KR102261190B1

KR102261190B1 - 발현 효율이 향상된 항원 결합 단백질

Info

Publication number: KR102261190B1
Application number: KR1020190122851A
Authority: KR
Inventors: 김태현; 김병환; 함연경
Original assignee: 주식회사 노블젠
Priority date: 2019-10-04
Filing date: 2019-10-04
Publication date: 2021-06-07
Also published as: KR20210040534A

Abstract

본 발명은 발현 효율이 향상된 항원 결합 단백질에 관한 것으로 더욱 상세하게는 상기 항원 결합 단백질의 아미노산 치환 및/또는 부가를 통해 단백질의 발현 효율 및 용해성을 향상시킬 수 있다.

Description

발현 효율이 향상된 항원 결합 단백질{Antigen binding protein with improved expression efficiency}

본 발명은 발현 효율이 향상된 항원 결합 단백질에 관한 것이다.

항체는 척추동물의 면역반응으로 생성되는 단백질로써 항원의 특정 부위를 특이적으로 인식하여 결합함으로써 항원의 작용을 비활성 시키거나 제거시키는 면역단백질이다. 항체는 경쇄가변영역(VL)과 중쇄가변영역(VH)으로부터 항원결합부위(antigen binding site)가 형성되며, 이를 이용하여 항체의 기능을 수행하고자 하는 연구가 진행되고 있다.

특히, 단일사슬항체조각(single chain variable fragment, scFv)은 일반 항체에 비해 크기가 작기 때문에 조직이나 암 조직으로의 침투율이 높고 대장균시스템을 비롯한 다양한 발현시스템에서 대량생산이 가능하고, 다양한 분자 생물학적 수식(modification)이 가능하다. 또한, scFv는 생산에 드는 시간과 비용이 절감되는 장점이 있다.

이러한 배경하에서 동물 세포 감염 바이러스에 대한 항바이러스제(한국등록특허 0890463호)로 외래 유래 핵산 사슬에 대해 항바이러스 활성이 있으나 자체 유래 핵산에 대해서는 세포독성이 없는 3D8 scFv 단백질에 대한 연구가 있으나 scFv를 포함한 항원 결합 단백질의 활용성을 향상시키는 방법에 대한 개발은 미미한 실정이다. 따라서, 산업적 활용성을 높이기 위하여, 단백질의 용해성 및 발현 효율을 향상시켜 항원 결합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요하다.

한국등록특허 0890463호(2009.03.18.)

본 발명은 발현 효율이 향상된 항원 결합 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 발현 효율이 향상된 scFv 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 scFv 변이체를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.

2. 위 1에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, K38R, K67R, L70I, S72R, A79L, L83M 및 T87R로 구성되는 군 및 VL의 아미노산 중 L2I S25A, L29I, S83R, Q85E, E87G 및 L89E로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 항원 결합 단백질.

3. 위 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 K38R, K67R 및 T87R를 포함하는, 항원 결합 단백질.

4. 위 3에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, L70I, S72R, A79L 및 L83M; 및 VL의 아미노산 중 L2I, S25A 및 L29I를 더 포함하는, 항원 결합 단백질.

5. 위 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VL의 아미노산 중 S83R, Q85E, E87G 및 L89E를 포함하는, 항원 결합 단백질.

6. 위 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, K38R, K67R, L70I, S72R, A79L, L83M 및 T87R; 및 VL의 아미노산 중 L2I S25A, L29I, S83R, Q85E, E87G 및 L89E를 포함하는, 항원 결합 단백질.

7. 위 1에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.

8. 위 2에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 VH 및 서열번호 5로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.

9. 위 2에 있어서, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.

10. 위 2에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.

11. 위 2에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.

12. 위 2에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 VH 및 서열번호 11로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.

13. 위 2에 있어서, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.

14. 위 2에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 VH 및 서열번호 14로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.

15. 위 2에 있어서, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.

16. 위 1에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 scFv인, 항원 결합 단백질.

17. 위 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 핵산 가수분해용 조성물.

18. 위 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 항바이러스 조성물.

19. 위 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

20. 위 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 사료 첨가제.

