KR102258231B1 - Polypeptide derived from oenanthe javanica and phamaceutical composition comprising polypeptide thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미나리로부터 유래된 특정 염기서열로 구성되는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 TLR 신호전달 기전에 의해 체내 면역반응에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 면역조절제로서 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특히, 면역반응 중에서도 항바이러스 활성을 나타내는 유전자의 발현을 촉진하여 항바이러스제로도 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a polypeptide consisting of a specific nucleotide sequence derived from parsley and a pharmaceutical composition comprising the polypeptide. Specifically, the polypeptide according to the present invention can be usefully used as an immunomodulatory agent by increasing the expression of various genes involved in the immune response in the body by a TLR signaling mechanism, and in particular, exhibits antiviral activity in the immune response. By promoting gene expression, it can be usefully used as an antiviral agent.
Description
본 발명은 미나리로부터 유래된 특정 염기서열로 구성되는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a polypeptide consisting of a specific nucleotide sequence derived from parsley and a pharmaceutical composition comprising the polypeptide.
면역이란 인체 내 자기(self)와 비자기(non-self)를 구별하여 인체 내에서 자연적으로 발생하거나 외부에서 들어온 유해물질을 인지한 후 제거함으로써, 신체의 항상성을 유지시키는 반응을 의미한다. 면역반응은 외부로부터 인체로 침입한 바이러스, 박테리아 및 기생충과 같은 유해균에 저항하고, 내부에 생긴 암세포에 저항하거나 이들을 제거하는데 중요하다.Immunity refers to a reaction that maintains the homeostasis of the body by discriminating between self and non-self in the human body and by recognizing and removing harmful substances that occur naturally in the human body or from outside. The immune response is important in resisting harmful bacteria such as viruses, bacteria, and parasites that have invaded the human body from the outside, and in resisting or removing cancer cells generated inside.
그러나, 면역계의 일부 구성요소에 결함이 발생하면 유해물질에 의해서도 면역반응이 일어나지 않는데, 이러한 면역 결핍은 선천성 면역결핍 및 후천선 면역결핍으로 나뉜다. 선천성 면역결핍은 B 세포 및 T 세포 등 면역세포가 원래부터 존재하지 않는 질병으로 유전자 치료, 항체주입 또는 골수이식 등의 치료방법만으로 치료가 가능하다. 한편, 후천성 면역결핍은 면역 구성요소 자체는 존재하나 이들에 의해 나타나는 면역반응 과정에 이상이 생긴 것으로, 이들 구성요소의 기능을 증진시킴으로써 질환의 상태를 개선할 수 있다.However, when a defect occurs in some components of the immune system, the immune response does not occur even by harmful substances, and this immunodeficiency is divided into congenital immunodeficiency and acquired immunodeficiency. Congenital immunodeficiency is a disease in which immune cells such as B cells and T cells do not exist from the original, and can be treated only with treatment methods such as gene therapy, antibody injection or bone marrow transplantation. On the other hand, acquired immunodeficiency is that the immune component itself exists, but an abnormality occurs in the immune response process exhibited by them, and the state of the disease can be improved by enhancing the function of these components.
한편, 면역기능이 비정상적으로 증진되는 경우에는 면역억제제를 사용하여 치료하고 있다. 그러나, 면역억제제는 신체의 면역력을 떨어뜨려 다른 부작용을 야기하는 경우가 많다는 문제가 있다.On the other hand, if the immune function is abnormally enhanced, it is treated with an immunosuppressant. However, there is a problem that immunosuppressants often cause other side effects by lowering the body's immunity.
최근 이와 같이 면역기능의 이상으로 발생하는 면역질환이 증가하고 있으며, 따라서 면역기능을 증진 또는 억제할 수 있는 면역조절 물질의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 이러한 면역조절 물질은 면역세포들을 자극하여 체내의 면역기능을 증진 또는 억제시키는데, 이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2006-0047447호에는 특정 화학식으로 표시되는 모노아세틸디아실글리세롤 화합물이 각종 면역체계의 기능 저하에 의해 발생하는 질환이나, 암, 관절염, 아토피, 치매 등과 같은 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있음을 개시하고 있다.In recent years, immune diseases caused by abnormal immune function are increasing, and therefore, development of immunomodulatory substances capable of enhancing or suppressing immune function has been actively made. These immunomodulatory substances stimulate immune cells to enhance or inhibit immune functions in the body. In this regard, Korean Patent Laid-Open No. 10-2006-0047447 discloses monoacetyldiacylglycerol compounds represented by a specific formula for various immune systems. Disclosed is that it can be used for the treatment of diseases caused by deterioration of the function of, or various diseases such as cancer, arthritis, atopy, and dementia.
본 발명의 목적은 특정 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a polypeptide composed of a specific amino acid sequence, an expression vector expressing the polypeptide, and a host cell transfected with the expression vector.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 폴리펩티드의 면역조절 또는 항바이러스용 용도를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an immunomodulatory or antiviral use of the polypeptide of the present invention.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.In addition, the present invention provides a host cell transfected with the expression vector.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공한다.In addition, the present invention provides an immunomodulatory agent comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding the polypeptide as an active ingredient.
나아가, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항바이러스제를 제공한다.Furthermore, the present invention provides an antiviral agent comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding the polypeptide as an active ingredient.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 TLR 신호전달 기전에 의해 체내 면역반응에 관여하는 다양한 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 면역조절제로서 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 특히, 면역반응 중에서도 항바이러스 활성을 나타내는 유전자의 발현을 촉진하여 항바이러스제로도 유용하게 사용될 수 있다.The polypeptide according to the present invention can be usefully used as an immunomodulatory agent by increasing the expression of various genes involved in the immune response in the body by a TLR signaling mechanism, and in particular, expression of genes that exhibit antiviral activity during the immune response. It can be usefully used as an antiviral agent by promoting it.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서, 미나리 유래 폴리펩티드가 대장균에서 발현되는 것을 확인한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서, 미나리 유래 폴리펩티드가 동물세포에서 발현 되는 것을 웨스턴 블랏(A) 및 공초점 현미경(B)으로 확인한 결과 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서, LPS에 의해 미나리 유래 폴리펩티드의 발현이 증가하고(A), 산화질소의 생성이 증가함(B)을 확인하고, 미나리 유래 펩티드에 의해서 TLR4 유전자의 발현이 증가하고(C), 상기 유전자 발현이 TLR4 억제제(TAK-242)에 의해 억제되는 것(D)을 확인한 결과 도면이다.
도 4는 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 TLR4 신호전달 기전을 COX2(A), IL-6(B) 및 TNFα(C) 유전자의 발현 변화를 통해 확인하고, TLR4 유전자의 발현 증가가 TLR4 억제제(TAK-242) 또는 MAPK 억제제(PD98059)에 의해 억제되는 것(D)을 확인한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서, 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4 억제제(TAK-242)에 의해 억제되는 것을 면역화학법으로 확인한 결과 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서, 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 TLR4 신호전달 기전에 관련된 CD80(A) 및 MIP2(B) 유전자의 발현 변화, 세포내 IκBα나 Akt 단백질의 인산화 증가(C), 및 NF-κB 단백질의 발현 변화(D)를 확인한 결과 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서, 미나리 유래 폴리펩티드에 의해 CD4+ T 세포에서 IFN-γ(A), IFN-α(B), Mx1(C), OAS(D), TLR2(E) 및 TLR4(F) 유전자의 발현 변화를 확인한 결과 그래프이다.1 is a diagram showing the results of confirming that a parsley-derived polypeptide is expressed in E. coli in an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing the results of confirming expression of a parsley-derived polypeptide in animal cells in an embodiment of the present invention with a Western blot (A) and a confocal microscope (B).
3 shows that in an embodiment of the present invention, expression of a parsley-derived polypeptide is increased by LPS (A), and production of nitric oxide is increased (B), and the expression of TLR4 gene by a parsley-derived peptide is It is a diagram as a result of confirming that the gene expression is increased (C) and that the gene expression is suppressed by the TLR4 inhibitor (TAK-242) (D).
Figure 4 shows the TLR4 signaling mechanism by the parsley-derived polypeptide through changes in the expression of the COX2 (A), IL-6 (B) and TNFα (C) genes, and the increase in the expression of the TLR4 gene is a TLR4 inhibitor (TAK-242). ) Or MAPK inhibitor (PD98059).
5 is a diagram showing the results of confirming that the polypeptide derived from parsley is inhibited by the TLR4 inhibitor (TAK-242) in an embodiment of the present invention by immunochemical method.
6 is a change in the expression of CD80 (A) and MIP2 (B) genes involved in the TLR4 signaling mechanism by a parsley-derived polypeptide in an embodiment of the present invention, increased phosphorylation of intracellular IκBα or Akt protein (C), and It is a figure of the result of confirming the expression change (D) of the NF-κB protein.
