KR102266930B1 - OsPHS4 Gene enhancing pre-harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 OsPHS4 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsPHS4 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 수발아 저항성이 증진되므로, 이를 이용하면 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.The present invention relates to an OsPHS4 gene for enhancing water germination resistance of plants, a recombinant vector comprising the gene, a plant transformed with the recombinant vector, a method for producing a transgenic plant with enhanced water germination resistance, and a method for enhancing water germination resistance of a plant is about
According to the present invention, plants transformed with OsPHS4 gene derived from rice have improved water germination resistance compared to wild-type plants. It is effective in increasing the productivity of crop plants and can be usefully used to build a platform for developing crops tolerant of environmental stress.

Description

수발아 저항성을 증진시키는 벼 유래 OsPHS4 유전자 및 이의 용도{OsPHS4 Gene enhancing pre-harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof}OsPHS4 gene enhancing pre-harvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof

본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 및 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a gene for enhancing water germination resistance of a plant, a recombinant vector comprising the gene, a plant transformed with the recombinant vector, a method for producing a transgenic plant with enhanced water germination resistance, and a method for enhancing water germination resistance of a plant. it's about

전 인류의 절반이 주식으로 삼고 있는 벼는 세계적으로 가장 중요한 식량 작물이다. 20세기 이후 종자 생산량 증대, 양질의 종자 생산, 수확 후 안정성 유지와 같은 농업형질 증진을 위해 관행 육종방법으로 수많은 벼 재배종들이 개발되어졌다. 종자의 휴면성은 수분, 빛, 온도 등 적절한 환경적 조건에서도 종자 발아가 억제되는 생리형질이다. 일반적으로 종자가 발달하는 과정에서 정상적으로 생성되는 휴면성은 완숙 종자에서 일정기간 동안 유지되며, 시간이 지나면 휴면성이 타파된다. 종자의 휴면은 식물의 생존에 필요한 기본 형질로서, 예를 들어 휴면 종자는 발아하지 않은 상태로 보다 먼 지역까지 확산될 수 있는 기회를 얻게 되며 생존에 불리한 환경 조건에서 발아되지 않음으로서 극심한 환경스트레스 조건에서도 생명을 유지한 채로 좋은 환경이 될 때까지 기다릴 수 있다.Rice, which is the staple food of half of the world, is the world's most important food crop. Since the 20th century, numerous rice cultivars have been developed as conventional breeding methods to improve agricultural traits such as increasing seed production, producing high-quality seeds, and maintaining stability after harvest. Seed dormancy is a physiological trait that suppresses seed germination even under appropriate environmental conditions such as moisture, light, and temperature. In general, dormancy, which is normally generated in the process of seed development, is maintained for a certain period of time in mature seeds, and over time, dormancy is broken. Seed dormancy is a basic trait necessary for the survival of plants. For example, dormant seeds have an opportunity to spread to more distant regions without germination, and do not germinate under adverse environmental conditions for survival under severe environmental stress conditions. You can wait until the environment is good while maintaining life.

만약 종자의 휴면성이 없거나 매우 약하다면 비가 많이 와서 수분이 계속 높은 환경이 지속되면 수확전에 미성숙한 종자들이 이삭에 달린 채로 발아가 일어날 것이다. 이런 현상을 수발아(pre-harvest sprouting, PHS)라고 한다(Bewley and Black, Seeds, 1994; Finkelstein et al., Ann Rev Plant Biol., 59:387-415, 2008). 따라서 수확시기에 종자 휴면성은 벼, 밀, 옥수수 등 주요 곡물에서 중요한 농업형질이며, 전 세계적으로 곡물의 수발아에 의한 생산량 감소와 곡물 품질 저하 때문에 경제적 손실이 심각한 상황이다. 이와 반대로, 종자의 휴면성이 너무 심하면 경작지에서 발아가 균일하게 유지되지 못하기 때문에 적절한 수준의 휴면보유는 새로운 품종 개발에 매우 중요한 농업적 특성이다.If the seeds do not have dormancy or are very weak, if there is a lot of rain and a high moisture environment continues, immature seeds will germinate before harvesting. This phenomenon is called pre-harvest sprouting (PHS) (Bewley and Black, Seeds, 1994; Finkelstein et al., Ann Rev Plant Biol., 59:387-415, 2008). Therefore, seed dormancy at harvest time is an important agricultural trait for major grains such as rice, wheat, and corn, and the economic loss is serious worldwide due to the decrease in production and deterioration of grain quality due to the number of germination of grains. Conversely, if seed dormancy is too severe, germination cannot be maintained uniformly in arable land, so maintaining an appropriate level of dormancy is a very important agricultural characteristic for the development of new varieties.

일반적으로 야생 벼의 종자휴면성이 강한데 비해 오랫동안 육종에 의해 개발된 자포니카형 벼 재배종들은 농사짓기 편하게 휴면성이 약화되었으며, 개발된 벼 재배종간에도 종자 휴면 정도가 매우 다양하다. 종자 발달과정에서 출수 후 약 1주일 이내에 배아의 분화가 완성되고 약 25일경에 배아의 성숙이 끝나면서 휴면성을 획득하게 되는데 이를 1차 휴면성(primary dormancy)라고 한다. 종자의 1차 휴면성은 수많은 내적 요인과 환경 인자에 의해 영향을 받는 유전적으로 복잡한 특성이다(Li and Foley, Trends Plant Sci., 2:384-389, 1997). 종자가 성숙하면 휴면성이 점진적으로 소실되어지거나 저온 또는 다른 환경적 자극에 의해 타파된다. 국내에서 개발된 벼 품종의 경우 휴면성이 유지되는 기간이 짧은 것으로 보고되어 있다(Suh and Kim, Korean J Crop Sci., 39;187-192, 1994; Park and Kim, Korean J Crop Sci., 54:241-248, 2009). 예를 들어 고품벼는 밥맛이 매우 뛰어난 품종으로 개발되었으나 (최임수 등 작물과학연구논총 2005. 6:18~28: Sun et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18385), 수발아저항성이 약한 단점을 가지고 있다.In general, wild rice has strong seed dormancy, but japonica-type rice cultivars developed by breeding for a long time have weakened dormancy for easy farming, and the degree of seed dormancy varies greatly among developed rice cultivars. In the process of seed development, differentiation of embryos is completed within about one week after seeding, and maturation of embryos is completed around 25 days, and dormancy is acquired. This is called primary dormancy. Seed primary dormancy is a genetically complex trait that is influenced by numerous intrinsic and environmental factors (Li and Foley, Trends Plant Sci., 2:384-389, 1997). When the seeds mature, dormancy is gradually lost or destroyed by low temperatures or other environmental stimuli. In the case of domestically developed rice varieties, it has been reported that the dormancy period is short (Suh and Kim, Korean J Crop Sci., 39;187-192, 1994; Park and Kim, Korean J Crop Sci., 54: 241-248, 2009). For example, high-quality rice was developed as a cultivar with excellent taste (Choi, et al., Crop Science Research Journal 2005. 6:18~28: Sun et al. PLoS One. 2011. 6(4):e18385), but had low germination resistance. It has weak disadvantages.

