KR102238258B1 - 간암 진단을 위한 신규 바이오마커 및 이를 이용한 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 LINC01572을 포함하는 간암 진단용 바이오마커 조성물, 이의 억제제를 포함하는 간암 치료제을 제공한다.
본 발명에 따른 바이오마커들은 간암의 진단에 우수한 효과를 보여, 간암 환자의 분류, 이에 따른 치료제 선택, 및 치료 계획 수립에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 이를 표적으로 하여 억제하는 경우 간암에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

간암 진단을 위한 신규 바이오마커 및 이를 이용한 치료 방법{A NOVEL BIOMARKER FOR DIAGNOSING LIVER CANCER AND A TREATING METHOD USING THEREOF}

본 발명은 간암 진단을 위한 신규 바이오마커 조성물, 이를 이용한 간암의 진단 방법, 상기 바이오마커에 대한 억제제를 포함하는 간암 치료 용도에 관한 것이다.

암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망 원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 흡연 인구의 증가 및 대기 오염으로 인해 폐암이 증가하고 있으며, 식생활이 서구화되어 고지방식의 섭취가 일반화되고, 환경오염 물질의 급격한 증가, 음주량의 증가 등으로 간암, 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가하는 추세에 있다. 이러한 실정에서 암의 조기 예방 및 치료를 가능하게 하여 인간 건강의 증진, 건강한 삶의 질 향상 및 인류 보건 증진에 기여할 수 있는 항암 물질의 창출이 절실히 요구되고 있다.

그 중에서도 간암은 한국인 남성에서 4위, 그리고 여성에서 6위를 차지하는 암으로써 국내 전체 암 사망자 중 약 22% 이상 (2015년 기준)을 차지하는 대표적인 고위험 한국인 호발암이다. 또한 환자 1명당 치료비용이 약 6,622만원으로 한국인 호발암 중 가장 많은 치료비용이 필요하며 사회·경제적 의료 부담을 증가시키는 주요 질환에 해당한다. 간암은 바이엘사의 넥사바(Nexavar)가 현재 유일한 치료제인데 연평균 10% 이상의 고성장을 통해 연간 1조 2천억원의 시장을 형성하고 있다.

간암의 진단은 뚜렷한 고위험군에 대한 감시 검사로 주로 진행되었으나 국내에서 간암으로 진단받은 환자 중 검진에 의해 발견되는 경우가 50%에 미치지 못한다. 현재까지 간암 진단을 위해 AFP와 PIVKA II 단백질을 이용한 바이오마커 개발이 진행되었으나 간암 환자별 치료 효과 및 예후를 예측할 수 있는 고성능 바이오마커 및 진단시스템 개발은 부진한 상태이다. 또한, 최근 TCGA (The Cancer Genome Atlas)와 같은 대규모 암유전체 프로젝트에서 암에 대한 대규모 유전체/전사체/후성유전체 분석을 수행하여 다수의 유전체/전사체/후성유전체 변이를 보고하고 새로운 분자아형들을 제시하고 있으나, 간암 환자 예후와 연관성 있는 바이오마커는 아직까지 체계적으로 개발되어 있지 않은 상태이다.

한편, 인간 게놈의 약 90%에서 RNA polymerase에 의한 전사가 일어나며 대부분의 RNA는 단백질을 암호화하지 않는 noncoding RNA이다. 이러한 noncoding RNA는 길이 및 기능에 따라 분류되며, transfer RNA, ribosomal RNA, miRNA, siRNA, 그리고 long noncoding RNA (lncRNA)의 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 최근 새로운 noncoding RNA의 한 종류로서, 활성화된 enhancer에서 만들어지는 enhancer RNA (eRNA)의 존재가 밝혀졌다. eRNA는 길이와 만들어지는 방식에 따라 1D(unidirectional) eRNA와 2D(bidirectional) eRNA로 구분이 된다. 최근 활발히 연구되고 있는 lncRNA와 달리 5' capping은 일어나지만 splicing이나 polyadenylation은 나타나지 않는 것으로 알려져 있다.

따라서, 간암 세포주, 환자 유래의 조직 및 오가노이드를 기반으로 한국인 간암 특이적 enhancer 및 eRNA들을 발굴하여 암 발병기전을 이해하고 간암 진단 및 치료를 위한 신규 타겟을 제시할 필요성이 있다. 더욱이, 신규 enhancer 및 eRNA의 조절기전을 규명하여 간암 특이적 예측 시스템을 개발하기 위한 노력이 필요하다.