7 is In one embodiment of the invention, IFN-γ (A) in the CD4 + T cells by a parsley-derived polypeptide, IFN-α (B), Mx1 (C), OAS (D), TLR2 (E) and This is a graph of the result of confirming the change in the expression of the TLR4(F) gene.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 제공한다.The present invention provides a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
상기 폴리펩티드는 미나리로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로, 약 16 kDa 크기를 가질 수 있다.The polypeptide may be derived from buttercup. The polypeptide is a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, and may have a size of about 16 kDa.
상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 갖는 아미노산의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 상기 폴리펩티드는 경우에 따라서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.The polypeptide may include variants or fragments of amino acids having different sequences by deletion, insertion, substitution, or a combination of amino acid residues within a range that does not affect the function of the protein. Amino acid exchanges in proteins or peptides that do not totally alter the activity of the molecule are known in the art. In some cases, the polypeptide may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like.
즉, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상기 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리펩티드도 포함될 수 있다.That is, the polypeptide according to the present invention may also include a polypeptide having 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% or more homology with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 범위 내에서, 하나 이상의 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해 상이한 서열을 갖는 변이체일 수 있다. 구체적으로, 상기 뉴클레오티드는 서열번호 1로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드도 모두 포함할 수 있다.In addition, the present invention may include all polynucleotides encoding the polypeptide. The polynucleotide may be a variant having a different sequence by deletion, insertion, substitution, or a combination of one or more bases within a range encoding a protein having an activity equivalent to that of the polypeptide of the present invention. Specifically, the nucleotide may be a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, and all polynucleotides having at least 80%, 85%, 90%, 95%, or 98% homology with the polynucleotide are also included. can do.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.In addition, the present invention provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide and a host cell transfected with the expression vector.
상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드라면 모두 포함할 수 있고, 구체적으로 서열번호 1로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.The polynucleotide may have the characteristics as described above. For example, the polynucleotide may include any polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, and specifically may be a polynucleotide composed of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
상기 발현벡터는 세포 내로 전달하는 DNA 단편, 핵산 분자를 의미하며, 발현벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 단백질을 독립적으로 재생산할 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터는 특정 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함할 수 있다.The expression vector refers to a DNA fragment or nucleic acid molecule that is transferred into a cell, and the expression vector refers to a DNA that can be replicated and that a protein can be independently reproduced in a host cell. In particular, the recombinant vector into which the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention is inserted is a vector capable of expressing a protein of interest or RNA of interest in a specific host cell, and may contain essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. have.
상기 발현벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열을 포함할 수 있고, 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선별하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제원점도 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 발현벡터는 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. The expression vector may include an expression control sequence such as a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal and an enhancer, and a signal sequence or leader for membrane targeting or secretion Sequence. In addition, the expression vector may include a selection marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, the origin of replication may also be included. The expression vector according to the present invention can be prepared in various ways according to the purpose.
상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 포스미드(fosmid) 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다.The expression vector may be a plasmid vector, a cosmid vector, a fosmid vector, a bacteriophage vector, or a viral vector.
또한, 상기 숙주세포는 본 발명의 발현벡터에 의해 유전적으로 변형된 숙주세포일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현벡터는 숙주세포 내에서 게놈 외부의 독립적 분자로서 개체 내에 존재할 수 있거나, 숙주세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다.In addition, the host cell may be a host cell genetically modified by the expression vector of the present invention. In addition, the polynucleotide or expression vector may exist in the individual as an independent molecule outside the genome within the host cell, or may be stably inserted into the genome of the host cell.
상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고, 필요에 따라서 통상의 기술자에 의해 적절히 선택되어 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 진핵세포는 동물세포일 수 있고, 일례로, 상기 동물세포는 불사의 하이브리도마 세포(immortal hybridoma cell), NS/O 골수종 세포, 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, 인간 양수 유래의 CapT 세포, COS 세포 등을 포함할 수 있다.The host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and may be appropriately selected and used by a person skilled in the art as needed. Specifically, the eukaryotic cells may be animal cells, for example, the animal cells are immortal hybridoma cells (immortal hybridoma cells), NS/O myeloma cells, 293 cells, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), HeLa cells, CapT cells derived from human amniotic fluid, COS cells, and the like may be included.
본 발명의 발현벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법은 통상의 기술분야에 알려진 모든 방법을 포함할 수 있으며, 구체적으로, CaCl2 방법, 전기천공법, 미세주입법 등을 포함할 수 있다.The method of introducing the expression vector of the present invention into a host cell may include all methods known in the art, and specifically, may include a CaCl 2 method, an electroporation method, a microinjection method, and the like.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 면역조절제를 제공한다.In addition, the present invention provides an immunomodulatory agent comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding the polypeptide as an active ingredient.
본 발명에 따른 면역조절제에 유효성분으로 포함되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.The polypeptide or polynucleotide included as an active ingredient in the immunomodulatory agent according to the present invention may have the above-described characteristics.
본 발명에 따른 면역조절제은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 면역조절제는 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.The immunomodulatory agent according to the present invention may contain 10 to 95% by weight of a polypeptide composed of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding the polypeptide, which is an active ingredient with respect to the total weight of the composition. In addition, the immunomodulatory agent of the present invention may further include one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the active ingredients.
본 발명의 면역조절제는 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.The immunomodulatory agent of the present invention may include carriers, diluents, excipients or mixtures thereof commonly used in biological preparations. Any pharmaceutically acceptable carrier may be used as long as it is suitable for delivering the composition in vivo. Specifically, the carrier is Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc., saline, sterile water, Ringer's solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, or a mixture thereof. In addition, conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents may be added as needed.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.When formulating the composition, diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants may be added.
본 발명의 면역조절제는 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.The immunomodulatory agent of the present invention may be formulated as an oral or parenteral formulation. Oral formulations may include solid formulations and liquid formulations. The solid preparation may be a tablet, a pill, a powder, a granule, a capsule or a troche, and the solid preparation may be prepared by adding at least one excipient to the composition. The excipient may be starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, or a mixture thereof. In addition, the solid preparation may contain a lubricant, and examples thereof include magnesium stearate and talc. On the other hand, the liquid formulation may be a suspension, an inner solution, an emulsion or a syrup. At this time, the liquid formulation may contain excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.The parenteral preparation may include injections, suppositories, powders for respiratory inhalation, aerosols for sprays, powders and creams. The injection may include a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension solvent, an emulsion, and the like. At this time, as the non-aqueous solvent or suspension solvent, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol, and olive oil, or injectable esters such as ethyl oleate may be used.
본 발명의 면역조절제는 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.The immunomodulatory agent of the present invention may be administered orally or parenterally according to a desired method. Parenteral administration may include intraperitoneal, rectal, subcutaneous, intravenous, intramuscular or intrathoracic injection.
상기 면역조절제는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 또는 수회일 수 있다.The immunomodulatory agent may be administered in a pharmaceutically effective amount. This may vary depending on the type of disease, the severity, the activity of the drug, the patient's sensitivity to the drug, the administration time, the administration route, the treatment period, and the drugs used at the same time. However, for a desirable effect, the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition according to the present invention may be 0.0001 to 1,000 mg/kg, specifically 0.001 to 500 mg/kg. The administration may be once or several times a day.
본 발명의 면역조절제는 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.The immunomodulatory agent of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents. When administered in combination, administration may be sequential or simultaneous.
나아가, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 항바이러스제를 제공한다.Furthermore, the present invention provides an antiviral agent comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding the polypeptide as an active ingredient.
본 발명에 따른 항바이러스제에 유효성분으로 포함되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 또한, 상기 항바이러스제는 상술한 바와 같은 면역조절제와 동일한 특징을 가질 수 있다.The polypeptide or polynucleotide included as an active ingredient in the antiviral agent according to the present invention may have the above-described characteristics. In addition, the antiviral agent may have the same characteristics as the immunomodulatory agent as described above.
