KR102213253B1 - 산화적 스트레스에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과 평가 방법 및 칸나비디올을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

산화적 스트레스에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과 평가 방법 및 칸나비디올을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산화적 스트레스 환경의 엄격한 통제 조건에서 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 반복재현성을 제공하며, 칸나비디올의 신경세포 보호 효과를 이용한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로의 활용을 목적으로 한다.

Description

산화적 스트레스에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과 평가 방법 및 칸나비디올을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Method for evaluating neuroprotective effect of cannabidiol against oxidative stress and Pharmaceutical composition containing cannabidiol As the active ingredient for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases}
본 발명은 산화적 스트레스로 유발된 신경 독성에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과를 평가하는 방법 및 이러한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과를 이용한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
산화적 스트레스(Oxidative stress)는 많은 세포 생물학적 경로에 있어서 활성 산소 종(ROS)의 영향에 의해 야기되는 손상을 생물학적 시스템이 복구하기 어려운 경우 또는 활성 산소 종(ROS)의 생성과 제거 사이에서 비롯된 불균형으로부터 발생한다. 산화적 스트레스는 정상적인 뇌 기능의 수행을 억제하는 것으로도 알려져 있는데, 이는 특히 뉴런의 세포 사이즈가 크고, 높은 산소 소비로 인해 산화환원 조절 이상에 취약하기 때문이며, 이로 인해 근위축성측삭경화증(ALS), 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증(MS)를 포함하는　신경퇴행성　질환들(neurodegenerative diseases)의 유발과 산화적 스트레스는 연관성이 높은 것으로 추측된다.
포유동물의 뇌는 신경줄기세포(neuronal stem cell)의 분열과 분화, 생존과 사멸(apoptosis) 및 시냅스 형성 등의 일련의 과정을 거쳐 체계적인 신경 회로망(neural network)을 발생함으로써 복잡한 기능을 수행할 수 있게 된다. 동물의 성체시기에도 뇌신경세포에서는 신경성장에 필요한 많은 물질을 생산하여 축색돌기(axon)과 수상돌기(dendrite)가 성장하게 되고 새로운 학습과 기억을 할 때마다 시냅스 연결과 신경회로망을 끊임없이 재구성하므로 성체에서도 계속 분화하고 있다고 할 수 있다. 이렇듯 신경세포는 세포가 분화하고 시냅스를 형성하는 과정에서 신경성장인자와 같은 표적유래 생존인자(target-derived survival factor)를 받지 못하면 세포사멸하게 되고, 특히 상술한 산화적 스트레스와 세포독성물질(cytotoxic agent)에 의한 세포사멸은 퇴행성 뇌질환의 주요원인이 될 수 있다.
한편, 칸나비디올(Cannabidiol: CBD, IUPAC name: 2-[(1R,6R)-3-methyl-6-prop-1-en-2-ylcyclohex-2-en-1-yl]-5-pentylbenzene-1,3-diol)은 하기 화학식 1로 표시되는 대마를 구성하는 주된 화합물 중 하나로서, 환각 증세를 일으키는 하기 화학식 2로 표시되는 테트라하이드로칸나비놀(tetrahydrocannabinol: THC)과 많이 비교되는 물질이다.
[화학식 1]
Figure 112020044185941-pat00001
[화학식 2]
Figure 112020044185941-pat00002
우리나라의 경우 마약류로 지정되어 많은 연구가 이루어지고 있지 않으나, 실제로 향정신성 효과가 거의 없어 외국의 경우 통증이나 기억 장애, 불안 등의 증상 완화를 위한 의료용으로 사용하며, 과도한 유분 생성을 억제하는 것이 알려져 여드름 피부용 화장품 성분과 관련된 연구도 활발히 이루어지고 있다. 또한, 칸나비디올은 신경 활성의 흥분-억제 평형(excitatory-inhibitory equilibrium)에 관여함으로써, 발작을 일으키는 간질 증후군에서 효과적일 수 있음을 시사하는 여러 보고가 있다.