한편, 간은 체내의 혈액을 대부분 여과하고 다양한 독성을 나타낼 수 있는 약물의 작용을 완화시키는 역할을 하는데, 이러한 간에 암이 발생하게 되면 독성 문제로 인하여 사용가능한 항암제의 종류가 매우 제한되게 된다. 이에 따라, 일반적으로 넥사바(소라페닙)를 치료제로써 사용하고 있는데, 치료 효과가 다른 항암제에 비해 충분히 만족스럽지 못하여 새로운 약물에 대한 요구가 상당히 많은 실정이다. 특히, 간암의 경우, 3기 또는 4기에 이르게 되면 원격성 전이가 많이 일어나게 되어 폐나 기타 장기들로 암의 전이가 많이 일어나게 되며, 이러한 전이에 대해서, 위 언급한 간 자체의 문제로 인하여 약물의 사용이 매우 한정되기 때문에, 전이에 대한 치료를 해결하지 못하여 다수의 환자가 사망하게 되는 결과를 나타낸다.

한국공개특허 제10-2019-0024379호 한국공개특허 제10-2019-0002874호

이에, 본 발명자들은 간암 세포주들을 이용하여 통합 전사체 분석을 실시하고, 간암 세포주에서 활성화된 enhancer를 발굴하기 위해 histone H3, H3K4me1과 H3K27ac에 대한 ChIP-sequencing을 실시하였으며, Enhancer 부위 확인을 위해 ATAC-seq을 수행하여 히스톤 ChIP-seq에서 확보한 enhancer peaks로 통합 분석을 수행하였다.

이에 따라, 간암 세포주로부터 활성화된 enhancer를 발굴하고, LINC01572을 The Cancer Genome Atlas(TCGA)의 데이터를 통해 분석한 결과, 정상인 대비 간암 환자에서 증가되어 있는 것으로 나타났다.

이러한 실험 결과를 바탕으로 검토하여 볼 때, LINC01572가 간암에 대한 특이적인 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

특히, 본 발명에 따른 바이오마커들은 ChIP-seq 분석, TCGA에서 모두 동일 결과를 나타내는 것을 확인하였다는 점에서 마커로써 우수한 효과가 인정된다.

또한, 본 발명에 따른 바이오마커는 LINC01572 자체 뿐만 아니라 TAD 그룹 및 발현 상관관계 기반 타겟 유전자에서도 동일한 발현 패턴을 확인하고 관련 그룹을 더 포함할 수 있는 점에서 보다 더 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다.

상기 발현 상관관계 기반 타겟 유전자에 대해 보다 구체적으로 설명하면, eRNA는 유전자 발현조절, 특히 타겟 유전자 발현의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있기 때문에, eRNA의 발현 정도와 타겟 유전자의 발현 정도는 매우 높은 상관관계를 나타낼 가능성이 있다. 따라서 각 eRNA(발현의 증가 혹은 감소)와 동일한 발현변화 패턴을 나타내는 유전자들을 선별하고 이를 발현 상관관계 기반 타겟 유전자의 대상으로 검토할 수 있다. 여기서 검출된 동일 발현 패턴을 보이는 유전자들을 발현 상관관계 기반 타겟 유전자로 선정하였다. 즉, eRNA가 regulator의 역할을 할 수 있기 때문에, eRNA의 발현량과 유의한 연관성이 있는 mRNA를 correlation test를 통해 선별하여 이를 eRNA의 타겟 유전자로 정의하였다.

또한, LINC01572를 특이적으로 억제하는 경우, 간암에서 우수한 치료 효능을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 하나의 목적은 LINC01572 바이오마커를 포함하는 간암의 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 LINC01572 eRNA(바이오마커)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

LINC01572의 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 LINC01572의 eRNA 발현 수준을 측정하는 단계;

(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 LINC01572의 발현 수준과 비교하는 단계; 및

(c) 상기 생물학적 시료의 LINC01572의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 LINC01572의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

LINC01572 억제제를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 LINC01572의 바이오마커를 포함하는 간암의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

상기 하나 이상의 eRNA는 독립적 또는 조합으로 간암의 진단용 바이오마커로 사용될 수 있다.

간암은 간세포가 지속적인 다양한 자극에 의해 자신의 고유 기능을 상실하고 암세포로 변신하여 끊임없는 자기증식을 이루면서 주변 또는 먼 곳으로 퍼져 나가는 특징을 갖게 되는 종양을 말하며, 원발성 종양과 간에서 발생하여 다른 장기로 이전된 전이암이 있다. 원발성 간암은 간세포의 이상으로 발생하는 간세포암과 담관세포의 이상으로 발생하는 담관암, 맥관육종을 포함하며, 90% 이상이 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)이다.

본원에 따른 간암은 조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양이며, 간세포암이다. 간세포암은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 간경변 또는 간경화를 포함하는 대사성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 고위험군 환자에서 빈발한다. 간세포암은 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다.

