KR102212505B1 - sacbrood vaccine of bees using CRISPR/Cas9 based Bacillus subtilis genome editing mechanism - Google Patents
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Abstract
Description
본 출원은 벌을 대상으로 하는 항원성 물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물에 관한 것이다.The present application relates to an antigenic substance targeting bees, a CRISPR/Cas9 system, and a vaccine composition for cystoid rot of bees including the same.
본 출원은 벌을 대상으로 하는 항원성 물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 벌의 낭충봉아부패 백신 제조방법에 관한 것이다.The present application relates to an antigenic substance targeting bees, a CRISPR/Cas9 system, and a method for manufacturing a bee cystoid spoilage vaccine including the same.
본 출원은 벌의 낭충봉아부패를 치료하는 치료방법에 관한 것이다.The present application relates to a treatment method for treating cystoid rot of bees.
백신은 질병 예방 또는/및 치료를 위해 조치할 수 있는 가장 중요한 수단 중 하나이다.Vaccines are one of the most important measures that can be taken to prevent or/and treat disease.
현재까지 여러 질병들에 대한 다양한 백신이 개발되어 왔음에도 불구하고 질병을 일으키는 원인체의 변이가 일어날 경우 개발되어 있는 백신만으로는 치료 또는/및 예방이 불가능하다.
본 발명의 배경이 되는 기술은 대한민국 공개특허공보 제2019-0011687호(2019.02.07)에 개시되어 있다.Although various vaccines for various diseases have been developed so far, treatment or/and prevention is not possible with only the developed vaccines when mutations in the cause of the disease occur.
The technology behind the present invention is disclosed in Korean Patent Application Publication No. 2019-0011687 (2019.02.07).
이와 같이, 질병을 일으키는 원인체의 변이에도 신속하게 대응할 수 있는 백신의 개발은 필요하다.As described above, it is necessary to develop a vaccine capable of rapidly responding to mutations in the cause of the disease.
본 출원의 일 과제는, 항원성 물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present application is to provide an antigenic substance, a CRISPR/Cas9 system, and a vaccine composition for cystoid rot of a bee including the same.
본 출원의 다른 과제는, 벌의 낭충봉아부패를 일으키는 원인체에 대한 백신 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.Another object of the present application is to provide a vaccine against a causative agent that causes cystoid rot of bees and a method for manufacturing the same.
본 출원의 또 다른 과제는, 벌의 낭충봉아부패를 예방 또는/및 치료하기 위한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.Another object of the present application is to provide a use for preventing or/and treating cystoid rot of bees.
전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, In order to solve the problems of the present application described above, according to an aspect of the present application,
i) 바실러스(Bacillus) 유래 포자;i) Spores from Bacillus;
ii) 상기 바실러스 유래 포자의 표면에 존재하는 포자 코트 단백질인 CotG 단백질;ii) CotG protein, which is a spore coat protein present on the surface of the Bacillus-derived spores;
iii) 상기 포자 코트 단백질에 연결된 펩타이드로 구성된 링커(linker);iii) a linker composed of a peptide linked to the spore coat protein;
iv) 상기 상기 링커에 연결되어 발현하는 SEQ ID NO. 1 내지 3 중 선택되는 어느 하나의 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질;iv) SEQ ID NO expressed by linking to the linker. Any one bee selected from 1 to 3 cystoid rot antigenic substances;
을 포함하는 벌의 낭충봉아부패 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.It provides a vaccine composition for preventing or treating cystoid rot of a bee comprising a.
이 때, 상기 바실러스 유래 포자의 지노믹 DNA에 CotG를 코딩하는 서열, 링커를 코딩하는 서열, 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 인코딩 코딩하는 서열이 순서대로 융합되어 있는 지노믹 DNA를 가진 포자인 것을 특징으로 하는 벌의 낭충봉아부패 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.In this case, a spore having a genomic DNA in which a sequence encoding CotG, a sequence encoding a linker, and a sequence encoding an antigenic substance for cystoid spores of bees are fused in order to the genomic DNA of the Bacillus-derived spore It provides a vaccine composition for preventing or treating cystoid rot of bees, characterized in that.