21. 위 1항 내지 16 중 어느 한 항에 따른 상기 항원 결합 단백질을 인코딩하는, 핵산 분자.

22. 위 21항에 따른 상기 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.

23. 위 22항에 따른 상기 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.

본 발명은 발현 효율이 향상된 항원 결합 단백질을 제공할 수 있다.

본 발명은 발현 효율이 향상된 scFv 변이체를 제공할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 scFv 변이체를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D8 scFv 변이체의 발현 수준을 확인하기 위한 western blotting 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 본 발명에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 제공한다.

본 발명에 있어 항원 결합 단백질은 면역글로불린 또는 그 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 단백질은 면역글로불린 G (IgG) 유래 단편이고, 일 실시예에서 상기 면역글로불린 G 단편은, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 3D8 항체의 변이체이다.

면역글로불린이란 혈청성분(血淸成分) 중 면역에 중요한 역할을 하고, 또 항체 작용을 하는 단백질의 총칭으로서, 기본구조는 분자량 약 2만 3000의 L 사슬(light chain, 경쇄) 한 쌍과 5만~7만의 H 사슬(heavy chain, 중쇄) 한 쌍이 이황화 결합된 것으로, H 사슬의 종류 γ, α, μ, δ, ε 에 의해 각각 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE로 분류된다.

면역글로불린 G는 분자량 약 2만 5000의 L사슬 1쌍과 분자량 약 5만의 H사슬 1쌍으로 되어 있고 전체 분자량은 약 15만이며, 양서류 이상의 고등동물에서 중요한 면역글로불린으로, 사람에서는 면역글로불린의 약 70%를 차지하고 있으며 태반을 통과하며 여러 형태의 항체활성을 지닌다.

본 발명에서 사용되는 "3D8"은 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질로서, 세포침투성 항체의 일종으로 이는 핵산 가수분해능을 가지고 있어서, 항바이러스 효과 및 항암 효과를 가지는 항체이다.

본 발명에서 사용되는 "항체", 또는 "항원 결합 단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 본 명세서에 기술된 항체뿐만 아니라 항체 유도체, 단편 및 모방체를 비롯한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 다수의 포맷을 가질 수 있다.

한편, 면역글로불린의 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소에 의한 절단 또는 화학 절단에 의해 생산될 수 있다. 상기 단편은 핵산 사슬에 대한 결합능과 그 분해능을 유지한다면, 통상의 기술자가 용이하게 변경하여 사용할 수 있으며, 상기 단편은, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv 또는 diabody, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 실시예에서 본 발명의 면역 글로불린 단편은 scFv이다.

Fv 단편은 항체의 한쪽 팔의 VL 및 VH 도메인이 있고, Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인이 있는 1가 단편이고; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편이 있는 2가 단편이다.

scFv는 연속적인 단백질 사슬을 형성하도록 VH와 VL이 링커로 연결된 것으로 VH 또는 VL만을 사용한 것보다 통상적으로 항원에 대한 결합력이 우수하다고 알려져 있다. 이때 VH와 VL을 결합시키는 링커는 당업계에서 통상적으로 사용이 되는 링커라면 어느 것을 사용해도 무방하다. 일 실시예에 있어서, 링커 펩티드는 Gly, Ser, Ala 또는 Thr을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 링커는 (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n, 및 (GGGS)n (식 중, n은 1 내지 4의 정수임)을 비롯한 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 다른 가요성 링커일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 있어서는 (GGGGS)₃ 링커를 사용한다.

Diabody는 항원 결합 특이성이 동일하거나 상이한 scFv가 이량체를 형성한 항체 단편이고, 동일한 항원에 대한 2가 항원 결합 활성 또는 상이한 항원에 대한 특이적인 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 "변이체" 또는 "변이체 단백질", 또는 "단백질 변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 단백질의 것과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 모체 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형을 갖지만, 단백질 변이체는 통상적인 서열 정렬 프로그램을 사용하여 모체 단백질과 정렬되지 않을 정도로 변형이 많지는 않다. 일반적으로, 본 명세서에 설명된 단백질 변이체(예컨대, scFv 변이체 등)는 통상적으로 사용되는 서열 정렬 프로그램, 예컨대, ClustalW를 사용할 때, 모체 단백질과 적어도 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다.

