KR102241681B1 - Composotion comprising α1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising α1-antitrypsin - Google Patents

Composotion comprising α1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising α1-antitrypsin Download PDF

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Abstract

본 발명은 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 알파1-안티트립신 억제제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알파1-안티트립신은 폐암의 발병 가능성 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악하는데 사용할 수 있으며, 비침습적으로 간단하게 폐암을 조기 진단할 수 있으므로, 폐암의 예방, 치료 또는 종양 형성 연구에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a composition for preventing or treating lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin inhibitor and a biomarker composition for diagnosing lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin. The alpha 1-antitrypsin inhibitor according to the present invention can effectively prevent or treat lung cancer by inhibiting cell proliferation and tumor formation of lung cancer cells. In addition, the alpha 1-antitrypsin according to the present invention can be used to significantly predict or identify the likelihood of developing lung cancer and the degree of disease, and since it is possible to easily diagnose lung cancer early in a non-invasive manner, prevent, treat or It can be usefully used in tumor formation studies.

Description

알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물{Composotion comprising α1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising α1-antitrypsin}Composition comprising α1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising α1 -antitrypsin}

본 발명은 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물 및 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for preventing or treating lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin inhibitor and a biomarker composition for diagnosing lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin.

폐암(pancreatic cancer)은 다른 암에 비해 발생 빈도는 낮으나, 기간별 암환자 사망률이 가장 높은 것으로 알려져 있다. 폐암은 조기 진단이 어려운 암으로, 주변 장기나 림프절로 쉽게 전이되는 특징이 있어, 예후가 다른 암들에 비해 좋지 않아 폐암 치료를 위한 여러 노력에도 불구하고, 폐암 발병 후 5년간의 생존율은 지난 30년 동안 개선되지 않았으며, 폐암으로 인한 사망률은 계속 높아져 암 질환으로 인한 사망 중에서 5위를 차지하고 있다. 또한, 보건복지부 암등록 본부에서 공개한 자료에 따르면, 폐암 발병 후 1년 이내의 사망률은 폐암 발병 환자의 약 80%를 차지하는 것으로 조사되어, 폐암 환자의 생존율 또한 매우 낮은 것으로 확인되었다. 폐암을 치료하기 위한 요법으로는 화학요법과 방사선요법이 실시되고 있으나, 치료 효과는 매우 낮으며 폐암에서 가장 많이 사용하는 항암제인 젬시타빈(gemcitabine)의 경우 피리미딘 항대사물질로서 폐암 환자에 사용되고 있으나 그 효율은 6-11%인 것으로 낮아 옥살레이트(Oxalate)나 5-FU(5-fluorouracil) 등의 다른 약물과 함께 병용하여 사용되고 있으나 폐암 환자의 유의적인 생존률 증가에는 영향을 미치지 못하고 있다. 실제로 폐암에 사용되도록 승인받은 약물임에도 불구하고 젬시타빈은 폐암 생존률에는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 확인되고 있어, 폐암을 치료할 수 있는 새로운 약물의 개발 및 다른 약물과 함께 병용할 수 있는 새로운 투여요법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.Although the incidence of pancreatic cancer is lower than that of other cancers, it is known that the mortality rate of cancer patients by period is the highest. Lung cancer is a cancer that is difficult to diagnose early.It has a characteristic that it easily metastasizes to surrounding organs or lymph nodes.The prognosis is poor compared to other cancers. It has not improved during the period, and the mortality rate from lung cancer continues to rise, ranking 5th among deaths from cancer disease. In addition, according to the data released by the Ministry of Health and Welfare's Cancer Registration Division, the mortality rate within one year after the onset of lung cancer accounts for about 80% of the patients with lung cancer, and it was confirmed that the survival rate of lung cancer patients was also very low. Chemotherapy and radiation therapy are being used to treat lung cancer, but the treatment effect is very low, and gemcitabine, an anticancer drug most commonly used in lung cancer, is used as a pyrimidine anti-metabolite in lung cancer patients. Its efficiency is 6-11%, so it is used in combination with other drugs such as oxalate or 5-fluorouracil, but it does not affect the significant increase in survival rate of lung cancer patients. Despite the fact that gemcitabine is a drug approved for use in lung cancer, it has been confirmed that gemcitabine does not significantly affect the survival rate of lung cancer.Therefore, the development of a new drug that can treat lung cancer and the development of a new dosage regimen that can be used in combination with other drugs This is the situation that is being demanded.

한편, 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT)은 간세포에서 합성된 후 혈액 내로 분비되며, 혈장 내에 존재하는 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 엘라스타제(elastase), 콜라게나제(collagenase), 트롬빈(thrombin) 및 플라스민(plasmin)과 같은 대부분의 세린계 단백질 분해효소에 대한 저해제들과 함께 설핀족(serpin family)에 속한다. 또한, 알파1-안티트립신은 분자량이 52kD(kilodalton)인 당단백질이며 생리적 기능은 중성 백혈구의 엘리스타제에 대한 저해제로 작용하며, 특히 폐포에 존재하는 탄성섬유(elastic fiber)가 중성백혈구의 엘리스타제에 의해 분해되는 것을 막아준다.On the other hand, alpha 1-antitrypsin (AAT) is synthesized in hepatocytes and then secreted into the blood, trypsin, chymotrypsin, elastase, collagenase present in plasma. (collagenase), thrombin (thrombin) and plasmin (plasmin), along with inhibitors for most serine-based proteases, it belongs to the sulfin family (serpin family). In addition, alpha 1-antitrypsin is a glycoprotein with a molecular weight of 52 kD (kilodalton), and its physiological function acts as an inhibitor of neutrophilic elastase. In particular, the elastic fibers present in the alveoli are neutrophils. It prevents decomposition by staze.

알파1-안티트립신과 관련된 병리학적 증상을 일으키는 선천적인 유전자 변이는 많이 알려져 있으며(Carrell et al., Mol. Biol.Med. 6, 35-42, 1982), 이들 대부분이 혈장 내의 알파1-안티트립신 농도를 감소시켜서 단백질 분해효소-저해제의 균형이 깨어지며, 이로써 허파는 신축성을 잃게 되고 호흡기종으로 진전된다. 이와 같은 유전적 결함에 의한 호흡기종 외에도 과다한 흡연이나 심한 환경공해로 인한 단백질 분해효소 저해제의 불활성화로 인해 호흡기종이 유발되기도 한다. 현재 북미와 유럽의 백인종에서 주로 발견되는 이러한 유전적 질환을 극복하기 위하여 매년 1억$ 이상의 알파1-안티트립신 시장이 형성되어 있고, 혈액에서 추출된 알파1-안티트립신이 치료제로 투여되고 있다. 한편, 쇼크 증후군은 중성백혈구의 갑작스런 대량 방출로 인해 혈장 설핀과 단백질분해효소사이의 균형이 파괴되어 야기되는 것으로 알려져 있다. 알파1-안티트립신은 급성 쇼크 증후군의 치료에도 사용될 수 있다(Robin W. Carrell, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 4,291-297, 1986)고 보고된 바 있다. There are many known congenital genetic mutations that cause pathological symptoms associated with alpha1-antitrypsin (Carrell et al., Mol. Biol. Med. 6, 35-42, 1982), most of which are alpha1-anti-anti in plasma. By reducing the trypsin concentration, the protease-inhibitor balance is disrupted, causing the lungs to lose elasticity and develop respiratory emphysema. In addition to respiratory emphysema caused by such a genetic defect, respiratory emphysema is also caused by inactivation of protease inhibitors due to excessive smoking or severe environmental pollution. Currently, in order to overcome these genetic diseases, which are mainly found in Caucasians in North America and Europe, more than 100 million dollars of alpha1-antitrypsin market has been formed every year, and alpha1-antitrypsin extracted from blood is being administered as a therapeutic agent. On the other hand, shock syndrome is known to be caused by the destruction of the balance between plasma sulfin and protease due to the sudden mass release of neutrophils. It has been reported that alpha1-antitrypsin can also be used in the treatment of acute shock syndrome (Robin W. Carrell, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 4,291-297, 1986).

본 발명자들은 새로운 폐암 진단 및 이의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위해 연구를 수행한 결과, 폐암에서 특이적으로 증가하는 알파1-안티트립신을 발견하고, 이를 이용하여 폐암을 간단하게 진단할 수 있으며, 알파1-안티트립신을 억제할 경우 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암 치료 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. As a result of conducting research to develop a new lung cancer diagnosis and a composition for preventing or treating the same, the present inventors discovered alpha1-antitrypsin that specifically increases in lung cancer, and using this, it is possible to diagnose lung cancer simply. , When inhibiting alpha 1-antitrypsin, it was confirmed that there is an effect of treating lung cancer by inhibiting cell proliferation and tumor formation of lung cancer cells, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT) 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용한 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a composition for preventing or treating lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin (AAT) inhibitor, a kit for diagnosing lung cancer comprising the composition, and a method for providing information for diagnosing lung cancer using the composition To provide.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알파1-안티트립신 억제제를 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for preventing or treating lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin inhibitor.

또한, 본 발명은 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing lung cancer comprising alpha 1-antitrypsin.

또한, 본 발명은 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for measuring the expression level of the mRNA of an alpha 1-antitrypsin protein or a gene encoding the same.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a lung cancer diagnostic kit comprising the composition.

또한, 본 발명은 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for providing information for diagnosis of lung cancer, comprising: measuring the mRNA expression level of an alpha 1-antitrypsin protein or a gene encoding the same from a biological sample of a patient suspected of lung cancer.

본 발명에 따른 알파1-안티트립신 억제제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 알파1-안티트립신은 폐암의 발병 가능성 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악하는데 사용할 수 있으며, 비침습적으로 간단하게 폐암을 조기 진단할 수 있으므로, 폐암의 예방, 치료 또는 종양 형성 연구에 유용하게 이용될 수 있다.The alpha 1-antitrypsin inhibitor according to the present invention can effectively prevent or treat lung cancer by inhibiting cell proliferation and tumor formation of lung cancer cells. In addition, the alpha 1-antitrypsin according to the present invention can be used to significantly predict or identify the likelihood of developing lung cancer and the degree of disease, and since it is possible to diagnose lung cancer at an early stage simply non-invasively, the prevention, treatment, or It can be usefully used in tumor formation studies.

