KR102261982B1 - METHOD FOR CELL PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION BY ELECTRICAL AND TOPOGRAPHICAl CONTROL OF MICRO/NANOPATTERN - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판과 그 기판을 이용한 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양용 기판을 이용 하는 경우, 세포 배양을 촉진 할 수 있다.The present invention relates to a substrate for cell culture in which micro-patterns and nano-patterns are formed together and a method for culturing cells using the substrate. When the substrate for cell culture of the present invention is used, cell culture can be promoted.
Description
본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판과 그 기판을 이용한 세포의 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a substrate for cell culture in which micro-patterns and nano-patterns are formed together and a method for culturing cells using the substrate.
기존의 줄기세포 분화를 위한 패턴에서는 세포가 성장하고 분화하는 substrate의 특성에 따른 분석만 진행하거나 전기적 특성에 따른 세포의 거동 분석만 진행하는 등 패턴과 전기적 특성을 분리하여 진행하였다. 줄기세포는 다양하고 복잡한 미세환경에 의하여 성장 및 분화가 조절되기 때문에, 다양한 조건에 대한 환경 변화와 그에 따른 분석이 필요하다. 본 발명에서는 시뮬레이션을 통해 나노필라의 어떤 특성이 세포의 성장과 분화에 영향을 주는지 확인하여 나노패턴을 최적화하였으며, 마이크로 패턴의 전기전도도를 최적화하여 전기적 자극을 줄 수 있는 마이크로패턴과 세포의 접착을 높이기 위한 나노패턴을 결합하였다. 따라서, 전기적 자극을 위한 마이크로패턴과 지형학적 이점을 가하기 위한 나노패턴을 함께 구성하여 줄기세포 분화를 효과적으로 촉진하는 기술을 개발하였다. 특별히, 마이크로패턴은 생체적합한 하이드로젤을 주성분으로 하며, rGO와 AgNW을 캡슐화하여 전기전도성을 증가하였다. 종래기술에서 한가지의 재료를 사용하여 전기전도성을 획득한 사례도 있으나, 본 발명에서는 두 재료(rGO, AgNW)를 모두 첨가하여 향상된 전기전도성을 확보하였다. 또한 컴퓨터 시뮬레이션을 통해서, 마이크로패턴이 세포에 전기적 자극을 균일하게 줄 수 있으며 높은 전기전도성을 갖는 것을 최적화하였다. 또한 나노필라의 설계 수치의 변화에 따른 역학적 특성을 분석하였고, 최적화된 설계 수치를 얻을 수 있었으며, 그 이후 실험을 통해서 나노패턴의 효과를 검증하였다. In the existing pattern for stem cell differentiation, only the analysis according to the characteristics of the substrate on which the cells grow and differentiate, or only the behavior analysis of the cells according to the electrical characteristics, was performed by separating the pattern and the electrical characteristics. Since the growth and differentiation of stem cells are regulated by various and complex microenvironments, it is necessary to change the environment for various conditions and analyze them accordingly. In the present invention, the nanopattern was optimized by confirming which characteristics of the nanopillars affect the growth and differentiation of cells through simulation, and the adhesion between the micropattern and cells capable of providing electrical stimulation by optimizing the electrical conductivity of the micropattern was achieved. Nanopatterns for heightening were combined. Therefore, a technology for effectively promoting stem cell differentiation was developed by composing a micropattern for electrical stimulation and a nanopattern for applying a topographical advantage. In particular, the micropattern has a biocompatible hydrogel as the main component, and the electrical conductivity is increased by encapsulating rGO and AgNW. In the prior art, there are cases in which electrical conductivity is obtained using one material, but in the present invention, improved electrical conductivity is secured by adding both materials (rGO, AgNW). In addition, through computer simulation, the micropattern was optimized to provide electrical stimulation to cells and to have high electrical conductivity. In addition, the mechanical characteristics according to the change in the design values of the nanopillars were analyzed, and the optimized design values were obtained, and the effect of the nanopatterns was verified through subsequent experiments.
본 발명자들은 세포 증식 및 분화 제어를 효과적으로 조절하기 위한 세포 배양방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 마이크로/나노패턴의 전기적 지형학적 조절을 최적화함으로써 세포의 성장 및 분화 촉진을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors made intensive research efforts to develop a cell culture method for effectively regulating cell proliferation and differentiation control. As a result, by optimizing the electrical and topographical control of micro/nano-patterns, cell growth and differentiation promotion was investigated, and the present invention was completed.
따라서, 본 발명의 목적은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a substrate for cell culture in which micro-patterns and nano-patterns are formed together.
본 발명의 또 다른 목적은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 이용한 세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for culturing cells using a substrate for cell culture in which micro-patterns and nano-patterns are formed together.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판 및 그 기판을 이용한 세포의 배양 방법을 제공한다. According to one aspect of the present invention, the present invention provides a substrate for cell culture in which a micro-pattern and a nano-pattern are formed together, and a cell culture method using the substrate.
본 발명자들은 세포 증식 및 분화 제어를 효과적으로 조절하기 위한 세포 배양방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 마이크로/나노패턴의 전기적 지형학적 조절을 최적화함으로써 세포의 성장 및 분화 촉진을 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors made intensive research efforts to develop a cell culture method for effectively regulating cell proliferation and differentiation control. As a result, by optimizing the electrical and topographical control of micro/nano-patterns, cell growth and differentiation promotion was investigated, and the present invention was completed.
본 발명의 일 구현예인 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 이용하여, 세포들을 배양함으로써 세포들의 분화 및/또는 성장을 촉진할 수 있다. 본 발명은 세포가 성장하는 환경의 지형학적 요소를 제어함으로써 세포의 분화와 성장을 촉진시키는 원리를 이용하고 있고, 특히 나노패턴을 사용하는 경우 표면적이 넓어지기 때문에 세포의 분화와 성장을 촉진시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 세포 배양용 기판을 사용함으로써 발휘되는 효과는 특정 세포를 선택함으로써 발휘되는 효과는 아니며, 세포의 종류는 크게 제한되지 않는다. 본 발명의 세포 배양용 기판을 이용하여 배양할 수 있는 세포에 대하여 구체적으로 예를 들면, 줄기세포, 암세포, 근육세포, 혈액세포, 면역세포, 골세포, 혈관내피세포, 섬유아세포, 상피세포 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포일 수 있다. 더욱 상세하게, 줄기세포란 신경줄기세포(neural stem cell; NSC), 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 조혈모세포 (haematopoietic stem cell;HSC), 조혈전구세포(haemopoietic precursor cell; HPC), 림프 선조 세포(lymphoid progenitor cell) 및 흉선선조 세포(thymic progenitor cell)를 의미한다. 본 발명의 근육세포란 구체적으로 예를 들면, 골격근 세포, 심근 세포, 및 민무늬근 세포를 의미한다. 본 발명의 암세포란 구체적으로 예를 들면, 유방암세포, 전립선암세포, 직장암세포, 폐암세포, 췌장암세포, 난소암세포, 방광암세포, 자궁내막암세포, 자궁경부암세포, 간암세포, 신장암세포, 갑상선암세포, 골암세포, 림프종암세포 및 피부암세포를 의미한다.Differentiation and/or growth of cells can be promoted by culturing cells using the substrate for cell culture in which the micro-pattern and nano-pattern are formed together according to an embodiment of the present invention. The present invention uses the principle of promoting cell differentiation and growth by controlling the topographical factors of the environment in which the cells grow, and in particular, when using nanopatterns, the surface area increases, so it can promote cell differentiation and growth. have. Therefore, the effect exerted by using the substrate for cell culture of the present invention is not an effect exerted by selecting a specific cell, and the type of cell is not significantly limited . For cells that can be cultured using the cell culture substrate of the present invention, specifically, for example, stem cells, cancer cells, muscle cells, blood cells, immune cells, osteocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, epithelial cells, etc. It may be any one or more cells selected from the group consisting of. More specifically, stem cells are neural stem cells (NSC), embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSCs), hematopoietic stem cells (HSC) , refers to haemopoietic precursor cells (HPC), lymphoid progenitor cells and thymic progenitor cells. The muscle cells of the present invention specifically refer to, for example, skeletal muscle cells, cardiomyocytes, and smooth muscle cells. The cancer cells of the present invention are specifically, for example, breast cancer cells, prostate cancer cells, rectal cancer cells, lung cancer cells, pancreatic cancer cells, ovarian cancer cells, bladder cancer cells, endometrial cancer cells, cervical cancer cells, liver cancer cells, kidney cancer cells, thyroid cancer cells, bone cancer cells, lymphoma cancer cells and skin cancer cells.