한편, 본 발명의 아미노산 변형은 아미노산의 부가, 치환 및/또는 결실을 포함하는 의미이다. 본 발명의 항원 결합 단백질은 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모체 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질 내 272번째 아미노산인 글루탐산이 타이로신으로 대체된 경우, E272Y로 표시한다.

본 발명에서 사용되는 "아미노산 부가" 또는 "부가"는 모체 폴리펩티드 서열의 특정 위치에 아미노산 서열이 첨가되는 것을 의미한다. 일 실시예에서, 아미노산 잔기를 부가하거나 결실시키는 변형은 VH 또는 VL의 N 말단 또는 C 말단에서 이루어 질 수 있다. 예를 들어, VL의 C 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 아미노산 잔기가 부가될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "단백질"은 적어도 2개의 공유 결합된 아미노산을 포함하며, 이것은 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, 페길화(PEGylation), 원순열(circular permutation), 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합, 및 펩티드 태그 또는 표지를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL을 포함한다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 단백질의 용해도 및/또는 발현 수율을 증가시키기 위하여 아미노산 잔기를 치환한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함할 수 있다. 상기 아미노산 치환은 상기 항원 결합 단백질의 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, K38R, K67R, L70I, S72R, A79L, L83M 및 T87R로 구성되는 군 및 VL의 아미노산 중 L2I S25A, L29I, S83R, Q85E, E87G 및 L89E로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 K38R, K67R 및 T87R를 포함한다. 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, L70I, S72R, A79L 및 L83M; 및 VL의 아미노산 중 L2I, S25A 및 L29I를 더 포함한다. 본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 아미노산 치환은 S83R, Q85E, E87G 및 L89E를 포함한다.

본 발명에 따른 일 실시예에서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, K38R, K67R, L70I, S72R, A79L, L83M 및 T87R; 및 VL의 아미노산 중 L2I S25A, L29I, S83R, Q85E, E87G 및 L89E를 포함한다.

본 발명의 일 실시예에서, 항원 결합 단백질은 서열번호 4로 표시되는 VH 및 서열번호 5로 표시되는 VL; 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL; 서열번호 10로 표시되는 VH 및 서열번호 11로 표시되는 VL; 또는 서열번호 13로 표시되는 VH 및 서열번호 14로 표시되는 VL을 포함한다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질은 DNA에 대해 결합능 및 가수분해능을 을 보유하고 있으며, 모 항원 결합 단백질에 비하여 용해성 및 발현 효율이 향상되는 특징이 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 scFv를 포함하는 핵산 가수분해용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 핵산 가수분해용 조성물은 사료, 식료품, 건강기능식품, 기호식품, 가공식품, 화장료 및 세정제 등의 제조 시 포함될 수 있는 핵산이나 바이러스를 분해하는 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산은 외래 유래 핵산으로 바이러스 게놈 핵산 또는 바이러스 단백질을 인코딩하는 핵산일 수 있다.

본 발명의 핵산 가수분해용 조성물은 핵산 가수분해 항원 결합 단백질과 함께 항바이러스 효과를 갖는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 상기 핵산 가수분해용 조성물은 사용 형태에 따라서 등장화제, 부형제, 희석제, 증점제, 안정화제, 완충제, 보존제 등의 여러가지 첨가제를 함유할 수 있다. 이들 첨가제의 배합량은 핵산 가수분해용 조성물의 사용 형태에 따라서 적절히 설정할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 사용 방식에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무 발열원물과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 scFv를 포함하는 항바이러스 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 항바이러스 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리적으로 혼화 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항 박테리아 제제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 의미하는 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤 및 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 당, 다가 알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 부가 예로서는, 항체의 유통 기한 또는 효능을 연장 및 증강시키는 습윤제 또는 최소량의 보조 물질 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액이 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 투여 방식과 치료 방법에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무 발열원물과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 scFv를 포함하는 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 특정 형태의 바이러스에 국한되는 것은 아니며, dsDNA계통 바이러스, ssDNA계통 바이러스 또는 RNA계통 바이러스일 수 있다. 구체적으로 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 마마바이러스, 파르보바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스 또는 레트로바이러스 등에 적용될 수 있고, 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 scFv가 항 바이러스 활성을 나타내는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 "치료"는 바이러스 감염에 의한 증상을 개선시키거나 호의적으로 변화시키는 활성을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 "예방"은 질환 또는 장애, 또는 질환/장애에 의해 발생하는 1 이상의 증상의 발병, 재발 또는 전염의 예방을 의미하며, 잠재적 후보자에 대한 예방적 치료(prophylactic treatment)를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 scFv를 포함하는 사료 첨가제를 제공할 수 있다.