도 1은 폐 및 폐 세포에서 알파1-안티트립신 발현 여부를 웨스턴 블롯 및 공초점 레이저 주사현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 L132 세포에서 알파1-안티트립신 발현 여부를 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 L132 세포에서 차등 발현 단백질의 단백체 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 상기 차등 발현 단백질의 정량 단백질 추정에 대한 단백질 비율, 및 비율 p 값 및 시료 p 값을 계산하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 5는 상기 차등 발현 단백질의 유전자 온톨로지(gene ontology, GO) 분석 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 STAT5B 및 EEF1A2의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 이중-발광효소 리포터 분석(Dual-Luciferase Reporter Assay) 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내에서 xCELLigence RTCA DP 시스템을 이용하여 실시간 세포 증식, 이동, 및 침윤을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 알파1-안티트립신 과발현 세포 내에서 GOPC 및 BECN1의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내에서 GOPC 발현을 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 BECN1 및 GOPC에 대한 면역침강분석 및 근접결찰분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 만노스-6-포스페이트 수용체(M6PR) 및 클라트린을 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 알파1-안티트립신 과발현 세포 내 OPN의 발현을 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 알파1-안티트립신 과발현된 세포의 인간 혈관 신생 배열 및 밀도 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 알파1-안티트립신 과발현된 세포의 크리스탈 바이올렛 분석을 통해 세포이동을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 15일간의 기아 조건하에서 알파1-안티트립신을 증가시킨 세포의 생존을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 알파1-안티트립신 과발현된 세포 내 Bcl-2, 시토크롬 c 및 LC3B의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 알파1-안티트립신이 소포-매개 수송, 생합성 과정, 혈관 신생 촉진, 및 세포 사멸 억제를 통한 세포 생존을 증진시키는 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 19는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 밀도 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 Bcl-2, 시토크롬 c, 및 LC3B의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 OPN ELISA 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 혈관 신생 배열 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 TSP-1의 면역염색 밀도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 NNK-처리된 마우스의 폐에서 알파1-안티트립신 및 FGF-2의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 암 세포 이동 및 침윤을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 28은 알파1-안티트립신이 감소된 세포 내에서 ICAM-1 및 EpCAM의 웨스턴 블롯 및 면역-형광 분석 수행 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 마우스 폐암 모델의 폐에서 알파1-안티트립신을 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 면역염색을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 30은 마우스 폐암 모델의 폐에서 알파1-안티트립신을 면역-형광 이미지를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 31은 마우스 폐암 모델의 폐 및 혈청에서 마우스 OPN ELISA 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 알파1-안티트립신이 감소된 마우스 모델의 폐에서 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 33은 알파1-안티트립신이 감소된 마우스 모델의 폐에서 CD31 및 PCNA의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하고, 면역조직화학 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 34는 마우스 폐암 모델의 폐에 AAT 에어로졸 전달 후 총 종양의 수 및 부피를 나타낸 도이다.
도 35는 마우스 폐암 모델의 폐 종양의 형성 여부를 H&E 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the results of observing the expression of alpha 1-antitrypsin in lungs and lung cells through Western blot and confocal laser scanning microscope.
2 is a diagram showing the results of observing whether alpha1-antitrypsin is expressed in L132 cells through Western blot and immunofluorescence analysis.
3 is a diagram showing the results of proteomic analysis of differentially expressed proteins in L132 cells.
4 is a graph showing a protein ratio, a ratio p value, and a sample p value for estimation of a quantitative protein of the differentially expressed protein.
5 is a diagram showing the result of performing gene ontology (GO) analysis of the differentially expressed protein.
6 is a diagram showing the results of observing the expression of STAT5B and EEF1A2 in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells through Western blot.
7 is a diagram showing the results of performing a Dual-Luciferase Reporter Assay in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells.
8 is a diagram showing the results of observing real-time cell proliferation, migration, and invasion in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells using the xCELLigence RTCA DP system.
9 is a diagram showing the results of observing the expression of GOPC and BECN1 in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells through Western blot.
10 is a diagram showing the results of observing GOPC expression in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells through immunofluorescence analysis.
11 is a diagram showing the results of immunoprecipitation analysis and proximity ligation analysis for BECN1 and GOPC in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells.
12 is a diagram showing the results of observing mannose-6-phosphate receptor (M6PR) and clathrin in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells through immunofluorescence analysis.
13 is a diagram showing the results of observing the expression of OPN in alpha 1-antitrypsin overexpressing cells through Western blot and immunofluorescence analysis.
14 is a diagram showing the results of performing human angiogenesis array and density analysis of alpha1-antitrypsin overexpressed cells.
15 is a diagram showing the results of observing cell migration through crystal violet analysis of alpha 1-antitrypsin overexpressed cells.
16 is a diagram showing the results of observing the survival of cells with increased alpha 1-antitrypsin under starvation conditions for 15 days.
17 is a diagram showing the results of observing the expression of Bcl-2, cytochrome c, and LC3B in alpha 1-antitrypsin overexpressed cells through Western blot analysis.
18 is a diagram schematically showing a process in which alpha1-antitrypsin promotes cell survival through vesicle-mediated transport, biosynthetic processes, angiogenesis promotion, and inhibition of apoptosis.
19 is a diagram showing the results of performing RT-PCR, Western blot, and density analysis in cells with reduced alpha 1-antitrypsin.
FIG. 20 is a diagram showing the results of observing cancer cell proliferation and cap-dependent protein translation in cells with reduced alpha 1-antitrypsin.
21 is a diagram showing the results of observing the expression of Bcl-2, cytochrome c, and LC3B in cells with reduced alpha 1-antitrypsin through Western blot analysis.
22 is a diagram showing the results of performing an OPN ELISA analysis in cells with reduced alpha 1-antitrypsin.
23 is a diagram showing the results of performing angiogenesis sequence analysis in cells with reduced alpha 1-antitrypsin.
24 is a diagram showing the results of observing the expression of TSP-1, FGF-2, and TIMP-1 in cells with reduced alpha 1-antitrypsin through Western blot analysis.
25 is a diagram showing the results of confirming the immunostaining density of TSP-1 in cells with reduced alpha 1-antitrypsin.
26 is a diagram showing the results of observing the expression of alpha 1-antitrypsin and FGF-2 in the lungs of NNK-treated mice through Western blot analysis.
FIG. 27 is a diagram showing the results of observing cancer cell migration and invasion in cells with reduced alpha 1-antitrypsin.
28 is a diagram showing the results of Western blot and immuno-fluorescence analysis of ICAM-1 and EpCAM in alpha 1-antitrypsin-reduced cells.
29 is a diagram showing the results of observing alpha1-antitrypsin in the lungs of a mouse lung cancer model through RT-PCR, Western blot, and immunostaining.
30 is a diagram showing the results of observing alpha1-antitrypsin through immuno-fluorescence images in the lungs of a mouse lung cancer model.
31 is a diagram showing the results of performing mouse OPN ELISA analysis on lung and serum of a mouse lung cancer model.
FIG. 32 is a diagram showing the results of observing the expression of TSP-1, FGF-2, and TIMP-1 in the lung of a mouse model with reduced alpha 1-antitrypsin through Western blot analysis.
33 is a diagram showing the results of confirming the expression of CD31 and PCNA through Western blot in the lungs of a mouse model with reduced alpha 1-antitrypsin, and performing immunohistochemical analysis.
34 is a diagram showing the total number and volume of tumors after delivery of AAT aerosols to the lungs of a mouse lung cancer model.
35 is a diagram showing the results of confirming the formation of lung tumors in a mouse lung cancer model through H&E staining.

본 발명은 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT) 억제제를 유효성분으로 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer comprising an alpha 1-antitrypsin (AAT) inhibitor as an active ingredient.

이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에 있어서, 알파1-안티트립신은 간세포에서 합성된 후 혈액 내로 분비되며, 혈장 내에 존재하는 당단백질로서, 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제한다.In the present invention, alpha 1-antitrypsin is synthesized in hepatocytes and then secreted into the blood, as a glycoprotein present in plasma, and inhibits cell proliferation and tumor formation in lung cancer cells.

본 발명에 따른 알파1-안티트립신 억제제는 알파1-안티트립신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 알파1-안티트립신 단백질에 직, 간접적으로 결합하여 이의 활성을 저해할 수 있는 모든 물질을 포함한다. The alpha1-antitrypsin inhibitor according to the present invention may be an antibody that specifically binds to the alpha1-antitrypsin protein, and any substance capable of inhibiting its activity by binding directly or indirectly to the alpha1-antitrypsin protein. Includes.

본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리기며, 본 발명의 목적상, 항체는 알파1-안티트립신에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하며, 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. The term "antibody" as used herein refers to a substance that specifically binds to an antigen and causes an antigen-antibody reaction, and for the purposes of the present invention, an antibody specifically binds to alpha1-antitrypsin. it means. The antibody of the present invention includes all of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a recombinant antibody, and can be easily prepared using techniques well known in the art.

상기 알파1-안티트립신 억제제는 AAT 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) 또는 shRNA(short hairpin RNA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 shRNA의 타겟 알파1-안티트립신은 서열번호 1의 염기서열로 표시될 수 있으며, 서열번호 1은 하기와 같다.The alpha 1-antitrypsin inhibitor may be an antisense nucleotide complementarily binding to the mRNA of the AAT gene, short interfering RNA (siRNA), or short hairpin RNA (shRNA), but is not limited thereto. For example, the target alpha1-antitrypsin of the shRNA may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 1 is as follows.

5'-GACATCCACAAGTCCTTCCAACACCTCCT-3'5'-GACATCCACAAGTCCTTCCAACACCTCCT-3'

상기 폐암은 비소세포폐암 또는 소세포폐암일 수 있으며, 바람직하게는 비소세포폐암이다.The lung cancer may be non-small cell lung cancer or small cell lung cancer, preferably non-small cell lung cancer.

