KR102264434B1 - Novel Probe for Specific Staphylococcus aureus and Uses Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 황색포도상구균-특이 핵산 프로브 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프로브는 황색포도상구균으로부터 분비되는 뉴클레아제에 의해 절단되어 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 거리적으로 분리되면서 유의한 형광 신호의 증가가 구현되어, 황색포도상구균의 검출 및 동정 뿐만 아니라 항균제 감수성을 정확하고 신속용이하게 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 황색포도상구균-특이 항생제 내성 진단(SF-AST; S. aureus specific FRET probe based AST) 시스템은 쉽게 실시할 수 있고, 신속하며, 경제적일 뿐만 아니라, 마이크로타이트레이션 플레이트 리더로 판독하기에 적합하도록 설계되어 기존 기술들을 쉽게 활용할 수 있어 임상 치료의 기초를 제공한다. The present invention relates to a Staphylococcus aureus-specific nucleic acid probe and a use thereof, wherein the probe of the present invention is cleaved by a nuclease secreted from Staphylococcus aureus so that a quencher and a fluorophore are separated by a distance A significant increase in the fluorescence signal is realized as the fluorescence signal is increased, so that not only the detection and identification of Staphylococcus aureus, but also the antimicrobial sensitivity can be accurately and quickly and easily confirmed. Therefore, the Staphylococcus aureus-specific antibiotic resistance diagnostic (SF-AST; S. aureus specific FRET probe based AST) system of the present invention is easy to implement, fast, economical, and read with a microtitration plate reader. It is designed to be suitable for treatment and provides the basis for clinical treatment as it can easily utilize existing technologies.
Description
본 발명은 황색포도상구균-특이 핵산 프로브 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to Staphylococcus aureus-specific nucleic acid probes and uses thereof.
감염질환은 병원체가 혈액, 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서, 원인균의 정확한 동정 및 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우, 생명을 잃을 수 있는 질병이다. 더욱이 최근에는 항생제 투여의 오남용으로 인해 병원체의 배양률이 감소하게 되었고, 이식에 따른 면역억제제 사용의 증가, 항암 치료로 인한 약물투여의 증가 등으로 인한 원인병원체가 다양해지게 되면서 배양 검사와 같은 기존의 감염질환을 진단하는 진단방법들이 점차 어려움에 부딪히고 있는 실정이다. 따라서, 이를 조속히 진단함과 동시에 원인 병원체의 종류를 확인하는 것이 치료에 있어서 상당히 중요한 위치를 차지한다.Infectious disease is a disease that occurs when a pathogen appears and begins to live in blood, body fluids, and tissues, and is a disease that can lead to death if the causative bacteria are not accurately identified and treated appropriately. Moreover, in recent years, the culture rate of pathogens has decreased due to the misuse and abuse of antibiotic administration, and as the causative pathogens are diversified due to the increase in the use of immunosuppressants following transplantation, and the increase in drug administration due to anticancer treatment, conventional methods such as culture tests Diagnostic methods for diagnosing infectious diseases are increasingly difficult. Therefore, prompt diagnosis and identification of the causative pathogen at the same time occupies a very important position in treatment.
이들 감염성 병원균 중 현재 전 세계적으로 가장 문제가 되고 있는 스타필로코코스 아우레우스는 황색포도상구균으로 불리며, 전체 인구의 약 30%에서 검출되는 그람 양성균으로서, 피부감염, 연조직 감염, 골관절염, 폐렴, 균혈증, 식중독 등을 일으키는 병원균으로 적절한 항생제로 치료를 하지 못했을 때 이환율과 치명률이 높다. 따라서 선별검사를 통하여 적절한 예방조치를 취하는 것이 중요하다.Among these infectious pathogens, Staphylococcus aureus, which is currently the most problematic in the world, is called Staphylococcus aureus, and is a gram-positive bacterium detected in about 30% of the total population, and is a gram-positive bacterium that is used for skin infections, soft tissue infections, osteoarthritis, pneumonia, and bacteremia. It is a pathogen that causes food poisoning, etc., and the morbidity and fatality rate are high when proper antibiotic treatment is not performed. Therefore, it is important to take appropriate preventive measures through screening tests.
이와 같은 필요성으로 인해 오랫동안 감염질환 원인균인 스타필로코코스 아우레우스를 동정하고자 하는 진단 방법들이 연구 및 개발되어 왔다. 지난 10년 동안에 많은 미생물을 검출하는데 상당한 진보가 있어 왔지만 현재 이용되고 있는 진단 방법들은 여전히 많은 노동을 필요로 하고 있고 민감도 및 특이성이 낮은 편이다.Due to this necessity, diagnostic methods to identify Staphylococcus aureus, the causative agent of infectious diseases, have been researched and developed for a long time. Although significant advances have been made in detecting many microorganisms in the past decade, currently used diagnostic methods are still labor intensive and have low sensitivity and specificity.
한편, 페니실린 (Penicilin), 메티실린(methicillin) 등 포도상구균 항균제는 그 효과가 우수하여 지난 수십 년간 본 감염증의 주요 치료약제로 사용되어 왔으나, 1961년 영국에서 메티실린에 내성을 보이는 균주 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)가 처음 보고된 이후 전 세계적으로 지속적인 증가 추세를 보이고 있다.On the other hand, staphylococcal antibacterial agents such as penicillin and methicillin have excellent effectiveness and have been used as major therapeutic agents for this infection for the past several decades, but in 1961 in the UK, methicillin-resistant strains (methicillin-resistant) Staphylococcus aureus (MRSA) has been continuously increasing worldwide since it was first reported.
이러한 병원균은 자기방어수단으로 항생제에 대한 내성을 돌연변이나 항생제 내성 유전자를 습득함으로써 얻게 되는데, 이러한 내성균의 발현 빈도는 항생제의 오용과 남용이 많아짐에 따라 더욱 증가하고 있고, 이러한 내성 병원균에 의한 전염병의 유행은 전세계의 건강 합병증 및 사망에 있어 가장 일반적인 원인 중 하나이다. 따라서, 항균제 내성을 방지하기 위해서는 광범위한 항균제의 남용과 오용을 줄일 수 있는 신속하고 정확한 항균제 감수성 검사(AST; antibacterial susceptibility testing)가 필요하다.These pathogens acquire resistance to antibiotics as a means of self-defense by acquiring mutations or antibiotic resistance genes. The frequency of expression of these resistant bacteria is increasing as the misuse and abuse of antibiotics increases, and the number of infectious diseases caused by these resistant pathogens is increasing. Epidemiology is one of the most common causes of health complications and deaths worldwide. Therefore, in order to prevent antimicrobial resistance, rapid and accurate antibacterial susceptibility testing (AST) that can reduce abuse and misuse of a wide range of antimicrobial agents is required.
즉, 신속한 항균제 감수성 검사(AST; antibacterial susceptibility testing)는 여러 유형의 박테리아 감염, 특히 전 세계적으로 문제인 다약제-내성 병원균의 임상 치료를 규정하는 데 필수적이다.In other words, rapid antibacterial susceptibility testing (AST) is essential to define the clinical treatment of several types of bacterial infections, particularly multidrug-resistant pathogens that are a worldwide problem.
이러한 항균제 감수성 검사(AST, Antibacterial susceptibility testing) 방법은 임상 표본에서 박테리아 분리체의 항균제 내성을 검출하고 특정 감염에 대해 선택된 약제에 대한 감수성을 확인하는 데 사용되는 시험 관내 방법으로, 박테리아에 사용할 항균제의 종류를 선택할 수 있게 해주는 직접적이고, 중요한 검사이다. 또한, 환자에 대하여 적절한 항균제를 처방할 때 처방 방법과 횟수, 비용, 부작용을 고려하여 맞춤 처방이 가능하게 해준다. 감수성 결과를 이용한다면 항균제를 경험적 처방을 하였을 때 생길 수 있는 치료 비용 증가와 보호자의 실망감을 줄여줄 수 있으며 세균의 내성 획득과 합병증의 감소 그리고 환자의 회복기간을 줄일 수 있는 기회를 제공한다. 따라서, AST 결과는 개별 환자를 위한 최적의 항균제 치료법을 선택하고, 임상 내성 감시를 실시하고, 항균제 처방에 대한 제도적 또는 전국적 정책을 수립하는데 유용한 임상 지침이 될 수 있다.This antibacterial susceptibility testing (AST) method is an in vitro method used to detect antimicrobial resistance of bacterial isolates in clinical specimens and to confirm susceptibility to selected agents for specific infections. It is a direct, important test that allows you to choose a type. In addition, when prescribing an appropriate antibacterial agent for a patient, it enables customized prescription in consideration of the prescription method, frequency, cost, and side effects. If the sensitivity result is used, it can reduce the increase in treatment cost and the disappointment of the caregiver that can occur when empirically prescribing an antibacterial agent, and provides an opportunity to acquire bacterial resistance, reduce complications, and shorten the recovery period of the patient. Therefore, AST results can be useful clinical guidelines for selecting optimal antimicrobial therapy for individual patients, conducting clinical resistance monitoring, and establishing institutional or national policies for antimicrobial prescribing.
임상 미생물학 실험실에서 가장 널리 사용되는 AST 방법은 테스트 중인 항균제가 있는 상태에서 박테리아의 성장을 관찰하며, 최소억제농도(MIC, minimal inhibitory concentration)를 기준으로 감수성 여부를 판정한다.The AST method, which is most widely used in clinical microbiology laboratories, observes the growth of bacteria in the presence of the antimicrobial agent being tested, and determines whether susceptibility is based on the minimal inhibitory concentration (MIC).
그러나, 디스크 확산 테스트, E-테스트 스트립 (bioMιrieux, 프랑스), 액체 배지 희석법(broth macrodilution, broth microdilution) 및 한천 희석 감수성 테스트와 같은 통상적인 배양-기반 방법들은 밤새 박테리아를 배양하여 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이다. 이러한 전통적인 방법은 결과를 내기 위해 17-24 시간의 시간이 필요하다. However, conventional culture-based methods such as disc diffusion tests, E-test strips (bioMιrieux, France), broth macrodilution (broth microdilution) and agar dilution susceptibility tests are time consuming and labor intensive by culturing bacteria overnight. Intensive. These traditional methods require 17-24 hours to produce results.
