KR102240706B1 - 시계꽃 추출물을 함유하는 수면 유도용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수면 유도용 조성물에 관한 것으로 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, GABA 신경계 활성 및 혈액 멜라토닌을 향상시키면서 다른 신체 조성은 변화되지 않으므로 신진 대사의 부작용 없이 수면을 유도에 우수하다.

Description

시계꽃 추출물을 함유하는 수면 유도용 조성물{A composition for sleep induction comprising Passiflora incarnata extract}

본 발명은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 신진 대사의 부작용 없이 수면을 유도에 우수한 조성물에 관한 것이다.

인체의 중요한 생리작용 중 하나인 수면은 인간의 기본적인 기능을 유지하는데 필수적이며, 뇌 또는 신체의 손상을 회복시키는 과정이다. 수면은 삶의 질과 기능에 커다란 영향을 미치고 있으며, 전체 환자의 약 30%는 수면장애를 앓고 있다고 보고되었다. 특히, 수면은 면역 시스템과 밀접한 관계가 있다.

중추 신경계(CNS)는 자율 신경계 및 신경내분비 경로를 통해 면역 체계의 표적 세포에 신호를 보내 면역 기능을 조절한다. 이러한 경로에 의해 생성되고 방출되는 신경전달물질과 호르몬은 면역 세포와 상호 작용하여 싸이토카인(Cytokine)이 생성이 되는데, 생성된 싸이토카인은 수면을 조절한다. 뿐만 아니라 수면장애는 의욕저하 및 정신적 피로를 유발하며, 집중장애 등의 사회심리적인 현상과 신경 생리학적 현상까지 건강상의 문제를 야기시키고 전체적인 질병 회복에 악 영향을 끼친다.

이러한 수면장애를 치료하기 위해서 환자들은 다양한 수면제를 복용을 하고 있다. 수면제는 트리아졸람(triazolam), 로라제팜(Lorazepam), 디아제팜(diazepam) 등의 성분을 포함하고 있는 벤조다이아제핀(benzodiazepine)계열과 졸피뎀 성분이 대표적인 비벤조디아제핀 계열(non-benzodiazepine)과 독세핀(Doxepin), 트라조돈(Trazodone) 등의 성분을 포함하는 항우울제 계열로 나뉜다.

그러나 이러한 수면제 복용은 중독이 될 수 있으며, 장기 복용 시에 식욕 장애, 체중 증가 및 자율 신경계의 이상 등 부작용이 있어 규제가 요구되고 있고, 우울증, 불안 및 자살과 같은 신경 정신병학적인 비정상적인 행동 및 증상이 수많은 연구에서 보고되었다. 즉, 수면제로 인해 매우 위험한 신체적, 정신적 변화가보고 되었다.

따라서 신진 대사의 부작용 없이 수면을 개선할 수 있는 천연물 소재의 수면 유도제가 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제1918249호 대한민국 공개특허 제2019-0017860호

본 발명의 목적은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 신진 대사의 부작용 없이 수면을 유도할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라토닌 분비 유도용 조성물을 제공하는데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 수면 유도용 조성물은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

상기 시계꽃 추출물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.

상기 시계꽃 추출물은 시계꽃과 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 1 내지 100의 부피비로 혼합하여 추출하는 것일 수 있다.

상기 혼합용매는 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액일 수 있다.

상기 시계꽃 추출물은 500 내지 1500 mg/kg으로 이용될 수 있다.