또한, 전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 다른 양태에 의하면, In addition, in order to solve the problems of the present application described above, according to another aspect of the present application,
i) gRNA및 Cas9을 바실러스에 도입하는 단계; - 이 때, 상기 gRNA는 상기 바실러스의 게놈 DNA에 포함된 CotG를 코딩하는 서열을 타겟하는 서열임 -;i) introducing gRNA and Cas9 into Bacillus; -In this case, the gRNA is a sequence targeting a sequence encoding CotG contained in the genomic DNA of Bacillus -;
ii) CotG를 인코딩하는 핵산, 링커를 인코딩하는 핵산 및 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질인 SEQ ID NO. 1 내지 3 중 적어도 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 포함하는 도너를 상기 바실러스에 도입하는 단계;ii) a nucleic acid encoding CotG, a nucleic acid encoding a linker, and SEQ ID NO, which is an antigenic substance for cystoid decay of bees. Introducing a donor containing a nucleic acid encoding at least one of 1 to 3 into the Bacillus;
iii) 상기 도너에 포함된 핵산이 넉인된 게놈 DNA를 가지고 있는 바실러스를 선택 하는 단계; 및; iii) selecting a Bacillus having genomic DNA knocked in the nucleic acid contained in the donor; And;
iv) 상기 선택된 바실러스로 포자를 형성시키는 단계;iv) forming spores from the selected Bacillus;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 벌의 낭충봉아부패 예방 또는 치료용 백신 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing a vaccine for preventing or treating cystoid rot of bees comprising a.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.According to the present application, the following effects occur.
첫째, 본 출원에 의하면, 벌의 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료할 수 있는 조성물을 제공할 수 있게 된다. 특히, 항원성 물질, CRISPR/Cas9 시스템 및 이를 포함한 벌의 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료 조성물을 제공할 수 있게 된다.First, according to the present application, it is possible to provide a composition capable of preventing or/and treating cystoid rot of bees. In particular, it is possible to provide an antigenic substance, a CRISPR/Cas9 system, and a composition for the prevention or/and treatment of cystoid rot of bees including the same.
둘째, 본 출원에 의해 제공되는 조성물을 이용함으로써, 벌의 낭충봉아부패 질병을 일으키는 원인체에 변이가 발생했을 때 신속하게 대응할 수 있는 효과를 제공할 수 있게 된다. Second, by using the composition provided by the present application, it is possible to provide an effect that can respond quickly when a mutation occurs in the causative agent of the bee cystoid rot disease.
도 1은 pHCas9 벡터를 도시한 도면이다.
도 2는 B. subtilis coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS 를 포함하는 pJB 벡터를 도시한 도면이다.
도 3은 B. subtilis coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 GFP를 포함하는 pJB-GFP 벡터를 도시한 도면이다.
도 4는 본 출원에서 사용한 벌의 낭충봉아부패의 항원결정부위를 도시한 도면이다.
도 5는 B. subtilis coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 VP1을 포함하는 pJB015 벡터를 도시한 도면이다.
도 6은 B. subtilis coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 VP2를 포함하는 pJB016 벡터를 도시한 도면이다.
도 7은 B. subtilis coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 VP3을 포함하는 pJB017 벡터를 도시한 도면이다.
도 8은 항생제 저항성유전자의 결손을 위해 ampicillin 저항성 유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 pJB-sg02 벡터를 도시한 도면이다.
도 9는 항생제 저항성유전자의 결손을 위해 neomycin 저항성 유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 pJB-sg03 벡터를 도시한 도면이다.
도 10은 B. subtilis의 포자 표면에 GFP가 발현되는지 확인하기 위해 수행한 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 B. subtilis의 포자 표면에 GFP가 발현되는지 확인하기 위해 수행한 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 B. subtilis의 포자 표면에 VP1, VP2, VP3가 발현되는지 확인하기 위해 수행한 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다
도 13은 pJB-VP 발현벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체에 항생제 유전자 ampicillin이 결손된 것을 확인하기 위해 수행한 PCR 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 pJB-VP 발현벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체에 항생제 유전자 neomycin이 결손된 것을 확인하기 위해 수행한 PCR 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 항원 특이적 항체 형성여부를 확인한 ELISA 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 항원 특이적 항체 형성여부를 확인한 Western blot 결과를 나타낸 도면이다.1 is a diagram showing a pHCas9 vector.
FIG. 2 is a diagram showing a pJB vector containing CotG CDS including a guide RNA of B. subtilis coat protein (CotG) and a promoter.
FIG. 3 is a diagram showing a pJB-GFP vector including CotG CDS and GFP including a guide RNA and promoter of B. subtilis coat protein (CotG).
4 is a view showing the epitope determinant site of cystoid rot of a bee used in the present application.
FIG. 5 is a diagram showing a pJB015 vector including CotG CDS and VP1 including a guide RNA and promoter of B. subtilis coat protein (CotG).