칸나비디올은 테트라하이드로칸나비놀과 유사한 구조를 가지나, 테트라하이드로칸나비놀이 흥분을 유도하고 일부 암에서 세포 사멸 효과가 있다고 알려진 반면, 칸나비디올은 테트라하이드로칸나비놀과는 달리 흥분을 유도하지 않는다고 알려져 있다. 오히려, 테트라하이드로칸나비놀에 의해 유발된 흥분감을 완화시킬 수 있으며, 칸나비노이드 수용체에 간접적으로 결합함으로써, 세라마이드를 만들어 ER(Endoplasmic Reticulum) 스트레스를 통한 자가포식에 의한 세포사멸을 유도하고, ERK(Extracellular-signal-regulated kinase)를 통한 cell cycle arrest를 유도할 수 있다는 일부 연구결과가 있다.
최근까지도 칸나비디올은 미 식품의약국에 의해 헤로인과 LSD가 해당되는 1급 마약으로 분류되었으나, 실제로 통증, 발작, 근경련, 항암 화학요법에 의해 나타나는 메스꺼움, 염증성 장질환과 같은 소화 장애, 고혈압 등의 증상이 칸나비디올에 의해 개선되는 것으로 밝혀지고 있으며, 칸나비디올의 의약적 효능에 집중하여 대마 산업에 대한 긍정적 인식의 변화와 함께 상기 의약적 효능과 관련된 칸나비디올의 약학 용도의 발견에 무게를 두고 연구가 이루어지고 있다.
다만, 칸나비디올의 세포사멸과 관련된 신경세포학적 연구는 여전히 시작 단계이며, 이 때문에 신경독성 효과 또는 신경보호 효과에 대한 여러 세포실험이 이루어지고 있지만 일관된 결과를 보여주고 있지 않은 실정이다. 실험 세팅 조건에 따라 모순된 결과를 나타내기도 하며, 정립되지 않은 실험 프로토콜에 기인한 오류의 문제도 해결되어야 할 과제이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2019-0098650호 (2019.08.22.)
이에 본 발명자는 칸나비디올의 신경세포사멸 효과에 관한 연구를 지속하던 중 산화적 스트레스가 유발된 환경에서 신경 독성을 중화함으로써, 신경보호 효과를 나타내는 칸나비디올의 약리학적 특성에 주목하고 본 발명을 안출하게 되었다.
본 발명은 산화적 스트레스 환경에서 칸나비디올의 신경보호 효과에 따른 신경퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 칸나비디올 성분 그 자체로 신경 독성을 나타내는 특성을 가지고 있어, 산화적 스트레스 환경에서 신경보호 효과를 반복 재현할 수 있기 위한 조건을 제시하고, 나아가 종래 일관되지 못한 결과가 도출되는 과제를 해결하면서, 칸나비디올의 신경보호 효과를 평가하는 신뢰성 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경세포를 배지에 시딩(seeding) 하고 신경세포의 증식을 촉진하는 인자를 포함한 무혈청 배지를 웰에 투입하여 배양하는 단계; 0 내지 8 ℃의 배지에 H2O2 용액을 희석하여 H2O2를 함유한 H2O2 저장 용액을 형성하는 단계; 상기 배양된 신경세포에 칸나비디올(cannabidiol)이 희석된 배지를 처리하는 단계; 상기 칸나비디올 처리된 배지를 산화적 스트레스 유도를 위해 H2O2를 함유한 배지로 처리하는 단계; 및 일정 시간 경과 후 세포 생존율을 분석하는 단계;를 포함하는, 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신경세포는 50 내지 1000 cells/mm2 밀도로 시딩되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 칸나비디올은 0.1 내지 100 μM로 처리되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 H2O2를 함유한 배지는 0.1 내지 50 μM의 농도로 H2O2-가 함유된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신경세포 보호 효과는 하기 [식 1]에 따른 PR[CBD]로 표현되고, 칸나비디올의 농도 의존적으로 증가하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
[식 1]
Figure 112020044185941-pat00003
(상기 식 1에서, % viability for [+H2O2][+CBD]는 CBD와 H2O2가 모두 처리된 배지에서의 세포 생존율, % viability for [+H2O2][-CBD]는 H2O2만 처리되고, CBD는 처리되지 않은 배지에서의 세포 생존율을 의미한다.)
