KR102254600B1 - Method for separating epithelial cell having improved recovery of stem cell - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 간세포 회수율이 향상된 상피세포 분리방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for separating epithelial cells with improved hepatocyte recovery rate.
피부는 표피, 진피, 피하조직으로 구성되었으며, 외부환경으로부터 몸을 보호하는 필수장벽이다. 표피의 90%이상은 각질세포로 구성되었으며, 각질세포의 전구 세포인 간세포는 표피의 재생과 정상적인 구조, 기능을 유지하는데 필수적이다. The skin is composed of epidermis, dermis, and subcutaneous tissue, and is an essential barrier to protect the body from the external environment. More than 90% of the epidermis is composed of keratinocytes, and hepatocytes, which are progenitor cells of keratinocytes, are essential for the regeneration of the epidermis and maintaining its normal structure and function.
피부조직 중 표피와 진피를 단단하게 결합할 수 있도록 기저층에는 기저막이 존재한다. 이 기저층에 있는 간세포가 세포분열을 반복하며, 세포는 점차 표피층으로 이동하고, 표피의 가장 상층부에 도달하면 케라틴만 남아 각질층을 형성한다.Among the skin tissues, a basement membrane exists in the base layer so that the epidermis and the dermis can be tightly bonded. The hepatocytes in the base layer repeat cell division, and the cells gradually move to the epidermal layer, and when reaching the uppermost layer of the epidermis, only keratin remains to form the stratum corneum.
피부각질세포를 배양하기 위해서는 피부를 분리할 때 간세포의 회수율을 높이는 것이 중요하다.In order to cultivate skin keratinocytes, it is important to increase the recovery rate of hepatocytes when separating the skin.
그런데, 기존의 피부 분리방법은 물리적 자극 등으로 인해 간세포 회수율이 높지 않았다. However, the conventional skin separation method did not have a high hepatocyte recovery rate due to physical stimulation or the like.
본 발명은 간세포 회수율이 향상된 상피세포 분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide a method for separating epithelial cells with improved hepatocyte recovery rate.
상기 본 발명의 목적은 간세포 회수율이 향상된 상피세포 분리방법에 있어서, 상피세포로부터 표피와 진피를 분리하여 얻는 단계; 상기 진피를 세포 분리하는 단계를 포함하며, 상기 진피의 세포 분리는, 상기 진피를 트립신/EDTA를 포함하는 용액으로 처리하는 단계, 처리된 진피를 우태아혈청이 포함된 배양배지로 트립신/EDTA의 효과를 중단시키는 중단 단계; 및 중단 상태에서 자기교반하는 교반 단계를 포함하는 것에 의해 달성된다.The object of the present invention is to provide a method for separating epithelial cells with improved hepatocyte recovery, the method comprising: obtaining by separating the epidermis and the dermis from the epithelial cells; Including the step of separating the cells of the dermis, the cell separation of the dermis, the step of treating the dermis with a solution containing trypsin/EDTA, the treated dermis with a culture medium containing fetal calf serum, of trypsin/EDTA. A cessation step to stop the effect; And a stirring step of magnetic stirring in the stopped state.
상기 진피의 세포 분리는, 상기 교반 단계 후에 상기 배양배지를 회수하고, 상기 중단 단계 및 상기 교반 단계를 반복하는 반복단계를 더 포함할 수 있다.Separation of the cells of the dermis may further include a repeating step of recovering the culture medium after the stirring step, and repeating the stopping step and the stirring step.
상기 진피의 세포 분리에 있어서, 상기 우태아혈청이 포함된 배양배지에서 우태아혈청은 3 내지 7w/v%이며, 상기 트립신/EDTA 용액에서 트립신은 0.2 내지 0.3w/v%이고 EDTA는 0.01 내지 0.03w/v%일 수 있다.In the separation of cells from the dermis, in the culture medium containing fetal bovine serum, fetal bovine serum is 3 to 7 w/v%, in the trypsin/EDTA solution, trypsin is 0.2 to 0.3 w/v%, and EDTA is 0.01 to It may be 0.03w/v%.