6 is a diagram showing a pJB016 vector including CotG CDS and VP2 including a guide RNA and promoter of B. subtilis coat protein (CotG).
7 is a diagram showing a pJB017 vector including CotG CDS and VP3 including a guide RNA and promoter of B. subtilis coat protein (CotG).
8 is a diagram showing a pJB-sg02 vector containing a guide RNA targeting an ampicillin resistance gene for the deletion of an antibiotic resistance gene.
FIG. 9 is a diagram showing a pJB-sg03 vector containing a guide RNA targeting a neomycin resistance gene for deletion of an antibiotic resistance gene.
10 is a diagram showing the results of PCR analysis performed to determine whether GFP is expressed on the spore surface of B. subtilis .
11 is a view showing the results of FACS analysis performed to determine whether GFP is expressed on the spore surface of B. subtilis .
12 is a diagram showing the results of PCR analysis performed to determine whether VP1, VP2, and VP3 are expressed on the spore surface of B. subtilis
13 is a diagram showing PCR results performed to confirm the deletion of the antibiotic gene ampicillin in the B. subtilis transformant into which the pJB-VP expression vector was introduced.
FIG. 14 is a diagram showing PCR results performed to confirm that the antibiotic gene neomycin was deleted in the B. subtilis transformant into which the pJB-VP expression vector was introduced.
15 is a diagram showing the results of ELISA confirming the formation of antigen-specific antibodies.
16 is a diagram showing Western blot results confirming whether or not antigen-specific antibodies are formed.
본 출원에 의해 개시되는 기술에서 사용되는 용어 또는 실시는 달리 정의되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 미생물학, 바이러스학, 세균학, 유전학, 면역학, 생화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 통상의 기술 등을 사용하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless otherwise defined, terms or practices used in the technology disclosed by this application are microbiology, virology, bacteriology, genetics, immunology, biochemistry, molecular biology, microbiology, cell biology, genomics and conventional It has the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art using technology and the like.
1. 백신(vaccine)1. Vaccine
본 출원의 일 태양은 백신에 관한 것이다.One aspect of the present application relates to a vaccine.
"백신(vaccine)"은 질병에 대한 방어 면역을 생성하는 물질을 지칭한다. 상기 방어 면역은 바이러스, 세균, 기생충 등의 병원체를 특이적으로 인식하는 항체나 T세포(T cell)로 생체에서 병원체를 배제하는 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 백신은 사백신(killed vaccine), 생백신(attenuated vaccine), 독소백신(toxoid vaccine), 조각백신(subnunit vaccine), 결합백신(conjugated vaccine) 등 통상의 백신은 모두 포함할 수 있으며, 이에 한정하지는 않는다. 용어 "백신" 또는 "예방주사"는 상호교환 가능하게 사용된다. 병을 예방하기 위해 상기 예방주사를 맞는 것을 예방접종이라고 한다.“Vaccine” refers to a substance that produces a protective immunity against disease. The protective immunity may include antibodies or T cells that specifically recognize pathogens such as viruses, bacteria, and parasites, which exclude pathogens from the living body, but are not limited thereto. The vaccine may include all conventional vaccines such as a killed vaccine, an attenuated vaccine, a toxoid vaccine, a subnunit vaccine, and a conjugated vaccine, but is not limited thereto. . The terms "vaccine" or "prophylactic injection" are used interchangeably. In order to prevent illness, getting the above vaccination is called vaccination.
상기 백신의 대상은 인간, 벌, 잠자리, 나비 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.The target of the vaccine may be a human, bee, dragonfly, butterfly, etc., but is not limited thereto.
예를 들어, 본 출원에서 백신의 대상은 벌일 수 있다.For example, the subject of a vaccine in this application may be punishment.
1-1. 포자1-1. Spore
상기 백신은 포자를 포함할 수 있다.The vaccine may contain spores.
상기 포자는 자연 상태의 포자 및 그 변형물을 포함할 수 있다.The spores may include spores in a natural state and variations thereof.
예를 들어, 포자는 식물, 효모, 진균, 박테리아 등의 포자일 수 있다.For example, spores may be spores of plants, yeast, fungi, bacteria, and the like.
상기 박테리아의 포자에서 박테리아는 Clostridium 속, Streptococcus 속, Bacillus 속 등일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.In the spores of the bacteria, the bacteria may be Clostridium genus, Streptococcus genus, Bacillus genus, etc., but are not limited thereto.
