을 억제하는 반면, VEGF mRNA의 비스플라이싱 형태(VEGF pre-mRNA)는 HeLa 세포에서 SF3B4 넉다운에 의해 증가되었다(도 12a). To investigate the biological role of SF3B4 in the development of hepatocellular carcinoma, spliceosome activity by SF3B4 knockdown was investigated. SF3B4 knockdown While suppressing the expression of VEGF, a representative molecule regulated by the SF3b complex, the unspliced form of VEGF mRNA (VEGF pre-mRNA) was increased by SF3B4 knockdown in HeLa cells (FIG. 12a).
SF3b 복합체의 억제제인 Spliceostatin A (SSA)를 처리한 경우, VEGF 단백질 발현 억제가 SF3b 복합체의 스플라이싱 활성 억제에 관여함이 밝혀졌고, 두 개의 다른 HCC 세포주에서 동일한 결과로 나타났다. SF3B4 넉다운 SSA의 처리는 HCC 세포주의 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났다(도 13a).When treated with Spliceostatin A (SSA), an inhibitor of the SF3b complex, suppression of VEGF protein expression was found to be involved in suppression of splicing activity of the SF3b complex, and the same results were obtained in two different HCC cell lines. Treatment of SF3B4 knockdown SSA was shown to inhibit tumor cell growth of HCC cell lines ( FIG. 13A ).
세포주기 조절 단백질에 대한 웨스턴 블럿은 SF3B4를 타겟팅 한 암세포 성장 억제의 기작을 확인하기 위해 수행하였다. SF3B4 넉다운은 CDK4, CDK2, cyclin D1 및 cyclin E의 발현을 억제하고 동시에 HCC 세포주에서 p27Kip1을 유도하였으며, SSA 처리는 동일한 세포에서 이러한 결과를 반복적으로 나타났다(도 12b). 이러한 결과는 SF3B4 과발현이 p27Kip1을 포함한 음성 세포주기 조절 인자의 억제를 유도하고 동시에 HCC 세포의 세포주기 전이(transition)에서 특이적 조절인자인 CDK4, CDK2, cyclinD1, cyclin E의 발현을 유도함을 시사한다. 간세포암에서 SF3B4 넉다운은 pRb의 인산화 억제(hypophosphorylation)를 유도한다.Western blot for cell cycle regulatory proteins was performed to confirm the mechanism of cancer cell growth inhibition targeting SF3B4. SF3B4 knockdown suppressed the expression of CDK4, CDK2, cyclin D1 and cyclin E and simultaneously induced p27Kip1 in HCC cell lines, and SSA treatment repeatedly showed these results in the same cells (Fig. 12b). These results suggest that SF3B4 overexpression induces suppression of negative cell cycle regulators including p27Kip1 and, at the same time, induces the expression of specific regulators CDK4, CDK2, cyclinD1, and cyclin E in the cell cycle transition of HCC cells. . In hepatocellular carcinoma, SF3B4 knockdown induces hypophosphorylation of pRb.
다음으로, HCC 세포에서 비정상적인 발현 SF3B4의 직접 표적을 조사하기 위해, SF3B4 넉다운 HepG2 세포의 차세대 시퀀싱 (NGS) -RNA 서열 데이타를 분석하였다. 이 데이터 세트는 GEO 데이터베이스 (GSE80861)에서 구할 수 있으며 ENCODE 프로젝트 (the Encyclopedia of DNA Element)의 일부로 수행하였다. 이 분석은 SF3B4 넉다운 세포에서 특이적인 발현양상을 보이는 유전자 (DEG; differentially expressed genes)들 3,182 개의 유전자를 확인하였다(대조군에 비해 1.5 배 이상 차이). SF3B4 넉다운 관련된 AS 현상을 확인하기 위해, paired-end reads를 ENCODE 데이터베이스에 매핑하고 MATS (Multivariate Analysis of Transcript Splicing Analysis) 분석 도구를 사용하여 엑손 포함을 정량화하였다. Next, to investigate the direct target of aberrant expression SF3B4 in HCC cells, next-generation sequencing (NGS)-RNA sequence data of SF3B4 knockdown HepG2 cells were analyzed. This data set is available from the GEO database (GSE80861) and was performed as part of the ENCODE project (the Encyclopedia of DNA Element). In this analysis, 3,182 genes (DEG; differentially expressed genes) showing specific expression patterns in SF3B4 knockdown cells were identified (more than 1.5-fold difference compared to the control group). To identify SF3B4 knockdown-related AS phenomena, paired-end reads were mapped to the ENCODE database and exon inclusion was quantified using a Multivariate Analysis of Transcript Splicing Analysis (MATS) analysis tool.
분석 결과, 스킵된 엑손 (SE), 유지된 인트론 (RI), 대안 3 '스플라이싱 사이트(A3SS), 대안 5' 스플라이싱 사이트 (A5SS) 및 상호 배타적인 엑손 (MXE)과 같이 6개의 서로 다른 스플라이싱 현상이 일어나는 것으로 분석되었다(도 12c). 또한, 2가지 이상의 AS 사건과 함께 이 두 가지 분석을 조합하면 SF3B4가 넉다운된 HepG2 세포에서 8개의 유전자가 현저하게 전사가 억제된 것으로 나타났다(도 13b).As a result of the analysis, six exons such as skipped exon (SE), retained intron (RI), alternative 3 'splice site (A3SS), alternative 5' splicing site (A5SS) and mutually exclusive exon (MXE) were found. It was analyzed that different splicing phenomena occurred (Fig. 12c). In addition, combining these two analyzes with two or more AS events revealed that eight genes were significantly repressed in transcription in HepG2 cells in which SF3B4 was knocked down (Fig. 13b).