보다 구체적으로는 근육세포 또는 신경줄기세포의 성장 및/또는 분화 유도를 위해 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 이용할 수 있다.More specifically, a substrate for cell culture in which micro-patterns and nano-patterns are formed together for inducing growth and/or differentiation of muscle cells or neural stem cells may be used.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노 패턴은 동일한 간격으로 형성된 복수의 돌기 형상이다.In one embodiment of the present invention, the nanopattern of the present invention has a plurality of protrusion shapes formed at the same interval.
본 발명에서 용어 '나노 패턴 기판'은 상술한 나노 패턴이 표면 상에 형성된 기판을 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 나노 패턴 기판은 포토리소그래피 공정에 의해 나노패턴화 된 단위 구조체의 집합이 표면상에 형성되도록 제작될 수 있다. In the present invention, the term 'nano-patterned substrate' refers to a substrate on which the above-described nano-pattern is formed on the surface. Specifically, for example, the nanopatterned substrate of the present invention may be manufactured so that a set of nanopatterned unit structures is formed on the surface by a photolithography process.
본 발명의 나노 패턴을 이루는 돌기 형상은 세포 배양용 기판의 표면적을 증가시킴으로서 세포부착성을 향상시키는 역할을 하고, 이로 인해 세포 성장 또는 분화를 촉진하는 효과가 발휘되는 바, 돌기의 형상에는 특별한 제한이 없고, 기판의 표면적을 증가시킬 수 있도록 표면상에 돌출된 형상이라면 어떠한 형상이라도 적용이 가능하다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 나노 패턴을 이루는 돌기 형상은 원통형, 원뿔형, 원뿔대형, 반구형, 다각 기둥형으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 복수의 돌기 형상이 집합을 이루어 나노 패턴을 구성한다.The shape of the projections constituting the nanopatterns of the present invention serves to improve cell adhesion by increasing the surface area of the substrate for cell culture, thereby exhibiting the effect of promoting cell growth or differentiation. There is a special limitation on the shape of the projections. Any shape can be applied as long as it protrudes on the surface so as to increase the surface area of the substrate. Specifically, for example, the protrusion shape constituting the nanopattern of the present invention may be any one or more selected from the group consisting of a cylindrical shape, a conical shape, a truncated cone shape, a hemispherical shape, and a polygonal column shape, and a plurality of protrusion shapes form a set to form a nanopattern make up
본 발명에서 용어 '원통형'은 밑면이 원인 기둥 형상의 돌기 형상이다.In the present invention, the term 'cylindrical' refers to a protrusion shape of a columnar shape whose bottom surface is the cause.
본 발명에서 용어 '원뿔대형'은 원뿔을 밑면에 평행한 평면으로 잘랐을 때, 잘린 면으로 나뉜 원뿔의 두 부분 중에서 원뿔의 꼭짓점을 포함하지 않는 아랫부분 및 잘린 면으로 이루어진 돌기 형상이다. In the present invention, the term 'truncated cone' is a protrusion shape consisting of a lower portion and a cut surface that does not include the vertex of the cone among the two portions of the cone divided by the cut surface when the cone is cut in a plane parallel to the base.
본 발명에서 용어 '다각기둥형'은 밑면이 다각형인 기둥 모양의 형상으로서 예를 들면, 밑면이 삼각형이면 삼각기둥형, 밑면이 사각형이면 사각기둥형이다.In the present invention, the term 'polygonal prism' refers to a shape of a column having a polygonal base, for example, a triangular prism if the base is a triangle, and a quadrangular prism if the base is a quadrilateral.
본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 나노 패턴을 이루는 각각의 돌기는 '나노 필라'로 지칭할 수 있다.Throughout this specification, each protrusion constituting the nanopattern of the present invention may be referred to as a 'nanopillar'.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 돌기 형상은 형태(shape), 크기(size) 등에 특별한 제한이 없으며, 돌기 형상이 기판 상에 형성되는 것 자체로 세포 배양용 기판의 표면적을 넓히는 작용 효과가 발휘되어 기판에 대한 배양 세포의 부착성이 증가되는 효과가 발휘된다. In one embodiment of the present invention, the protrusion shape of the present invention is not particularly limited in shape, size, etc., and the protrusion shape is formed on the substrate itself to increase the surface area of the substrate for cell culture The effect is exhibited, and the effect of increasing the adhesion of cultured cells to a substrate is exhibited.
구체적으로 예를 들면, 상술한 돌기 형상은 반지름이 200 nm 내지 300 nm 및 높이가 650 nm 내지 850 nm 인 원통형의 돌기 형상이다.Specifically, for example, the above-described protrusion shape is a cylindrical protrusion shape having a radius of 200 nm to 300 nm and a height of 650 nm to 850 nm.