또한, 식물호르몬인 ABA(abscisic acid)는 종자의 휴면성을 획득하고 유지하는 과정에 관여하는 중요 조절자로 알려져 있다(Gubler et al., Curr Op in Plant Biol., 8:183-187, 2005; Kermode, J Plant Growth Regulation., 24:319-344, 2005). ABA의 생합성과 ABA 반응성은 벼, 옥수수와 같은 주요 곡물의 종자 휴면성에 영향을 주는 인자이다. 벼 종자의 휴면성은 ABA 뿐만 아니라 종자 성숙기의 환경조건, 수확 후 종자보관 온도, 수분함량, 산소, 질소, 이산화탄소 등 다양한 조건에 의해 영향을 받는다(Roberts, J Exp Botany, 13:75-94, 1962; Ikehashi, Jap J Breeding, 22:209-216, 1972). 또한 벼 종자의 휴면은 종피의 물리적 특성이나 종피가 포함하는 화학적 물질에 따라서 영향을 받는 것으로 알려져 있다(Bewley and Black, Seeds, 1994). 종자의 휴면성이 여러 가지 다양한 유전자에 의해 조절된다고 알려져 있음에도 불구하고 종자 휴면의 유전적 근원에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. In addition, abscisic acid (ABA), a plant hormone, is known as an important regulator involved in the process of acquiring and maintaining seed dormancy (Gubler et al., Curr Op in Plant Biol., 8:183-187, 2005; Kermode). , J Plant Growth Regulation., 24:319-344, 2005). ABA biosynthesis and ABA reactivity are factors affecting seed dormancy of major crops such as rice and maize. The dormancy of rice seeds is affected not only by ABA, but also by various conditions such as environmental conditions during seed maturation period, seed storage temperature after harvest, moisture content, oxygen, nitrogen, and carbon dioxide (Roberts, J Exp Botany, 13:75-94, 1962). ; Ikehashi, Jap J Breeding, 22:209-216, 1972). Also, it is known that the dormancy of rice seeds is affected by the physical properties of the seed coat or the chemical substances contained in the seed coat (Bewley and Black, Seeds, 1994). Although it is known that seed dormancy is regulated by a number of different genes, little is known about the genetic origin of seed dormancy.

대한민국공개특허 제10-2016-0149573호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2016-0149573

본 발명의 하나의 목적은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide an OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 that promotes water germination resistance of plants.

본 발명의 다른 목적은 상기 OsPHS4 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the OsPHS4 gene.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 OsPHS4 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a plant transformed with the OsPHS4 gene or the recombinant vector.

본 발명의 또 다른 목적은, 제3항의 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention, comprising the steps of preparing the recombinant vector of claim 3; And to provide a method for producing a transgenic plant with improved resistance to water germination, comprising the step of transforming the vector into the plant.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 OsPHS4 유전자 또는 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for enhancing water germination resistance of a plant, comprising introducing the OsPHS4 gene or the recombinant vector into the plant.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for promoting water germination resistance of plants containing the recombinant vector.

본 발명자들은 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 적응할 수 있는 종자 또는 작물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 등숙단계의 수발아 저항성을 향상시키는 벼 유래의 OsPHS4 유전자를 발굴하였으며, 이를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 식물체 또는 이로부터 수득한 종자의 수발아 저항성이 야생형식물체 또는 종자와 비교하여 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다. 특히 본 발명을 통해 품질은 우수하나 수발아 저항성이 약한 벼 품종의 수발아저항성을 증진시키는데 이용할 수 있다. As a result of diligent efforts to develop seeds or crops that can adapt to poor environments where the risk of damage to water germination is increased due to abnormal climate, the present inventors have discovered a rice-derived OsPHS4 gene that improves water germination resistance in the ripening stage. The present invention was completed by preparing a plant transformed with the recombinant vector, and confirming that the water germination resistance of the transformed plant or seed obtained therefrom is improved compared to that of a wild-type plant or seed. In particular, through the present invention, it can be used to improve water germination resistance of rice varieties with excellent quality but weak water germination resistance.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 식물의 수발아 저항성을 증진시키는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention provides an OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 that promotes water germination resistance of plants.

본 발명에서 용어 "수발아(pre-harvest sprouting, PHS)"는 생리적 성숙기에 도달한 이삭이 강우로 인하여 발생하는 습한 조건으로 수확 전 종실이 이삭에 달린 채로 발아하는 현상으로, 곡물에서 중요한 농업형질인 종자 휴면성(seed dormancy)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.In the present invention, the term "pre-harvest sprouting (PHS)" refers to a phenomenon in which an ear that has reached physiological maturity germinates while the seed is attached to the ear before harvest under humid conditions caused by rainfall, which is an important agricultural trait in grains. It is known to be associated with seed dormancy.

