KR102256570B1 - 비색-형광 혼합 모드를 이용한 환경호르몬 검출 방법 - Google Patents

비색-형광 혼합 모드를 이용한 환경호르몬 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분석 대상물질을 효과적으로 정량하기 위하여, 금속 나노입자와 압타머를 기반으로 동일한 시료에서 비색법과 형광분석법을 동시 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

비색-형광 혼합 모드를 이용한 환경호르몬 검출 방법{Methods for detecting endocrine disruptors using dual modes of colorimetric and fluorometric analysis}
본 발명은 검출 대상물질의 검출 및 정량 방법에 관한 것이다.
환경호르몬의 한 종류인 비스페놀 A는 플라스틱 가소제, 열전사지의 코팅제 및 캔 음료 내부의 코팅 등에 흔하게 포함되는 물질이다. 상기 비스페놀 A는 인체 내로 고농도로 유입될 경우 성 호르몬 대사를 방해하여 인체에 해로운 영향을 주기 때문에, 보다 신속하고 정확한 측정법이 필요하다.
표준 측정법으로서 LC/GC-MS법은 가장 정확한 시료 분석을 제공하고 있으나, 분석에 과도한 시간이 소요되고 공정에 따른 시료분석의 어려움을 가지므로, 이를 극복하기 위한 방법들이 개발되어 왔다.
신속분석을 위한 대표적 방법으로서, 금 나노입자 비색법이 개발되었다(비특허문헌 1). 상기 방법은 색변화를 통해 손쉽게 시료를 감지할 수 있으나 민감도가 현저히 결여될 수 있다는 단점을 가진다. 또한, 압타머 및 항체에 기반한 형광분석의 경우 시료에 의한 형광간섭으로 인한 정확성이 떨어지는 단점을 가진다. 또한 비스페놀 이외의 저분자 물질을 측정하기 위한 방법으로 금 나노입자와 압타머를 이용하여 비색법과 형광법을 동시에 측정하는 사례가 보고된 바 있으나 (비특허문헌 2), DNA 압타머 말단에 형광을 부착할 경우 압타머와 타겟간의 결합이 표지된 형광물질에 영향을 받을 수 있고, 형광신호의 효과적인 증폭이 어렵다는 단점이 있다.
1. Trends in Analytical Chemistry 52 (2013) 248-260 2. RSC Advances, 2017, 7, 16290
본 발명에서는 전술한 문제점을 해결하기 위하여, 금 나노입자와 압타머가 가지는 구조적 변화에 기반하여 동일한 시료에 대해 순차적으로 형광분석 및 색변화를 동시에 구현하는 것을 목적으로 한다.
즉, 본 발명에서는 금 나노입자와 압타머를 기반으로 동일한 시료에서 비색법과 형광분석법을 측정하여, 시료 안에 존재하는 검출 대상물질을 검출 및 정량하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 (A) 검출 대상물질을 포함하는 시료와 압타머-금속 나노입자 복합체를 반응시키는 단계;
(B) 상기 단계 (A)의 반응물에 형광 염료를 첨가하고 형광을 측정하는 단계; 및
(C) 상기 단계 (B)의 반응물에 염을 첨가하고 흡광도를 측정하는 단계를 포함하며,
상기 압타머는 검출 대상물질과 특이적으로 결합가능하며, 상기 형광 염료는 압타머와 결합할 때 형광을 나타내는 검출 대상물질의 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 전술한 방법을 사용하여 검출 대상물질의 농도에 따른 형광값 및 흡광도를 측정하고,
상기 형광값 및 흡광도를 사용하여 하기 식 1의 형광·흡광도를 계산하며,
농도에 따른 형광·흡광도의 변화를 검출 대상물질의 정량을 위한 표준곡선으로 사용하는 검출 대상물질의 정량 방법을 제공한다.
<식 1>
형광·흡광도 = {(ODx/ODy)n - (ODx/ODy)o} / (Fn/Fo)
상기 식 1에서 ODx는 x nm에서의 흡광도를 나타내고, ODy 는 y nm에서의 흡광도를 나타내며, (ODx/ODy)o와 Fo는 각각 검출 대상물질을 포함하지 않는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타내고, (ODx/ODy)n과 Fn은 각각 검출 대상물질을 포함하는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타낸다.
또한, 본 발명은 압타머-금속 나노입자 복합체 및 형광 염료를 포함하며,
상기 압타머는 검출 대상물질과 특이적으로 결합가능하며, 상기 형광 염료는 압타머와 결합할 때 형광을 나타내는 검출 대상물질의 검출 및 정량을 위한 키트를 제공한다.