상기 표피를 세포 분리하는 단계를 더 포함하며, 상기 표피의 세포 분리는, 상기 표피를 트립신/EDTA를 포함하는 용액에 처리하는 용액 처리 단계; 자기교반을 수행하지 않고 상기 트립신/EDTA 용액으로 처리된 상기 표피를 팁핑하는 팁핑 단계; 및 팁핑 이후 상기 트립신/EDTA 용액을 표피에서 분리하고, 우태아혈청이 포함된 배양배지를 상기 트립신/EDTA 용액에 가하여 트립신/EDTA의 효과를 중단시키는 중단 단계를 포함할 수 있다.It further comprises the step of separating the cells of the epidermis, wherein the cell separation of the epidermis comprises: a solution treatment step of treating the epidermis with a solution containing trypsin/EDTA; A tipping step of tipping the epidermis treated with the trypsin/EDTA solution without performing magnetic stirring; And a stopping step of separating the trypsin/EDTA solution from the epidermis after tipping, and stopping the effect of trypsin/EDTA by adding a culture medium containing fetal calf serum to the trypsin/EDTA solution.
상기 표피의 세포 분리는, 트립신/EDTA 용액에서 분리된 상기 표피에 대해, 상기 용액처리단계, 상기 팁핑 단계 및 상기 중단 단계를 반복할 수 있다.Cell separation of the epidermis may be performed by repeating the solution treatment step, the tipping step, and the stopping step for the epidermis separated from the trypsin/EDTA solution.
표피의 세포 분리에 있어서, 상기 우태아혈청이 포함된 배양배지에서 우태아혈청은 3 내지 7w/v%이며, 상기 트립신/EDTA 용액에서 트립신은 0.2 내지 0.3w/v%이고 EDTA는 0.01 내지 0.03w/v%일 수 있다.In the separation of cells from the epidermis, in the culture medium containing fetal bovine serum, fetal bovine serum is 3 to 7 w/v%, in the trypsin/EDTA solution, trypsin is 0.2 to 0.3 w/v%, and EDTA is 0.01 to 0.03 It may be w/v%.
본 발명에 따르면 간세포 회수율이 향상된 상피세포 분리방법이 제공된다.According to the present invention, a method for separating epithelial cells with improved hepatocyte recovery rate is provided.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 상피세포 분리방법의 순서도이고,
도 2는 본 발명의 실험예에서 세포 획득율을 비교한 그래프이고,
도 3은 본 발명의 실험예에서 p63 및 인볼루크린 발현을 나타낸 것이고,
도 4는 본 발명의 실험예에서 콜로니 형성 효율을 나타낸 것이다.1 is a flow chart of a method for separating epithelial cells according to an embodiment of the present invention,
Figure 2 is a graph comparing the cell acquisition rate in the experimental example of the present invention,
Figure 3 shows the expression of p63 and involukrin in the experimental example of the present invention,
Figure 4 shows the colony formation efficiency in the experimental example of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 실시예는 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공하는 것이다. 도면에서의 요소의 형상 등은 보다 명확한 설명을 위하여 과장되게 표현된 부분이 있을 수 있으며, 도면상에서 동일 부호로 표시된 요소는 동일 요소를 의미한다.Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, this embodiment is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various forms, only this embodiment makes the disclosure of the present invention complete, and the scope of the invention is given to those of ordinary skill in the art. It is provided to be fully informed. The shapes of elements in the drawings may be exaggerated for a more clear description, and elements indicated by the same reference numerals in the drawings refer to the same elements.
이하 본 발명에서는 상피세포로 피부를 예시하여 설명하나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.Hereinafter, in the present invention, the skin is exemplified by epithelial cells, but the present invention is not limited thereto.
도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 상피세포의 처리방법을 설명한다.A method of treating epithelial cells according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 1.
먼저 피부로부터 표피와 진피를 분리하여 얻는다(S100).First, it is obtained by separating the epidermis and the dermis from the skin (S100).
피부는, 이에 한정되지 않으나, 서혜부, 허벅지, 가슴 또는 포피의 피부일 수 있다.The skin may be, but is not limited to, the skin of the groin, thigh, chest, or foreskin.
표피와 진피는 통상의 방법을 따라 얻을 수 있다. 예를 들어, 피부에서 멸균한 외과용 가위로 피하(subcutaneous)지방조직을 진피로부터 제거하고, 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 인산완충용액(PBS)으로 세척한다. 세척한 피부조직을 잘게 자르고, 조직조각들을 디스페이즈Ⅱ용액으로 처리하고, DPBS로 세척 후 진피와 표피를 분리할 수 있다.The epidermis and dermis can be obtained according to conventional methods. For example, subcutaneous adipose tissue is removed from the dermis with sterilized surgical scissors from the skin, and washed with a phosphate buffer solution (PBS) containing penicillin/streptomycin. The washed skin tissue is cut finely, the tissue pieces are treated with Disphase II solution, and after washing with DPBS, the dermis and the epidermis can be separated.
이후, 진피와 표피 각각에 대해 세포 분리를 진행한다.Thereafter, cell separation is performed for each of the dermis and epidermis.