본 발명의 사료첨가제는 가축의 종류에 따라 급여되는 일반적인 기초사료들을 포함할 수 있다. 이러한 기초사료들은 가축의 종류에 따라서 그 필요한 성분 및 조성 그리고 적합한 조성 비율이 모두 당업계에 공지되어 있으며, 또한 시판되고 있기 때문에 당업자라면 누구나 매우 용이하게 이를 제조 또는 구입하여 사용할 수 있을 것이다. 구체적으로 기초사료로는 가축의 종류에 따라 적합한 전분함유 물질, 단백질 함유 물질, 지방 함유 물질, 비타민 함유 물질, 무기질 함유 물질, 산화 방지 물질, 항생제 등의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 제공할 수 있다. 본 발명에 있어 상기 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 핵산사슬에 대한 결합능과 분해능이 있는 면역글로불린 또는 그 단편의 핵산 분자를 포함하는 의미이다. 일 실시예에 따라 본 발명의 핵산 분자는 3D8 항체의 변이체 유래 단편을 인코딩하는 핵산 분자일 수 있다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 구성성분을 인코딩하는 핵산은 본 발명의 항원 결합 단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포에 따라 발현 벡터에 혼입될 수 있다.

본 발명은 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공할 수 있다. 상기 발현 벡터는 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "벡터"는 그것이 결합되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 예를 들면, 상기 벡터로서는 플라스미드 즉, 부가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 DNA의 환형 이중 사슬 조각이 있다. 또한, 상기 벡터로서는 바이러스 벡터 즉, 부가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 결찰될 수 있는 벡터가 있다. 상기 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물벡터일 수 있다. 또한, 상기 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입됨에 따라서 이 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 임의의 벡터는 이 벡터에 작동 가능하도록 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "발현 조절 서열"은 암호화 서열이 결찰되어 이 암호화 서열을 발현 및 가공시키는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이다. 발현 조절 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 가공 신호 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호, 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 번역 효율을 증가시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열) 및 단백질의 안정성을 증강시키는 서열을 포함하며 원하는 경우에는, 단백질 분비를 촉진하는 서열도 포함한다. 이와 같은 발현 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라서 상이한데 원핵 생물의 경우, 이러한 발현 조절 서열로서는 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 위치, 그리고 전사 종결 서열을 포함하고 진핵 생물의 경우, 이러한 발현 조절 서열로서는 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 본 발명에 있어서 발현 조절 서열은 최소한 그 존재가 발현 및 가공 과정에 필수적인 모든 성분들을 포함하는 것이며, 그 존재가 유리한 부가 성분 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 는 핵산, 예를 들어, 본 발명의 핵산을 발현시키는데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵 생물, 예를 들어, 대장균일 수 있거나, 또는 진핵 생물, 예를 들어, 단세포 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 기타 진균류), 식물 세포 (예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 숙주 세포의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주 (ATCC CRL 1651) (문헌 [Gluzman et al.,1981, Cell 23:175] 참조), L세포, C127 세포, 3T3 세포 (ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 이의 유도체 예컨대 무혈청 배지에서 성장하는 베지(Veggie) CHO 및 관련 세포주 (문헌 [Rasmussen et al.,1998, Cytotechnology 28:31] 참조) 또는 DHFR 결핍성인 CHO 계통 DX-B11 (문헌 [Urlaub et al., 1980, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20] 참조), HeLa 세포, BHK (ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장세포주 CV1로부터 유래된 CV1/EBNA 세포주 (ATCC CCL 70) (문헌 [McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821] 참조), 인간 배아 신장 세포 예컨대 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상적인 이배수체 세포, 1차 조직의 시험관내 배양물로부터 유래된 세포 계통, 1차 체외이식편, HL-60, U937, HaK 또는 유캇(Jurkat) 세포가 포함된다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드-코딩 핵산으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 배양 세포이고, 그 후 상기 핵산이 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