상기 Clostridium 속은 예를 들어, C. difficile, C. botulinum, C. perfringens 등 일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.The Clostridium genus may be, for example, C. difficile, C. botulinum, C. perfringens , but is not limited thereto.
상기 Bacillus 속은 예를 들어, B. subtilis, B. anthrasis, B. thuringiensis, B. cereus 등 일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.The genus Bacillus may be, for example, B. subtilis, B. anthrasis, B. thuringiensis, B. cereus , but is not limited thereto.
예를 들어, 본 출원은 B. subtilis의 포자를 포함한 백신일 수 있다.For example, the present application may be a vaccine containing spores of B. subtilis .
상기 박테리아는 GRAS(generally recognized as safe)로 인정되고 있는 예를 들어, B. subtilis 등의 박테리아를 포함할 수 있다.The bacteria may include, for example, bacteria such as B. subtilis recognized as GRAS (generally recognized as safe).
특히, 본 출원이 포자를 포함한 백신일 경우, GRAS로 인정되는 박테리아라면 모두 사용할 수 있다.In particular, if the present application is a vaccine containing spores, any bacteria recognized as GRAS can be used.
상기 포자는 식물, 효모, 진균, 박테리아 등의 외부에 형성되는 외생포자(exospore) 및 내부에 형성되는 내생포자(endospore)를 포함할 수 있다.The spores may include exospores formed on the outside of plants, yeast, fungi, and bacteria, and endospores formed on the inside.
예를 들어, 본 출원은 내생포자를 포함한 백신일 수 있다.For example, the present application may be a vaccine containing endospores.
상기 외생포자는 포자가 포자낭 밖에서 만들어져서 그대로 분리되어 나오는 것으로, 포자의 생식기능에 관여하는 포자를 지칭한다.The exospore refers to spores that are produced outside the sporangia and come out as they are, and are involved in the reproductive function of spores.
상기 내생포자는 포자의 내부(구체적으로, 세포 안)에 형성하는 포자를 지칭하며, 대사활동이 거의 없으며 생존이 어려운 조건이 오면 일시적으로 형성되는 포자를 지칭한다.The endospores refer to spores formed inside (specifically, cells) of spores, and refer to spores that have little metabolic activity and are temporarily formed when conditions difficult to survive.
예를 들어, 본 출원은 B. subtilis의 내생포자를 포함한 백신일 수 있다.For example, the present application may be a vaccine containing endospores of B. subtilis .
상기 내생포자가 형성되는 조건은 영양분이 고갈된 영양학적 조건, 고온 또는 저온의 온도적 조건, 고수분 또는 저수분의 수분적 조건, 살균제, 보존제 등의 화학적 조건, 산성 또는 알칼리성의 pH적 조건 등에서 형성될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.The conditions under which the endospores are formed are nutrient-depleted nutritional conditions, high or low temperature temperature conditions, high or low moisture moisture conditions, chemical conditions such as disinfectants and preservatives, acidic or alkaline pH conditions, etc. It may be formed, but is not limited thereto.
이와 같이 내생포자는 생존이 어려운 조건에서 형성될 수 있기 때문에, 다양한 환경에서 오랫동안 살아남을 수 있다. 즉, 내생포자는 열, 건조, 독성 화학물질, 영양분 고갈, 자외선 조사 등과 같은 해로운 조건에 엄청난 저항성을 가질 수 있다.In this way, because endospores can be formed under conditions that are difficult to survive, they can survive for a long time in various environments. In other words, endospores can have tremendous resistance to harmful conditions such as heat, drying, toxic chemicals, nutrient depletion, and UV irradiation.
상기 포자는 포자외부단백질을 포함할 수 있으며, 예를 들어 상기 포자외부단백질은 spore exosporium protein, spore coat protein, transmembrane protein, spore appendage protein, spore associated enzyme 등 일 수 있다.The spore may include an external spore protein. For example, the spore external protein may be a spore exosporium protein, a spore coat protein, a transmembrane protein, a spore appendage protein, a spore associated enzyme, and the like.
예를 들어, 본 출원은 동일한 속의 미생물들의 포자 간에는 서로의 포자외부단백질을 사용할 수 있다.For example, the present application may use each other's spore proteins between spores of microorganisms of the same genus.
상기 spore exosporium protein은 예를 들어, BclA, InhA 등 일 수 있다.The spore exosporium protein may be, for example, BclA or InhA.
