KR102236812B1 - Biocompatible polymer-hydrogel complexes and preparation thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유기화합물, PPG-에폭사이드 및 리포산, 가교제 및 광 개시제를 포함하는 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자가 혼합된 고분자-하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 유기화합물, PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)], 리포산(Lipoic acid)을 포함하는 하이드로젤, 아크릴레이트/광개시제 첨가에 의해 제조되는 기계적 물성이 향상된 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자를 물리적으로 결합시켜 제조된 고분자-하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 복합체는 3D 프린팅 소재로 적용될 수 있다.The present invention relates to a polymer-hydrogel complex in which at least one biocompatible polymer is mixed in a hydrogel containing an organic compound, PPG-epoxide and lipoic acid, a crosslinking agent and a photoinitiator, and a method for preparing the same, and specifically, an organic compound , PPG-epoxide [Poly(propylene glycol) diglycidyl ether)], a hydrogel containing lipoic acid, and a hydrogel with improved mechanical properties prepared by adding an acrylate/photoinitiator. It provides a polymer-hydrogel composite prepared by physically bonding and a method for producing the same. The composite of the present invention can be applied as a 3D printing material.

Description

생체적합성 고분자-하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법{Biocompatible polymer-hydrogel complexes and preparation thereof}Biocompatible polymer-hydrogel complexes and preparation thereof TECHNICAL FIELD

본 발명은 유기화합물, PPG-에폭사이드, 리포산을 포함하는 하이드로젤에 1종 이상의 생체/세포 적합성 고분자 생체재료가 물리적으로 결합된 고분자-하이드로젤 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a polymer-hydrogel complex in which at least one bio/cell compatible polymer biomaterial is physically bonded to a hydrogel containing an organic compound, PPG-epoxide, and lipoic acid, and a method for preparing the same.

종래의 하이드로젤은 주로 사용하고자 하는 고분자에 가교결합제를 화학적으로 결합시켜 중합체를 합성하는 방법으로 제조되었다. 통상적인 제조방법으로는, 가교결합제를 고분자에 미리 화학적으로 결합시켜 개질된 고분자들 사이의 반응을 이용하거나, 가교결합제를 고분자 용액에 혼합시켜 가교결합에 의한 하이드로젤을 합성하는 방법을 사용하는 것이 일반적이다. 또한, 특정한 이온이나 유기화합물을 첨가하여 이온결합에 의한 하이드로젤의 합성을 유도하거나, 소수성 화합물을 결합시켜 소수성 결합에 의한 하이드로젤의 합성을 유도하는 방법을 사용하고 있다. 한편으로는, 개질된 고분자의 작용기에 효소 및 촉매를 부가하거나, 고분자 작용기 사이의 자가 반응을 유도하여 고분자젤을 제조하는 방법이 이용되기도 한다. Conventional hydrogels are mainly manufactured by chemically binding a crosslinking agent to a polymer to be used to synthesize a polymer. As a typical manufacturing method, a crosslinking agent is chemically bonded to a polymer in advance to use a reaction between modified polymers, or a crosslinking agent is mixed with a polymer solution to synthesize a hydrogel by crosslinking. It is common. In addition, a method of inducing the synthesis of hydrogel by ionic bonding by adding specific ions or organic compounds, or inducing the synthesis of hydrogel by hydrophobic bonding by bonding a hydrophobic compound is used. On the one hand, a method of preparing a polymer gel by adding an enzyme and a catalyst to a functional group of the modified polymer or by inducing an autoreaction between the functional groups of the polymer may be used.

이온결합에 의해 생성되는 하이드로젤은 반응속도가 빠르고 다루기 쉬운 장점을 가지는 반면에, pH의 조건에 따른 젤 특성의 변화, 세포부착성이 낮고, 점탄성과 기계적 물성이 약한 문제점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 고분자량의 알긴산, 히알론산 고분자들을 사용하는 방법이 있으나 분자량 증가에 따른 고분자의 고점성 유도는 고분자 작용기 제조공정에서 균일한 결과를 얻지 못하는 단점이 있다. 가교결합제를 이용하여 고분자를 개질하고, 화학적 결합에 의한 고분자 젤을 합성하는 경우에는, 가교결합제의 독성으로 인한 문제점을 해결해야 하는 단점이 있으며, 효소나 촉매를 사용하는 경우 또한 효소와 촉매의 인체 무해성을 입증해야 하는 번거로움이 있다. 최근에는 카페인을 촉매로 사용하여 폴리(에틸렌글리콜 다이글라이시딜 에터), 퓨마르산 혹은 시트르산을 이용한 젤의 합성 및 폴리(프로필렌 옥사이드), 시트르산, 머캅토 수신산 및 폴리(프로필렌 다이메타아크릴레이트)를 이용한 젤 합성이 보고되고 있다(Polymeric materials for bio-applications, PCT/US2015/028311).Hydrogels produced by ionic bonding have the advantage of having a fast reaction rate and easy handling, but there are problems in that the gel properties change according to the conditions of pH, cell adhesion is low, and viscoelasticity and mechanical properties are weak. In order to overcome this problem, there is a method of using alginic acid and hyaluronic acid polymers having a high molecular weight, but induction of high viscosity of the polymer due to an increase in molecular weight has a disadvantage that a uniform result cannot be obtained in the manufacturing process of the polymer functional group. In the case of modifying a polymer using a crosslinking agent and synthesizing a polymer gel by chemical bonding, there is a disadvantage of having to solve the problem due to the toxicity of the crosslinking agent. There is a hassle of having to prove harmless. Recently, the synthesis of gels using poly(ethylene glycol diglycidyl ether), fumaric acid or citric acid using caffeine as a catalyst, and poly(propylene oxide), citric acid, mercapto-rex acid and poly(propylene dimethacrylate) Gel synthesis has been reported using (Polymeric materials for bio-applications, PCT/US2015/028311).

하이드로젤은 고분자 제조와 약물전달/조직공학/미용 등의 분야에서 다양한 응용이 가능하다는 장점을 가지고 있으나, 상술한 문제점을 해결해야 하는 곤란성이 있고, 앞서 언급한 카페인을 촉매로 젤의 합성에 있어서, 젤의 포스트-프린팅 형태안정성을 제공하지 못하는 문제점이 해결되지 못하고 있다. 따라서, 종래의 하이드로젤은 점성과 물성이 약하여 3D 바이오 프린팅용으로 제조가 용이하지 않고, 프린팅 이후의 지지체의 형태안정성(포스트-프린팅 형태안정성)이 좋지 않아 조직공학, 약물전달, 3D 프린팅의 분야에 이용하기에는 한계가 있다. 더욱이, 기존의 하이드로젤은 세포 및 조직적합성을 보다 더 향상시키기 위하여 하이드로젤에 세포부착성 및 세포증식성을 유도할 수 있는 고분자 생체재료와 복합될 수 있는 하이드로젤 복합체기술이 필요하다. 또한 3D 프린팅에 적용할 수 있고 포스트-프린팅 지지체의 형태안정성을 제공할 수 있는 하이드로젤 복합체 제조기술 개발이 필요하다. Hydrogel has the advantage that it can be applied in a variety of fields such as polymer manufacturing and drug delivery/tissue engineering/beauty, but it is difficult to solve the above-described problems, and in the synthesis of gels using caffeine as a catalyst, , The problem of not providing the post-printing shape stability of the gel has not been solved. Therefore, conventional hydrogels are not easy to manufacture for 3D bioprinting due to their weak viscosity and physical properties, and the morphology stability of the support after printing (post-printing morphology) is poor, so the fields of tissue engineering, drug delivery, and 3D printing There is a limit to using it. Moreover, in order to further improve cell and tissue compatibility, conventional hydrogels require a hydrogel complex technology that can be combined with a polymeric biomaterial capable of inducing cell adhesion and cell proliferation to the hydrogel. In addition, there is a need to develop a hydrogel composite manufacturing technology that can be applied to 3D printing and can provide morphological stability of a post-printing support.

본 발명에서 개발된 말레산, 폴리(프로필렌 글리콜)-에폭사이드 및 리포산 등을 모두 포함하는 하이드로젤에 세포/생체 적합성 고분자를 물리적으로 복합시킨 고분자-하이드로젤 복합체(고분자-터프젤 또는 고분자-비트리젤 복합체)는 종래에 보고된 바가 없으며, 또한 이를 3D 프린팅 하여 포스트-프린팅 형태안정성과 세포적합성을 제공한 기술과 소재는 보고된 바 없다.A polymer-hydrogel complex (polymer-terf gel or polymer-beet) in which a cell/biocompatible polymer is physically combined in a hydrogel containing all of maleic acid, poly(propylene glycol)-epoxide and lipoic acid developed in the present invention. Rigel complex) has not been previously reported, and there have been no reports of technologies and materials that provide post-printing morphological stability and cellular compatibility by 3D printing it.

한국공개특허 제2016-0115204호Korean Patent Publication No. 2016-0115204 한국공개특허 제2016-0096829호Korean Patent Publication No. 2016-0096829

본 발명의 목적은 유기화합물, PPG-에폭사이드 [Poly(propylene glycol) diglycidyl ether)], 리포산(Lipoic acid), 가교제(메타(아크릴레이트)화합물), 광 개시제를 포함하는 하이드로젤 및 1종 이상의 생체적합성 고분자로 이루어지는, 고분자-하이드로젤 복합체를 제공하는 것이다.An object of the present invention is an organic compound, PPG-epoxide [Poly(propylene glycol) diglycidyl ether)], lipoic acid, a crosslinking agent (meth (acrylate) compound), a hydrogel containing a photoinitiator, and at least one It is to provide a polymer-hydrogel complex made of a biocompatible polymer.

본 발명의 다른 목적은 PPG-에폭사이드[Poly(propyleneglycol)diglycidyl ether)]에 유기화합물 및 카페인 촉매를 혼합하여 하이드로젤 전구체 용액을 제조하는 단계, 상기 하이드로젤 전구체 용액에 리포산을 첨가하여 하이드로젤을 합성하는 단계 및 상기 합성된 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자를 3:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는, 고분자-하이드로젤 복합체 제조방법 및 형태안정성이 향상된 포스트-3D 프린팅 지지체 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to prepare a hydrogel precursor solution by mixing an organic compound and a caffeine catalyst in PPG-epoxide [Poly (propyleneglycol) diglycidyl ether)], and adding lipoic acid to the hydrogel precursor solution to prepare a hydrogel. A method for preparing a polymer-hydrogel composite and post-3D printing with improved morphology stability, comprising the step of synthesizing and mixing at least one biocompatible polymer in the synthesized hydrogel at a weight ratio of 3:1 to 1:1 It is to provide a method for manufacturing a support.

본 발명의 다른 목적은 생체적합성 고분자를 제공함으로써, 세포와의 부착성, 증식성 및 조직재생성 등의 생물학적 특성을 지지체에 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a biocompatible polymer, thereby providing biological properties such as adhesion to cells, proliferation, and tissue regeneration to a support.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problem to be solved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems that are not mentioned will be clearly understood by those of ordinary skill in the art from the following description.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 유기화합물, PPG-에폭사이드[Poly(propyleneglycol)diglycidyl ether)], 리포산(Lipoic acid), 가교제, 광 개시제를 포함하는 하이드로젤; 및 1종 이상의 생체적합성 고분자로 이루어지는, 고분자-하이드로젤 복합체가 제공된다.According to an embodiment of the present invention, a hydrogel containing an organic compound, PPG-epoxide [Poly(propyleneglycol)diglycidyl ether)], lipoic acid, a crosslinking agent, and a photoinitiator; And consisting of one or more biocompatible polymers, a polymer-hydrogel complex is provided.

일 측에 따르면, 상기 생체적합성 고분자는, 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 콜라겐, 피브린, 피브로인, 피브로넥틴, 키토산, 셀룰로오스(cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose, CMC), 콘드로이친 설페이트(Chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. According to one side, the biocompatible polymer is gelatin, albumin, collagen, fibrin, fibroin, fibronectin, chitosan, cellulose, carboxymethyl cellulose (CMC), chondroitin sulfate (Chondroitin). sulfate) and hyaluronic acid.

일 측에 따르면, 상기 하이드로젤 및 생체적합성 고분자는, 3:1 내지 1:1의 중량비를 가질 수 있다.According to one side, the hydrogel and the biocompatible polymer may have a weight ratio of 3:1 to 1:1.