실험예 1. 3D8 scFv 변이체의 제조

1-1. 3D8 scFv 변이체 제작 근거

3D8 scFv 변이체는 Ewert S1, Honegger A, Pluckthun A. Structure-based improvement of the biophysical properties of immunoglobulin VH domains with a generalizable approach. Biochemistry. 2003 Feb 18;42(6):1517-28.; Nieba L1, Honegger A, Krebber C, Pluckthun A. Disrupting the hydrophobic patches at the antibody variable/constant domain interface: improved in vivo folding and physical characterization of an engineered scFv fragment. Protein Eng. 1997 Apr;10(4):435-44 ; Ewert S1, Huber T, Honegger A, Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. J Mol Biol. 2003 Jan 17;325(3):531-53에 기재된 항체 구조에 근거하여 제작하였다. 더욱 구체적으로, 실시예 1은 야생형 3D8 scFv (서열번호 16)를 기준으로 하여, 단백질 수율을 증가시킬 것으로 예상되는 위치에서 Q5V, P9A, 및 E62D로 아미노산을 치환하였다. 실시예 2 내지 실시예 5는 실시예 1의 변이체에서 하기의 아미노산 치환을 더 수행하였다. 실시예 2는 VH 도메인의 응집을 방지할 것으로 예상되는 위치에서 아미노산 잔기를 치환 (K38R, K67R, 및 T87R)하였다. 실시예 3은 실시예 2의 아미노산 서열에서 scFv 내에서 코어(core)가 잘 형성되도록 하여 용해성을 향상시킬 수 있도록 Val18, Tyr27, Leu70, Ser72, Ala79, Leu83, Leu137, Ser160, 및 Leu164를 각각 소수성 성질의 아미노산 잔기인 Leu, Phe, Ile, Arg, Leu, Met, Ile, Ala, 및 Ile로 치환하였다. 실시예 4는 외부 환경에 노출될 것으로 예상되는 C 말단의 소수성 성질의 아미노산 잔기인 Ser218, Gln220, 및 Glu222를 단백질의 용해성을 증가시키기 위한 친수성 성질의 아미노산 잔기인 Arg, Glu, 및 Gly으로 각각 치환하였다. 실시예 5는 실시예 3 및 실시예 4의 아미노산 치환을 모두 포함하도록 제작하였다. 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 야생형 3D8 scFv를 비교예 1로 사용하였다. 비교예 2는 야생형 3D8 scFv (서열번호 16)를 기준으로 하여 VH 도메인의 응집을 방지할 것으로 예상되는 위치에서 아미노산 잔기를 치환 (K38R, K67R, 및 T87R) 및 외부 환경에 노출될 것으로 예상되는 C 말단의 소수성 성질의 아미노산 잔기인 Ser218, Gln220, 및 Glu222를 단백질의 용해성을 증가시키기 위한 친수성 성질의 아미노산 잔기인 Arg, Glu, 및 Gly으로 각각 치환하였다. 비교예 3은 야생형 3D8 scFv (서열번호 16)를 기준으로 하여 외부 환경에 노출될 것으로 예상되는 C 말단의 소수성 성질의 아미노산 잔기인 Ser218, Gln220, 및 Glu222를 단백질의 용해성을 증가시키기 위한 친수성 성질의 아미노산 잔기인 Arg, Glu, 및 Gly으로 각각 치환하였다.

상기에 따른 3D8 scFv 변이체의 아미노산 서열을 표 1, 이를 발현하는 핵산 서열을 표 2에 나타내었다.