암의 진단 및 병기는 일반적으로 수술이나 생검으로 획득한 조직을 조직검사를 통해 암 세포의 종류와 분화도, 전이 정도 등에 따라 암종의 진행 병기를 결정한다. 즉 일반적인 고형암은 치료 및 예후가 TNM 병기에 의해 결정된다.

그러나, 간암의 경우, TNM 병기만으로 치료방법을 선택하거나 예후를 예측하기 어려울 수 있다. 이는 대부분의 간암환자에서 만성 간질환이 병발되어 암과는 별개의 진행된 간질환만으로도 치료방법 선택에 제한이 있기 때문이다.

따라서, 본 발명에 따른 마커를 사용하는 경우 간암의 발병을 모니터링하고 조기 진단할 수 있다. 본 발명에서 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간암의 발병 여부, 간암의 예후, 간암으로 진행 가능성 등을 확인하는 것이다. 예를 들어, 병명을 판정하는 일을 말하고, 간암의 병명, 병의 상태, 병기, 병인, 합병증의 유무, 예후, 및 재발 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 바이오마커는 간암을 정상 간세포 등과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 간암에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: eRNA, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 간암 진단용 바이오마커는 정상 간의 세포에 비해 간암에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내는 LINC01572의 eRNA이다.

본 발명에서 enhancer RNA (eRNA)는 noncoding RNA의 한 종류로서 활성화된 enhancer에서 만들어지는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 LINC01572(long intergenic non-protein coding RNA 1572) (ENSG00000261008) 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 GeneID: 101927957로 등록되어 있다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, LINC01572를 The Cancer Genome Atlas (TCGA)의 데이터 간암 샘플을 통해 분석한 결과, 정상인 대비 간암 환자에서 증가되어 있는 것으로 나타났다.

이러한 실험 결과를 바탕으로 검토하여 볼 때, LINC01572가 간암에 대한 특이적인 바이오마커로 활용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오마커 조성물은 단독으로 이용될 수 있고, 기타의 간암에 대한 마커들과 함께 조합되어 이용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 바이오마커 조성물은 LINC01572 eRNA가 속한 TAD(Topologically Associated domains)내의 유전자로 PMFBP1, ZNF821 또는 이들 모두를 마커로 더 포함할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 LINC01572와 동일한 TAD 내 mRNA로써 PMFBP1(polyamine modulated factor 1 binding protein 1, GeneID: 83449) 및 ZNF821 (zinc finger protein 821, GeneID: 55565)은 LINC01572와 유사하게 정상 시료와 대비하여 간암 시료에서 높게 발현된다.

또한, LINC01572 eRNA와 관련된 mRNA로 C14orf93(chromosome 14 open reading frame 93, GeneID: 60686), CEP152(centrosomal protein 152, GeneID: 22995), DXO(decapping exoribonuclease, GeneID: 1797), HELLS(helicase, lymphoid specific, GeneID: 3070), NCAPH2(non-SMC condensin II complex subunit H2, GeneID: 29781), NFKB2(nuclear factor kappa B subunit 2, GeneID: 4791), NMB(neuromedin B, GeneID: 4828), SFSWAP(splicing factor SWAP, GeneID: 6433), STK19(serine/threonine kinase 19, GeneID: 8859) 및 TIGD5 (tigger transposable element derived 5, GeneID: 84948)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 마커로 더 포함할 수 있다. 즉, LINC01572 eRNA와 관련하여 TCGA LIHC Tumor 상 상관관계가 높은 mRNA로 C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19, TIGD5는 LINC01572와 유사하게 정상 시료와 대비하여 간암 시료에서 높게 발현된다.

상기 TAD 내 mRNA 및 관련된 mRNA(발현 상관관계 기반 타겟 유전자들)는 LINC01572 eRNA와 간암 및 정상 조직에서 동일 유사 발현 패턴을 보이기 때문에, 보다 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다. 즉, 상기 언급된 mRNA들은 정상 간 조직과 대비할 때 간암에서 높게 발현된다.

본 발명은 또한, LINC01572의 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 조성물을 제공한다.

LINC01572의 바이오마커의 발현 수준은 eRNA의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명에서 "eRNA 및/또는 mRNA 발현수준 측정"이란 간암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 eRNA 및/또는 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, eRNA 및/또는 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

eRNA 및/또는 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, LINC01572의 유전자의 핵산 서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서는 예를 들어 LINC01572의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 프로브는 eRNA 및/또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 eRNA 및/또는 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들어 본 발명에서는 LINC01572의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 LINC01572의 수준을 측정하는 제제 및 방법에 대한 예시는 PMFBP1 ZNF821, C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5에도 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 간암의 진단용 조성물은 단독, 또는 2 이상의 바이오마커의 조합에 대한 eRNA, 및/또는 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 제한없이 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 간암의 진단용 조성물은 LINC01572 eRNA가 속한 TAD 내의 유전자로 PMFBP1, ZNF821 또는 이들 모두의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

또한, LINC01572 eRNA와 관련된 mRNA로 C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

상기 TAD 내 유전자 및 관련된 mRNA는 LINC01572 eRNA와 간암 및 정상 조직에서 동일 유사 발현 패턴을 보이기 때문에, 보다 정확한 진단 정보를 제공할 수 있다.