본 발명에서 용어 "종자 휴면성(seed dormancy)"은 성숙한 종자에 적당한 발아 조건을 주어도 일정 기간 동안 발아하지 않는 현상으로, 종자의 휴면성이 없거나 매우 약하다면 비가 많이 와서 수분이 계속 높은 환경이 지속되면 수확 전에 미성숙한 종자들이 이삭에 달린 채로 발아가 일어나는 수발아 현상을 유발하게 된다.In the present invention, the term "seed dormancy" refers to a phenomenon in which mature seeds do not germinate for a certain period of time even when appropriate germination conditions are given. Previously immature seeds are attached to the ear, causing the phenomenon of water germination in which germination occurs.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 유전자인 "OsPHS4(Oryza sativa pre-harvest sprouting 4)"은 벼(Oryza sativa) 유래 유전자로, 염색체 6번(chromosome 6)에 위치한 Os06g38470 유전자이며, 상기 유전자가 인코딩하는 단백질의 아미노산 서열은 히스톤 수식화를 조절하는 Histone deacethylase 단백질과 유사성이 높다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 수발아 저항성이 약한 고품벼 종자의 유전자 발현분석을 통하여 수발아 저항성 관련 유전자를 동정하기 위해 고품벼에서 출수 후 종자발달 단계에 따라 RNA를 분리하여 microarray 분석을 수행하고, 종자 휴면이 상실되는 등숙기인 25 DAH에서 40 DAH 사이에 유전자 발현이 4배 이상 증가하는 유전자(Os06g38470)를 선발하였으며, 염기서열 분석 결과 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 확인하고 이를 OsPHS4로 명명하였다. 또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, OsPHS4 유전자의 과발현을 통해서 벼 종자의 수발아 저항성이 증진됨을 확인하여, 상기 유전자는 식물체의 수발아 저항성에 관여함을 확인하였다(도 5).In the present invention, the gene represented by SEQ ID NO: 1 "OsPHS4 (Oryza sativa pre-harvest sprouting 4)" is a rice ( Oryza sativa )-derived gene, located on chromosome 6 (chromosome 6) Os06g38470 gene, the gene is encoded The amino acid sequence of the protein is highly similar to the histone deacethylase protein, which regulates histone modification. According to an embodiment of the present invention, first, through gene expression analysis of high-quality rice seeds with weak germination resistance, In order to identify genes related to water germination resistance, microarray analysis was performed by separating RNA according to the seed development stage after seeding from high-quality rice, and gene expression increased more than 4 times between 25 DAH and 40 DAH, which is the normal ripening period in which seed dormancy is lost. The gene (Os06g38470) was selected, and as a result of nucleotide sequence analysis, it was confirmed that it had the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and this was named OsPHS4. In addition, in one embodiment of the present invention, it was confirmed that the water germination resistance of rice seeds was enhanced through overexpression of the OsPHS4 gene, and it was confirmed that the gene was involved in the water germination resistance of the plant ( FIG. 5 ).

상기 OsPHS4 유전자는 벼(Oryza sativa) 유래로, 구체적으로 동진벼 또는 고품벼 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The OsPHS4 gene is derived from rice ( Oryza sativa ), specifically, it may be derived from Dongjinbyeo or high quality rice, but is not limited thereto.

상기 OsPHS4 유전자는 서열번호 1의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.The OsPHS4 gene is not limited to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and includes a functionally equivalent codon or a nucleotide sequence including a codon encoding the same amino acid, or a codon encoding a biologically equivalent amino acid. Considering mutations having biologically equivalent activity, the nucleotide sequence used in the present invention is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence described in the sequence listing. The substantial identity is at least 60% when the sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence that exhibits homology, more specifically 70% homology, even more specifically 80% homology, and most specifically 90% homology.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a recombinant vector comprising the OsPHS4 gene.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환용 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 수발아 저항성을 증진시키는 재조합 벡터일 수 있다.In the present invention, the recombinant vector includes a recombinant vector for transformation. In addition, the recombinant vector of the present invention may be a recombinant vector that enhances water germination resistance.

본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.As used herein, the term “recombinant” refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a heterologous peptide, or a protein encoded by the heterologous nucleic acid. Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the native form of the cell, either in sense or antisense form. Recombinant cells can also express genes found in cells in a natural state, but the genes are modified and re-introduced into cells by artificial means.

본 발명에서 "형질전환용 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.In the present invention, the term "recombinant vector for transformation" refers to a gene construct including essential regulatory elements operably linked to express a gene insert, and includes all common vectors including plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, and viral vectors. include

본 발명의 "형질전환용 재조합 벡터"는 상기 OsPHS4 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.The "recombinant vector for transformation" of the present invention is functionally linked to an expression control sequence so that the OsPHS4 gene can be expressed. For example, the vector includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, operator, initiation codon, stop codon, polyadenylation signal, and enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. . In addition, the vector may include a selectable marker, and the vector may be self-replicating or integrated into host DNA. The vector of the present invention can be prepared using a genetic recombination technique well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation are performed using enzymes generally known in the art.

본 발명의 일실시예에서는, pGA2897-3X 계열 벡터의 maize ubiquitin 프로모터의 하류에 OsPHS4 유전자를 연결하고, OsPHS4 단백질의 C 말단에 HA epitope를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 pGA2897-OsPHS4-3xHA 재조합 벡터를 제조하였다. In one embodiment of the present invention, pGA2897-OsPHS4-3xHA recombinant vector which is constantly expressed in plants by linking the OsPHS4 gene to the downstream of the maize ubiquitin promoter of the pGA2897-3X family vector and linking the HA epitope to the C terminus of the OsPHS4 protein prepared.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a plant transformed with the gene or recombinant vector.

본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.As used herein, the term "transformation" refers to a phenomenon in which DNA enters the cell and changes the genetic trait when DNA, which is a genetic material, is injected into a living cell of another lineage. Also called conversion.