상기 비소세포폐암은 폐선암, 편평상피세포암 또는 대세포암을 포함하며, 바람직하게는 폐선암이다.The non-small cell lung cancer includes lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma or large cell carcinoma, and is preferably lung adenocarcinoma.

본 발명에 있어서, 약학적 조성물은, AAT 억제제 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition, in addition to the AAT inhibitor, may preferably contain other ingredients capable of giving a synergistic effect to the main effect within a range that does not impair the main effect targeted by the present invention.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, and diluent in addition to the active ingredients described above for administration.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, textrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, It may be selected from the group consisting of polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.

본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral administration forms according to known methods. As a representative formulation for parenteral administration, an isotonic aqueous solution or suspension is preferred as a formulation for injection. Formulations for injection can be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component can be formulated for injection by dissolving it in saline or buffer.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc. to the active ingredient. It is prepared by mixing. In addition, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.

경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc., and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., can be included in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. have.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations, and suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like may be used. As a base for suppositories, Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like can be used.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 0.0001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여될 수 있다.The effective dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age and gender of the patient, but may be administered at 0.0001 to 100 mg/kg, preferably 0.001 to 10 mg/kg.

본 발명의 조성물은 폐암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 화학적 치료, 방사성 치료, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The composition of the present invention may be used alone for the prevention or treatment of lung cancer, or in combination with surgery, chemotherapy, radiotherapy, hormone therapy, drug therapy, and methods of using a biological response modifier.

본 발명의 알파1-안티트립신 억제제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. The alpha1-antitrypsin inhibitor of the present invention can effectively prevent or treat lung cancer by inhibiting cell proliferation and tumor formation of lung cancer cells.

또한, 본 발명은 알파1-안티트립신을 포함하는 폐암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing lung cancer comprising alpha 1-antitrypsin.

알파1-안티트립신은 폐암 세포에서 증가하는바, 이를 이용하여 폐암을 진단하는 바이오마커로서 사용할 수 있다.Since alpha 1-antitrypsin is increased in lung cancer cells, it can be used as a biomarker for diagnosing lung cancer.

본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커"는 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표로서, 생명체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다. The term "biomarker" used in the present invention is an index that can detect changes in the body, and can objectively measure the normal or pathological state of an organism, the degree of reaction to a drug, and the like.

또한, 본 발명은 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for diagnosing lung cancer comprising an agent for measuring the expression level of the mRNA of an alpha 1-antitrypsin protein or a gene encoding the same.

본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것으로, 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준은 폐암 세포에서 증가하는바, 알파1-안티트립신을 폐암 진단에 활용할 수 있다.The term "diagnosis" as used herein refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disease, determining whether a subject currently has a specific disease or disease, or a specific disease or disease. Determining the prognosis (e.g., identification of a pre-metastatic or metastatic cancer state, determining the stage of the cancer, or determining the responsiveness of the cancer to treatment) of a subject suffering from the disease, or therametrics (e.g., therapeutic efficacy Monitoring the state of the object to provide information about For the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm whether or not the occurrence of lung cancer is possible (risk), and the expression level of the alpha1-antitrypsin protein or the mRNA of the gene encoding the same is increased in lung cancer cells. Trypsin can be used to diagnose lung cancer.

본 발명에 있어서, 상기 제제는 알파1-안티트립신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는, 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the agent may be an antibody that specifically binds to an alpha1-antitrypsin protein, or a primer, probe or antisense nucleotide that specifically binds to a gene encoding alpha1-antitrypsin, but is limited thereto. It doesn't work.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.The term "primer" as used in the present invention is a fragment that recognizes a target gene sequence, and includes forward and reverse primer pairs, but is preferably a primer pair that provides an analysis result having specificity and sensitivity. Since the nucleic acid sequence of the primer is a sequence inconsistent with the non-target sequence present in the sample, a primer that amplifies only the target gene sequence containing the complementary primer binding site and does not induce non-specific amplification can give high specificity. .

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다.The term "probe" as used in the present invention refers to a substance capable of specifically binding to a target substance to be detected in a sample, and refers to a substance capable of specifically confirming the presence of a target substance in a sample through the binding. do.

프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.The type of probe is not limited as a material commonly used in the art, but is preferably PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), peptide, polypeptide, protein, RNA or DNA, and most preferred Hagi is PNA. More specifically, the probe is a biomaterial that includes an organism-derived or similar thing or a thing produced in vitro, for example, enzymes, proteins, antibodies, microorganisms, animal and plant cells and organs, neurons, DNA, and It may be RNA, DNA includes cDNA, genomic DNA, oligonucleotide, RNA includes genomic RNA, mRNA, oligonucleotide, and examples of proteins include antibodies, antigens, enzymes, peptides, and the like.

본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.The term "antisense" as used herein refers to a nucleotide base in which an antisense oligomer is hybridized with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing, typically allowing the formation of an mRNA and RNA: oligomeric heterodimer within the target sequence. It means an oligomer having a sequence of and a backbone between subunits. Oligomers may have exact sequence complementarity or approximate complementarity to the target sequence.

또한, 본 발명은 상기 폐암 진단용 바이오마커 조성물을 포함하는 폐암 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a lung cancer diagnostic kit comprising the biomarker composition for lung cancer diagnosis.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the kit is a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kit, a DNA chip kit, an ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a multiple reaction monitoring (MRM) kit. May be, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 폐암이 의심되는 환자의 생물학적 시료로부터 알파1-안티트립신 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 폐암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for providing information for diagnosis of lung cancer, comprising: measuring the mRNA expression level of an alpha 1-antitrypsin protein or a gene encoding the same from a biological sample of a patient suspected of lung cancer.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 상기 발현량을 정상 대조군 시료의 알파1-안티트립신 단백질의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함한다.In the present invention, the method further comprises comparing the expression level with the expression level of the alpha1-antitrypsin protein of the normal control sample or the mRNA expression level of the gene encoding the alpha1-antitrypsin.

상기 방법에서 "시료"란 생물학적 시료(biological sample)로서 폐암 발병에 의해 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈장을 의미한다.In the above method, the term "sample" refers to a sample such as a tissue, cell, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine whose protein expression level or gene expression level differs due to lung cancer. And, preferably, it means blood, serum or plasma.

본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현 수준 측정"은 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 일반적으로 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한다. The term "protein expression level measurement" used in the present invention is a process of determining the presence and expression level of a biomarker protein in a biological sample to diagnose lung cancer, and generally uses an antibody that specifically binds to the protein.

이를 위한 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용한 방법을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Analysis methods for this include protein chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) analysis, SELDITOF (Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry). Analysis, radioimmunoassay, radioactive immunodiffusion, okteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation assay, two-dimensional electrophoresis analysis, liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC -MS), LCMS/MS (liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), Western blot, or ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), but is not limited thereto.

본 발명에 사용된 용어 "mRNA의 발현 수준 측정"이란 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 폐암 진단용 단백질을 암호화하는 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. The term "measurement of expression level of mRNA" used in the present invention refers to measuring the amount of mRNA in a biological sample in order to diagnose lung cancer by confirming the presence and expression level of mRNAs of genes encoding lung cancer diagnostic proteins. .

이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩을 이용한 방법을 통해 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.Analysis methods for this include reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase reaction (Real-time RT-PCR), and RNase protection assay (RPA; RNase protection). assay), Northern blotting, or a method using a DNA chip, but is not limited thereto.

상기 알파1-안티트립신 또는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA는 폐암 환자에서의 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준과 비교하여 증가하므로, 폐암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 알파1-안티트립신의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 상기 단백질 또는 유전자의 발현 수준보다 높으면 폐암 발병 가능성이 높다고 판정할 수 있다.Since the expression level of the alpha1-antitrypsin or the mRNA of the gene encoding the protein is increased compared to the expression level in the normal control group, the alpha1-antitrypsin in a subject to be diagnosed with lung cancer If the expression level of or the mRNA expression level of the gene encoding alpha1-antitrypsin is higher than the expression level of the protein or gene in the normal control, it can be determined that the possibility of developing lung cancer is high.

상기 '폐암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 알파1-안티트립신의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 높다'는 것은 다양한 방법에 의해 측정될 때 폐암 발병 여부를 진단하고자 하는 대상에서의 알파1-안티트립신의 발현 수준 또는 알파1-안티트립신을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에서의 발현 수준보다 1.0배를 초과, 1.5배를 초과, 2배를 초과, 3배를 초과, 5배를 초과 또는 10배를 초과하는 것을 의미한다.The'expression level of alpha1-antitrypsin in the subject to be diagnosed with lung cancer or the mRNA expression level of the gene encoding alpha1-antitrypsin is higher than the expression level in the normal control group' by various methods. When measured, the expression level of alpha1-antitrypsin or the mRNA expression level of the gene encoding alpha1-antitrypsin in the subject to be diagnosed with lung cancer is more than 1.0 times and 1.5 times the expression level in the normal control group. It means more than, more than 2 times, more than 3 times, more than 5 times, or more than 10 times.

본 발명에 따른 조성물 및 정보제공방법은 폐암의 발병 가능성 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있으며, 비침습적으로 간단하게 폐암을 조기 진단할 수 있으므로, 폐암의 예방, 치료 또는 종양 형성 연구에 유용하게 이용될 수 있다.The composition and information providing method according to the present invention can significantly predict or identify the onset of lung cancer and the extent of the disease, and can easily diagnose lung cancer at an early stage in a non-invasive manner. It can be usefully used.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a preferred embodiment is presented to aid the understanding of the present invention. However, the following examples are provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.