또한, 필요에 따라, 마커의 양을 확인할 수 있는 공지된 방법이면 제한없이 이용할 수 있기 때문에, 다중 마커들, 즉 eRNA의 다량 분석을 위해 ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq, CLIP-seq, RIP-seq 및 luciferase assay로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 mRNA를 고려할 때의 발현 수준의 측정은 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하는 것일 수 있다. 즉, PMFBP1 ZNF821, C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5에 대해서는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제로써 이의 발현 변화의 측정을 하는 것이 또한 가능하다.

"단백질의 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 구체적으로는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

상기 항체를 이용하여 이와 결합한 표적 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 LINC01572의 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 간암 진단을 위한 바이오마커인 LINC01572의 바이오마커, 즉 eRNA의 발현 수준을 확인함으로써 검출할 수 있다. 본 발명의 진단용 키트에는 간암 바이오마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적으로, LINC01572의 eRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 바이오마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭용 시약은 중합효소, dNTP, 완충제, 핵산, 조효소, 형광물질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 중합 효소는 예를 들어 Taq 중합효소이다. 상기 키트는 핵산 분리용 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 분리용 시약은 세포 용해 용액을 포함할 수 있다. 세포 용해 용액은 염, 계면활성제, 금속 이온, 당, 환원제(예, DTT), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 간암의 진단용 키트는 앞서 살핀 조성물에서와 같이 단독, 2 이상의 바이오마커의 조합에 대한 즉, eRNA; 및 상기 관련 mRNA 또는 TAD 내 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직한 예는 앞서 살핀 바와 같다.

mRNA의 발현 수준 측정에 관한 사항은 앞서는 eRNA의 발현 수준 측정에 관한 사항을 적절히 적용할 수 있다.

이에 따라, LINC01572 eRNA가 속한 TAD 내의 유전자로 PMFBP1, ZNF821 또는 이들 모두의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으며, 및/또는 LINC01572 eRNA와 관련된 mRNA로 C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하여 키트를 구성할 수 있다.

eRNA 및 mRNA를 기반으로 측정되고 제공되는 키트는 위 살핀바와 같다.

한편, mRNA 마커의 단백질을 기초로 고려할 때, 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하는 키트가 더 포함되어 제공될 수 있다. 예를 들어, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 LINC01572의 발현 수준을 측정하는 단계;

(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 LINC01572의 발현 수준과 비교하는 단계; 및

(c) 상기 생물학적 시료의 LINC01572의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 LINC01572의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 (a) 및 (b) 단계의 발현 수준을 eRNA 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 eRNA 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 "시료"란 세포, 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료를 포함하며, 바람직하게 간 조직 시료이다.

상기 발현 수준 측정을 통하여, 정상 대조군에서의 eRNA 발현 수준을 간암 의심환자에서의 eRNA 발현 수준과 비교함으로써 간암 의심 환자의 간암 여부 발병 및 진행을 진단할 수 있다.

즉, 간암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 더 많이 발현되면 간암으로 추정되며, 이에 따라 간암으로 예측할 수 있는 것이다.

eRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 eRNA 발현량과 간암 의심환자에서의 eRNA 발현량을 비교할 수 있고, 간암 바이오마커 유전자에서 eRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 간암 의심 환자의 발병 여부를 진단할 수 있다.

eRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 간암 바이오마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 간암 바이오마커로 사용되는 유전자의 eRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 간암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

DNA 칩은 상기 간암 바이오마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 eRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 간암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 간암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 앞서 살핀 조성물에서와 같이 2 이상의 바이오마커의 조합에 대한 발현 수준 측정을 제한없이 포함할 수 있으며 바람직한 예는 앞서 살핀 바와 같다.

상기 언급한 (a) 단계의 eRNA의 측정에 더하여, 추가로 PMFBP1 ZNF821, C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 하는 단계를 포함할 수 있다. 이에 따라, (b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 PMFBP1 ZNF821, C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 생물학적 시료의 PMFBP1 ZNF821, C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 LINC01572의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 측정 및 판정 방법은 위 살핀 내용을 적절히 변형하여 적용할 수 있다.

본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 LINC01572의 발현 수준을 측정하는 단계;

(b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 LINC01572의 발현 수준과 비교하는 단계; 및

(c) 상기 생물학적 시료의 LINC01572의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 LINC01572의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계; 및

(d) 상기 간암으로 판정된 환자에게 약학적으로 유효한 양의 항암제를 투여하는 단계를 포함하는 간암의 치료 방법을 제공한다.