본 발명의 일 구체예에 있어서 상기 돌기 형상은 반지름이 225 nm 내지 275 nm 및 높이가 675 nm 내지 825 nm 인 원통형의 돌기 형상이다. 더욱 구체적으로 돌기 형상은 반지름이 240 nm 내지 260 nm 및 높이가 690 nm 내지 810 nm 인 원통형의 돌기 형상 일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the protrusion shape is a cylindrical protrusion shape having a radius of 225 nm to 275 nm and a height of 675 nm to 825 nm. More specifically, the protrusion shape may be a cylindrical protrusion shape having a radius of 240 nm to 260 nm and a height of 690 nm to 810 nm.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 패턴은 표면이 친수성 물질로 코팅될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the surface of the nano-pattern may be coated with a hydrophilic material.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 나노 패턴의 표면에 코팅된 친수성 물질은 금, 은, 티타늄 옥사이드, 크롬 옥사이드, 구리 옥사이드, 및 알루미늄 옥사이드 일 수 있고 보다 구체적으로 예를 들면 이산화 규소(SiO2)이다.In one embodiment of the present invention, the hydrophilic material coated on the surface of the nanopattern may be gold, silver, titanium oxide, chromium oxide, copper oxide, and aluminum oxide, and more specifically, for example, silicon dioxide (SiO 2 ) to be.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 패턴은 UV 경화형 수지에 의해 형성되는 것이다.In one embodiment of the present invention, the nano-pattern is formed of a UV curable resin.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 UV 경화형 수지는 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리우레탄 아크릴레이트, 실리콘, 또는 폴리다이메틸실록세인로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 구성되는 고분자를 포함하는 것으로, 보다 구체적으로 예를 들면 폴리우레탄 아크릴레이트로 구성되는 고분자를 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the UV curable resin is a polymer composed of a material selected from the group consisting of polyurethane, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyurethane acrylate, silicone, or polydimethylsiloxane. To include, more specifically, for example, may include a polymer composed of polyurethane acrylate.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 마이크로 패턴은 전도성 하이드로젤에 의해 형성되는 것이다. 본 발명에서의 전도성 하이드로젤이란 친수성 고분자로 이루어진 삼차원 구조체로서 전도성을 갖는 구조체를 의미한다.In one embodiment of the present invention, the micro-pattern of the present invention is formed by a conductive hydrogel. Conductive hydrogel in the present invention means a structure having conductivity as a three-dimensional structure made of a hydrophilic polymer.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전도성 하이드로젤은 (i) 생체적합성 고분자 및 (ii) 환원된 산화 그래핀 및 금속 나노와이어 중 어느 하나 이상을 포함하는 것이다.In one embodiment of the present invention, the conductive hydrogel comprises at least one of (i) a biocompatible polymer and (ii) reduced graphene oxide and metal nanowires.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 전도성 하이드로젤을 구성하는 일 성분인 생체적합성 고분자는 본래의 세포, 조직 또는 기관 등에 도입되더라도 세포, 조직 또는 기관에 유의한 염증 반응, 면역원성 또는 세포 독성을 유도하지 않는 기능을 가지는 고분자로써, 당업계에 공지된 어떠한 생체적합성 고분자도 사용 가능하다. 구체적인 예로는, 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 알부민, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌이민, 폴리락틱글라이코릭산(PLGA), 폴리락틱산, 폴리락타이드, 폴리글라이콜릭산, 폴리아미노산, 폴리아세탈, 폴리오써칼본에이트, 폴리칼본에이트, 폴리칼보락톤 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산, 폴리사카라이드, 폴리케탈, 폴리에테르, 폴리아마이드, 폴리말레익안하드라이드, 폴리메틸비닐에테르 및 상기 고분자의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 생체적합성 고분자이고, 보다 구체적으로 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용가능하다.In one embodiment of the present invention, the biocompatible polymer, which is one component constituting the conductive hydrogel of the present invention, has a significant inflammatory response, immunogenicity, or cell effect in cells, tissues or organs even when introduced into original cells, tissues or organs. As a polymer having a function that does not induce toxicity, any biocompatible polymer known in the art can be used. Specific examples, the biocompatible polymer is polyethylene glycol (PEG), dextran, albumin, polyvinyl alcohol, polyethyleneimine, polylactic glycolic acid (PLGA), polylactic acid, polylactide, polyglycolic acid, Polyamino acids, polyacetals, polyothercarbonates, polycarbonates, polycarbolactone polyacrylic acids, polymethacrylic acids, polysaccharides, polyketals, polyethers, polyamides, polymaleic anhydrides, polymethylvinyl ethers and It is a biocompatible polymer selected from the group consisting of copolymers of the polymer, and more specifically, for example, polyethylene glycol (PEG) can be used.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 전도성 하이드로젤을 구성하는 일 성분인 금속 나노와이어는 금속으로 이루어진 나노미터 단위의 크기를 가지는 와이어 구조체를 말한다. 나노 와이어의 종류는 제한되지 않으나 구체적인 예를 들면, 은 나노와이어, 구리 나노와이어, 금 나노와이어 또는 알루미늄 나노와이어를 이용할 수 있고, 보다 구체적으로 은 나노와이어를 이용할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the metal nanowire, which is one component constituting the conductive hydrogel of the present invention, refers to a wire structure having a size of a nanometer unit made of metal. The type of the nanowire is not limited, but specifically, for example, a silver nanowire, a copper nanowire, a gold nanowire, or an aluminum nanowire may be used, and more specifically, a silver nanowire may be used.
본 명세서에서 용어 '환원된 산화 그래핀'이란 전기 전도도를 포함하는 그래핀 고유의 물리적 특징을 복원하기 위해 산화 그래핀을 환원시킨 그래핀의 한 종류이다.As used herein, the term 'reduced graphene oxide' is a type of graphene in which graphene oxide is reduced in order to restore the intrinsic physical properties of graphene including electrical conductivity.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 하이드로젤은 (i) 생체적합성 고분자 및 (ii) 환원된 산화 그래핀 및 금속 나노와이어가 2:1 내지 10:1 비율(w/w)로 포함될 수 있다. 더욱 구체적으로 (i) 과 (ii)의 함량비는 2:1 내지 10:1, 3:1 내지 10:1, 4:1 내지 10:1, 5:1 내지 10:1, 2:1 내지 9:1, 3:1 내지 9:1, 4:1 내지 9:1, 5:1 내지 9:1, 2:1 내지 8:1, 3:1 내지 8:1, 4:1 내지 8:1, 5:1 내지 8:1, 2:1 내지 7:1, 3:1 내지 7:1, 4:1 내지 7:1, 5:1 내지 7:1, 2:1 내지 6:1, 3:1 내지 6:1, 4:1 내지 6:1, 또는 5:1 내지 6:1 비율로 구성 될 수 있고 보다 구체적으로는 3:1 내지 7:1 비율로 구성 될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the hydrogel of the present invention contains (i) a biocompatible polymer and (ii) reduced graphene oxide and metal nanowires in a 2:1 to 10:1 ratio (w/w). can More specifically, the content ratio of (i) and (ii) is 2:1 to 10:1, 3:1 to 10:1, 4:1 to 10:1, 5:1 to 10:1, 2:1 to 9:1, 3:1 to 9:1, 4:1 to 9:1, 5:1 to 9:1, 2:1 to 8:1, 3:1 to 8:1, 4:1 to 8: 1, 5:1 to 8:1, 2:1 to 7:1, 3:1 to 7:1, 4:1 to 7:1, 5:1 to 7:1, 2:1 to 6:1, It may be configured in a ratio of 3:1 to 6:1, 4:1 to 6:1, or 5:1 to 6:1, and more specifically, 3:1 to 7:1 ratio.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 기판에 형성된 나노패턴 상부에 형성되는 것을 특징으로 하는 것이다.In one embodiment of the present invention, the micro-pattern is characterized in that it is formed on the nano-pattern formed on the substrate.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노 패턴은 상기 마이크로 패턴에 의해 구획되고 마이크로 패턴이 형성되지 않은 영역 내에 형성되는 것이다.In one embodiment of the present invention, the nano-pattern is defined by the micro-pattern and is formed in an area where the micro-pattern is not formed.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 마이크로 패턴은 일정한 형상의 구조체가 반복되는 패턴을 갖는 3차원 구조체로서, 상기 마이크로 패턴은 일 방향으로 연장되는 복수 개의 선형 구조를 포함하며, 상기 복수 개의 선형 구조는 소정의 간격을 사이에 두고 서로 이격되도록 기판상에 배치되어 있다.In one embodiment of the present invention, the micro-pattern is a three-dimensional structure having a pattern in which structures of a certain shape are repeated, wherein the micro-pattern includes a plurality of linear structures extending in one direction, and the plurality of linear structures are disposed on the substrate so as to be spaced apart from each other with a predetermined interval therebetween.