상기 항바이러스제는 바이러스의 감염에 대해 가장 빠르게 대응하는 선천선 면역반응을 촉진함으로써 항바이러스 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 항바이러스제는 통상의 기술분야에서 인체에 감염되어 질병을 유발하는 모든 바이러스를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스는 단일가닥 DNA 바이러스, 이중가닥 DNA 바이러스, 단일가닥 RNA 바이러스 또는 이중가닥 RNA 바이러스 등을 모두 포함할 수 있다. 일례로, 상기 바이러스는 EBV(Epstein-Barr virus), HAV(hepatitis A virus), HBV(hepatitis B virus), HCV(hepatitis C virus), HDV(hepatitis D virus), HEV(hepatitis E virus), 한탄바이러스(Hantaan virus), CMV(cytomegalovirus), HIV(human immunodeficiency virus), 독감 바이러스(influenza virus), HPV(human papilloma virus), 소아마비 바이러스(poliovirus), 에볼라 바이러스(ebola virus), 로타바이러스(rotavirus), 댕기열바이러스(dengue virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열바이러스(yellow fever virus), 아데노바이러스(adenovirus), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), BK 바이러스(BK virus), 천연두 바이러스(smallpox virus), 지카 바이러스(Zika virus), 중증열성혈소판감소증후근 바이러스(SFTS virus), 조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus), 레트로바이러스(retrovirus) 또는 HSV(herpes simplex virus)일 수 있다.The antiviral agent may exhibit antiviral activity by promoting an innate gland immune response that responds most quickly to viral infection. Therefore, the antiviral agent of the present invention can be used to treat all viruses that infect the human body and cause disease in the art. Specifically, the virus may include all of a single-stranded DNA virus, a double-stranded DNA virus, a single-stranded RNA virus, or a double-stranded RNA virus. For example, the virus is EBV (Epstein-Barr virus), HAV (hepatitis A virus), HBV (hepatitis B virus), HCV (hepatitis C virus), HDV (hepatitis D virus), HEV (hepatitis E virus), lamentation Viruses (Hantaan virus), CMV (cytomegalovirus), HIV (human immunodeficiency virus), flu virus (influenza virus), HPV (human papilloma virus), poliovirus (poliovirus), ebola virus (ebola virus), rotavirus (rotavirus) , Dengue virus, West Nile virus, yellow fever virus, adenovirus, Japanese encephalitis virus, BK virus, smallpox virus smallpox virus), Zika virus, severe febrile thrombocytopenia syndrome virus (SFTS virus), avian influenza virus, retrovirus (retrovirus), or HSV (herpes simplex virus).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples, provided that the following examples are for illustrative purposes only, and the present invention is not limited thereto. Anything that has substantially the same configuration as the technical idea described in the claims of the present invention and achieves the same operation and effects is included in the technical scope of the present invention.
실시예 1. 미나리 유래 폴리펩티드를 발현하는 발현벡터의 제작Example 1. Construction of an expression vector expressing a parsley-derived polypeptide
미나리 유래 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 동정하고, 동정된 염기서열을 발현하는 발현벡터를 다음과 같이 제작하였다.A base sequence encoding a parsley-derived polypeptide was identified, and an expression vector expressing the identified base sequence was constructed as follows.
1-1. 미나리의 cDNA 라이브러리 준비1-1. Buttercup cDNA library preparation
세척한 미나리의 잎(경기도, 한국)을 TissueLyser II(Qiagen, 미국) 기기를 이용하여 균질화하였다. 균질화된 미나리 잎으로부터 easy-spin™ Plant RNA 추출 키트(iNtRON, 한국)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 UV/Vis 분광광도계(MECASYS, 한국)를 이용하여 정량하였다. 정량한 RNA를 0.4 ㎍의 RNA 올리고뉴클레오티드 링커(서열번호 3: 5'-AGC AUC GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG-3') 및 T4 라이게이즈(ligase, New England Biolabs, 미국)를 이용하여 결찰시켰다. 올리고-캡핑(oligo-capping) 반응이 완료된 뒤, 올리고-캡핑된 mRNA를 Oligotex 미니 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 분리하고, 분리된 mRNA로부터 임프롬(Improm)-역전사 시스템(Promega, 미국)을 이용하여 20 ㎕의 총 부피로 첫번째-가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 이어서, 증폭된 PCR 산물을 SfiI 절단효소로 처리하고, 1.3 kb 이상의 길이를 갖는 cDNA를 DraIII 절단효소로 처리된 pCNS-D2 벡터와 결찰시켰다. 결찰된 cDNA를 통상적인 전기천공 방법으로 E.coli Top 10F'(Invitrogen, 미국) 균주로 형질전환하고, 제작된 cDNA 라이브러리를 공지된 방법으로 표준화하였다.Washed parsley leaves (Gyeonggi-do, Korea) were homogenized using a TissueLyser II (Qiagen, USA) device. Total RNA was extracted from the homogenized parsley leaves according to the manufacturer's protocol using the easy-spin™ Plant RNA extraction kit (iNtRON, Korea), and the extracted RNA was quantified using a UV/Vis spectrophotometer (MECASYS, Korea). I did. RNA was quantified using 0.4 μg of RNA oligonucleotide linker (SEQ ID NO: 3: 5'-AGC AUC GAG UCG GCC UUG UUG GCC UAC UGG-3') and T4 ligase (ligase, New England Biolabs, USA). Ligated. After completion of the oligo-capping reaction, the oligo-capped mRNA was isolated using an Oligotex mini kit (Qiagen, USA), and from the isolated mRNA, an Improm-reverse transcription system (Promega, USA) First-stranded cDNA synthesis was performed with a total volume of 20 μl. Subsequently, the amplified PCR product was treated with SfiI cleavage enzyme, and cDNA having a length of 1.3 kb or more was ligated with the pCNS-D2 vector treated with DraIII cleavage enzyme. The ligated cDNA was transformed into an E. coli Top 10F' (Invitrogen, USA) strain by a conventional electroporation method, and the prepared cDNA library was standardized by a known method.
1-2. 미나리 유래의 폴리펩티드 선별1-2. Selection of polypeptides derived from buttercups
상기에서 제작된 미나리의 cDNA 라이브러리를 주형으로 콜로니 PCR(colony polymerase chain reaction)을 랜덤 수행하고, 수득된 PCR 산물을 통상적인 방법으로 pGEM® T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다. PCR 산물이 클로닝된 벡터의 서열을 ABI DNA 서열분석기(Applied Biosystems, 미국)로 분석하였다.Colony PCR (colony polymerase chain reaction) was randomly performed using the cDNA library of parsley produced above as a template, and the obtained PCR product was cloned into a pGEM ® T vector (Promega, USA) by a conventional method. The sequence of the vector in which the PCR product was cloned was analyzed with an ABI DNA sequencer (Applied Biosystems, USA).
그 결과, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드가 확인되었다.As a result, a polynucleotide composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was identified.
실시예 2. 대장균에서 폴리펩티드의 발현 확인Example 2. Confirmation of expression of polypeptide in E. coli
실시예 1에서 확인된 미나리 유래의 폴리펩티드가 대장균에서 발현되는지 여부를 다음과 같이 확인하였다.Whether or not the polypeptide derived from parsley identified in Example 1 was expressed in E. coli was confirmed as follows.
먼저, 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머(서열번호 4: 5'-CCATGGGTGTTCAGAGCCAT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 5: 5'-CCTCATTGCCAACTACCTCGAG-3')를 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물을 NcoI 및 XhoI 절단효소를 이용하여 pET32a 발현벡터에 클로닝함으로써, 재조합 pET32a-OJPR 플라스미드를 제조하였다. 제조된 pET32a-OJPR 플라스미드를 BL21 균주에 전기천공 방법으로 형질전환하고, 100 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB(Luria-Bertani) 고체배지에서 배양함으로써, 원하는 콜로니를 선별하였다. pET32a-OJPR 플라스미드가 형질전환된 BL21 균주의 콜로니를 암피실린이 포함된 LB 액체배지에 접종하고, 37℃ 및 200 rpm 조건하에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 세포를 모아 OD600에서 1.0이 되도록 LB 액체배지에 현탁하고, IPTG(isopropyl-f-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 뒤, 24시간 동안 더 배양하였다. 배양이 끝난 뒤, 세포를 모아서 용해시키고, 10% SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동하였다. 0.01% 코마시 블루(Coomassie-blue) 염색 방법을 이용하여 폴리펩티드의 발현을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 폴리펩티드에 표지된 6×His을 전기영동 또는 웨스턴 블럿으로 확인하였다.First, the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was amplified using a forward primer (SEQ ID NO: 4: 5'-CCATGGGTGTTCAGAGCCAT-3') and a reverse primer (SEQ ID NO: 5: 5'-CCTCATTGCCAACTACCTCGAG-3'). The amplified PCR product was cloned into a pET32a expression vector using NcoI and XhoI cleavage enzymes, thereby preparing a recombinant pET32a-OJPR plasmid. The prepared pET32a-OJPR plasmid was transformed into BL21 strain by electroporation, and cultured in LB (Luria-Bertani) solid medium containing 100 μg/ml of ampicillin to select desired colonies. The colonies of the BL21 strain transformed with the pET32a-OJPR plasmid were inoculated into LB liquid medium containing ampicillin, and cultured overnight at 37° C. and 200 rpm. The cultured cells were collected and suspended in an LB liquid medium at an OD 600 of 1.0, and IPTG (isopropyl-fD-thiogalactopyranoside) was added, followed by further incubation for 24 hours. After the culture was completed, the cells were collected and lysed, and electrophoresis was performed using 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel. The result of confirming the expression of the polypeptide using the 0.01% Coomassie-blue staining method is shown in FIG. 1. At this time, 6×His labeled on the polypeptide as a control was confirmed by electrophoresis or Western blot.
도 1에 나타난 바와 같이, 약 16 kDa 정도의 크기를 갖는 미나리 유래의 폴리펩티드가 대장균에서 발현되었다.As shown in FIG. 1, a polypeptide derived from parsley having a size of about 16 kDa was expressed in E. coli.