또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 멜라토닌 분비 유도용 조성물은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 시계꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 수면 유도용 조성물은 세라토닌 및 멜라토닌 분비 등에 효과가 있고, 수면유도에 효과가 있어서 기능성 식품 또는 약학적 용도로 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1A는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군에서 분리한 해마 및 시상하부의 칼레티닌 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이며, 도 1B는 상기 도 1A의 해마의 칼레티닌 발현을 수치로 나타낸 그래프이고, 도 1C는 상기 도 1A의 시상하부의 칼레티닌 발현을 수치로 나타낸 그래프이며, 도 1D는 PI 700군 및 대조군에 추출물을 투여하는 동안(5일)의 체중 변화를 나타낸 그래프이고, 도 1E는 5일 동안 반복된 추출물의 투여 후 수면 관련 호르몬인 멜라민의 수치를 측정한 그래프이며, 도 1F는 5일 동안 반복된 추출물의 투여 후 수면 관련 호르몬인 세로토닌의 수치를 측정한 그래프이다.
도 2A는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군이 24시간 동안 식이를 섭취한 양을 나타낸 그래프이며, 도 2B는 상기 PI 700군 및 대조군이 암주기 및 24시간 동안 식이를 섭취한 양을 나타낸 그래프이고, 도 2C는 상기 PI 700군 및 대조군이 24시간 동안 물을 섭취한 양을 나타낸 그래프이며, 도 2D는 상기 PI 700군 및 대조군이 암주기 및 24시간 동안 물을 섭취한 양을 나타낸 그래프이다.
도 3A는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군의 24시간 동안 RER을 측정한 그래프이며, 도 3B는 상기 PI 700군 및 대조군의 암주기 및 24시간 동안 RER을 측정한 그래프이고, 도 3C는 상기 PI 700군 및 대조군의 24시간 동안 EE를 측정한 그래프이며, 도 3D는 상기 PI 700군 및 대조군의 암주기 및 24시간 동안 EE를 측정한 그래프이고, 도 3E는 상기 PI 700군 및 대조군의 24시간 동안 활성을 측정한 그래프이며, 도 3F는 상기 PI 700군 및 대조군의 암주기 및 24시간 동안 활성을 측정한 그래프이다.
도 4A는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군의 지방, 체액 및 제지방(Lean)을 측정하여 질량으로 나타낸 그래프이며, 도 4B는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군의 지방, 체액 및 제지방(Lean)을 구성비로 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 추출된 PI 추출물을 HPLC로 측정한 그래프이다.

본 발명은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 신진 대사의 부작용 없이 수면을 유도에 우수한 조성물을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 수면 유도용 조성물은 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 시계꽃(Passiflora incarnata)은 상록성 다년 덩굴식물로서 시계꽃의 꽃, 잎, 줄기, 뿌리, 열매를 이용할 수 있다. 아메리카 원주민들은 눈이 붓거나 염증이 생길 때 식물 전체를 사용했으며, 뿌리는 일반적으로 강장제로 사용된다. 또한 잎은 빠른 맥박을 예방하며 고혈압을 감소시키고 비중독적이고 불안의 진정제로 사용될 뿐만 아니라 천식의 근육 경련, 간질, 신경 과민, 대장성 증후군을 완화시키며 습포제로 사용되어 화상과 피부 염증을 부드럽게 한다.

본 발명의 시계꽃 추출물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비, 바람직하게는 1 : 0.2-0.5의 중량비로 혼합된 추출물이다. 시계꽃 잎을 기준으로 시계꽃 열매의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 수면 유도 효과를 기대할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 본 발명의 효과가 전혀 발현되지 않고 독성이 유발될 수 있다.

상기 시계꽃 잎과 시계꽃 열매를 함께 사용하지 않고 단독으로 사용하는 경우에는 상기 두 물질을 함께 사용하는 경우에 비하여 1.5 내지 20배로 낮은 효능을 보이며; 시계꽃 꽃, 줄기, 뿌리를 사용하는 경우에는 상기 두 물질을 함께 사용하는 경우에 비하여 5 내지 50배로 낮은 효능을 보인다.

상기 시계꽃, 예컨대 시계꽃 잎과 시계꽃 열매의 혼합물은 추출용매와 1 : 1 내지 100, 바람직하게는 1 : 5 내지 20의 중량비로 혼합하여 70 내지 100 ℃에서 추출하여 추출물을 제조한다. 상기 시계꽃 잎과 시계꽃 열매의 혼합물과, 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 시계꽃 잎과 시계꽃 열매 혼합물의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.

상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액, 바람직하게는 20 내지 80 부피%의 에탄올로 추출된 추출물이 우수한 효과를 보인다.