즉, 종래에는 서로 다른 약물에 대한 세포의 반응 검사를 수행할 때 세포를 액체 또는 고체 배지에 넣고 검사하고자 하는 약물을 액체 배지와 혼합하거나 또는 고체 배지 위에 약물을 흡수시킨 종이 디스크를 올려 세포와 반응시킨 다음 세포의 약물에 대한 성장반응을 혼탁도(흡광도)로 측정하여 약물에 대한 반응을 측정하였다. 이러한 방식은 개별 세포의 변화보다 통계학적인 정보를 수집하는 방법이고 통계학적인 결과를 얻기 위해서 세포 수가 어느 정도(보통 1ml 당 천만 개체) 이상 자라야 하기 때문에 배양 시간이 오래 걸리는 문제가 있다(보통 16~24시간). 또한, 약물에 대한 개별 세포에서 발생하는 변화의 관측과 운동성이 있는 개별 세포의 실시간 관측은 불가능하며, 약물을 주입하는 방법에 있어서 개별 약물에 대해서 개별적으로 주입하는 과정이 필요하여 많은 수의 약물을 검사하는데 시간과 노력이 많이 요구된다.That is, conventionally, when performing a reaction test of cells to different drugs, the cells are placed in a liquid or solid medium and the drug to be tested is mixed with the liquid medium, or a paper disk in which the drug is absorbed is placed on the solid medium to react with the cells. Then, the growth response of the cells to the drug was measured by turbidity (absorbance) to measure the response to the drug. This method collects statistical information rather than individual cell changes, and in order to obtain statistical results, the number of cells must grow to a certain level (usually 10 million individuals per 1 ml), so there is a problem that the culture takes a long time (usually 16 to 24). time). In addition, observation of changes occurring in individual cells for a drug and real-time observation of individual cells with motility are impossible, and in the method of injecting a drug, it is necessary to inject a large number of drugs individually for each drug. The inspection requires a lot of time and effort.
이러한 실험 및 인큐베이션 시간을 줄이기 위해, VITEK2® 시스템 (프랑스 bioMιrieux), MicroScan 시스템 (독일 Siemens) 및 BD Phoenix 시스템 (미국 BD diagnostic Systems)과 같은 다양한 자동화 계측 시스템이 개발되어 6-8 시간 내에 빠른 결과를 얻을 수 있게 되었다. 그러나, 이러한 기술은 리소스-제한 설정에서 사용을 제한할 수 있는 부피가 크고 값 비싼 지원 장비를 필요로 한다.In order to reduce these experiments and incubation times, various automated metrology systems have been developed, such as the VITEK2® system (bioMιrieux, France), the MicroScan system (Siemens, Germany) and the BD Phoenix system (BD diagnostic Systems, USA) with fast results within 6-8 hours. was able to get However, these techniques require bulky and expensive support equipment that can limit their use in resource-limited settings.
게다가, 고체 배지에서의 항균제 감수성 검사의 경우 KB-test는 약물을 올릴 수 있는 개수가 한정되어서 기본 수십 가지의 항균제의 감수성 검사를 위해서 많은 수의 한천배지 플레이트가 요구된다. 이런 검사시간을 최소화한 자동화 장비인 VITEK 시스템인 경우에도 마찬가지로 균의 탁도가 일정 수준 이상 증가해야 하기 때문에 보통 12 시간 이상의 오랜 시간이 소요되는 한계가 있다. In addition, in the case of antimicrobial susceptibility test in solid medium, KB-test requires a large number of agar plates to test the sensitivity of several dozen basic antimicrobial agents because the number of drugs that can be raised is limited. Even in the case of the VITEK system, which is an automated equipment that minimizes the inspection time, there is a limitation that it usually takes more than 12 hours because the turbidity of bacteria must increase by more than a certain level.
또한, 기존 방법은 테스트 환경이 인체 내 환경과 다르므로 실제로 인체 내 일어나는 현상과 많은 차이점이 있을 수 있다(Gregory G. Anderson, et al.(2003), "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections", Science 301, 105; Gallo et al.(2011),"Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay.", J Bone Joint Surg Am, 93).In addition, since the test environment of the existing method is different from that of the human body, there may be many differences from the actual phenomenon occurring in the human body (Gregory G. Anderson, et al. (2003), "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections ", Science 301, 105; Gallo et al. (2011)," Demonstration of Bacillus cereus in Orthopedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay.", J Bone Joint Surg Am, 93).
보다 최근에는 PCR 기반 기술, 질량 분광법, 마이크로 어레이, 마이크로유체 및 전체 게놈 시퀀싱과 같은 내성의 신속한 탐지를 위한 새로운 접근법이 임상 미생물 실험에 도입되었다. 그러나 여전히 고가의 장비 및/또는 숙련된 인력이 필요하다.More recently, novel approaches for the rapid detection of resistance, such as PCR-based techniques, mass spectrometry, microarrays, microfluidic and whole-genome sequencing, have been introduced into clinical microbiological experiments. However, expensive equipment and/or skilled personnel are still required.
이에, 종래의 항균제 감수성 검사의 한계를 극복하기 위하여, 신속한 항균제 감수성 검사 (Rapid AST, RAST) 방법으로서, 액적 내의 미생물 세포의 대사 활성으로 인한 형광 시그널을 측정하는 방법이 대두되고 있다.Accordingly, in order to overcome the limitations of the conventional antimicrobial susceptibility test, as a rapid antimicrobial susceptibility test (Rapid AST, RAST) method, a method of measuring a fluorescence signal due to the metabolic activity of microbial cells in a droplet is emerging.
한편, 뉴클레아제는 핵산의 인산이에스테르(phosphodiester) 결합을 절단하는 효소이며 endo 또는 exo, DNase 또는 RNase, 제한 효소, 리보자임 또는 CRISPR/Cas9 시스템일 수 있다. 뉴클레아제는 복제, DNA 수리, 재조합 및 바이러스 방어와 같은 많은 생물학적 과정에 관여하며 임상 연구 및 생명 공학 분야에도 매우 유용하다. 뉴클레아제의 생물학적 기술적 중요성 및 광범위한 용도에서의 이들의 사용으로 인해, 많은 상이한 기술이 뉴클레아제 활성을 검출하기 위해 개발되어왔다. 그 중 형광 기술은 뉴클레아제 활성 분석을 위한 가장 인기 있는 도구 중 하나이며 민감하고 신속하다. On the other hand, the nuclease is an enzyme that cleaves a phosphodiester bond of a nucleic acid, and may be endo or exo, DNase or RNase, restriction enzyme, ribozyme, or CRISPR/Cas9 system. Nucleases are involved in many biological processes such as replication, DNA repair, recombination and viral defense, and are also very useful in clinical research and biotechnology fields. Because of the biological and technological importance of nucleases and their use in a wide range of applications, many different techniques have been developed to detect nuclease activity. Among them, the fluorescence technique is one of the most popular tools for nuclease activity analysis, and is sensitive and rapid.
따라서, 이러한 형광 기술을 이용하여 박테리아 내 뉴클레아제 활성을 검출함으로써 항균제 감수성을 실시간으로 측정할 수 있고, 시간 및 노동력을 단축시켜, 종래 항균제 감수성 검사법의 문제점을 극복한 신규한 접근법의 개발이 필요하다.Therefore, it is necessary to develop a novel approach that can measure antimicrobial susceptibility in real time by detecting nuclease activity in bacteria using this fluorescence technique, and reduce time and labor, thereby overcoming the problems of conventional antimicrobial susceptibility testing methods. Do.
이에 본 발명자들은 고가의 장비 및 숙련된 실험자 없이 신속하며 효과적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus; S. aureus)를 검출 및/또는 동정할 뿐만 아니라, 황색포도상구균의 항균제 감수성을 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 (i) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출용 마커로서 황색포도상구균의 뉴클레아제(nuclease)의 활성을 측정할 수 있는, 퀀처(quencher) 및 형광단(fluorophore)을 갖는 단일가닥 프로브인 황색포도상구균-특이 FRET-기반 DNA 프로브; 및 (ii) 황색포도상구균 뉴클레아제를 검출하는 제제로서 상기 FRET-기반 DNA 프로브(probe)를 이용하는, 황색포도상구균-특이 항생제 내성 진단(SF-AST; S. aureus specific FRET probe based AST) 방법을 개발하였다. Accordingly, the present inventors developed a method capable of quickly and effectively detecting and/or identifying Staphylococcus aureus ( S. aureus ) without expensive equipment and skilled experimenters, as well as diagnosing the antimicrobial sensitivity of Staphylococcus aureus. endeavored to do so. As a result, the present inventors (i) Staphylococcus aureus as a marker for detection, capable of measuring the activity of the nuclease of Staphylococcus aureus (nuclease), a quencher (quencher) and having a fluorophore (fluorophore) a Staphylococcus aureus-specific FRET-based DNA probe that is a single-stranded probe; And (ii) using the FRET-based DNA probe as an agent for detecting Staphylococcus aureus nuclease, Staphylococcus aureus-specific antibiotic resistance diagnosis (SF-AST; S. aureus specific FRET probe based AST) method has been developed.