일 측에 따르면, 상기 유기화합물은, 말레산(Maleic acid), 푸마르산(Fumaric acid), 글루타코닉산(Glutaconic acid), 2-뷰텐-1,4-디카르복실산(2-Butene-1,4-dicarboxylic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. According to one side, the organic compound is maleic acid, fumaric acid, glutaconic acid, 2-butene-1,4-dicarboxylic acid (2-Butene-1 ,4-dicarboxylic acid) may be any one selected from the group consisting of.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, PPG-에폭사이드[Poly(propyleneglycol)diglycidyl ether)]에 유기화합물 및 카페인 촉매를 혼합하여 하이드로젤 전구체 용액을 제조하는 단계; 상기 하이드로젤 전구체 용액에 리포산을 첨가하여 하이드로젤을 합성하는 단계; 및 상기 합성된 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자를 3:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는, 고분자-하이드로젤 복합체 제조방법이 제공된다.According to another embodiment of the present invention, preparing a hydrogel precursor solution by mixing an organic compound and a caffeine catalyst in PPG-epoxide [Poly (propyleneglycol) diglycidyl ether)]; Synthesizing a hydrogel by adding lipoic acid to the hydrogel precursor solution; And mixing at least one biocompatible polymer in a weight ratio of 3:1 to 1:1 with the synthesized hydrogel, a polymer-hydrogel composite manufacturing method is provided.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기의 고분자-하이드로젤 복합체의 기계적물성과 포스트-프린팅 향상을 높이기 위하여 아크릴레이트 화합물을 첨가하여 3D 프린팅 하여 광 조사하여 포스트-프린팅 형태안정성을 제공하고, 생체적합성을 향상시키는 방법이 제공된다.According to another embodiment of the present invention, in order to improve the mechanical properties and post-printing of the polymer-hydrogel composite, an acrylate compound is added and 3D-printed and irradiated with light to provide post-printing morphology stability. Methods of improving suitability are provided.

본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체를 이용하면, 하이드로젤에 고순도의 생체적합성 고분자인 젤라틴, 알부민 등을 화학적 개질없이 물리적으로 결합시킬 수 있어 고순도 3D 프린팅 지지체를 제조할 수 있다. 또한, 고온-고압의 조건에서도 형태가 유지되는 특성이 있어 멸균이 용이하므로, 의료용 소재로 적합하다. When the polymer-hydrogel complex of the present invention is used, high purity biocompatible polymers such as gelatin and albumin can be physically bonded to the hydrogel without chemical modification, thereby manufacturing a high purity 3D printing support. In addition, since the shape is maintained even under high temperature-high pressure conditions, sterilization is easy, so it is suitable as a medical material.

특히, 본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체는 하이드로젤 자체의 우수한 생체적합성 이외에 세포적합성이 우수한 고분자를 물리적으로 하이드로젤 네트워크 내부에 추가함으로써 형성되므로, 보다 더 우수한 세포증식성 및 부착성을 가지게 된다. 따라서, 본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체는 세포 유입에 의한 조직공학용 지지체, 조직 재생용 소재, 세포배양용 지지체, 의료용 프린팅 소재 등으로 적합하다. 또한, 내부에 추가적으로 생체활성물질을 담지하는 경우, 상온에서도 담지할 수 있어서 생체활성물질의 생체활성을 유지할 수 있으며, 우수한 약물 전달성을 가지고 있으며, 생분해성을 조절할 수 있으므로 약물 전달체로도 용이한 이점이 있다. 아울러, 본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체에 생체활성물질을 추가로 로딩함으로써 서방출성이 있는 약물전달체로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체는 다층으로 적층하여 3D 프린팅될 수 있으므로, 복잡한 형상을 가진 고층의 지지체 용도에도 적합하다. In particular, the polymer-hydrogel complex of the present invention is formed by physically adding a polymer having excellent cell compatibility to the inside of the hydrogel network in addition to the excellent biocompatibility of the hydrogel itself, and thus has better cell proliferation and adhesion. Therefore, the polymer-hydrogel complex of the present invention is suitable as a support for tissue engineering by cell influx, a material for tissue regeneration, a support for cell culture, a medical printing material, and the like. In addition, when additionally carrying a bioactive material inside, it can be supported at room temperature, thus maintaining the bioactivity of the bioactive material, has excellent drug delivery, and can control biodegradability, making it easy to use as a drug delivery system. There is an advantage. In addition, by additionally loading a bioactive material into the polymer-hydrogel complex of the present invention, it can be used as a drug delivery system having sustained release. In addition, since the polymer-hydrogel composite of the present invention can be 3D-printed by laminating in multiple layers, it is also suitable for use as a high-rise support having a complex shape.

그러나 본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.However, the effects of the present invention are not limited to the above effects, and should be understood to include all effects that can be inferred from the configuration of the invention described in the detailed description or claims of the present invention.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤, 고분자-터프젤 복합체, 고분자-비트리젤 복합체의 합성 과정을 도식화한 것이다.
도 2은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 레올로지 분석 결과를 나타낸 것이다.
도3는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 기계적 물성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 열중량(TGA)분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 젤라틴-하이드로젤 복합체를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 알부민-하이드로젤 복합체를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC)-하이드로젤 복합체를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것이다.
도 8는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 콘드로이친 설페이트(CS)-하이드로젤 복합체를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 알부민-젤라틴-하이드로젤 복합체를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 FTIR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 팽윤도를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 약물방출성능을 실험한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 프린팅된 (a) 젤라틴-하이드로젤 복합체 및 (b) 알부민-하이드로젤 복합체로부터 오르니다졸 약물방출성능을 실험한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 하이드로젤 및 고분자-하이드로젤 복합체의 인 비트로(in vitro) (a) 세포증식성 및 부착성 및 (b) 조직재생을 관찰한 것이다.1 is a schematic diagram of a synthesis process of a hydrogel, a polymer-tough gel composite, and a polymer-vitrigel composite according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 shows the rheological analysis results of a hydrogel and a polymer-hydrogel composite according to an embodiment of the present invention.
3 shows the results of confirming the mechanical properties of the hydrogel and the polymer-hydrogel composite according to an embodiment of the present invention.
4 shows the results of thermogravimetric (TGA) analysis of a hydrogel and a polymer-hydrogel composite according to an embodiment of the present invention.
5 is a photograph of a structure obtained by 3D printing a hydrogel and a gelatin-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
6 is a photograph of a structure obtained by 3D printing a hydrogel and an albumin-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
7 is a photograph of a structure obtained by 3D printing a hydrogel and carboxymethyl cellulose (CMC)-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
8 is a photograph of a structure obtained by 3D printing a hydrogel and chondroitin sulfate (CS)-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
9 is a photograph of a structure obtained by 3D printing an albumin-gelatin-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
10 shows the result of FTIR measurement of a hydrogel and a polymer-hydrogel composite according to an embodiment of the present invention.
11 shows the degree of swelling of a hydrogel and a polymer-hydrogel composite according to an embodiment of the present invention.
12 shows the results of testing the drug release performance of a hydrogel and a polymer-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
13 shows the results of testing the ornidazole drug release performance from 3D printed (a) gelatin-hydrogel complex and (b) albumin-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.
14 is an observation of in vitro (a) cell proliferation and adhesion and (b) tissue regeneration of a hydrogel and a polymer-hydrogel complex according to an embodiment of the present invention.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.Hereinafter, embodiments will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, since various changes may be made to the embodiments, the scope of the patent application is not limited or limited by these embodiments. It is to be understood that all changes, equivalents, or substitutes to the embodiments are included in the scope of the rights.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.The terms used in the examples are used for illustrative purposes only and should not be construed as limiting. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly indicates otherwise. In the present specification, terms such as "comprise" or "have" are intended to designate the presence of features, numbers, steps, actions, components, parts, or combinations thereof described in the specification, but one or more other features. It is to be understood that the presence or addition of elements or numbers, steps, actions, components, parts, or combinations thereof does not preclude in advance.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms used herein, including technical or scientific terms, have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the embodiment belongs. Terms as defined in a commonly used dictionary should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related technology, and should not be interpreted as an ideal or excessively formal meaning unless explicitly defined in the present application. Does not.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.In addition, in the description with reference to the accompanying drawings, the same reference numerals are assigned to the same components regardless of the reference numerals, and redundant descriptions thereof will be omitted. In describing the embodiments, when it is determined that a detailed description of related known technologies may unnecessarily obscure the subject matter of the embodiments, the detailed description thereof will be omitted.

본 명세서에서 하이드로젤은 터프젤(toughgel) 또는 터프 하이드로젤(tough hydrogel), 더 넓게는 상기 터프젤(toughgel) 또는 터프 하이드로젤(tough hydrogel)로부터 합성되는 비트리젤(vitrigel) 중 어느 하나 이상을 포함하는 포괄적인 의미로 기재되었다. In the present specification, the hydrogel includes any one or more of toughgel or tough hydrogel, more broadly, vitrigel synthesized from the toughgel or tough hydrogel. It has been described in a comprehensive sense to include.

따라서, 본 명세서에서 고분자-하이드로젤 복합체는 고분자-터프젤 복합체 또는 고분자-비트리젤 복합체 중 하나 이상을 포함하는 포괄적인 의미로 기재되었다.Accordingly, in the present specification, the polymer-hydrogel composite has been described in a comprehensive sense including at least one of a polymer-terfgel composite or a polymer-vitrigel composite.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 유기화합물, PPG-에폭사이드[Poly(propyleneglycol)diglycidyl ether)], 리포산(Lipoic acid), 가교제, 광 개시제를 포함하는 하이드로젤 및 1종 이상의 생체적합성 고분자로 이루어지는, 고분자-하이드로젤 복합체가 제공된다. According to an embodiment of the present invention, an organic compound, PPG-epoxide [Poly (propyleneglycol) diglycidyl ether)], a lipoic acid, a crosslinking agent, a hydrogel containing a photoinitiator, and one or more biocompatible polymers. , A polymer-hydrogel complex is provided.

상기 하이드로젤에 포함되는 유기화합물은 하이드로젤의 합성에 사용가능한 물질이면 별도로 제한되지는 않으나, 구체적으로는 산성의 유기화합물일 수 있으며, 이중결합을 가지는 산성의 유기화합물임이 가장 바람직하다.The organic compound contained in the hydrogel is not particularly limited as long as it is a material that can be used for the synthesis of the hydrogel, but may be specifically an acidic organic compound, and it is most preferably an acidic organic compound having a double bond.

일 측에 따르면, 상기 유기화합물은, 말레산(Maleic acid), 푸마르산(Fumaric acid), 글루타코닉산(Glutaconic acid), 2-뷰텐-1,4-디카르복실산(2-Butene-1,4-dicarboxylic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 말레산임이 가장 바람직하다. According to one side, the organic compound is maleic acid, fumaric acid, glutaconic acid, 2-butene-1,4-dicarboxylic acid (2-Butene-1 ,4-dicarboxylic acid) may be any one selected from the group consisting of, maleic acid is most preferred.

상기 하이드로젤에 포함되는 유기화합물 중 말레산은, 2개의 카르복실기를 갖는 물질로, 인간의 신진대사 과정에 사용되는 비교적 독성이 낮은 유기화합물이다. 그러나 직접 신체조직과 접촉시에는 강한 자극을 야기시킬 수 있으므로, 다른 물질과 중합시켜 생체적합성을 높이고 독성을 낮출 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 이용되는 말레산은 하기의 구조식 1과 같을 수 있다. Among the organic compounds contained in the hydrogel, maleic acid is a material having two carboxyl groups and is a relatively low toxicity organic compound used in human metabolic processes. However, direct contact with body tissues can cause strong irritation, so it can be polymerized with other substances to increase biocompatibility and reduce toxicity. Specifically, maleic acid used in the present invention may be the same as in Structural Formula 1 below.