상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 항암제를 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 위 언급한 바와 같이, 각 단계에서 추가로 상기 관련 mRNA 또는 TAD 내 mRNA의 발현 수준에 대한 확인 및 판단을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 LINC01572 발현 억제제를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

LINC01572 발현 억제에 의해, 간세포 사멸 증가, 세포의 전이 변화, 즉, 이동 및 침윤 능력 변화 억제 등의 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 용어 "LINC01572 억제제"는 LINC01572의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 LINC01572의 발현 감소에 영향을 주거나 LINC01572에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식으로, LINC01572의 발현양을 전사(transcription), mRNA 수준, 또는 이행 (translation) 수준에서 감소시키거나, LINC01572 활성을 방해함으로써, LINC01572의 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.

상기 LINC01572의 억제제는 LINC01572의 발현 또는 LINC01572을 표적으로 하여 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한 없이 사용 가능하다. 상기 LINC01572 억제제는 이에 제한되지는 않으나, LINC01572 유전자의 mRNA를 분해시키는 siRNA 또는 shRNA, LINC01572 단백질의 발현을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있다. 또한, LINC01572 단백질에 결합하여 기능을 억제하는 LINC01572 억제제로 앱타머(aptamer) 또는 저분자 화합물일 수 있다.

예시적인 일 구현 예에서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1을 가지는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 LINC01572을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 간암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, "예방"은 본 발명에 따른 LINC01572을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 간암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 RNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, RNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 RNA의 작용을 억제한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 LINC01572 eRNA에 상보적이고 상기 eRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 LINC01572 eRNA의 번역, 세포질 내로의 전위 (translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 예는 RNA 중합효소 I을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록하는 한 가지 예는 다중클로닝부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 LINC01572의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 제작할 수 있다.

본 발명에서 용어, "앱타머 (aptamer)"는 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 (modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 LINC01572에 결합하여 LINC01572의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 LINC01572의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱 (silencing)을 매개할 수 있는 핵산분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운 (knock down) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀 (hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서 (dicer)에 의해 절단되면서 21 내지 25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 LINC01572에 특이적으로 작용하여 LINC01572 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭 (RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 LINC01572을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소 학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내 (in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내 (in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR (polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트 (cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 양태는 LINC01572 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 간암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 인간을 제외한 개체일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암의 치료에 우수한 효과를 보이며 또한 간암의 전이를 억제할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 비율로 질환을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 약학적으로 유효한 양은 0.5∼1000 ㎎/day/체중㎏, 바람직하게는 0.5∼500 ㎎/day/체중㎏이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는 간암 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 LINC01572 억제제를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 양태는 간암 치료에 사용하기 위한 LINC01572 억제제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 LINC01572의 바이오마커와 이와 관련된 유전자들은 간암의 진단에 우수한 효과를 보여, 간암 환자의 분류, 이에 따른 치료제 선택, 및 치료 계획 수립에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 간암 특이적 enhancer 및 eRNA 발굴을 위한 전체 프로세스에 대한 모식도를 나타낸다.
도 2는 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는 eRNA를 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는 LINC01572의 TAD 내 유전자의 발현량 차이, 유의성을 확인한 박스플랏 결과를 나타낸다.
도 4는 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는 LINC01572의 TAD 내 유전자의 발현량 차이, 유의성, 발현 패턴을 나타내는 도이다.
도 5는 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는 LINC01572와 발현 상관관계 분석을 통해 확인한 하위 타겟유전자의 발현량 차이, 유의성을 확인한 박스플랏 결과를 나타낸다.
도 6은 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 기초로 정상대조군 대비 간암에서 높게 발현되는, LINC01572와 발현 상관관계 분석을 통해 확인한 하위 타겟유전자의 발현량 차이, 유의성, 발현 패턴을 나타내는 도이다.
도 7은 LINC01572에 대한 antisense oligo 처리에 따른 억제 효능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 LINC01572가 Knock down에 따른 세포 성장 억제를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 또는 제제예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation-sequencing) 분석

간암 특이적 enhancer 및 eRNA 발굴을 위해 총 8개의 간암(HCC) 세포주 (FT 3-7, Huh 7, Huh 7-5, PCLC PRF 5, SNU 182, SNU 387, SNU 449, HepG2)를 이용하였다.