먼저 진피의 세포 분리에 대해 설명하면 다음과 같다.First, the cell separation of the dermis will be described as follows.
진피를 트립신/EDTA 용액으로 처리한다(S210).The dermis is treated with a trypsin/EDTA solution (S210).
이 때, 진피는 가위 등을 이용하여 잘게 잘라진 상태일 수 있다. 트립신/EDTA 용액에서 트립신농도는 0.2w/v% 내지 0.3w/v%이고 EDTA는 0.01w/v% 내지 0.03w/v%일 수 있다.At this time, the dermis may be finely cut using scissors or the like. The trypsin concentration in the trypsin/EDTA solution may be 0.2w/v% to 0.3w/v%, and the EDTA may be 0.01w/v% to 0.03w/v%.
처리는 진피를 트립신/EDTA 용액에 일정시간 넣어 두는 것으로 수행될 수 있다. 이에 한정되지는 않지만 상온에서 5분 내지 20분 동안 수행될 수 있다.Treatment can be carried out by placing the dermis in a trypsin/EDTA solution for a certain period of time. Although not limited thereto, it may be performed for 5 to 20 minutes at room temperature.
이후 우태아혈청을 포함하는 배양배지를 이용하여 트립신/EDTA의 효과를 중단시킨다(S220). 이때 우태아혈청은 농도는 3w/v% 내지 7w/v%일 수 있다.Thereafter, the effect of trypsin/EDTA is stopped using a culture medium containing fetal calf serum (S220). At this time, the concentration of fetal calf serum may be 3w/v% to 7w/v%.
다음으로 트립신/EDTA 효과가 중단된 상태에서 자기교반(S230)한다. 본 발명에서의 자기교반은 마그네틱바를 이용한 교반을 의미한다. 자기교반은 상온에서 1시간-3시간 동안, 100rpm 내지 500rpm으로 수행될 수 있다. Next, self-stirring (S230) is performed while the trypsin/EDTA effect is stopped. Magnetic stirring in the present invention means stirring using a magnetic bar. Magnetic stirring may be performed at room temperature for 1 hour to 3 hours, at 100 rpm to 500 rpm.
피부조직을 트립신이 들어있는 상태에서 교반하게 되면 트립신이 피부조직으로 침투를 촉진한다. 세포는 빠른 시간에 침투된 트립신에 장시간 노출되기 때문에 트립신에 의한 세포손상이 빠르게 진행된다. 또한 자기교반을 수행하면 물리적 손상까지 발생한다. 본 발명에서는 우태아혈청이 포함된 배양배지를 이용해 트립신반응을 정지시킨 상태로 자기교반을 진행하기 때문에 트립신에 의한 손상을 최소화할 수 있다.When the skin tissue is stirred with trypsin in it, trypsin promotes penetration into the skin tissue. Cells are exposed to trypsin that penetrated quickly for a long time, so cell damage by trypsin proceeds rapidly. In addition, when magnetic stirring is performed, even physical damage occurs. In the present invention, since the trypsin reaction is stopped using a culture medium containing fetal calf serum, magnetic stirring is performed, so that damage caused by trypsin can be minimized.
이후 배양배지를 회수한다(S240). 자기교반 후에 진피는 가라앉는데, 피펫 등을 이용하여 상청액인 배양배지를 회수한다. 회수된 배양배지는 셀 스트레이너를 통과시킨 후 별도로 회수해 모은다.Then, the culture medium is recovered (S240). After self-stirring, the dermis subsides, and the culture medium, which is the supernatant, is collected using a pipette or the like. The recovered culture medium is collected and collected separately after passing through a cell strainer.
이후 남아있는 진피에 대해 효과 중단(S220), 자기교반(S230) 및 배양배지 회수(S240)를 1-4회 추가로 반복해 회수된 배양배지를 모은다.After that, for the remaining dermis, the effect is stopped (S220), magnetic stirring (S230) and culture medium recovery (S240) are repeated 1-4 times to collect the recovered culture medium.
다음으로 표피의 세포 분리에 대해 설명하면 다음과 같다.Next, the cell separation of the epidermis will be described as follows.
표피를 트립신/EDTA 용액으로 처리한다(S310).The epidermis is treated with a trypsin/EDTA solution (S310).
이 때, 표피는 가위 등을 이용하여 잘게 잘라진 상태일 수 있다. 트립신/EDTA 용액에서 트립신농도는 0.2w/v% 내지 0.3w/v%이고 EDTA는 0.01w/v% 내지 0.03w/v%일 수 있다.At this time, the epidermis may be finely cut using scissors or the like. The trypsin concentration in the trypsin/EDTA solution may be 0.2w/v% to 0.3w/v%, and the EDTA may be 0.01w/v% to 0.03w/v%.