본 발명의 일 구현예에 있어서 상기 소정의 간격은 100 μm 내지 600 μm 로 이루어져 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 마이크로 패턴의 간격은 100 μm 내지 550 μm 로 구성될 수 있고, 더욱 구체적으로 100 μm 내지 550 μm, 150 μm 내지 550 μm, 200 μm 내지 550 μm, 250 μm 내지 550 μm, 300 μm 내지 550 μm, 100 μm 내지 500 μm, 150 μm 내지 500 μm, 200 μm 내지 500 μm, 250 μm 내지 500 μm, 300 μm 내지 500 μm,, 100 μm 내지 450 μm, 150 μm 내지 450 μm, 200 μm 내지 450 μm, 250 μm 내지 450 μm, 300 μm 내지 450 μm, 100 μm 내지 400 μm, 150 μm 내지 400 μm, 200 μm 내지 400 μm, 250 μm 내지 400 μm, 300 μm 내지 400 μm, 100 μm 내지 350 μm, 150 μm 내지 350 μm, 200 μm 내지 350 μm, 250 μm 내지 350 μm, 또는 300 μm 내지 350 μm으로 구성될 수 있고 보다 구체적으로는 100 μm 내지 500 μm 로 이루어 질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the predetermined interval consists of 100 μm to 600 μm. In one embodiment of the present invention, the spacing of the micro-patterns may be 100 μm to 550 μm, more specifically 100 μm to 550 μm, 150 μm to 550 μm, 200 μm to 550 μm, 250 μm to 550 μm, 300 μm to 550 μm, 100 μm to 500 μm, 150 μm to 500 μm, 200 μm to 500 μm, 250 μm to 500 μm, 300 μm to 500 μm, 100 μm to 450 μm, 150 μm to 450 μm , 200 μm to 450 μm, 250 μm to 450 μm, 300 μm to 450 μm, 100 μm to 400 μm, 150 μm to 400 μm, 200 μm to 400 μm, 250 μm to 400 μm, 300 μm to 400 μm, 100 It may be composed of μm to 350 μm, 150 μm to 350 μm, 200 μm to 350 μm, 250 μm to 350 μm, or 300 μm to 350 μm, and more specifically 100 μm to 500 μm.
본 발명의 일 구현예인 전도성 하이드로젤로 구성된 마이크로 패턴을 이용하여, 상기 기판은 전기 전도성을 갖고, 기판에 대한 전기적 자극을 통해 세포 배양에 유의한 상승작용을 일으킨다. 또한 상기 나노패턴에 의한 지형학적 작용과의 조합에 의해 세포 배양을 촉진 할 수 있다. By using the micro-pattern composed of a conductive hydrogel, which is an embodiment of the present invention, the substrate has electrical conductivity and causes a significant synergism in cell culture through electrical stimulation to the substrate. In addition, cell culture can be promoted by the combination with the topographic action by the nanopatterns.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 배양용 기판은 세포 배양을 위해 전압이 인가(apply)되는 것인 세포 배양용 기판인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the cell culture substrate is a cell culture substrate to which a voltage is applied for cell culture.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 배양을 위해 인가되는 전압은 교류형태의 전압이 인가 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 예를 들면 DC 서플라이(DC supply)를 이용하여 직류를 발생하고 DC 서플라이(DC supply)를 함수 발생기(function generator)와 연결하여 교류형태로 전압을 인가할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the voltage applied for cell culture may be an AC voltage, and more specifically, for example, a DC supply (DC supply) is used to generate a direct current, and the DC supply ( DC supply) can be connected to a function generator to apply a voltage in an AC form.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 전압을 인가하는 방식은 구리선을 마이크로 패턴에 접촉시켜 세포 배양을 위한 전압을 인가한다.In one embodiment of the present invention, in the method of applying a voltage, a voltage for cell culture is applied by contacting a copper wire to a micro pattern.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전압의 인가는 마이크로 패턴이 배열된 방향에 수직방향으로 인가되는 것을 특징으로 한다. In one embodiment of the present invention, the voltage is applied in a direction perpendicular to the direction in which the micro-patterns are arranged.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 전압은 1 V 내지 15 V 로 인가 되는 것이다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 배양용 기판에 인가될 수 있는 전압은 2 V 내지 15 V, 3 V 내지 15 V, 4 V 내지 15 V, 5 V 내지 15 V, 1 V 내지 14 V, 2 V 내지 14 V, 3 V 내지 14 V, 4 V 내지 14 V, 5 V 내지 14 V, 1 V 내지 13 V, 2 V 내지 13 V, 3 V 내지 13 V, 4 V 내지 13 V, 5 V 내지 13 V, 1 V 내지 12 V, 2 V 내지 12 V, 3 V 내지 12 V, 4 V 내지 12 V, 5 V 내지 12 V, 1 V 내지 11 V, 2 V 내지 11 V, 3 V 내지 11 V, 4 V 내지 11 V, 5 V 내지 11 V, 1 V 내지 10 V, 2 V 내지 10 V, 3 V 내지 10 V, 4 V 내지 10 V, 또는 5 V 내지 10 V 로 인가 될 수 있고, 보다 구체적으로는 5 V 내지 10 V로 인가 될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the voltage is applied in a range of 1 V to 15 V. In one embodiment of the present invention, the voltage that can be applied to the substrate for cell culture is 2 V to 15 V, 3 V to 15 V, 4 V to 15 V, 5 V to 15 V, 1 V to 14 V, 2 V to 14 V, 3 V to 14 V, 4 V to 14 V, 5 V to 14 V, 1 V to 13 V, 2 V to 13 V, 3 V to 13 V, 4 V to 13 V, 5 V to 13 V, 1 V to 12 V, 2 V to 12 V, 3 V to 12 V, 4 V to 12 V, 5 V to 12 V, 1 V to 11 V, 2 V to 11 V, 3 V to 11 V, 4 V to 11 V, 5 V to 11 V, 1 V to 10 V, 2 V to 10 V, 3 V to 10 V, 4 V to 10 V, or 5 V to 10 V may be applied, More specifically, 5 V to 10 V may be applied.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 배양용 기판은 ECM(extracellular matrix) 기질로 코팅된 것을 특징으로 하는 것이다.In one embodiment of the present invention, the cell culture substrate is characterized in that it is coated with an extracellular matrix (ECM) substrate.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 세포 배양용 기판에 코팅 될 수 있는 ECM 기질은, 피브린(fibrin), 매트리젤(Matrigel), 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen), 라미닌(laminin) 또는 poly-L-ornithine(PLO)으로 구성된 군으로부터 선택되는 ECM 기질이고 보다 구체적으로 예를 들면 라미닌 및 Poly-L-ornithine (PLO)을 사용가능하다.In one embodiment of the present invention, the ECM substrate that can be coated on the substrate for cell culture is fibrin, Matrigel, fibronectin, collagen, laminin or poly- It is an ECM substrate selected from the group consisting of L-ornithine (PLO), and more specifically, for example, laminin and Poly-L-ornithine (PLO) can be used.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 세포를 배양하는 방법은 상기 세포 배양용 기판에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법이다.In one embodiment of the present invention, the method for culturing cells is a cell culture method comprising culturing the cells on the cell culture substrate.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명에서 이용될 수 있는 근육세포의 배양방법은 근육세포를 배양액이 포함된 배지에서 배양하는 단계; 근육세포를 세포 배양용 기판에 씨딩하는 단계; 세포 배양용 기판에 전압을 인가하여 근육세포를 배양하는 단계를 포함한다.In one embodiment of the present invention, the method for culturing muscle cells that can be used in the present invention includes culturing the muscle cells in a medium containing a culture solution; seeding the muscle cells on a substrate for cell culture; and culturing the muscle cells by applying a voltage to the cell culture substrate.