[구조식 1][Structural Formula 1]

Figure 112019069817612-pat00001
Figure 112019069817612-pat00001

상기 하이드로젤은 카페인을 촉매로 이용하여 합성된 것일 수 있다. 촉매를 이용한 하이드로젤의 중합은 젤 형성 후에도 촉매가 완전히 제거되지 않는 경우가 대부분이며, 반응성을 위해서 대체로 금속촉매를 필요로 하는데, 의료용으로 이용하기 위한 하이드로젤에 이러한 금속촉매가 잔존하는 경우, 인체에 독성이나 다른 부작용을 야기시킬 수 있는 문제점이 있다. 그러나, 상기 하이드로젤은 합성과정에서 카페인을 촉매로 이용함으로써, 완전히 제거되지 않고 체내에 남게 되더라도 안전하다는 장점이 있다. 카페인은 과거에는 화학합성에 주로 이용되지 않은 물질로, 식물로부터 추출되어 화학합성에 약한 염기성 물질로 작용할 수 있어 다른 분자와의 합성시 양성자를 제거할 수 있다. 또, 카페인은 기존의 하이드로젤 형성에 사용되던 다른 약염기성 물질과도 유사한 구조를 가지고 있어, 촉매활성은 저하되지 않으면서 보다 생체적합성이 뛰어난 장점이 있다. 구체적으로 촉매로 이용되는 카페인은, 하기의 구조식 2와 같을 수 있다.The hydrogel may be synthesized using caffeine as a catalyst. Polymerization of a hydrogel using a catalyst is often not completely removed even after gel formation, and generally requires a metal catalyst for reactivity.If such a metal catalyst remains in the hydrogel for medical use, the human body There are problems that can cause toxicity or other side effects. However, the hydrogel has the advantage of being safe even if it is not completely removed and remains in the body by using caffeine as a catalyst in the synthesis process. Caffeine is a substance that was not mainly used for chemical synthesis in the past. It is extracted from plants and can act as a weak basic substance for chemical synthesis, so it can remove protons during synthesis with other molecules. In addition, caffeine has a structure similar to other weakly basic substances used to form conventional hydrogels, and thus has an advantage of superior biocompatibility without deteriorating catalytic activity. Specifically, caffeine used as a catalyst may be the same as in Structural Formula 2 below.

[구조식 2][Structural Formula 2]

Figure 112019069817612-pat00002
Figure 112019069817612-pat00002

상기 하이드로젤에 포함되는 PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)]는, 폴리프로필렌글리콜에 2개의 에폭시 작용기가 말단에 생성된 구조로, 글리시딜에테르는 공정상에 필요한 화학물질의 반응성을 조절할 수 있는 중간체로 주로 이용된다. 글리시딜에테르와 같은 중간체를 이용하면 상기 에폭시 작용기가 산성 작용기와 산 촉매 반응을 통하여 젤의 구조가 형성된다. 구체적으로, 본 발명에 이용되는 PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)]는 하기의 구조식 3과 같을 수 있다. PPG-epoxide [Poly (propylene glycol) diglycidyl ether)] contained in the hydrogel is a structure in which two epoxy functional groups are formed at the ends of polypropylene glycol, and glycidyl ether is a chemical substance required for the process. It is mainly used as an intermediate capable of controlling the reactivity. When an intermediate such as glycidyl ether is used, the epoxy functional group is formed of a gel structure through an acid-catalyzed reaction with an acidic functional group. Specifically, the PPG-epoxide [Poly (propylene glycol) diglycidyl ether)] used in the present invention may be as shown in Structural Formula 3 below.

[구조식 3][Structural Formula 3]

Figure 112019069817612-pat00003
Figure 112019069817612-pat00003

상기 하이드로젤에 포함되는 리포산은, 구체적으로는 알파-리포산(α-lipoic acid)일 수 있다. 2 개의 황을 함유하고, 오각형의 고리구조를 가지고 있는 알파-리포산은 pH에 민감하고 낮은 환원 포텐셜을 가진 물질로, 약물 및 기타화합물의 활성성분으로 많이 사용되고 있는 물질이다. 구체적으로 본 발명에 이용되는 리포산은 하기의 구조식 4와 같을 수 있다. The lipoic acid contained in the hydrogel may be, specifically, alpha-lipoic acid. Alpha-lipoic acid, which contains two sulfur and has a pentagonal ring structure, is sensitive to pH and has a low reduction potential, and is widely used as an active ingredient in drugs and other compounds. Specifically, the lipoic acid used in the present invention may be as shown in Structural Formula 4 below.

[구조식 4][Structural Formula 4]

Figure 112019069817612-pat00004
Figure 112019069817612-pat00004

알파-리포산은 카이랄 중심을 가지고 있어 광학 이성질체 특성을 보이지만, 자연계에서는 R형의 형태만을 가지고 있고 있다. 따라서, 본 발명의 성장하는 사슬 말단에 리포산을 카페인 촉매로 반응시키면 리포산이 합성되는 고분자 말단에 존재하고, 이황화 고리 작용기를 말단에 포함하는 고분자를 생성하여 안정적으로 젤을 제조할 수 있다. 또, 유기화합물과 PPG-에폭사이드 만으로 제조된 MAL-PPG 젤의 경우, 물 속에서 빠른 속도로 융해가 되는 단점이 있으며, 3D 프린터를 이용하여 인쇄시 적층구조를 고층으로 지지체를 형성하지 못하는 문제점이 발생한다. 상기 문제점을 해결하기 위해, 리포산을 반응에 추가하여 반응이 종결된 고분자 네트워크를 제조함으로써 안정된 하이드로젤을 제조할 수 있고, 3D 프린팅용으로도 이용가능한 비트리젤을 형성할 수 있다.Alpha-lipoic acid has a chiral center and thus exhibits optical isomerism, but in nature it only has an R-type form. Accordingly, when lipoic acid is reacted with a caffeine catalyst at the end of the growing chain of the present invention, a polymer that exists at the end of the polymer where lipoic acid is synthesized and contains a disulfide ring functional group at the end can be stably prepared. In addition, in the case of MAL-PPG gel made of only organic compounds and PPG-epoxide, there is a disadvantage that it melts at a high speed in water, and when printing using a 3D printer, the laminated structure cannot be formed on a high-rise support. This happens. In order to solve the above problem, a stable hydrogel can be prepared by adding lipoic acid to the reaction to prepare a polymer network in which the reaction is terminated, and a vitrgel that can be used for 3D printing can be formed.

상기 가교제는 가교밀도를 향상시키는 아크릴레이트 화합물일 수 있으며, 구체적으로는 하이드로젤의 기계적 물성과 포스트-프린팅 형태안정성을 향상시킬 수 있는 디아크릴레이트계 가교제(diacrylate crosslinker)일 수 있다. 디아크릴레이트계 가교제는 아크릴레이트 화합물을 가교결합시켜 제조된 젤 고분자 네트워크 사이에 침투(interpenetrating network)하도록 제조될 수 있으므로 하이드로젤의 구조를 더욱 밀집시켜 고밀도의 고분자 구조를 형성할 수 있다. 이 때, 아크릴레이트 화합물, 즉, 디아크릴레이트계 가교제의 함량을 조절함으로써 가교밀도(x-linking density), 기계적 물성 및 다공성 구조를 조절할 수 있다. 가교밀도와 다공성 구조가 조절된 중합된 젤은 내부에 약물을 담지할 수 있는 약물 전달체, 조직공학 지지체 등으로 적용될 수 있으며, 그 외에도 3D 프린팅용 소재, 주사용 젤로도 이용될 수 있다. 본 발명에 이용되는 디아크릴레이트계 가교제는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(poly(ethylene glycol), diacrylate), 폴리(에틸렌 글리콜) 테트라 아크릴레이트(poly(ethylene glycol) tetra-acrylate), 덴드리머 형태의 폴리(에틸렌 글리콜) 멀티아크릴레이트(poly(ethylene glycol) multiacrylate), 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트 및 젤라틴-메타아크릴레이트 중 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(poly(ethylene glycol), diacrylate, PEGDA) 또는 젤라틴-메타아크릴레이트 임이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The crosslinking agent may be an acrylate compound that improves crosslinking density, and specifically, may be a diacrylate crosslinker capable of improving mechanical properties and post-printing shape stability of a hydrogel. Since the diacrylate-based crosslinking agent can be prepared to penetrate between the gel polymer networks prepared by crosslinking the acrylate compound (interpenetrating network), the structure of the hydrogel can be further concentrated to form a high-density polymer structure. At this time, by controlling the content of the acrylate compound, that is, the diacrylate-based crosslinking agent, the x-linking density, mechanical properties, and porous structure can be controlled. The polymerized gel with controlled crosslinking density and porosity can be applied as a drug carrier capable of carrying a drug therein, a tissue engineering support, etc., and can also be used as a material for 3D printing and a gel for injection. The diacrylate-based crosslinking agent used in the present invention is poly(ethylene glycol) diacrylate (poly(ethylene glycol), diacrylate), poly(ethylene glycol) tetra-acrylate (poly(ethylene glycol) tetra-acrylate), dendrimer type Of poly(ethylene glycol) multiacrylate, poly(propylene glycol) diacrylate, and gelatin-methacrylate, and specifically poly(ethylene glycol) diacrylate (poly(ethylene glycol), diacrylate, PEGDA) or gelatin-methacrylate is preferable, but is not limited thereto.

상기 광 개시제는 중합젤을 형성하는 과정에서 광중합 반응의 효율을 증진시키기 위한 것으로, 중합시키고자 하는 아크릴레이트 화합물과 함께 추가한 뒤, 광(예컨대, UV)을 조사하여 중합반응을 유도할 수 있다. 광개시제로는 벤조일 퍼옥사이드, 티오잔톤(thioxantone), 벤조피논(benzophenoe), 아조화합물(2,2'-azo-bis-isobutyrylnitrile; AIBN), 다이설파이드(dimethylsulfide), 다로큐어 1173(Darocure 1173), 다로큐어 4265(Darocure 4265), 다로큐어 1664(Darocure 1664); 유니온 카바이드(Union Carbide)의 시라큐어(Cyracure) UVI-6990, UVI-6974; 데구사(Degusa)의 데가큐어(Degacure); 아사히 덴카(Asahi Denka)의 SP-55, SP-150, SP-170; 시바가이기(Ciba-Geigy)의 이가큐어261(Irgacure 261), 이가큐어 184(Irgacure 184), 이가큐어 819(Irgacure 819), 이가큐어 907(Irgacure 907), 이가큐어 2959(Irgacure 2959) 중 어느 하나를 선택하여 이용할 수 있으나, 구체적으로, 광개시제는 이가큐어(Irgacure) D-2959를 이용함이 바람직하다. The photoinitiator is for enhancing the efficiency of the photopolymerization reaction in the process of forming the polymerization gel, and after being added together with the acrylate compound to be polymerized, the photoinitiator may be irradiated with light (eg, UV) to induce a polymerization reaction. . Photoinitiators include benzoyl peroxide, thioxantone, benzophenoe, azo compounds (2,2'-azo-bis-isobutyrylnitrile; AIBN), disulfide, and Darocure 1173 (Darocure 1173), Darocure 4265, Darocure 1664; Union Carbide's Cyracure UVI-6990, UVI-6974; Degacure from Degusa; SP-55, SP-150, SP-170 from Asahi Denka; Ciba-Geigy's Irgacure 261, Igacure 184, Igacure 819, Igacure 907, or Igacure 2959 (Irgacure 2959) One can be selected and used, but specifically, it is preferable to use Irgacure D-2959 as the photoinitiator.

일 측에 따르면, 상기 생체적합성 고분자는, 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 콜라겐, 피브린, 피브로인, 피브로넥틴, 키토산, 셀룰로오스(cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose, CMC), 콘드로이친 설페이트(Chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 의료용 고분자일 수 있으며, 합성된 하이드로젤에 물리적으로 첨가하여 고분자-하이드로젤 복합체를 형성할 수 있다. 이 때, 하이드로젤 및 생체적합성 고분자는 소정의 비율로 물리적으로 복합된 것일 수 있다. 이 때, 생체적합성 고분자의 종류와 특성에 따라 상기 소정의 비율은 각각 상이할 수 있으며, 최적의 비율을 가지는 고분자-하이드로젤 복합체는 우수한 세포적합성, 세포증식성 및 세포부착성을 가지며, 지지체의 조직재생촉진과 생분해성 조절 특성을 제공한다. 상기 고분자-하이드로젤 복합체는, 전술한 생체적합성 고분자 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자로 젤라틴 및 알부민을 포함하는 경우, 젤라틴-알부민-하이드로젤 복합체 또는 알부민-젤라틴-하이드로젤 복합체일 수 있다. According to one side, the biocompatible polymer is gelatin, albumin, collagen, fibrin, fibroin, fibronectin, chitosan, cellulose, carboxymethyl cellulose (CMC), chondroitin sulfate (Chondroitin). sulfate) and hyaluronic acid. The biocompatible polymer may be a medical polymer, and may be physically added to the synthesized hydrogel to form a polymer-hydrogel complex. In this case, the hydrogel and the biocompatible polymer may be physically combined in a predetermined ratio. At this time, the predetermined ratio may be different depending on the type and characteristics of the biocompatible polymer, and the polymer-hydrogel complex having the optimum ratio has excellent cell compatibility, cell proliferation and cell adhesion, and the tissue of the support. It provides regenerative promotion and biodegradability control properties. The polymer-hydrogel complex may include one or more of the aforementioned biocompatible polymers. For example, when the biocompatible polymer includes gelatin and albumin, it may be a gelatin-albumin-hydrogel complex or an albumin-gelatin-hydrogel complex.