HCC 세포주들을 1 % 파라포름알데히드로 고정하고 글리신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 펠릿을 용해 완충액 (5mM PIPES pH 8.0, 85nM KCl, 0.5 % NP40, 1X 프로테아제 억제제 (Roche))에 용해시키고 sonication 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA pH 8.0, 0.1% SDS, 0.1 % Na-Deoxycholate, 1 % Triton X-100)으로 대부분의 조각 크기가 200 ~ 300bp 범위에 있을때까지 milliTUBE 또는 microTUBE에서 60 분 동안 초음파처리(diagenode)하였다. 각각의 면역 침강에 대해 항체를 첨가하고 실온에서 2 시간 회전시켜 비드 (DynabeadsTM Protein A, Invitrogen)에 결합시켰다. 사용된 항체는 H3 (면역 침 전당 2μg, Abcam ab1791), H3K27ac (면역 침 전당 2 μg, Abcam ab4729) 및 H3K4me1 (면역 침 전당 2 μg, Abcam ab8895)이었다. 대조군 라이브러리의 경우, 1 μg의 비특이적 IgG 마우스 항체를 사용한 면역 침전이 사용되었다. block된 항체-접합된 비드를 자석에 놓고 상층액을 제거하고 초음파 처리된 용해물을 비드에 첨가한 다음 회전기, 4 °C에서 3 ~ 4 시간 동안 배양하였다. 비드를 세척한 다음 태그를 반응시켰다 (Nextra® DNA Library Prep Kit, illumina). 비드를 세척하고 2.5μl의 Proteinase K (Roche) 및 1.5ul의 10 % SDS를 포함하는 1X TE 완충액 (10mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA)으로 65 °C에서 밤새도록 용출하여 포름알데히드 cross-linking을 revert하였다. 마지막으로, DNA를 AMPure XP 비드로 정제하고 각 라이브러리를 증폭하였다 (Nextra® DNA Library Prep Kit, Nextra® Index Kit, illumina). 증폭된 라이브러리는 AMPure XP 비드를 사용하여 정제한 다음 AMPure XP 비드를 사용하여 크기를 선택하여 200-400bp의 조각 길이를 가진 라이브러리를 복구하였다. RNA 라이브러리 시퀀싱은 Illumina HiSeq2000 플랫폼에서 수행되었다.

< 실험예 2> ChIP - seq 및 Total RNA- seq 분석

활성화된 enhancer 발굴을 위해 H3K4 monomethylation (H3K4me1)과 H3K27 acetylation에 대한 ChIP-seq을 수행하였다. 또한 활성화된 enhancer로부터 발현되는 eRNA의 발굴을 위해 상기 8개의 간암세포주로부터 총 RNA 추출하여 total RNA-seq을 수행하였다.

구체적으로, Chip seq를 위하여, ‘FastQC’로 리드 퀄리티 체크 진행 후, ‘Trimmomatic’으로 리드 필터링을 진행하였다. ‘Bowtie2’로 alignment를 진행한 뒤 non-uniquely aligned reads 및 potential PCR duplicates를 제거한 BAM파일을 생성하였다. 이후 ‘MACS14’를 사용해 peack calling을 진행하고, ‘HOMER’로 peak annotation을 진행하였다.

또한, RNA seq를 위하여, ‘FastQC’로 리드 퀄리티 체크 진행 후, ‘Trimmomatic’으로 리드 필터링을 진행하였다. ‘Tophat’을 사용하여 total RNA-seq 리드를 Reference genom에 alignment하였다. Reference genome은 Ensembl의 GRCh38을 사용하였다. 이후 ‘Cufflinks’를 수행하고, 유전자의 발현량을 FPKM으로 구하였다.

<실험예 3> 간암 특이적 enhancer 및 eRNA 발굴

간암세포주에서 특이적으로 활성화된 enhancer 및 이로부터 발현되는 eRNA 발굴을 위해, 활성화된 enhancer에서 높게 나타나는 것으로 알려진 H3K27 acetylation peaks을 전체 genome 상에서 선별하였다. 활성화된 enhancer만을 발굴하기 위해 유전자의 promoter나 내부에서 나타나는 H3K27 acetylation peaks은 제외하였다. 다음으로 enhancer에 대한 마커로 알려진 H3K4 monometylation (H3K4me1)의 peaks을 전체 genome에서 선별하였고, 최종적으로 H3K27 acetylation과 H3K4 monomethylation이 동시에 높게 존재하는 활성화된 enhancer 부위를 선별하였다.

또한 활성화된 enhancer에서 발현되는 eRNA를 발굴하기 위해 total RNA-seq 데이터와 통합 분석을 진행하였다.

이와 관련된 일련의 분석 모식도를 도 1에 나타내었다.

<실험예 4> eRNA의 하위 타겟유전자 선별

1) TAD 분석을 통한 하위 타겟유전자 선별

TAD(Topologically associating domain)는 유전자 발현을 조절하는 enhancer와 이에 의해 발현이 조절되는 타겟유전자가 염색체 내에서도 동일한 공간에 포함되어 있는 것을 의미한다. 선별된 eRNA의 타겟유전자 선별을 위해 TAD 분석을 진행하였고, 이를 통해 각 eRNA에 의해 조절될 것으로 예상되는 타겟유전자들을 선별하였다.