처리는 트립신/EDTA 용액 내의 표피를 팁핑(S320)하여 이루어진다. 처리온도는 상온일 수 있다.The treatment is performed by tipping the epidermis in the trypsin/EDTA solution (S320). The treatment temperature may be room temperature.
본 발명에서의 '팁핑"은 피펫팁 등을 이용하여 휘젓는 방식으로 나타낸다. 휘젓는 방식은, 이에 한정되지 않으나, 시계방향과 반시계방향 각각 약 5회-10회 정도 휘젓는 방식일 수 있다."Tiping" in the present invention is represented by a method of stirring using a pipette tip, etc. The method of stirring is not limited thereto, but may be a method of stirring about 5 to 10 times each in a clockwise direction and a counterclockwise direction.
즉, 본 발명에서는 표피에 대해서는 자기교반을 수행하지 않는다. That is, in the present invention, magnetic stirring is not performed on the epidermis.
표피에서는 자기교반을 수행하지 않고 비교적 교반조건이 완화된 팁핑을 수행하여 트립신 침투는 촉진시키지만 물리적손상은 감소시킨다.In the epidermis, self-stirring is not performed, and the tipping with relatively relaxed agitation conditions is performed to promote trypsin penetration but reduce physical damage.
이후 세포배양기에서 반응시킨다(S320). 세포막에 있는 부착단백질 분해를 위한 트립신 반응은 트립신의 활성이 우수한 온도인 35℃ 내지 39℃에서 1분 내지 5분간 세포배양기에서 수행될 수 있다.Then, it is reacted in the cell incubator (S320). The trypsin reaction for decomposition of adherent proteins in the cell membrane may be performed in a cell incubator for 1 minute to 5 minutes at 35°C to 39°C, which is an excellent temperature for trypsin activity.
이후 피펫 등을 이용해 트립신/EDTA를 회수(S330)하고 우태아혈청을 포함하는 배양배지를 이용하여 회수된 트립신/EDTA의 효과를 중단시킨다(S340). 이때 우태아혈청은 농도는 3w/v% 내지 7w/v%일 수 있다.Thereafter, trypsin/EDTA is recovered using a pipette or the like (S330), and the effect of the recovered trypsin/EDTA is stopped using a culture medium containing fetal calf serum (S340). At this time, the concentration of fetal calf serum may be 3w/v% to 7w/v%.
이후 남아있는 표피에 대하여 트립신/EDTA 처리(S310), 세포배양기 반응(S320), 트립신/EDTA회수(S330) 및 효과중단(S340)은 1-4회 추가로 반복 수행되면서, 효과중단된 트립신/EDTA를 모은다.Thereafter, trypsin/EDTA treatment (S310), cell incubator reaction (S320), trypsin/EDTA recovery (S330), and cessation of effect (S340) for the remaining epidermis were repeated 1-4 additional times, while the effect was interrupted trypsin/ Collect EDTA.
마지막으로 세포 분리가 수행된 진피로부터의 배양배지와 표피로부터의 트립신/EDTA 용액을 혼합하고, 원심분리후 배양 접시에 접종시킨다(S400).Finally, the culture medium from the dermis from which the cell separation was performed and the trypsin/EDTA solution from the epidermis are mixed, centrifuged, and then inoculated into a culture dish (S400).
본 발명은 이전의 세포 분리법의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 피부조직에 존재하는 간세포 손상을 최소화하고, 세포증식력이 우수한 간세포의 분리법이 제공된다.The present invention is to overcome the problems of the previous cell separation method, minimizing damage to hepatocytes present in the skin tissue, and provides a method for isolating hepatocytes having excellent cell proliferation power.
이하 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.The present invention will be described in detail through the following experimental examples.
실시예 Example
표피와 진피 분리Separation of epidermis and dermis
초기 각질세포(세포분리방법을 통해 표피와 진피에서 획득한 각질세포)를 피부조직으로부터 분리하였다. 세포분리는 외과 수술 후 24시간이내에 진행하였다. 멸균한 외과용 가위로 피하(subcutaneous)지방조직을 진피로부터 제거하고, 5% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 인산완충용액(PBS)에 8회 세척하였다. Initial keratinocytes (keratinocytes obtained from the epidermis and dermis through the cell separation method) were isolated from the skin tissue. Cell separation proceeded within 24 hours after surgery. Subcutaneous adipose tissue was removed from the dermis with sterilized surgical scissors, and washed 8 times in a phosphate buffer solution (PBS) containing 5% penicillin/streptomycin.