본 발명에 따르면, 황색포도상구균의 검출 및/또는 동정을 위해 황색포도상구균이 존재할 것으로 의심되는 시료에 황색포도상구균-특이 FRET-기반 DNA 프로브(probe)를 처리하는 경우, 황색포도상구균 자체로부터 분비되는 뉴클레아제에 의해 상기 프로브가 절단되면서 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 이격되면서 발생한 유의한 형광 시그널을 검출하였고; 항생제 내성 검사를 위해 황색포도상구균이 존재하는 시료에 항생제 및 상기 프로브를 처리했을 때, 항균제에 대하여 내성이 있는 경우, 항생제에 의해 사멸되지 않은 황색포도상구균의 뉴클레아제에 의하여 상기 프로브가 절단되면서 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 이격되면서 발생한 유의한 형광 시그널을 검출함으로써, 본 발명의 SF-AST 프로브가 황색포도상구균의 검출 및 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 항균제 내성을 정확하고 효율적으로 진단할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.According to the present invention, when a Staphylococcus aureus-specific FRET-based DNA probe is treated with a sample suspected of having Staphylococcus aureus for detection and/or identification of Staphylococcus aureus, it is secreted from Staphylococcus aureus itself. A significant fluorescence signal generated as the quencher and the fluorophore spaced apart as the probe was cleaved by the nuclease was detected; When antibiotics and the probe are treated in a sample in which Staphylococcus aureus is present for antibiotic resistance test, if there is resistance to the antibacterial agent, the probe is cut by the nuclease of Staphylococcus aureus, which is not killed by the antibiotic. By detecting a significant fluorescence signal generated when the quencher and the fluorophore are spaced apart, the SF-AST probe of the present invention can detect and identify Staphylococcus aureus, as well as accurately and efficiently detect antimicrobial resistance. The present invention was completed by confirming that the diagnosis can be made.
따라서, 본 발명의 일 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 또는 동정용 마커 조성물을 제공하는 데 있다.Accordingly, one object of the present invention is to provide a marker composition for detection or identification of Staphylococcus aureus.
또한, 본 발명의 다른 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 또는 동정용 키트를 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a kit for detecting or identifying Staphylococcus aureus.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항균제 내성 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항균제 내성 진단용 키트를 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing antibacterial resistance of Staphylococcus aureus.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항균제 내성 진단 방법을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is to provide a method for diagnosing antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus.
달리 정의되지 않으면, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 내용상 달리 요구되지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함하며 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기법은 당업계에 잘 알려지고 통상적으로 이용되는 것들이다.Unless defined otherwise, scientific and technical terms used in connection with the present invention have the meanings commonly understood by one of ordinary skill in the art. Also, unless the context requires otherwise, singular terms shall include the plural and plural terms shall include the singular. In general, the nomenclature and techniques used in connection with cell and tissue culture, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, and protein and nucleic acid chemistry and hybridization disclosed herein are those well known and commonly used in the art.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 9에 기재된 염기서열 또는 이의 상보적 서열; 및 이중-표지를 갖는 단일가닥-올리고뉴클레오타이드인 이중-표지 프로브를 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 또는 동정용 마커 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 의 항균제 내성 진단용 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or a complementary sequence thereof; and a double-labeled single-stranded-oligonucleotide comprising a double-labeled probe, Staphylococcus aureus ; a marker composition for detection or identification; And it provides a composition for diagnosing antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus , comprising the composition.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 이중-표지 프로브는 형광단(fluorophore) 및 퀀처(quencher)를 포함하는 상호작용적 이중-표지를 갖는다.According to a preferred embodiment of the present invention, the dual-label probe has an interactive double-label comprising a fluorophore and a quencher.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 형광단은 상기 이중-표지 프로브의 5’-말단에 결합되며, 상기 퀀처는 상기 이중-표지 프로브의 3’-말단에 결합된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the fluorophore is bound to the 5'-end of the double-labeled probe, and the quencher is bound to the 3'-end of the double-labeled probe.
상기 퀀처는 상기 이중-표지 프로브의 5’-말단에 결합되며, 상기 형광단은 상기 이중-표지 프로브의 3’-말단에 결합된다.The quencher is bound to the 5'-end of the double-labeled probe, and the fluorophore is bound to the 3'-end of the double-labeled probe.
상기 이중-표지 프로브는 뉴클레아제의 핵산 절단 반응에 의해 절단되어 상기 형광단이 상기 퀀처로부터 이격되며, 상기 퀀처 분자가 상기 형광단 분자로부터 나오는 형광 시그널을 언퀀칭(unquenching)하여 상기 형광 시그널의 변화를 야기한다.The double-labeled probe is cleaved by a nucleic acid cleavage reaction of a nuclease to separate the fluorophore from the quencher, and the quencher molecule unquenches the fluorescence signal emitted from the fluorophore molecule, thereby reducing the fluorescence signal. cause change
상기 형광단은 발광 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot) 및 양자선(quantum wire)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상이다.The fluorophore is at least one selected from the group consisting of a light emitting molecule, a metal ion, a complex compound, an organic dye, a conductor, a semiconductor, an insulator, a quantum dot, and a quantum wire.
상기 퀀처는 BHQ(Black Hole Quencher)-1, DABCYL, 이클립스(Eclipse), TAMRA, QSY-7, BHQ(Black Hole Quencher)-2, BHQ(Black Hole Quencher)-3, 및 금나노입자 (Gold nano-particle)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상이다.The quencher is BHQ (Black Hole Quencher)-1, DABCYL, Eclipse, TAMRA, QSY-7, BHQ (Black Hole Quencher)-2, BHQ (Black Hole Quencher)-3, and gold nanoparticles (Gold nano) -particle) is at least one selected from the group consisting of.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus; S. aureus; S. 아우레우스)의 검출 및 항균제 감수성(또는 내성) 여부를 판단하는 것에 이용될 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention can be used to detect Staphylococcus aureus ; S. aureus ; S. aureus) and determine whether antimicrobial sensitivity (or resistance) is present.
즉, 본 발명의 특징은, 사멸 후 황색포도상구균으로부터 배출되는 뉴클레아제가 아닌, 살아있는 황색포도상구균 자체로부터 특이적으로 분비되는 뉴클레아제에 의해 본 발명의 프로브가 절단되면서 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 이격되어 발생한 유의한 형광 시그널의 검출; 또는 항생제 내성 검사를 위해 황색포도상구균이 존재하는 시료에 항생제 및 상기 프로브를 처리했을 때, 항균제에 대하여 내성이 있는 경우, 항생제에 의해 사멸되지 않은 황색포도상구균의 뉴클레아제에 의하여 상기 프로브가 절단되면서 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 이격되어 발생한 유의한 형광 시그널의 검출을 이용하여, 황색포도상구균의 동정 및 항균제에 대한 감수성 여부를 판단 및/또는 진단하는 것이다.That is, a feature of the present invention is that the probe of the present invention is cut by a nuclease specifically secreted from living Staphylococcus aureus itself, not a nuclease discharged from Staphylococcus aureus after death, while quencher and fluorescence detection of significant fluorescence signals caused by separation of fluorophores; Or, when a sample in which Staphylococcus aureus is present is treated with an antibiotic and the probe for antibiotic resistance test, if there is resistance to the antibacterial agent, the probe is cut by the nuclease of Staphylococcus aureus that is not killed by the antibiotic. It is to identify and/or diagnose Staphylococcus aureus and whether it is sensitive to antibacterial agents by using the detection of a significant fluorescence signal generated as a quencher and a fluorophore are spaced apart.
통상적으로 당업계에서 이용하는 미생물의 항균제 감수성 검사의 경우, 세포가 사멸하여도 시각적 판독 또는 광학 밀도에 의해 감수성 여부를 결정하므로, 사멸 또는 생존력이 매우 낮은 미생물 역시 측정되어 위양성 결과를 초래할 수 있다. In the case of the antimicrobial susceptibility test of microorganisms commonly used in the art, even if cells die, whether or not sensitivity is determined by visual reading or optical density, microorganisms with very low death or viability are also measured, which may lead to false-positive results.
그러나, 본 발명의 조성물은 실질적으로 항균제 처리에 의해 황색포도상구균 에서 유리된 뉴클레아제의 검출 여부를 기반으로 하여 항균제 감수성 여부를 신속하고 용이하게 진단할 수 있으므로 상술한 바와 같은 위양성 발생 문제를 해결할 수 있다.However, the composition of the present invention can rapidly and easily diagnose whether or not antimicrobial susceptibility is based on whether or not the nuclease released from Staphylococcus aureus is substantially detected by the antibacterial agent treatment, so it is possible to solve the problem of false positives as described above. can
또한, 종래 통상적인 항균제 감수성 검사 방법은 치료를 조정하기 전에 검사 결과에 대해 수 일 동안 기다리는 동안 임상의가 지나치게 광범위한 스펙트럼 경험 치료를 처방하도록 남겨둔다. In addition, conventional conventional antimicrobial susceptibility testing methods leave clinicians prescribing overly broad-spectrum experience treatments while waiting for days for test results before adjusting treatment.
그러나, 본 발명의 조성물을 이용할 경우, 약 4-6 시간밖에 소요되지 않으므로, 짧은 시간 이내에 항균제 감수성 검사 결과를 얻을 수 있기 때문에 적절한 치료법을 투여할 수 있고, 이로써 중환자 환자의 이환율과 사망률을 잠재적으로 감소시킬 수 있다. 또한 광범위 스펙트럼 경험 치료에서 표적 특정 항균제로 신속하게 디에스컬레이션(de-escalation)하면 항균제 청지기의 노력으로 다중 약물 내성 유기체(multi-drug resistant organisms)(MDROs)의 출현과 확산을 줄일 수 있다.However, when using the composition of the present invention, since it takes only about 4-6 hours, the antimicrobial susceptibility test result can be obtained within a short time, so an appropriate treatment can be administered, thereby potentially reducing the morbidity and mortality of critically ill patients. can be reduced In addition, rapid de-escalation to target-specific antimicrobials in broad-spectrum experiential therapy can reduce the emergence and spread of multi-drug resistant organisms (MDROs) with the efforts of antimicrobial stewards.
본 명세서에 사용되는 용어 "AST(antibacterial susceptibility testing)"는 항생제 감수성 검사 또는 항균제 감수성 검사이며, 본 명세서에서 혼용된다.As used herein, the term "antibacterial susceptibility testing (AST)" is an antibiotic susceptibility test or an antimicrobial susceptibility test, and is used herein.
마찬가지로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "항균제"는 "항생제"와 혼용된다.Likewise, as used herein, the term “antibacterial agent” is used interchangeably with “antibiotic agent”.