일 측에 따르면, 상기 하이드로젤 및 생체적합성 고분자는, 첨가되는 고분자와 복합되어 젤을 형성하고, 프린팅이 가능한 비율범위에서 비제한적으로 복합체로서 적용이 가능하나, 구체적으로는 3:1 내지 1:1의 중량비를 가질 수 있다. 일례로, 상기 생체적합성 고분자가 젤라틴인 경우, 하이드로젤 및 젤라틴은 3:1 내지 1:1의 중량비를 가질 수 있으나, 2:1임이 바람직하다. 다른 일례로, 상기 생체적합성 고분자가 알부민인 경우, 하이드로젤 및 알부민은 2:1 내지 1:1의 중량비를 가질 수 있으나, 1:1임이 바람직하다.According to one side, the hydrogel and the biocompatible polymer are combined with the polymer to be added to form a gel, and can be applied as a composite, without limitation, in a range in which printing is possible, specifically, 3:1 to 1: It may have a weight ratio of 1. For example, when the biocompatible polymer is gelatin, the hydrogel and gelatin may have a weight ratio of 3:1 to 1:1, but it is preferably 2:1. As another example, when the biocompatible polymer is albumin, the hydrogel and albumin may have a weight ratio of 2:1 to 1:1, but it is preferably 1:1.

상기 고분자-하이드로젤 복합체는 3D 프린팅 된 형태일 수 있다. 구체적으로는, 상기 고분자-하이드로젤 복합체는 다층의 지지체와 같은 구조물의 형태일 수 있다. 또한, 상기 고분자-하이드로젤 복합체는 생체적합성 고분자 물질을 하이드로젤에 화학적 가교없이 물리적으로 복합시켜 생체적합성이 우수하므로 조직 재생용, 조직 공학용, 세포 배양용 등의 의료기기 또는 연구용으로 용이하게 이용될 수 있다. 예를들어, 조직공학 지지체, 약물 전달체, 이온트로닉스(iontronics)와 같은 바이오센서, 소프트로봇 인공피부, 인공근육, 사이클로딩-피로저항성 컨트랙터, 접착제, 접착성 패치, 바이오 액튜에이터, 마이크로플루이딕스, 3D 프린팅 몰드에 젤 복합체를 캐스팅하여 제조되는 지지체(예, 반월상연골, 혈관, 피부, 뼈 등) 등의 생체재료로 적합한 것일 수 있다. 그러나, 본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체는 그 용도가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. The polymer-hydrogel complex may be 3D printed. Specifically, the polymer-hydrogel composite may be in the form of a structure such as a multilayer support. In addition, the polymer-hydrogel complex is excellent in biocompatibility by physically combining a biocompatible polymer material with a hydrogel without chemical crosslinking, so it can be easily used for medical devices such as tissue regeneration, tissue engineering, and cell culture, or for research. I can. For example, tissue engineering scaffolds, drug carriers, biosensors such as iontronics, soft robot artificial skin, artificial muscles, cycloding-fatigue resistant contractors, adhesives, adhesive patches, bio actuators, microfluidics, 3D It may be suitable as a biomaterial such as a support (eg, meniscus, blood vessels, skin, bones, etc.) manufactured by casting a gel composite on a printing mold. However, the use of the polymer-hydrogel composite of the present invention is not necessarily limited thereto.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, (a) PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)]에 유기화합물 및 카페인 촉매를 혼합하여 하이드로젤 전구체 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 하이드로젤 전구체 용액에 리포산을 첨가하여 하이드로젤을 합성하는 단계; 및; 및 (c) 상기 합성된 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자를 3:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는, 고분자-하이드로젤 복합체 제조방법이 제공된다. 이 때, 상기 (a) 단계 내지 (c) 단계는 순차적으로 수행됨이 바람직하다.According to another embodiment of the present invention, (a) preparing a hydrogel precursor solution by mixing an organic compound and a caffeine catalyst in PPG-epoxide [Poly (propylene glycol) diglycidyl ether)]; (b) synthesizing a hydrogel by adding lipoic acid to the hydrogel precursor solution; And; And (c) mixing at least one biocompatible polymer with the synthesized hydrogel in a weight ratio of 3:1 to 1:1. In this case, the (a) to (c) steps are preferably performed sequentially.

상기 (a) 단계 및 (b) 단계는 하이드로젤을 합성하는 단계를 순차적으로 나타낸 것으로, PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)]에 유기화합물 및 카페인 촉매를 혼합하는 단계를 수행한 뒤, 리포산을 넣는 순서로 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 이와 같은 순서에 의해, 유기화합물과 PPG-에폭사이드가 카페인 촉매에 의해 먼저 반응하여 하이드로젤 형성을 위한 하이드로젤 전구체를 1차적으로 생성시킨 후, 리포산을 추가하고, 온도를 올려 가교결합을 완성함으로써 구조식 양 말단에 리포산이 캡핑(capping)된 형태의 하이드로젤이 합성될 수 있으며, 이러한 하이드로젤의 구조가 형태안정성과 기계적물성을 높이는 역할을 할 수 있다. Steps (a) and (b) sequentially show the steps of synthesizing a hydrogel, and mixing an organic compound and a caffeine catalyst in PPG-epoxide [Poly (propylene glycol) diglycidyl ether)] Then, it is preferable to perform the reaction in the order of adding lipoic acid. In this order, the organic compound and the PPG-epoxide react first by a caffeine catalyst to first generate a hydrogel precursor for hydrogel formation, and then lipoic acid is added and the temperature is raised to complete crosslinking. A hydrogel in a form in which lipoic acid is capped at both ends of the structural formula may be synthesized, and the structure of the hydrogel may serve to enhance morphological stability and mechanical properties.

상기 (b) 내지 (c) 단계는, (b) 단계의 혼합물에 리포산을 첨가하여 말단에 리포산이 캡핑된 하이드로젤을 합성하는 단계로, 이 때 제조된 하이드로젤로부터, (a) 단계에서 촉매로 사용한 카페인을 제거하는 공정을 포함하여 수행할 수도 있다. 카페인을 제거하는 공정은, 아세톤을 이용하는 방법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Steps (b) to (c) are steps of synthesizing a hydrogel capped with lipoic acid at the terminal by adding lipoic acid to the mixture of step (b). It may also be carried out including a process of removing caffeine used as. The process of removing caffeine may be a method of using acetone, but is not limited thereto.

상기 (b) 단계는, 리포산을 넣어 하이드로젤을 합성한 후 아크릴레이트 화합물 및 개시제를 추가하여 반응시키는 공정을 포함하여 수행할 수도 있다. 이 때, 아크릴레이트 화합물은 디아크릴레이트계 화합물(diacrylate compounds)일 수 있다. 디아크릴레이트계 가교제는 중합젤 네트워크에 침입함으로써 고분자 간의 구조를 더욱 밀집시켜(intermolecular penetrating network) 밀도가 높은 구조를 형성할 수 있도록 연결해주며, 함량을 조절함으로써 가교밀도(Degree x-linking), 기계적 물성 및 다공성 구조를 조절할 수 있다. 가교밀도와 다공성 구조에 따라 중합된 하이드로젤은 내부에 약물을 담지할 수 있는 조직재생용 지지체, 조직공학 지지체, 세포배양용 지지체, 약물 전달체등으로 적용될 수 있으며, 그 외에도 3D 프린팅용 소재, 주사용 젤로도 이용될 수 있다. 본 발명에 이용되는 디아크릴레이트계 화합물은 아크릴레이트계 화합물, 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(poly(ethylene glycol), diacrylate), 폴리(에틸렌 글리콜) 테트라크릴레이트(poly(ethylene glycol) tetraacrylate), 폴리(에틸렌 글리콜) 멀티아크릴레이트(poly(ethylene glycol) multiacrylate), 폴리(프로필렌 글리콜) 디아크릴레이트 및 젤라틴-메타아크릴레이트 중 어느 하나일 수 있으며, 구체적으로는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(poly(ethylene glycol), diacrylate, PEGDA) 또는 젤라틴-메타아크릴레이트임이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 전술한 아크릴레이트 화합물 중 어느 하나를 포함하여 제조된 고분자-하이드로젤 복합체는 프린팅 용이성 및 포스트-프린팅 지지체 안정성을 향상시킬 수 있는 이점이 있다. The step (b) may be performed including a step of reacting by adding an acrylate compound and an initiator after synthesizing a hydrogel by adding lipoic acid. In this case, the acrylate compound may be a diacrylate compound. The diacrylate-based crosslinking agent infiltrates the polymerized gel network and connects the polymers to form an intermolecular penetrating network to form a dense structure. By controlling the content, the crosslinking density (degree x-linking) and mechanical Physical properties and porous structure can be adjusted. Depending on the crosslinking density and porous structure, the polymerized hydrogel can be applied as a support for tissue regeneration, a support for tissue engineering, a support for cell culture, and a drug delivery system that can hold drugs inside. It can also be used as a use gel. The diacrylate-based compound used in the present invention is an acrylate-based compound, such as poly(ethylene glycol) diacrylate (poly(ethylene glycol), diacrylate), poly(ethylene glycol) tetraacrylate (poly(ethylene glycol)). tetraacrylate), poly(ethylene glycol) multiacrylate, poly(propylene glycol) diacrylate, and gelatin-methacrylate, and specifically, poly(ethylene glycol) diacrylate. It is preferable that it is acrylate (poly(ethylene glycol), diacrylate, PEGDA) or gelatin-methacrylate, but is not limited thereto. The polymer-hydrogel composite prepared including any one of the aforementioned acrylate compounds has advantages of improving printing ease and post-printing support stability.

상기 광개시제는, 중합젤을 형성하는 과정에서 광중합 반응의 효율을 증진시키기 위한 것으로, 중합시키고자 하는 물질과 함께 추가한 뒤, 광(예컨대, UV)을 조사하여 반응을 유도할 수 있다. 광개시제로 벤조일 퍼옥사이드, 티오잔톤(thioxantone), 벤조피논(benzophenoe), 아조화합물(2,2'-azo-bis-isobutyrylnitrile; AIBN), 다이설파이드(dimethylsulfide), 다로큐어 1173(Darocure 1173), 다로큐어 4265(Darocure 4265), 다로큐어 1664(Darocure 1664); 유니온 카바이드(Union Carbide)의 시라큐어(Cyracure) UVI-6990, UVI-6974; 데구사(Degusa)의 데가큐어(Degacure); 아사히 덴카(Asahi Denka)의 SP-55, SP-150, SP-170; 시바가이기(Ciba-Geigy)의 이가큐어261(Irgacure 261), 이가큐어 184(Irgacure 184), 이가큐어 819(Irgacure 819), 이가큐어 907(Irgacure 907), 이가큐어 2959(Irgacure 2959) 중 어느 하나를 선택하여 이용할 수 있으나, 구체적으로, 광개시제는 이가큐어(Irgacure) D-2959를 이용함이 바람직하다.The photoinitiator is for enhancing the efficiency of a photopolymerization reaction in the process of forming a polymerization gel, and after being added together with a substance to be polymerized, the reaction may be induced by irradiating light (eg, UV). As photoinitiators, benzoyl peroxide, thioxantone, benzophenoe, azo compounds (2,2'-azo-bis-isobutyrylnitrile; AIBN), disulfide, Darocure 1173 (Darocure 1173), Daro Cure 4265 (Darocure 4265), Darocure 1664 (Darocure 1664); Union Carbide's Cyracure UVI-6990, UVI-6974; Degacure from Degusa; SP-55, SP-150, SP-170 from Asahi Denka; Ciba-Geigy's Irgacure 261, Igacure 184, Igacure 819, Igacure 907, or Igacure 2959 (Irgacure 2959) One can be selected and used, but specifically, it is preferable to use Irgacure D-2959 as the photoinitiator.