근육세포는 fetal bovine serum 및 penicillin-streptomycin 이 포함된 high-serum DMEM 또는 low-serum DMEM 배양액을 첨가하여 배양할 수 있다.Muscle cells can be cultured by adding high-serum DMEM or low-serum DMEM containing fetal bovine serum and penicillin-streptomycin.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명에서 이용될 수 있는 신경세포의 배양방법은 신경줄기세포를 배양하여 신경구를 유도하는 단계; 신경구를 세포 배양 기판상에 씨딩하는 단계; 세포 배양용 기판에 전압을 인가하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함한다.In one embodiment of the present invention, the method for culturing nerve cells that can be used in the present invention comprises the steps of inducing a neurosphere by culturing neural stem cells; seeding the neurospheres on the cell culture substrate; and applying a voltage to the substrate for cell culture to differentiate into neurons.
신경줄기세포는 BFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor) 또는 FGF(fibroblast growth factor)의 생장 인자를 적합 농도 범위로 배지에 첨가하여 배양할 수 있다.Neural stem cells can be cultured by adding growth factors of basic fibroblast growth factor (BFGF), epidermal growth factor (EGF) or fibroblast growth factor (FGF) to the medium in an appropriate concentration range.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명은 마이크로 패턴과 나노 패턴이 함께 형성된 세포 배양용 기판을 제공한다. (a) The present invention provides a substrate for cell culture in which a micro-pattern and a nano-pattern are formed together.
(b) 본 발명은 전압이 인가된 세포 배양용 기판을 이용한 세포배양방법을 제공한다.(b) The present invention provides a cell culture method using a cell culture substrate to which voltage is applied.
(c) 본 발명의 세포 배양용 기판을 이용하는 경우, 세포 배양을 촉진 할 수 있다.(c) When the substrate for cell culture of the present invention is used, cell culture can be promoted.
도 1a는 나노패턴의 제작 과정을 나타낸다.
도 1b는 나노패턴과 마이크로 패턴 결합 모식도이다. A) 는 나노필라 생성 후 전도성 하이드로 젤을 마이크로 패턴하고 세포 부착에 대한 것이고 B)는 지형학적 나노패턴과 전기적 자극을 위한 마이크로패턴을 나타낸다.
도 2a는 나노 패턴에 대한 시뮬레이션 결과로써 A) 나노필라의 3차원 모델링 B) 설계 수치에 대한 지시 C) 나노필라의 높이에 따른 변위 D) 반지름에 따른 변위 E) 탄성률에 따른 변위 F) 반지름과 높이의 비율에 따른 변위를 나타낸다.
도 2b는 나노필라의 전자현미경 사진과 접촉각을 분석한 결과로써 A) 나노필라의 전자현미경 사진 B) 표면 처리된 전자현미경 사진 C) 각각의 접촉각 사진 D) 접촉각 분석 그래프를 나타낸다.
도 3은 마이크로 패터닝 소재의 전자 현미경 사진으로써 A) AgNW의 전자현미경 사진 B) rGO의 전자현미경사진 C) PEG의 전자현미경 사진 D) AgNW-PEG-rGO의 전자현미경 사진 E) AgNW-PEG-rGO의 성분 분석한 표를 나타낸다.
도 4는 마이크로 패턴의 시뮬레이션 결과로써 A) 마이크로 패턴의 모델링 및 전류 밀도 B) 근육 세포와 신경 세포에 인가된 전압 및 주파수 (C) 하이드로젤에 첨가된 재료에 따른 전류 밀도 D) 패턴의 간격에 따른 전류 밀도를 나타낸다.
도 5a는 나노 패턴에 따른 근육세포 증식 및 신경세포 분화 공초점 현미경 사진으로써 A) 나노 패턴에 따른 근육세포 증식 사진 B) 나노 패턴에 따른 신경세포 분화 사진을 나타낸다.
도 5b는 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 및 신경세포 분화 공초점 현미경 사진으로써 A) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 사진 B) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 신경세포 분화 사진을 나타낸다.
도 6은 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 및 신경세포 분화 분석한 결과로써 A) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 근육세포 증식 그래프 B) 마이크패턴과 전기적 자극에 따른 신경세포 분화 그래프를 나타낸다.1A shows a manufacturing process of a nanopattern.
Figure 1b is a schematic diagram of nano-pattern and micro-pattern combination. A) shows micropatterns of conductive hydrogels and cell adhesion after nanopillar generation, and B) shows topographical nanopatterns and micropatterns for electrical stimulation.
2A is a simulation result for a nano-pattern, showing A) 3D modeling of nanopillars B) Instruction for design values C) Displacement according to height of nanopillar D) Displacement according to radius E) Displacement according to elastic modulus F) Radius and It represents the displacement according to the ratio of the height.
FIG. 2b is an electron micrograph and contact angle analysis result of nanopillars, showing A) electron micrographs of nanopillars B) surface-treated electron micrographs C) respective contact angle photos D) contact angle analysis graphs.
3 is an electron micrograph of the micro-patterned material. A) electron micrograph of AgNW B) electron micrograph of rGO C) electron micrograph of PEG D) electron micrograph of AgNW-PEG-rGO E) AgNW-PEG-rGO The table of component analysis is shown.
4 is a simulation result of the micropattern, A) Modeling and current density of the micropattern B) Voltage and frequency applied to muscle cells and nerve cells (C) Current density according to the material added to the hydrogel D) The interval of the pattern represents the current density.
5A is a confocal micrograph of muscle cell proliferation and nerve cell differentiation according to nano-pattern A) a photograph of muscle cell proliferation according to nano-pattern B) neuron differentiation photograph according to nano-pattern.
5B is a confocal micrograph of muscle cell proliferation and nerve cell differentiation according to a microphone pattern and electrical stimulation, A) a photograph of muscle cell proliferation according to a microphone pattern and electrical stimulation B) A photograph of nerve cell differentiation according to a microphone pattern and electrical stimulation .