또한, 본 명세서에서 "AST"를 언급하면서 사용되는 용어 "감수성"과 "내성"은 혼용될 수 있다.In addition, the terms "susceptibility" and "tolerance" used while referring to "AST" in the present specification may be used interchangeably.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열로 이루어진 단일가닥-올리고뉴클레오티드를 의미하며, 본 명세서에서 "이중-표지 프로브" 또는 "SF-AST 프로브"와 혼용된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the probe of the present invention refers to a single-stranded oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and is used interchangeably with "double-labeled probe" or "SF-AST probe" herein do.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"는 타겟 핵산서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 또한, 프로브는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.As used herein, the term “probe” refers to a single-stranded nucleic acid molecule comprising a region or regions that are substantially complementary to a target nucleic acid sequence. Preferably, the probe is a single-stranded deoxyribonucleotide molecule. In addition, the probe may include ribonucleotides.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 이중-표지 프로브는 서열번호 1 내지 10의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 6 내지 9의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열이고, 가장 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열이다.In one embodiment of the present invention, the double-labeled probe of the present invention may use a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10, preferably the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9 a nucleotide sequence selected from, and most preferably, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
바람직하게는, 본 발명의 이중-표지 프로브는 프로브 서열 내에 TT, AT 및 AA 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 하나 이상 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 AA 및 TT 서열을 포함하는 것이다. Preferably, the double-labeled probe of the present invention may include one or more sequences selected from the group consisting of TT, AT and AA sequences in the probe sequence, and most preferably include AA and TT sequences.
본 명세서에서 프로브를 언급하면서 사용된 용어 "말단(ends)"은 핵산 서열의 각 끝(또는 근위)에 위치하는 서열 영역을 의미한다.The term "ends" as used herein in reference to a probe refers to a sequence region located at each end (or proximal) of a nucleic acid sequence.
본 명세서에서 사용된 용어 "5'-말단" 부위는, 프로브의 5'-말단으로부터 어떤 길이의 연속적인 서열을 포함하는 부위 또는 구역을 의미한다. 바람직하게는, 프로브의 5'-말단 부위는 그의 5'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열로 구성된다.As used herein, the term "5'-end" site refers to a site or region comprising a continuous sequence of any length from the 5'-end of a probe. Preferably, the 5'-end portion of the probe consists of a sequence comprising 1-10 nucleotides from its 5'-end.
본 명세서에서 사용된 용어 "3'-말단" 부위는 프로브의 3'-말단으로부터 어떤 길이의 연속적인 서열을 포함하는 부위 또는 구역을 의미한다. 바람직하게는, 프로브의 3'-말단 부위는 그의 3'-말단으로부터 1-10 개의 뉴클레오티드를 포함하는 서열로 구성된다.As used herein, the term "3'-end" site refers to a site or region comprising a continuous sequence of any length from the 3'-end of a probe. Preferably, the 3'-end portion of the probe consists of a sequence comprising 1-10 nucleotides from its 3'-end.
본 명세서에서 사용된 용어 "퀀칭" 및 "언퀀칭"은 상대적인 개념으로 해석된다. 예를 들어, 언퀀칭은 퀀칭에 비하여 퀀칭의 효율 또는 수준이 낮은 것으로 해석될 수 있다. 즉, 리포터 분자로부터 나오는 시그널의 퀀칭은 상기 시그널의 완전한 소멸만을 의미하는 것은 아니며, 퀀칭 현상이 없는 경우와 비교하여 상대적으로 시그널이 감소되는 것을 포괄하는 의미를 갖는다. 또한, 리포터 분자로부터 나오는 시그널의 언퀀칭은 상기 시그널의 완전한 회복만을 의미하는 것은 아니며, 퀀칭 현상이 있는 경우와 비교하여 상대적으로 시그널이 증가되는 것을 포괄하는 의미를 갖는다.As used herein, the terms “quenching” and “unquenching” are to be interpreted as relative concepts. For example, unquenching may be interpreted as having a lower efficiency or level of quenching compared to quenching. That is, the quenching of the signal from the reporter molecule does not mean only the complete disappearance of the signal, but has a meaning encompassing a relatively reduced signal compared to the case in which there is no quenching phenomenon. In addition, unquenching of the signal from the reporter molecule does not mean only the complete recovery of the signal, but has a meaning encompassing a relatively increased signal compared to the case where there is a quenching phenomenon.
본 발명에서 핵산 가닥은 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 단편 또는 부분을 지칭하며, 센스 또는 안티센스 가닥을 의미할 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 본 발명에서 핵산 가닥은 바람직하게는 DNA로 이루어질 수 있다. In the present invention, nucleic acid strand refers to oligonucleotides, nucleotides or polynucleotides, and fragments or portions thereof, and refers to DNA or RNA of genomic or synthetic origin, which may refer to sense or antisense strands. In the present invention, the nucleic acid strand may preferably consist of DNA.
본 발명의 핵산 가닥은 천연 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 염기도 본 발명의 핵산에 포함될 수 있으며, 이는 예를 들어 이노신 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 상보성이 완벽할 필요는 없으며; 안정한 이중체가 불일치 염기쌍 또는 쌍을 이루지 않는 염기를 포함할 수 있다. 핵산 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 길이, 올리고뉴클레오티드의 염기 조성 및 서열, 이온 세기 및 불일치 염기쌍의 발생률과 같은 다수의 변수를 고려하여 실험적으로 이중체의 안정성을 결정할 수 있다.In the nucleic acid strand of the present invention, bases not normally found in natural nucleic acids may also be included in the nucleic acid of the present invention, including, for example, inosine and 7-deazaguanine. Complementarity need not be perfect; A stable duplex may contain mismatched or unpaired bases. One skilled in the art of nucleic acid art can determine the stability of duplexes experimentally, taking into account a number of variables, such as, for example, the length of the oligonucleotide, the base composition and sequence of the oligonucleotide, the ionic strength, and the incidence of mismatched base pairs.
본 발명의 프로브의 핵산 가닥의 길이는 한정되지 않으나 프로브의 양 말단에 존재할 수 있는 퀀처 및 형광물질이 서로의 영향을 주지 않는 길이인 것이 바람직하다.Although the length of the nucleic acid strand of the probe of the present invention is not limited, it is preferable that the quencher and the fluorescent material present at both ends of the probe do not affect each other.
본 발명의 핵산 가닥은 임의의 방식, 예를 들어 화학적 합성, DNA 복제, 역전사, PCR, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다.The nucleic acid strands of the present invention may be generated in any manner, for example, by chemical synthesis, DNA replication, reverse transcription, PCR, or a combination thereof.
본 발명에서 뉴클레아제(nuclease)는 핵산 가수분해 효소를 의미하며, 핵산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드등의 가수분해 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 뉴클레아제는 그 종류의 제한이 없으며, DNA를 분해하는 DNase, RNA를 분해하는 RNase를 포함한다. 또한, 상기 뉴클레아제는 폴리뉴클레오티다아제, 뉴클레오티다아제, 뉴클레오시다아제를 포함하는 개념이다. 또한, 이는 3' 말단 또는 5' 말단을 순차적으로 분해하는 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 포함한다. In the present invention, nuclease refers to a nucleic acid hydrolytic enzyme, and refers to an enzyme that catalyzes a hydrolysis reaction of nucleic acids, nucleotides, nucleosides, and the like. The nuclease is not limited in its type, and includes a DNase that degrades DNA and an RNase that degrades RNA. In addition, the nuclease is a concept including polynucleotides, nucleotidases, and nucleosidases. It also includes an exonuclease that sequentially degrades the 3' end or the 5' end.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어 "이격(distant)"은 언퀀칭 반응이 일어나는데 충분할 정도의 어떠한 위치 또는 장소를 포함한다.The term "distant" as used herein in reference to positions or locations includes any location or location sufficient to cause an unquenching reaction to occur.
본 발명에 있어서, 형광단은 퀀처와 물리적으로 거리가 생길 때, 형광을 발생시키는 물질로서 그 종류를 제한하지 않는다. 형광단으로는 여기상태에서 발광하는 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot), 양자선(quantum wire) 등이 있다. In the present invention, the type of the fluorophore is not limited as a material that generates fluorescence when physically distant from the quencher. Fluorophores include molecules that emit light in an excited state, metal ions, complex compounds, organic dyes, conductors, semiconductors, insulators, quantum dots, quantum wires, and the like.
상기 형광물질의 예로서, EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), EBFP (enhanced blue fluorescent protein), EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP (red fluorescent protein) 등의 형광단백질이 있다.Examples of the fluorescent material include fluorescent proteins such as enhanced green fluorescent protein (EGFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), enhanced blue fluorescent protein (EBFP), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), and red fluorescent protein (RFP). have.