실시예Example 1. 재료의 준비 1. Preparation of ingredients

1-1. 인간 및 마우스 시료의 준비1-1. Preparation of human and mouse samples

본 발명에 사용된 인체시료(biospecimens)는 국가중앙인체자원은행(National Biobank of Korea)의 일원인 고려대학교 구로병원 한국인체자원은행로부터 제공 받았으며, 인간 조직을 사용한 본 실험은 서울대학교 임상시험 심사위원회(Seoul National University Institutional Review Board,　SNUIRB-E1201/001-001)에 의해 승인받았다. 또한, 실험에 사용된 모든 마우스는 서울대학교 지침의 동물 프로토콜 하에 보관하였으며, 본 실험은 서울대학교(SNU-121017-1 and SNU-140707-3)의 동물실험윤리위원회(Animal Care and Use Committees)에 의해 승인받았다. 인간 비소세포성 폐암 모델인 A/J 마우스 및 K-ras LA1 마우스는 중앙실험동물(Joongang Laboratory Animal Inc.)(Seoul, Korea) 및 인간 암 컨소시움-국립 암 연구소(National Cancer Institute)(Frederick, MD, USA)로부터 각각 구매하였으며, 온도 및 상대 습도가 23 ± 2°C 내지 50 ± 20%로 유지되는 실험 동물 시설에서 12-시간 명/암 주기 하에 보관하였다. 4-주령 수컷 A/J 마우스에서 4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone으로도 알려진, 티코틴-유래 니트로사민 케톤(NNK)에 의한 폐 종양을 유도하기 위하여, 체중당 100 mg 및 75 mg의 NNK를 1주 간격으로 정맥 내 주사한 후, 19주 후, 마우스를 희생하였다(Lu et al., 2010). 대조군은 생리식염수만을 주사하였다. The biospecimens used in the present invention were provided by the Korea University Guro Hospital, which is a member of the National Biobank of Korea, and this experiment using human tissue was conducted by the Seoul National University Clinical Trial Review Committee. (Seoul National University Institutional Review Board, SNUIRB-E1201/001-001). In addition, all mice used in the experiment were stored under the animal protocol of Seoul National University guidelines, and this experiment was submitted to the Animal Care and Use Committees of Seoul National University (SNU-121017-1 and SNU-140707-3). Approved by A/J mice and K-ras LA1 mice, which are human non-small cell lung cancer models, are Joongang Laboratory Animal Inc. (Seoul, Korea) and human cancer consortium-National Cancer Institute (Frederick, MD). , USA), respectively, and stored under a 12-hour light/dark cycle in an experimental animal facility where temperature and relative humidity are maintained at 23±2°C to 50±20%. To induce lung tumors by tycotin-derived nitrosamine ketone (NNK), also known as 4-(methylnitro-samino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone, in 4-week-old male A/J mice, After intravenous injection of 100 mg and 75 mg of NNK per body weight at 1 week intervals, 19 weeks later, mice were sacrificed (Lu et al., 2010). The control group was injected with physiological saline only.

또한, 폐암의 진행에 있어 마우스 shAAT(5′-GAC ATC CAC AAG TCC TTC CAA CAC CTC CT-3′)의 효과를 확인하기 위하여, 6-주령 수컷 K-ras LA1 마우스(Chang et al., 2013a; Chang et al., 2012c)를 3개의 군으로 나누었다(그룹당 n = 5). 대조군은 미처리하였으며, 다른 두개의 군은 렌티바이러스-스크램블 또는 렌티바이러스-shAAT를 포함하는 에어로졸에 노출시켰다. 에어로졸 전달을 위하여, K-ras LA1 마우스를 렌티바이러스-shAAT 또는 -스크램블 용액(50 mL, 렌티바이러스의 40 ng/mL의 p24 항원을 포함)을 포함하는 에어로졸에 8주동안 일주일에 두번씩 노출시켰다. 실험 마지막에 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 폐를 수거하였다. In addition, in order to confirm the effect of mouse shAAT (5′-GAC ATC CAC AAG TCC TTC CAA CAC CTC CT-3′) on the progression of lung cancer, 6-week-old male K- ras LA1 mice (Chang et al., 2013a) ; Chang et al., 2012c) were divided into 3 groups ( n = 5 per group). The control group was untreated, and the other two groups were exposed to an aerosol containing lentivirus-scrambled or lentivirus-shAAT. For aerosol delivery, K- ras LA1 mice were exposed to an aerosol containing lentiviral-shAAT or -scrambled solution (50 mL, containing 40 ng/mL of lentiviral p24 antigen) twice a week for 8 weeks. . Mice were sacrificed at the end of the experiment and lungs were harvested for further analysis.

1-2. 1-2. AATAAT 가 증가 또는 Increase or 감소된Reduced 세포주의 세포 배양 및 생성 Cell culture and production of cell lines

인간 정상 폐 상피 세포 L132를 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)로부터 얻었으며 인간 폐포성 기저암(lung alveolar basal carcinoma) 상피 세포 A549를 ATCC(American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)로부터 얻었다. NCI-H146, -H209, -H226, -H322, -H460, -H520, 및 -H522 세포를 37℃, 5% CO2의 가습 배양기 내 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 제공된 RPMI-1640에서 배양하였다. L132 또는 A549 세포 (1×106)를 T25 플라스크에서 성장시킨 후 TransITR-LT1 시약(Mirus Bio, Madison, WI, USA)을 사용하여 인간 AAT 또는 shRNA(5′-CAG ATC CAT GAA GGC TTC CAG GAA CTC CT-3′; Catalog No. TG309541D)를 포함하는 각 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질 감염 후, 각 세포는 인간 AAT 과발현을 위한 400 mg/ml의 G418 이황산염(disulfate salt)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 shRNA 형질주입을 위한 1 mg/ml의 퓨로마이신(puromycin)(InvivoGen, San Diego, CA, USA)을 포함하는 배지를 선택하였다. L132 및 선택된 안정한 세포주(Vector/L132 및 AAT/L132) 또는 A549 및 선택된 안정한 세포주(shScramble/A549 및 shAAT/A549)를 10% FBS 및 1% P/S가 제공된 DMEM(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 또는 10% FBS 및 1% P/S (GibcoBRL)가 제공된 Ham′s F-12 (GibcoBRL)에서, 각각 성장시켰다.Human normal lung epithelial cells L132 were obtained from the Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea), and human alveolar basal carcinoma epithelial cells A549 were obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). NCI-H146, -H209, -H226, -H322, -H460, -H520, and -H522 cells in a humidified incubator at 37°C, 5% CO 2 Incubated in RPMI-1640 provided with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S) within. L132 or A549 cells (1×10 6 ) were grown in T25 flasks, and then human AAT or shRNA (5′-CAG ATC CAT GAA GGC TTC CAG) using TransIT R-LT1 reagent (Mirus Bio, Madison, WI, USA). GAA CTC CT-3′; Catalog No. TG309541D). After transfection, each cell was subjected to 400 mg/ml of G418 disulfate salt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for human AAT overexpression or 1 mg/ml of puromycin for shRNA transfection. A medium containing (puromycin) (InvivoGen, San Diego, CA, USA) was selected. L132 and selected stable cell lines (Vector/L132 and AAT/L132) or A549 and selected stable cell lines (shScramble/A549 and shAAT/A549) were treated with DMEM (GibcoBRL, Grand Island, NY, provided with 10% FBS and 1% P/S). USA) or Ham's F-12 (GibcoBRL) provided with 10% FBS and 1% P/S (GibcoBRL), respectively.

실험예Experimental example 1. One. 폐 lungs 선암종Adenocarcinoma 조직 및 세포주에서 In tissues and cell lines AATAAT 의 과발현 여부 확인.Overexpression of.

각 시료에서 AAT의 발현 수준을 확인하기 위하여, 인간 및 마우스의 폐, 및 폐 세포를 이용하여 웨스턴 블롯 및 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM) 분석을 수행하였으며 그 결과를 도 1에 나타내었다.In order to confirm the expression level of AAT in each sample, Western blot and confocal laser scanning microscope (CLSM) analysis was performed using human and mouse lungs and lung cells, and the results are shown in FIG. Indicated.

도 1a 내지 1c에 나타낸 바와 같이, 인간 폐암 종양 시료(특히 단계 II) 및 선암종 세포인, A549 및 NCI-H522에서 AAT 단백질 수치가 증가하였다. 1A to 1C, AAT protein levels were increased in human lung cancer tumor samples (particularly stage II) and adenocarcinoma cells, A549 and NCI-H522.

또한, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 폐 세포 및 L132와 비교하여 A549 세포에서 AAT 단백질 수치가 증가하였다.In addition, as shown in Figure 1d, compared to normal lung cells and L132, A549 cells increased AAT protein levels.

또한, 도 1e 및 1f에 나타낸 바와 같이, K-ras 야생형(WT) 마우스와 비교하여 인간 폐 선암종(K-ras LA1) 마우스 모델의 폐 내에서 AAT 단백질 수치가 유의미하게 증가하였고, 도 1g 및 1h에 나타낸 바와 같이, A/J 마우스의 티코틴-유래 니트로사민 케톤(nicotine-derived nitrosamine ketone, NNK)-유도된 폐 선암종에서 AAT 단백질 수치가 증가하였다. 이는 AAT가 폐 선암종 세포 및 조직 내에서 과발현된다는 것을 나타낸다.In addition, as shown in Figures 1e and 1f, compared to the K- ras wild-type (WT) mouse human lung adenocarcinoma (K- ras LA1 ) AAT protein level was significantly increased in the lung of the mouse model, and as shown in FIGS. 1G and 1H, nicotine-derived nitrosamine ketone (NNK)-induced lung of A/J mice AAT protein levels were increased in adenocarcinoma. This indicates that AAT is overexpressed in lung adenocarcinoma cells and tissues.

실험예Experimental example 2. 2. AATAAT -과발현 -Overexpression L132L132 세포 내 차등 발현 단백질(differential expressed proteins, Differential expressed proteins in cells DEPsDEPs )의 )of 단백체Proteomic (( proteomicproteomic ) 분석) analysis

폐암 진행에 AAT이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 L132 세포 내에서 AAT 발현을 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 이용하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. In order to confirm the effect of AAT on lung cancer progression, AAT expression in L132 cells prepared in Example 1-2 was observed using Western blot and immunofluorescence analysis, and the results are shown in FIG. 2.