본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체는 도 1의 공정에 의한 하이드로젤의 합성과정 및 고분자-하이드로젤 복합체 제조방법을 포함할 수 있다. 그러나, 도 1 및 도 1과 관련된 후술하는 내용은 본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체를 제조하는 방법 중 일 실시예에 불과할 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다. The polymer-hydrogel composite of the present invention may include a process for synthesizing a hydrogel according to the process of FIG. 1 and a method for preparing a polymer-hydrogel composite. However, the following description related to FIGS. 1 and 1 is only an example of the method of manufacturing the polymer-hydrogel composite of the present invention, but is not limited thereto.

도 1은 유기화합물로 말레산을 이용하여 하이드로젤을 합성하고, 합성된 하이드로젤로부터 고분자-터프젤 복합체와 고분자-비트리젤 복합체를 제조하는 과정을 도식화한 것으로, 도 1에 도시한 바와 같이, 말레산-PPGe 하이드로젤 전구체 용액을 저온에서 1차적으로 합성하고, 리포산 첨가하고 온도를 올려서 터프젤(toughgel)을 합성한 다음에, 생체적합성 고분자를 물리적으로 추가하여 고분자-터프젤 복합체를 합성할 수 있다. 또는, 상기 합성된 터프젤에 다이아크릴레이트 화합물을 첨가하여 비트리젤(vigrigel)을 합성할 수 있으며, 합성된 비트리젤에 생체적합성 고분자를 물리적으로 첨가하여 고분자-비트리젤 복합체를 제조할 수 있다. FIG. 1 is a schematic diagram of a process of synthesizing a hydrogel using maleic acid as an organic compound, and preparing a polymer-terf gel composite and a polymer-vitrigel composite from the synthesized hydrogel, as shown in FIG. The maleic acid-PPGe hydrogel precursor solution is primarily synthesized at low temperature, lipoic acid is added, and the temperature is raised to synthesize toughgel, and then a biocompatible polymer is physically added to synthesize a polymer-toughgel complex. I can. Alternatively, a diacrylate compound may be added to the synthesized tough gel to synthesize a vitrigel, and a biocompatible polymer may be physically added to the synthesized vitrgel to prepare a polymer-vitrigel complex.

도 1을 구체적으로 살펴보면, 하이드로젤은 다음과 같은 과정으로 먼저 합성될 수 있다. 말레산과 PPG-에폭사이드의 산촉매 반응에 의한 화학결합을 위해 카페인을 추가함으로써 상기 카페인 촉매에 의해 말레산의 양성자가 제거되어 음이온이 형성된다. 이러한 말레산의 음이온 형성으로, PPG-에폭사이드와의 결합이 유도되어 MAL-PPG 가 결합된 하이드로젤 전구체가 형성된다. 이후, MAL-PPG의 하이드로젤 전구체가 형성된 반응액에 리포산을 추가하고 온도를 올리게 되면, 반응액에 남아있는 카페인에 의해 리포산 또한 양성자가 제거되어 음이온을 형성하게 되므로, PPG-에폭사이드와의 결합반응이 유도되어 MAL-PPG-LA 삼중합 단위체가 생성된다. 이후, 전술한 광개시제와 가교제를 추가하여 하이드로젤을 합성할 수 있다.Referring to FIG. 1 in detail, the hydrogel may be synthesized first by the following process. By adding caffeine for chemical bonding between maleic acid and PPG-epoxide through an acid-catalyzed reaction, protons of maleic acid are removed by the caffeine catalyst to form anions. With the formation of an anion of maleic acid, a bond with PPG-epoxide is induced to form a hydrogel precursor to which MAL-PPG is bonded. Thereafter, when lipoic acid is added to the reaction solution in which the hydrogel precursor of MAL-PPG is formed and the temperature is raised, the protons are also removed by the caffeine remaining in the reaction solution to form anions. The reaction is induced to form the MAL-PPG-LA triplex unit. Thereafter, the hydrogel can be synthesized by adding the above-described photoinitiator and a crosslinking agent.

전술한 방법으로 하이드로젤이 합성되면, 합성된 하이드로젤에 생체적합성 고분자를 넣고 물리적으로 복합시켜 고분자-하이드로젤 복합체를 제조할 수 있다. 이 때, 생체적합성 고분자는, 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 피브린, 피브로인, 피브로넥틴, 키토산, 셀룰로오스(cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose, CMC), 콘드로이친 설페이트(Chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 의료용 고분자일 수 있으며, 합성된 하이드로젤에 물리적으로 결합하여 고분자-하이드로젤 복합체를 형성할 수 있다. 이 때, 하이드로젤 및 생체적합성 고분자는 소정의 비율로 물리적으로 복합된 것일 수 있다. 일 경우로, 2종 이상의 생체적합성 고분자를 추가하여 고분자-하이드로젤 복합체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 생체적합성 고분자로 젤라틴과 알부민을 선택하는 경우, 하이드로젤에 물리적으로 복합시킴으로써, 젤라틴-알부민-하이드로젤 복합체를 제조할 수도 있고, 젤라틴-하이드로젤 복합체를 먼저 제조한 뒤 추가적으로 알부민을 결합시키는 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다만, 복합체 제조시 첨가되는 물질의 양, 화학구조 및 특성(친수성 등)에 의해 하이드로젤의 형성이 달라질 수 있으므로, 첨가되는 고분자는 생체적합성이 뛰어난 물질임이 바람직하며, 하이드로젤의 형성이 유지되는 범위에서 복합화를 유도할 수 있는 범위를 선정하여 복합체를 제조하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. When the hydrogel is synthesized by the above method, a biocompatible polymer is added to the synthesized hydrogel and physically complexed to prepare a polymer-hydrogel complex. At this time, the biocompatible polymer is gelatin, albumin, fibrin, fibroin, fibronectin, chitosan, cellulose, carboxymethyl cellulose (CMC), chondroitin sulfate, and hyaluronic acid. It may be any one selected from the group consisting of (hyaluronic acid). The biocompatible polymer may be a medical polymer, and may be physically bonded to the synthesized hydrogel to form a polymer-hydrogel complex. In this case, the hydrogel and the biocompatible polymer may be physically combined in a predetermined ratio. In one case, a polymer-hydrogel complex may be prepared by adding two or more biocompatible polymers. For example, when gelatin and albumin are selected as biocompatible polymers, a gelatin-albumin-hydrogel complex may be prepared by physically complexing them with a hydrogel, or a gelatin-hydrogel complex may be prepared first, followed by additional albumin. It may be manufactured by combining, but is not limited thereto. However, since the formation of the hydrogel may vary depending on the amount, chemical structure, and properties (hydrophilicity, etc.) of the substance added during the manufacture of the composite, the added polymer is preferably a material with excellent biocompatibility, and the formation of the hydrogel is maintained. It is preferable to manufacture the composite by selecting a range that can induce the composite from the range, but is not limited thereto.

상기 (c)단계는, 상기 합성된 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자를 3:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계로, 전술한 생체적합성 고분자의 종류에 따라 전술한 중량비 범위내에서 각기 상이한 최적의 중량비를 가질 수 있다. 일 예로, 상기 생체적합성 고분자가 젤라틴인 경우, 하이드로젤 및 젤라틴은 3:1 내지 1:1의 중량비를 가질 수 있으나, 2:1임이 가장 바람직하다. 다른 예로, 상기 생체적합성 고분자가 알부민인 경우, 하이드로젤 및 알부민은 2:1 내지 1:1의 중량비를 가질 수 있으나, 1:1임이 가장 바람직하다. The step (c) is a step of mixing at least one biocompatible polymer with the synthesized hydrogel at a weight ratio of 3:1 to 1:1, and within the range of the weight ratio described above according to the type of the biocompatible polymer. Each can have a different optimal weight ratio. For example, when the biocompatible polymer is gelatin, the hydrogel and gelatin may have a weight ratio of 3:1 to 1:1, but it is most preferably 2:1. As another example, when the biocompatible polymer is albumin, the hydrogel and albumin may have a weight ratio of 2:1 to 1:1, but it is most preferably 1:1.

보다 구체적인 설명은 이하의 실시예를 통해 후술하도록 한다.A more detailed description will be described later through the following examples.

실시예 1.Example 1.

본 발명의 고분자-하이드로젤 복합체는 후술하는 실시예의 방법을 이용하여 제조되었다. 하이드로젤 제조시 사용되는 각각의 성분은 하기 표 1에 기재된 것을 이용하였다. 후술하는 실시예에서는 기재를 간결하게 하기 위해 PPG-에폭사이드와 PPG를 혼용하여 사용하였으나, 모두 PPG-에폭사이드의 의미로 기재된 것이다.The polymer-hydrogel composite of the present invention was prepared using the method of Examples to be described later. Each component used in the manufacture of the hydrogel was used as described in Table 1 below. In the examples to be described later, in order to simplify the substrate, PPG-epoxide and PPG were mixed and used, but all are described in the meaning of PPG-epoxide.

[표 1][Table 1]

Figure 112019069817612-pat00005
Figure 112019069817612-pat00005

실시예 1. 하이드로젤의 제조 Example 1. Preparation of hydrogel

막자사발을 이용하여 곱게 만든 카페인 0.35g과 말레산 1.89g을 6.84g의 PPGe-에폭사이드 용액 60ml 에 첨가한 뒤 유리 바이알(Vial)에 마그네틱바와 함께 넣는다. 바이알에 질소를 3분간 주입한 뒤, 70 ℃에서(핫플레이트 또는 오일배쓰를 이용) 교반시켰다. 교반을 시작하고 10분정도 지나면서 용액은 서서히 투명해 지게 되고, 완전히 흰색입자가 사라져 투명하고 점도가 상승한 용액이 되는 젤화(gelation)가 시작되면(교반 이후, 약3시간 경과시) 바이알의 용액을 70 ℃에서 24시간동안 2차 반응시켜 MAL-PPG 가 결합된 하이드로젤 전구체 용액을 제조하였다. 이후, 젤화가 시작된 용액에 준비된 리포산 0.68g을 넣은 후, 질소를 5분간 주입하여 불활성 분위기를 조성하고, 온도를 올려 90℃에서 추가로 24시간 동안 반응시켜 리포산 캡핑된 MAL-PPG-LA 하이드로젤 샘플을 수득하였다(도 1). Add 0.35 g of caffeine and 1.89 g of maleic acid finely made using a mortar to 60 ml of 6.84 g of PPGe-epoxide solution, and then put it in a glass vial with a magnetic bar. Nitrogen was injected into the vial for 3 minutes, and then stirred at 70° C. (using a hot plate or an oil bath). After 10 minutes of stirring, the solution gradually becomes transparent, and when gelation begins (approximately 3 hours after agitation), the white particles disappear and become a transparent and viscous solution. Was subjected to a secondary reaction at 70° C. for 24 hours to prepare a hydrogel precursor solution to which MAL-PPG was bound. Thereafter, 0.68 g of prepared lipoic acid was added to the gelation-beginning solution, and nitrogen was injected for 5 minutes to create an inert atmosphere, and the temperature was raised to react at 90° C. for an additional 24 hours to obtain a lipoic acid capped MAL-PPG-LA hydrogel. A sample was obtained (Fig. 1).

실시예 2. 고분자-터프젤 및 고분자-비트리젤 복합체의 제조Example 2. Preparation of polymer-tough gel and polymer-vitrigel composite

실시예 1로 제조된 하이드로젤에 생체적합성 고분자를 추가하여 복합체 중간체(complex intermediate)를 제조한 다음, 55℃에서 24시간 동안 추가적인 반응을 진행하여 프로세싱을 완성하여 고분자-터프젤 복합체를 제조하였다. A complex intermediate was prepared by adding a biocompatible polymer to the hydrogel prepared in Example 1, and then an additional reaction was performed at 55° C. for 24 hours to complete the processing to prepare a polymer-terfgel complex.

실시예 1로 제조된 하이드로젤에 생체적합성 고분자를 혼합한 후, 1.106 ml의 PEGDA(Poly(ethylene glycol) diacrylate, Mn = 700) 를 추가로 혼합하고, PEGDA의 이중결합 간에 반응이 일어나 젤을 지지할 수 있는 구조를 형성시키기 위해 광개시제인 이가큐어(Igarcure) D-2959 0.015 g을 함께 주입하였다. 이후, 80 ℃에서 초음파기로 균일하게 혼합하고, 광개시제를 활성화시켜 PEGDA 화합물의 가교결합에 의한 고분자-비트리젤 복합체를 제조하였다. After mixing the biocompatible polymer in the hydrogel prepared in Example 1, 1.106 ml of PEGDA (Poly(ethylene glycol) diacrylate, Mn = 700) was additionally mixed, and a reaction occurred between the double bonds of PEGDA to support the gel. 0.015 g of Igarcure D-2959, a photoinitiator, was injected together in order to form a structure that can be used. Thereafter, the mixture was uniformly mixed with an ultrasonicator at 80° C., and a photoinitiator was activated to prepare a polymer-vitrogel complex by crosslinking of the PEGDA compound.