본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.In the present invention, "transformation" of a plant with the vector can be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. Specifically, transformation method using Agrobacterium, microprojectile bombardment, electroporation, PEG-mediated fusion, microinjection, liposome-mediated method ( liposome-mediated method, In planta transformation, Vacuum infiltration method, floral meristem dipping method, or Agrobacterium spraying method can be used. And, more specifically, a transformation method using Agrobacterium or an Agrobacterium spraying method may be used.

본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다. In the present invention, the term "plant" is meant to include not only mature plants, but also plant cells, plant tissues, and seeds of plants that can develop into mature plants.

본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 일례로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 구체적으로는 벼이나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the plant is not particularly limited, and as an example, food crops including rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, wheat, red bean, oat or sorghum; vegetable crops including Arabidopsis thaliana, Chinese cabbage, radish, red pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion or carrot; special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, sugar beet, perilla, peanut or rapeseed; fruit trees, including apple trees, pear trees, jujube trees, peaches, poplars, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots or bananas; flowers including roses, gladiolus, gerberas, carnations, chrysanthemums, lilies or tulips; And ryegrass, red clover, orchard grass, alpha alpha, tall fescue or any one selected from the group consisting of forage crops including perennial ryegrass, specifically rice, but is not limited thereto.

본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 OsPHS4 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 OsPHS4 유전자 또는 OsPHS4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 OsPHS4의 발현을 증진시킬 수 있다.In the present invention, since the transformed plant expresses the OsPHS4 gene or a protein thereof, the expression of OsPHS4 present in the plant can be enhanced by introducing a recombinant vector containing the OsPHS4 gene or the OsPHS4 gene.

본 발명의 일실험예에 따르면, 고품벼 유래의 OsPHS4 유전자가 과발현된 벼의 형질전환체를 제작하기 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium )을 사용하여, 동진벼의 형질전환체를 제작하였다. 대조구(동진벼)와 동진벼 기반의 OsPHS4 형질전환 벼를 포장에서 육성한 후, 출수후 41 일째의 이삭을 채취한 후 이삭에서 종자를 분리하여 페트리디쉬에 넣고 100% 상대습도, 30도, 암조건에서 5일간 종자 발아율을 측정하였다. 그 결과 야생형인 동진벼의 경우 출수 후 41 일째 이삭의 종자가 적정발아조건에서 3일째에 80% 이상 발아하는데 비하여, OsPHS4 형질전환체의 종자는 20% 미만으로 종자의 휴면성이 크게 증진되었음을 확인하였으며(도 5A). 완전히 성숙한 종자에서도 OsPHS4 형질전환체의 종자가 야생형인 동진벼에 비해 종자가 발아하는데 걸리는 시간이 느려지는 것을 확인하였다 (도 5B)According to an experimental example of the present invention, a transformant of Dongjinbyeo was prepared using Agrobacterium in order to produce a transformant of rice overexpressing the OsPHS4 gene derived from high-quality rice. After cultivating the control (Dongjinbyeo) and Dongjinbyeo-based OsPHS4 transgenic rice in the field, and harvesting the ears on the 41st day after planting, separate the seeds from the ears and put them in a Petri dish under 100% relative humidity, 30 degrees, and dark conditions. The seed germination rate was measured for 5 days. As a result, it was confirmed that, in the case of wild-type Dongjinbyeo, the seed dormancy was significantly improved to less than 20% in the seed of the OsPHS4 transformant, compared to the germination of 80% or more on the 3rd day under proper germination conditions at the 41st day after planting ( 5A). Even in fully mature seeds, it was confirmed that the time it takes for seeds to germinate was slower in the seeds of the OsPHS4 transformant compared to the wild-type Dongjinbyeo (Fig. 5B).

상기의 결과를 통해, 본 발명의 형질전환된 식물체는 수발아 저항성유전자인 OsPHS4 유전자의 세포 내 발현 수준을 증가시켜, 등숙 단계에서 문제가 되는 벼의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.Through the above results, it was confirmed that the transformed plant of the present invention can enhance the water germination resistance of rice, which is a problem in the ripening stage, by increasing the intracellular expression level of the OsPHS4 gene, which is a water germination resistance gene.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다. As another aspect, the present invention comprises the steps of preparing a recombinant vector comprising the OsPHS4 gene; And it provides a method for producing a transgenic plant having improved resistance to water germination, comprising the step of transforming the vector into the plant.

본 발명에서, 상기 "OsPHS4 유전자", "재조합 벡터", "식물체", "내수발아 저항성"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In the present invention, the descriptions of the "OsPHS4 gene", "recombinant vector", "plant", and "resistant germination in water" are the same as described above.

본 발명은 상기 수발아 저항성을 가지는 OsPHS4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다. In the present invention, it is possible to prepare a recombinant vector containing the OsPHS4 gene having resistance to water germination, and to transform it into a plant, thereby producing a transgenic plant having improved resistance to water germination.

상기 식물체를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물체로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.)The method for transforming the plant is the same as described above, and the method of the present invention includes the step of redifferentiating the transgenic plant from the transformed plant. Any method known in the art may be used for the method of redifferentiating the transgenic plant. Techniques for the redifferentiation of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species (Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1-5, 1983-1989 Momillan, N.Y.)

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS4 유전자 또는 상기 OsPHS4 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다. As another aspect, the present invention provides a method for enhancing water germination resistance of a plant, comprising introducing the OsPHS4 gene or a recombinant vector comprising the OsPHS4 gene into the plant.

본 발명에서 용어 "OsPHS4 유전자", "재조합 벡터", "식물체", "수발아 저항성"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.In the present invention, the terms "OsPHS4 gene", "recombinant vector", "plant", and "water germination resistance" are the same as described above.

본 발명에서 용어 "유전자를 식물체에 도입하는 단계"는 특정 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 그 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 의미한다. In the present invention, the term "introducing a gene into a plant" refers to a step of preparing a recombinant vector including a polynucleotide having a specific nucleotide sequence and transforming the recombinant vector into a plant.