세척한 피부조직은 가로, 세로 2-3㎜ 조각으로 잘게 잘라주었다. 조직조각들을 13시간 동안 4℃에서 디스페이즈Ⅱ용액(DispaseⅡ solution:2.5 U/ml, Cat No. : 4942078001, Roche)을 처리하고, DPBS로 세척 후 진피와 표피를 분리하였다.The washed skin tissue was cut into pieces of 2-3 mm in length and width. Tissue fragments were treated with Dispase II solution (2.5 U/ml, Cat No.: 4942078001, Roche) at 4° C. for 13 hours, washed with DPBS, and separated from the dermis and epidermis.
진피 세포 분리Dermal cell isolation
60㎜접시에 진피조직(12㎠)을 트립신 0.25w/v%와 EDTA 0.02w/v%양이 포함된 5ml의 DPBS에 넣고, 10분간 상온에서 반응시켰다. 10분 반응 후 진피조직만 분리하여 5w/v% 우태아혈청이 포함된 배양배지(DMEM배지) 10㎖을 50㎖ 크기의 튜브에 넣고, 20분 상온에서 250rpm에서 마그네틱 자기교반했다. 20분 후 자기교반을 정지하고 바닥에 가라앉은 진피를 제외하고 상청액인 배양배지를 피펫으로 회수했다. 회수된 배양배지를 20㎛ cell strainer에 부어 세포만을 포함한 배양배지를 새로운 50ml 크기의 튜브에 회수해 모았다.In a 60mm dish, the dermal tissue (12㎠) was put in 5ml DPBS containing 0.25w/v% trypsin and 0.02w/v% EDTA, and reacted at room temperature for 10 minutes. After the reaction for 10 minutes, only the dermal tissue was isolated, and 10 ml of the culture medium (DMEM medium) containing 5w/v% fetal calf serum was placed in a 50 ml-sized tube, and magnetically magnetically stirred at 250 rpm at room temperature for 20 minutes. After 20 minutes, magnetic stirring was stopped, and the culture medium, which is the supernatant, was collected with a pipette, except for the dermis settled on the floor. The recovered culture medium was poured into a 20 μm cell strainer, and the culture medium containing only cells was collected and collected in a new 50 ml-sized tube.
남아있는 진피에 새로운 5w/v% 우태아혈청이 포함된 배양배지 10㎖을 넣고 위와 같은 과정을 2회 더 반복하면서 세포를 포함하는 배양배지를 모았다. 10 ml of the culture medium containing new 5w/v% fetal calf serum was added to the remaining dermis, and the above process was repeated two more times to collect the culture medium containing the cells.
표피 세포 분리Epidermal cell isolation
60㎜접시에 잘게 자른 피부조직에서 분리한 표피조직(12㎠)을 트립신 0.25w/v%와 EDTA 0.02w/v%양이 포함된 5ml의 DPBS에 넣고, 피펫용 팁 끝을 잡은 후 표피를 시계방향, 반시계방향 각 5회~10회 휘저은 후 2분간 37℃에서 반응시켰다. 피펫을 이용해 트립신/EDTA을 회수해 50ml 튜브에 넣고, 5ml의 5w/v% 우태혈청을 함유하는 DMEM배지와 혼합해 트립신 효과를 중단시켰다. Put the epidermal tissue (12㎠) isolated from the skin tissue cut into a 60mm dish into 5ml DPBS containing 0.25w/v% trypsin and 0.02w/v% EDTA, hold the tip for a pipette, and then remove the epidermis. The mixture was stirred for 5 to 10 times in a clockwise direction and counterclockwise direction, and then reacted at 37°C for 2 minutes. Trypsin/EDTA was collected using a pipette, placed in a 50 ml tube, and mixed with DMEM medium containing 5 ml of 5w/v% fetal calf serum to stop the trypsin effect.
남아있는 표피에 새로운 트립신/EDTA를 가하고 위 과정을 4회 더 반복하면서, 효과가 중단된 트립신/EDTA를 모았다. New trypsin/EDTA was added to the remaining epidermis, and the above process was repeated 4 more times to collect trypsin/EDTA whose effect was stopped.
이후 분리된 세포를 혼합해 원심분리 한 다음, 세포 펠렛을 KGM(Cat.No. 00192060, Lonza)에 현탁해 배양접시에 6*103/㎠으로 접종시켰다.After the separated cells were mixed and centrifuged, the cell pellet was suspended in KGM (Cat. No. 00192060, Lonza) and inoculated into a culture dish at 6*10 3 /cm 2.