6 is a graph showing muscle cell proliferation and nerve cell differentiation according to a microphone pattern and electrical stimulation, A) a muscle cell proliferation graph according to a microphone pattern and electrical stimulation B) a neuron differentiation graph according to a microphone pattern and electrical stimulation.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
실시예Example
실시예 1: 지형학적 요소 Example 1: Topographical Elements
1-1. 나노 필라 최적화 설계1-1. Nanopillar Optimized Design
나노 패턴 제작에 앞서, 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 나노필라를 구성하는 각종 설계 수치의 변화에 따른 나노필라의 굽힘을 관찰하였다. 필라의 굽힘은 일반적으로 다음과 같은 공식으로 설명된다.Prior to nanopattern fabrication, bending of the nanopillars according to the change of various design values constituting the nanopillars was observed through computer simulation. Pillar bending is generally described by the following formula:
(y는 필라 끝의 변위, x는 필라의 시작점에서부터 해당 지점까지의 거리, M 은 해당 지점에 작용하는 회전 모멘트, E는 young's modulus, I는 필라에 수직한 평면의 면적 관성 모멘트) 또한, 유동에서 필라가 받는 힘은 유체의 점성에 기원한다.(y is the displacement of the tip of the pillar, x is the distance from the starting point of the pillar to the corresponding point, M is the rotational moment acting on the corresponding point, E is the young's modulus, I is the area moment of inertia in the plane perpendicular to the pillar) The force received by the pillars is derived from the viscosity of the fluid.
(CD는 항력계수, AP는 물체의 단면적)(C D is the drag coefficient, A P is the cross-sectional area of the object)
점성 저항력은 위와 같은 식으로 표현되며, CD의 값은 레이놀즈 수에 따라 달라진다. 흐르는 유체 내부에서 각 지점마다 유속이 다르고 레이놀즈 수도 다르다. 따라서 유체에 안에서 작용하는 힘들은 선형적으로 표현될 수 없으며, 해당 미분방정식을 풀기에는 어려움이 있다. 본 발명에서는 컴퓨터 시뮬레이션을 이용하여 그 값을 최적화하였다. COMSOL 소프트웨어에 내장된 Geometry 기능을 이용하여 나노필라와 유체의 유동을 구현하였고, Fine Mesh를 설정하였다. 전체 모델은 Laminar flow를 가정하였고 비압축성 유체를 가정하였다. 지형학적 시뮬레이션을 통하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1) 나노필라의 반지름이 작을수록 나노필라 끝의 변위가 증가했다. 2) 나노필라의 높이가 높을수록 나노필라 끝의 변위가 증가했다. 3) 나노필라의 탄성률이 작을수록 나노필라 끝의 변위가 증가했다. 시뮬레이션 결과 돌기 형상은 반지름이 250 nm 및 높이가 750 nm 인 원통형의 돌기 형상이 최적의 조건임을 발견하였고, 그 결과를 반영하여 제작된 나노필라를 기판에 패터닝하여 제작하였다.The viscous resistivity is expressed as above, and the value of C D depends on the Reynolds number. Each point in a flowing fluid has a different flow velocity and a different Reynolds number. Therefore, the forces acting in the fluid cannot be expressed linearly, and it is difficult to solve the corresponding differential equation. In the present invention, the value was optimized using computer simulation. Using the geometry function built into COMSOL software, nanopillars and fluid flow were realized, and a fine mesh was set. The whole model assumed laminar flow and assumed incompressible fluid. The following results were obtained through topographical simulation. 1) As the radius of the nanopillars decreased, the displacement of the tip of the nanopillars increased. 2) As the height of the nanopillars increased, the displacement of the tip of the nanopillars increased. 3) As the elastic modulus of the nanopillars decreased, the displacement of the tip of the nanopillars increased. As a result of the simulation, it was found that a cylindrical protrusion shape with a radius of 250 nm and a height of 750 nm was the optimal condition, and the nanopillars fabricated by reflecting the results were patterned on a substrate and fabricated.
1-2. 나노 패터닝된 기판의 제조1-2. Preparation of nano-patterned substrates
본 발명에서 전기전도성을 갖는 전도성 하이드로젤 마이크로패터닝 기술과 지형학적 조건을 제어하는 나노패터닝 기술을 융합하여 줄기세포의 분화를 유도하고 촉진하는 기술을 개발하였다. 일반적으로 세포가 성장하는 기판의 지형학적 요소는 세포의 분화와 성장에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 지형학적 조건을 제어하기 위하여 본 발명에서는 나노필라 설계를 기반으로 제작된 포토마스크를 제작하고 실리콘 웨이퍼 위에 감광제를 코팅하고 포토마스크를 사용하여 UV에 조사하여 패턴을 형성한 후 실리콘 웨이퍼를 에칭하여 나노홀을 가지는 실리콘 웨이퍼를 제작하였다. 이후 표면에 폴리우레탄 아크릴레이트를 도포한 후 UV를 조사하여 경화시켜 나노필라를 가지는 폴리머 기판을 제작하였다. 친수성을 높이기 위하여 SiO2를 사용하여 표면을 코팅하였다.In the present invention, a technology for inducing and promoting differentiation of stem cells was developed by fusion of a conductive hydrogel micropatterning technology with electrical conductivity and a nanopatterning technology that controls topographical conditions. In general, it is known that the topographical factors of the substrate on which cells are grown affect the differentiation and growth of cells. Therefore, in order to control the topographical conditions, in the present invention, a photomask manufactured based on a nanopillar design is manufactured, a photosensitive agent is coated on a silicon wafer, and a pattern is formed by irradiating it with UV using a photomask, and then etching the silicon wafer. Thus, a silicon wafer having nanoholes was manufactured. Then, polyurethane acrylate was applied to the surface. After coating, it was cured by irradiating UV light to prepare a polymer substrate having nanopillars. In order to increase the hydrophilicity, SiO 2 was used to coat the surface.