실시예 3. 동물 세포에서 폴리펩티드의 발현 확인Example 3. Confirmation of Expression of Polypeptide in Animal Cells
실시예 1에서 확인된 미나리 유래의 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 어떠한 생물학적 특성을 나타내는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.The following experiment was performed to confirm what kind of biological properties the parsley-derived polypeptide identified in Example 1 exhibits in mammalian cells.
3-1. 포유동물 세포로의 형질감염3-1. Transfection into mammalian cells
실시예 2에서 제조된 pET32a-OJPR 플라스미드와 포유동물 발현벡터인 pcDNA3.1(+) 벡터를 각각 EcoRI 및 XhoI으로 처리하여 결찰시켜, pcDNA3.1(+).OJPR 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터를 E.coli(DH5α) 균주에 형질전환하고, 형질전환된 균주를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 포함된 LB 배지에 배양하여 선별하였다. 선별된 콜로니는 암피실린이 포함된 LB 액체배지에 접종하여 37℃ 및 200 rpm 조건하에서 하룻밤 동안 배양하고, 미나리 유래 폴리펩티드의 클로닝은 서열분석을 통해 확인하였다. 한편, RAW264.7 세포주는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하여 준비하였다. 준비된 RAW264.7 세포주를 6웰 플레이트에 약 4×105 cells/㎖이 되도록 분주하고, 하룻 밤 동안 더 배양하였다. 배양된 세포의 융합성(confluent)이 80% 정도되었을 때, 배양배지를 무혈청의 DMEM 배지로 교체하고, 상기 pcDNA3.1(+).OJPR 벡터를 PolyFect® 형질감염 리에이전트 키트(Qiagen, 미국)를 이용하여 RAW264.7 세포주에 형질감염시켰다. 형질감염된 RAW264.7 세포주는 500 ㎍/㎖의 G418(Promega, 미국)이 포함된 DMEM 배양배지에서 배양하면서 pcDNA3.1(+).OJPR 벡터가 형질감염된 세포를 선별하였다. 선별된 세포주는 PCR을 사용하여 클로닝 여부를 확인하였다.The pET32a-OJPR plasmid prepared in Example 2 and the pcDNA3.1(+) vector, which is a mammalian expression vector, were treated with EcoRI and XhoI and ligated, respectively, to prepare a pcDNA3.1(+).OJPR vector. The prepared vector was transformed into an E. coli (DH5α) strain, and the transformed strain was cultured in LB medium containing 100 μg/ml of ampicillin and selected. The selected colonies were inoculated into LB liquid medium containing ampicillin and cultured overnight under conditions of 37° C. and 200 rpm, and cloning of parsley-derived polypeptide was confirmed through sequencing. On the other hand, RAW264.7 cell line using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) containing 10% FBS (fetal bovine serum), 100 U / ㎖ penicillin, and 100 ㎍ / ㎖ streptomycin at 37 ℃ and 5% CO 2 conditions Prepared by culturing under. The prepared RAW264.7 cell line was dispensed into a 6-well plate at about 4×10 5 cells/ml, and further cultured overnight. When the confluent of the cultured cells was about 80%, the culture medium was replaced with a serum-free DMEM medium, and the pcDNA3.1(+).OJPR vector was replaced with a PolyFect® transfection reagent kit (Qiagen, USA). ) Was used to transfect the RAW264.7 cell line. The transfected RAW264.7 cell line was cultured in a DMEM culture medium containing 500 μg/ml of G418 (Promega, USA), and cells transfected with pcDNA3.1(+).OJPR vector were selected. The selected cell line was confirmed to be cloned using PCR.
3-2. 미나리 유래의 폴리펩티드의 항체 제조3-2. Antibody production of a parsley-derived polypeptide
먼저, 실시예 3-1에서 제조한 pcDNA3.1(+).OJPR 벡터를 이용하여 통상적인 방법으로 미나리 유래의 폴리펩티드를 정제하였다. 정제된 폴리펩티드를 토끼에 주입하여 통상적인 방법으로 미나리 유래의 폴리펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 제조하였다. 높은 역가의 항체를 제조하기 위해, 미나리 유래의 폴리펩티드를 3회에 걸쳐 10주 이상 주입하였고, 전체 30 ㎖의 미나리 유래 폴리펩티드에 특이적인 면역혈청(antiserum)을 수득하였다.First, using the pcDNA3.1(+).OJPR vector prepared in Example 3-1, a polypeptide derived from parsley was purified by a conventional method. The purified polypeptide was injected into rabbits to prepare a polyclonal antibody against a parsley-derived polypeptide by a conventional method. In order to prepare an antibody having a high titer, the Buttercup-derived polypeptide was injected 3 times for 10 weeks or more, and an antiserum specific for the Buttercup-derived polypeptide was obtained in total of 30 ml.
3-3. 미나리 유래 폴리펩티드의 발현 확인3-3. Confirmation of expression of parsley-derived polypeptide
실시예 3-1에서 pcDNA3.1(+).OJPR 벡터가 형질감염된 RAW264.7 세포주를 단백질분해효소(protease) 및 인산가수분해효소(phosphatase) 억제제가 첨가된 1% RIPC 완충액으로 용해시켰다. 전체 세포 용해물을 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고, 이를 PVDF(polyvinylidene difluoride)(BD Bioscience, 미국) 막으로 옮겼다. PVDF 막을 5% 탈지유(skim milk)가 포함된 TBS-T(tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 완충액에 넣어 전처리한 뒤, 상기 막을 실시예 2-2에서 제작한 미나리 유래 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 β-액틴에 대한 1차 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)에 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, 2차 항체를 첨가하여 반응시키고, ECL(enhanced chemiluminescence, Cell Signaling Technology, 미국) 용액을 이용하여 미나리 유래 폴리펩티드의 발현을 확인하였다. 이때, 대조군으로서 벡터가 형질감염되지 않은 세포를 사용하였다.The RAW264.7 cell line transfected with pcDNA3.1(+).OJPR vector in Example 3-1 was lysed in 1% RIPC buffer to which a protease and a phosphatase inhibitor were added. The whole cell lysate was electrophoresed on a 10% SDS-PAGE gel, and it was transferred to a PVDF (polyvinylidene difluoride) (BD Bioscience, USA) membrane. After pre-treatment by putting the PVDF membrane in a TBS-T (tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) buffer containing 5% skim milk, the membrane was prepared in Example 2-2. It was reacted with an antibody or a primary antibody against β-actin (Santa Cruz Biotechnology, USA). After the reaction was completed, a secondary antibody was added to react, and expression of a parsley-derived polypeptide was confirmed using an ECL (enhanced chemiluminescence, Cell Signaling Technology, USA) solution. At this time, cells not transfected with the vector were used as a control.
그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드가 RAW264.7 세포주에서 발현되는 것을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 2A, it was confirmed that the parsley-derived polypeptide was expressed in the RAW264.7 cell line.
3-4. 미나리 유래 폴리펩티드의 발현 위치 확인3-4. Confirmation of expression position of parsley-derived polypeptide
본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드가 세포 내에서 발현되는 위치를 공초점 현미경으로 확인하였다.The position at which the parsley-derived polypeptide of the present invention is expressed in cells was confirmed with a confocal microscope.