본 발명에서는 시료 안에 존재하는 검출 대상물질을 효과적으로 검출 및 정량하기 위하여, 금 나노입자와 압타머를 기반으로 동일한 시료에서 비색법과 형광분석법을 측정할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 압타머 말단에 직접 형광을 표지하는 종래의 방법과 비교하여, 압타머에 결합하여 형광을 발생하는 염색물질을 사용하여 압타머와 타겟간의 결합이 형광물질에 영향을 받지 않고, 형광 신호를 보다 효과적으로 증폭할 수 있다.
특히, 환경호르몬의 한 종류인 비스페놀 A를 검출 및 정량시, 본 발명에 따른 방법을 적용할 경우 비색법이나 형광법 어느 하나에 의존하는 것에 비해 빠른 시간 내에 높은 민감도로 측정이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 비스페놀 A(BPA)의 검출 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에서 사용되는 비스페놀 A(BPA) 압타머를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법에 따른 압타머와 금 나노입자 간의 농도비율 적합성 조사 결과를 나타낸다.
도 4는 압타머-금 나노입자 복합체의 비스페놀 A(BPA)에 대한 반응 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 방법에 따른 비스페놀 A(BPA) 정량 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 방법에 따른 비스페놀 A(BPA) 특이성 조사 결과를 나타낸다
도 7은 본 발명의 방법에 따른 영수증 내에 함유된 비스페놀 A(BPA)의 검출 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 방법에 따른 영수증 내에 함유된 비스페놀 A(BPA)의 함량 측정을 위한 HPLC data를 나타낸다.
도 9는 FAM-aptamer를 이용한 비스페놀 A(BPA) 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 FAM-aptamer를 이용한 영수증 내에 함유된 비스페놀 A(BPA)의 검출 결과를 나타낸다.
도 11은 영수증 샘플의 준비와 측정 과정을 나타내는 모식도이다.
본 발명은 검출 대상물질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 검출 대상물질의 검출방법은 (A) 검출 대상물질을 포함하는 시료와 압타머-금속 나노입자 복합체를 반응시키는 단계;
(B) 상기 단계 (A)의 반응물에 형광 염료를 첨가하고 형광을 측정하는 단계; 및
(C) 상기 단계 (B)의 반응물에 염을 첨가하고 흡광도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 비색법과 형광분석법을 동일한 시료에 적용할 수 있다. 여기서, 비색법(colormetric)은 색 시약 등을 이용하여 빛의 특정 파장의 흡광도를 측정하여 화학 화합물, 용액의 농도를 테스트하거나 정량하는 것을 의미한다. 또한, 형광분석법은 물질의 형광성을 이용한 화학 분석법으로서, 비형광 물질인 시료를 화학 반응에 의해서 발형광 물질로 변화시켜 그 형광을 분석하는 것을 의미한다.
즉, 본 발명에서는 상기 비색법 및 형광분석법을 동시에 이용하여, 시료 안에 존재하는 분석 대상물질을 빠른 시간 내에 효과적이며 정확도 높게 검출 및 정량할 수 있다.
본 발명에서 검출 대상물질은 특별히 제한되지 않으며, 소분자(small molecule) 물질일 수 있다. 상기 소분자 물질로는 비스페놀 A(BPA), 비스페놀 S(BPS), 비스페놀 F(BPF), 베타 에스트라디올, 프탈레이트 또는 트롬빈 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 상기 검출 대상물질의 종류에 따라 이에 특이적으로 결합가능한 압타머를 선택 및 사용하여, 상기 대상물질을 검출할 수 있다. 특히, 비스페놀 A, 베타 에스트라디올 및 트롬빈의 경우 상기 물질과 결합가능한 압타머가 당업계에 공개되어 있으므로, 본 발명의 방법을 사용하여 손쉽게 검출이 가능하다.
이러한 검출 대상물질의 농도는 검출 대상물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 10,000 ng/ml, 또는 0.01 내지 1,000 ng/ml일 수 있다.
금속 나노입자에서 금속은 금 또는 은일 수 있다. 상기 금속 나노입자는 응집 또는 분산 상태에 따라 서로 다른 색을 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 금속 나노입자는 표면처리된 금속 나노입자일 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 상기 금속 나노입자는 시트레이트(citrate)에 의해 안정화된 입자일 수 있다. 예를 들어, 압타머로 단일가닥 DNA 압타머를 사용할 경우, 상기 단일가닥 DNA 압타머의 염기 부분은 반데르발스힘에 의해 금속 나노입자 표면에 용이하게 흡착될 수 있다.
압타머는 검출 대상물질과 특이적으로 결합가능한 것을 사용할 수 있다. 압타머는 금속 나노입자와 결합하여 압타머-금속 나노입자 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 검출 대상물질과 결합하여 압타머-검출 대상물질 복합체를 형성할 수 있다.