구체적으로 본 발명에서는, OsPHS4 유전자를 삽입하여 형질전환용 재조합 벡터 pGA2897-OsPHS4-3xHA를 제작하고, 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 사용하여, 동진벼의 형질전환체를 제작하였으며, 상기 OsPHS4 유전자 도입에 의해 식물체의 수발아 저항성이 증진되는 것을 확인하였다.Specifically, in the present invention, a recombinant vector pGA2897-OsPHS4-3xHA for transformation was prepared by inserting the OsPHS4 gene, and using Agrobacterium , a transformant of Dongjinbyeo was prepared, and by introducing the OsPHS4 gene, It was confirmed that the water germination resistance of the plant was improved.

본 발명에 의하면, 상기 OsPHS4 유전자의 발현이 증진되는 경우, 식물체의 수발아 저항성이 증진되므로, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 OsPHS4 유전자의 발현을 증진하는 형질전환용 벡터를 이용하여, 식물체를 형질전환하거나 또는 다른 인위적인 물질의 처리에 의해 상기 유전자의 발현을 증진시켜 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 것도 가능하며, 이에 제한되지 않는다.According to the present invention, when the expression of the OsPHS4 gene is enhanced, since the water germination resistance of the plant is enhanced, in order to enhance the water germination resistance of the plant, as described above, using a transformation vector that promotes the expression of the OsPHS4 gene. , It is also possible to enhance the water germination resistance of the plant by transforming the plant or enhancing the expression of the gene by treatment with other artificial substances, but is not limited thereto.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 OsPHS4 유전자 또는 상기 OsPHS4 유전자를 포함하는, 포함하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물을 제공한다. As yet another aspect, the present invention provides a composition for enhancing water germination resistance of a plant comprising the OsPHS4 gene or the OsPHS4 gene.

상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있다.The composition can enhance the water germination resistance of the plant by transforming the plant with a recombinant vector comprising the OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.

본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsPHS4 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 수발아 저항성이 증진되므로, 이를 이용하면 이상기후로 인해 수발아 피해 위험성이 높아진 불량환경 하에서도 강하게 자랄 수 있는 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.According to the present invention, plants transformed with OsPHS4 gene derived from rice have improved water germination resistance compared to wild-type plants. It is effective in increasing the productivity of crop plants and can be usefully used to build a platform for developing crops tolerant of environmental stress.

도 1은 종자 발달 단계에 따른 전사체 분석을 이용한 종자발현 유전자 선발을 나타낸 도이다: (A) 고품벼의 종자발달 단계, (B) 선별된 OsPHS4 유전자의 종자 발달 단계에 따른 발현율.
도 2는 pGA2897-OsPHS4-3XHA 식물 발현 벡터 모식도를 나타낸다.
도 3은 OsPHS4 과발현 형질전환 벼의 RT-PCR 분석 결과이다: DJ, 동진벼 (대조구); T86, 87, 88, 89, 162 (OsPHS4 형질전환 벼).
도 4는 OsPHS4 과발현 형질전환 벼의 Western 분석 결과이다: DJ, 동진벼 (대조구); T86, 87, 88, 89, 162 (OsPHS4 형질전환 벼.
도 5는 OsPHS4 과발현 동진벼의 종자 발아율 비교 결과이다: (A) 출수 후 41일된 동진벼와 OsPHS4 과발현 동진벼 이삭에서 분리한 종자의 발아율 비교 분석, 사진: 출수후 41일된 이삭의 침윤 후 7일째 사진 비교 (상대습도 100%, 28도 조건), (B) 수확 후 90일된 동진벼와 OsPHS4 과발현 동진벼 성숙 종자의 발아율 비교 분석.1 is a diagram illustrating seed expression gene selection using transcript analysis according to seed development stages: (A) high-quality rice seed development stages, (B) expression rates of selected OsPHS4 genes according to seed development stages.
2 shows a schematic diagram of a pGA2897-OsPHS4-3XHA plant expression vector.
3 shows the results of RT-PCR analysis of OsPHS4 overexpressing transgenic rice: DJ, Dongjinbyeo (control); T86, 87, 88, 89, 162 (OsPHS4 transgenic rice).
4 is a Western analysis result of OsPHS4 overexpressing transgenic rice: DJ, Dongjinbyeo (control); T86, 87, 88, 89, 162 (OsPHS4 transgenic rice.
5 is a comparison result of seed germination rate of OsPHS4 overexpressing Dongjinbyeok: (A) Comparative analysis of the germination rate of seeds isolated from Dongjinbyeo 41-day-old and OsPHS4-overexpressing Dongjinbyeok ears after seeding, Photo: Comparison of photos on day 7 after infiltration of the 41-day-old ears (Relative humidity 100%, 28 degrees), (B) Comparative analysis of the germination rate of Dongjinbyeo 90 days after harvest and Dongjinbyeo overexpressing OsPHS4.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those of ordinary skill in the art can easily carry out the present invention. However, the present invention may be embodied in many different forms and is not limited to the embodiments described herein.

<실시예 1> 벼 종자발달 전사체 분석과 Os06g38470(OsPHS4) 유전자 선발<Example 1> Rice seed development transcript analysis and Os06g38470 (OsPHS4) gene selection

고품벼는 수발아 저항성이 매우 약한 품종이다. 고품벼에서 출수 후 종자발달 단계 (도 1A)에 따라 고품벼 출수 후 3~6일, 25일 40일째에 각각 종자를 채취한 후 total RNA를 분리하였다. 종자 발달 단계에 따른 유전자 발현양상의 변화를 분석하기 위하여 total RNA를 분리하여 microarray 분석을 수행하고, 종자 휴면이 상실되는 등숙기인 25 DAH에서 40 DAH 사이에 유전자 발현이 4배 이상 증가하는 유전자 (Os06g38470)를 선발하고 이를 OsPHS4로 명명하였다 (도 1B). High quality rice is a cultivar with very weak germination resistance. According to the seed development stage (FIG. 1A) after planting in high-pom rice, seeds were collected on the 3rd, 6th, 25th, and 40th days after planting of high-pom rice, respectively, and total RNA was isolated. To analyze the changes in gene expression patterns according to the seed development stage, total RNA was isolated and microarray analysis was performed. Genes whose gene expression increases more than 4 times between 25 DAH and 40 DAH, which are the mature stages in which seed dormancy is lost (Os06g38470) ) and named it OsPHS4 (FIG. 1B).