먼저, 실시예 3-1에서 pcDNA3.1(+).OJPR 벡터가 형질감염된 RAW264.7 세포주를 4-웰 챔버 슬라이드(4-well chamber slide)에 분주하고, 1 ㎍/㎖의 LPS가 존재 또는 부존재하에서 5 ㎍/㎖의 정제된 미나리 유래 폴리펩티드를 처리하였다. 상기 세포주를 4% 파라포름알데하이드가 포함된 0.1 M PBS(phosphate buffer saline)에 15분 동안 두어 고정시키고, 0.25% 트리톤 X-100(Sigma-Aldrich)가 포함된 PBS에 넣어 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포주를 0.1% BSA(bovine serum albumin)로 상온에서 30분 동안 전처리하고, 실시예 2-2에서 제조된 미나리 유래 폴리펩티드 특이적인 항체를 1% BSA가 포함된 PBS 완충액에 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하고, 알렉사 플루오르 488(Alexa fluor 488이 결합된 2차 항-토끼 IgG(H+L), F(ab')2 단편(fragment)(Cell Signaling, 미국)을 1% BSA에 희석하여 첨가하여 1시간 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 세포를 세척하고, PI(propidium iodide, Assay Designs, 미국)를 10분 동안 처리하여 대비염색을 하였다. 염색된 세포는 공초점 레이저 현미경(Olympus FV300, 일본)으로 관찰하였고, 이때, 488 ㎚ 파장의 라르곤이온 레이저 및 543 ㎚ 파장의 HeNe 레이저가 각각 알렉사 플루오르나 PI 염색을 확인하기 위해 사용되었다. 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 도 2B에 나타내었다.First, the RAW264.7 cell line transfected with pcDNA3.1(+).OJPR vector in Example 3-1 was dispensed into a 4-well chamber slide, and 1 μg/ml of LPS was present or 5 μg/ml of purified water parsley derived polypeptide was treated in the absence of it. The cell line was fixed by placing it in 0.1 M phosphate buffer saline (PBS) containing 4% paraformaldehyde for 15 minutes, and then placed in PBS containing 0.25% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) and reacted at room temperature for 10 minutes. Made it. The cell line after the reaction was pretreated with 0.1% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes at room temperature, and the polypeptide-specific antibody derived from buttercups prepared in Example 2-2 was diluted in PBS buffer containing 1% BSA, and at room temperature. It was reacted for 2 hours. After the reaction, the cells were washed 3 times with PBS buffer, and Alexa fluor 488 conjugated secondary anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 fragment (Cell Signaling, USA) ) Was diluted in 1% BSA and reacted at room temperature for 1 hour and 30 minutes After the reaction, cells were washed and treated with PI (propidium iodide, Assay Designs, USA) for 10 minutes to perform counter-staining. The cells were observed with a confocal laser microscope (Olympus FV300, Japan), and at this time, a Largon ion laser with a wavelength of 488 nm and a HeNe laser with a wavelength of 543 nm were used to confirm Alexa Fluor or PI staining, respectively. The results of observation under a microscope are shown in Fig. 2B.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드는 LPS의 존재여하에 관계없이 세포 내에서 발현되었다.As shown in Fig. 2B, the parsley-derived polypeptide was expressed in cells regardless of the presence or absence of LPS.
실험예 1. 마이크로어레이 분석Experimental Example 1. Microarray Analysis
본 발명에 따른 미나리 유래 폴리펩티드가 다른 유전자의 발현에 어떠한 영향을 주는지 마이크로어레이 분석을 다음과 같이 수행하였다.Microarray analysis was performed as follows to see how the parsley-derived polypeptide according to the present invention affects the expression of other genes.
먼저, 실시예 3-1에서 pcDNA3.1(+).OJPR 벡터가 형질감염된 RAW264.7 세포주로부터 수득된 총 500 ng의 RNA를 사용하여 표준 어피매트릭스(Affymetrix) 프로토콜에 따라 바이오틴화된 cRNA를 준비하였다. 준비된 cRNA를 단편화한 후, 15 ㎍의 aRNA를 진칩 마우스 게놈 어레이(GeneChip Mouse Genome Array)(Affymetrix, 미국)에 45℃에서 16시간 동안 반응시킴으로써 혼성화하였다. aRNA가 혼성화된 진칩을 세척하고, 어피매트릭스 플루이딕스 스테이션 450(Affymetrix Fluidics Station 450)을 이용하여 염색하였다. 그리고 나서, 염색된 진칩을 어피매트릭스 진칩 스캐너 3000 7G(Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G)로 스캔하였다. 결과 데이터는 RMA(Robust Multi-array Analysis)를 이용하여 분석하였다.First, using a total of 500 ng of RNA obtained from the RAW264.7 cell line transfected with pcDNA3.1(+).OJPR vector in Example 3-1, biotinylated cRNA was prepared according to the standard Affymetrix protocol. I did. After fragmenting the prepared cRNA, 15 μg of aRNA was hybridized by reacting with GeneChip Mouse Genome Array (Affymetrix, USA) at 45° C. for 16 hours. Gene chip hybridized with aRNA was washed and stained using Affymetrix Fluidics Station 450. Then, the dyed gene chip was scanned with Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G. The resulting data was analyzed using RMA (Robust Multi-array Analysis).
각 어레이의 강도(intensity)의 평균은 임의로 100에 정하고, 표준화 및 로그전환된 강도값은 진스프링 GX12.5(GeneSpring GX12.5)(Agilent Technologies, 미국)를 이용하여 분석하였다. 유전자 발현 변화는 대조군에 비해 최소 200% 이상 증가한 것을 상향조절된 유전자로, 대조군에 비해 50% 이하 감소한 것을 하향조절된 유전자로 판단하였다. 계층적 클러스터링 데이터(hierarchical clustering data)는 진스프링 GX12.5에서 유사해 보이는 것을 수집하였고, 클러스터링 알고리즘은 유클리드 거리, 평균연결(average linkage)이었다. 그 결과, 마이크로어레이의 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.The average of the intensity of each array was arbitrarily set to 100, and the normalized and log-converted intensity values were analyzed using GeneSpring GX12.5 (Agilent Technologies, USA). Changes in gene expression were judged as upregulated genes, which increased by at least 200% compared to the control, and downregulated genes, which decreased by 50% or less compared to the control. Hierarchical clustering data was collected from Genespring GX12.5 that looked similar, and the clustering algorithm was Euclidean distance and average linkage. As a result, the analysis results of the microarray are shown in Table 1 below.
(강도)OJRP.LPS/N.LPS
(burglar)
(신호 값)N.LPS
(Signal value)
(신호 값)OJPR.LPS
(Signal value)
box 1High Mobility group
표 1에 나타낸 바와 같이, 전체 2744개의 유전자 중에서 1868개의 유전자의 발현이 미나리 유래 폴리펩티드에 의해 상향조절되었고, 반면 876개의 유전자는 하향조절되었다. 이중에서, 체내 면역반응과 관련된 HMGB1(high mobility group box 1), PKC-α(protein kinase C-α), IGFBP4(insulin-like growth factor binding protein 4) 및 뉴클레오포린 85(nucleoporin 85)의 발현이 현저히 유의적으로 증가하였다.As shown in Table 1, the expression of 1868 genes out of a total of 2744 genes was upregulated by the Buttercup-derived polypeptide, while 876 genes were downregulated. Among them, the expression of HMGB1 (high mobility group box 1), PKC-α (protein kinase C-α), IGFBP4 (insulin-like growth factor binding protein 4), and nucleoporin 85 related to the in vivo immune response Was significantly and significantly increased.
여기서 HMGB1 유전자에 의해 발현되는 단백질은 핵 단백질로서, TLR-2(toll-like receptor-2) 및 TLR-4(toll-like receptor-4)를 통해서 선천성 면역반응을 유도하고, PKC-α는 TLR-2 기전을 통해 세포내 신호전달을 담당한다. 따라서, 상기로부터 본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드는 세포 내에서 면역반응을 유도하는 활성을 나타냄을 알 수 있었다.Here, the protein expressed by the HMGB1 gene is a nuclear protein, which induces an innate immune response through TLR-2 (toll-like receptor-2) and TLR-4 (toll-like receptor-4), and PKC-α is a TLR It is responsible for intracellular signaling through the -2 mechanism. Accordingly, it was found from the above that the parsley-derived polypeptide of the present invention exhibits an activity to induce an immune response in cells.
실험예 2. 미나리 유래 폴리펩티드의 세포내 신호전달 기전 확인Experimental Example 2. Confirmation of intracellular signaling mechanism of parsley-derived polypeptide
2-1. LPS에 의한 미나리 유래 폴리펩티드의 발현 변화 확인2-1. Confirmation of expression change of parsley-derived polypeptide by LPS
본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드에 의해 세포내 신호전달 기전 변화를 다음과 같이 확인하였다.Changes in intracellular signaling mechanisms were confirmed by the parsley-derived polypeptide of the present invention as follows.
먼저, 미나리 유래 폴리펩티드가 형질감염된 RAW264.7 세포주를 웰 당 1.2×106개가 되도록 12웰 플레이트에 분주하고 안정적으로 부착되도록 37℃에서 3시간 동안 전배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지를 첨가하였다. 여기에 1, 5 또는 10 ㎍/㎖ 농도의 LPS와 함께 처리하고, 배양한 뒤, 상기 배양된 세포를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 통상적인 방법으로 수행되었으며, 실시예 2에서 사용한 서열번호 4 및 5의 염기서열로 기재된 프라이머를 사용하였다. 수득된 PCR 산물의 발현량을 확인한 결과를 도 3A에 나타내었다. 이때, 대조군으로서는 아무것도 형질감염되지 않은 RAW264.7 세포주를 사용하였다.First, the RAW264.7 cell line transfected with the parsley-derived polypeptide was dispensed into a 12-well plate at 1.2×10 6 cells per well, and pre-cultured at 37° C. for 3 hours to stably adhere. Thereafter, the cells were washed with PBS, and DMEM medium containing no FBS was added. Here, it was treated with LPS at a concentration of 1, 5, or 10 μg/ml, cultured, and then RT-PCR was performed using the cultured cells. RT-PCR was performed by a conventional method, and primers described in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5 used in Example 2 were used. The result of confirming the expression level of the obtained PCR product is shown in FIG. 3A. At this time, as a control, a RAW264.7 cell line that was not transfected with anything was used.