형광 염료의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 압타머와 결합할 때 형광을 나타내는 염료를 사용할 수 있다. 이러한 염료로 SYBR Green, Gel Red 또는 Gel green을 사용할 수 잇다.
또한, 염은 염화나트륨(NaCl)을 사용할 수 있으며, 사용 편의상 염을 포함하는 용액을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 PBS 완충용액을 사용할 수 있다.
본 발명에서 단계 (A)는 검출 대상물질을 포함하는 시료와 압타머-금속 나노입자 복합체를 반응시키는 단계이다.
압타머-금속 나노입자 복합체는 금속 나노입자에 압타머가 결합 또는 흡착되어 있으며, 상기 복합체는 시료 내에서 분산된 상태로 존재한다. 압타머는 검출 대상물질과 특이적으로 결합가능하므로, 상기 압타머-금속 나노입자 복합체는 검출 대상물질과 반응하여 압타머가 분리되고, 상기 분리된 압타머는 검출 대상물질과 결합하여 압타머-검출 대상물질 복합체를 형성할 수 있다.
일 구체예에서, 금속 나노입자는 표면처리된 금속 나노입자일 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 상기 금속 나노입자는 시트레이트(citrate)에 의해 안정화된 입자일 수 있다. 예를 들어, 압타머로 단일가닥 DNA 압타머를 사용할 경우, 상기 단일가닥 DNA 압타머의 염기 부분은 반데르발스힘에 의해 금속 나노입자 표면에 용이하게 흡착될 수 있다.
본 발명에서 단계 (B)는 단계 (A)의 반응물에 형광 염료를 첨가하고 형광을 측정하는 단계이다.
상기 형광 염료는 압타머와 결합할 때 형광을 나타낼 수 있다. 상기 형광 염료의 첨가 시, 압타머-금속 나노입자 복합체는 형광 염료와 반응하여 압타머가 분리되고, 상기 분리된 압타머는 형광 염료와 결합하여 형광을 나타내게 된다.
다만, 전술한 단계 (A)에서 형성된 압타머-검출 대상물질 복합체는 형광 염료와 반응하지 않는다. 형광 염료로 사용되는 SYBR Green은 cyanine계열의 염료로서 dsDNA및 ssDNA에 모두 결합하여 형광을 내는 염료이다. 압타머가 금속 나노입자 표면에 결합된 상태로 존재시 나노입자-압타머의 결합보다 SYBR Green과 압타머 결합력이 강하기 때문에 상기 염료는 압타머와 결합하여 형광을 방출할 수 있다. 반면에, 압타머가 검출 대상물질과 반응할 경우 압타머-검출 대상물질의 결합력이 강하므로, 염료와 압타머와 결합반응을 경쟁적으로 저해하여 형광이 발생하지 않는다.
형광의 측정 방법은 당업계의 일반적인 측정 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 일반적으로 형광의 세기(형광값) F는 Fn/Fo의 식으로 계산할 수 있는데, 이때, Fo는 검출 대상물질을 포함하지 않는 샘플(시료)의 특정 파장에서의 형광값을, Fn은 검출 대상물질을 포함하는 실험군의 특정 파장에서의 형광값을 의미할 수 있다. 측정되는 파장은 분석 대상물질의 종류 및 사용하는 형광 염료의 종류 등에 따라 달라질 수 있다.
상기 단계에서 검출 대상물질의 농도가 높을 경우 형광의 세기는 감소하고, 검출 대상물질의 농도가 낮을 경우 형광의 세기는 증가한다.
일 구체예에서, 분석 대상물질로 비스페놀 A(BPA)를 사용할 경우 525 nm의 파장에서 형광값을 계산할 수 있다.
본 발명에서 단계 (C)는 단계 (B)의 반응물에 염을 첨가하고 흡광도를 측정하는 단계이다.
상기 단계에서 염을 첨가하면 결합을 형성하지 않은 금속 나노입자는 서로 응집하여 색의 변화를 나타내게 된다.
일 구체예에서, 금속 나노입자로 금 나노입자를 사용할 경우 분산 상태의 금 나노입자는 붉은 색을 띠고, 응집된 금 나노입자는 푸른 색을 띤다. 단계 (B)의 반응물에 염을 첨가하면 압타머-금 나노입자 복합체는 분산된 상태를 지니지만, 금 나노입자는 서로 응집하여 푸른 색을 띠게 된다.
본 발명에서는 이러한 색의 변화를 흡광도로 측정하여 분석 대상물질의 존재 유무를 검출할 수 있으며, 나아가 분석 대상물질을 정량화할 수 있다. 상기 흡광도는 당업계의 일반적인 측정 방법을 이용하여 측정할 수 있다. (ODx/ODy)로 표현할 수 있는데, 이때 x 및 y는 각각 특정 파장을 나타낸다. 측정되는 파장은 분석 대상물질의 종류 및 금속 나노입자의 종류 등에 따라 달라질 수 있다.