도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 벡터-형질주입된 세포(Vec) 및 대조군 세포(Con)와 비교하여 안정적으로 AAT가 증가된 세포(AAT)에서 AAT 단백질 수치가 증가하였음을 확인하였다. As shown in FIGS. 2A and 2B, it was confirmed that the AAT protein level was increased in the cells (AAT) stably increased in AAT compared to the vector-transfected cells (Vec) and control cells (Con).

또한, 기준 세포와 비교하여 L132 세포 내 AAT의 과발현과 관련된 변화를 더 확인하기 위하여, TMT 표지 정량적 단백체 분석을 수행하였다. AAT-과발현 세포의 단백질 용해물로부터 얻은 트립신 분해 펩티드(tryptic peptides)를 TMT-128로 표지하고, 벡터-형질주입된(vector-transfected, Vec) 세포 및 대조군 세포 (Con)의 단백질 용해물로부터 얻은 트립신 분해 펩티드를 TMT-126 및 TMT127로 각각 표지한 후, 삼중 MS 분석을 통하여, 총 8,709개의 단백질을 확인하고 정량하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. In addition, in order to further confirm the changes related to the overexpression of AAT in L132 cells compared to the reference cells, TMT-labeled quantitative proteomic analysis was performed. Tryptic peptides obtained from protein lysates of AAT-overexpressing cells were labeled with TMT-128 and obtained from protein lysates of vector-transfected (Vec) cells and control cells (Con). After the trypsin-degrading peptides were labeled with TMT-126 and TMT127, respectively, a total of 8,709 proteins were identified and quantified through triple MS analysis, and the results are shown in FIG. 3.

또한, R 소프트웨어 패키지 동중원소(Isobar) (Isobar released Sep_2014, http://bioinformatics.cemm.oeaw.ac.at)를 이용하여, 각각의 정량 단백질 추정의 기술적 변동성에 대한 단백질 비율, 및 비율 p 값 및 시료 p 값을 계산하였다. 적어도 하나의 복제의 128/126 (AAT/Con) 및 128/127 (AAT/Vec)에서 비율 p 값 및 시료 p 값이 모두 0.05 미만인 경우(Figures 2D and S1, and Table S2) 단백질을 차등 발현 단백질 (DEPs)로서 수거하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.In addition, using the R software package Isobar (Isobar released Sep_2014, http://bioinformatics.cemm.oeaw.ac.at ), the protein ratio for the technical variability of each quantitative protein estimation, and the ratio p value And the sample p value was calculated. If the ratio p value and sample p value are both less than 0.05 at 128/126 (AAT/Con) and 128/127 (AAT/Vec) of at least one replicate (Figures 2D and S1, and Table S2), the protein is a differentially expressed protein. It was collected as (DEPs), and the results are shown in FIG. 4.

도 4에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내에서 각각 106 및 103개의 단백질이 증가 및 감소된 DEPs인 반면, 총 209개의 단백질이 AAT/Vec 내에서 DEPs로 확인되었다. As shown in FIG. 4, 106 and 103 proteins were increased and decreased DEPs, respectively, in AAT-overexpressing cells, whereas a total of 209 proteins were identified as DEPs in AAT/Vec.

또한, AAT 과발현과 관련된 생물학적 과정의 변화를 조사하기 위해, DAVID 생물정보학 자원(Bioinformatics resources)(Huang et al., 2009a; Huang et al., 2009b)을 이용하여 DEPs로부터 생물학적 과정의 유전자 온톨로지(gene ontology, GO) 분석을 수행하였다. Fisher 정확검정(Fisher exact test)에서 p 값이 0.5 미만인 경우 현저히 영향을 주는 GO annotations를 선택하였다. 생물학적 과정은 도 5 로 나타내었으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.In addition, in order to investigate changes in biological processes associated with AAT overexpression, DAVID Bioinformatics resources (Huang et al., 2009a; Huang et al., 2009b) were used to investigate the gene ontology of biological processes from DEPs. ontology, GO) analysis was performed. In Fisher exact test, GO annotations that significantly affect when p value is less than 0.5 were selected. The biological process is shown in Figure 5, and the results are shown in Table 1.


Expression log2 (AAT/Con)Expression log2 (AAT/Con) Expression log2 (AAT/Vec)Expression log2 (AAT/Vec) #1#One #2#2 #3#3 #1#One #2 #2 #3#3 세포 사멸 조절Cell death regulation EEF1A2(Elongation factor 1-alpha 2)EEF1A2 (Elongation factor 1-alpha 2) 1.041.04 1.041.04 1.171.17 0.980.98 1.141.14 1.321.32 STAT5B(Signal transducer and activator of transcription 5B )Signal transducer and activator of transcription 5B (STAT5B) 0.610.61 0.370.37 0.430.43 0.580.58 0.450.45 0.520.52 TSP-1(Thrombospondin-1)TSP-1 (Thrombospondin-1) 0.680.68 N/DN/D N/DN/D 1.331.33 N/DN/D N/DN/D 소포 매개 수송Parcel-mediated transport GOPC(Golgi-associated PDZ and coiled-coil motif-containing protein)GOPC (Golgi-associated PDZ and coiled-coil motif-containing protein) 0.350.35 0.330.33 0.140.14 0.260.26 0.240.24 0.140.14 TGF-β1(Transforming growth factor-beta 1)Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) 0.460.46 0.150.15 0.170.17 0.620.62 0.280.28 0.530.53 세포 부착 조절Cell adhesion regulation ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1) -0.03-0.03 -0.17-0.17 -0.41-0.41 0.770.77 0.480.48 1.251.25 유기 화합물의 산화에 의한 에너지 유도Energy induction by oxidation of organic compounds Cytochrome c Cytochrome c -0.50-0.50 -0.43-0.43 -0.47-0.47 -0.68-0.68 -0.54-0.54 -0.57-0.57 SOD2(Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial)SOD2 (Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial) -0.55-0.55 -0.42-0.42 -0.47-0.47 -0.63-0.63 -0.52-0.52 -0.69-0.69

표 1에 나타낸 바와 같이, 증가된 DEPs가 가장 명백하게 영향을 주는 GO 조건은 소포(vesicle)-매개 수송, 세포 사멸 조절, 및 세포 접착 조절이며, 감소된 DEPs는 유기 화합물의 산화에 의한 에너지 유도와 같은 미토콘드리아 기능 관련 GO 조건에 영향을 미치는 것을 확인하였다.As shown in Table 1, the GO conditions in which increased DEPs most clearly affects are vesicle-mediated transport, regulation of apoptosis, and regulation of cell adhesion, and the reduced DEPs are energy induction by oxidation of organic compounds and It was confirmed that it affects the GO condition related to the same mitochondrial function.

실험예Experimental example 3. 3. 상승된Elevated AATAAT 가 인간 정상 폐 세포 내 세포 증식 및 캡-의존적(cap-dependent) 단백질 번역에 미치는 영향 확인The effect of the influenza on cell proliferation and cap-dependent protein translation in human normal lung cells

단백질 전사 및 번역에 미치는 AAT의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 AAT-과발현 세포 내 STAT5B(signal transducer and activator of transcription 5B) 및 EEF1A2(eukaryotic trans translation elongation factor 1-α2)의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.In order to confirm the effect of AAT on protein transcription and translation, STAT5B (signal transducer and activator of transcription 5B) and EEF1A2 (eukaryotic trans translation elongation factor 1-α2) in the AAT-overexpressing cells prepared in Example 1-2. The expression of was measured through Western blotting, and the results are shown in FIG. 6.

도 6에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포에서 STAT5B 및 EEF1A2의 발현이 증가함을 확인하였다. As shown in Fig. 6, it was confirmed that the expression of STAT5B and EEF1A2 was increased in AAT-overexpressing cells.

또한, AAT-매개 캡-의존적 단백질 번역을 확인하기 위하여, AAT-과발현 세포 내에서 이중-발광효소 리포터 분석(Dual-Luciferase Reporter Assay)을 수행하였다. 먼저, 세포를 6-웰 플레이트에서 성장시키고 bicistronic 리포터 플라스미드(pcDNA-fLuc-polIRES-rLuc)로 형질주입시켰다. 24 또는 48시간 동안 배양한 후, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS에서 두번 세척하고 수동적 용해 완충액(passive lysis buffer)(Promega)에서 추출한 후, 반?불이(firefly) 및 레닐라(renilla) 발광효소 활성을 이중-발광효소 리포터 분석 시스템(Dual-Luciferase® Reporter Assay System)(Promega)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.In addition, in order to confirm AAT-mediated cap-dependent protein translation, a Dual-Luciferase Reporter Assay was performed in AAT-overexpressing cells. First, cells were grown in 6-well plates and transfected with a bicistronic reporter plasmid (pcDNA-fLuc-polIRES-rLuc). After incubation for 24 or 48 hours, the cells were washed twice in ice-cold PBS and extracted in passive lysis buffer (Promega), followed by firefly and renilla luminase activity. Was measured using a Dual-Luciferase ® Reporter Assay System (Promega), and the results are shown in FIG. 7.

도 7에 나타낸 바와 같이, AAT가 과발현되는 경우, 캡-의존적 번역은 24시간 및 48시간 동안 대조군과 비교하여 각각 ~53% 내지 ∼45% 증가하였다. 이는 eIF4E 및 4EBP1의 인산화가 캡-의존적 단백질 번역과 연관되어 있음을 나타낸다.As shown in FIG. 7, when AAT was overexpressed, cap-dependent translation was increased by ∼53% to ∼45%, respectively, compared with the control group for 24 hours and 48 hours. This indicates that phosphorylation of eIF4E and 4EBP1 is associated with cap-dependent protein translation.