상기 포자 코트단백질(coat protein)은 예를 들어, CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CotH, CotJA, CotJC, CotK, CotL, CotM 등 일 수 있다.The spore coat protein is, for example, CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CotH, CotJA, CotJC, CotK , CotL, CotM, etc.
상기 transmembrane protein은 예를 들어, prkC, OppA 등 일 수 있다.The transmembrane protein may be, for example, prkC, OppA, or the like.
상기 spore appendage protein은 예를 들어, P29a, P29b, P85 등 일 수 있다.The spore appendage protein may be, for example, P29a, P29b, P85, or the like.
상기 spore associated enzyme은 예를 들어, CotA(laccase), oxdD(oxalate decarboxylase), CotQ(reticuline oxidase-like protein), tgI(transglutaminase)등 일 수 있다.The spore associated enzyme may be, for example, CotA (laccase), oxalate decarboxylase (oxdD), reticuline oxidase-like protein (CotQ), transglutaminase (tgI), and the like.
상기 포자는 소수성(hydrophobic)을 지니고 있을 수 있다. 이 때 포자 전체 또는 일부에서 소수성을 지니고 있을 수 있다.The spores may have hydrophobic properties. At this time, all or part of the spore may have hydrophobicity.
상기 포자는 포자 시스템의 구성요소일 수 있다.The spores may be components of the spore system.
상기 백신은 포자 시스템을 포함할 수 있다.The vaccine may comprise a spore system.
상기 포자 시스템은 시스템 구조체가 포자이거나 포자, 항원성 물질 및 부가 물질을 포함한 시스템 모두를 지칭한다.The spore system refers to all of the systems in which the system construct is spores or contains spores, antigenic substances and additional substances.
상기 부가 물질은 백신의 효능을 더 증진시킬 수 있는 물질 모두를 지칭한다. 예를 들어, 알루미늄 겔 입자(알루미늄염), 광유(mineral oil)를 주성분으로 함유하는 오일 어쥬번트, 백편두(white hyacinth bean)로부터 정제된 사포닌과 같은 계면활성제-유사 어쥬번트, 세균 내 독소(LPS 등) 유래의 TH1 유도형 어쥬번트 등 일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.The additional substances refer to all substances that can further enhance the efficacy of the vaccine. For example, aluminum gel particles (aluminum salts), oil adjuvants containing mineral oil as a main component, surfactant-like adjuvants such as saponins purified from white hyacinth beans, bacterial toxins ( LPS, etc.) may be derived from a TH1 inducing adjuvant, but is not limited thereto.
1-2. 항원성 물질1-2. Antigenic substance
본 출원은 항원성 물질을 포함한 백신일 수 있다.The present application may be a vaccine containing an antigenic substance.
본 출원에서 사용되는 용어 "항원(antigen)"은 면역 반응을 일으키는 물질을 지칭한다. 상기 항원은 예를 들어, 병원균, 바이러스, 단백질, 다당류, 인위적으로 합성된 물질, 생체 내에서 변이가 생긴 물질 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 용어 "항원" 또는 "면역원"은 상호교환 가능하게 사용된다.The term "antigen" as used in the present application refers to a substance that causes an immune response. The antigen may include, for example, pathogens, viruses, proteins, polysaccharides, artificially synthesized substances, substances with mutations in vivo, etc., but is not limited thereto. The terms “antigen” or “immunogen” are used interchangeably.
상기 항원성 물질은 방어 면역 반응을 일으키는 모든 물질을 포함하며, 예를 들어 병원체, 에피토프, 폴리펩티드, 단백질, 비단백질 분자 및 이들의 단편 등일 수 있다.The antigenic substance includes all substances that cause a protective immune response, and may be, for example, a pathogen, an epitope, a polypeptide, a protein, a non-protein molecule, and a fragment thereof.
상기 항원성 물질은 야생형(wild type), 변이형(mutant type)일 수 있다. 이 때, 상기 변이는 항원성 물질의 일부 또는/및 전체가 결실, 변형 등의 조작이 이루어진 것으로 자연적인 조작 또는 인위적인 조작을 포함할 수 있다.The antigenic substance may be a wild type or a mutant type. In this case, the mutation may include a natural manipulation or an artificial manipulation, in which some or/and all of the antigenic substance is manipulated such as deletion or modification.
예를 들어, 상기 항원성 물질의 일부를 포함한 백신일 수 있다.For example, it may be a vaccine containing a portion of the antigenic substance.
예를 들어, 상기 항원성 물질의 전체를 포함한 백신일 수 있다.For example, it may be a vaccine including all of the antigenic substances.