이하 비교예 1 내지 3을 설명한다. 비교예 1 내지 3에서의 표피와 진피를 얻는 방법은 실시예와 동일하며, 표피와 진피의 사용량도 동일하다.Hereinafter, Comparative Examples 1 to 3 will be described. The methods of obtaining the epidermis and the dermis in Comparative Examples 1 to 3 are the same as those of the Examples, and the amount of the epidermis and the dermis is the same.
비교예 1 : 표피/진피 분리하지 않음, 효과 중단 없이 자기교반Comparative Example 1: No separation of epidermis/dermis, self-stirring without interruption of effect
표피와 진피로 분리하지 않은 피부조직을 10ml의 0.25w/v% 트립신 및 0.02w/v% EDTA에서 30분 동안 140rpm의 속도로 자기교반시켰다. 분리된 세포를 5w/v% 우태혈청을 함유하는 10ml의 DMEM배지에서 세척하여 트립신 효과를 중단시키고, 원심분리하였다. 세포 펠렛을 KGM(Cat.No. 00192060, Lonza)에 재현탁시키고, 5*103/cm2로 접종시켰다. The skin tissue that was not separated into the epidermis and the dermis was self-stirred in 10 ml of 0.25w/v% trypsin and 0.02w/v% EDTA for 30 minutes at a rate of 140 rpm. The isolated cells were washed in 10 ml of DMEM medium containing 5w/v% fetal calf serum to stop the trypsin effect and centrifuged. The cell pellet was resuspended in KGM (Cat.No. 00192060, Lonza) and inoculated at 5*10 3 /cm 2.
비교예 2 : 진피, 효과 중단 없이 자기교반 Comparative Example 2: Dermis, self-stirring without stopping the effect
진피 세포 분리Dermal cell isolation
진피조직은 트립신 0.25w/v%와 EDTA 0.02w/v%양이 포함된 5ml의 DPBS에 넣고, 10분간 상온에서 마그네틱 자기교반했다. 10분 후 트립신/EDTA를 회수해 5w/v%우태혈청이 포함된 DMEM이 들어있는 50㎖ 크기의 튜브에 옮겼다. 이후 남아있는 진피에 새로운 트립신/EDTA 용액을 가하고 위 과정을 2회 더 반복하였다.The dermal tissue was placed in 5 ml of DPBS containing 0.25w/v% trypsin and 0.02w/v% EDTA, and magnetically magnetically stirred at room temperature for 10 minutes. After 10 minutes, trypsin/EDTA was recovered and transferred to a 50 ml tube containing DMEM containing 5w/v% fetal calf serum. Then, a new trypsin/EDTA solution was added to the remaining dermis, and the above process was repeated two more times.
표피 세포 분리Epidermal cell isolation
표피는 실시예와 동일하게 처리하였다.The epidermis was treated in the same manner as in Examples.
분리한 세포를 혼합해 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 KGM(Cat.No. 00192060, Lonza)에 현탁해 배양접시에 6*103/㎠으로 접종시켰다The separated cells were mixed and centrifuged, and then the cell pellet was suspended in KGM (Cat.No. 00192060, Lonza) and inoculated in a culture dish at 6*10 3 /cm2.
비교예 3 : 표피만 사용Comparative Example 3: Using only the epidermis
실시예와 동일한 방법으로 표피를 분리하였으며, 실시예와 달리 진피는 사용하지 않았다.The epidermis was separated in the same manner as in the examples, and unlike the examples, the dermis was not used.
위에서 설명한 방법으로 얻은 실시예 및 비교예 1 내지 3에서 얻은 세포를 대상으로 세포 획득율, p63발현, 인볼루크린발현 및 콜로니 형성 효율을 실험하였다.The cells obtained in Examples and Comparative Examples 1 to 3 obtained by the above-described method were tested for cell acquisition rate, p63 expression, involucrin expression, and colony formation efficiency.
세포 획득율Cell acquisition rate
분리한 세포를 KGM에 현탁한 세포 20㎕와 트리판블루 20㎕를 혼합한 후 cover glass가 덮여있는 Hematocytometer에 주입했다. 1분 정도 기다린 후 현미경에서 죽은 세포 (트리판블루 염색된 세포)를 제외한 살아있는 세포를 계수했다.The isolated cells were mixed with 20 µl of cells suspended in KGM and 20 µl of trypan blue, and then injected into a hematocytometer covered with a cover glass. After waiting for about 1 minute, live cells were counted except for dead cells (trypan blue stained cells) under the microscope.
표 1과 도 2는 실시예 및 비교예에서의 세포 획득율을 나타낸 것이다.Table 1 and Figure 2 show the cell acquisition rates in Examples and Comparative Examples.