본 명세서에서 시계꽃을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 시계꽃 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 시계꽃 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 시계꽃 추출물은 광의로는 시계꽃을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 시계꽃의 가공물, 예컨대, 시계꽃 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 시계꽃 추출물로 실험을 진행하긴 하였으나, 시계꽃의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 시계꽃 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 시계꽃 추출물은 500 내지 1500 mg/kg, 바람직하게는 600 내지 1000 mg/kg의 농도로 사용된다. 시계꽃 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 시계꽃 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 조성물은 수면 유도를 위한 약제학적 조성물로 이용될 수 있으며, 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있고, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 시계꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 수면 유도용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 시계꽃 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 시계꽃 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 상기 시계꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 유도용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 시계꽃 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 시계꽃 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 수면 유도용 의약 또는 식품의 제조를 위한 시계꽃 추출물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 시계꽃 추출물은 수면 유도를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 시계꽃 추출물을 투여하는 것을 포함하는 수면 유도용 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 시계꽃 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 500 내지 1500 mg/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 시계꽃 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

실시예 1. 시계꽃 잎 : 시계꽃 열매 = 1 : 0.25의 중량비 추출물(PI 추출물)

시계꽃 잎과 시계꽃 열매를 1 : 0.25의 중량비로 혼합한 혼합물을 60% 에탄올과 혼합하여 80 ℃에서 4시간 동안 추출한 후 여과하고 농축한 다음 분무 건조시켜 시계꽃 추출물(PI 추출물)을 수득하였다(도 5).

<시험예>

마우스 준비

수면 유도용 조성물로서의 효과를 검증하기 위해 많은 연구가 진행되고 있으나 사람을 대상으로 하는 연구에는 한계가 있기 때문에 대부분 동물을 이용하고 있다. 실시예 1의 시계꽃 추출물의 투여가 급여, 활동 또는 대사 변화에 어떠한 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 Charles River (Incheon, Korea)로부터 구입한 C57BL/6 마우스를 이용하여 시험을 수행하였다.

실험동물은 7주령의 C57BL/6 수컷 마우스(평균 체중 22 g) 10마리를 구입하였다.

실험 시작 전 1주일간 적응시킨 후 12시간 명암주기(light cycle from 7:00-19:00) 하에서 상온(22±1 ℃) 및 60% 습도로 사육하였다. 상기 동물들은 정상적인 음식(2018S; Harlan, USA)과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 제공되었으며, 증류수 또는 시계초 추출물을 투여시작일(day 1)로부터 5일 동안 매일 소등하기 2시간 전인 17:00시 경에 경구투여하였다.

본 실험에 사용한 모든 시험물질은 매일 동일한 시간에 경구 투여하였으며, 상기 마우스와 관련된 모든 절차는 순천향대학교의 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC approval no. SCH16-0037)의 윤리적 기준에 따라 수행하였다.

-2개 군의 마우스-

대조군(Veh): 증류수(DW) 700 mg/kg_무게/day 식이군 5마리

PI 700군(PI 700): 실시예 1의 시계꽃 추출물 700 mg/kg_무게/day 식이군 5마리

상기 마우스들을 투여시작 5일째에 1g/kg의 우레탄(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 마취시키고 0.1M 인산 완충액(pH 7.4)으로 관류하여 가능한 한 많은 혈액을 제거하였다. 관류하기 전에 혈청 세로토닌과 멜라토닌 측정을 위해 복부 정맥에서 혈액을 채취하였다. 혈관을 완전히 비운 후 뇌를 제거하고 시상하부를 분리하고, 뇌 조직은 나중에 처리하기 위해 -80 ℃에서 보관하였다. 실험을 위해 Phenomasterㄾ로 모니터링하였다.

웨스턴 블롯

분리한 해마와 시상하부를 lysis buffer(iNtRon Biotechnology, Seoul, Korea)에서 균질화한 후 단백질 농도는 BCA 키트(iNtRon Biotechnology)로 측정하였다. 총 단백질(샘플 당 20μg)을 12% SDS-PAGE의 각 레인에 넣고 전기영동한 후 PVDF 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)으로 옮겼다.

그 후, 멤브레인을 10% 탈지유(BD Biosciences, CA, USA)를 함유하는 TBST [100 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.8 % NaCl 및 0.1 % Tween-20]로 차단시키고 상기 멤브레인을 다음의 1차 항체와 함께 배양하였다. 배양은 4 ℃에서 밤새 rabbit anti-calretinin(1:3000, Swant, Switzerland) 및 rabbit anti-GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 1:5000, Cell Signaling Technology, MA, USA)으로 수행되었다.

배양이 완료되면 세척한 후, 멤브레인을 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-rabbit 이차 항체(Vector, CA, USA)와 함께 배양하고, 면역 반응 신호를 향상된 화학 발광(Abclon, Seoul, Korea)을 통해 검출하며, 이를 MicroChemi 4.2 시스템으로 기록하였다.