병원체(pathogen)는 예를 들어, 바이러스, 세균, 박테리아 등을 포함하는 질병을 일으키는 개체를 지칭한다.Pathogen refers to a disease-causing individual, including, for example, viruses, bacteria, and bacteria.
예를 들어, 병원체 자체를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.For example, it may be a vaccine containing the pathogen itself as an antigenic substance.
예를 들어, 병원체의 일부를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.For example, it may be a vaccine containing a portion of the pathogen as an antigenic substance.
상기 병원체는 특정 부위가 변형 또는 조작된 것일 수 있다. 상기 변형과 조작은 자연적으로 또는 인위적으로 이루어질 수 있다.The pathogen may be a specific site modified or manipulated. The transformation and manipulation can be made naturally or artificially.
상기 병원체는 곤충 대상 질병의 병원체일 수 있다.The pathogen may be a pathogen of an insect target disease.
예를 들어, 곤충은 벌, 잠자리, 나비, 나방 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.For example, the insect may be a bee, a dragonfly, a butterfly, or a moth, but is not limited thereto.
예를 들어, 병원체는 삭브로드 바이러스(Sacbrood Virus; SBV)일 수 있다.For example, the pathogen may be Sacbrood Virus (SBV).
삭브로드 바이러스는 발굽을 가진 동물의 가장 치명적인 바이러스성 질병인 구제역과 같은 피코르나비랄레스(Picornavirales)이며, 이프라비리데 (Iflaviridae), 이프라바이러스(Iflavirus)에 속한다. RNA 바이러스이며, 동양형 (Eastern type), 서양형(Western type), 남아공형 (South african type) 등 3개의 타입이 있다.Saxbrod virus is Picornavirales, which is the most deadly viral disease of hoofed animals, such as foot and mouth disease, and belongs to Iflaviridae and Iflavirus. It is an RNA virus, and there are three types: Eastern type, Western type, and South african type.
상기 삭브로드 바이러스는 구조단백질로서 캡시드 단백질인 VP1(Viral Protein 1), VP2(Viral Protein 2), VP3(Viral Protein 3), VP4(Viral Protein 4) 등이 있으며, 비구조단백질로는 헬리케이즈(helicase), 프로테아즈(protease), RNA 의존성 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase) 등이 있다.The sacbrood virus is a structural protein such as VP1 (Viral Protein 1), VP2 (Viral Protein 2), VP3 (Viral Protein 3), VP4 (Viral Protein 4), etc. ), protease, RNA dependent RNA polymerase, and the like.
상기 병원체는 삭브로드 바이러스의 구조단백질을 포함할 수 있다.The pathogen may include the structural protein of the sacbrod virus.
상기 병원체는 VP1(Viral Protein 1), VP2(Viral Protein 1), VP3(Viral Protein 1) 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.The pathogen may include one or more selected from Viral Protein 1 (VP1), Viral Protein 1 (VP2), and Viral Protein 1 (VP3).
예를 들어 상기 병원체는 도 4에 도시된 VP1 내지 VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.For example, the pathogen may include one or more selected from VP1 to VP3 shown in FIG. 4.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen may include one selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 2개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen may include two selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 VP1, VP3, VP3 중 선택되는 3개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen may include three selected from VP1, VP3, and VP3.
상기 병원체는 VP1, VP2, VP3중 선택되는 1 이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The pathogen may include part or all of one or more sequences selected from VP1, VP2, and VP3.
상기 병원체는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상을 포함할 수 있다.The pathogen is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include one or more selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 1을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. May contain 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 2를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. May contain 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 3을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. May contain 3.
상기 병원체는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The pathogen is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a part or all of one or more sequences selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 1의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 2의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 3의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 3.
상기 병원체는 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.The pathogen is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with at least one selected from among the three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 1의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 2의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 병원체는 SEQ ID NO. 3의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the pathogen is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 3.
에피토프(epitope)는 항원 결정기라고 불리며, 항원을 식별하게 해주는 항원의 특정한 부위를 지칭한다.An epitope is called an antigenic determinant and refers to a specific site on an antigen that allows identification of the antigen.
예를 들어, 에피토프 자체를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.For example, it may be a vaccine containing the epitope itself as an antigenic substance.
예를 들어, 에피토프의 일부를 항원성 물질로 포함한 백신일 수 있다.For example, it may be a vaccine containing a portion of the epitope as an antigenic substance.