실시예는 비교예에 비해 세포 획득율이 높으며 특히 표피/진피 분리하지 않고 효과 중단 없이 자기교반을 수행한 비교예 1보다 약 3배 정도 높은 세포 획득율을 나타냈다.The example showed a higher cell acquisition rate than the comparative example, and in particular, showed a cell acquisition rate of about 3 times higher than that of Comparative Example 1 in which self-stirring was performed without separating the epidermis/dermis without stopping the effect.
방법Cell separation
Way
자기교반법Dynamic Dermis
Self-stirring method
자기교반법Trypsin dermis
Self-stirring method
팁핑법epidermis
Tipping method
자기교반법Trypsin/EDTA
Self-stirring method
세포 획득율 - (x106)Cell acquisition rate-(x10 6 )
p63발현 및 로리크린 발현p63 expression and loliclean expression
면역염색을 위해 분리된 각질세포를 커버슬립에서 배양한 후 메탄올에서 10분간 4℃반응시켜 세포 성장을 중지시켰다. 분리 배양된 세포가 상피세포만으로 이루어졌는지 확인하기 위하여 고정된 세포를 상피세포의 표지자인 팬-사이토케라틴 항체로 염색하였다. 또한, 분리한 세포가 간세포의 특징을 나타내는지 확인하기 위해, p63항체로 염색하였다. The isolated keratinocytes for immunostaining were cultured on a coverslip and then reacted in methanol at 4° C. for 10 minutes to stop cell growth. In order to confirm whether the isolated and cultured cells consisted of only epithelial cells, the fixed cells were stained with a pan-cytokeratin antibody, which is a marker of epithelial cells. In addition, in order to confirm whether the isolated cells exhibit the characteristics of hepatocytes, they were stained with the p63 antibody.
도 3은 실험예에 관한 것으로 DAPI염색을 통해 세포여부를 확인했고, 각질세포마커인 팬-사이토케라틴 염색을 통해 분리된 세포가 모두 각질세포임을 보여주었다. 3 shows that the cells were confirmed by DAPI staining as to the experimental example, and all the cells isolated through the pan-cytokeratin staining, which is a keratinocyte marker, were keratinocytes.
도 3과 같이 면역염색법에 의한 결과를 확인 시, 각질세포 중 기저층에 있는 세포에서 발현되는 p63의 형광발현이 높았고, 반대로 각질세포의 분화세포마커인 로리크린(loricrin)은 낮은 빈도로 발현되는 것으로 보아 실시예 방법으로 분리된 간세포 비율이 가장 많은 것을 알 수 있다.When confirming the results by the immunostaining method as shown in FIG. 3, the fluorescence expression of p63 expressed in cells in the basal layer among keratinocytes was high, and on the contrary, loricrin, a differentiated cell marker of keratinocytes, was expressed at a low frequency. It can be seen that the percentage of hepatocytes isolated by the Example method is the largest.
콜로니 형성 효율Colony formation efficiency
획득한 각질세포의 증식력을 비교하기 위해, 100개의 세포를 6웰 플레이트에 접종한 후, 37℃/5% CO2 배양기에서 배양한다. 10일간 배양 후 1%로다닐 블루 용액으로 염색하고, 콜로니 측정기를 이용하여 콜로니 크기가 0.5㎜이상인 것을 측정했다.In order to compare the proliferation power of the obtained keratinocytes, 100 cells are inoculated into a 6-well plate and then cultured in a 37°C/5% CO 2 incubator. After incubation for 10 days, dyed with 1% rodanil blue solution, and a colony size of 0.5 mm or more was measured using a colony meter.
간세포의 존재 정도를 콜로니 형성 효율로 확인할 수 있는데, 트립신/EDTA 자기교반법에 비해 다이나믹 진피자기교반법에서 콜로니형성능(CFE)가 더 높았다(도 4). 다이나믹 진피자기교반법에 의해 분리된 각질세포에서 간세포의 비율이 더 높은 것을 나타낸다.The degree of presence of hepatocytes can be confirmed by colony formation efficiency, and the colony-forming ability (CFE) was higher in the dynamic dermal magnetic stirring method compared to the trypsin/EDTA magnetic stirring method (FIG. 4). It indicates that the proportion of hepatocytes is higher in the keratinocytes isolated by the dynamic dermal magnetic stirring method.