또한, 본 발명은 칸나비디올(Cannabidiol) 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 칸나비디올 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염은 산화적 스트레스에 의한 세포사멸을 예방 또는 저감하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 칸나비디올 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염의 농도는 0.1 내지 100 μM일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포는 해마뉴런세포, 대뇌 피질 뉴런세포, 성상세포, 및 희소돌기교세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 헌팅턴 증후군, 루게릭병, 외상후 스트레스 장애, 다발성 경화증, 대뇌 허혈질환 및 근위축성측색경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법은 H2O2 처리 온도를 조절함으로써, 칸나비디올의 신경세포 보호 효과가 농도 의존적인 양상을 나타낸다. 이는 이전의 반복재현성이 없었던 실험 결과와 관련하여 반복재현성과 신뢰성을 가지는 체계적인 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 칸나비디올을 유효성분으로 포함하는 조성물의 경우 산화적 스트레스에 의해 유발된 신경 독성을 중화시킴으로써, 신경세포 사멸을 차단하고, 신경세포의 보호 효과를 나타낼 수 있다. 이러한 신경세포의 보호 효과로 신경세포의 괴사로 발생하는 신경퇴행성 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 건강 보조식품으로 활용될 수 있다.
도 1a는 신경독성 효과와 관련하여, 농도별 칸나비디올 처리에 따른 세포 생존율 분석 결과를 CLSM 이미지를 통하여 나타낸 것이다. 녹색 형광은 살아 있는 세포, 빨간 형광은 죽은 세포를 의미한다.
도 1b는 신경독성 효과와 관련하여, 농도별 칸나비디올 처리에 따른 세포 생존율(% viability)을 그래프로 나타낸 것으로, LC50 수치는 9.85μM임을 확인할 수 있다.
도 2a는 신경독성 효과와 관련하여, 농도별 H2O2의 처리에 따른 세포 생존율 분석 결과를 CLSM 이미지를 통하여 나타낸 것이다. 녹색 형광은 살아 있는 세포, 빨간 형광은 죽은 세포를 의미한다.
도 2b는 신경독성 효과와 관련하여, 농도별 H2O2의 처리에 따른 세포 생존율(% viability)을 그래프로 나타낸 것으로, LC50 수치는 2.46 μM임을 확인할 수 있다.
도 3a는 신경보호 효과와 관련하여, H2O2 10 μM을 이용한 산화적 스트레스 환경 하에 농도별 칸나비디올 처리에 따른 세포 생존율 분석 결과를 CLSM 이미지를 통하여 나타낸 것이다. 녹색 형광은 살아 있는 세포, 빨간 형광은 죽은 세포를 의미한다.
도 3b는 신경보호 효과와 관련하여, H2O2 10 μM을 이용한 산화적 스트레스 환경 하에 칸나비디올 처리농도의 증가에 따라 PR[CBD](protection ratio of CBD)이 증가한 것을 나타낸 그래프이다.
도 4는 해마 뉴런을 H2O2 10 μM로 처리한 경우(중간 이미지), H2O2 10 μM 및 칸나비디올 5 μM로 처리한 경우(오른쪽 이미지), 대조군으로서 DMSO 처리한 경우(왼쪽 이미지)의 CLSM 이미지를 나타낸 것이다.
이하 본 발명에 따른 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법 및 칸나비디올 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
이하에서 어느 하나의 구성요소가 다른 구성요소를 “포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 당해 구성요소만으로 이루어지는 것으로 한정되어 해석되지 아니하며, 다른 구성요소들을 더 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
이하 본 명세서에서 사용되는 '신경세포'는 뇌신경줄기세포에서 분화되는 세포를 의미하며, 뉴런뿐만 아니라, 신경교세포(glia cells)로서, 성상세포(astrocytes), 희소돌기교세포(oligodendrocyte), 슈반세포(Schwann cells), 후각초성세포(olfactory ensheathing cells), 상의세포(ependymal cells) 및 위성세포(satellite glial cells)을 포함하는 개념으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법은 구체적으로 시딩(seeding) 하고 신경세포의 증식을 촉진하는 인자를 포함한 무혈청 배지를 웰에 투입하여 배양하는 단계; 0 내지 8 ℃의 배지에 H2O2 용액을 희석하여 H2O2를 함유한 H2O2 저장 용액을 형성하는 단계; 상기 배양된 신경세포에 칸나비디올(cannabidiol)이 희석된 배지를 처리하는 단계; 상기 칸나비디올 처리된 배지를 산화적 스트레스 유도를 위해 H2O2를 함유한 배지로 처리하는 단계; 및 일정 시간 경과 후 세포 생존율을 분석하는 단계;를 포함한다.