상기 에피토프는 특정 부위가 변형 또는 조작된 것일 수 있다. 상기 변형과 조작은 자연적으로 또는 인위적으로 이루어질 수 있다.The epitope may be a specific site modified or manipulated. The transformation and manipulation can be made naturally or artificially.
상기 에피토프는 1 이상의 독소를 포함할 수 있다. 독소는 외독소와 내독소를 포함할 수 있다. The epitope may contain one or more toxins. Toxins can include exotoxins and endotoxins.
상기 독소는 시가톡신(Shiga toxin), 이열성 독소(heat-labile toxin), 클로스트리디움 퍼프린젠스 톡신(Clostridium perfringens toxin), 캄필로박터 제주니 장독소(Campylobacter jejuni enterotoxin), 퍼츄시스 톡신(pertussis toxin), 시가 유사 톡신(shiga-like toxin 또는 verotoxin) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.The toxins are Shiga toxin, heat-labile toxin, Clostridium perfringens toxin, Campylobacter jejuni enterotoxin, and Perchus toxin. pertussis toxin), a shiga-like toxin (or verotoxin), and the like, but are not limited thereto.
상기 항원성 물질은 삭브로드 바이러스의 구조단백질을 포함할 수 있다.The antigenic substance may include a structural protein of the sacbrod virus.
상기 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.The antigenic substance may include one or more selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어 상기 항원성 물질은 도 4에 도시된 VP1 내지 VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.For example, the antigenic substance may include at least one selected from VP1 to VP3 shown in FIG. 4.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance may include one selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 2개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance may include two selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 VP1, VP3, VP3 중 선택되는 3개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance may include three selected from VP1, VP3, and VP3.
상기 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3중 선택되는 1 이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The antigenic substance may include part or all of one or more sequences selected from VP1, VP2, and VP3.
상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상을 포함할 수 있다.The antigenic substance is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include one or more selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. May contain 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. May contain 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. May contain 3.
상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The antigenic substance is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a part or all of one or more sequences selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 3.
상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.The antigenic substance is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with at least one selected from among the three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 3.
상기 에피토프는 2 이상이 서로 예를 들어 단일 결합, 이중 결합 등의 결합 방식에 의해 연결된 다중 에피토프도 포함할 수 있다.The epitope may also include multiple epitopes in which two or more are linked to each other by, for example, a single bond or a double bond.
상기 백신은 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 포함할 수 있다.The vaccine may contain an antigenic substance of bee cystoid rot.
상기 항원성 물질은 삭브로드 바이러스의 구조단백질을 포함할 수 있다.The antigenic substance may include a structural protein of the sacbrod virus.
상기 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.The antigenic substance may include one or more selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어 상기 백신의 항원성 물질은 도 4에 도시된 VP1 내지 VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.For example, the antigenic substance of the vaccine may include one or more selected from VP1 to VP3 shown in FIG. 4.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine may include one selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 2개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine may include two selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 VP1, VP3, VP3 중 선택되는 3개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine may include three selected from VP1, VP3, and VP3.
상기 백신의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3중 선택되는 1 이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The antigenic substance of the vaccine may include part or all of one or more sequences selected from VP1, VP2, and VP3.
상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상을 포함할 수 있다.The antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include one or more selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. May contain 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. May contain 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. May contain 3.
상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a part or all of one or more sequences selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 3.
상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.The antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with at least one selected from among the three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 백신의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the vaccine is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 3.
본 출원은 종래 백신의 한계를 해결 또는 최소화 할 수 있다. 특히, 종래 벌의 낭충봉아부패 백신의 한계를 해결 또는 최소화 할 수 있다.This application can solve or minimize the limitations of conventional vaccines. In particular, it is possible to solve or minimize the limitations of the conventional bee cystic rod decay vaccine.
본 출원은 상기 항원성 물질을 1 이상 포함한 백신으로, 질병을 일으키는 원인체의 변이에 신속하게 대응할 수 있다. 특히, 1 이상의 벌의 낭충봉아부패의 항원성 물질로 포함하고 있어서 벌의 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료에 용이하게 사용할 수 있다.The present application is a vaccine containing one or more antigenic substances, and can quickly respond to mutations in the cause of the disease. In particular, since it contains as an antigenic substance for cystoid rot of one or more bees, it can be easily used for the prevention or/and treatment of cystoid rot of bees.
2. 낭충봉아부패2. Cystoid rot
본 출원은 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료를 표적 하는 백신일 수 있다.The present application may be a vaccine targeting the prevention or/and treatment of cystoid rot.