또한, 증가된 AAT가 증식에 미치는 효과를 확인하기 위하여, AAT-과발현 세포 내에서 실시간으로 세포를 관찰하는 xCELLigence RTCA DP 시스템(Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)을 이용하여 실시간 세포 증식, 이동, 및 침윤을 측정하였다. 이때, 세포를 E-plate 16 (증식용; 2.5×103 세포) 또는 CIM-plate 16 (이동용; 2∼8×104 세포, 침윤용; 8×104 세포)의 웰에 두고 배양하였으며, 측정 결과를 도 8에 나타내었다.In addition, in order to confirm the effect of increased AAT on proliferation, real-time cell proliferation and migration using the xCELLigence RTCA DP system (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) that observes cells in real time within AAT-overexpressing cells. , And infiltration were measured. At this time, the cells were cultured by placing them in the wells of E-plate 16 (for proliferation; 2.5×10 3 cells) or CIM-plate 16 (for mobile; 2-8×10 4 cells, for infiltration; 8×10 4 cells), The measurement results are shown in FIG. 8.

도 8a에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내에서 대조군 및 벡터-형질주입된 세포와 비교하여 증식이 현저하게 증가하였으며, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 밀도의 막대 그래프를 통해 48 시간 후에 측정한 xCELLigence의 결과와 연관되어 있음을 확인하였다. 이는 AAT의 과발현이 전사, 캡-의존적 단백질 번역, 및 세포 증식을 유도함을 나타낸다.As shown in FIG. 8A, proliferation was remarkably increased in AAT-overexpressing cells compared to control and vector-transfected cells, and as shown in FIG. 8B, xCELLigence measured after 48 hours through a bar graph of density It was confirmed that it was related to the results of. This indicates that overexpression of AAT induces transcription, cap-dependent protein translation, and cell proliferation.

실험예Experimental example 4. 4. AATAAT 가 소포-매개 수송의 증가, 생합성 과정, 혈관 신생, 및 세포 사멸의 음성 조절을 통해 세포 생존을 Cell survival through increased vesicle-mediated transport, biosynthetic processes, angiogenesis, and negative regulation of apoptosis. 촉진시키는지Promote 여부 Whether

소포-매개 수송의 결과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 AAT-과발현 세포 내에서 GOPC 및 관련 자가소화(autophagy) 단백질인 BECN1의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.In order to confirm the result of vesicle-mediated transport, the expression of GOPC and related autophagy protein BECN1 in the AAT-overexpressing cells prepared in Example 1-2 was confirmed through Western blot, and the results were confirmed. It is shown in Figure 9.

도 9에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내 24 및 48 시간 후의 BECN1의 발현이 감소한 반면, GOPC 발현이 증가하였다. As shown in FIG. 9, the expression of BECN1 after 24 and 48 hours in AAT-overexpressing cells decreased, whereas the expression of GOPC increased.

또한, 24시간 후 AAT-과발현 세포 내 GOPC 발현을 면역형광 분석에 의해 확인하였으며, 이를 도 10에 나타내었다.In addition, after 24 hours, the expression of GOPC in the AAT-overexpressing cells was confirmed by immunofluorescence analysis, which is shown in FIG. 10.

도 10에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포 내 GOPC의 발현이 증가됨을 확인하였다. As shown in FIG. 10, it was confirmed that the expression of GOPC in AAT-overexpressing cells was increased.

또한, Dynabead 단백질 G(Invitrogen)를 이용하여 BECN1 및 GOPC에 대한 면역침강분석(Immuno-precipitation assay, IPA)을 수행하였으며, Duolink® In Situ Kit(Olink Bioscience, Uppsala, Sweden)를 이용하여 이에 대한 근접결찰분석(proximity ligation assay, PLA)을 수행하였다. 실험 절차는 제조업체의 프로토콜을 따랐으며, 골지체에 대한 GM130의 면역염색은 PLA 분석 후 수행되었다. 이의 결과를 도 11에 나타내었다.In addition, immunoprecipitation analysis (Immuno-precipitation assay, IPA) for BECN1 and GOPC was performed using Dynabead protein G (Invitrogen), and proximity to this was performed using Duolink® In Situ Kit (Olink Bioscience, Uppsala, Sweden). Ligation analysis (proximity ligation assay, PLA) was performed. The experimental procedure followed the manufacturer's protocol, and immunostaining of GM130 on the Golgi apparatus was performed after PLA analysis. The results are shown in FIG. 11.

도 11a에 나타낸 바와 같이, 안정적으로 AAT가 증가된 L132 세포에서 GOPC, Golgi-연관 단백질, 및 BECN1 사이의 결합을 확인하였으며, 도 11b에 나타낸 바와 같이, 이들 두개의 단백질의 결합 친화도를 확인하였다. As shown in FIG. 11A, binding between GOPC, Golgi-associated protein, and BECN1 was confirmed in L132 cells with stably increased AAT, and as shown in FIG. 11B, the binding affinity of these two proteins was confirmed. .

또한, AAT-과발현 세포 내에서 소포-매개 수송에 대한 AAT의 효과를 확인하기 위하여, 만노스-6-포스페이트 수용체(mannose-6-phosphate receptor, M6PR) 및 클라트린(clathrin)(코팅된 비히클의 형성에 중요한 역할을 하는)을 면역형광 분석을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. In addition, in order to confirm the effect of AAT on vesicle-mediated transport in AAT-overexpressing cells, the formation of mannose-6-phosphate receptor (M6PR) and clathrin (coated vehicle) Which plays an important role in) was confirmed through immunofluorescence analysis, and the results are shown in FIG. 12.

도 12에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포에서 M6PR 및 클라트린이 유도됨을 확인하였다.As shown in Fig. 12, it was confirmed that M6PR and clathrin were induced in AAT-overexpressing cells.

또한, 오스테오폰틴(osteopontin, OPN)은 글리코실화된 인단백질로 알려져 있으며, 폐암을 포함하는 다양한 인간 종양에서 과발현되는 것으로 알려져 있으므로, 증가된 AAT에 의한 생합성 과정시 대표적인 단백질로서, OPN의 발현을 웨스턴 블롯 및 면역형광 분석을 통하여 검출하였으며, 그 결과를 도 13에 나타내었다.In addition, osteopontin (OPN) is known as a glycosylated phosphoprotein, and is known to be overexpressed in various human tumors including lung cancer, so it is a representative protein during the biosynthetic process by increased AAT. It was detected through Western blot and immunofluorescence analysis, and the results are shown in FIG. 13.

도 13에 나타낸 바와 같이, AAT-과발현 세포에서 OPN이 유도됨을 확인하였다. As shown in FIG. 13, it was confirmed that OPN was induced in AAT-overexpressing cells.

또한, 혈관 신생 및 세포에 AAT가 미치는 영향을 확인하기 위해 안정적으로 AAT 과발현된 L132 세포에서 인간 혈관 신생 어레이 및 밀도 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. In addition, in order to confirm the effect of AAT on angiogenesis and cells, human angiogenesis array and density analysis were performed on L132 cells stably overexpressing AAT, and the results are shown in FIG. 14.

도 14a 및 14b에 나타낸 바와 같이, 혈관 신생-관련 단백질의 발현은 대조군 세포(Con)와 비교하여 AAT-과발현 L132 세포 (AAT)에서 상당히 증가하였다. 도 15c 및 15d에 나타낸 바와 같이, 이들 단백질 중, 폐 종양에 중요한 역할을 하는 TSP-1를 선택하여 TSP-1의 증가된 수치를 확인하였다. 이 때, 도 15e에 나타낸 바와 같이, AAT 돌연변이가 TSP-1 단백질 발현을 증가시키지 않으므로 증가된 수치는 AAT와 관련이 있음을 나타낸다. 14A and 14B, the expression of angiogenesis-related proteins was significantly increased in AAT-overexpressing L132 cells (AAT) compared to control cells (Con). 15C and 15D, among these proteins, TSP-1, which plays an important role in lung tumors, was selected to confirm the increased level of TSP-1. At this time, as shown in Fig. 15e, the AAT mutation does not increase the expression of the TSP-1 protein, indicating that the increased level is related to AAT.

또한, 세포 이동에 AAT가 미치는 영향을 확인하기 위해 크리스탈 바이올렛 분석(Crystal violet assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.In addition, a crystal violet assay was performed to confirm the effect of AAT on cell migration, and the results are shown in FIG. 15.

도 15에 나타낸 바와 같이, 세포 이동이 AAT의 증가에 의하여 증가함을 확인하였다. As shown in Figure 15, it was confirmed that the cell migration increased by the increase of AAT.

또한, 15일간의 기아 조건하에서 AAT를 증가시킨 결과를 도 16에 나타내었다. In addition, the results of increasing AAT under starvation conditions for 15 days are shown in FIG. 16.

도 16에 나타낸 바와 같이, 옅은 색을 나타낸 대조군에 비하여 뚜렷한 핑크색(세포 생존의 간접 신호)을 나타낸 AAT-과발현 세포 배지의 경우 생존을 길게한다는 것을 나타내므로, 15일간의 기아 조건하에서도 세포 생존은 증가하였음을 확인하였다. As shown in Fig. 16, the AAT-overexpressing cell medium exhibiting a distinct pink color (indirect signal of cell survival) compared to the light-colored control group indicates that the survival is prolonged, so that even under the starvation condition of 15 days, cell survival It was confirmed that it increased.

AAT의 증가가 자가소화(autophagy) 또는 세포사멸과 관련성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, AAT-과발현 L132 세포 내에서 Bcl-2, 시토크롬 c 및 LC3B의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 측정하였으며, 그 결과를 도 17에 나타내었다.To determine whether an increase in AAT is related to autophagy or apoptosis, the expression of Bcl-2, cytochrome c and LC3B in AAT-overexpressing L132 cells was measured through Western blot analysis, and the result Fig. 17 shows.