1-2. 3D8 scFv 변이체 단백질 발현 및 정제

링커((GGGGS)₃로 해독됨)에 의해 연결되는 VH 또는 VL이 있는 scFv 변이체 단백질을 발현시키기 위해 Pho A 리더 서열 신호와 C-말단에 단백질 A 태그를 포함하는 PIg20 발현 벡터를 사용하였다. Escherichia coli BL21(DE3) pLysE 세포에서 scFv 변이체 단백질을 발현시키고, IgG-세파로스 컬럼(GE Healthcare 사) 크로마토그래피를 통해 용해된 박테리아 배양 상청액으로부터 정제하였다. 단백질은 분자 컷오프가 10,000 Da인 Vivaspin 20 (Sartorius Stedim Biotech 사) 원심농축기를 사용하여 농축시켰다. 단백질 농도는 각각의 아미노산 서열로부터 계산된 280nm에서의 흡광계수를 사용하여 측정하였다.

실험예 2. Western blot을 통한 단백질 발현 분석

3D8 scFv 변이체는 E.coli 로부터 추출하였다. 세포를 8000 ×g, 4°C에서 15분 동안 원심 분리하였다. 그 상청액을 10분 동안 100℃에서 가열하고 western blotting에 사용하였다. 각 샘플(15 ㎕/lane)의 단백질은 gradient SDS-PAGE로 분리하고 electro-blotting 장치(BIO-RAD)를 사용하여 0.2㎛ PVDF 막(BIO-RAD)으로 여과하였다. PVDF 막은 4℃에서 1시간동안 5% 탈지유를 포함하는 블로킹 용액에서 블로킹되고, 항-His 태그(1:5000) 및 rabbit lgG(1:5000)을 포함하는 1차 항체와 반응하였다. 세척 후에, 블롯을 HRP 접합된 항-mouse lgG(1:5000) 및 HRP 접합된 항-rabbit lgG(1:5000)를 포함하는 적절한 2차 항체과 반응시켰다. 밴드는 ECL 기질(Pierce^TM)로 검출하였다. X-ray 필름 상에서 검출된 밴드는 Image J 소프트웨어를 이용하여 수치화 하였으며, 야생형 3D8 scFv의 신호 강도를 1.0으로 하여 상대 값으로 나타내었다(도 1 및 표 3).

도 1 및 표 3을 살펴보면, 실시예 1 내지 실시예 5는 야생형 3D8 scFv와 비교하여 단백질 발현양이 향상됨을 알 수 있다. 반면, 비교예 2의 경우는 발현양의 차이가 없고, 비교예 3의 경우 약간 감소함을 알 수 있다.

3D8 scFv	상대적 발현양
실시예 1	2.32
실시예 2	1.76
실시예 3	1.98
실시예 4	3.41
실시예 5	2.95
비교예 1(wt)	1
비교예 2	1
비교예 3	0.9