간접 열량 측정에 의한 행동 및 대사 변화 모니터링

Phenomasterㄾ를 결합한 간접 열량계 시스템(TSE System GmBH, Bad Homburg, 독일)을 사용하여 대사 성능 매개 변수(에너지 섭취량 및 에너지 소비량)를 연구하였다. 실험 전에 마우스를 음식과 물이 들어있는 대사실에서 2일 동안 순응시킨 후 7일 동안 산소 소비량(VO₂), 이산화탄소 생산량(VCO₂) 및 음식 소비량을 측정하였다. 호흡기 환율(RER; VCO₂/VO₂)은 표준 사내 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 에너지 소비(EE)는 하기 [수학식 2]로 계산되었다.

[수학식 2]

EE = 3.815 X 10^-3 X VO₂ + 1.232 X 10^-3 X VCO₂

Mini-spec LF50(Bruker Biospins, The Woodlands, TX)을 사용하여 신체 구성(조직, 지방 및 벤치 탑 플랫폼에서 마우스의 체액)을 측정하였다.

HPLC 분석

실시예 1의 시계꽃 추출물 분말(1 g)을 50% 에탄올 수용액 50 ml에 용해시키고 10분간 초음파 처리한 후 0.45 ㎛ 주사기 필터로 여과하였다. HPLC는 모델 G1312A 바이너리 LC 펌프, 오토 샘플러 및 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1200 시스템을 사용하여 수행되었다. C-18(Waters, SunFireTMC18) 컬럼 (250 mm X 4.6 mm id 및 5μm 입자 크기)을 선택하였으며, 스탠다드는 Sigma Chemicals(미국 미주리 주 세인트 루이스)에서 구입하였다.

크로마토그래피 분리는 nanopure water(87%)와 100% acetonitrile(13%)에서 60분 동안 준비한 0.1% 인산으로 구성된 이동상으로 수행하였으며, 주입량은 20 μL였다. 이동상 유속은 1 ml min-1이고, 오븐 온도는 35 ℃이며, 검출 파장은 360 nm이다.

데이터 분석

객관성을 보장하기 위해 동일한 조건에서 실험 당 두 명의 관찰자가 모든 조건을 블라인드 조건으로 수행하였다. 웨스턴 블롯팅 동안 생성된 밴드의 강도는 하기의 [수학식 1]을 사용하여 평균 그레이 레벨을 변환함으로써 측정된 광학 밀도에 기초하여 평가되었다(NIH Image 1.59 소프트웨어 사용).

[수학식 1]

광학 밀도 = log (256/평균 그레이 레벨)

표시된 데이터는 각 실험 그룹에 대한 실험 평균 ± 표준 오차(SE)를 나타낸다. 평균값 간의 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA), 적절한 경우 t-검정 및/또는 unpaired t- 검정으로 분석하였다.

사후 분석은 피셔의 가장 중요한 차이점이나 Newman-Keul 테스트를 통해 수행되었으며, 통계 분석은 JMP9(SAS Institute, USA)와 Prism7 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. P 값(*: <0.05, **: <0.005, ***: <0.0005)은 통계적으로 유의하다고 간주되었다.

시험예 1. 반복적인 PI 투여에 의한 뇌에서의 GABA 활성화, 체중 및 호르몬 변화 측정

도 1A는 PI 700군 및 대조군에서 분리한 해마 및 시상하부의 칼레티닌 발현을 나타낸 웨스턴 블롯이며, 도 1B는 상기 도 1A의 해마의 칼레티닌 발현을 수치로 나타낸 그래프이고, 도 1C는 상기 도 1A의 시상하부의 칼레티닌 발현을 수치로 나타낸 그래프이며, 도 1D는 PI 700군 및 대조군에 추출물을 투여하는 동안(5일)의 체중 변화를 나타낸 그래프이고, 도 1E는 5일 동안 반복된 추출물의 투여 후 수면 관련 호르몬인 멜라민의 수치를 측정한 그래프이며, 도 1F는 5일 동안 반복된 추출물의 투여 후 수면 관련 호르몬인 세로토닌의 수치를 측정한 그래프이다.