이를 보다 명확하게 확인하기 위해, 8개의 유전자를 TCGA_LIHC 데이터셋에 적용하였고, 이 중에서 4개의 유전자인 GRIP, PLP1, KLF4 및 KRT80을 SF3B4의 타겟 후보 유전자로 선택하였다(도 12d). 특이하게 KLF4만이 SF3B4가 넉다운된 2개의 간세포암 세포주에서 활성화 되어 있는 것으로 나타났다(도 12e 및 도 13c 참조). To confirm this more clearly, eight genes were applied to the TCGA_LIHC dataset, and among them, four genes, GRIP, PLP1, KLF4 and KRT80, were selected as target candidate genes for SF3B4 ( FIG. 12d ). Specifically, only KLF4 was found to be activated in the two hepatocellular carcinoma cell lines in which SF3B4 was knocked down (see FIGS. 12e and 13c ).
8개의 유전자들 중에서 KLF4과 SF3B4은 간세포암에서 서로 유의미한 음성적인 상관관계를 보였다(도 13d 및 13e). 이러한 결과는 SF3B4 넉다운이 야생형 KLF4의 전사 발현의 회복을 유도하고, HCC 세포에 대한 항종양 효과를 나타냄을 의미하며, 실제로, NGS-RNA 분석은 HCC 조직에서 야생형 KLF4의 전사체가 억제되어 있는 것으로 나타났으며, 간세포암 환자에서는 KLF4 SE 전사체가 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 12f).Among the eight genes, KLF4 and SF3B4 showed a significant negative correlation with each other in HCC ( FIGS. 13D and 13E ). These results suggest that SF3B4 knockdown induces restoration of transcriptional expression of wild-type KLF4 and exhibits an antitumor effect on HCC cells. Indeed, NGS-RNA analysis showed that the transcript of wild-type KLF4 was repressed in HCC tissues. It was found that the KLF4 SE transcript was increased in hepatocellular carcinoma patients (FIG. 12f).
나아가 본 발명자들은 SF3B4 과발현이 SF3b 복합체를 유발하여 KLF4 전사 체를 스플라이싱하여 비기능성 AS 전사체가 되도록 하는지 확인하기 위해, SF3B4 넉다운되고 KLF4가 이소성 발현(ectopic expression)되는 플라스미드를 간세포암 세포주에 적용하여 분석하였다.Furthermore, the present inventors applied a plasmid in which SF3B4 overexpression induces the SF3b complex and splices the KLF4 transcript to become a non-functional AS transcript, a plasmid in which SF3B4 is knocked down and KLF4 is ectopic expression is applied to hepatocellular carcinoma cell lines. and analyzed.
이후 SF3B4가 넉다운되고 KLF4가 과발현되는 세포에서 SF3B4의 조절인자 인 p27Kip1과 Slug을 관찰하였다. Afterwards, p27Kip1 and Slug, which are regulators of SF3B4, were observed in cells in which SF3B4 was knocked down and KLF4 was overexpressed.
그 결과, 예상대로 KLF4의 이소성 발현은 동일한 세포에서 SF3B4 넉다운의 효과를 나타내었다(도 14a). As a result, as expected, ectopic expression of KLF4 showed the effect of SF3B4 knockdown in the same cells (FIG. 14a).
다음으로, SF3B4 활성화가 HCC 세포에서 KLF4 전사 활성을 통해 p27Kip1 및 Slug 발현을 직접적으로 조절하는지를 조사하기 위해, p27Kip1 또는 slug-promoter를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 제조하고 SNU-449 세포로 형질 감염시켰고, 동시에 SF3B4 특이적인 siRNA 또는 KLF4 플라스미드를 형질감염시켰다. Next, to investigate whether SF3B4 activation directly regulates p27Kip1 and Slug expression through KLF4 transcriptional activity in HCC cells, a luciferase reporter plasmid with p27Kip1 or slug-promoter was prepared and transfected into SNU-449 cells, Simultaneously, SF3B4-specific siRNA or KLF4 plasmids were transfected.
그 결과, p27Kip1 프로모터 형질 감염체의 루시퍼라제 활성은 SF3B4 넉다운 세포주 및 KLF4 과발현 세포주 모두에서 유의하게 증가하였으며, Slug- 프로모터 형질 감염체의 루시퍼라제 활성은 동일한 세포에서 유의하게 억제되었다(도 14b).As a result, the luciferase activity of the p27Kip1 promoter transfectant was significantly increased in both the SF3B4 knockdown cell line and the KLF4 overexpressing cell line, and the luciferase activity of the Slug-promoter transfectant was significantly inhibited in the same cell (Fig. 14b).
이후 SF3B4 넉다운이 KLF4의 발현 유도와 동시에 KLF4, Liver-KLF4-iso1 및 Liver-KLF4-iso2의 다양한 스플라이싱 이성질체를 억제하는지 확인하였다.Afterwards, it was confirmed whether SF3B4 knockdown suppressed various splicing isomers of KLF4, Liver-KLF4-iso1 and Liver-KLF4-iso2 simultaneously with the induction of KLF4 expression.