상기 단계에서 검출 대상물질의 농도가 높을 경우 흡광도는 증가하고, 검출 대상물질의 농도가 낮을 경우 흡광도는 감소한다.
일 구체예에서, 분석 대상물질로 비스페놀 A(BPA)를 사용할 경우 흡광도는 (OD650/OD530)로 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 검출 대상물질을 정량화하는 방법은 제공할 수 있다.
상기 정량화 방법은 전술한 검출 방법을 사용할 수 있는데, 구체적으로 검출 대상물질의 농도에 따른 형광값 및 흡광도를 측정하고,
상기 형광값 및 흡광도를 사용하여 하기 식 1의 형광·흡광도를 계산하며, 농도에 따른 형광·흡광도의 변화를 검출 대상물질의 정량을 위한 표준곡선으로 사용하여 검출 대상물질을 정량화할 수 있다.
<식 1>
형광·흡광도 = {(ODx/ODy)n - (ODx/ODy)o} / (Fn/Fo)
상기 식 1에서 ODx는 x nm에서의 흡광도를 나타내고, ODy 는 y nm에서의 흡광도를 나타내며, (ODx/ODy)o와 Fo는 각각 검출 대상물질을 포함하지 않는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타내고(예 w.o.EDC 샘플), (ODx/ODy)n과 Fn은 각각 검출 대상물질을 포함하는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타낸다.
상기 형광 및 흡광도에서 측정 파장은 검출 대상물질의 종류 및 금속 나노입자의 종류 등에 따라 달라질 수 있다.
일 구체예에서, 분석 대상물질로 비스페놀 A(BPA)를 사용할 경우 하기 식 2에 따라 형광·흡광도를 계산할 수 있다.
<식 2>
형광·흡광도 = {(OD650/OD530)n - (OD650/OD530)o } / (Fn/Fo)
상기 식 2에서 OD650은 650 nm에서의 흡광도를 나타내고, OD530는 530 nm에서의 흡광도를 나타내며, (ODx/ODy)0와 FO는 각각 비스페놀 A를 포함하지 않는 시료의 흡광 도의 비율 및 형광값을 나타내고(예 w.o.EDC 샘플), (ODx/ODy)n과 Fn은 각각 비스페놀 A를 포함하는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타낸다.
본 발명에서는 분석 대상물질을 포함하는 시료의 분석 대상물질의 농도를 측정하기 위하여, 상기 시료의 형광·흡광도를 계산하고, 이를 전술한 표준곡선에 대입하여 상기 분석 대상물질의 농도를 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 검출 대상물질의 검출 및 정량을 위한 키트를 제공한다.
상기 키트는 압타머-금속 나노입자 복합체 및 형광 염료를 포함한다. 상기 키트에서 압타머는 검출 대상물질과 특이적으로 결합가능하며, 상기 형광 염료는 압타머와 결합할 때 형광을 나타낼 수 있다.
본 발명에서는 상기 키트를 사용하고, 전술한 검출 및 정량 방법을 통해 분석 대상물질을 검출 및 정량할 수 있다.
실시예
제조예 1. 금 나노입자 합성
하기 방법을 통해 금 나노입자를 합성하였다.
둥근바닥 플라스크는 왕수(염산 9 ml, 질산 1 ml)로 세척하여 준비하였다. HAuCl4 파우더(sigma aldrich)는 300 mM농도로 준비했으며, 구연산 나트륨(Sodium citrate)은 2%로 준비했다.
DW 55 ml에 마그네틱 바를 넣고 후드 안에서 핫플레이트로 물을 끓였다. 물이 끓기 시작하면 HAuCl4 100 ul를 넣고, 10 초 후에 구연산 나트륨 1 ml를 넣었다. 약 15 분 동안 용액이 와인 색으로 붉게 변할 때까지 기다렸다. 색이 붉게 변하면 열원을 제거하고 상온에서 식힌 뒤 4℃에서 보관하여 금 나노입자를 최종 합성하였다.
금 나노입자의 크기는 scatteroscope를 이용하여 측정되었다. 큐벳에 상기 제조된 용액 100 ul씩 넣어 5분 동안 측정하였으며, 총 5회 측정하고 그 평균을 구했다.
그 결과, 입경은 약 28.34 nm이고, 농도는 약 0.85 nM인 금 나노입자 50 ml을 합성한 것으로 계산되었다.
제조예 2. 압타머 서열
본 발명에서 사용되는 압타머의 서열은 하기와 같다.