1-3. 패터닝된 하이드로젤의 제조1-3. Preparation of patterned hydrogels
세포에 가해지는 전기적 자극은 줄기세포의 신경세포 분화와 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, 마이크로패턴은 분화 방향에도 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 세포의 성장을 촉진하기 위하여, 하이드로젤을 주성분으로 하는 마이크로패턴을 앞서 기술한 나노패턴 기판 위에 패터닝하였다. 그 과정에서 반도체 제조 공정인 포토리소그래피 기술을 이용하였다. Photoresist가 패턴 된 실리콘 웨이퍼를 이용하여 polydimethylsiloxane(PDMS)으로 마이크로 몰드를 제작하였고, 높은 전기전도성을 획득하기 위해 polyethylene glycol(PEG)에 환원된 산화 그래핀(rGO)과 은 나노와이어(AgNW)를 각각 10:1:1의 비율로 혼합하여 앞서 제작된 PDMS 마이크로 몰드를 사용하여 기판에 패터닝하였다. 1w/v% 광개시제(photoinitiator)인 2-하이드록시-2-메틸 프로피오페논(2-hydroxy-2-methyl propiophenone,Sigma-Aldrich Co., MO, 미국)을 10w/v% PEG-diacrylate(1000 Da)와 혼합한 뒤 은 나노와이어 수용액과 rGO 파우더와 10:1:1 의 비율로 혼합하여 패터닝에 PDMS 마이크로몰드에 주입한다. 제작된 PDMS 마이크로몰드를 사용하여 유연한(flexible) 나노 패턴이 있는 PUNO 필름위에 위에 패터닝하여 디바이스를 제작하였다. 제작방법은 PDMS 마이크로몰드에 인렛(inlet) 및 아웃렛(outlet) 홀을 펀치로 뚫어주고 PDMS와 나노 패턴 필름을 접착시킨 뒤 파이펫을 이용하여 PEG/AgNW/rGO가 혼합된 물질을 인렛 홀에 주입하고 UV를 조사하여 광가교결합(photocrosslink)을 하여 패터닝을 진행하였다. 상기 패터닝된 하이드로젤은 바닥면은 나노패턴이고 벽면은 전도성 물질인 은나노와이어와 rGO가 포함된 하이드로젤로 이루어지게 된다. 이 후 패터닝 된 디바이스 표면에 ECM(extracellular matrix) 기질인 라미닌(laminin)과 폴리-L-오리니틴(poly-L-orinithine; PLO)을 사용하여 줄기세포의 분화를 유도하도록 코팅처리를 진행하였다. 상세하게는, 마이크로피펫을 이용하여 200 ㎖의 PLO 0.1 ㎎/㎖를 패턴 위에 처리한 뒤 37℃ 인큐베이터에 6시간 이상 항온반응 하였다. 세포분화를 유도하기 위해 PLO가 처리된 패턴 위에 0.02 ㎎/㎖ 라미닌을 200 ㎖ 처리하여 37℃ 인큐베이터에 2시간 이상 항온반응 하였다. 또한 마이크로 패턴의 기술 개발 및 특성 평가를 진행하기 위해 100 μm, 300 μm, 500 μm의 간격을 갖는 마이크로 패턴에 대하여 컴퓨터 시뮬레이션을 진행하였다. 각각의 모델에 대하여, 전류 밀도가 거의 같다는 것을 확인하였고, 본 발명에서는 세포의 크기를 고려하여 300 μm의 간격을 채택하였다.Electrical stimulation applied to cells is known to promote the differentiation and growth of stem cells into nerve cells, and micropatterns are also known to affect the direction of differentiation. Therefore, in the present invention, in order to promote cell growth, a micropattern containing a hydrogel as a main component was patterned on the above-described nanopatterned substrate. In the process, photolithography technology, a semiconductor manufacturing process, was used. Micro-moulds were fabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) using photoresist-patterned silicon wafers, and graphene oxide (rGO) and silver nanowires (AgNW) reduced in polyethylene glycol (PEG) were each prepared in order to obtain high electrical conductivity. It was mixed in a ratio of 10:1:1 and patterned on the substrate using the previously prepared PDMS micro mold. 1w/v% photoinitiator 2-hydroxy-2-methyl propiophenone (Sigma-Aldrich Co., MO, USA) was mixed with 10w/v% PEG-diacrylate (1000 Da) and mixed with silver nanowire aqueous solution and rGO powder in a ratio of 10:1:1, and injected into the PDMS micromould for patterning. A device was fabricated by patterning on the PUNO film with flexible nano-patterns using the produced PDMS micro-mould. The manufacturing method is to punch inlet and outlet holes in the PDMS micromould, attach PDMS and nano-patterned film, and then inject a PEG/AgNW/rGO mixed material into the inlet hole using a pipette. Then, patterning was carried out by photocrosslinking by irradiating UV. The patterned hydrogel has a bottom surface of a nanopattern and a wall surface of a hydrogel containing silver nanowires and rGO, which are conductive materials. After that, the patterned device surface was coated with extracellular matrix (ECM) substrates such as laminin and poly-L-orinithine (PLO) to induce stem cell differentiation. Specifically, 200 ml of PLO 0.1 mg/ml was treated on the pattern using a micropipette, and then incubated in an incubator at 37° C. for 6 hours or more. In order to induce cell differentiation, 200 ml of 0.02 mg/ml laminin was treated on the PLO-treated pattern and incubated in an incubator at 37° C. for 2 hours or more. In addition, computer simulations were performed for micropatterns with intervals of 100 μm, 300 μm, and 500 μm to proceed with the technology development and characteristic evaluation of the micro pattern. For each model, it was confirmed that the current density was almost the same, and in the present invention, an interval of 300 μm was adopted in consideration of the cell size.
실시예 2: 전기적 요소Example 2: Electrical Elements
나노패턴과 마이크로패턴이 결합된 조건에서 전기적 자극을 위하여 근육세포에는 5 V에 1 Hz의 교류를 인가하였고, 신경 세포에는 10 V에 139 μHz를 인가하여 세포의 생리를 관찰하였다.For electrical stimulation under the conditions in which the nanopattern and micropattern were combined, an alternating current of 5 V and 1 Hz was applied to muscle cells, and 139 μHz to 10 V was applied to nerve cells to observe the physiology of the cells.
배양용 기판에 전압을 인가하기 위하여 DC 서플라이(DC supply)를 이용하여 직류를 발생하고 DC 서플라이(DC supply)를 함수 발생기(function generator)와 연결하여 교류형태로 전압을 인가하였으며, 구리선을 마이크로 패턴에 접촉시켜 세포 배양을 위한 전압을 인가하였다.In order to apply a voltage to the substrate for culture, a DC supply was used to generate a direct current, and the DC supply was connected to a function generator to apply a voltage in an alternating current form, and the copper wire was micropatterned. A voltage for cell culture was applied by contacting the .
실시예 3: 세포의 배양 방법Example 3: Cell culture method
3-1. 근육세포의 배양3-1. culture of muscle cells
C2C12 세포는 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum) (Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, USA)이 포함된 high-serum DMEM (Gibco, USA) 배양액을 통해 배양된다. C2C12 세포를 마이크로 패턴위에 올리고 하루동안 배양한 다음 2% 소태아 혈청 (fetal bovine serum) (Gibco, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, USA)이 포함된 low-serum DMEM 배양액으로 교체한다. C2C12 cells are cultured in high-serum DMEM (Gibco, USA) medium containing 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco, USA). C2C12 cells are placed on the micropattern, cultured for one day, and then replaced with a low-serum DMEM medium containing 2% fetal bovine serum (Gibco, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Gibco, USA). .
3-2. 신경줄기세포의 배양3-2. Cultivation of neural stem cells
BFGF 및 EGF를 포함하는 N2 배지(1% 무혈청 N2, 2% B27 보충물 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12)에 신경줄기세포(Pregnant female C57BL/6 mice cerebral cortex from brain at E12 (DAEHAN BIOLINK, 대한민국))를 3일 동안 배양하여 세포가 신경구를 형성하도록 하였다. 3일 동안 세포 배양 디시에서 배양을 하게 되면 신경줄기세포들은 서로 뭉쳐 자연스럽게 신경구 형태를 갖게 된다. 3일 동안 배양했을 경우 신경구의 크기는 약 100 μm - 150 μm이다.Pregnant female C57BL/6 mice cerebral cortex from brain at E12 in N2 medium containing BFGF and EGF (DMEM/F12 with 1% serum-free N2, 2% B27 supplement and 1% penicillin-streptomycin). (DAEHAN BIOLINK, Korea)) was cultured for 3 days to allow cells to form neurospheres. When cultured in a cell culture dish for 3 days, neural stem cells are naturally clustered with each other to have a neurosphere shape. When cultured for 3 days, the size of neurospheres is about 100 μm - 150 μm.