직접적인 시퀀싱 분석으로 야생형 KLF4 전사체에서 스킵된 엑손 전사체가 생성되었음을 확인하였다(도 14c). Direct sequencing analysis confirmed that a skipped exon transcript was generated in the wild-type KLF4 transcript (Fig. 14c).
마지막으로, SF3B4의 불활성화가 생체 내에서 종양억제자인 KLF4의 회복을 통해 종양 억제 효과를 유발하는지 확인하기 위해, SF3B4 넉다운 및 KLF4 과발현 세포를 흉선 누드 마우스에 피하 주사 하였다.Finally, to determine whether inactivation of SF3B4 induces a tumor suppressor effect through recovery of the tumor suppressor KLF4 in vivo, SF3B4 knockdown and KLF4 overexpressing cells were subcutaneously injected into thymic nude mice.
그 결과, SF3B4 넉다운과 KLF4를 발현하는 SNU-449 세포 모두에서 전체적으로 종양 성장 속도와 희생시의 평균 체적이 유의하게 감소했다(도 14d). 또한, 면역블럿 분석에서는 SF3B4 넉다운 및 KLF4가 발현하는 이종 이식 조직 모두에서 KLF4의 유도를 확인할 수 있었다(도 14e).As a result, overall tumor growth rate and mean volume at sacrifice were significantly decreased in both SF3B4 knockdown and KLF4 expressing SNU-449 cells ( FIG. 14d ). In addition, immunoblot analysis confirmed the induction of KLF4 in both SF3B4 knockdown and KLF4 expressing xenografts ( FIG. 14e ).
따라서 이상과 같은 실험 결과를 통해 본 발명자들은 초기 간암을 정확하게 예측할 수 있는 바이오마커로서 BANF1, PLOD3 및 SF3B4를 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 이들 마커를 단일로 사용하는 것에 비해 2개 이상으로 조합하여 사용할 경우, 진단 정확도가 더 높은 것을 알 수 있었으며, 특히 이들 마커는 전암성 병변 시료에서 확인할 수 있다는 특징이 있다.Therefore, through the above experimental results, the present inventors found that BANF1, PLOD3 and SF3B4 can be used as biomarkers that can accurately predict early liver cancer, and in particular, these markers are combined in two or more compared to using a single use. It was found that the diagnostic accuracy was higher when used for this purpose, and in particular, these markers can be identified in precancerous lesion samples.
뿐만 아니라 SF3B4의 경우, 간암 발병시 KLF4의 발현 및 활성을 억제하여 간암을 진행 및 유발시키는 것을 알 수 있었고, SF3B4 발현을 억제할 경우, KLF4의 발현 증가를 통해 항암 활성을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.In addition, in the case of SF3B4, it was found that it inhibited the expression and activity of KLF4 during the onset of liver cancer, thereby advancing and inducing liver cancer. In the case of suppressing the expression of SF3B4, it was found that anticancer activity could be induced through increased expression of KLF4 could
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, with respect to the present invention, the preferred embodiments have been looked at. Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments are to be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is indicated in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A composition for preventing and treating liver cancer comprising BANF1, PLOD3 or SF3B4 <130> PN2007-289 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 cDNA sequence <400> 1 ccagtgttcc cagttcccac cagtccaact gcgaggagtg cgacgtgagt ctgagtctga 60 tccctccgaa aaccgtactt ccggcgctgt ctcggaggcc tcccgtcccc tcccttgtcc 120 gtcttctaac tcttccccac gccaggtccg tcaagcctaa gtccttgagt tccgggtccg 180 ggcagcagag aaaggaagtc ctctccctgg aggcctatct ccctcagaac tgcgcgagaa 240 gcgagacctt agaaggcagg gcttcccgcg aaggaccgga aaggagcgcc tactaaggac 300 gccgtcgagg tccggggcgc ctcaactcta tagctctaac tggctagaag tgcccaacgt 360 ggaatgtttc ttttttaaag gcggctcttg aagcgacccg gaagcggaag tggaagaaag 420 ttctagtggc ttgaggtatc cgcaggagcg gccgggtggc gggaggaacc gttacgggaa 480 ctgaagttgc ggattaagcc tgatcaagat gacaacctcc caaaagcacc gagacttcgt 540 ggcagagccc atgggggaga agccagtggg gagcctggct gggattggtg aagtcctggg 600 caagaagctg gaggaaaggg gttttgacaa ggcctatgtt gtccttggcc agtttctggt 660 gctaaagaaa gatgaagacc tcttccggga atggctgaaa gacacttgtg gcgccaacgc 720 caagcagtcc cgggactgct tcggatgcct tcgagagtgg tgcgacgcct tcttgtgatg 780 ctctctggga agctctcaat ccccagccct catccagagt ttgcagccga gtagggactc 840 ctcccctgtc ctctacgaag gaaaagattg ctattgtcgt actcacctcc gacgtactcc 900 ggggtctttt gggagttttc tcccctaacc atttcaactt ttttttggat tctcgctctt 960 gcatgcctcc cccgtccttt ttcccttgcc agttccctgg tgacagttac cagctttcct 1020 gaatggattc ccggccccat ccctcacccc caccctcact ttcaatccgt ttgataccat 1080 ttggctcctt ttttggcaga acagtcactg tccttgtaaa gttttttaga tcaataaagt 1140 cagtggcttt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1179 <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Amino acid sequence <400> 2 Met Thr Thr Ser Gln