도 3A에 나타낸 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드는 세포에 처리된 LPS 농도에 의존적으로 발현이 증가하였다.As shown in Fig. 3A, the expression of the parsley-derived polypeptide was increased depending on the concentration of LPS treated in the cells.
2-2. 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 산화질소의 생성 확인2-2. Confirmation of Nitric Oxide Production by Parsley-derived Polypeptides
본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드가 형질감염된 RAW264.7 세포주에 1, 5 또는 10 ㎍/㎖ 농도로 LPS를 처리하고, 산화질소 생성을 그리스 시약(Griess reagent)을 사용하여 확인하고, 그 결과를 도 3B에 나타내었다. 이때, 대조군으로서는 아무것도 형질감염되지 않은 RAW264.7 세포주를 사용하였다.A RAW264.7 cell line transfected with a parsley-derived polypeptide of the present invention was treated with LPS at a concentration of 1, 5 or 10 µg/ml, and nitric oxide production was confirmed using a Grease reagent, and the results are shown in Fig. 3B. Shown in. At this time, as a control, a RAW264.7 cell line that was not transfected with anything was used.
도 3B에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 미나리 유래 폴리펩티드를 발현하는 세포주에서 산화질소의 생성이 약 10배 증가하였고, 이는 LPS의 처리농도에 의존적으로 더 증가하였다.As shown in FIG. 3B, the production of nitric oxide in the cell line expressing the parsley-derived polypeptide was increased by about 10 times compared to the control group, which further increased depending on the treatment concentration of LPS.
2-3. 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 TLR4 유전자의 발현 변화 확인2-3. Confirmation of changes in expression of TLR4 gene by parsley-derived polypeptide
먼저, 아무것도 형질감염되지 않은 RAW264.7 세포주를 웰 당 1.2×106개가 되도록 12웰 플레이트에 분주하고 안정적으로 부착되도록 37℃에서 3시간 동안 전배양하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지를 첨가하였다. 여기에 1 또는 5 ㎍/㎖ 농도의 미나리 유래 폴리펩티드를 처리하고, 배양한 뒤, 상기 배양된 세포를 이용하여 qPCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.First, the RAW264.7 cell line, which was not transfected with anything, was dispensed into a 12-well plate at 1.2×10 6 cells per well, and pre-cultured at 37° C. for 3 hours to stably adhere. Thereafter, the cells were washed with PBS, and DMEM medium containing no FBS was added. Here, a parsley-derived polypeptide at a concentration of 1 or 5 μg/ml was treated, cultured, and then qPCR (quantitative real-time PCR) was performed using the cultured cells.
구체적으로, qPCR은 SensiMix™ SYBR HiROX 키트(Bioline, 영국)를 사용하여 로터-진 6000(Rotor-gene 6000) 기기(Qiagen, 미국)에서 수행되었다. qPCR을 위한 반응물은, 10 ㎕의 2×효소 마스터믹스, 7 ㎕의 RNase가 없는 증류수, 1 ㎕의 정방향 및 역방향 프라이머 각각, 1 ㎕의 희석된 주형을 포함하여 제조하였다. 이때, TLR4 유전자에 대한 프라이머는 서열번호 6(5'-CGCTCTGGCATCATCTTCAT-3') 및 서열번호 7(5'-TGTTTGCTCAGGATTCGAGG-3')로 기재된 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하였다. 상기 반응물을 이용하여 하기 표 2에 기재된 조건으로 qPCR을 수행하였다.Specifically, qPCR was performed on a Rotor-gene 6000 instrument (Qiagen, USA) using the SensiMix™ SYBR HiROX kit (Bioline, UK). The reactants for qPCR were prepared including 10 μl of 2× enzyme mastermix, 7 μl of RNase-free distilled water, 1 μl of each of the forward and reverse primers, and 1 μl of the diluted template. At this time, the primer for the TLR4 gene was used as a primer consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 6 (5'-CGCTCTGGCATCATCTTCAT-3') and SEQ ID NO: 7 (5'-TGTTTGCTCAGGATTCGAGG-3'). Using the above reactants, qPCR was performed under the conditions shown in Table 2 below.
qPCR 결과, 녹는 곡선(melting curve) 분석은 예상되는 PCR 산물의 형태를 확인하기 위해 사용되었고, PCR 산물의 길이는 1.2% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동함으로써 확인하였다. 또한, 표준 곡선은 PCR 효율성을 확인하기 위해 각각의 유전자에 대해 작성되었다. 상대적인 샘플의 발현 수준은 로터-진 6000 시리즈 소프트웨어 1.7을 사용하여 계산되었고, 결과 데이터는 내부 대조군 유전자의 발현 수준을 기준으로 폴드 값으로 나타내었다.As a result of qPCR, melting curve analysis was used to confirm the shape of the expected PCR product, and the length of the PCR product was confirmed by electrophoresis using a 1.2% agarose gel. In addition, a standard curve was created for each gene to confirm the PCR efficiency. The expression levels of the relative samples were calculated using Rotor-Gene 6000 series software 1.7, and the resulting data were expressed as fold values based on the expression level of the internal control gene.
그 결과, 도 3C에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드는 세포 내에서 TLR4 유전자의 발현을 유의적으로 증가시켰다.As a result, as shown in Fig. 3C, the parsley-derived polypeptide of the present invention significantly increased the expression of the TLR4 gene in cells.
또한, 상기와 같은 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 TLR4 유전자 신호전달 기전을 재확인 하기 위해, 상기 과정에서 미나리 유래 폴리펩티드를 TLR4 억제제인 TAK-242(0.5, 1, 2 또는 5 ㎍/㎖)와 함께 처리하여 상술한 바와 동일한 방법으로 qPCR을 수행하였다. 이때, iNOS 유전자의 발현량을 서열번호 8(5'-TGCCCCTGGAAGTTTCTCTT-3') 및 서열번호 9(5'-ACTGCCCCAGTTTTTGATCC-3')로 기재된 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하여 측정하고, 그 결과를 도 3D에 나타내었다.In addition, in order to reconfirm the mechanism of TLR4 gene signaling by the parsley-derived polypeptide as described above, the parsley-derived polypeptide was treated with TLR4 inhibitor TAK-242 (0.5, 1, 2 or 5 μg/ml) in the above process. QPCR was performed in the same manner as described above. At this time, the expression level of the iNOS gene was measured using a primer consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 8 (5'-TGCCCCTGGAAGTTTCTCTT-3') and SEQ ID NO: 9 (5'-ACTGCCCCAGTTTTTGATCC-3'), and the results are shown in Fig. Shown in 3D.
표 3D에 나타난 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드에 의해 증가한 iNOS 유전자의 발현이 TAK-242의 처리 농도에 의존적으로 감소하였다.As shown in Table 3D, the expression of the iNOS gene, which was increased by the parsley-derived polypeptide, decreased depending on the treatment concentration of TAK-242.
따라서, 상기의 결과들로부터 본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4 신호전달 기전을 촉진함을 알 수 있었다.Therefore, from the above results, it was found that the polypeptide derived from the parsley of the present invention promotes the TLR4 signaling mechanism.
2-4. 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 TLR4 신호전달 기전 확인2-4. Confirmation of TLR4 signaling mechanism by parsley-derived polypeptide
미나리 유래 폴리펩티드에 의해 TLR4 신호전달 기전에 관련된 유전자인 COX2, IL-6 및 TNFα 유전자의 발현 변화를 실험예 2-3에 기재된 조건 및 방법으로 확인하였다. 이때, qPCR을 위한 프라이머는 하기 표 3에 기재된 프라이머를 사용하였다. 그 결과, COX2, IL-6 및 TNFα 유전자의 발현 변화를 확인한 그래프를 도 4A 내지 4C에 나타내었다.Changes in the expression of COX2, IL-6 and TNFα genes, which are genes related to the TLR4 signaling mechanism by the parsley-derived polypeptide, were confirmed by the conditions and methods described in Experimental Example 2-3. At this time, primers for qPCR were used as shown in Table 3 below. As a result, graphs confirming the changes in the expression of COX2, IL-6 and TNFα genes are shown in FIGS. 4A to 4C.
도 4A 내지 4C에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4 의존적인 유전자인 COX2, IL-6 및 TNFα 유전자의 발현을 증가시켰고, 이는 LPS 처리에 의해서 더욱 촉진되었다.As shown in Figs. 4A to 4C, the parsley-derived polypeptide of the present invention increased the expression of the TLR4-dependent genes COX2, IL-6, and TNFα genes, which were further promoted by LPS treatment.