<실시예 2> OsPHS4 유전자 분리 및 OsPHS4 과발현 벡터 제작<Example 2> OsPHS4 gene isolation and OsPHS4 overexpression vector construction

동진벼의 잎에서 RNA를 추출하여 cDNA를 작성하고 하기 OsPHS4-F 및 OsPHS4-R 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 1557 bp 길이의 OsPHS4 유전자의 ORF를 분리하고 염기서열을 분석하였다(서열번호 1). 그 결과 염기서열이 Os06g38470 유전자와 99.8% 일치하는 것을 확인하였다. RNA was extracted from the leaves of Dongjinbyeok to prepare cDNA, and PCR was performed using the following OsPHS4-F and OsPHS4-R primer sets to isolate the ORF of the OsPHS4 gene with a length of 1557 bp and analyzed the base sequence (SEQ ID NO: 1) . As a result, it was confirmed that the nucleotide sequence was 99.8% identical to the Os06g38470 gene.

벼 종자의 수발아저항성을 개량하기 위한 목적으로 OsPHS4 유전자를 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 하기 OsPHS4-entF 및 OsPHS4-entR 프라이머 세트를 이용하여 pGA2897-3X 계열 벡터의 maize ubiquitin 프로모터의 하류에 OsPHS4 유전자를 연결하고, OsPHS4 단백질의 C 말단에 HA epitope를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 형질전환 벡터 (pGA2897-OsPHS4-3xHA)를 제작하였다 (도 2).In order to confirm whether the OsPHS4 gene can be utilized for the purpose of improving the water germination resistance of rice seeds, the OsPHS4 gene was added downstream of the maize ubiquitin promoter of the pGA2897-3X family vector using the following OsPHS4-entF and OsPHS4-entR primer sets. A transformation vector (pGA2897-OsPHS4-3xHA) was constructed by ligating the HA epitope to the C-terminus of the OsPHS4 protein (Fig. 2).

OsPHS4-entF 프라이머(서열번호 2): GCCGCCCCCTTCACCATGGACGCCTCCGCCGGAGOsPHS4-entF primer (SEQ ID NO:2): GCCGCCCCCTTCACCATGGACGCTCCGCCGGAG

OsPHS4-entR 프라이머(서열번호 3): TCGGCGCGCCCACCCTTTGTCTTCTGGTGCACCGATGOsPHS4-entR primer (SEQ ID NO: 3): TCGGCGCGCCCACCCTTTGTCTTCTGGTGCACCGATG

<실시예 3> OsPHS4 발현 벡터가 삽입된 벼 형질전환체 제작 및 도입 유전자와 단백질 발현 확인<Example 3> Preparation of a rice transformant into which the OsPHS4 expression vector is inserted, and confirmation of transgene and protein expression

동진벼의 종자로부터 유도한 캘루스에 상기 pGA2897-OsPHS4-3xHA 벡터를 포함하는 아그로박테리움(Agrobacterium)을 접종하고, hygromycin (30 ㎍/ml)을 포함하는 배지에서 형질전환 캘루스를 선발한 후 줄기와 뿌리를 유도하여 형질전환 벼를 생산하였다. Wherein a loose Cal derived from the seeds of dongjinbyeo pGA2897-OsPHS4-3xHA Agrobacterium (Agrobacterium) inoculation and, after selecting a hygromycin stem dig loose transformants in a culture medium containing (30 ㎍ / ml) containing the vector and roots to produce transgenic rice.

동진벼와 OsPHS4 형질전환 벼의 잎에서 각각 RNA를 분리하고 cDNA를 제작한 후 OsPHS4 유전자 특이적인 하기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RNA was isolated from the leaves of Dongjinbyeo and OsPHS4 transgenic rice, respectively, and cDNA was prepared, and then RT-PCR was performed using the following primer set specific to the OsPHS4 gene.

OsPHS4-486F 프라이머(서열번호 4): 5‘-CTGCTACGTCAACGACATCGTCC-3’OsPHS4-486F Primer (SEQ ID NO: 4): 5'-CTGCTACGTCAACGACATCGTCC-3'

OsPHS4-905R 프라이머(서열번호 5): 5‘-GACCTCATGAATCTCACGCATTCC-3’OsPHS4-905R primer (SEQ ID NO: 5): 5'-GACCTCATGAATCTCACGCATTCC-3'

그 결과 대조구에 비해 OsPHS4 형질전환 벼에서 도입한 OsPHS4 유전자의 발현수준이 높은 것을 확인하였다(도 3). As a result, it was confirmed that the expression level of the OsPHS4 gene introduced from the OsPHS4 transgenic rice was higher than that of the control ( FIG. 3 ).