상기 신경세포의 배양을 위한 배지는 일반적으로 공지된 Neural Basal Media를 사용할 수 있고, 본 발명의 일 구현예를 위하여 1차 해마신경세포(Primary hippocampal cells) 배양에 특이적인 성분을 포함하는 배지로서, 순수 신경세포만을 배양하기 위하여, 신경교세포의 생장은 억제하는 배지를 사용할 수 있다. 상기 Neural Basal Media의 영양성분은 2 mM의 GlutaMAX supplement 와 B27 supplement를 사용하는 것을 특징으로 한다.
신경세포는 상기 배지에 50 내지 1000 cells/mm2 밀도로 시딩될 수 있고, 바람직하게는 80 내지 500 cells/mm2, 보다 바람직하게는 100 내지 300 cells/mm2의 저밀도로 시딩되는 것이 좋다.
상기 칸나비디올은 0.1 내지 100 μM로 처리되는 것일 수 있다. 바람직하게는0.1 내지 50 μM, 0.1 내지 30 μM, 또는 0.1 μM 이상 10 μM 미만, 보다 바람직하게는 3 내지 8 μM의 농도로 처리되는 것이 본 발명에 따른 신경세포 보호 효과의 신뢰성 있는 평가를 위하여 좋을 수 있다. 칸나비디올은 과다하게 처리될 경우 그 자체로 신경세포에 독성을 나타내기 때문에 적절한 농도로 처리되어야 한다.
상기 H2O2를 함유한 배지는 0.1 내지 50 μM의 농도로 H2O2-가 함유된 것일 수 있다. 바람직하게는 3 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 5 내지 20 μM인 것이 세포사멸(apoptosis)을 유도하면서도 세포가 완전히 사멸되지 않아, 세포 보호효과를 연구하기 위한 산화적 스트레스 환경으로 적합하다.
일반적으로 H2O2는 산화적 스트레스를 유발하는 물질로서, 본 발명의 일 실시예에 따라 뉴런에 처리하는 경우, 세포사멸을 유도하여 퇴화된 신경세포 파편을 형성하는 것을 관찰할 수 있다. H2O2에 의하여 유발된 산화적 스트레스가 신경세포 사멸을 유도한다는 것은 알려진 사실이나, 본 발명은 기존에 정립되지 않았던, 신경세포의 보호 작용과 관련된 연구에 적합한 산화적 스트레스 환경을 조성함으로써, 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법에 있어서 신뢰도 높은 데이터를 제공할 수 있다.
주변 온도에서 H2O2는 빠른 분해가 일어나는 특성이 있기 때문에, 이를 피하기 위해서는 저온에서 저장 및 희석될 필요가 있다. 구체적으로 예를 들면, 0 내지 8 ℃일 수 있고, 바람직하게는 3 내지 6 ℃인 경우 칸나비디올의 신경세포 보호 효과와 관련된 실험 데이터의 재현성이 보장될 수 있다. 이때 H2O2의 저장 및 희석 과정에 국한되지 않고, 제조 후, 짧은 시간 내에 배지에 옮겨져야 하는 것이 중요할 수 있다. 예를 들어 제조 직후 내지 5 분 이내이면 H2O2의 분해를 최소화할 수 있어서 좋다.