앞에서 설명되고, 도면에 도시된 본 발명의 실시예는, 본 발명의 기술적 사상을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 기재된 사항에 의하여만 제한되고, 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상을 다양한 형태로 개량 변경하는 것이 가능하다. 따라서 이러한 개량 및 변경은 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것인 한 본 발명의 보호 범위에 속하게 될 것이다.The embodiments of the present invention described above and illustrated in the drawings should not be construed as limiting the technical idea of the present invention. The protection scope of the present invention is limited only by the matters described in the claims, and those of ordinary skill in the technical field of the present invention can improve and change the technical idea of the present invention in various forms. Therefore, these improvements and changes will fall within the protection scope of the present invention as long as it is apparent to those of ordinary skill in the art.
Claims (6)
상피세포로부터 표피와 진피를 분리하여 얻는 단계;
상기 진피를 세포 분리하는 단계를 포함하며,
상기 진피의 세포 분리는,
상기 진피를 트립신/EDTA를 포함하는 용액으로 처리하는 단계,
처리된 진피를 우태아혈청이 포함된 배양배지로 트립신/EDTA의 효과를 중단시키는 중단 단계; 및
중단 상태에서 자기교반하는 교반 단계를 포함하는 방법. In the method of separating hepatocytes present in the epithelial tissue,
Obtaining by separating epidermis and dermis from epithelial cells;
It comprises the step of separating the cells of the dermis,
Separation of the cells of the dermis,
Treating the dermis with a solution containing trypsin/EDTA,
Interrupting the effect of trypsin/EDTA in the treated dermis with a culture medium containing fetal bovine serum; And
A method comprising a stirring step of self-stirring in a suspended state.
상기 진피의 세포 분리는,
상기 교반 단계 후에 상기 배양배지를 회수하고,
상기 중단 단계 및 상기 교반 단계를 반복하는 반복단계를 더 포함하는 방법.The method of claim 1,
Separation of the cells of the dermis,
Recovering the culture medium after the stirring step,
The method further comprising a repeating step of repeating the stopping step and the stirring step.
상기 진피의 세포 분리에 있어서,
상기 우태아혈청이 포함된 배양배지에서 우태아혈청은 3 내지 7w/v%이며,
상기 트립신/EDTA 용액에서 트립신은 0.2 내지 0.3w/v%이고 EDTA는 0.01 내지 0.03w/v%인 방법.The method of claim 1,
In the separation of the cells of the dermis,
In the culture medium containing fetal calf serum, fetal calf serum is 3 to 7w/v%,
In the trypsin/EDTA solution, trypsin is 0.2 to 0.3w/v% and EDTA is 0.01 to 0.03w/v%.
상기 표피를 세포 분리하는 단계를 더 포함하며,
상기 표피의 세포 분리는,
상기 표피를 트립신/EDTA를 포함하는 용액에 처리하는 용액 처리 단계;
자기교반을 수행하지 않고 상기 트립신/EDTA 용액으로 처리된 상기 표피를 휘젓는 단계; 및
상기 휘젓는 단계 이후 상기 트립신/EDTA 용액을 표피에서 분리하고, 우태아혈청이 포함된 배양배지를 상기 트립신/EDTA 용액에 가하여 트립신/EDTA의 효과를 중단시키는 중단 단계를 포함하는 방법.The method of claim 1,
It further comprises the step of separating the cells of the epidermis,
Separation of the cells of the epidermis,
A solution treatment step of treating the epidermis with a solution containing trypsin/EDTA;
Agitating the epidermis treated with the trypsin/EDTA solution without performing magnetic stirring; And
After the stirring step, the trypsin/EDTA solution is separated from the epidermis, and a culture medium containing fetal calf serum is added to the trypsin/EDTA solution to stop the effect of trypsin/EDTA.
상기 표피의 세포 분리는,
트립신/EDTA 용액에서 분리된 상기 표피에 대해,
상기 용액처리단계, 상기 휘젓는 단계 및 상기 중단 단계를 반복하는 방법.The method of claim 1,
Separation of the cells of the epidermis,
For the epidermis separated from trypsin/EDTA solution,
A method of repeating the solution treatment step, the stirring step, and the stopping step.
표피의 세포 분리에 있어서,
상기 우태아혈청이 포함된 배양배지에서 우태아혈청은 3 내지 7w/v%이며,
상기 트립신/EDTA 용액에서 트립신은 0.2 내지 0.3w/v%이고 EDTA는 0.01 내지 0.03w/v%인 방법.The method of claim 1,
In the separation of cells from the epidermis,
In the culture medium containing fetal calf serum, fetal calf serum is 3 to 7w/v%,
In the trypsin/EDTA solution, trypsin is 0.2 to 0.3w/v% and EDTA is 0.01 to 0.03w/v%.
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2020
- 2020-02-13 KR KR1020200017690A patent/KR102254600B1/en active IP Right Grant
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