<110> novelgen <120> Antigen binding protein with improved expression efficiency <130> 19P08020 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> Example 1 VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> Example 1 VL <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 3 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Example 1 fl <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> Example 2 VH <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> Example 2 VL <400> 5 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gln Ala Gly Gln His His His His His His 115 120 <210> 6 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Example 2 fl <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> Example 3 VH <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> Example 3 VL <400> 8 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gln Ala Gly Gln His His His His His His 115 120 <210> 9 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Example 3 fl <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ala 145 150 155 160 Ser Gln Ser Ile Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> Example 4 VH <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> Example 4 VL <400> 11 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gln Ala Gly Gln His His His His His His 115 120 <210> 12 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Example 4 fl <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(120) <223> Example 5 VH <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(123) <223> Example 5 VL <400> 14 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gln Ala Gly Gln His His His His His His 115 120 <210> 15 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Example 5 fl <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Asp Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Met Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ala 145 150 155 160 Ser Gln Ser Ile Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 16 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(248) <223> wild type 3D8 scFv(Comparison 1) fl <400> 16 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 17 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Comparison 2 fl <400> 17 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Leu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 18 <211> 258 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(258) <223> Comparison 3 fl <400> 18 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp 165 170 175 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 180 185 190 Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Glu 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gln Ala Gly Gln His His His His 245 250 255 His His <210> 19 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Example 1 <400> 19 gaagttcagc tggttcagag cggtgcagaa ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60 agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agctatgtta tgcattgggt gaaacagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgatgg caccaagtac 180 aacgacaaat tcaaaggtaa agcaaccctg accagcgata aaagcagcag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgac cagtgaagat agcgcagttt attactgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gttatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttct ggcggtggcg gtagcgatct ggttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgag ctgcaaaagc 480 agccagagcc tgtttaatag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgacaattag cagcgttcag 660 gcagaggatc tggcagtgta ttattgtaaa cagagctact atcatatgta tacctttggt 720 agcggcacca aactggaaat caaacaggca ggtcag 756 <210> 20 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Example 2 <400> 20 gaagttcagc tggttcagag cggtgcagaa ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60 agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agctatgtta tgcattgggt tcgtcagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgatgg caccaagtac 180 aacgacaaat tcaaaggtcg tgcaaccctg accagcgata aaagcagcag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgcg tagcgaagat agcgcagtgt attattgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gctatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttct ggcggtggcg gtagcgatct ggttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgag ctgcaaaagc 480 agccagagcc tgtttaatag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgacaattag cagcgttcag 660 gcagaggatc tggccgtcta ttattgtaaa cagagctatt atcatatgta tacctttggc 720 agcggcacca aactggaaat caaacaggca ggtcag 756 <210> 21 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Example 3 <400> 21 gaagttcagc tggttcagag cggtgcagaa ctggttaaac cgggtgcaag cctgaaaatg 60 agctgtaaag caagcggttt tacctttacc agctatgtta tgcattgggt tcgtcagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgatgg caccaagtac 180 aacgacaaat tcaaaggtcg tgcaaccatt acacgtgata aaagcagcag caccctgtat 240 atggaaatga gcagcctgcg tagcgaagat agcgcagtgt attattgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gctatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttct ggcggtggcg gtagcgatat tgttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgtc atgtaaagcc 480 agccagagca tttttaacag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgaccattag cagcgttcag 660 gcagaggatc tggccgtcta ttattgtaaa cagagctatt atcatatgta tacctttggc 720 agcggcacca aactggaaat taaacaggca ggtcag 756 <210> 22 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Example 4 <400> 22 gaagttcagc tggttcagag cggtgcagaa ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60 agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agctatgtta tgcattgggt gaaacagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgatgg caccaagtac 180 aacgacaaat tcaaaggtaa agcaaccctg accagcgata aaagcagcag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgac cagtgaagat agcgcagttt attactgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gttatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttct ggcggtggcg gtagcgatct ggttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgag ctgcaaaagc 480 agccagagcc tgtttaatag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgacaattag ccgtgttgaa 660 gccggtgatg aagcagtgta ttattgtaaa cagagctatt atcatatgta tacctttggc 720 agcggcacca aactggaaat caaacaggca ggtcag 756 <210> 23 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Example 5 <400> 23 gaagttcagc tggttcagag cggtgcagaa ctggttaaac cgggtgcaag cctgaaaatg 60 agctgtaaag caagcggttt tacctttacc agctatgtta tgcattgggt tcgtcagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgatgg caccaagtac 180 aacgacaaat tcaaaggtcg tgcaaccatt acacgtgata aaagcagcag caccctgtat 240 atggaaatga gcagcctgcg tagcgaagat agcgcagtgt attattgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gctatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttct ggcggtggcg gtagcgatat tgttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgtc atgtaaagcc 480 agccagagca tttttaacag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgaccattag ccgtgttgaa 660 gccggtgatg aagcagttta ttactgtaaa cagagctatt atcatatgta tacctttggc 720 agcggcacca aactggaaat taaacaggca ggtcag 756 <210> 24 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(744) <223> Wild type 3D8 scFv(Comparison 1) <400> 24 gaagttcagc tgcagcagag cggtccggaa ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60 agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agctatgtta tgcattgggt gaaacagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgacgg caccaaatac 180 aacgagaaat tcaaaggtaa agcaaccctg accagcgata aaagcagcag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgac cagtgaagat agcgcagttt attactgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gttatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttca ggcggtggcg gtagcgatct ggttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgag ctgcaaaagc 480 agccagagcc tgtttaatag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgacaattag cagcgttcag 660 gcagaggatc tggcagtgta ttattgtaaa cagagctact atcatatgta tacctttggc 720 agcggtacga aactggaaat caaa 744 <210> 25 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Comparison 2 <400> 25 gaagttcagc tgcagcagag cggtccggaa ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60 agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agctatgtta tgcattgggt gcgtcagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgacgg caccaaatac 180 aacgagaaat tcaaaggtcg tgcaaccctg accagcgata aaagcagcag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgcg tagtgaagat agcgcagttt attactgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gttatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttca ggcggtggcg gtagcgatct ggttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgag ctgcaaaagc 480 agccagagcc tgtttaatag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgacaattag ccgtgttgaa 660 gcaggtgatc tggcagtgta ttattgtaaa cagagctact atcatatgta tacctttggc 720 agcggtacga aactggaaat caaacaggca ggtcag 756 <210> 26 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <220> <221> gene <222> (1)..(756) <223> Comparison 3 <400> 26 gaagttcagc tgcagcagag cggtccggaa ctggttaaac cgggtgcaag cgttaaaatg 60 agctgtaaag caagcggtta tacctttacc agctatgtta tgcattgggt gaaacagaaa 120 cctggtcaag gtctggaatg gattggttat atcaatccgt ataatgacgg caccaaatac 180 aacgagaaat tcaaaggtaa agcaaccctg accagcgata aaagcagcag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgac cagtgaagat agcgcagttt attactgtgc acgtggtgca 300 tataaacgtg gttatgcaat ggattattgg ggtcagggca ccagcgttac cgttagcagc 360 ggtggtggtg gtagtggtgg cggtggttca ggcggtggcg gtagcgatct ggttatgagc 420 cagagtccga gcagtctggc agttagtgcc ggtgaaaaag ttaccatgag ctgcaaaagc 480 agccagagcc tgtttaatag tcgtacccgt aaaaactatc tggcatggta tcagcagaaa 540 ccgggacaga gcccgaaact gctgatttat tgggcaagca cccgtgaaag cggtgttccg 600 gatcgtttta ccggtagcgg tagtggcacc gattttaccc tgacaattag cagcgttcag 660 gcagaggatg aagcagtgta ttattgtaaa cagagctact atcatatgta tacctttggc 720 agcggtacga aactggaaat caaacaggca ggtcag 756