후술하는 실시예 2-1 내지 2-5는 하이드로젤에 추가된 생체적합성 고분자의 종류만 각각 젤라틴, 알부민, 카르복시메틸 셀룰로오스, 콘드로이친 설페이트, 알부민-젤라틴으로 차이가 있을 뿐, 전술한 고분자-비트리젤 복합체와 동일한 방법으로 제조하였다. In Examples 2-1 to 2-5 to be described later, only the types of biocompatible polymers added to the hydrogel are gelatin, albumin, carboxymethyl cellulose, chondroitin sulfate, and albumin-gelatin. It was prepared in the same way as the composite.

실시예 2-1. 젤라틴-비트리젤 복합체 제조Example 2-1. Preparation of gelatin-vitrogel complex

실시예 1의 하이드로젤 제조과정 중 생성된 MAL-PPG-LA 하이드로젤에 젤라틴(Bovine skin유래, Type B, Sigma Aldrich, USA)을 2:1의 중량비로 혼합하였다. 이후, PEGDGA(Mn = 700) 1.106 ml와 0.015 g의 광개시제 (Irgacure 2959)를 넣고 80 ℃에서 초음파 분쇄기로 균일하게 혼합한 뒤, 3D 프린팅 하는 동안에 UV를 조사하여 광가교시켜, 젤라틴-하이드로젤 복합체 (복합체 1)을 제조하였다. 제조된 복합체 1은 물성 검증 실험을 수행할 때까지, 4 ℃에서 알루미늄 호일로 덮어 보관하였다. Gelatin (Bovine skin derived, Type B, Sigma Aldrich, USA) was mixed in a weight ratio of 2:1 to the MAL-PPG-LA hydrogel produced during the hydrogel manufacturing process of Example 1. Thereafter, 1.106 ml of PEGDGA (Mn = 700) and 0.015 g of a photoinitiator (Irgacure 2959) were added and uniformly mixed with an ultrasonic grinder at 80° C., and UV irradiated during 3D printing to photocrosslink, gelatin-hydrogel complex (Complex 1) was prepared. The prepared composite 1 was stored covered with aluminum foil at 4° C. until the physical property verification experiment was performed.

실시예 2-2. 알부민-비트리젤 복합체 제조Example 2-2. Preparation of albumin-vitrogel complex

실시예 1의 하이드로젤 제조과정 중 생성된 MAL-PPG-LA 하이드로젤 샘플에 알부민(BSA, Sigma Aldrich, USA)을 1:1의 중량비로 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 알부민-비트리젤 복합체 (복합체2)를 제조 및 보관하였다. The same as in Example 2-1, except that albumin (BSA, Sigma Aldrich, USA) was mixed in a weight ratio of 1:1 to the MAL-PPG-LA hydrogel sample produced during the hydrogel production process of Example 1. By the method, an albumin-vitrogel complex (complex 2) was prepared and stored.

실시예 2-3. 카르복시메틸 셀룰로오스-비트리젤 복합체 제조Example 2-3. Preparation of carboxymethyl cellulose-vitrogel composite

실시예 1의 하이드로젤 제조과정 중 생성된 MAL-PPG-LA 하이드로젤 샘플에 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC, Sigma Aldrich, USA)를 1:0.3의 중량비로 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 카르복시메틸 셀룰로오스-비트리젤 복합체 (복합체3)을 제조 및 보관하였다. Example 2-1, except that carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma Aldrich, USA) was mixed in a weight ratio of 1:0.3 to the MAL-PPG-LA hydrogel sample produced during the hydrogel manufacturing process of Example 1 Carboxymethyl cellulose-vitrigel complex (complex 3) was prepared and stored in the same manner as described above.

실시예 2-4. 콘드로이친 설페이트-비트리젤 복합체 제조Example 2-4. Preparation of chondroitin sulfate-vitrogel complex

실시예 1의 하이드로젤 제조과정 중 생성된 MAL-PPG-LA 하이드로젤 샘플에 콘드로이친 설페이트(CS-A, Sigma Aldrich, USA)를 1:1의 중량비로 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 콘드로이친 설페이트-비트리젤 복합체 (복합체4)를 제조 및 보관하였다. Example 2, except that chondroitin sulfate (CS-A, Sigma Aldrich, USA) was mixed in a weight ratio of 1:1 to the MAL-PPG-LA hydrogel sample produced during the hydrogel manufacturing process of Example 1. Chondroitin sulfate-vitrogel complex (complex 4) was prepared and stored in the same manner as in 1.

실시예 2-5. 알부민-젤라틴-비트리젤 복합체의 제조Example 2-5. Preparation of albumin-gelatin-vitrogel complex

실시예 2-1로 제조된 젤라틴-비트리젤 복합체에 알부민을 1:1의 중량비로 혼합한 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 알부민-젤라틴-비트리젤 복합체(복합체 5)를 제조 및 보관하였다. The albumin-gelatin-vitrogel complex (complex 5) was prepared in the same manner as in Example 2-1, except that albumin was mixed in a weight ratio of 1:1 to the gelatin-vitrogel complex prepared in Example 2-1. Prepared and stored.

실시예 3. 고분자-비트리젤 복합체의 레올로지 분석Example 3. Rheological analysis of polymer-vitrogel complex

전술한 실시예 1 및 2로 제조된 하이드로젤과 복합체 1 및 2의 레올로지를 분석한 결과, 도 2와 같이 나타났다. 도 3의 (a)는 젤과 복합체의 점도(viscosity)를, (b)는 전단응력(shear stress)을 측정한 것으로, 그래프를 보면, 전단속도(shear rate)에 따라 하이드로젤과 복합체 1 및 2의 점도는 유사한 수준으로 유지되고, 전단응력(shear stress)은 하이드로젤에 비해 복합체 1 및 2에서 크게 증가되는 것을 확인하였다. As a result of analyzing the rheology of the hydrogels and composites 1 and 2 prepared in Examples 1 and 2 described above, it was as shown in FIG. 2. 3(a) is a measurement of the viscosity (viscosity) of the gel and the composite, and (b) is a measurement of shear stress. It was confirmed that the viscosity of 2 was maintained at a similar level, and the shear stress was significantly increased in Composites 1 and 2 compared to the hydrogel.

실시예 4. 고분자-비트리젤 복합체의 기계적 물성 확인Example 4. Confirmation of mechanical properties of polymer-vitrogel composite

전술한 실시예 1 및 2로 제조된 하이드로젤과 복합체 1 및 2의 기계적 물성변화를 측정하기 위해, Stable Micro System (Model: TA. XT plus texture analyzer, Surrey, UK)을 이용하여, 하이드로젤 샘플(10 × 10 × 3 mm3)의 압축을 25℃에서 수행하였다. 압축 속도는 1 mm/min, 최대 변형률은 30% 이고, 각각 3회 실험을 수행한 결과값의 평균값으로 그래프를 도출하였다. In order to measure the mechanical properties change of the hydrogels and composites 1 and 2 prepared in Examples 1 and 2 described above, a hydrogel sample was performed using a Stable Micro System (Model: TA. XT plus texture analyzer, Surrey, UK). A compression of (10 × 10 × 3 mm 3 ) was performed at 25°C. The compression speed was 1 mm/min and the maximum strain was 30%, and a graph was derived as the average value of the results of each of the three experiments.

실험 결과, 도 3의 그래프와 같이 확인되었다. 도 3의 (a)는 경도(Hardness), (b)는 씹힘성(chewiness), (c)는 복원력(resilience), (d)는 접착력(adhesiveness), (e)는 응집력(cohesiveness), (f)는 탄력(springiness)을 각각 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 3에 따르면, 복합체 1 및 2는 대조군인 하이드로젤에 비해 기계적 물성이 다소 감소하는 것을 확인함으로써, 하이드로젤에 생체적합성 고분자 물질이 물리적으로 혼합되어 있는 상태임을 평가되었다. 복합체 1 및 2의 기계적 물성이 다소 감소하였으나, 이러한 감소량에 비해 후술하는 세포적합성, 생체적합성이 향상되는 정도가 더 크므로, 복합체 1 및 2이 의료용(조직공학)으로 적합함을 확인하였다. As a result of the experiment, it was confirmed as in the graph of FIG. 3. In Figure 3 (a) is hardness, (b) is chewiness, (c) is resilience, (d) is adhesiveness, (e) is cohesiveness, (f) ) Is a graph showing the results of measuring each springiness. According to FIG. 3, it was confirmed that the mechanical properties of the composites 1 and 2 slightly decreased compared to the control hydrogel, and thus it was evaluated that the biocompatible polymer material was physically mixed with the hydrogel. Although the mechanical properties of the complexes 1 and 2 slightly decreased, compared to the reduction amount, the degree of improvement in cell compatibility and biocompatibility described later was greater, and thus it was confirmed that complexes 1 and 2 are suitable for medical use (tissue engineering).

실시예 5. 고분자-비트리젤 복합체의 열중량(TGA) 분석Example 5. Thermogravimetric (TGA) analysis of polymer-vitrogel composite

전술한 실시예 1 및 2로 제조된 하이드로젤과 복합체 1 및 2를 동결건조기로 건조시킨 뒤, 질소 분위기 하에서 열중량 분석기(TGA, DTG-60, Shimadzu, Japan)를 사용하여 5℃/분의 스캔 속도로 분석하였다. After drying the hydrogel and composites 1 and 2 prepared in Examples 1 and 2 described above with a freeze dryer, using a thermogravimetric analyzer (TGA, DTG-60, Shimadzu, Japan) under a nitrogen atmosphere at 5°C/min. Analyze at scan rate.

분석 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, 하이드로젤과 복합체 1, 2의 열중량 감소 패턴이 큰 차이없이 유사하게 나타났다. As a result of the analysis, as shown in FIG. 4, the thermal weight reduction patterns of the hydrogel and the composites 1 and 2 were similar without significant difference.

실시예 6. 고분자-비트리젤 복합체의 3D 프린팅 특성분석Example 6. Analysis of 3D printing characteristics of polymer-vitrogel composite

복합체의 3D 프린팅 특성을 분석하기 위해, 솔리드 워크(SolidWorks, Dassault Systems SolidWorks Corp, USA)사의 인쇄 모델(격자, 마름모, 벌집)을 이용하여 하이드로젤을 3D 프린팅하여 샘플을 준비했다. 프린팅 된 샘플(젤, 복합체 1, 2)은 UV 투과조명기(UVT-2126, OPTIMA, USA)를 사용하여 10분간 UV광 조사하에서 가교결합시킨 다음, 추가 실험을 하기 전 최소 5일간 증류수로 세척하였다. 이후, 주사전자현미경(Model Tescan Vega3: SEM, 체코)을 이용하여 표면 형태를 분석했으며, 공극의 크기는 ImageJ 소프트웨어 (1.52a, Wayne Rasband National Institutes of Health, USA)를 이용하여 측정하였다. In order to analyze the 3D printing characteristics of the composite, a sample was prepared by 3D printing a hydrogel using a printed model (lattice, rhombus, honeycomb) manufactured by Solidworks (SolidWorks, Dassault Systems SolidWorks Corp, USA). The printed samples (gel, composites 1, 2) were crosslinked under UV light irradiation for 10 minutes using a UV transmission illuminator (UVT-2126, OPTIMA, USA), and then washed with distilled water for at least 5 days before further experiments. . Then, the surface morphology was analyzed using a scanning electron microscope (Model Tescan Vega3: SEM, Czech Republic), and the size of the pores was measured using ImageJ software (1.52a, Wayne Rasband National Institutes of Health, USA).