개량된 압타머 ( 44mer , Truncated aptamer ): 5'-CGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCG-3'
Full Lenth BPA aptamer ( 63mer ); Oligonucleotides 2011, 21(2);85: 5'-CCG GTG GGT GGT CAG GTG GGA TAG CGT TCC GCG TAT GGC CCA GCG CAT CAC GGG TTC GCA CCA-3'
상기 본 발명에서 사용되는 압타머는 비스페놀 A에 결합가능한 BPA 압타머로 도 2와 같다.
상기 압타머는 95℃에서 10 분 동안 끓이고 얼음에서 10 분 동안 빠르게 식혀서 준비하였다.
실험예 1. 비스페놀 A 검출
(1) 방법
100 uM 압타머(제조예 2의 개량된 압타머), 3차 증류수, 20 mM Tris buffer(Tris HCl, pH7.4), 금 나노입자(제조예 1에 의해 제조), 비스페놀 A, 100X SYBR Green I 및 4X PBS를 준비하였다.
비스페놀 A는 100 mM 농도로 100% 에탄올에 용해되었으며, 사용 전에 3차 증류수에 희석하였다. 100X SYBR Green I의 경우 10000X로 구매한 시약을 100X로 DMSO에 희석하여 냉동 보관하였으며, 사용 전에 상온에서 녹여 사용하였다.
금 나노입자 150 ul, Tris buffer 40 ul 및 압타머 0.6 ul의 비율로 모든 웰에 들어갈 양을 미리 섞어준 뒤, 투명 96-웰플레이트에 190 ul씩 분주하였다. 그 후, 분석할 비스페놀 A 시료를 10 ul씩 첨가하였다(Toatal volume 200 ul에 분석 시료 10 ul).
10 분 동안 상온(Room temp)에서 기다린 뒤에, SYBR을 1X로 증류수에 희석하여 100 ul씩 첨가하고 섞어주었다. 그리고 바로 Varioscan(Thermo)로 형광을 측정하였다. 형광 측정은 485 nm으로 여기(excitation)하여 505 nm에서 600 nm까지 측정하였다(525nm에서 peak).
측정이 끝난 샘플에 4X PBS를 10 ul씩 넣고 색이 더 이상 변하지 않을 때까지 기다렸다(5-15분). Varioscan(Thermo)에서 450 nm에서 800 nm까지 흡광도를 측정하였다.
(2) 결과
형광·흡광도(y)는 하기 식으로 계산하였다.
y = {(OD650/OD530)n - (OD650/OD530)o} / (Fn/Fo)
본 발명에서 도 1은 본 발명에 따른 비스페놀 A의 검출 방법을 나타내는 모식도로, 도 1에 나타난 바와 같이, 비스페놀 A가 많을수록 형광은 감소하고, 흡광도 A650/A530은 증가한다. 반면에, 비스페놀 A가 없으면 형광이 크고, A650/A530 값은 작은 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 압타머와 금 나노입자 간의 농도비율 적합성 측정
(1) 방법
투명 96-웰플레이트에 금 나노입자를 160 ul씩 넣고, 최종 농도(Final concentration)가 0 내지 1000 nM이 되도록 압타머(개량된 압타머 및 Full lenth 압타머 사용)를 넣어주었다. 최종 부피는 200 ul이며 나머지는 DW로 맞춰주었다. 10분 동안 바인딩 시킨 뒤 12.5 mM NaCl 용액으로 금을 응집시키고, 색이 더이상 변하지 않을 때까지 10분정도 기다렸다. 색이 변하면 Varioscan(Thermo)를 이용해 450 nm 내지 800 nm까지 흡광도를 측정하여 색을 분석하였다.
(2) 결과
결과는 흡광도의 비율로 분석하였다(도 3 참조).
금 나노입자가 응집되면 푸른색으로 바뀌게 되는데, 금 나노입자의 흡광도는 520 nm에서 내려가고 620 nm 에서 증가하였다. 이를 통해, 개량된 압타머의 경우 400 nM이면 금을 완전히 보호할 수 있으나, Full lenth 압타머의 경우 1000 nM가 되어야 금을 완전히 보호할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
즉, 개량된 압타머가 Full lenth 압타머보다 금을 보호하는 능력이 우수함을 확인할 수 있다.
실험예 3. 비스페놀 A에 대한 압타머 - 금나노입자의 반응 조사
(1) 방법
100 uM 압타머(제조예 2의 개량된 압타머), 3차 증류수, 20 mM Tris buffer(Tris HCl, pH7.4), 금 나노입자(제조예 1에 의해 제조), 비스페놀 A 및 1M NaCl을 준비하였다.
비스페놀 A는 100 mM 농도로 100% 에탄올에 용해되었으며, 사용 전에 3차 증류수에 희석하였다.