Lys His Arg Asp Phe Val Ala Glu Pro Met Gly 1 5 10 15 Glu Lys Pro Val Gly Ser Leu Ala Gly Ile Gly Glu Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Leu Glu Glu Arg Gly Phe Asp Lys Ala Tyr Val Val Leu 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tgcacaacaa cgaggtcttc catgaacccc acatcgctga ctcctggccg 1500 cagctccagg accacttctc agctgtgaag ctcgtggggc cggaggaggc tctgagccca 1560 ggcgaggcca gggacatggc catggacctg tgtcggcagg accccgagtg tgagttctac 1620 ttcagcctgg acgccgacgc tgtcctcacc aacctgcaga ccctgcgtat cctcattgag 1680 gagaacagga aggtgatcgc ccccatgctg tcccgccacg gcaagctgtg gtccaacttc 1740 tggggcgccc tgagccccga tgagtactac gcccgctccg aggactacgt ggagctggtg 1800 cagcggaagc gagtgggtgt gtggaatgta ccatacatct cccaggccta tgtgatccgg 1860 ggtgataccc tgcggatgga gctgccccag agggatgtgt tctcgggcag tgacacagac 1920 ccggacatgg ccttctgtaa gagctttcga gacaagggca tcttcctcca tctgagcaat 1980 cagcatgaat ttggccggct cctggccact tccagatacg acacggagca cctgcacccc 2040 gacctctggc agatcttcga caaccccgtc gactggaagg agcagtacat ccacgagaac 2100 tacagccggg ccctggaagg ggaaggaatc gtggagcagc catgcccgga cgtgtactgg 2160 ttcccactgc tgtcagaaca aatgtgtgat gagctggtgg cagagatgga gcactacggc 2220 cagtggtcag gcggccggca tgaggattca aggctggctg gaggctacga gaatgtgccc 2280 accgtggaca tccacatgaa gcaggtgggg tacgaggacc agtggctgca gctgctgcgg 2340 acgtatgtgg gccccatgac cgagagcctg tttcccggtt accacaccaa ggcgcgggcg 2400 gtgatgaact ttgtggttcg ctaccggcca gacgagcagc cgtctctgcg gccacaccac 2460 gactcatcca ccttcaccct caacgttgcc ctcaaccaca agggcctgga ctatgaggga 2520 ggtggctgcc gcttcctgcg ctacgactgt gtgatctcct ccccgaggaa gggctgggca 2580 ctcctgcacc ccggccgcct cacccactac cacgaggggc tgccaacgac ctggggcaca 2640 cgctacatca tggtgtcctt tgtcgacccc tgacactcaa ccactctgcc aaacctgccc 2700 tgccattgtg cctttttagg gggcctggcc cccgtcctgg gagttggggg atgggtctct 2760 ctgtctcccc acttcctgag ttcatgttcc gcgtgcctga actgaatatg tcaccttgct 2820 cccaagacac ggccctctca ggaagctccc ggagtccccg cctctctcct ccgcccacag 2880 gggttcgtgg gcacagggct tctggggact ccccgcgtga taaattatta atgttccgca 2940 gtctcactct gaataaagga cagtttgtaa gtcttgaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2995 <210> 4 <211> 738 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Amino acid sequence <400> 4 Met Thr Ser Ser Gly Pro Gly Pro Arg Phe Leu Leu Leu Leu Pro Leu 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Asp Glu Tyr Tyr Ala Arg Ser Glu Asp Tyr Val Glu Leu Val 435 440 445 Gln Arg Lys Arg Val Gly Val Trp Asn Val Pro Tyr Ile Ser Gln Ala 450 455 460 Tyr Val Ile Arg Gly Asp Thr Leu Arg Met Glu Leu Pro Gln Arg Asp 465 470 475 480 Val Phe Ser Gly Ser Asp Thr Asp Pro Asp Met Ala Phe Cys Lys Ser 485 490 495 Phe Arg Asp Lys Gly Ile Phe Leu His Leu Ser Asn Gln His Glu Phe 500 505 510 Gly Arg Leu Leu Ala Thr Ser Arg Tyr Asp Thr Glu His Leu His Pro 515 520 525 Asp Leu Trp Gln Ile Phe Asp Asn Pro Val Asp Trp Lys Glu Gln Tyr 530 535 540 Ile His Glu Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Glu Gly Glu Gly Ile Val Glu 545 550 555 560 Gln Pro Cys Pro Asp Val Tyr Trp Phe Pro Leu Leu Ser Glu Gln Met 565 570 575 Cys Asp Glu Leu Val Ala Glu Met Glu His Tyr Gly Gln Trp Ser Gly 580 585 590 Gly Arg His Glu Asp Ser Arg Leu Ala Gly Gly Tyr Glu Asn Val Pro 595 600 605 Thr Val Asp Ile His Met Lys Gln Val Gly Tyr Glu Asp Gln Trp Leu 610 615 620 Gln Leu Leu Arg Thr Tyr Val Gly Pro Met Thr Glu Ser Leu Phe Pro 625 630 635 640 Gly Tyr His Thr Lys Ala Arg Ala Val Met Asn Phe Val Val Arg Tyr 645 650 655 Arg Pro Asp Glu Gln Pro Ser Leu Arg Pro His His Asp Ser Ser Thr 660 665 670 Phe Thr Leu Asn Val Ala Leu Asn His Lys Gly Leu Asp Tyr Glu Gly 675 680 685 Gly Gly Cys Arg Phe Leu Arg Tyr Asp Cys Val Ile Ser Ser Pro Arg 690 695 700 Lys Gly Trp Ala Leu Leu His Pro Gly Arg Leu Thr His Tyr His Glu 705 710 715 720 Gly Leu Pro Thr Thr Trp Gly Thr Arg Tyr Ile Met Val Ser Phe Val 725 730 735 Asp Pro <210> 5 <211> 2001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 cDNA sequence <400> 5 aaatcagggt tgtgaggcca aatctgcaag aaggctgcag gcgagaggga aggctccctc 60 tgcgcctgaa agcccccaag tcctcgggtt ggggggaact cttcagcaca tccttctctg 120 gacaacagaa gaagaatcac tgtccacaaa atatattaaa actgaaattt ttgttctttt 180 agctttcgaa tttacacttt tgagagcagt gtgattcttt caagtctagc agtgcattaa 240 gagggcctga