측정 결과, 도 5내지 9과 같은 구조를 확인하였다. 도 5은 하이드로젤과 복합체 1를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것으로, 도 5을 보면 복합체 1을 2층으로 프린팅했을 때, 젤라틴이 물리적으로 첨가되었음에도 불구하고 복합체 1이 고배율로 잘 프린팅 되어 그 형상을 유지하고 있음을 나타내고 있다.As a result of the measurement, the structure as shown in FIGS. 5 to 9 was confirmed. 5 is a photograph of a structure in which the hydrogel and complex 1 are 3D-printed. Referring to FIG. 5, when the complex 1 is printed in two layers, the complex 1 is printed well at high magnification despite the physical addition of gelatin. It indicates that it is maintained.

도 6은 하이드로젤과 복합체 2를 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것으로, 도 6을 보면, 복합체 2를 2층으로 프린팅했을 때, 알부민이 물리적으로 첨가되었음에도 불구하고 복합체 2가 고배율로 잘 프린팅 되어 그 형상을 유지하고 있음을 나타내고 있다.Figure 6 is a photograph of a structure in which the hydrogel and the composite 2 are 3D printed. Referring to Figure 6, when the composite 2 is printed in two layers, the composite 2 is printed well at a high magnification despite the physical addition of albumin. It shows that the shape is maintained.

도 7은 하이드로젤과 복합체 3을 각각 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것으로, 도 7을 보면, 복합체 3을 2층으로 프린팅했을 때, 카복시메틸 셀룰로오스가 물리적으로 첨가되었음에도 불구하고 복합체 3이 고배율로 잘 프린팅 되어 그 형상을 유지하고 있음을 나타내고 있다. 다만, 셀룰로오스의 친수성 특성으로 인해 젤라틴 혹은 알부민을 첨가한 경우에 비해, 상대적으로 프린팅 배율이 낮은 것으로 확인되었다. 7 is a photograph of a structure in which the hydrogel and the composite 3 are 3D-printed, respectively. Referring to FIG. 7, when the composite 3 is printed in two layers, the composite 3 is well formed at high magnification despite the physical addition of carboxymethyl cellulose. It has been printed to show that it maintains its shape. However, it was confirmed that the printing magnification was relatively low compared to the case where gelatin or albumin was added due to the hydrophilic properties of cellulose.

도 8를 보면 하이드로젤과 복합체 4를 각각 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것으로, 도 8를 보면, 복합체 4를 2층으로 프린팅했을 때, 콘드로이틴설페이트(type A)를 물리적으로 첨가하였음에도 불구하고 복합체 4가 고배율로 잘 프린팅되어 그 형상을 유지하고 있음을 나타내고 있다. 그러나 콘드로이틴설페이트의 친수성 특성으로 인해 전술한 복합체 1 내지 3의 경우에 비해 프린팅의 배율이 낮은 것으로 확인되었다. 또한, 상기의 복합체 1, 2, 3은 물 속에서는 그 형상의 안정성을 유지하고 있었으나, 복합체 4는 30분 경과시부터 분해가 시작되어 90분 경과시점에는 대부분 생분해되는 것을 확인하였다. 즉, 고분자-비트리젤 복합체가 조직재생 유도에 효과적이고, 물 속(예, 세포배양 동안)에서 그 형상을 유지하기 위해 소수성의 생체적합성 고분자의 첨가가 유리하나, 친수성이 강한 다당류에서는 다당류의 팽창으로 인하여 하이드로젤의 형상을 유지하기 위한 조성 비율이 달라지는 것을 확인하였다. Referring to FIG. 8, a structure obtained by 3D printing of the hydrogel and the complex 4 was photographed. Referring to FIG. 8, when the complex 4 was printed in two layers, despite the physical addition of chondroitin sulfate (type A), the complex 4 Is printed well at high magnification, indicating that it maintains its shape. However, due to the hydrophilic properties of chondroitin sulfate, it was confirmed that the printing magnification was lower than that of the complexes 1 to 3 described above. In addition, it was confirmed that the above complexes 1, 2, and 3 maintained the stability of their shape in water, but the complex 4 began to decompose after 30 minutes, and most of them biodegraded at the elapse of 90 minutes. That is, the polymer-vitrogel complex is effective in inducing tissue regeneration, and the addition of a hydrophobic biocompatible polymer is advantageous to maintain its shape in water (e.g., during cell culture), but in polysaccharides with strong hydrophilicity, the polysaccharide expands. Due to this, it was confirmed that the composition ratio for maintaining the shape of the hydrogel was changed.

도 9는 알부민과 복합체 1이 1:1 비율로 혼합된 복합체 5를 제조하여 3D 프린팅한 구조를 촬영한 것으로, 도 9에서 프린팅 된 복합체 5 샘플을 위에서 내려다 보았을 때 2층으로 잘 프린팅 되어있고, 그 형상을 유지하고 있음을 알 수 있었다. 인 비트로(In vitro) 세포배양을 통해서 얻어진 세포부착성/증식성의 결과인 도 14를 통해 관찰된 결과를 바탕으로, 세포부착성과 조직재생성이 더 우수한 고분자인 알부민을 첨가하여 제조된 복합체를 사용함으로써 세포 부착성/증식성과 조직재생 유도를 조절하는데 적용할 수 있음을 확인하였다. FIG. 9 is a photograph of a 3D-printed structure by preparing a composite 5 in which albumin and composite 1 are mixed in a 1:1 ratio, and when viewed from above, the composite 5 sample printed in FIG. 9 is well-printed in two layers, It can be seen that it maintains its shape. Based on the results observed in FIG. 14, which is the result of cell adhesion/proliferation obtained through in vitro cell culture, by using a complex prepared by adding albumin, a polymer having better cell adhesion and tissue regeneration. It was confirmed that it can be applied to control cell adhesion/proliferation and induction of tissue regeneration.

실시예 7. 고분자-비트리젤 복합체의 FTIR 측정 Example 7. FTIR measurement of polymer-vitrogel composite

실시예 1 및 2로 제조된 하이드로젤, 복합체 1 및 2는 ATR-FTIR 분광기 (Model: Travel IR, Smiths Detection, USA)를 이용하여 FTIR 분석하였다. 이 때, 스펙트럼의 파장범위는 500 내지 4000 cm-1 를 사용하였다. FTIR 분석 결과, 도 10과 같이 나타났다. 도 10의 (a)의 하이드로젤에서 2873 cm-1,1721 cm-1, 669 cm-1, 552cm-1피크가 (c) 와 (e)에서도 동일하게 확인되었다. 또한, (b)에서 나타난 3286 cm-1, 1654, 1530 피크가 (c)에서 확인되고, (d)에서 나타난 1631 cm-1, 1535 cm-1 피크가 (e) 에서도 확인되어 복합체 1, 2는 각각 젤라틴과 알부민이 하이드로젤에 첨가된 결과물 임을 확인하였다. Hydrogels prepared in Examples 1 and 2, and Composites 1 and 2 were analyzed by FTIR using an ATR-FTIR spectroscopy (Model: Travel IR, Smiths Detection, USA). At this time, the wavelength range of the spectrum was 500 to 4000 cm -1 . As a result of FTIR analysis, it appeared as shown in FIG. 10. In the hydrogel of Figure 10 (a), 2873 cm -1 ,1721 cm -1 , 669 cm -1 , 552 cm -1 peaks were also confirmed in (c) and (e). In addition, the 3286 cm -1 , 1654 and 1530 peaks shown in (b) were confirmed in (c), and the 1631 cm -1 , 1535 cm -1 peaks shown in (d) were also confirmed in (e), and complexes 1 and 2 Respectively confirmed that gelatin and albumin were added to the hydrogel.

실시예 8. 고분자-비트리젤 복합체의 팽윤도 확인Example 8. Confirmation of swelling degree of polymer-vitrogel composite

전술한 실시예 1 및 2로 제조된 하이드로젤, 복합체 1 및 2를 3D프린팅한 구조체를 원형디스크(n = 3, φ = 35mm, 높이 = 10mm)에 넣은 뒤, 동결건조제로 동결 건조하여 -60 ℃에서 48 시간 유지하였다. 건조된 샘플을 37 ℃, 5ml의 완충용액(pH 7.4)에 침지시킨 후, 일정 시간이 지난 뒤 배지로부터 분리하고 표면의 수분을 제거하였다. 팽윤도는 하기의 식에 의해 도출되었으며, 하이드로젤, 복합체 1 및 2 각각 동일한 조건에서 3회 수행하였다. The hydrogel prepared in Examples 1 and 2 described above, and the structure obtained by 3D-printing the composites 1 and 2 were placed in a circular disk (n = 3, φ = 35 mm, height = 10 mm), and then freeze-dried with a lyophilizer to -60 It was kept at °C for 48 hours. The dried sample was immersed in a 5 ml buffer solution (pH 7.4) at 37°C, and after a certain period of time, it was separated from the medium to remove moisture from the surface. The degree of swelling was derived by the following equation, and the hydrogel, composites 1 and 2 were each performed three times under the same conditions.

Swelling (%) =

Figure 112019069817612-pat00006
x 100
Figure 112019069817612-pat00007
Swelling (%) =
Figure 112019069817612-pat00006
x 100
Figure 112019069817612-pat00007

위와 같은 방법으로 팽윤도를 도출한 결과, 도 12의 그래프와 같이 나타났다. 도 11을 보면, 최초 6시간이 경과하는 동안 하이드로젤과 복합체 1의 팽윤도는 약 150%에서 평형을 이루는 것으로 관찰되어 하이드로젤의 팽윤도는 최초 6시간과 유사한 수준을 유지하는 반면, 복합체 2는 48시간 경과시 250%까지 수화되어 평형을 이루었다. 복합체 1의 경우, 최초 6시간 경과시 약 210%의 팽윤도에 도달하여 평형을 이루는 것으로 확인되었다. As a result of deriving the swelling degree by the above method, it was shown as the graph of FIG. Referring to FIG. 11, it was observed that the swelling degree of the hydrogel and the composite 1 reached an equilibrium at about 150% during the first 6 hours, so that the swelling degree of the hydrogel was maintained at a level similar to that of the first 6 hours, whereas the composite 2 was 48. It was hydrated to 250% over time and was equilibrated. In the case of Complex 1, it was confirmed that the swelling degree of about 210% was reached and equilibrium was achieved after the first 6 hours.

실시예 9. 고분자-비트리젤 복합체의 약물방출 특성 평가Example 9. Evaluation of drug release characteristics of polymer-vitrogel complex

전술한 실시예 1 및 2로 제조된 하이드로젤, 복합체 1 및 2의 약물 방출 특성을 평가하기 위해, pH 7.4, 37 ℃의 인 비트로(in vitro) 조건에서 오르니다졸(ornidazole)의 약물 방출시험을 수행하였다. 오르니다졸이 포함된 시료 10ml를 완충액(pH 7.4)에 넣고 1, 3, 6, 24 및 48시간 경과 후, 분취액을 분리하여 UV-Vis 분광 광도계(BioMATE 3, Thermo Scientific, Madison, USA)로 흡광도를 측정하였다. 이 때, 오르니다졸의 방출률(%)은 표준 약물 방출거동을 기준으로 하여 도출하였으며, 각 실험은 3회 수행하였다. In order to evaluate the drug release characteristics of the hydrogels and complexes 1 and 2 prepared in Examples 1 and 2 described above, drug release test of ornidazole at pH 7.4 and 37° C. in in vitro conditions Was performed. 10 ml of a sample containing ornidazole was added to a buffer solution (pH 7.4), and after 1, 3, 6, 24 and 48 hours elapsed, an aliquot was separated and a UV-Vis spectrophotometer (BioMATE 3, Thermo Scientific, Madison, USA) Absorbance was measured by furnace. At this time, the release rate (%) of ornidazole was derived based on the standard drug release behavior, and each experiment was performed three times.

도 12은 하이드로젤, 복합체 1 및 2를 각각 3D 프린팅한 구조체를 이용하여 생분해성 실험한 결과를 나타낸 것으로, 복합체 1 및 2의 경우에도, 하이드로젤과 유사한 패턴으로 생분해성을 나타내고 있음을 확인할 수 있다. 그러나, 생체적합성 고분자를 물리적으로 첨가하여 제조된 복합체 1 및 2의 경우, 고분자들이 물리적으로 복합화되어 있으므로 하이드로젤에 비해 다소 빠른 생분해성이 있음을 확인하였다.FIG. 12 shows the results of a biodegradability experiment using a hydrogel, complexes 1 and 2, respectively, 3D-printed structures, and in the case of complexes 1 and 2, it can be confirmed that the biodegradability is shown in a pattern similar to that of the hydrogel. have. However, in the case of the composites 1 and 2 prepared by physically adding a biocompatible polymer, it was confirmed that the polymers are physically complexed and thus have a somewhat faster biodegradability compared to the hydrogel.