도 1A 내지 도 1C에 도시된 바와 같이, PI 700군의 해마 및 시상하부에서의 칼레티닌 발현은 대조군의 해마 및 시상하부에서의 칼레티닌 발현에 비하여 월등히 높은 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 PI 추출물은 GABA 신경원에 의해 분비된 칼슘 결합 단백질로 알려진 해마 및 시상하부(hypothalamus)에서 칼레티닌(calretinin)을 증가시킨다.

또한 도 1D에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 추출물이 반복 투여된 PI 700 군의 체중 변화는 반복 투여되는 5일 동안 대조군과 유사한 것으로 확인되었다.

또한 도 1E 및 도 1F에 도시된 바와 같이, PI 700군의 혈청 멜라토닌은 대조군에 비하여 월등히 높으며, 혈청 세로토닌 수치는 PI 700군이 대조군에 비하여 약간 높은 것을 확인하였다. 파르브알부민(Parvalbumin)은 GABA 신경계의 마커로 알려져 있으며, 파르브알부민 단백질 발현은 PI 추출물을 투여한 마우스의 해마에서 대조군 보다 더 높았다(데이터 미표시).

상기 세로토닌은 카테콜아민(catecholamine)의 일종으로 wake-cycler로서 매우 중요한 역할을 담당하며, 멜라토닌 분비의 주요 조절 인자이다. 세로토닌은 멜라토닌의 분비를 자극하지만 잠을 자는 데에도 역할을 한다.

즉, 세로토닌은 PI 700군에서 증가하는 경향이 있었으나 대조군에 비하여 통계적으로 유의하지 않았으며, 멜라토닌은 PI 700군이 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다.

한편, 혈액을 샘플링한 시간부터 조명이 꺼지기 2시간 전까지 세로토닌 수치가 낮아졌고, 멜라토닌 자극이 대신 증가하였으며, 증가된 멜라토닌은 이종 생물에 의해 생성된 슈퍼 옥사이드 음이온 라디칼 수준의 감소에 의한 면역 반응을 향상시킨다.

시험예 2. 음식 섭취와 물 소비 측정

음식물 섭취와 물 소비는 Phenomaster® 대사 케이지에 의해 5일 동안 기록되었다. 상기 Phenomaster® 대사 케이지에서 얻은 모든 데이터는 24시간 명암 사이클에 대한 실시간 평균 소비량을 제공하도록 변형되었다.

도 2A는 PI 700군 및 대조군이 24시간 동안 식이를 섭취한 양을 나타낸 그래프이며, 도 2B는 PI 700군 및 대조군이 암주기 및 24시간 동안 식이를 섭취한 양을 나타낸 그래프이고, 도 2C는 PI 700군 및 대조군이 24시간 동안 물을 섭취한 양을 나타낸 그래프이며, 도 2D는 PI 700군 및 대조군이 암주기 및 24시간 동안 물을 섭취한 양을 나타낸 그래프이다. ZT는 차이트게버(zeitgeber) 시간을 의미한다.

도 2A 및 2C에 도시된 바와 같이, PI 추출물 및 증류수는 조명이 꺼지기 2시간 전에 투여되었으며, 조명이 켜지기 2-3시간 전에 PI 700군의 식이 및 물 섭취량이 크게 감소한 것을 제외하고는 통계적으로 차이가 없는 것을 확인하였다.

또한 도 2B 및 도 2D에 도시된 바와 같이, 각 암주기 동안 식이 섭취량과 물 소비량이 두 그룹 모두에서 증가하였지만 상기 두 그룹간에 체적의 차이는 발견되지 않았다. 더욱이, 각 암주기 및 전체 24시간 동안의 총 소비량은 서로 다르지 않는 것을 확인하였다.

시험예 3. 반복되는 PI 추출물의 투여에 의한 RER, EE 및 활성의 변화 측정

도 3A는 PI 700군 및 대조군의 24시간 동안 RER을 측정한 그래프이며, 도 3B는 PI 700군 및 대조군의 암주기 및 24시간 동안 RER을 측정한 그래프이고, 도 3C는 PI 700군 및 대조군의 24시간 동안 EE를 측정한 그래프이며, 도 3D는 PI 700군 및 대조군의 암주기 및 24시간 동안 EE를 측정한 그래프이고, 도 3E는 PI 700군 및 대조군의 24시간 동안 활성을 측정한 그래프이며, 도 3F는 PI 700군 및 대조군의 암주기 및 24시간 동안 활성을 측정한 그래프이다. PI 추출물 및 증류수는 조명이 꺼지기 2시간 전에 투여되었다.