또한, 상기 형광물질의 예로서, 파이렌 (Pyrene) 또는 이의 유도체, 시아닌(Cyanine, Cy) 시리즈, 알렉사플루오르(Alexa Fluor) 시리즈, 보디피 (BODIPY) 시리즈, DY 시리즈, 로다민 (rhodamine) 또는 이의 유도체, 플루오레신(Fluorescein) 또는 이의 유도체, 쿠마린 (coumarin) 또는 이의 유도체, 아크리딘 호모다이머 (Acridine homodimer) 또는 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 또는 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 또는 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 또는 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 또는 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 또는 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 또는 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 또는 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 또는 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 또는 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 또는 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 또는 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 또는 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 또는 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 또는 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 또는 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 또는 이의 유도체, 칼세인(Calcein) 또는 이의 유도체, 오레건 그린(Oregon Green) 또는 이의 유도체, 마그네슘 그린(Magnesium Green) 또는 이의 유도체, 칼슘 그린(Calcium Green) 또는 이의 유도체, JOE 또는 이의 유도체, 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine) 또는 이의 유도체, TRITC 또는 이의 유도체, TAMRA 또는 이의 유도체, 피로닌 Y(Pyronin Y) 또는 이의 유도체, 리싸민(Lissamine) 또는 이의 유도체, ROX 또는 이의 유도체, 칼슘크림선(Calcium Crimson) 또는 이의 유도체, 텍사스 레드(Texas Red) 또는 이의 유도체, 나일 레드(Nile Red) 또는 이의 유도체, 티아디카복시아닌(Thiadicarbocyanine) 또는 이의 유도체, 단실아마이드(dansylamide) 또는 이의 유도체, 캐스캐이드 블루 (cascade blue), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)일 수 있다.In addition, as an example of the fluorescent material, pyrene or a derivative thereof, cyanine (Cyanine, Cy) series, Alexa Fluor series, BODIPY series, DY series, rhodamine or Derivatives thereof, fluorescein or derivatives thereof, coumarin or derivatives thereof, acridine homodimer or derivatives thereof, acridine orange or derivatives thereof, 7-amino solution Tinomycin D (7-aminoactinomycin D, 7-AAD) or a derivative thereof, Actinomycin D (Actinomycin D) or a derivative thereof, ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) or a derivative thereof , DAPI or a derivative thereof, dihydroethidium or a derivative thereof, ethidium bromide or a derivative thereof, ethidium homodimer-1 (EthD-1) or a derivative thereof, ethidium homodimer-1 (EthD-1) or a derivative thereof Dimer-2 (EthD-2) or a derivative thereof, ethidium monoazide or a derivative thereof, hexidium iodide or a derivative thereof, bisbenzimide (Hoechst 33258) or a derivative thereof , Hoechst 33342 or a derivative thereof, Hoechst 34580 or a derivative thereof, hydroxystilbamidine or a derivative thereof, LDS 751 (LDS 751) or a derivative thereof, propidium Iodide (Propidium Iodide, PI) or its derivatives, Calcein or its derivatives, Oregon Green or its derivatives, Magnesium Green or its derivatives Derivatives of, Calcium Green or its derivatives, JOE or its derivatives, tetramethylrhodamine or its derivatives, TRITC or its derivatives, TAMRA or its derivatives, Pyronin Y or its derivatives, Lissamine or a derivative thereof, ROX or a derivative thereof, Calcium Crimson or a derivative thereof, Texas Red or a derivative thereof, Nile Red or a derivative thereof, thiadicarboxyanine ( Thiadicarbocyanine) or a derivative thereof, dansylamide or a derivative thereof, cascade blue, or DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).
상기 형광물질로서 양자점이 사용될 수 있는데, 양자점은 나노크기의 Ⅱ-Ⅳ 또는 Ⅲ-Ⅴ 반도체 입자가 중심을 이루고 있는 입자로, 약 2-10nm 크기의 중심(core)과 주로 ZnS 등으로 이루어진 껍질(shell)로 구성되며, 동일한 물질이라 하더라도 입자의 크기에 따라 형광파장이 달라져 다양한 파장대의 형광을 얻을 수 있다. 상기 양자점을 이루는 Ⅱ-Ⅳ 또는 Ⅲ-Ⅴ 화합물은 CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS 및 HgTe로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 단일 코어(core) 또는 코어(core)/쉘(shell) 형태일 수 있다.Quantum dots may be used as the fluorescent material. Quantum dots are particles centered on nano-sized II-IV or III-V semiconductor particles, with a core having a size of about 2-10 nm and a shell mainly composed of ZnS, etc. shell), and even with the same material, the fluorescence wavelength varies depending on the size of the particle, so fluorescence in various wavelength bands can be obtained. The II-IV or III-V compounds constituting the quantum dots are CdSe, CdSe/ZnS, CdTe/CdS, CdTe/CdTe, ZnSe/ZnS, ZnTe/ZnSe, PbSe, PbS InAs, InP, InGaP, InGaP/ZnS and HgTe. It may be selected from the group consisting of, and may be in the form of a single core or a core/shell.
본 발명에 있어서, 용어 "퀀처(quencher)"는 소광제, 흡광물질 등으로 사용될 수 있으며, 이는 형광물질 또는 광원으로부터 에너지 또는 빛을 흡수하는 물질을 의미한다. 퀀처는 흡광단백질, 흡광분자, 금속나노입자, 탄소입자 등일 수 있다. 바람직하게는 BHQ(Black Hole Quencher)-1, DABCYL, 이클립스(Eclipse), TAMRA, QSY-7, BHQ(Black Hole Quencher)-2, BHQ(Black Hole Quencher)-3, 금나노입자(Gold nano-particle)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 표지물질에 방출되는 에너지 또는 빛을 흡수할 수 있는 한, 그 종류는 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서는 BHQ-1을 이용하였다. 상기 퀀처는 N-아세틸뮤라민산 (N-Acetylmuramic acid, NAA)과 결합되어 있으며, N-아세틸뮤라민산 (N-Acetylmuramic acid, NAA)을 통하여 펩티도글리칸에 연결(link)되어 있을 수 있고, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the term "quencher" may be used as a quencher, a light absorbing material, etc., which means a fluorescent material or a material that absorbs energy or light from a light source. The quencher may be a light-absorbing protein, a light-absorbing molecule, metal nanoparticles, carbon particles, or the like. Preferably BHQ (Black Hole Quencher)-1, DABCYL, Eclipse, TAMRA, QSY-7, BHQ (Black Hole Quencher)-2, BHQ (Black Hole Quencher)-3, gold nanoparticles (Gold nano- particle), but the type is not limited as long as it can absorb energy or light emitted by the labeling material. In one embodiment of the present invention, BHQ-1 was used. The quencher is bound to N-acetylmuramic acid (N-Acetylmuramic acid, NAA), and may be linked to peptidoglycan through N-acetylmuramic acid (NAA). and is not limited thereto.
즉, 본 발명의 FRET(fluorescence resonance energy transfer)-발색 발색단을 갖는 이중-표지 프로브는 그 자체로는 비-형광성이나, 뉴클레아제에 의한 절단시 형광성이 된다.That is, the dual-labeled probe having a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-chromophore of the present invention is non-fluorescent by itself, but becomes fluorescent upon cleavage by a nuclease.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물을 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 또는 동정용 키트; 및 항균제 감수성 진단용 키트를 제공한다.In addition, according to another aspect of the present invention, the present invention comprising the above-described composition, Staphylococcus aureus ) detection or identification kit; and a kit for diagnosing antimicrobial susceptibility.
본 발명의 키트는 황색포도상구균을 검출 또는 동정; 및 항균제 감수성을 진단하는 것에 이용될 수 있다. The kit of the present invention detects or identifies Staphylococcus aureus; and diagnosing antimicrobial susceptibility.
본 발명의 상기 키트는 목적 용도를 실시하기 위해 필요한 반응 구성성분의 보관 또는 전달을 위한 키트를 제공한다. 키트는 검출에 필요하거나 바람직한 임의의 모든 구성성분을 포함할 수 있으며, 여기에는 시약 자체, 완충액, 제어 시약(예를 들어 조직 시료, 양성 및 음성 대조군 표적 올리고뉴클레오티드 등), 고체 지지체, 표지, 서면 및/또는 도면 사용 설명서 및 제품 정보, 저해제, 표지화 및/또는 검출 시약, 포장 환경 제어(예를 들어 얼음, 제습제 등) 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. The kit of the present invention provides a kit for storage or delivery of the reaction components necessary for carrying out the intended use. The kit may contain any and all components necessary or desirable for detection, including the reagents themselves, buffers, control reagents (eg tissue samples, positive and negative control target oligonucleotides, etc.), solid support, label, written and/or drawing instructions and product information, inhibitors, labeling and/or detection reagents, packaging environmental controls (eg ice, desiccant, etc.), and the like.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the kit of the present invention includes the above-described composition as a component, redundant descriptions are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항균제 내성 진단 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, there is provided a method for diagnosing antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus comprising the following steps:
(a) 상술한 조성물 및 목적의 항균제를 대상인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 포함된 시료에 처리하는 단계; 및 (A) the above-described composition and the target antibacterial agent for Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) processing a sample containing; and
(b) 상기 시료에서 형광 시그널의 변화를 확인하는 단계.(b) confirming a change in the fluorescence signal in the sample.
본 발명에 있어서 용어 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물 (예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함 하는 의미이다. 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다.In the present invention, the term "sample" is used in the broadest sense. On the one hand, this is meant to include samples or cultures (eg cultures of microorganisms). On the other hand, it is meant to include both biological and environmental samples. The sample may include a sample of synthetic origin.
생물학적 시료는 멸균된 액체 및 고체 식품 및 사료 제품(feed product) 및 유제품 품목, 야채, 식육 및 식육 부산물과 같은 성분 및 폐기물일 수도 있다. 생물학적 시료는 야생화(feral) 또는 야생 동물을 비롯하여 다양한 계열의 모든 가축으로부터 수득할 수 있으며, 이들 동물은 유제류, 곰, 물고기, 토끼목의 포유류, 설치류 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.Biological samples may be sterile liquid and solid food and feed products and components and waste products such as dairy items, vegetables, meat and meat by-products. The biological sample may be obtained from all livestock of various families, including feral or wild animals, and these animals include, but are not limited to, ungulates, bears, fish, rabbits, rodents, and the like.
환경적 시료는, 식품 및 유제품 가공 기기, 기구, 장비, 용구, 일회용 및 비-일회용 품목과 함께, 표면 소재 (surface matter), 토양, 물 및 산업적 시료와 같은 환경적 재료를 포함한다. 이들 예가 본 발명에 적용할 수 있는 시료 유형을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.Environmental samples include environmental materials such as surface matter, soil, water and industrial samples, along with food and dairy processing equipment, utensils, equipment, utensils, single-use and non-disposable items. These examples should not be construed as limiting the types of samples applicable to the present invention.
본 발명의 상기 방법은 상기 시료에서 형광 시그널의 변화를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 형광 시그널의 변화는 프로브의 퀀처가 형광물질의 발광을 제한하며, 뉴클레아제에 의하여 프로브가 절단하는 시점에서 퀀처의 작용이 사라져, 형광이 발색하는 것을 의미한다.The method of the present invention may include confirming a change in a fluorescence signal in the sample. The change in the fluorescence signal means that the quencher of the probe limits the emission of the fluorescent material, the quencher action disappears when the probe is cut by the nuclease, and the fluorescence develops.
상기 형광 시그널의 변화는, 상기 형광 시그널의 형광 수준이 항균제 처리 전과 비교하여 증가한 경우, 상기 황색포도상구균이 목적의 항균제에 대하여 내성이 있는 것으로 판정한다. The change in the fluorescence signal, when the fluorescence level of the fluorescence signal is increased compared to before the antibacterial agent treatment, it is determined that the Staphylococcus aureus is resistant to the antibacterial agent of interest.