한편, 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 TLR4 신호전달 기전의 촉진이 TLR4/MyD88 신호 캐스캐이드에 의한 것인지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, 실험은 실험예 2-3에 기재된 조건 및 방법으로 수행되었고, RAW264.7 세포주에 미나리 유래 폴리펩티드를 단독으로 첨가하거나, 상기 펩티드를 TAK-242 또는 MAP 카이네이즈 억제제인 PD98059와 함께 처리하였을 때의 TLR4 유전자 발현 변화를 측정하였다.On the other hand, the following experiment was performed to confirm whether the promotion of the TLR4 signaling mechanism by the parsley-derived polypeptide is due to the TLR4/MyD88 signaling cascade. Specifically, the experiment was performed under the conditions and methods described in Experimental Example 2-3, and when a parsley-derived polypeptide was added to the RAW264.7 cell line alone, or when the peptide was treated with TAK-242 or PD98059, a MAP kinase inhibitor. The change in TLR4 gene expression was measured.
그 결과, 도 4D에 나타낸 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드에 의해 증가한 TLR4 유전자의 발현이 TAK-242 및 PD98059에 의해 억제되었다. 따라서, 상기 결과로부터 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4/MyD88 신호전달 기전에 관여함을 알 수 있었다.As a result, as shown in Fig. 4D, the expression of the TLR4 gene increased by the parsley-derived polypeptide was suppressed by TAK-242 and PD98059. Therefore, from the above results, it was found that the parsley-derived polypeptide is involved in the TLR4/MyD88 signaling mechanism.
실험예 3. 미나리 유래 폴리펩티드의 세포내 상호작용 확인Experimental Example 3. Intracellular interaction confirmation of parsley-derived polypeptide
실험예 2에서 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4/MyD88 신호전달 기전에 관여함을 확인한 것을 기초로, 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4 단백질과 상호작용하고, 그에 따라 MyD88/NF-κB 신호전달 기전이 촉진되는지를 다음과 같이 확인하였다.Based on the confirmation that the Buttercup-derived polypeptide is involved in the TLR4/MyD88 signaling mechanism in Experimental Example 2, it is determined whether the Buttercup-derived polypeptide interacts with the TLR4 protein, thereby promoting the MyD88/NF-κB signaling mechanism as follows. I confirmed it together.
3-1. TLR4 억제제에 의한 미나리 유래 폴리펩티드의 억제 확인-13-1. Confirmation of Inhibition of Buttercup-derived Polypeptide by TLR4 Inhibitor-1
먼저, 상기 실험예 3-3에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 RAW264.7 세포주에 미나리 유래 폴리펩티드 및 TAK-242를 처리하여 배양하였다. 배양된 세포는 4% 파라포름알데하이드가 포함된 0.1 M PBS에 15분 동안 두어 고정시키고, 100 mM 글라이신이 포함된 PBS 완충액을 이용하여 5분 동안 세척하였다. 세척된 세포를 0.1% 트리톤 X-100이 포함된 PBS에 넣어 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 세포주를 0.1% BSA(bovine serum albumin)로 상온에서 30분 동안 전처리하고, 실시예 2-2에서 제조된 미나리 유래 폴리펩티드 특이적인 항체를 1% BSA가 포함된 PBS 완충액에 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척하고, 1:200으로 희석된 FITC(fluorescein isothiocyanate)-결합된 항-마우스 IgG 항체(Cell Signaling, 미국)를 1% BSA에 희석하여 첨가하고 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 염색된 세포를 역 형광 현미경 시스템(inverted fluorescent microscope system)(Eclipse Ti-S, 일본)을 사용하여 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.First, in the same conditions and methods as described in Experimental Example 3-3 above, the RAW264.7 cell line was cultured by treatment with a parsley-derived polypeptide and TAK-242. The cultured cells were fixed by placing them in 0.1 M PBS containing 4% paraformaldehyde for 15 minutes, and washed for 5 minutes using PBS buffer containing 100 mM glycine. The washed cells were placed in PBS containing 0.1% Triton X-100 and reacted at room temperature for 30 minutes. The cell line after the reaction was pretreated with 0.1% bovine serum albumin (BSA) for 30 minutes at room temperature, and the polypeptide-specific antibody derived from buttercups prepared in Example 2-2 was diluted in PBS buffer containing 1% BSA, and at room temperature. It was reacted for 2 hours. After the reaction, the cells were washed 3 times with PBS buffer, and FITC (fluorescein isothiocyanate)-conjugated anti-mouse IgG antibody (Cell Signaling, USA) diluted 1:200 was diluted in 1% BSA and added for 1 hour. It was reacted at room temperature. 5 shows the results of confirming the stained cells using an inverted fluorescent microscope system (Eclipse Ti-S, Japan).
도 5에 나타낸 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드가 TAK-242에 의해 거의 대부분 억제되는 것으로 보아, 미나리 유래 폴리펩티드가 TLR4 기전에 관련되어 있음을 알 수 있었다.As shown in Fig. 5, it was found that the parsley-derived polypeptide was almost inhibited by TAK-242, indicating that the parsley-derived polypeptide was involved in the TLR4 mechanism.
3-2. TLR4 억제제에 의한 미나리 유래 폴리펩티드의 억제 확인-23-2. Confirmation of Inhibition of Buttercup-derived Polypeptide by TLR4 Inhibitor-2
먼저, 상기 실험예 3-3에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 RAW264.7 세포주에 미나리 유래 폴리펩티드 및 TAK-242를 처리하여 배양하고, 배양된 세포를 이용하여 실험예 2-3에 기재된 바와 같은 조건 및 방법으로 qPCR을 수행하였다. 이때, CD80 및 MIP2 유전자에 대한 프라이머는 상기 표 3에 기재된 프라이머를 사용하였다.First, under the same conditions and methods as described in Experimental Example 3-3, the RAW264.7 cell line was cultured with a parsley-derived polypeptide and TAK-242, and the cultured cells were used as described in Experimental Example 2-3. And qPCR was performed by the method. At this time, primers for the CD80 and MIP2 genes were used as shown in Table 3 above.
그 결과, 도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, TLR4 신호전달 기전에 관련된 CD80 및 MIP2 유전자의 발현이 TAK-242에 의해 유의적으로 억제되었다.As a result, as shown in Figs. 6A and 6B, the expression of CD80 and MIP2 genes related to the TLR4 signaling mechanism was significantly suppressed by TAK-242.
3-3. 미나리 유래 폴리펩티드의 MAPK 및 PI3K 신호전달 기전 관련성 확인3-3. Confirmation of the relationship between MAPK and PI3K signaling mechanisms of parsley-derived polypeptides
미나리 유래 폴리펩티드가 MAPK 및 PI3K 신호전달 기전에 관여하는 IκBα나 Akt 단백질의 인산화에 영향을 주는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.The following experiments were performed to confirm whether the parsley-derived polypeptide affects the phosphorylation of IκBα or Akt proteins involved in MAPK and PI3K signaling mechanisms.
먼저, 상기 서술한 바와 같이 미나리 유래 폴리펩티드가 처리된 세포주를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험은 항-phospho-IκB-alpha 항체 또는 항-phospho-Akt 항체를 1차 항체로 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3-3과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 이때, 대조군으로서 β-액틴 단백질을 사용하였다.First, Western blot was performed using a cell line treated with a parsley-derived polypeptide as described above. The experiment was performed in the same conditions and methods as in Example 3-3, except that an anti-phospho-IκB-alpha antibody or an anti-phospho-Akt antibody was used as the primary antibody. At this time, β-actin protein was used as a control.
그 결과, 도 6C에 나타낸 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드에 의해서 세포 내 IκBα나 Akt 단백질의 인산화가 유의적으로 증가하였다.As a result, as shown in Fig. 6C, phosphorylation of intracellular IκBα or Akt protein was significantly increased by the parsley-derived polypeptide.
3-4. 미나리 유래 폴리펩티드에 의한 NF-κB의 발현 변화 확인3-4. Confirmation of change in expression of NF-κB by parsley-derived polypeptide
미나리 유래 폴리펩티드에 의해서 NF-κB 단백질의 발현 변화를 이중-루시퍼라제 분석방법(dual-luciferase assay)으로 확인하였다.The change in the expression of NF-κB protein by the parsley-derived polypeptide was confirmed by a dual-luciferase assay.