도 3A 및 3B에 도시된 바와 같이, PI 700군의 RER(VCO₂/VO₂) 값은 빛주기 동안 높았으며 PI 추출물을 경구 투여한 후 약 11시간 동안 더 높은 것을 확인하였다. 그러나, 04:00~06:00시에서는 RER의 패턴이 역전되어 대조군의 RER이 상승하기 시작하였다. RER 실시간 그래프에서 유의한 3개의 시간-점만 나타났으나, 암주기 및 전체 24시간에 대한 축적된 RER의 AUC는 유의하지 않는 것을 확인하였다.

일반적으로, 에너지 소비(EE)는 깨어있는 상태보다 수면 상태에서 약 15% 적은 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 도 3C 및 3D에 도시된 바와 같이, EE 결과는 EE 실시간(도 3C)과 EE의 AUC(도 3D) 모두에서 PI 추출물을 투여 후 암주기 동안 PI 700군에서 약 16% 감소되었다. 축적된 EE의 결과는 24시간 동안 PI 700군에서 8.8%의 감소를 보였다.

또한 도 3E 및 3F에 도시된 바와 같이, PI 추출물을 투여 후 PI 700군은 대조군보다 실시간 활동 그래프에서 암주기 동안 낮은 활성을 나타내었으며, 조명이 켜지기 2시간(빨간색 점원) 전부터 점진적으로 증가하다가, 점등 후 대조군과 유사한 활성을 보이는 것을 확인하였다.

PI 700군은 암주기 동안 낮은 활성을 유지했으며, PI 700군의 누적 활성은 상당히 낮은 것을 확인하였다.

시험예 4. 반복되는 PI 추출물의 투여에 의한 신체 조성의 변화 측정

도 4A는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군의 지방, 체액 및 제지방(Lean)을 측정하여 질량으로 나타낸 그래프이며, 도 4B는 PI 추출물 및 증류수를 반복 투여한 PI 700군 및 대조군의 지방, 체액 및 제지방(Lean)을 구성비로 나타낸 그래프이다.

동물을 희생하기 직전에 마우스의 신체 조성을 신속하게 측정하였다. 획득된 지방, 체액 및 제지방은 일반적으로 전체 체중의 약 95%를 차지하는 것으로 알려져 있다.

도 4A 및 4B에 도시된 바와 같이, PI 700군 및 대조군 간의 지방, 체액 및 제지방(Lean)의 함량 차이는 없는 것을 확인하였다. 이 데이터는 반복된 PI 추출물의 구강 투여가 신체 조성을 변화시키지 않았다는 것을 의미한다.

본 발명의 이러한 결과는 PI 추출물이 GABA 신경계 활성 및 혈액 멜라토닌 수준을 증가시키는데 효과적임을 의미하며, 마우스가 일반적으로 암주기에서 활성을 보일 때 EE의 유의한 감소를 보이는 것을 확인하였다. 즉, 식욕의 증가 또는 체중의 증가가 관찰되지 않았고, 모든 신체 조성은 변화되지 않았다. 오직 수면만 변화되었다.

본 발명은 PI 추출물을 마우스에 5일간 반복 투여하여 과다증 또는 예상치 못한 대사 변화와 같은 비정상적인 대사성 표현형이나 행동의 부작용을 발견하지 못하였으므로, 신진 대사의 부작용 없이 수면 유도제로 사용될 수 있다.

하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 500 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 300 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 200 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 600 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 4 g

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 과립제의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

실시예 1에서 얻은 추출물 분말 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (6)

1. 시계꽃(Passiflora incarnata) 추출물을 유효성분으로 함유하며,
   상기 시계꽃 추출물은 시계꽃 잎과 시계꽃 열매가 1 : 0.1-0.8의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 수면 유도용 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 시계꽃 추출물은 시계꽃과 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 1 : 1 내지 100의 부피비로 혼합하여 추출하는 것을 특징으로 하는 수면 유도용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 혼합용매는 20 내지 80 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액인 것을 특징으로 하는 수면 유도용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 시계꽃 추출물은 500 내지 1500 mg/kg으로 이용되는 것을 특징으로 하는 수면 유도용 조성물.
6. 삭제

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