상기 형광 시그널의 변화는, 상기 형광 시그널의 형광 수준이 항균제 처리 전과 비교하여 감소 또는 유사한 경우, 상기 황색포도상구균이 목적의 항균제에 대하여 감수성이 있는 것으로 판정한다. The change in the fluorescence signal, when the fluorescence level of the fluorescence signal is reduced or similar compared to before the antibacterial agent treatment, it is determined that the Staphylococcus aureus is sensitive to the antibacterial agent of interest.
상기 항균제는 본 발명의 조성물이 대상 미생물인 황색포도상구균의 항균제 감수성을 진단할 수 있는 한, 목적 항균제의 종류는 제한되지 않으나, 세폭시틴(cefoxitin), 피페라실린(piperacillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 메로페넘(meropenem), 클로람페니콜(chloramphenicol), 세팔로스포린(cephalosporin), 엠피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin), 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이다.As long as the composition of the present invention can diagnose the antimicrobial sensitivity of the target microorganism, Staphylococcus aureus, the type of the antimicrobial agent is not limited, but cefoxitin, piperacillin, vancomycin ), gentamicin, kanamycin, meropenem, chloramphenicol, cephalosporin, ampicillin, nafcillin, aminoglycoside and One selected from the group consisting of macrolides.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 조성물; 및 목적의 항균제를 포함하는, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 항균제 내성 진단용 키트를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention is the composition described above; And it provides a kit for diagnosing antibacterial resistance of Staphylococcus aureus , including the target antibacterial agent.
본 발명의 프로브는 황색포도상구균으로부터 특이적으로 분비되는 뉴클레아제에 의해 절단되어 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 거리적으로 분리되면서 유의한 형광 신호의 증가가 구현되어, 황색포도상구균의 검출 및 동정 뿐만 아니라 항균제 감수성을 정확하고 신속용이하게 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 황색포도상구균-특이 항생제 내성 진단(SF-AST; S. aureus specific FRET probe based AST) 시스템은 쉽게 실시할 수 있고, 신속하며, 경제적일 뿐만 아니라, 마이크로타이트레이션 플레이트 리더로 판독하기에 적합하도록 설계되어 기존 기술들을 쉽게 활용할 수 있어 임상 치료의 기초를 제공한다. The probe of the present invention is cleaved by a nuclease specifically secreted from Staphylococcus aureus, and a significant increase in fluorescence signal is realized while a quencher and a fluorophore are separated by a distance, and Staphylococcus aureus. It is possible to accurately and quickly and easily confirm not only the detection and identification of the antimicrobial agent but also the antimicrobial susceptibility. Therefore, the Staphylococcus aureus-specific antibiotic resistance diagnostic (SF-AST; S. aureus specific FRET probe based AST) system of the present invention is easy to implement, fast, economical, and read with a microtitration plate reader. It is designed to be suitable for treatment and provides the basis for clinical treatment as it can easily utilize existing technologies.
도 1은 본 발명에 따른 황색포도상구균-특이 항생제 내성 검사용 핵산 프로브(SF-AST probe)의 개념도이다.
도 2a는 본 발명의 프로브의 구조적 차이에 의한 효과를 보여준다. 도 2b는 본 발명의 프로브의 서열 차이에 의한 효과를 보여준다.
도 3a 및 도 3b은 본 발명의 SF-AST 반응 버퍼 조건에 따른 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 다양한 박테리아 종류에 따른 본 발명의 SF-AST 프로브의 황색포도상구균-특이 검출 형광 측정 결과를 보여준다. 괄호 안의 숫자는 ATCC 번호이다.
도 5는 다양한 항생제에 대하여 종래 방법인 BMD와 본 발명의 SF-AST 프로브를 이용한 경우 황색포도상구균-특이 항균제 감수성 검사(Antibiotic susceptibility test, AST)를 비교한 결과를 보여준다. 각 그래프에서 붉은 네모칸은 각 결과의 MIC 농도를 의미하고 본 발명의 SF-AST 그래프에서는 붉은 선(5000) 이상의 형광값을 증가 신호로 활용하였다.1 is a conceptual diagram of a Staphylococcus aureus-specific antibiotic resistance test nucleic acid probe (SF-AST probe) according to the present invention.
Figure 2a shows the effect of the structural difference of the probe of the present invention. Figure 2b shows the effect of the sequence difference of the probe of the present invention.
3a and 3b are results confirming the effect according to the SF-AST reaction buffer conditions of the present invention.
4 shows the results of Staphylococcus aureus-specific detection fluorescence measurement of the SF-AST probe of the present invention according to various types of bacteria. The number in parentheses is the ATCC number.
5 shows a comparison result of Staphylococcus aureus-specific antibiotic susceptibility test (AST) when using the conventional method BMD and the SF-AST probe of the present invention for various antibiotics. In each graph, a red square indicates the MIC concentration of each result, and in the SF-AST graph of the present invention, a fluorescence value above the red line (5000) was used as an increase signal.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 본 발명의 SF-AST 프로브의 설계 및 합성Example 1. Design and synthesis of the SF-AST probe of the present invention
본 발명자들은 대상인 황색포도상구균의 검출 동정 및 목적 항생제에 대한 내성을 진단하기 위하여 황색포도상구균의 특이적으로 분비하는 뉴클레아제 검출 여부를 측정할 수 있는 SF-AST 프로브를 제작하였다. The present inventors prepared an SF-AST probe capable of measuring whether a nuclease specifically secreted by Staphylococcus aureus is detected in order to identify the target Staphylococcus aureus and diagnose resistance to the target antibiotic.
상기 SF-AST 프로브는 형광단-퀀처(fluorophore-quencher) 이중-표지 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드로서, 5'-말단 및 3'-말단이 노출되어 단일가닥 핵산 분해효소(single strand DNA exonuclease)에 의해 분해될 수 있도록 설계하였다.The SF-AST probe is a fluorophore-quencher double-labeled single-stranded oligonucleotide, wherein the 5'-end and 3'-end are exposed, and single-stranded DNA exonuclease is used. It is designed to be disassembled.
본 실시예에서는, 상기 SF-AST 프로브(서열번호 9)의 5'-말단에 형광발색단(fluorophore)으로서 6-FAM(6-Carboxyfluorescein)을, 3'-말단에 퀀처(quencher)로서 BHQ-1(Black Hole Quencher-1)을 표지하였다. In this embodiment, 6-FAM (6-Carboxyfluorescein) as a fluorophore at the 5'-end of the SF-AST probe (SEQ ID NO: 9) and BHQ-1 as a quencher at the 3'-end (Black Hole Quencher-1) was labeled.
상기 제작된 본 발명의 프로브는 황색포도상구균-특이적이며, 살아있는 황색포도상구균에서 프로브의 형광이 측정되므로 황색포도상구균의 성장을 측정가능한 것을 특징으로 한다. The prepared probe of the present invention is Staphylococcus aureus-specific, and since the fluorescence of the probe is measured in live Staphylococcus aureus, the growth of Staphylococcus aureus can be measured.
이러한 본 발명에 따른 황색포도상구균 검출 및 항균제 내성 검사용 SF-AST 프로브의 개념을 도 1에 나타내었다.The concept of the SF-AST probe for Staphylococcus aureus detection and antimicrobial resistance test according to the present invention is shown in FIG. 1 .
실시예 2. 본 프로브의 구성적 특징Example 2. Structural features of the present probe
본 발명자들은 본 발명의 SF-AST 프로브의 황색포도상구균-특이적 민감도를 확인하기 위하여, 황색포도상구균(S. 아우레우스) 성장 동안 분비된 MNase(micrococcal nuclease)의 활성을 검출하도록 설계된 다양한 FRET 프로브를 대조군으로 이용하여 MNase 활성 분석을 실시하였다.The present inventors, in order to confirm the Staphylococcus aureus-specific sensitivity of the SF-AST probe of the present invention, various FRETs designed to detect the activity of MNase (micrococcal nuclease) secreted during Staphylococcus aureus (S. aureus) growth. MNase activity assay was performed using the probe as a control.
MNase 활성 분석은 황색포도상구균에 하기 표 1에 기재한 염기서열의 프로브들을 처리하여 배양한 후, 형광신호를 측정하였다. For MNase activity analysis, Staphylococcus aureus was treated with probes of the nucleotide sequence shown in Table 1 and cultured, and then the fluorescence signal was measured.
2-1. 프로브 구조적 차이에 의한 효과2-1. Effects of Probe Structural Differences
본 발명자들은 SF 프로브의 최적 구조를 확인하기 위하여, 3 가지 구조인 이중-가닥 구조(DS), 3 또는 5 bp로 5'-오버행을 갖는 스템-루프 구조(SL-3, SL-5) 및 단일-가닥 구조(SS; SF-AST)를 갖는 프로브를 비교하였다.In order to confirm the optimal structure of the SF probe, the present inventors have three structures: a double-stranded structure (DS), a stem-loop structure having a 5'-overhang with 3 or 5 bp (SL-3, SL-5), and Probes with single-stranded structures (SS; SF-AST) were compared.
상기 프로브의 서열은 하기 표 1에 나열하였고, 각 프로브들은 5'말단에 FAM 및 3'-말단에 BHQ-1을 위치시켰다.The sequences of the probes are listed in Table 1 below, and each probe has FAM at the 5' end and BHQ-1 at the 3'-end.
이때, DS 및 SL 프로브는 모두 혼성화하여 안정적인 구조를 달성한 후 SS 프로브를 변성시켜 이중 가닥 형성을 방지하였다.At this time, both the DS and SL probes were hybridized to achieve a stable structure, and then the SS probe was denatured to prevent double strand formation.
도 2a에 나타낸 바와 같이, SS 프로브는 S. 아우레우스로부터 분비된 MNase에 의한 절단으로 인해 형광 신호의 증가를 나타낸 반면, DS 프로브는 효과가 없었다.As shown in Figure 2a, the SS probe showed an increase in fluorescence signal due to cleavage by MNase secreted from S. aureus, whereas the DS probe had no effect.