상기 신경구를 패터닝된 하이드로젤 상에 씨딩한다. 6 웰 플레이트에 3일 동안 배양된 신경구들을 파이펫을 이용하여 패터닝된 하이드로젤 상에 씨딩을 한 후 가볍게 플레이트를 흔들어 패턴 사이로 신경구들이 부착될 수 있도록 한다.The neurospheres are seeded on the patterned hydrogel. After seeding the neurospheres cultured for 3 days in a 6-well plate on the patterned hydrogel using a pipette, gently shake the plate so that the neurospheres can be attached between the patterns.
실험 결과Experiment result
C2C12 세포의 부착 증가를 확인하기 위하여, 컨트롤과 SiO2가 코팅된 나노패턴을 비교하였다. 2 x 106의 C2C12 세포를 나노필라 필름이 있는 6 웰 플레이트에서 7일동안 배양하고 phalloidin을 marker를 통해 확인한 결과, SiO2가 코팅된 나노패턴 위에서 C2C12 세포의 부착이 확연하게 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 5a의 A). 또한 NSC의 세포 부착을 확인하였다. C2C12와 같은 방법으로 7일동안 SiO2가 코팅된 나노패턴 위에서 세포를 배양하고 Tuj1 항체(Stem cell technology, CANADA)와 Nestin 항체(abcam, UK)로 확인한 결과, 부유해서 자라는 신경구(neurosphere) 형태의 신경줄기세포가 뭉치지 않고 부착되어 신경돌기(neurite)를 형성하는 것을 확인하였다 (도 5a의 B). 이를 통해 본 발명의 나노필라가 세포의 부착을 증가시켜 분화를 촉진할 수 있다는 것을 확인하였다.To confirm the increased adhesion of C2C12 cells, the control and SiO 2 coated nanopatterns were compared. 2 x 10 6 C2C12 cells were cultured in a 6-well plate with a nanopillar film for 7 days, and phalloidin was checked through a marker. As a result, it was confirmed that the adhesion of C2C12 cells was significantly increased on the SiO 2 coated nanopattern. (A in Fig. 5a). In addition, cell adhesion of NSCs was confirmed. In the same way as C2C12, cells were cultured on the SiO 2 coated nanopattern for 7 days and confirmed with Tuj1 antibody (Stem cell technology, CANADA) and Nestin antibody (abcam, UK). It was confirmed that the neural stem cells were attached without aggregation to form neurites (FIG. 5B). Through this, it was confirmed that the nanopillars of the present invention can promote differentiation by increasing cell adhesion.
나노필라가 세포의 부착을 증가시킨 다는 것을 확인하고 세포의 분화를 촉진하기 위하여 세포를 마이크로/나노패턴 위에서 배양하고 전기자극이 있을 때와 없을 때를 비교하였다. 도 5b의 C2C12세포의 경우 세포를 염색하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과 마이크로나노패턴 위에서 세포가 근육다발을 형성한 것을 확인할 수 있었다 (도 5b의 A). 신경줄기세포의 경우에는 대조군에 비하여 신경줄기세포 마커인 Tuj1의 발현이 증가하였으며, 신경돌기가 많이 형성된 것을 확인하여 신경세포로의 분화가 증가한 것을 확인하였다 (도 5b의 B) To confirm that nanopillars increase cell adhesion and promote cell differentiation, cells were cultured on micro/nanopatterns and compared with and without electrical stimulation. In the case of the C2C12 cells of FIG. 5B, it was confirmed that the cells formed muscle bundles on the micro-nano-pattern as a result of staining the cells and observing them with a confocal microscope (FIG. 5B A). In the case of neural stem cells, the expression of the neural stem cell marker Tuj1 was increased compared to the control group, and it was confirmed that a lot of neurites were formed, thereby confirming that differentiation into neurons was increased ( FIG. 5B ).
(도 5b의 A)spatial contrast muscle cells
(A of Fig. 5b)
(도 5b의 B)neuron neurite length
(B of Fig. 5b)
Claims (18)
상기 마이크로 패턴은 전도성 하이드로젤에 의해 형성되는 것이고,
상기 전도성 하이드로젤은 (i) 생체적합성 고분자 및 (ii) 환원된 산화 그래핀 및 금속 나노와이어 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인,
세포 배양용 기판.
Micro-patterns and nano-patterns are formed together,
The micro-pattern is formed by a conductive hydrogel,
The conductive hydrogel comprises at least one of (i) a biocompatible polymer and (ii) reduced graphene oxide and metal nanowires,
Substrate for cell culture.
The substrate for cell culture according to claim 1, wherein the nanopattern has a plurality of protrusion shapes formed at equal intervals.
The substrate for cell culture according to claim 1, wherein the surface of the nano-pattern is coated with a hydrophilic material.
The substrate for cell culture according to claim 3, wherein the hydrophilic material is a material selected from the group consisting of gold, silver, titanium oxide, chromium oxide, copper oxide, aluminum oxide and silicon dioxide.
The substrate for cell culture according to claim 1, wherein the nano-pattern is formed of a UV-curable resin.
The cell of claim 5, wherein the UV curable resin is a polymer composed of a material selected from the group consisting of polyurethane, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyurethane acrylate, silicone and polydimethylsiloxane. substrate for culture.
The substrate for cell culture according to claim 2, wherein the protrusion shape is a cylindrical protrusion shape.
The substrate for cell culture according to claim 4, wherein the hydrophilic material is silicon dioxide.
The substrate for cell culture according to claim 1, wherein the micro-pattern is formed on the nano-pattern formed on the substrate.
10. The method according to claim 9, wherein the micro-pattern includes a plurality of linear structures extending in one direction, and the plurality of linear structures are disposed on a substrate to be spaced apart from each other with a predetermined interval therebetween. Board.
The substrate for cell culture according to claim 10, wherein the predetermined interval is 100 μm to 500 μm.
The substrate for cell culture according to claim 1, wherein a voltage is applied to the substrate for cell culture.
The substrate for cell culture according to claim 12, wherein the voltage is applied in a range of 5 V to 10 V.
The substrate for cell culture according to any one of claims 1 to 13, wherein the substrate for cell culture is coated with an extracellular matrix (ECM) substrate.
A cell culture method comprising the step of culturing cells on the cell culture substrate of any one of claims 1 to 13.
The method of claim 15 , wherein the culturing of the cells is culturing the cells by applying a voltage to the cell culture substrate.
The method according to claim 16, wherein the voltage is applied in a direction perpendicular to the direction in which the micro-patterns are arranged.
The method according to claim 16, wherein the voltage is applied in a range of 5 V to 10 V.
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