Claims

서열번호 1로 표시되는 VH 및 서열번호 2로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, K38R, K67R, L70I, S72R, A79L, L83M 및 T87R로 구성되는 군 및 VL의 아미노산 중 L2I S25A, L29I, S83R, Q85E, E87G 및 L89E로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 더 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 K38R, K67R 및 T87R를 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 3에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, L70I, S72R, A79L 및 L83M; 및
VL의 아미노산 중 L2I, S25A 및 L29I를 더 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VL의 아미노산 중 S83R, Q85E, E87G 및 L89E를 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 상기 아미노산 치환은 VH의 아미노산 중 V18L, Y27F, K38R, K67R, L70I, S72R, A79L, L83M 및 T87R; 및
VL의 아미노산 중 L2I S25A, L29I, S83R, Q85E, E87G 및 L89E를 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 1에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 VH 및 서열번호 5로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 VH 및 서열번호 8로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 VH 및 서열번호 11로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 13으로 표시되는 VH 및 서열번호 14로 표시되는 VL을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 2에 있어서, 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항원 결합 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 scFv인, 항원 결합 단백질.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 핵산 가수분해용 조성물.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 항바이러스 조성물.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는, 사료 첨가제.
청구항 1항 내지 16 중 어느 한 항에 따른 상기 항원 결합 단백질을 인코딩하는, 핵산 분자.
청구항 21항에 따른 상기 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
청구항 22항에 따른 상기 발현 벡터를 포함하는, 숙주 세포.