또한, SL 프로브의 경우, 형광 신호는 SL-3이 아닌 SL-5에 의해서만 증가되었다.Also, in the case of the SL probe, the fluorescence signal was increased only by SL-5, not SL-3.
이는 5'-오버행의 긴 길이가 SS 프로브와 동일한 효과를 가져온 것으로 보인다.It seems that the long length of the 5'-overhang had the same effect as the SS probe.
결과적으로, SS 구조의 프로브가 MNase 활성의 검출을 위한 최적의 구조임을 확인하였다.As a result, it was confirmed that the SS-structured probe was the optimal structure for the detection of MNase activity.
2-2. 프로브 서열 차이에 의한 효과2-2. Effects of Probe Sequence Differences
본 발명자들은 보다 민감한 프로브를 얻기 위해 AT-풍부(rich) 영역을 포함한 SS DNA로 신규한 FRET 프로브를 설계하고 MNase 활성 실험의 민감도를 비교하였다.In order to obtain a more sensitive probe, the present inventors designed a novel FRET probe with SS DNA containing an AT-rich region and compared the sensitivity of the MNase activity experiment.
SF-1 프로브는 상기 실시예 2-1에 이용된 SS 구조의 프로브이고;The SF-1 probe is an SS structure probe used in Example 2-1;
TT 프로브는 당업계에 공지된 서열(WO2013033436에 기재된 서열을 이용한 프로브)로서, MNase 활성 실험의 민감도를 비교하기 위한 대조군 프로브이다. The TT probe is a sequence known in the art (probe using the sequence described in WO2013033436), and is a control probe for comparing the sensitivity of MNase activity experiments.
당업계에서는, TT 서열을 가진 프로브가 AT 또는 AA 서열을 가진 다른 프로브보다 MNase 활성을 검출하는 데 더 효과적이라는 것이 공지되어 있다(Hernandez, F.J., Huang, L., Olson, M.E., Powers, K.M., Hernandez, L.I., Meyerholz, D.K., Thedens, D.R., Behlke, M.A., Horswill, A.R., and McNamara, J.O. 2nd. (2014) Noninvasive imag-ing of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nat. Med. 20(3), 301-306).It is known in the art that probes with TT sequences are more effective at detecting MNase activity than other probes with AT or AA sequences (Hernandez, FJ, Huang, L., Olson, ME, Powers, KM, Hernandez, LI, Meyerholz, DK, Thedens, DR, Behlke, MA, Horswill, AR, and McNamara, JO 2nd. (2014) Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe. Nat. Med. 20 ( 3), 301-306).
이에, SF-1 프로브 내 다른 위치에 TT 또는 AATT를 대체시켜 각각 SF-2, -3, -4 및 -5를 설계하였다.Accordingly, SF-2, -3, -4 and -5 were designed by replacing TT or AATT at different positions in the SF-1 probe, respectively.
도 2b에 나타낸 바와 같이, AATT 서열을 갖는 SF-5 프로브는 종래 공지된 TT 대조군 프로브를 비롯한 다른 프로브들보다 더 높은 형광 신호를 나타냈다.As shown in FIG. 2B , the SF-5 probe having the AATT sequence showed a higher fluorescence signal than other probes including the conventionally known TT control probe.
따라서, SF-5 프로브가 SF-AST에 가장 민감한 SF 프로브로서 선별하였다.Therefore, the SF-5 probe was selected as the SF probe most sensitive to SF-AST.
(서열번호 1 및 2)DS
(SEQ ID NOs: 1 and 2)
3'-GG GAG GGG CGT GGT TAT CCC ACG CCC CTC CCA-5'5'- ATC A CC CTC CCC GCA CC T AA A GGG TGC GGG GAG GGT-3'
3'-GG GAG GGG CGT GG T TA T CCC ACG CCC CTC CCA-5'
(밑줄친 뉴클레오티드는 미스매치(Mismatch), 루프(loop) 또는 오버행(overhanging) 부위를 가르키고; 굵은 이탤릭체로 표시한 뉴클레오티드들은 TT 또는 AATT 서열을 가르킨다)(Underlined nucleotides indicate mismatch, loop or overhanging sites; nucleotides in bold italics indicate TT or AATT sequences)
2-3. 반응 버퍼 조성 차이에 의한 효과2-3. Effects of difference in reaction buffer composition
본 발명자들은 본 발명의 SF-AST 프로브 반응을 위한 최적의 조건을 확인하기 위하여, 다양한 조성(배지, pH, Ca2+ 농도 및 염 농도)의 SF-AST 반응 버퍼에 따른 S. aureus의 형광을 테스트하였다. In order to confirm the optimal conditions for the SF-AST probe reaction of the present invention, the present inventors measured the fluorescence of S. aureus according to SF-AST reaction buffers of various compositions (medium, pH, Ca 2+ concentration and salt concentration). tested.
먼저, 기본 배양 배지인 MHB, 칼슘과 마그네슘이 첨가된 CAMHB, 다양한 뉴클레아제 반응 버퍼 (restriction enzyme 2, 3, S buffer와 DNase reaction buffer, lamda nuclease reaction buffer, exo-nuclease reaction buffer)를 이용하여 형광 신호를 비교하였다. First, using the basic culture medium MHB, calcium and magnesium added CAMHB, and various nuclease reaction buffers (
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 칼슘과 마그네슘이 풍부하면서 항생제 감수성 검사의 기본 액체 배지인 CAMHB에서 가장 높은 형광 신호를 확인하였고, 이를 반응 배지로 사용하였다.As a result, as shown in FIG. 3a , the highest fluorescence signal was confirmed in CAMHB, which is a basic liquid medium for antibiotic susceptibility testing while rich in calcium and magnesium, and used as a reaction medium.
또한, 다른 pH 값(pH 7.4, 8.0 및 8.8), Ca2+ 농도 (0.5, 1 및 5 mM) 및 염 농도 (NaCl 0, 0.5, 1 및 2 %)를 측정하였다. 성장 배지(MHB [pH 7.3, 0 mM Ca2+] 및 CAMHB [pH 7.3, 0.625 mM Ca2+])도 음성 대조군으로 시험되었다.In addition, different pH values (pH 7.4, 8.0 and 8.8), Ca 2+ concentrations (0.5, 1 and 5 mM) and salt concentrations (
그 결과, 도 3b 왼쪽 그래프에 나타낸 바와 같이, pH 및 Ca2+ 농도의 영향에 따라, MNase 활성에 대한 형광 강도는 pH 8.0 또는 8.8 및 1mM Ca2+ 농도에서 최대에 도달하는 경향이 있으며; 도 3b 오른쪽 그래프에 나타낸 바와 같이, NaCl 농도는 형광 신호가 농도 의존적이었다.As a result, as shown in the graph on the left of Fig. 3b , depending on the effect of pH and Ca 2+ concentration, the fluorescence intensity for MNase activity tends to reach a maximum at pH 8.0 or 8.8 and 1 mM Ca 2+ concentration; As shown in the graph on the right of Figure 3b, the NaCl concentration was concentration-dependent with the fluorescence signal.
따라서, 본 발명의 SF-AST의 최적 반응 버퍼는 1mM의 Ca2+ 농도 및 pH 7.4 내지 pH 8.8로 선택되었다.Therefore, the optimal reaction buffer for SF-AST of the present invention was selected with a Ca 2+ concentration of 1 mM and pH 7.4 to pH 8.8.
실시예 2. 본 프로브에 의한 황색포도상구균 검출 및 동정 확인Example 2. Staphylococcus aureus detection and identification by this probe
본 발명자들은 본 프로브에 의한 황색포도상구균의 검출 및 동정 여부를 확인하였다.The present inventors confirmed whether Staphylococcus aureus was detected and identified by this probe.
상기 실시예 1에서 선별된 SF-AST 프로브(SF-5)가 황색포도상구균-특이적 검출이 가능한지를 MRSA를 포함하는 4 종의 S.aureus와 10 종의 다른 세균들(S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. epidermidis, E. coli, S. flexneri, E. faecalis, E. faecium, A. baumannii, K. pneumonia, 및 P. aeruginosa)을 이용하여 비교 실험하였다. To determine whether the SF-AST probe (SF-5) selected in Example 1 can detect Staphylococcus aureus-specifically, 4 types of S. aureus including MRSA and 10 types of other bacteria ( S. haemolyticus, S saprophyticus, S. epidermidis, E. coli, S. flexneri, E. faecalis, E. faecium, A. baumannii, K. pneumonia, and P. aeruginosa ) were used for comparative experiments.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, MRSA를 포함한 4 종의 S. aureus에서는 형광 신호의 검출 및 증가가 확인되었으나, 10 종의 다른 세균들에서는 검출되지 않았다. As a result, as shown in FIG. 4 , the detection and increase of the fluorescence signal were confirmed in 4 types of S. aureus including MRSA, but not in 10 other types of bacteria.
따라서, 본 발명의 프로브가 황색포도상구균 특이적으로 검출이 가능함을 확인할 수 있었다. Therefore, it was confirmed that the probe of the present invention can specifically detect Staphylococcus aureus.
실시예 3. 본 프로브를 이용한 황색포도상구균-특이 항균제 감수성 검사(Antibiotic susceptibility test, AST)Example 3. Staphylococcus aureus-specific antimicrobial susceptibility test using this probe (Antibiotic susceptibility test, AST)
본 발명자들은 실시예 1에서 확인한 본 발명의 SF-AST 프로브를 이용한 항균제 감수성 검사 방법과 종래 이용되고 있는 방법(BMD)에 의한 항생제 감수성 검사 결과를 비교하였다. The present inventors compared the antimicrobial susceptibility test result by the antimicrobial susceptibility test method using the SF-AST probe of the present invention confirmed in Example 1 and the conventionally used method (BMD).