상기 신경세포 보호 효과는 하기 [식 1]에 따른 PR[CBD]로 표현될 수 있고, 칸나비디올의 농도 의존적으로 증가하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
[식 1]
Figure 112020044185941-pat00004
(상기 식 1에서, % viability for [+H2O2][+CBD]는 CBD와 H2O2가 모두 처리된 배지에서의 세포 생존율, % viability for [+H2O2][-CBD]는 H2O2만 처리되고, CBD는 처리되지 않은 배지에서의 세포 생존율을 의미한다.)
도 3b에 본 발명의 일 실시예에 따른 PR[CBD]의 변화가 도시되어 있다. 칸나비디올을 함유하고 있는 배지에 H2O2를 10 μM 처리한 경우, 1차 해마뉴런의 세포 생존율을 분석하면 칸나비디올(CBD)의 농도가 0.1 μM일 때, PR[CBD]=1.03; [CBD]=1일 때, PR[CBD]=1.24; [CBD]=2일 때, PR[CBD]=1.41; [CBD]=3일 때, PR[CBD]=1.88; [CBD]=5일 때, PR[CBD]=2.40을 나타낸다. 이를 통해 칸나비디올의 농도가 0.1 내지 5 μM 인 범위에서, 신경세포 보호 효과가 농도의존적으로 증가한다는 사실을 확인할 수 있다. 또한, 이러한 경향성은 본 발명에 따른 평가 방법의 반복재현성을 보장한다.
또한, 본 발명은 칸나비디올(Cannabidiol) 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 칸나비디올 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염은 산화적 스트레스에 의한 세포사멸을 예방 또는 저감하는 것일 수 있다.
상기 칸나비디올 또는 이의 약리학적 허용 가능한 염의 농도는 0.1 내지 100 μM일 수 있다. 바람직하게는0.1 내지 50 μM, 0.1 내지 30 μM, 또는0.1μM 이상 10 μM 미만일 수 있고, 보다 바람직하게는 3 내지 8 μM인 것이 세포 보호능 발현에 좋다.
상기 세포는 해마뉴런세포, 대뇌 피질 뉴런세포, 성상세포, 및 희소돌기교세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다. 바람직하게는 해마뉴런세포에서 해당 세포 보호 효과가 우수하게 나타난다.
상기 약리학적으로 허용 가능한 염은 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 및 벤조산 중에서 선택된 유기산이거나, 염산, 황산, 인산 및 브롬화수소산 중에서 선택된 무기산에 의해 형성되는 산 부가염의 형태일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후군, 헌팅턴 증후군, 루게릭병, 외상후 스트레스 장애, 다발성 경화증, 대뇌 허혈질환 및 근위축성측색경화증으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다. 상기 제제는 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
필요에 따라, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니 톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 제제화를 통하여 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 피부 도포, 직장 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 조절될 수 있으며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001㎎/㎏ 내지 10 g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ 내지 1 g/㎏일 수 있다. 필요에 따라 상기 투여량을 수회에 나누어 일정시간 간격으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 숙련된 의사에 의해 조절될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 칸나비디올을 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선을 위한 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품이란 칸나비디올을 포함하는 조성물을 식품 소재에 첨가하여 제조된 식품이거나, 이를 캡슐, 분말, 현탁액 등으로 제조한 식품으로서, 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 통상적인 의미의 건강 식품을 포함한다. 상기 식품의 종류로는 예를 들면, 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스켓, 떡, 초콜릿, 캔디, 스낵, 과자, 피자, 면류, 껌, 아이스크림, 스프, 음료, 차, 비타민 복합체 등이 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산, 펙트산염, 알긴산, 알긴산염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하 실시예를 통해 본 발명에 따른 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경 보호효과의 평가 방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
실험예 1. H 2 O 2 및 칸나비디올(CBD)의 신경독성 효과 평가
1-1. 1차 해마뉴런 배양
SD 랫트의 18주된 배아를 해부하고, AccumaxTM(Stemcell Technologies)를 10분동안 처리한 후, 1차 해마뉴런을 1차 조직으로부터 분리하였다. 1차 해마뉴런을 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution, Welgene)로 4회 세척하고, HBSS에 현탁시킨 후, 1000 rpm 에서 3분간 원심 분리하였다. 그리고 무혈청 보충제(B-27TM , 50Х, Thermo Fisher Scientific), 2 mM GlutaMAXTM(100Х, Thermo Fisher Scientific), 12.5 μM L-글루탐산(L-glutaminc acid) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(5,000 U/mL 페니실린 및 5,000 ㎍/mL 스트렙토마이신, Welgene)을 함유한 배지에 재현탁시켰다. 이후 세포여과기(cell strainer)를 사용하여 여과시키고, 1차 해마뉴런을 100 cell/mm2의 밀도로 24-웰플레이트에서 poly-D-lysine으로 코팅된 유리커버 슬립에 시딩하였다. 이후, 37℃ 및 5% CO2의 습한 대기 조건에서 유지시켰다. 이 실험은 KAIST의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의하여 승인되었다.