도 13는 3D 프린팅된 고분자-비트리젤 복합체로부터 서로 다른 양의 오르니다졸 약물을 로딩하여 인 비트로(in vitro)방출성을 측정한 결과를 나타낸 것으로, 도 13의 (a)는 복합체 1로부터의 오르니다졸 약물의 서방출성을, (b)는 복합체 2로부터의 오르니다졸 약물의 서방출성을 측정하였다. 도 13를 보면, 고 농도의 오르니다졸의 로딩하였을 때 보다 천천히 방출되는 것으로 측정되었고, 모든 약물이 약 10일 이상에 걸쳐 서방출되는 것을 확인하였다. FIG. 13 shows the results of measuring in vitro release by loading different amounts of ornidazole drugs from the 3D-printed polymer-vitrogel complex, and FIG. 13(a) shows the results from complex 1. The sustained-release property of the ornidazole drug, (b) was measured for the sustained-release property of the ornidazole drug from complex 2. Referring to FIG. 13, it was determined that the drug was released more slowly when a high concentration of ornidazole was loaded, and it was confirmed that all drugs were sustained release over about 10 days or more.

실시예 10. 인 비트로(In vitro) 세포 적합성 평가Example 10. In vitro cell suitability evaluation

인 비트로(In vitro) 세포배양기를 이용하여, 3D 프린팅 된 하이드로젤, 복합체 1 및 2의 표면에 골아세포(MC3T3)를 접종 및 증식시키는 연구를 통해 하이드로젤 및 복합체의 세포독성 및 생체적합성을 평가했다. 먼저, 3D 프린팅 된 샘플을 5일간 실온에서 멸균수로 헹군 뒤, 사용된 용액은 매일 새로운 용액으로 교체하여 미 반응물을 샘플로부터 제거하였다. 이후, 준비한 시료를 121 ℃에서 고온-고압으로15 분간 멸균하였다. 세포증식 시험을 수행하기 위해 24 웰 플레이트에 놓인 시료 표면에 마우스(MC3T3, Sigma Aldrich) 유래 2 x 106 개의 조골세포를 접종한 뒤, 37 ℃, 5%의 CO2 분위기 하에서 2일간 배양하여 세포를 사용하였다. 10%의 소 태아 혈청과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 포함된 α-MEM 배지 1 ㎖를 샘플이 포함된 각 웰 플레이트에 넣고 5일간 인 비트로(in vitro) 배양하였다. 세포접종 이후에는, 24시간마다 배양 배지를 교체하고, 1, 3, 5일 차 마다 세포 증식 정도를 CCK-8 분석을 통해 세포 수를 측정하였다. 세포의 생존 확인을 위해 공지된 염색법(ethidium homodimer-1/calcein AM live & dead assay)을 이용하였다. 하이드로젤 필름 상의 MC3T3 세포의 이미지는 형광현미경(Leica DMLB, Wetzlar, Germany)을 이용하여 촬영하였다. To evaluate the cytotoxicity and biocompatibility of hydrogels and complexes by inoculating and proliferating osteoblasts (MC3T3) on the surfaces of 3D-printed hydrogels and complexes 1 and 2 using an in vitro cell incubator. did. First, the 3D-printed sample was rinsed with sterile water at room temperature for 5 days, and then the used solution was replaced with a new solution every day to remove unreacted material from the sample. Thereafter, the prepared sample was sterilized at 121° C. by high temperature and high pressure for 15 minutes. In order to perform the cell proliferation test, 2 x 10 6 osteoblasts derived from mice (MC3T3, Sigma Aldrich) were inoculated on the surface of a sample placed on a 24-well plate, and then cultured for 2 days in a 5% CO 2 atmosphere at 37°C. Was used. 1 ml of α-MEM medium containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin was added to each well plate containing the sample and cultured in vitro for 5 days. After cell inoculation, the culture medium was changed every 24 hours, and the number of cells was measured through CCK-8 analysis for the degree of cell proliferation every 1, 3, and 5 days. A known staining method (ethidium homodimer-1/calcein AM live & dead assay) was used to confirm the survival of cells. Images of MC3T3 cells on the hydrogel film were taken using a fluorescence microscope (Leica DMLB, Wetzlar, Germany).

위의 방법으로 세포 적합성을 하이드로젤과 비교하여 젤라틴, 알부민이 복합된 복합체의 세포 수 측정과 H&E 및 콜라겐 조직염색을 통해서 도 14와 같은 결과를 획득하였다. 도 14의 (a)는 CCK-8 세포증식성을 확인한 결과로, 폴리스타이렌 세포배양 플라스크에서 세포 수를 측정한 결과를 대조군으로 하여 측정한 것이다. 도 14의 (a)를 보면, 하이드로젤의 경우 표면에서의 세포 수 증식이 대조군 샘플에서와 유사한 정도로 측정되어 제조된 하이드로젤의 세포적합성이 매우 우수한 것으로 판단되었다. 한편, 복합체 1 및 2의 경우, 대조군과 하이드로젤 샘플에 비해 상대적으로 우수한 세포증식성이 나타났다. By comparing the cell suitability with the hydrogel by the above method, the results as shown in FIG. 14 were obtained through measurement of the number of cells in the complex containing gelatin and albumin, and staining of H&E and collagen tissues. 14A is a result of confirming the CCK-8 cell proliferation, and the result of measuring the number of cells in a polystyrene cell culture flask was measured as a control. 14A, in the case of the hydrogel, the cell number proliferation on the surface was measured to be similar to that of the control sample, and it was determined that the cell suitability of the prepared hydrogel was very excellent. On the other hand, in the case of complexes 1 and 2, cell proliferation was relatively superior to that of the control and hydrogel samples.

도 14의 (b) 내지 (j)는 3D프린팅된 하이드로젤, 복합체 1 및 2에서의 세포증식 및 세포부착성을 염색을 통해서 관찰한 것이다. 도 14의 (b) 내지 (g)는 세포독성평가(live & dead assay)를 통해 관찰한 세포생존성 결과를, (h) 내지 (j)는 5일간 인 비트로(in vitro) 세포 배양하는 동안 재생된 조직을 염색하여 확인한 결과를 관찰한 것이다. 이 때, 도 14의 (b), (e), (h)는 3D 프린팅된 하이드로젤에서의 배양세포, (c), (f), (i)는 3D 프린팅 된 복합체 1에서의 배양세포, (d), (g), (j)는 3D 프린팅된 복합체 2에서의 배양세포들을 각각 관찰한 것이고, (b) 내지 (d)는 세포배양 1일차, (e) 내지 (g)는 세포배양 5일차의 세포의 증식성을 각각 측정한 것이다. 14 (b) to (j) show the observation of cell proliferation and cell adhesion in the 3D-printed hydrogel, complexes 1 and 2 through staining. 14(b) to (g) show the cell viability results observed through a live & dead assay, and (h) to (j) show the cell culture in vitro for 5 days. The regenerated tissue was stained and confirmed. At this time, Figure 14 (b), (e), (h) are cultured cells in the 3D-printed hydrogel, (c), (f), (i) are cultured cells in the 3D-printed complex 1, (d), (g), (j) are observations of cultured cells in 3D-printed complex 2, respectively, (b) to (d) are the first day of cell culture, and (e) to (g) are cell culture The proliferation of cells on day 5 was measured.

도 14의 (b) 내지 (g)를 보면, 하이드로젤에 비해 세포부착성이 우수한 고분자인 젤라틴과 알부민 생체재료를 이용하여 제조된 복합체 1 및 2에서 대조군 및 하이드로젤에 비해 세포증식성이 향상되는 것을 염색을 통해서 확인할 수 있었다. 이와 마찬가지로, 도 14의 (h) 내지 (j)를 보면, 하이드로젤에 비해 복합체 1 및 2에서 조직재생이 더 잘되었음을 확인할 수 있었다. 특히, 세포증식성이 우수한 고분자 생체재료인 알부민이 포함된 복합체 2 의 경우, 1일 경과시 측정된 세포 증식률에 비해 3일, 5일 경과시에 측정된 세포 증식률이 월등히 향상된 것을 확인할 수 있었다.14B to 14G, in complexes 1 and 2 prepared using gelatin and albumin biomaterials, which are polymers having superior cell adhesion compared to hydrogels, cell proliferation is improved compared to the control and hydrogels. It could be confirmed through dyeing. Similarly, looking at (h) to (j) of FIG. 14, it was confirmed that tissue regeneration was better in the complexes 1 and 2 compared to the hydrogel. Particularly, in the case of Complex 2 containing albumin, which is a polymer biomaterial having excellent cell proliferation, it was confirmed that the cell proliferation rate measured at 3 and 5 days was significantly improved compared to the cell proliferation rate measured at 1 day.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.As described above, although the embodiments have been described by the limited drawings, a person of ordinary skill in the art can apply various technical modifications and variations based on the above. For example, even if the described techniques are performed in a different order from the described method, and/or the described components are combined or combined in a form different from the described method, or are replaced or substituted by other components or equivalents. Appropriate results can be achieved.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.Therefore, other implementations, other embodiments, and claims and equivalents fall within the scope of the following claims.

Claims (5)

이중결합을 가지는 산성의 유기화합물,
PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)],
리포산(Lipoic acid),
디아크릴레이트계 가교제(diacrylate crosslinker),
광 개시제를 포함하는 하이드로젤; 및
젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 콜라겐, 피브린, 피브로인, 피브로넥틴, 키토산, 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose, CMC), 콘드로이친 설페이트(Chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생체적합성 고분자;
로 이루어지는, 고분자-하이드로젤 복합체.Acidic organic compounds with double bonds,
PPG-epoxide [Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)],
Lipoic acid,
Diacrylate crosslinker,
Hydrogel containing a photoinitiator; And
At least one selected from the group consisting of gelatin, albumin, collagen, fibrin, fibroin, fibronectin, chitosan, carboxymethyl cellulose (CMC), chondroitin sulfate and hyaluronic acid Biocompatible polymers of;
Consisting of, a polymer-hydrogel complex. 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 하이드로젤 및 생체적합성 고분자는, 3:1 내지 1:1의 중량비를 갖는, 고분자-하이드로젤 복합체.The method of claim 1,
The hydrogel and the biocompatible polymer have a weight ratio of 3:1 to 1:1, a polymer-hydrogel complex. 제1항에 있어서,
상기 이중결합을 가지는 산성의 유기화합물은, 말레산(Maleic acid), 푸마르산(Fumaric acid), 글루타코닉산(Glutaconic acid), 2-뷰텐-1,4-디카르복실산(2-Butene-1,4-dicarboxylic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 고분자-하이드로젤 복합체. The method of claim 1,
The acidic organic compound having a double bond is maleic acid, fumaric acid, glutaconic acid, 2-butene-1,4-dicarboxylic acid (2-Butene- 1,4-dicarboxylic acid) any one selected from the group consisting of, a polymer-hydrogel complex. (a) PPG-에폭사이드[Poly(propylene glycol)diglycidyl ether)]에 이중결합을 가지는 산성의 유기화합물 및 카페인 촉매를 혼합하여 하이드로젤 전구체 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 하이드로젤 전구체 용액에 리포산을 첨가하여 하이드로젤을 합성하는 단계; 및
(c) 상기 합성된 하이드로젤에 1종 이상의 생체적합성 고분자를 3:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계;
를 포함하고,
상기 생체적합성 고분자는 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 콜라겐, 피브린, 피브로인, 피브로넥틴, 키토산, 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxymethyl cellulose, CMC), 콘드로이친 설페이트(Chondroitin sulfate) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인, 고분자-하이드로젤 복합체 제조방법.(a) preparing a hydrogel precursor solution by mixing an acidic organic compound having a double bond and a caffeine catalyst in PPG-epoxide [Poly (propylene glycol) diglycidyl ether)];
(b) synthesizing a hydrogel by adding lipoic acid to the hydrogel precursor solution; And
(c) mixing at least one biocompatible polymer in the synthesized hydrogel in a weight ratio of 3:1 to 1:1;
Including,
The biocompatible polymer is composed of gelatin, albumin, collagen, fibrin, fibroin, fibronectin, chitosan, carboxymethyl cellulose (CMC), chondroitin sulfate and hyaluronic acid. At least one selected from the group, a polymer-hydrogel composite manufacturing method.
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