먼저 S. 아우레우스에 4 가지 항생제[반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamycin), 메로페넘(meropenem) 및 카나마이신(kanamycin)]를 각각 농도별로 처리한 후, SF-AST 방법을 사용하는 경우는 매 시간마다 형광신호를 측정하여 항생제 내성 여부가 구별되는 4-6 시간 후의 형광신호를 이용하였고; BMD 방법을 사용하는 경우 18 시간 후에 탁도를 측정하여 MIC를 측정하였다. First, four antibiotics [vancomycin, gentamycin, meropenem, and kanamycin] were first treated with S. aureus at different concentrations, and then the SF-AST method was used. The fluorescence signal was measured every hour, and the fluorescence signal after 4-6 hours to distinguish antibiotic resistance was used; When using the BMD method, the MIC was measured by measuring the turbidity after 18 hours.
이 때, 황색포도상구균이 항생제에 대하여 내성이 있는 경우, 항생제에 의해 사멸되지 않은 황색포도상구균 자체로부터 분비되는 뉴클레아제에 의해 본 SF-AST 프로브가 절단되면서 퀀처(quencher)와 형광단(fluorophore)이 이격된다. 이에 따라 형광단에 의해 유의한 형광 신호가 발생 및 증가하고, 해당 방출 파장 스펙트럼을 측정하였다. At this time, when Staphylococcus aureus is resistant to antibiotics, the SF-AST probe is cut by the nuclease secreted from Staphylococcus aureus itself, which has not been killed by the antibiotic, and a quencher and a fluorophore ) are separated. Accordingly, a significant fluorescence signal was generated and increased by the fluorophore, and the corresponding emission wavelength spectrum was measured.
공지된 종래 방법인 BMD(Broth microdilution) 방법은 CLSI(M07) 지침에 따라 수행되었으며 기준 MIC는 시각적 판독 또는 광학 밀도에 의해 결정되었다. 항생제에 대한 MIC 값은 약제가 없는(drug-free) 대조군에 비해 80%로 성장이 억제되는 가장 낮은 항생제 농도로 정의되었다.A known conventional method, the Broth microdilution (BMD) method, was performed according to the CLSI (M07) guidelines and the baseline MIC was determined by visual readout or optical density. The MIC value for antibiotics was defined as the lowest antibiotic concentration at which growth was inhibited by 80% compared to the drug-free control group.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 각 항생제를 처리하여 기존의 방식 (BMD)으로 얻어진 MIC를, 본 발명의 기술 SF-AST로 얻은 MIC 값과 비교했을 때, 동일 또는 유사한 값임을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 5, when the MIC obtained by the conventional method (BMD) by treating each antibiotic was compared with the MIC value obtained by the SF-AST technique of the present invention, it was confirmed that the value was the same or similar. .
즉, 각 항생제를 처리하여 기존의 방식(BMD)으로 얻어진 MIC를, 본 발명의 기술인 SF-AST로 얻은 MIC 값과 비교했을 때, 기존의 BMD 방식은 16-20시간 이상의 배양 후 결과를 얻을 수 있으나, 본 기술은 불과 4-6 시간 내에 높은 정확도로 내성 황색포도상구균 검출한 바, 상당한 시간적 이점을 가지고 있음을 입증하였다. That is, when the MIC obtained by the conventional method (BMD) by treating each antibiotic is compared with the MIC value obtained by the SF-AST technique of the present invention, the conventional BMD method can obtain results after incubation for more than 16-20 hours. However, the present technology has proven that it has a significant time advantage as it detects resistant Staphylococcus aureus with high accuracy within only 4-6 hours.
결론적으로, 본 발명의 SF-AST 프로브를 활용한 FRET-DNA 프로브 기반 항생제 감수성 검사(F-AST) 기술을 이용하면, 황색포도상구균의 항생제에 대한 감수성 여부를 위양성 시그널 없이, 종래 방법보다 신속하며 용이하게 진단할 수 있다.In conclusion, using the FRET-DNA probe-based antibiotic susceptibility test (F-AST) technology using the SF-AST probe of the present invention, the sensitivity of Staphylococcus aureus to antibiotics is determined faster than the conventional method without a false-positive signal. can be easily diagnosed.
<110> BioNano Health Guard Research Center <120> Novel Probe for Specific Staphylococcus aureus and Uses Thereof <130> NHG1-13p-1 <150> KR 10-2018-0147343 <151> 2018-11-26 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS <400> 1 atcaccctcc ccgcacctaa agggtgcggg gagggt 36 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS <400> 2 gggaggggcg tggttatccc acgcccctcc ca 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SL-5 <400> 3 acaccctccc cgcacctaaa gggtgcgggg ag 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SL-3 <400> 4 accctccccg cacctaaagg gtgcggggag 30 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-1 <400> 5 atcaccctcc gt 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-2 <400> 6 ttcaccctcc gt 12 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-3 <400> 7 tcaccgttcc gt 12 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-4 <400> 8 tcacctccgc tt 12 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-5 <400> 9 tcacaattcc gt 12 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TT <400> 10 ctcgttcgtt c 11 <110> BioNano Health Guard Research Center <120> Novel Probe for Specific Staphylococcus aureus and Uses Thereof <130> NHG1-13p-1 <150> KR 10-2018-0147343 <151> 2018-11-26 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS <400> 1 atcaccctcc ccgcacctaa agggtgcggg gagggt 36 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DS <400> 2 gggaggggcg tggttatccc acgcccctcc ca 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SL-5 <400> 3 acaccctccc cgcacctaaa gggtgcgggg ag 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SL-3 <400> 4 accctccccg cacctaaagg gtgcggggag 30 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-1 <400> 5 atcaccctcc gt 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-2 <400> 6 ttcaccctcc gt 12 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-3 <400> 7 tcaccgttcc gt 12 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-4 <400> 8 tcacctccgc tt 12 <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SF-5 <400> 9 tcacaattcc gt 12 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TT <400> 10 ctcgttcgtt c 11
Claims (13)
황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 검출 또는 동정용 마커 조성물.
(a) a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 9 or a complementary sequence thereof and (b) a single-stranded-oligonucleotide probe having a double-label,
A marker composition for detection or identification of Staphylococcus aureus.
상기 이중-표지는 형광단(fluorophore) 및 퀀처(quencher)를 포함하는 상호작용적 이중-표지인 것을 특징으로 하는 조성물.
According to claim 1,
wherein the double-label is an interactive double-label comprising a fluorophore and a quencher.
상기 형광단은 상기 프로브의 5'-말단에 결합되며, 상기 퀀처는 상기 프로브의 3'-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. The method of claim 2,
The fluorophore is bound to the 5'-end of the probe, and the quencher is bound to the 3'-end of the probe.
상기 퀀처는 상기 프로브의 5'-말단에 결합되며, 상기 형광단은 상기 프로브의 3'-말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. The method of claim 2,
The quencher is bound to the 5'-end of the probe, and the fluorophore is bound to the 3'-end of the probe.
상기 프로브는 뉴클레아제의 핵산 절단 반응에 의해 절단되어 상기 형광단이 상기 퀀처로부터 이격되며, 상기 퀀처 분자가 상기 형광단 분자로부터 나오는 형광 시그널을 언퀀칭(unquenching)하여 상기 형광 시그널의 변화를 야기하는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. The method of claim 2,
The probe is cleaved by a nucleic acid cleavage reaction of a nuclease to separate the fluorophore from the quencher, and the quencher molecule unquenches the fluorescence signal emitted from the fluorophore molecule, thereby causing a change in the fluorescence signal. A composition, characterized in that
상기 형광단은 발광 분자, 금속 이온, 착화합물, 유기염료, 도체, 반도체, 부도체, 양자점 (quantum dot) 및 양자선(quantum wire)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. The method of claim 2,
The fluorophore is at least one selected from the group consisting of light emitting molecules, metal ions, complexes, organic dyes, conductors, semiconductors, insulators, quantum dots, and quantum wires.
상기 퀀처는 BHQ(Black Hole Quencher)-1, DABCYL, 이클립스(Eclipse), TAMRA, QSY-7, BHQ(Black Hole Quencher)-2, BHQ(Black Hole Quencher)-3, 및 금나노입자 (Gold nano-particle)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. The method of claim 2,
The quencher is BHQ (Black Hole Quencher)-1, DABCYL, Eclipse, TAMRA, QSY-7, BHQ (Black Hole Quencher)-2, BHQ (Black Hole Quencher)-3, and gold nanoparticles (Gold nano) -particle) composition, characterized in that at least one selected from the group consisting of.
Any one of claims 1 to 7, comprising the composition of any one of claims, Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) Detection or identification kit.
A composition for diagnosis of antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus , comprising the composition of any one of claims 1 to 7.
The composition of any one of claims 1 to 7; And a kit for diagnosing antibacterial resistance of Staphylococcus aureus , comprising the antibacterial agent of interest.
(a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물 및 목적의 항균제를 대상인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 포함된 시료에 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 형광 시그널의 변화를 확인하는 단계.
A method for diagnosing antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus comprising the following steps:
(A) claim 1 to claim 7, wherein any one of the composition and the target antibacterial agent Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) The step of treating a sample containing; and
(b) confirming a change in the fluorescence signal in the sample.
상기 형광 시그널의 변화는, 상기 형광 시그널의 형광 수준이 항균제 처리 전과 비교하여 증가한 경우, 상기 황색포도상구균이 목적의 항균제에 대하여 내성이 있는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. The method of claim 11,
The change in the fluorescence signal, when the fluorescence level of the fluorescence signal is increased compared to before the antibacterial agent treatment, the method characterized in that it is determined that the Staphylococcus aureus is resistant to the antibacterial agent of interest.
상기 항균제는 세폭시틴(cefoxitin), 피페라실린(piperacillin), 반코마이신(vancomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 메로페넘(meropenem), 클로람페니콜(chloramphenicol), 세팔로스포린(cephalosporin), 엠피실린(ampicillin), 나프실린(nafcillin), 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 마크로라이드(macrolides)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
12. The method of claim 11,
The antibacterial agent is cefoxitin, piperacillin, vancomycin, gentamycin, kanamycin, meropenem, chloramphenicol, cephalosporin. , ampicillin (ampicillin), nafcillin (nafcillin), aminoglycoside (aminoglycoside) and a method characterized in that one selected from the group consisting of macrolides (macrolides).
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