먼저, RAW264.7 세포주를 96-웰 플레이트에 웰 당 8×104개가 되도록 분주하고 배양하여 세포를 부착시켰다. 배양된 세포에 200 ng의 pGL4.32[luc2P/NF-κB -RE/hygro] 플라스미드(Promega, 미국) 및 2 ng의 pRL-SV40 플라스미드(Promega, 미국)를 통상적인 방법으로 공-형질감염시켰다. 24시간 후, 세포에 1 ㎍/㎖ LPS 또는 5 ㎍/㎖의 미나리 유래 폴리펩티드를 처리하고 6시간 동안 더 배양하였다. 배양된 세포에서 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 뒤, 여기에 용해완충액을 첨가하여 세포를 용해시키고, 5분 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 상대적인 루시러파제 활성은 듀얼-루시퍼라제 리포터 어세이 키트(Bioassay, 미국)를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 50 ㎕의 세포 용해물을 불투명한 흰색 멀티-웰 플레이트에 넣고, 100 ㎕의 파이어플라이 루시퍼라제를 첨가하여, 565 ㎚ 파장의 루미노미터를 이용하여 측정하였다. 그리고 나서, 여기에 100 ㎕의 레닐라 시약을 첨가하고, 플레이트를 가볍게 교반하여 용액을 섞은 뒤, 480 ㎚ 파장의 루미노미터를 이용하여 측정하였다.First, the RAW264.7 cell line was dispensed into a 96-well plate so as to be 8×10 4 cells per well and cultured to attach the cells. The cultured cells were co-transfected with 200 ng of pGL4.32 [luc2P/NF-κB -RE/hygro] plasmid (Promega, USA) and 2 ng of pRL-SV40 plasmid (Promega, USA) by a conventional method. . After 24 hours, the cells were treated with 1 µg/ml LPS or 5 µg/ml of parsley-derived polypeptide, followed by further incubation for 6 hours. After removing the medium from the cultured cells, washing the cells with PBS, lysis buffer was added thereto to lyse the cells, and reacted with stirring at room temperature for 5 minutes. Relative lucirupase activity was measured using a dual-luciferase reporter assay kit (Bioassay, USA). Specifically, 50 µl of cell lysate was placed in an opaque white multi-well plate, 100 µl of Firefly luciferase was added, and the measurement was performed using a luminometer with a wavelength of 565 nm. Then, 100 µl of Renilla's reagent was added thereto, and the plate was gently stirred to mix the solution, followed by measurement using a luminometer having a wavelength of 480 nm.
그 결과, 도 6D에 나타난 바와 같이, 미나리 유래 폴리펩티드에 의해서 NF-κB 단백질의 발현이 증가하였다.As a result, as shown in Fig. 6D, the expression of the NF-κB protein was increased by the parsley-derived polypeptide.
따라서, 상기로부터 미나리 유래 폴리펩티드가 세포 내에서 MAPK 및 PI3K 신호전달 기전에 관련되고, 그에 따라 선천선 면역반응을 유도함을 알 수 있었다.Therefore, from the above, it was found that the parsley-derived polypeptide is involved in the MAPK and PI3K signaling mechanisms in the cell, and thus induces an innate gland immune response.
실험예 4. 미나리 유래 폴리펩티드의 항바이러스 활성 확인Experimental Example 4. Antiviral activity confirmation of parsley-derived polypeptide
본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드가 면역반응을 촉진하면서 항바이러스 활성을 나타내는지를 qPCR 방법으로 확인하였다. 이때, 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 항바이러스 활성이나 숙주의 면역 반응을 조절하는데 관여하거나, IFN에 의해 유도되는 항바이러스 유전자인 IFN-γ, IFN-α, Mx1(myxovirus resistance protein 1) 및 OAS(2'5'oligoadenylate synthetase 1) 유전자의 발현을 확인하였다.It was confirmed by the qPCR method whether the parsley-derived polypeptide of the present invention exhibits antiviral activity while promoting an immune response. At this time, in order to confirm the antiviral activity, it is involved in regulating the antiviral activity or the immune response of the host, or the antiviral genes IFN-γ, IFN-α, Mx1 (myxovirus resistance protein 1) and OAS ( 2'5'oligoadenylate synthetase 1) gene expression was confirmed.
구체적으로, CD4+ T 세포를 마우스의 비장으로부터 분리한 뒤, 상기 서술한 바와 같이 1 또는 5 ㎍/㎖의 미나리 유래 폴리펩티드를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포로부터 상술한 바와 같이 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 실험예 2-3에 기재된 바와 같이 qPCR을 수행하여 IFN-γ, IFN-α, Mx1 및 OAS 유전자의 발현을 확인하였다. 또한, CD4+ T 세포에서 IFN-γ의 발현이 TLR2 및 TLR4 유전자와 관련되는지 확인하기 위해, TLR2 및 TLR4 유전자의 발현도 함께 확인하였다. 이때, TLR4 유전자에 대한 프라이머는 상기의 서열번호 6 및 7로 기재되는 염기서열로 구성된 프라이머를 사용하였고, 이외 다른 유전자에 대한 프라이머는 하기 표 4에 기재된 프라이머를 사용하였다. 이때, 양성대조군으로서는 항-CD2 및 항-CD28을 처리한 세포를 사용하였다.Specifically, after CD4 + T cells were isolated from the spleen of mice, 1 or 5 µg/ml of parsley-derived polypeptide was treated as described above, and cultured for 24 hours. From the cultured cells, cDNA was synthesized as described above, and qPCR was performed as described in Experimental Example 2-3 as a template to confirm the expression of IFN-γ, IFN-α, Mx1 and OAS genes. In addition, in order to confirm whether the expression of IFN-γ in CD4 + T cells is related to the TLR2 and TLR4 genes, the expression of the TLR2 and TLR4 genes was also confirmed. In this case, primers for the TLR4 gene were used as primers composed of nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 6 and 7, and primers for other genes were used as shown in Table 4 below. At this time, as a positive control, cells treated with anti-CD2 and anti-CD28 were used.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미나리 유래 폴리펩티드가 IFN-γ, IFN-α, Mx1 및 OAS 유전자뿐만 아니라, TLR2 및 TLR4 유전자의 발현도 모두 유의적으로 증가시켰다.As a result, as shown in Figure 7, the parsley-derived polypeptide of the present invention significantly increased the expression of not only IFN-γ, IFN-α, Mx1 and OAS genes, but also TLR2 and TLR4 genes.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 미나리 유래 폴리펩티드는 사람의 면역활성을 조절하거나 항바이러스용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, from the above, the parsley-derived polypeptide according to the present invention can be usefully used as a composition for regulating human immune activity or as an antiviral composition.
<110> GANGNEUNG-WONJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION GROUP <120> POLYPEPTIDES DERIVED OENANTHE JAVANICA AND PHAMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING POLYPEPTIDES THEREOF <130> DP-2019-0289-KR <160> 31 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OJPR polynucleotide <400> 1 atgggtgttc agagccatgt tcttgagctc acttcctcac tctcagcaga gaaaatgttc 60 cagggcttag tcattgatgc tgatacaatc atccccaagg ctgcccctgg agcttacaag 120 agtgtcgagg tcaaaggaga cggtggagct ggaaccataa aaaacatcac tctgcctgaa 180 ggtagcccaa tcaccacaat gaccctgagg actgatgcag taaataagga ggcattgaca 240 ttcgattaca gtgtcatcga cggagacatc ctgttgggct tcattgaatc catcgaaaac 300 catctcgtaa ttgtaccaac tgctgatgga ggtagcatta ccaagaccac agccatattc 360 cacaccaaag gcgatgccgt agttcctgaa gagaacatca agtatgccaa tgagcagaac 420 actgctcttt tcaaggctat cgaggcccac ctcattgcca actaa 465 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OJPR polypeptide <400> 2 Met Gly Val Gln Ser His Val Leu Glu 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agtatgccaa tgagcagaac 420 actgctcttt tcaaggctat cgaggcccac ctcattgcca actaa 465 <210> 2 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OJPR polypeptide <400> 2 Met Gly Val Gln Ser His Val Leu Glu Leu Thr Ser Ser Leu Ser Ala 1 5 10 15 Glu Lys Met Phe Gln Gly Leu Val Ile Asp Ala Asp Thr Ile Ile Pro 20 25 30 Lys Ala Ala Pro Gly Ala Tyr Lys Ser Val Glu Val Lys Gly Asp Gly 35 40 45 Gly Ala Gly Thr Ile Lys Asn Ile Thr Leu Pro Glu Gly Ser Pro Ile 50 55 60 Thr Thr Met Thr Leu Arg Thr Asp Ala Val Asn Lys Glu Ala Leu Thr 65 70 75 80 Phe Asp Tyr Ser Val Ile Asp Gly Asp Ile Leu Leu Gly Phe Ile Glu 85 90 95 Ser Ile Glu Asn His Leu Val Ile Val Pro Thr Ala Asp Gly Gly Ser 100 105 110 Ile Thr Lys Thr Thr Ala Ile Phe His Thr Lys Gly Asp Ala Val Val 115 120 125 Pro Glu Glu Asn Ile Lys Tyr Ala Asn Glu Gln Asn Thr Ala Leu Phe 130 135 140 Lys Ala Ile Glu Ala His Leu Ile Ala Asn 145 150 <210> 3 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligonucleotide linker <400> 3 agcaucgagu 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forward primer <400> 28 ccagaatcta tgccatcctc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OAS reverse primer <400> 29 ctccttacac agttggtacc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 forward primer <400> 30 tcagtggcca gaaaagatgc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TLR2 reverse primer <400> 31 accagcaaca cagggaacaa 20
Claims (9)
A polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
The polypeptide according to claim 1, wherein the polypeptide is derived from buttercup.
An expression vector comprising a polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1.
A host cell transfected with the expression vector of claim 3.
An antiviral agent comprising a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide encoding the polypeptide as an active ingredient.
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