2) 발현 상관관계 기반 타겟유전자 선별 (Correlation-based identification of target genes)

eRNA는 유전자 발현조절, 특히 타겟유전자 발현의 활성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 eRNA의 발현정도와 타겟유전자의 발현 정도는 매우 높은 상관관계를 나타낼 가능성이 있다. 따라서 각 eRNA(발현의 증가 혹은 감소)와 동일한 발현변화 패턴을 나타내는 유전자들을 선별하여 이를 타겟유전자 후보군으로 선정하였다.

<실험예 5> TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 이용한 검증

정산인 간암 시료 50례와 간암환자 시료 50례에서 생산된 RNA-seq 데이터를 활용하여 선별된 eRNA의 발현 패턴을 분석하였다.

< 실험예 6> LINC01572에 대한 antisense oligo 효능 검증 관련

LINC01572에 대한 antisense oligonucleotide(ASO)는 Qiagen에서 custom-design 하여 구입하였다. 해당 ASO는 LINC01572 유전자의 6번째 엑손내의 위치하는 염기서열(5’-CAGTCTGTCTCTATGT-3’-서열번호 2)과 상보적으로 결합하는 것으로 그 서열은 다음과 같다(5’-ACATAGAGACAGACTG-3’-서열번호 1).

이 customized ASO를 transfection하기 위해 lipofectamine RNAimax (invitrogen)를 사용하였다. Transfection시, customized ASO(20nM)와 lipofectamine RNAimax (2ul-24well기준)를 섞은 후 FT 3-7세포에 처리하였다. 첫번째 transfection을 진행하고 24시간 이후에 두 번째 transfection을 진행하였고 48시간 후 (총 72시간 incubation) cell을 harvest 하였다. Cell의 total RNA는 RNeasy Mini Kit(qiagen)를 사용하여 isolation하였고, 유전자의 Knock-down efficiency는 real time PCR를 이용하여 확인하였다.

< 실험예 7>LINC01572가 Knock down에 따른 세포 성장 억제 확인

두 번의 transfection을 통해 효과적으로 LINC01572가 Knock down된 FT3-7 cell을 24well에 다시 seeding한 후, seeding한 당일부터 72시간 까지 세포의 생장을 확인하였다.

<실험결과>

1. 간암세포주에서 발현되는 eRNA 발굴 및 4개의 간암세포주를 이용한 분석

전체 8개의 간암세포주를 이용하여 활성화된 enhancer와 이로부터 발현되는 eRNA를 분석하여, 총 6개의 eRNA를 발굴하였다.

그리고 나서, 8개의 간암세포주 중 유전자 발현 패턴이 유사한 4개의 간암세포주 (F-3-7, Huh-7-5, SNU182, PLC-PRF-5)를 이용하여 총 45개의 eRNA을 선별하였고, 이 중 6개의 eRNA는 8개의 간암 세포주 모두에서 발현되는 것을 확인하였다.

그 구체적 분석 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, THUMPD3-AS1, TRAF3IP2-AS1, LINC00511, SAP30L-AS1, LINC01572, AL136311.1의 6종 eRNA가 8개의 간암세포주에서 모두 발현되는 것이 확인되었다.

2. TCGA 데이터를 이용한 검증

TCGA 데이터를 이용하여 발굴된 45개의 eRNA의 발현패턴을 확인하였다. 총 11개의 eRNA는 정상(Normal) 간조직 (50례) 대비 간암조직(Tumor) (50례)에서 발현이 증가하였다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 그 중 특히 LINC01572의 경우 우수한 진단 효과(즉, 간암과 정상 대조군 사이에 매우 유의적 의미를 가지는 발현 차이를 나타냄)를 나타내었다.

3. eRNA의 하위 타겟유전자 확인

1) TAD 분석을 통한 하위 타겟유전자 선별

eRNA가 속한 TAD 내의 유전자 발현 패턴을 분석한 결과를 아래 표 2 및 도 3과 도 4에 나타내었다. Q < 0.01 이면서 normal.mean < tumor.mean 인 유전자들을 선별하였다. box plot에 표기된 유의값은 Q value(adjusted P)이다.

eRNA	mRNA	TCGA normal.mean	TCGA tumor.mean	adjust.p
LINC01572	PMFBP1	3.42E-02	1.21E-01	5.40E-03
LINC01572	ZNF821	3.53E-01	4.73E-01	6.78E-04

도 3 및 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, PMFBP1, ZNF821에 대해 동일 발현 패턴(즉, 정상대조군 대비 간암에서 증가)을 나타내었으며, LINC01572의 직접적인 하위 타겟유전자일 가능성이 높음을 확인하였다.