gcgtttccgt tccgccctcc tcgctaagac aactagcagc ggcacctcag 300 gacgcgagcc gaggactcta ccgcccgacc caggttaagt ttcggaggct cctaagatgg 360 ctgcagccgc ttccaggcac ctcctcttcc gcggccccgc ccaccgctac gtccgtcttc 420 gccccggaag tggaagtcgt gctgaggtca gaaggcggaa ccgctgctgg gagacggcgg 480 gatctctttc gccatggctg ccgggccgat ctccgagcgg aatcaggatg ccactgtgta 540 cgtggggggc ctggatgaga aggttagtga accgctgctg tgggaactgt ttctccaggc 600 tggaccagta gtcaacaccc acatgccaaa ggatagagtc actggccagc accaaggcta 660 tggctttgtg gaattcttga gtgaggaaga tgctgactat gccattaaga tcatgaacat 720 gatcaaactc tatgggaagc caatacgggt gaacaaagca tcagctcaca acaaaaacct 780 ggatgtaggg gccaacattt tcattgggaa cctggaccct gagattgatg agaagttgct 840 ttatgatact ttcagcgcct ttggggtcat cttacaaacc cccaaaatta tgcgggaccc 900 tgacacaggc aactccaaag gttatgcctt tattaatttt gcttcatttg atgcttcgga 960 tgcagcaatt gaagccatga atgggcagta cctctgtaac cgtcctatca ccgtatctta 1020 tgccttcaag aaggactcca agggtgagcg ccatggctca gcagccgaac gacttctggc 1080 agctcagaac ccgctctccc aggctgatcg ccctcatcag ctgtttgcag atgcacctcc 1140 tccaccctct gctcccaatc ctgtggtatc atcattgggg tctgggcttc ctccaccagg 1200 catgcctcct cctggctcct tcccaccccc agtgccacct cctggagccc tcccacctgg 1260 gataccccca gccatgcccc caccacctat gcctcctggg gctgcaggac atggcccccc 1320 atcggcagga accccagggg caggacatcc tggtcatgga cactcacatc ctcacccatt 1380 cccaccgggt gggatgcccc atccagggat gtctcagatg cagcttgcac accatggccc 1440 tcatggctta ggacatcccc acgctggacc cccaggctct gggggccagc caccgccccg 1500 accaccacct ggaatgcctc atcctggacc tcctccaatg ggcatgcccc cccgagggcc 1560 tccattcgga tctcccatgg gtcacccagg tcctatgcct ccgcatggta tgcgtggacc 1620 tcctccactg atgccccccc atggatacac tggccctcca cgacccccac cctatggcta 1680 ccagcggggg cctctccctc cacccagacc cactccccgg ccaccagttc cccctcgagg 1740 cccacttcga ggccctctcc ctcagtaaat tcacattttc cttcctcctg ttacattttc 1800 ccaatatctt ttctattcct tggaccaatc agagatgctg tagctccttg gggcaaaggt 1860 actaatccct ttcagcaccc ccactccatt ccccttttta atgtaacttt ttccacagga 1920 ggtatttctt ttttatgttg gtcctgagta ttttgcaaat gcacagagaa aataaaacta 1980 aactccttgt ttaaaaaaaa a 2001 <210> 6 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Amino 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ataccgtcag a 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP1 Forward Primer <400> 23 acctatgccc tgaccgttg 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP1 Reverse Primer <400> 24 tgctggggaa ggcaatagac t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT80 Forward Primer <400> 25 tgatgggtga gtcggaatta 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT80 Reverse Primer <400> 26 cttcccagga attccagata ca 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 27 accaggtggt ctcctctgac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 28 tgctgtagcc aaattcgttg 20 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control Sense siRNA <400> 29 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control Antisense siRNA <400> 30 acgaaauugg uggcguagg 19 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Sense siRNA <400> 31 aagaagcugg aggaaagggg u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Antisense siRNA <400> 32 accccuuucc uccagcuucu u 21 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Sense siRNA <400> 33 gcaucuggag cuuucugua 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Antisense siRNA <400> 34 uacagaaagc uccagaugc 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Sense siRNA <400> 35 gcaguaccuc uguaaccgu 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Antisense siRNA <400> 36 acgguuacag agguacugc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Banf1 Sense siRNA <400> 37 ccucagcguu ucaaucuuu 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Banf1 Antisense siRNA <400> 38 aaagauugaa acgcugagg 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plod3 Sense siRNA <400> 39 cgacugcaga aucuccucu 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plod3 Antisense siRNA <400> 40 agaggagauu cugcagucg 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf3b4 Sense siRNA <400> 41 cugcuuuacg auacuuuca 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf3b4 Antisense siRNA <400> 42 ugaaaguauc guaaagcag 19 <110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A