구체적으로, 금 나노입자 150 ul, Tris buffer(pH 7.4) 40 ul, 압타머 0.6 ul의 비율로 모든 웰에 들어갈 양을 미리 섞어준 뒤, 투명 96-웰 플레이트에 190 ul씩 분주하였다. 그 후, 분석할 환경호르몬(비스페놀 A) 샘플을 10 ul씩 첨가하였다. 10분 동안 상온(Room temp)에서 기다린 뒤에, 1M NaCl 10 ul씩을 넣고 색이 더 이상 변하지 않을 때까지 15분 동안 상온(Room temp)에서 기다린 다음, Scatteroscope I (K-ONE)과 암시야 광학 현미경(CytoViva)으로 금 나노입자의 크기를 측정하였다.
한편, 비스페놀 A 대신 DW만 들어간 실험군과, 2000 ng/mL 농도의 비스페놀 A를 첨가한 실험군을 준비하였다. 또한, 압타머와 염이 없는 대조군을 준비하였다. 상기 압타머 또는 염이 없는 대조군은 물을 넣고 실험을 진행하였다.
(2) 결과
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4-1은 비스페놀 A의 유무에 따른 금나노입자의 크기를 측정한 결과이고, 도 4-2는 비스페놀 A의 유무에 따른 금나노입자의 크기를 현미경으로 촬영한 결과이다.
상기 비스페놀 A를 실험군은 농도를 1.00 X 102 ng/ml으로 하였다.
상기 도를 통해 본 발명에 따른 방법이 1.00 X 102 ng/ml의 비스페놀 A의 존재 하에 염에 의해 크기가 변함을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명은 비스페놀 A를 효과적으로 감지하여 검출할 수 있다.
실험예 4. 비스페놀 A 정량분석 및 특이성 조사
(1) 방법
100 uM 압타머(제조예 2의 개량된 압타머), 3차 증류수, 20 mM Tris buffer(Tris HCl, pH7.4), 금 나노입자(제조예 1에 의해 제조), 환경호르몬(BPA, BPS, BPF, 프탈레이트), 100X SYBR Green I 및 4X PBS를 준비하였다.
모든 환경호르몬은 100 mM 농도로 100% 에탄올에 용해되었으며, 사용 전에 3차 증류수에 희석하였다. 100X SYBR Green I의 경우 10000X로 구매한 시약을 100X로 DMSO에 희석하여 냉동보관하였으며, 사용 전에 상온에서 녹였다.
환경호르몬이 들어가지 않고 DW만 들어간 것과, 환경호르몬의 농도가 1.00 X 10-2 ng/ml 부터 100 배씩 차이 나는 농도로 1.00 X 104 ng/ml(1.00E-2 ng/ml 부터 1.00E+4 ng/ml)까지인 실험군을 준비하였다. 또한, 압타머가 없는 대조군을 준비하였다. 상기 압타머가 없는 대조군은 물을 넣고 실험을 진행하였다.
구체적으로, 금 나노입자 150 ul, Tris buffer(pH 7.4) 40 ul, 압타머 0.6 ul의 비율로 모든 웰에 들어갈 양을 미리 섞어준 뒤, 투명 96-웰플레이트에 190 ul씩 분주하였다. 그 후, 분석할 환경호르몬 샘플을 10 ul씩 첨가하였다. 10분 동안 상온(Room temp)에서 기다린 뒤에, SYBR을 1X로 증류수에 희석하여 100 ul씩 첨가하고 섞어주었다. 그리고 바로 Varioscan(Thermo)로 형광을 측정하였다.
형광 측정은 485 nm로 여기(excitation)하여 505 nm에서 600 nm까지 측정하였다. 측정이 끝난 샘플에 4X PBS를 10 ul씩 넣고 색이 더 이상 변하지 않을 때까지 기다렸다(5-15분). Varioscan(Thermo)에서 450 nm에서 800 nm까지 흡광도를 측정하였다.
(2) 결과
그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
상기 도 5 및 6에서 형광·흡광도는 {(OD650/OD530)n - (OD650/OD530)o} / (Fn/Fo)로 계산하였다. 또한, 그래프를 log scale로 나타내기 위해 0을 제외하고 그래프로 나타내어 분석하였다.
도 5는 농도별 비스페놀 A를 측정한 결과이다. 상기 비스페놀 A를 측정시에는 농도를 1.00 X 10-3 ng/ml 부터 1.00 X 101 ng/ml로 하였다.
상기 도를 통해 본 발명에 따른 방법이 0.001 ng/ml 에서 10 ng/ml까지의 비스페놀 A를 검출할 수 있을 뿐 아니라, 정량적으로 측정할 수 있는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 방법은 저농도의 비스페놀 A를 효과적으로 감지할 수 있으며, 이를 표준곡선으로 이용하여 미지의 시료 중의 비스페놀 A를 검출할 수 있다.