2) 발현 상관관계 분석을 통한 하위 타겟유전자 선별

eRNA(발현의 증가 혹은 감소)와 동일한 발현변화 패턴을 나타내는 유전자들을 선별하여 이를 타겟유전자 후보군으로 선정하여 검토한 결과 총 16개의 관련 유전자 중 10 종에 대해서 동일 발현 패턴(즉, 정상대조군 대비 간암에서 증가, 62.5 %)을 나타내는 것을 확인하였다.

해당 결과를 표 3 및 도 5와 도 6에 나타내었다. Q < 0.01 이면서 normal.mean < tumor.mean 인 유전자들을 선별하였다. box plot에 표기된 유의값은 Q value(adjusted P)이다.

eRNA	mRNA	TCGA normal.mean	TCGA tumor.mean	adjust.p	Pval	Cor	R.squared
LINC01572	C14orf93	9.18E-01	1.30E+00	1.00E-09	2.78E-03	9.05E-01	7.29E-01
LINC01572	CEP152	1.36E-01	2.76E-01	3.07E-05	3.97E-04	-1.00E+00	9.80E-01
LINC01572	DXO	2.02E+00	2.48E+00	5.30E-07	2.78E-03	-9.05E-01	7.82E-01
LINC01572	HELLS	1.51E-01	4.91E-01	6.80E-08	2.78E-03	9.05E-01	8.36E-01
LINC01572	NCAPH2	2.75E+00	3.33E+00	3.27E-09	2.78E-03	9.05E-01	7.98E-01
LINC01572	NFKB2	2.92E+00	3.55E+00	3.92E-05	2.78E-03	-9.05E-01	7.69E-01
LINC01572	NMB	8.69E-01	1.71E+00	1.34E-06	2.78E-03	9.05E-01	8.24E-01
LINC01572	SFSWAP	1.21E+00	1.52E+00	1.69E-08	2.78E-03	-9.05E-01	7.95E-01
LINC01572	STK19	1.13E+00	1.40E+00	1.94E-05	2.78E-03	-9.05E-01	8.31E-01
LINC01572	TIGD5	7.46E-01	1.49E+00	1.70E-11	2.78E-03	-9.05E-01	9.73E-01

도 5 및 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 발현 상관관계 분석에서 동일 발현 패턴을 나타내는 10종의 유전자는 C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19, TIGD5로 확인되었다.

상기 결과를 통해서, LINC01572 뿐만 아니라 이의 TAD 내 유전자와 발현 상관관계 분석을 통한 하위 타겟유전자가 간암의 진단 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.

4. LINC01572에 대한 antisense oligo 처리를 통한 억제 효능 확인

LINC01572에 대한 antisense oligo (서열번호 1)처리를 통한 억제 효능을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, LINC01572의 발현이 크게 감소하여, 이의 발현이 억제를 명확히 확인하였다.

5. LINC01572가 Knock down에 따른 세포 성장 억제 확인

LINC01572가 Knock down된 FT3-7 cell을 24well에 다시 seeding한 후, seeding한 당일부터 72시간 까지 세포의 생장을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포 관찰 3일 후 그 생장이 정상세포에 비해 유의미하게 25% 감소함을 확인하였다.

이를 통해 LINC01572의 억제가 암세포의 성장 억제, 특히 간암의 성장 억제에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY ERICA CAMPUS KNU-INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY <120> A NOVEL BIOMARKER FOR DIAGNOSING LIVER CANCER AND A TREATING METHOD USING THEREOF <130> ewha189p <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 <400> 1 acatagagac agactg 16 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 <400> 2 cagtctgtct ctatgt 16

Claims (12)

1. LINC01572의 eRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암의 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 eRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 eRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인, 간암의 진단용 조성물.
3. 제1항에 있어서, eRNA의 발현 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것인, 간암의 진단용 조성물.
4. 제1항에 있어서, eRNA의 발현 수준의 측정은 ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq, CLIP-seq, RIP-seq 및 luciferase assay로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 간암의 진단용 조성물.
5. 제1항에 있어서, PMFBP1 ZNF821, C14orf93, CEP152, DXO, HELLS, NCAPH2, NFKB2, NMB, SFSWAP, STK19 및 TIGD5로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것인, 간암의 진단용 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 간암의 진단용 키트.
7. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 LINC01572의 발현 수준을 측정하는 단계;
   (b) 상기 측정된 발현 수준을 대비되는 정상 대조군 시료의 LINC01572의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
   (c) 상기 생물학적 시료의 LINC01572의 발현 수준이 대비되는 정상 대조군의 LINC01572의 발현 수준보다 높을 경우 간암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 발현 수준 측정은 eRNA의 발현 수준을 측정하는 것인, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계의 발현 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의한 것인, 간암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
10. siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 LINC01572 발현 억제제를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 삭제
12. 제10항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것인, 간암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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