composition for preventing and treating liver cancer comprising BANF1, PLOD3 or SF3B4 <130> PN2007-289 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 cDNA sequence <400> 1 ccagtgttcc cagttcccac cagtccaact gcgaggagtg cgacgtgagt ctgagtctga 60 tccctccgaa aaccgtactt ccggcgctgt ctcggaggcc tcccgtcccc tcccttgtcc 120 gtcttctaac tcttccccac gccaggtccg tcaagcctaa gtccttgagt tccgggtccg 180 ggcagcagag aaaggaagtc ctctccctgg aggcctatct ccctcagaac tgcgcgagaa 240 gcgagacctt agaaggcagg gcttcccgcg aaggaccgga aaggagcgcc tactaaggac 300 gccgtcgagg tccggggcgc ctcaactcta tagctctaac tggctagaag tgcccaacgt 360 ggaatgtttc ttttttaaag gcggctcttg aagcgacccg gaagcggaag tggaagaaag 420 ttctagtggc ttgaggtatc cgcaggagcg gccgggtggc gggaggaacc gttacgggaa 480 ctgaagttgc ggattaagcc tgatcaagat gacaacctcc caaaagcacc gagacttcgt 540 ggcagagccc atggggggaga agccagtggg gagcctggct gggattggtg aagtcctggg 600 caagaagctg gaggaaaggg gttttgacaa ggcctatgtt gtccttggcc agtttctggt 660 gctaaagaaa gatgaagacc tcttccggga atggctgaaa gacacttgtg gcgccaacgc 720 caagcagtcc cgggactgct tcggatgcct tcgagagtgg tgcgacgcct tcttgtgatg 780 ctctctggga agctctcaat ccccagccct catccagagt ttgcagccga gtagggactc 840 ctcccctgtc ctctacgaag gaaaagattg ctattgtcgt actcacctcc gacgtactcc 900 ggggtctttt gggagttttc tcccctaacc atttcaactt ttttttggat tctcgctctt 960 gcatgcctcc cccgtccttt ttcccttgcc agttccctgg tgacagttac cagctttcct 1020 gaatggattc ccggccccat ccctcacccc caccctcact ttcaatccgt ttgataccat 1080 ttggctcctt ttttggcaga acagtcactg tccttgtaaa gttttttaga tcaataaagt 1140 cagtggcttt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1179 <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 amino acid sequence <400> 2 Met Thr Thr Ser Gln Lys His Arg Asp Phe Val Ala Glu Pro Met Gly 1 5 10 15 Glu Lys Pro Val Gly Ser Leu Ala Gly Ile Gly Glu Val Leu Gly Lys 20 25 30 Lys Leu Glu Glu Arg Gly Phe Asp Lys Ala Tyr Val Val Leu Gly Gln 35 40 45 Phe Leu Val Leu Lys Lys Asp Glu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Lys 50 55 60 Asp Thr Cys Gly Ala Asn Ala Lys Gln Ser Arg Asp Cys Phe Gly Cys 65 70 75 80 Leu Arg Glu Trp Cys Asp Ala Phe 85 <210> 3 <211> 2995 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 cDNA sequence <400> 3 taggcttcct ccctccctgt cgccgccagc ctctcgctct ccccgtcttc cgcccgcact 60 ctctgggcag ggctgcggcc aggacccgcc cccgcgtccc gcccgaccct ccgccagggg 120 tcacttcccc tgtccaggtt tcagcttcca catgtgtcaa gcggctggct cagcccagag 180 tccctgtctc ccgcccgccg gcccgagccg ccgcccctcc cccgcctccc 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agccttaatc tggatcataa gtctcggatc tttcagaacc tcaacggggc tttagatgaa 1140 gtggttttaa agtttgatcg gaaccgtgtg cgtatccgga acgtggccta cgacacgctc 1200 cccattgtgg tccatggaaa cggtcccact aagctgcagc tcaactacct gggaaactac 1260 gtccccaatg gctggactcc tgagggaggc tgtggcttct gcaaccagga ccggaggaca 1320 ctcccggggg ggcagcctcc cccccgggtg tttctggccg tgtttgtgga acagcctact 1380 ccgtttctgc cccgcttcct gcagcggctg ctactcctgg actatccccc cgacagggtc 1440 acccttttcc tgcacaacaa cgaggtcttc catgaacccc acatcgctga ctcctggccg 1500 cagctccagg accacttctc agctgtgaag ctcgtggggc cggaggaggc tctgagccca 1560 ggcgaggcca gggacatggc catggacctg tgtcggcagg accccgagtg tgagttctac 1620 ttcagcctgg acgccgacgc tgtcctcacc aacctgcaga ccctgcgtat cctcattgag 1680 gagaacagga aggtgatcgc ccccatgctg tcccgccacg gcaagctgtg gtccaacttc 1740 tggggcgccc tgagccccga tgagtactac gcccgctccg aggactacgt ggagctggtg 1800 cagcggaagc gagtgggtgt gtggaatgta ccatacatct cccaggccta tgtgatccgg 1860 ggtgataccc tgcggatgga gctgccccag agggatgtgt tctcgggcag tgacacagac 1920 ccggacatgg ccttctgtaa gagctttcga gacaagggca tcttcctcca tctgagcaat 1980 cagcatgaat ttggccggct cctggccact tccagatacg acacggagca cctgcacccc 2040 gacctctggc agatcttcga caaccccgtc gactggaagg agcagtacat ccacgagaac 2100 tacagccggg ccctggaagg ggaaggaatc gtggagcagc catgcccgga cgtgtactgg 2160 ttcccactgc tgtcagaaca aatgtgtgat gagctggtgg cagagatgga gcactacggc 2220 cagtggtcag gcggccggca tgaggattca aggctggctg gaggctacga gaatgtgccc 2280 accgtggaca tccacatgaa gcaggtgggg tacgaggacc agtggctgca gctgctgcgg 2340 acgtatgtgg gccccatgac cgagagcctg tttcccggtt accacaccaa ggcgcgggcg 2400 gtgatgaact ttgtggttcg ctaccggcca gacgagcagc cgtctctgcg gccacaccac 2460 gactcatcca ccttcaccct caacgttgcc ctcaaccaca agggcctgga