도 17에 나타낸 바와 같이, 벡터(Vec) 및 대조군(Con)과 비교하여 AAT-과발현 세포 (AAT)에서 Bcl-2의 증가 및 시토크롬 c 및 LC3B의 감소를 확인하였다. 인간 Bcl-2은 미토콘드리아 막의 안정을 통한 시토크롬 c의 방출 억제에 의해 세포 생존을 증가시킬 수 있는 세포사멸 억제(anti-apoptotic), 막-관련 종양단백질(oncoprotein)이며, BECN1-의존 자가소화를 억제하므로, 세포 생존을 돕는다. 따라서, 상기 결과는 AAT의 증가가 소포-매개 수송, 생합성 과정, 혈관 신생 촉진, 및 세포 사멸 억제를 통한 세포 생존을 증진시킨다는 것을 나타낸다. 이를 간단히 도 18에 나타내었다. As shown in FIG. 17, an increase in Bcl-2 and a decrease in cytochrome c and LC3B were observed in AAT-overexpressing cells (AAT) compared to the vector (Vec) and the control (Con). Human Bcl-2 is an anti-apoptotic, membrane-related oncoprotein that can increase cell survival by inhibiting the release of cytochrome c through stabilization of the mitochondrial membrane, and inhibits BECN1-dependent autophagy. Therefore, it helps cells survive. Thus, the above results indicate that an increase in AAT enhances cell survival through vesicle-mediated transport, biosynthetic processes, promotion of angiogenesis, and inhibition of cell death. This is simply shown in Figure 18.

실험예Experimental example 5. 5. AATAAT 의 감소가 인간 폐암 세포에서 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역을 억제하는지 여부Reduction in human lung cancer cells inhibit cell proliferation and cap-dependent protein translation

암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역에 있어 감소된 AAT의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 안정하게 AAT가 감소된 A549 세포에서 RT-PCR, 웨스턴 블롯, xCELLigence을 이용한 실시간 세포 증식, 및 이중-발광효소 분석을 수행하였다. In order to confirm the effect of reduced AAT on cancer cell proliferation and cap-dependent protein translation, real-time using RT-PCR, Western blot, xCELLigence in A549 cells stably reduced AAT prepared in Example 1-2. Cell proliferation, and double-luminase assays were performed.

먼저, AAT 감소 세포(shAAT)에서 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 밀도 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 19에 나타내었다.First, RT-PCR, Western blot and density analysis were performed in AAT-reduced cells (shAAT), and the results are shown in FIG. 19.

도 19a 내지 19c에 나타낸 바와 같이, 스크램블-형질주입된 세포(scramble-transfected, shScr) 및 대조군 세포(Con)와 비교하여 AAT 감소 세포에서 감소된 mRNA 및 AAT 단백질 수치를 확인하였다.As shown in FIGS. 19A to 19C, reduced levels of mRNA and AAT protein were confirmed in AAT-reducing cells compared to scramble-transfected cells (scramble-transfected, shScr) and control cells (Con).

또한, AAT 감소 세포에서 암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역을 확인하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.In addition, cancer cell proliferation and cap-dependent protein translation were confirmed in AAT-reducing cells, and the results are shown in FIG. 20.

도 20a 내지 20d에 나타낸 바와 같이, AAT 감소 세포에서 암 세포 증식 및 캡-의존적 단백질 번역 또한 감소하였다. As shown in Figs. 20A-20D, cancer cell proliferation and cap-dependent protein translation were also reduced in AAT-reducing cells.

또한, AAT의 감소와 자가소화 및 세포사멸의 연관성을 확인하기 위하여, AAT 감소 세포에서 Bcl-2, 시토크롬 c, 및 LC3B의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.In addition, in order to confirm the association between AAT reduction and autodigestion and apoptosis, Western blot analysis of Bcl-2, cytochrome c , and LC3B was performed in AAT-reducing cells, and the results are shown in FIG. 21.

도 21에 나타낸 바와 같이, 감소된 AAT는 시토크롬 c 및 LC3B의 증가 및 Bcl-2의 감소를 유발하였다. As shown in Fig. 21, reduced AAT caused an increase in cytochrome c and LC3B and a decrease in Bcl-2.

상기 결과는 AAT의 감소가 캡-의존적 단백질 번역, 자가소화, 및 세포사멸을 조절함으로써 세포 생존을 억제하는 것을 나타낸다.These results indicate that a decrease in AAT inhibits cell survival by regulating cap-dependent protein translation, autodigestion, and apoptosis.

실험예Experimental example 6. 6. AATAAT 의 감소가 인간 폐암 세포에서 혈관 신생, 이동 및 침윤을 억제하는지 여부Whether a reduction in human lung cancer cells inhibits angiogenesis, migration, and invasion

혈관 신생을 유도하는 OPN 발현에 미치는 AAT 감소의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 제조한 AAT 감소 세포의 배지에서 인간 OPN ELISA 분석을 수행하였다. 먼저, 배양된 배지 또는 마우스 혈청의 OPN 수치를 인간 또는 마우스/랫트 OPN 면역분석법을 위한 Quantikine ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 관찰 후, 이를 Microplate Reader (Bio-Rad)를 이용하여 OD 450 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 도 22에 나타내었다.In order to confirm the effect of AAT reduction on OPN expression inducing angiogenesis, human OPN ELISA analysis was performed in the medium of the AAT-reducing cells prepared in Example 1-2. First, the OPN levels of cultured medium or mouse serum were observed with Quantikine ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) for human or mouse/rat OPN immunoassay, and then OD using a Microplate Reader (Bio-Rad). Measurement was made at 450 nm, and the results are shown in FIG. 22.

도 22에 나타낸 바와 같이, AAT의 감소가 정상 세포 수준과 유사하게 OPN 분비를 저해함을 확인하였다. As shown in Fig. 22, it was confirmed that the decrease in AAT inhibited OPN secretion similar to the normal cell level.

또한, 감소된 AAT가 혈관 신생에 미치는 효과를 더 확인하기 위하여, 프로테옴 프로파일러 인간 혈관 신생 어레이 키트(Proteome ProfilerTM Human Angiogenesis Array Kit)를 이용하여 AAT 감소 세포에서 인간 혈관 신생 어레이 분석을 수행하고, TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였으며, 그 결과를 각각 도 23 및 도 24에 나타내었다. In addition, in order to further confirm the effect of reduced AAT on angiogenesis, human angiogenesis array analysis was performed in AAT-reducing cells using Proteome Profiler TM Human Angiogenesis Array Kit, Expression of TSP-1, FGF-2, and TIMP-1 was confirmed through Western blot, and the results are shown in FIGS. 23 and 24, respectively.

도 23에 나타낸 바와 같이, 혈관 신생-관련 단백질의 발현은 96 시간 후에 대조군 세포(Con)와 비교하여 AAT 감소된 A549 세포 (shAAT)에서 4 ~ 58% 감소하였으며, 도 24에 나타낸 바와 같이, 7일 후 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현이 현저히 감소하였다. As shown in FIG. 23, the expression of angiogenesis-related protein was reduced by 4 to 58% in A549 cells (shAAT) with reduced AAT compared to control cells (Con) after 96 hours, and as shown in FIG. 24, 7 After days, the expression of TSP-1, FGF-2, and TIMP-1 was significantly reduced.

이 때, 도 25에 나타낸 바와 같이, TSP-1의 면역염색 밀도는 AAT 감소 세포에 의해 별개로 감소되었다. At this time, as shown in Fig. 25, the immunostaining density of TSP-1 was separately decreased by AAT-reducing cells .

또한, NNK 처리 및 AAT 감소의 관계를 확인하기 위하여, NNK-처리된 마우스의 폐에서 AAT 및 FGF-2의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 26에 나타내었다.In addition, in order to confirm the relationship between NNK treatment and AAT reduction, expression of AAT and FGF-2 in lungs of NNK-treated mice was observed through Western blot analysis, and the results are shown in FIG. 26.

도 26에 나타낸 바와 같이, AAT 및 FGF-2의 발현은 A549 세포(Con)에서 NNK 처리에 의해 현저히 증가하였으나, 이러한 NNK-매개 증가된 AAT 단백질 발현은 AAT 감소 세포(shAAT)에서 상쇄되었다. FGF-2 단백질 발현 또한 이와 매우 유사한 결과를 나타내었다. As shown in FIG. 26, the expression of AAT and FGF-2 was significantly increased by NNK treatment in A549 cells (Con), but this NNK-mediated increased AAT protein expression was canceled out in AAT reducing cells (shAAT). FGF-2 protein expression also showed very similar results.

또한, 암 세포 이동 및 침윤에 대한 AAT 감소의 효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 27에 나타내었다.In addition, the effect of reducing AAT on cancer cell migration and invasion was confirmed, and the results are shown in FIG. 27.

도 27에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 스크램블-형질주입된 세포과 비교하여 AAT 감소 세포에서 암 세포 이동(27a 및 27b) 및 침윤(27c 및 27d)이 현저히 감소하였다. As shown in FIG. 27, cancer cell migration (27a and 27b) and invasion (27c and 27d) were significantly reduced in AAT-reducing cells compared to control and scramble-transfected cells.

이와 관련하여, shAAT가 세포 부착에 미치는 효과를 평가하기 위해 ICAM-1 및 EpCAM(epithelial cellular adhesion molecule)과 같은 대표적인 부착 분자의 웨스턴 블롯 및 면역-형광 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 28에 나타내었다.In this regard, Western blot and immunofluorescence analysis of representative adhesion molecules such as ICAM-1 and EpCAM (epithelial cellular adhesion molecule) were performed to evaluate the effect of shAAT on cell adhesion, and the results are shown in FIG. I got it.

도 28에 나타낸 바와 같이, AAT 감소 세포에서 대조군 또는 스크램블-형질주입된 세포와 비교하여 ICAM-1 및 EpCAM의 발현이 감소하였다. As shown in FIG. 28, the expression of ICAM-1 and EpCAM was decreased in the AAT-reducing cells compared to the control or scramble-transfected cells.

이들 결과는 AAT의 감소가 폐암 세포의 혈관 신생, 이동, 및 침윤을 억제한다는 것을 나타낸다. 또한, AAT의 감소는 암 세포 부착을 방지함으로써 세포 사멸을 유도할 수 있다.These results indicate that reduction in AAT inhibits angiogenesis, migration, and invasion of lung cancer cells. In addition, reduction of AAT can induce cell death by preventing cancer cell adhesion.