또한, 도 6은 여러 종류의 환경호르몬을 측정한 결과이다.
상기 도를 통해 본 발명에 따른 방법이 비스페놀 A를 선택적으로 측정할 수 있음을 확인할 수 있다. 단, 다른 비슷한 구조의 환경호르몬에 대해서도 비스페놀 A보다는 약하지만 반응성을 가지는 것을 확인할 수 있다.
실험예 5. 영수증을 이용한 비스페놀 A 측정
(1) 방법
영수증 샘플은 비스페놀 A가 포함된 일반 영수증(Normal)과 포함되지 않은 영수증 전사용지(BPA free)를 사용하였다.
3차 증류수 48 ml에 10 cm x 4 cm의 영수증 용지를 넣고 30분 동안 상온(room temp.)에서 녹여냈다. 상기 영수증 샘플은 다시 3차 증류수로 1/500으로 희석하여 준비하였고, 10 ul를 검출용으로 사용하였다(도 11).
BPA 측정 방법은 실험예 3과 동일한 방법과 동일한 방법으로 실험했으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
(2) 결과
Normal 영수증 및 BPA free 영수증의 형광·흡광도를 계산하여 도 7에 그래프로 나타내었다
그리고, 계산된 형광·흡광도를 실험예 3에서 제시된 표준곡선에 대입하여 농도를 계산한 결과, Normal 영수증은 비스페놀 A의 농도가 6.68 ng/ml로 측정되었다. 이를 희석한 만큼 곱해준 결과 실제 농도는 6.68(ng/ml) X 500 X 20으로 66,800 ng/ml, 즉, 66.8 ug/ml인 것으로 계산되었다.
상기 비스페놀 A가 포함된 일반 영수증(Normal)을 HPLC로 측정한 결과(도 8 참조), 그 농도는 61 ug/ml로 측정되었다.
즉, 본 발명에 따른 비스페놀 A 방법은 HPLC 측정과 유사한 정도의 높은 정확도를 가지는 것으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명에 따른 검출 대상물질의 검출 및 정량 방법이 검출 대상물질의 농도 정량에 효과적이며, 빠른 시간 내에 정량할 수 있는 것을 확인할 수 있다.
한편, BPA Free 영수증의 경우에는 같은 계산법으로 계산시, 측정 범위보다 낮은 값을 가지는 것으로 나타났다.
비교- 실험예 1. FAM- 압타머를 이용한 비스페놀 A 측정
(1) 방법
100 uM 압타머, 3차 증류수, 20 mM Tris-HCl buffer(pH7.4) 40ul, citrate-금 나노입자, BPA 및 4X PBS를 준비하였다. 이때 압타머는 제조예 2의 개량된 압타머에 형광이 부착된 FAM 압타머이다.
금 나노입자 150 ul, Tris buffer 40 ul 및 FAM-압타머 0.6 ul의 비율로 형광 압타머 코팅된 금 나노입자를 준비하고, 투명 96-웰플레이트에 190 ul씩 분주하였다. 그 후, 분석할 비스페놀 A(BPA) 샘플을 10 ul씩 첨가하였다(Toatal volume 200 ul에 분석 샘플 10 ul).
30 분 동안 상온(Room temp)에서 기다린 뒤에, 4X PBS 10 ul를 넣고 금 나노입자가 응집되어 색이 변하도록 10 내지 15분 기다렸다. 색이 완전히 변하면 Varioscan(Thermo)에서 450 nm 내지 800 nm 흡광도와 485 nm에서 여기(excitation)시켜 520 nm에서 최대 형광을 나타내는 FAM의 형광세기를 측정하였다.
(2) 결과
상기 측정 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 형광의 일반화 식은 F=Fn-F0/F0를 이용하였다. 이때, Fn은 실험군의 520 nm에서의 형광값이고, F0는 BPA가 없는 샘플의 520 nm에서의 형광값이다.
BPA의 농도가 높아질수록 형광-압타머가 BPA와 결합하여 금 나노입자로부터 떨어지게 되며, 압타머의 형광(FAM)이 금 나노입자의 quenching 효과로부터 벗어나게 되면서 형광세기가 증가하게 된다.
비교- 실험예 2. FAM 압타머를 이용한 영수증 샘플의 비스페놀 A 측정
(1) 방법
실험예 4와 동일한 종류의 영수증(Normal(BPA) 및 BPA free)을 사용하였다. 상기 10 cm X 4 cm의 영수증을 물 48 ml에 넣고 30 분 동안 환경호르몬을 녹여냈으며, 물을 이용해 1/250으로 희석하여 측정에 사용하였다.