1-2. 산화적 스트레스 유발을 위한 H 2 O 2 의 적정 농도 평가
1차 해마뉴런에 배양 배지를 첫째 날 0, 0.1, 1, 3, 5, 7, 10, 30, 50 μM의 다양한 농도에 따른 H2O2를 함유하는 배지(NeurobasalTM)로 교체하고, 37 ℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 37 ℃에서 20 분 동안 PBS에서 2μM 칼 세인 AM(calcein AM, Thermo Fisher Scientific) 및 4 μM 에티디움 동종이량체-1(ethidium homodimer-1, Thermo Fisher Scientific)로 처리하여, 1차 해마뉴런의 생존율(% Viability)을 측정하였다.
H2O2의 경우 열에 의해 분해속도가 가속화되므로 0.1 또는 1 mM H2O2 저장액은 4 ℃ 저온배지(cold media)에서 준비되었다. 세포 생장 가능 온도인 37 ℃로 미리 데워진 NeurobasalTM 배지에 H2O2 용액을 희석하는 대신에, H2O2의 분해를 최소화하기 위해 4 ℃의 저온 배지에 H2O2용액을 희석하여 H2O2 저장 용액을 제작하고, 미리 결정된 양의 H2O2 저장 용액으로 희석하였다.
살아있는 세포와 죽은 세포의 이미지는 LSM 700 공초점 현미경(confocal laser-scanning microscope:CLSM, Carl Zeiss)으로 얻었다. 칼세인 AM을 통해 살아있는 세포는 녹색으로 염색되고, 에티디움 동종이량체-1를 통해 죽은 세포는 빨간색으로 염색된다. 세포 생존율은 ImageJ 소프트웨어 (NIH) 및 ZEN 소프트웨어 (Carl Zeiss)의 이미지 분석을 사용하여 추정되었고, 3 번의 반복 실험을 통해 3 회 이상의 독립적 배양 후, % viability (평균 ± 표준 오차; 평균 ± SE)로 표현되었다.
도 2a는 CLSM 이미지로 세포를 관찰한 결과이다. H2O2를 1 μM농도로 처리할 때까지는 대조군(control)과 비교하여 생존율에 큰 차이가 없으나, H2O2의 농도가 3 μM이상일 경우 세포 생존율이 감소하였고, 10 μM로 처리하는 경우 세포 생존율이 16.49%로 감소하였다. 도 2b를 통해 H2O2의 LC50(lethal concentration 50)는 2.46 μM로 계산되었음을 확인할 수 있다.
1-3. 칸나비디올의 신경독성 효과
신경독성 실험을 위하여 배양 배지를 첫째 날 0.1 내지 100 μM(0, 0.1, 1, 3, 5, 10, 15, 30, 50 및 100 μM) 칸나비디올(CBD, Cayman Chemical Company)를 포함하는 NeurobasalTM(Thermo Fisher Scientific)배지로 교체하였다. 세포를 37 ℃에서 20 분 동안 PBS에서 2 μM 칼세인 AM(calcein AM, Thermo Fisher Scientific) 및 4 μM 에티디움 동종이량체-1(ethidium homodimer-1, Thermo Fisher Scientific)로 처리하고, 1차 해마뉴런의 생존율(% Viability)을 측정하였다. 세포 생존율은 상기 실험예에서와 동일하게 측정할 수 있다.