실험예Experimental example 7. 7. AATAAT 의 감소가 K-The decrease in K- rasras LA1LA1 마우스의 폐에서 혈관 신생 및 암 세포 증식의 억제를 통해 폐 종양 형성(Lung tumor formation through inhibition of angiogenesis and cancer cell proliferation in the lungs of mice ( tumorigenesistumorigenesis )을 억제하는지 여부) To suppress

생체내(in vivo)에서 shAAT가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1의 마우스 폐암 모델, K-ras LA1 마우스를 이용하였다. K-rasLA1 마우스의 폐에서 AAT의 RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 면역염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 29 및 도 30에 나타내었다.In order to confirm the effect of shAAT in vivo , the mouse lung cancer model of Example 1-1, K- ras LA1 mouse, was used. RT-PCR, Western blot and immunostaining of AAT were performed in the lungs of K- ra s LA1 mice, and the results are shown in FIGS. 29 and 30.

도 29에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con) 및 스크램블-전달(shScr)군과 비교하여 shAAT에 의해 K-ras LA1 마우스의 폐에서 AAT mRNA 및 단백질 수치가 감소하였음을 확인하였다.As shown in FIG. 29, it was confirmed that AAT mRNA and protein levels were decreased in the lungs of K-ras LA1 mice by shAAT compared to the control (Con) and scramble-transfer (shScr) groups.

또한, 도 30에 나타낸 바와 같이, AAT의 면역-형광 이미지를 통해 RT-PCR 및 웨스턴 블롯과 동일한 결과를 확인하였다. In addition, as shown in FIG. 30, the same results as those of RT-PCR and Western blot were confirmed through the immunofluorescence image of AAT.

또한, AAT의 감소가 K-rasLA1 마우스의 폐에서 혈관 샌생을 변경시키는지 여부를 측정하기 위하여, K-rasLA1 마우스의 폐 및 혈청에서 마우스 OPN ELISA 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 31에 나타내었다.Further, to the reduction of the AAT to determine whether to alter the blood vessel in the lungs of saensaeng K- ra s LA1 mouse, the mouse OPN ELISA analysis was performed on the lungs and blood of the mouse K- ra s LA1, also the result It is shown in 31.

도 31에 나타낸 바와 같이, OPN의 수치는 스크램블(shScr) 및 대조군 마우스와 비교하여 K-ras 야생형 마우스(WT)뿐만 아니라 AAT이 감소된 마우스 모델의 혈청에서도 현저히 감소하였다. As shown in FIG. 31, the level of OPN was significantly reduced in serum of a mouse model with reduced AAT as well as K-ras wild-type mice (WT) compared to scrambled (shScr) and control mice.

또한, 도 32에 나타낸 바와 같이, AAT가 감소된 마우스 모델의 폐에서 TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과, TSP-1, FGF-2, 및 TIMP-1의 발현이 감소하였다.In addition, as shown in Figure 32, as a result of confirming the expression of TSP-1, FGF-2, and TIMP-1 through Western blot in the lungs of the mouse model with reduced AAT, TSP-1, FGF-2, and TIMP- The expression of 1 was decreased.

또한 암 세포 증식에 미치는 AAT 감소의 효과를 확인하기 위하여, AAT이 감소된 마우스 모델의 폐에서 CD31 및 PCNA의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하고, 이의 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC) 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 33에 나타내었다.In addition, in order to confirm the effect of AAT reduction on cancer cell proliferation, the expression of CD31 and PCNA in the lung of a mouse model with reduced AAT was confirmed through Western blot, and immunohistochemistry (IHC) analysis thereof was performed. , The results are shown in FIG. 33.

도 33에 나타낸 바와 같이, AAT가 감소된 마우스 모델의 폐에서 CD31 및 PCNA의 감소된 수치와 세포 증식 마커를 확인하였으며, 도 34에 나타낸 바와 같이, 14-주령 K-rasLA1 마우스의 폐의 총 종양의 수 및 부피는 shAAT의 에어로졸 전달에 의해 현저히 감소하였다.As shown in FIG. 33, the decreased levels of CD31 and PCNA and cell proliferation markers were confirmed in the lungs of the mouse model with reduced AAT. As shown in FIG. K-ras LA1 The total number and volume of tumors in the lungs of mice was significantly reduced by the aerosol delivery of shAAT.

또한, 상기 마우스 모델의 폐 종양 형성은 H&E 염색을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 35에 나타내었다.In addition, lung tumor formation in the mouse model was confirmed through H&E staining, and the results are shown in FIG. 35.

도 35에 나타낸 바와 같이, AAT가 감소된 마우스 모델의 폐에서 AAT 감소에 의해 폐 종양의 형성이 억제됨을 확인하였다.As shown in Fig. 35, it was confirmed that the formation of lung tumors was suppressed by the reduction of AAT in the lungs of the mouse model with reduced AAT.

상기 결과는, AAT의 감소가 K-rasLA1 마우스의 폐에서 세포 증식 및 혈관 신생의 저해를 통해 폐암을 억제한다는 것을 나타낸다.The above results indicate that a decrease in AAT inhibits lung cancer through inhibition of cell proliferation and angiogenesis in the lungs of K- ra s LA1 mice.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 알파1-안티트립신의 증가는 폐암 세포에서 암세포의 혈관 신생 및 세포 생존을 촉진시키며, 알파1-안티트립신의 감소는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제하므로, 알파1-안티트립신의 발현을 폐암의 진단 마커로서 사용할 수 있음을 확인하였으며, 알파1-안티트립신 억제는 폐암 세포의 세포 증식의 억제 및 종양 형성을 억제함으로써 폐암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. Through the above experimental results, an increase in alpha 1-antitrypsin according to the present invention promotes angiogenesis and cell survival of cancer cells in lung cancer cells, and a decrease in alpha 1-antitrypsin inhibits cell proliferation and tumor formation in lung cancer cells. Therefore, it was confirmed that the expression of alpha1-antitrypsin can be used as a diagnostic marker for lung cancer.Inhibition of alpha1-antitrypsin can effectively prevent or treat lung cancer by inhibiting cell proliferation and tumor formation of lung cancer cells. I can.

이하 본 발명의 알파1-안티트립신 억제제을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.Hereinafter, examples of the preparation of a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the alpha 1-antitrypsin inhibitor of the present invention as an active ingredient will be described, but it is intended to be described in detail only, not to limit the present invention.

제제예Formulation example 1. 약학적 제제의 제조 1. Preparation of pharmaceutical preparations

1. One. 산제의Powdery 제조 Produce

알파1-안티트립신 억제제 20 mgAlpha1-antitrypsin inhibitor 20 mg

유당 100 mg100 mg lactose

탈크 10 mg10 mg of talc

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.The above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.

2. 정제의 제조2. Preparation of tablets

알파1-안티트립신 억제제 10 mgAlpha1-antitrypsin inhibitor 10 mg

옥수수전분 100 mg100 mg corn starch

유당 100 mg100 mg lactose

스테아린산 마그네슘 2 mg2 mg of magnesium stearate

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.After mixing the above ingredients, tablets are prepared by tableting according to a conventional tablet preparation method.

3. 캡슐제의 제조3. Manufacture of capsules

알파1-안티트립신 억제제 10 mgAlpha1-antitrypsin inhibitor 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg3 mg of crystalline cellulose

락토오스 14.8 mg14.8 mg lactose

마그네슘 스테아레이트 0.2 mgMagnesium stearate 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.According to a conventional capsule preparation method, the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare a capsule.

4. 주사제의 제조4. Preparation of injection

알파1-안티트립신 억제제 10 mgAlpha1-antitrypsin inhibitor 10 mg

만니톨 180 mgMannitol 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg2974 mg of sterile distilled water for injection

Na2HPO42H2O 26 mgNa 2 HPO 4 2H 2 O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.It is prepared with the above ingredients per ampoule (2 ml) according to a conventional injection preparation method.

5. 5. 액제의Liquid 제조 Produce

알파1-안티트립신 억제제 20 mgAlpha1-antitrypsin inhibitor 20 mg

이성화당 10 g10 g of isomerized sugar

만니톨 5 g5 g of mannitol

정제수 적량Purified water appropriate amount

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.According to the usual preparation method of the liquid formulation, add and dissolve each component in purified water, add an appropriate amount of lemon flavor, mix the above ingredients, add purified water, add purified water, adjust the total to 100 ml, and fill in a brown bottle. It is sterilized to prepare a liquid formulation.

<110> Seoul National University R&DB Foundation University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Composotion comprising a1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising a1-antitrypsin <130> p-107-1 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> RNA <213> a1-antitrypsin <400> 1 gacatccaca agtccttcca acacctcct 29 <110> Seoul National University R&DB Foundation University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Composotion comprising a1-antitrypsin inhibitor for preventing or treating lung cancer and biomarker composition for diagnosing comprising a1-antitrypsin <130> p-107-1 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> RNA <213> a1-antitrypsin <400> 1 gacatccaca agtccttcca acacctcct 29

Claims (16)

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 타겟 알파1-안티트립신(α1-antitrypsin, AAT) 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 shRNA(short hairpin RNA)를 유효성분으로 포함하고,
에어로졸 제형인,
폐암 단계 II의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
It contains as an active ingredient shRNA (short hairpin RNA) that complementarily binds to the mRNA of the target alpha 1-antitrypsin (AAT) gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
An aerosol formulation,
A pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer stage II.
 제1항에 있어서, 상기 조성물은 암 세포 이동을 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐암 단계 II의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer stage II according to claim 1, wherein the composition inhibits cancer cell migration.
 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈관 신생을 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐암 단계 II의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition for preventing or treating lung cancer stage II according to claim 1, wherein the composition inhibits angiogenesis.
 제1항에 있어서, 상기 조성물은 캡-의존적 단백질 번역을 억제하는 것을 특징으로 하는, 폐암 단계 II의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the composition inhibits cap-dependent protein translation.
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