비스페놀 A 측정 시험은 표준시약을 사용한 실험 방법과 동일하게 진행하였다. 즉, 표준농도의 BPA 10 ul 대신 영수증 샘플 10 ul를 넣고 실험을 진행하였다.
(2) 결과
측정된 형광세기를 표준시약을 이용해 얻은 그래프(도 9 가운데 그래프)에 대입하여 Normal 영수증에 포함된 BPA의 농도를 계산하였다.
계산 결과 BPA의 농도는 323.4 ug/ml로 측정되었다.
이는 HPLC로 측정한 결과(농도: 61 ug/ml)와 매우 큰 차이를 가지는 것이다.
즉, FAM-압타머를 이용하며, 형광 염료를 사용하지 않는 비교-실험예는 본 발명에 따른 방법과 비교하여 정확도 및 민감도가 매우 떨어지는 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 방법의 경우 형광과 흡광이 독립적으로 측정되며, 형광 X 흡광 방식의 기존과 다른 분석 방법을 통해 형광과 흡광 신호가 상호 보완되어 분석의 정확성을 높일 수 있다.

Claims (13)

  1. (A) 검출 대상물질을 포함하는 시료와 압타머-금속 나노입자 복합체를 반응시키는 단계로,
    압타머-금속 나노입자 복합체는 검출 대상물질과 반응하여 상기 복합체로부터 압타머가 분리되고, 상기 분리된 압타머는 검출 대상물질과 결합하여 압타머-검출 대상물질 복합체를 형성하는 단계;
    (B) 상기 단계 (A)의 반응물에 형광 염료를 첨가하고 형광을 측정하는 단계로,
    압타머-검출 대상물질 복합체는 형광 염료와 반응하지 않아 형광이 생성되지 않고, 압타머-금속 나노입자 복합체는 형광 염료와 반응하여 압타머가 분리되고, 상기 분리된 압타머가 형광 염료와 결합하여 나타내는 형광을 측정하는 단계; 및
    (C) 상기 단계 (B)의 반응물에 염을 첨가하고 흡광도를 측정하는 단계로,
    압타머와 결합을 형성하지 않은 금속 나노입자가 응집하여 색의 변화를 나타내고, 상기 색의 변화를 흡광도로 측정하는 단계를 포함하는 검출 대상물질의 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    검출 대상물질은 비스페놀 A(BPA), 비스페놀 S(BPS), 비스페놀 F(BPF), 베타 에스트라디올, 프탈레이트 또는 트롬빈인 검출 대상물질의 검출방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    검출 대상물질의 농도는 0.001 내지 10,000 ng/ml인 검출 대상물질의 검출방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    금속 나노입자에서 금속은 금 또는 은인 검출 대상물질의 검출방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    형광 염료는 SYBR Green, Gel Red 또는 Gel green인 검출 대상물질의 검출방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    염은 염화나트륨인 검출 대상물질의 검출방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 따른 방법을 사용하여 검출 대상물질의 농도에 따른 형광값 및 흡광도를 측정하고,
    상기 형광값 및 흡광도를 사용하여 하기 식 1의 형광·흡광도를 계산하며,
    농도에 따른 형광·흡광도의 변화를 검출 대상물질의 정량을 위한 표준곡선으로 사용하는 검출 대상물질의 정량 방법:

    <식 1>
    형광·흡광도 = {(ODx/ODy)n - (ODx/ODy)o} / (Fn/Fo)

    상기 식 1에서 ODx는 x nm에서의 흡광도를 나타내고, ODy 는 y nm에서의 흡광도를 나타내며, (ODx/ODy)o와 Fo는 각각 검출 대상물질을 포함하지 않는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타내고, (ODx/ODy)n과 Fn은 각각 검출 대상물질을 포함하는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타낸다.
  11. 제 10 항에 있어서,
    검출대상물질이 비스페놀 A일 경우 형광·흡광도는 하기 식2로 계산되는 검출 대상물질의 정량 방법:

    <식 2>
    형광·흡광도 = {(OD650/OD530)n - (OD650/OD530)o} / (Fn/Fo)

    상기 식 2에서 OD650은 650 nm에서의 흡광도를 나타내고, OD530는 530 nm에서의 흡광도를 나타내며, (ODx/ODy)0와 FO는 각각 비스페놀 A를 포함하지 않는 시료의 흡광 도의 비율 및 형광값을 나타내고, (ODx/ODy)n과 Fn은 각각 비스페놀 A를 포함하는 시료의 흡광도의 비율 및 형광값을 나타낸다.
  12. 제 10 항에 있어서,
    검출 대상물질을 포함하는 시료의 형광·흡광도를 계산하고, 이를 표준곡선에 대입하여 시료 중의 분석 대상물질의 농도를 도출하는 검출 대상물질의 정량 방법.
  13. 삭제
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