ctatgaggga 2520 ggtggctgcc gcttcctgcg ctacgactgt gtgatctcct ccccgaggaa gggctgggca 2580 ctcctgcacc ccggccgcct cacccactac cacgaggggc tgccaacgac ctggggcaca 2640 cgctacatca tggtgtcctt tgtcgacccc tgacactcaa ccactctgcc aaacctgccc 2700 tgccattgtg cctttttagg gggcctggcc cccgtcctgg gagttggggg atgggtctct 2760 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cacccagacc cactccccgg ccaccagttc cccctcgagg 1740 cccacttcga ggccctctcc ctcagtaaat tcacattttc cttcctcctg ttacattttc 1800 ccaatatctt ttctattcct tggaccaatc agagatgctg tagctccttg gggcaaaggt 1860 actaatccct ttcagcaccc ccactccatt ccccttttta atgtaacttt ttccacagga 1920 ggtatttctt ttttatgttg gtcctgagta ttttgcaaat gcacagagaa aataaaacta 1980 aactccttgt ttaaaaaaaa a 2001 <210> 6 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 amino acid sequence <400> 6 Met Ala Ala Gly Pro Ile Ser Glu Arg Asn Gln Asp Ala Thr Val Tyr 1 5 10 15 Val Gly Gly Leu Asp Glu Lys Val Ser Glu Pro Leu Leu Trp Glu Leu 20 25 30 Phe Leu Gln Ala Gly Pro Val Val Asn Thr His Met Pro Lys Asp Arg 35 40 45 Val Thr Gly Gln His Gln Gly Tyr Gly Phe Val Glu Phe Leu Ser Glu 50 55 60 Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Ile Lys Ile Met Asn Met Ile Lys Leu Tyr 65 70 75 80 Gly Lys Pro Ile Arg Val Asn Lys Ala Ser Ala His Asn Lys Asn Leu 85 90 95 Asp Val Gly Ala Asn Ile Phe Ile Gly Asn Leu Asp Pro Glu Ile Asp 100 105 110 Glu Lys Leu Leu Tyr Asp Thr Phe Ser Ala Phe Gly Val Ile Leu Gln 115 120 125 Thr Pro Lys Ile Met Arg Asp Pro Asp Thr Gly Asn Ser Lys Gly Tyr 130 135 140 Ala Phe Ile Asn Phe Ala Ser Phe Asp Ala Ser Asp Ala Ala Ile Glu 145 150 155 160 Ala Met Asn Gly Gln Tyr Leu Cys Asn Arg Pro Ile Thr Val Ser Tyr 165 170 175 Ala Phe Lys Lys Asp Ser Lys Gly Glu Arg His Gly Ser Ala Ala Glu 180 185 190 Arg Leu Leu Ala Ala Gln Asn Pro Leu Ser Gln Ala Asp Arg Pro His 195 200 205 Gln Leu Phe Ala Asp Ala Pro Pro Pro Ser Ala Pro Asn Pro Val 210 215 220 Val Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Pro Pro Pro Gly Met Pro Pro Pro 225 230 235 240 Gly Ser Phe Pro Pro Val Pro Pro Pro Gly Ala Leu Pro Pro Gly 245 250 255 Ile Pro Pro Ala Met Pro Pro Pro Pro Met Pro Pro Gly Ala Ala Gly 260 265 270 His Gly Pro Pro Ser Ala Gly Thr Pro Gly Ala Gly His Pro Gly His 275 280 285 Gly His Ser His Pro His Pro Phe Pro Pro Gly Gly Met Pro His Pro 290 295 300 Gly Met Ser Gln Met Gln Leu Ala His His Gly Pro His Gly Leu Gly 305 310 315 320 His Pro His Ala Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gln Pro Pro Pro Arg 325 330 335 Pro Pro Pro Gly Met Pro His Pro Gly Pro Pro Pro Met Gly Met Pro 340 345 350 Pro Arg Gly Pro Pro Phe Gly Ser Pro Met Gly His Pro Gly Pro Met 355 360 365 Pro Pro His Gly Met Arg Gly Pro Pro Pro Leu Met Pro Pro His Gly 370 375 380 Tyr Thr Gly Pro Pro Arg Pro Pro Pro Tyr Gly Tyr Gln Arg Gly Pro 385 390 395 400 Leu Pro Pro Pro Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Val Pro Pro Arg Gly 405 410 415 Pro Leu Arg Gly Pro Leu Pro Gln 420 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Forward Primer <400> 7 gaaccgttac gggaactgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Reverse Primer <400> 8 cccggaagag gtcttcatct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Forward Primer <400> 9 cagctccagg accacttctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Reverse Primer <400> 10 gagcgggcgt agtactcatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Forward Primer <400> 11 ctcagatgca gcttgcacac 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Reverse Primer <400> 12 ggagggccag tgtatccat 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_exon1-2 Forward Primer <400> 13 tccaacttct gggctgttct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_exon1-2 Reverse Primer <400> 14 atgattctgc cctcctcctt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_intron1 Forward Primer <400> 15 tgtcaggtcc gcatgtcttg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGFA_intron1 Reverse Primer <400> 16 acccgcatca gatcattcct 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 Forward Primer <400> 17 ttaccaagag ctcatgccac c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4 Reverse Primer <400> 18 ggtgtgcctt gagatgggaa 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4-Full Forward Primer <400> 19 ttctgggccc ccacatta 18 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLF4-Full Reverse Primer <400> 20 tccactgtct gggatttaaa aatg 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIP1 Forward Primer <400> 21 tgagagtccc tacactaaat ccg 23 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRIP1 Reverse Primer <400> 22 attcctcccg ataccgtcag a 21 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP1 Forward Primer <400> 23 acctatgccc tgaccgttg 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP1 Reverse Primer <400> 24 tgctggggaa ggcaatagac t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT80 Forward Primer <400> 25 tgatgggtga gtcggaatta 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRT80 Reverse Primer <400> 26 cttcccagga attccagata ca 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 27 accaggtggt ctcctctgac 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 28 tgctgtagcc aaattcgttg 20 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control Sense siRNA <400> 29 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control Antisense siRNA <400> 30 acgaaauugg uggcguagg 19 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Sense siRNA <400> 31 aagaagcugg aggaaagggg u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BANF1 Antisense siRNA <400> 32 accccuuucc uccagcuucu u 21 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Sense siRNA <400> 33 gcaucuggag cuuucugua 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLOD3 Antisense siRNA <400> 34 uacagaaagc uccagaugc 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Sense siRNA <400> 35 gcaguaccuc uguaaccgu 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF3B4 Antisense siRNA <400> 36 acgguuacag agguacugc 19 <210> 37 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Banf1 Sense siRNA <400> 37 ccucagcguu ucaaucuuu 19 <210> 38 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Banf1 Antisense siRNA <400> 38 aaagauugaa acgcugagg 19 <210> 39 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plod3 Sense siRNA <400> 39 cgacugcaga aucuccucu 19 <210> 40 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plod3 Antisense siRNA <400> 40 agaggagauu cugcagucg 19 <210> 41 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf3b4 Sense siRNA <400> 41 cugcuuuacg auacuuuca 19 <210> 42 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sf3b4 Antisense siRNA <400> 42 ugaaaguauc guaaagcag 19
Claims (7)
상기 SF3B4 유전자에 대한 억제제는 SF3B4에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것인, SF3B4가 발현되어 KLF4가 저발현된 간암의 전이 억제용 약학적 조성물.According to claim 1,
The inhibitor for the SF3B4 gene is siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, aptamer, or antibody specific for SF3B4, SF3B4 is expressed and KLF4 is a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of low-expression liver cancer.
상기 SF3B4 유전자에 대한 억제제는 서열번호 35 및 36; 또는 서열번호 41 및 42의 염기서열로 이루어진 siRNA 또는 Spliceostatin A인 것인, SF3B4가 발현되어 KLF4가 저발현된 간암의 전이 억제용 약학적 조성물.According to claim 1,
The inhibitors for the SF3B4 gene are SEQ ID NOs: 35 and 36; Or siRNA or Spliceostatin A consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 41 and 42, SF3B4 is expressed and KLF4 is a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of low-expression liver cancer.
상기 SF3B4 유전자에 대한 억제제는 SF3B4에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체인 것인, SF3B4가 발현되어 KLF4가 저발현된 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.6. The method of claim 5,
The inhibitor for the SF3B4 gene is siRNA, shRNA, antisense oligonucleotide, aptamer or antibody specific for SF3B4, SF3B4 is expressed, KLF4 is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of low-expression liver cancer.
상기 SF3B4 유전자에 대한 억제제는 서열번호 35 및 36; 또는 서열번호 41 및 42의 염기서열로 이루어진 siRNA 또는 Spliceostatin A인 것인, SF3B4가 발현되어 KLF4가 저발현된 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. The method of claim 5,
The inhibitors for the SF3B4 gene are SEQ ID NOs: 35 and 36; Or siRNA or Spliceostatin A consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 41 and 42, SF3B4 is expressed, KLF4 is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of low-expression liver cancer.
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