또한 OsPHS4 단백질의 C-말단에 표지된 HA epitope에 대한 항체를 이용하여, OsPHS4 형질전환벼에서 OsPHS4 단백질이 제대로 발현되고 있는지를 western 분석을 통해 확인하였다. 이를 위하여 동진벼와 OsPHS4 형질전환 벼의 잎에서 각각 분리한 단백질 분획을 SDS-PAGE로 전개하여 나일론막으로 옮긴 후 anti-HA 항체를 이용하여 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과 OsPHS4 형질전환벼에서만 도입된 OsPHS4 단백질이 발현되고 있음을 확인하였다(도 4). 한편 내재 단백질 대조구인 히스톤 H3 단백질은 동진벼와 형질전환벼에서 모두 정상적으로 발현되었다. 따라서 OsPHS4 발현벡터가 도입된 형질전환 벼에서 도입된 OsPHS4 유전자 및 OsPHS4 단백질이 높게 발현되고 있음을 증명하였다. In addition, using an antibody against the HA epitope labeled at the C-terminus of the OsPHS4 protein, it was confirmed through western analysis whether the OsPHS4 protein was properly expressed in the OsPHS4 transgenic rice. To this end, protein fractions isolated from the leaves of Dongjinbyeo and OsPHS4-transformed rice were developed by SDS-PAGE, transferred to a nylon membrane, and protein expression was analyzed using an anti-HA antibody. As a result, it was confirmed that the OsPHS4 protein introduced only in the OsPHS4 transgenic rice was expressed (FIG. 4). Meanwhile, histone H3 protein, an endogenous protein control, was normally expressed in both Dongjinbyeo and transgenic rice. Therefore, it was verified that the introduced OsPHS4 gene and OsPHS4 protein were highly expressed in the transgenic rice into which the OsPHS4 expression vector was introduced.

<실시예 4> OsPHS4 과발현 형질전환 벼의 등숙 단계 수발아저항성 분석<Example 4> Analysis of water germination resistance at maturity stage of transgenic rice overexpressing OsPHS4

대조구(동진벼)와 동진벼 기반의 OsPHS4 형질전환 벼를 포장에서 육성후, 출수후 41 일째의 이삭을 채취한 후 이삭에서 종자를 분리하여 페트리디쉬에 넣고 100% 상대습도, 30도, 암조건에서 5일간 종자 발아율을 측정하였다. 그 결과 야생형인 동진벼의 경우 출수후 41 일째 이삭의 종자가 적정발아조건에서 3일째에 80% 이상 발아하는데 비하여, OsPHS4 형질전환체의 종자는 20% 미만으로 종자의 휴면성이 크게 증진되었음을 확인하였다 (도 5A). After cultivating the control (Dongjinbyeo) and Dongjinbyeo-based OsPHS4 transgenic rice in the field, and harvesting the ears on the 41st day after planting, separate the seeds from the ears and put them in a Petri dish under 5 conditions of 100% relative humidity, 30 degrees, and dark conditions. The daily seed germination rate was measured. As a result, it was confirmed that, in the case of wild-type Dongjinbyeo, the seed dormancy was significantly improved to less than 20% in the seed of the OsPHS4 transformant, compared to the germination of 80% or more on the 3rd day under the optimal germination conditions at the 41st day after planting ( 5A).

또한 완전히 성숙한 종자에서도 OsPHS4 형질전환체의 종자가 야생형인 동진벼에 비해 종자가 발아하는데 걸리는 시간이 느려지는 것을 확인하였다 (도 5B). 동진벼 종자의 경우 침윤 후 48시간째에 95%가 발아한 반면 OsPHS4 형질전환체의 종자의 발아율은 70%였다. 따라서 OsPHS4 유전자가 종자 휴면을 유지시키는 기능이 있으며, OsPHS4 유전자의 과발현을 통해서 등숙 단계에서 문제가 되는 벼의 수발아 저항성을 증진시킬 수 있음을 증명하였다.In addition, it was confirmed that even in fully matured seeds, the time it takes for seeds to germinate is slower in OsPHS4 transformant seeds compared to wild-type Dongjinbyeo (Fig. 5B). In the case of Dongjinbyeo seeds, 95% of them germinated 48 hours after infiltration, whereas the germination rate of seeds of the OsPHS4 transformant was 70%. Therefore, it was demonstrated that the OsPHS4 gene has a function of maintaining seed dormancy, and that overexpression of the OsPHS4 gene can enhance the germination resistance of rice, which is a problem in the ripening stage.