도 1a는 다양한 농도로 칸나비디올을 처리한 1차 해마뉴런의 CLSM 이미지를 나타낸 결과이다. 칸나비디올을 5 μM 농도로 처리하기까지는 세포 사멸이 눈에 띄지 않았으나, 30 μM에서는 대부분의 세포가 사멸한 것을 확인할 수 있다. 10 μM 농도에서 44.8%까지 세포 생존율이 감소하였고, LC50은 9.85 μM임을 도 1b를 통해 확인할 수 있다.
실시예 1. 칸나비디올의 신경보호 효과의 평가
칸나비디올의 신경보호 효과 평가를 위하여, 첫째 날 다양한 농도(0, 0.1, 1, 2, 3, or 5 μM)의 칸나비디올(Cayman Chemical Company)을 함유하는 990 μL의 새로운 NeurobasalTM 배지로 교체하였다. 칸나비디올의 농도가 0인 경우는 0.1% DMSO가 대신 사용되었으며, 이후 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 0.1 mM H2O2 저장용액을 10 μL 첨가하였다. 37 ℃에서 24시간 배양 후, 세포를 37 ℃에서 20 분 동안 PBS에서 2 μM 칼세인 AM(calcein AM, Thermo Fisher Scientific) 및 4 μM 에티디움 동종이량체-1(ethidium homodimer-1, Thermo Fisher Scientific)로 처리하였다.
살아있는 세포와 죽은 세포의 이미지는 LSM 700 공 초점 현미경 (Carl Zeiss)으로 얻었다. 세포 생존율은 ImageJ 소프트웨어 (NIH) 및 ZEN 소프트웨어 (Carl Zeiss)의 이미지 분석을 사용하여 추정되었고, 4 번의 반복 실험을 갖는 4 회 이상의 독립적 배양 후 % viability (평균 ± 표준 오차; 평균 ± SE)로 표현되었다.
도 3a는 H2O2에 의하여 유발된 산화적 스트레스 환경에서 신경독성을 중화하는 칸나비디올의 신경보호 효과를 확인할 수 있는 CLSM 이미지를 나타낸 것이다. 도 3b는 칸나비디올의 농도에 따른 PR[CBD]를 나타낸 그래프로서, 처리한 칸나비디올의 농도가 증가할수록 PR[CBD] 수치가 증가한 결과를 통하여, 신경 독성을 나타내는 농도에 이르기 전까지 칸나비디올의 신경보호 효과는 농도 의존적임을 확인할 수 있다.

Claims (10)

  1. 신경세포를 배지에 시딩(seeding) 하고 신경세포의 증식을 촉진하는 인자를 포함한 무혈청 배지를 웰에 투입하여 배양하는 단계;
    0 내지 8 ℃의 배지에 H2O2 용액을 희석하여 H2O2를 함유한 H2O2 저장 용액을 형성하는 단계;
    상기 배양된 신경세포에 칸나비디올(cannabidiol)이 희석된 배지를 처리하는 단계;
    상기 칸나비디올이 처리된 배지를 산화적 스트레스 유도를 위해 H2O2를 함유한 배지로 처리하는 단계; 및
    일정 시간 경과 후 세포 생존율을 분석하는 단계;를 포함하고,
    상기 H2O2를 함유한 배지는 3 이상 30 μM 미만의 농도로 H2O2가 함유된, 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 신경세포는 50 내지 1000 cells/mm2 밀도로 시딩되는 것인, 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 칸나비디올은 0.1 내지 100 μM로 처리되는 것인, 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 신경세포 보호 효과는 하기 [식 1]에 따른 PR[CBD]로 표현되고, 칸나비디올의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 특징으로 하는, 산화적 스트레스 환경에 대한 칸나비디올의 신경세포 보호 효과의 평가 방법.
    [식 1]
    Figure 112020044185941-pat00005

    (상기 식 1에서, % viability for [+H2O2][+CBD]는 CBD와 H2O2가 모두 처리된 배지에서의 세포 생존율, % viability for [+H2O2][-CBD]는 H2O2만 처리되고, CBD는 처리되지 않은 배지에서의 세포 생존율을 의미한다.)
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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