<110> Republic of Korea <120> OsPHS4 Gene enhancing preharvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof <130> DP20190142 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4 <400> 1 atggacgcct ccgccggagg cggggggaac tcgctgccga cggcgggggc cgacggggcc 60 aagcggcggg tgtgctactt ctacgacgcg gaggtgggga actactacta cgggcagggg 120 cacccgatga agccgcaccg catccggatg acccacgcgc tgctcgccca ctacggcctc 180 ctcgaccaga tgcaggtgct caagccccac ccggcgcgcg accgcgacct ctgccgcttc 240 cacgccgacg actacgtcgc cttcctccgc tccgtcacgc cggagaccca gcaggaccag 300 atccgggcgc tcaagcgctt caacgtcggc gaggactgcc ccgtcttcga cggcctctac 360 agcttctgcc agacctacgc cgggggatcc gtcggcggcg ccgtcaagct caaccacggc 420 cacgacatcg ccatcaactg ggccggcggc ctccaccacg ccaagaagtg cgaggcctcg 480 ggattctgct acgtcaacga catcgtcctc gccatcctcg agctcctcaa ataccaccag 540 cgtgttctct atgtggatat cgatatccac catggggatg gtgtggagga ggcgttctac 600 acaacggaca gggtgatgac ggtctcgttc cacaagtttg gggattattt cccggggacc 660 ggggacattc gcgatattgg gcactcaaag gggaagtatt actctctgaa tgtcccgttg 720 gacgacggta tcgacgacga gagctaccag tcgttgttca agccgatcat ggggaaggtg 780 atggaggttt ttcgccctgg cgcggtggtg ctccagtgcg gtgcggactc tctgtcgggt 840 gataggttgg gttgcttcaa cctgtcaatc aggggccacg cggaatgcgt gagattcatg 900 aggtccttca atgtcccgct gttgctgctt ggtggtggtg ggtataccat aagaaatgtt 960 gcgcggtgtt ggtgctatga gacaggagtt gcacttggtc atgagctcac tgacaagatg 1020 cctccaaatg agtattttga gtactttggt ccagattata cacttcatgt tgcaccaagt 1080 aacatggaga acaaaaacac acgccagcag ttggatgata taagatcaag acttcttgat 1140 aatctttcaa aacttcgaca tgctcctagc gtccaatttc aagagcgacc ccctgaggct 1200 gagctacctg agcaggatga agaccaagag gatcctgatg aaaggcacca tgctgattct 1260 gatgtggaaa tggatgatgt caaacctttg gatgactcag gaaggaggag cagtattcag 1320 aatgtgagag ttaagagaga gtctgctgaa acagatgccg cagatcagga tggtaatagg 1380 gtcgctgcag agaacaccaa gggcacagaa cctgcggctg atggagttgg ttcctcgaaa 1440 caaactgttc ctaccgatgc aagtgcgatg gccatagacg aaccaggctc cctgaaagtc 1500 gagccagata actcaaacaa attgcaagat caaccatcgg tgcaccagaa gacataa 1557 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-entF primer <400> 2 gccgccccct tcaccatgga cgcctccgcc ggag 34 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-entR primer <400> 3 tcggcgcgcc caccctttgt cttctggtgc accgatg 37 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-486F primer <400> 4 ctgctacgtc aacgacatcg tcc 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-905R primer <400> 5 gacctcatga atctcacgca ttcc 24 <110> Republic of Korea <120> OsPHS4 Gene enhancing preharvest sprouting tolerance derived from Oryza sativa and uses thereof <130> DP20190142 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4 <400> 1 atggacgcct ccgccggagg cgggggggaac tcgctgccga cggcgggggc cgacggggcc 60 aagcggcggg tgtgctactt ctacgacgcg gaggtgggga actactacta cgggcagggg 120 cacccgatga agccgcaccg catccggatg acccacgcgc tgctcgccca ctacggcctc 180 ctcgaccaga tgcaggtgct caagccccac ccggcgcgcg accgcgacct ctgccgcttc 240 cacgccgacg actacgtcgc cttcctccgc tccgtcacgc cggagaccca gcaggaccag 300 atccgggcgc tcaagcgctt caacgtcggc gaggactgcc ccgtcttcga cggcctctac 360 agcttctgcc agacctacgc cgggggatcc gtcggcggcg ccgtcaagct caaccacggc 420 cacgacatcg ccatcaactg ggccggcggc ctccaccacg ccaagaagtg cgaggcctcg 480 ggattctgct acgtcaacga catcgtcctc gccatcctcg agctcctcaa ataccaccag 540 cgtgttctct atgtggatat cgatatccac catggggatg gtgtggagga ggcgttctac 600 acaacggaca gggtgatgac ggtctcgttc cacaagtttg gggattattt cccggggacc 660 ggggacattc gcgatattgg gcactcaaag gggaagtatt actctctgaa tgtcccgttg 720 gacgacggta tcgacgacga gagctaccag tcgttgttca agccgatcat ggggaaggtg 780 atggaggttt ttcgccctgg cgcggtggtg ctccagtgcg gtgcggactc tctgtcgggt 840 gataggttgg gttgcttcaa cctgtcaatc aggggccacg cggaatgcgt gagattcatg 900 aggtccttca atgtcccgct gttgctgctt ggtggtggtg ggtataccat aagaaatgtt 960 gcgcggtgtt ggtgctatga gacaggagtt gcacttggtc atgagctcac tgacaagatg 1020 cctccaaatg agtattttga gtactttggt ccagattata cacttcatgt tgcaccaagt 1080 aacatggaga acaaaaacac acgccagcag ttggatgata taagatcaag acttcttgat 1140 aatctttcaa aacttcgaca tgctcctagc gtccaatttc aagagcgacc ccctgaggct 1200 gagctacctg agcaggatga agaccaagag gatcctgatg aaaggcacca tgctgattct 1260 gatgtggaaa tggatgatgt caaacctttg gatgactcag gaaggaggag cagtattcag 1320 aatgtgagag ttaagagaga gtctgctgaa acagatgccg cagatcagga tggtaatagg 1380 gtcgctgcag agaacaccaa gggcacagaa cctgcggctg atggagttgg ttcctcgaaa 1440 caaactgttc ctaccgatgc aagtgcgatg gccatagacg aaccaggctc cctgaaagtc 1500 gagccagata actcaaacaa attgcaagat caaccatcgg tgcaccagaa gacataa 1557 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-entF primer <400> 2 gccgccccct tcaccatgga cgcctccgcc ggag 34 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-entR primer <400> 3 tcggcgcgcc caccctttgt cttctggtgc accgatg 37 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-486F primer <400> 4 ctgctacgtc aacgacatcg tcc 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OsPHS4-905R primer <400> 5 gacctcatga atctcacgca ttcc 24

Claims (7)

삭제delete 삭제delete 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 포함하는 식물의 수발아 저항성 증진용 재조합 벡터로 형질전환된 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체.A transgenic plant with enhanced water germination resistance transformed with a recombinant vector for promoting water germination resistance of a plant comprising the OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 제3항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상인, 수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체.According to claim 3, wherein the plant is rice, wheat, barley, corn, soybean, potato, red bean, oats, and at least one selected from the group consisting of sorghum, transgenic plant with improved water germination resistance. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 포함하는 식물의 수발아 저항성 증진용 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는,
수발아 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.Preparing a recombinant vector for promoting water germination resistance of a plant comprising the OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; and
Containing the step of transforming the vector into a plant,
A method for producing a transgenic plant with improved water germination resistance. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 포함하는 식물의 수발아 저항성 증진용 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 수발아 저항성을 증진시키는 방법.A method for enhancing water germination resistance of a plant, comprising introducing a recombinant vector for promoting water germination resistance of a plant comprising the OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 into the plant. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsPHS4 유전자를 포함하는 식물의 수발아 저항성 증진용 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 수발아 저항성 증진용 조성물.A composition for promoting water germination resistance of a plant comprising a recombinant vector for promoting water germination resistance of a plant comprising the OsPHS4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
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