특히, 본 출원은 벌의 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료를 표적하는 백신일 수 있다.In particular, the present application may be a vaccine targeting the prevention or/and treatment of cystoid rot of bees.
예를 들어, 병원체는 삭브로드 바이러스(Sacbrood Virus; SBV)일 수 있다.For example, the pathogen may be Sacbrood Virus (SBV).
낭충봉아부패병은 꿀벌의 애벌레가 낭충봉아부패병 바이러스에 감염되어 짓무르게 되고 번데기로 변태되지 못하고 부패하게 되는 꿀벌의 바이러스성 전염병이다. 낭충봉아부패병 바이러스는 동양형, 서양형, 남아공형 등 3가지 종류가 있다. 동양형 낭충봉아부패병 바이러스에 의해서는 동양종꿀벌에 발생하고 있는데 우리나라를 비롯한 여러 나라에서 극심한 피해를 주고 있다. Cystoid rot disease is a viral infectious disease of bees in which the larvae of bees are infected with the cystoid rot virus and become crushed, unable to transform into pupae and decay. There are three types of cystoid rot virus: Asian type, Western type, and South African type. Oriental cystoid rot virus occurs in oriental bees, and it is causing extreme damage in many countries including Korea.
특히, 2009년 토종벌에서 공식적으로 국내발생이 확인된 낭충봉아부패병은 토종벌에서 멸종위기에 가까운 피해를 입히고 있으며 감염의심봉군의 밀봉소각처리가 적극적으로 실행되고 있지 않아 최근까지도 본 질병에 대한 피해가 좀처럼 수그러들 기미를 보이지 않고 있다. 의심봉군의 조기신고, 조기방역조치 등의 적극적인 이행과 주변봉장의 예방적 조치 등 농가의 적극적인 협조와 보다 개선된 백신 개발이 시급한 실정이다.In particular, cystoid rot disease, which was officially confirmed to occur in Korea in 2009, is causing damage close to endangered species in native bees, and the sealed incineration treatment of suspicious infectious bees has not been actively carried out. There is no sign of fading. There is an urgent need for active cooperation from farmers and the development of improved vaccines, such as active implementation of early reporting of suspected peaks and early quarantine measures, and preventive measures of surrounding peaks.
상기 벌의 낭충봉아부패와 관련 있는 삭브로드 바이러스 유발인자를 모두 포함하는 것으로 한다.It is assumed to include all sacbrood virus inducing factors related to cystic rod decay of the bee.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 삭브로드 바이러스의 구조단백질을 포함할 수 있다.The bee cystoid rot vaccine may contain a structural protein of sacbrod virus.
삭브로드 바이러스의 구조단백질은 VP1, VP2, VP3 등일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.The structural protein of the sacbrod virus may be VP1, VP2, VP3, etc., but is not limited thereto.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1개를 포함할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may include one selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 2개를 포함할 수 있다.For example, the bee's cystoid decay vaccine of the present application may include two selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신은 VP1, VP3, VP3 중 선택되는 3개를 포함할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may include three selected from VP1, VP3, and VP3.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 VP1, VP2, VP3중 선택되는 1 이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The bee cystoid rot vaccine may include part or all of one or more sequences selected from VP1, VP2, and VP3.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상을 포함할 수 있다.The bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include one or more selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 1을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee's cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. May contain 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 2를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee's cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. May contain 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 3을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee's cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. May contain 3.
벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The bee cystoid rot vaccine is shown in SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a part or all of one or more sequences selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 1의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 2의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 3의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 3.
벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.The bee cystoid rot vaccine is shown in SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with at least one selected from among the three.
예를 들어, 본 출원에서 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 1의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 2의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 벌의 낭충봉아부패 백신은 SEQ ID NO. 3의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the bee cystoid rot vaccine is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 3.
2-1. 낭충봉아부패 백신2-1. Cystoid rot vaccine
낭충봉아부패는 삭브로드 바이러스 (Sacbrood virus)에 의해 발생한다. Cystoid rot is caused by the Sacbrood virus.
낭충봉아부패병 바이러스는 다른 바이러스의 병리발생기전과 마찬가지로 숙주세포에 부착, 핵산합성과 복제, 바이러스 방출 등의 과정을 거치며 숙주에 증상을 나타낸다. 낭충봉아부패병 바이러스는 애벌레의 수용체에 부착한 후, 캡시드내에 있는 RNA가 애벌레 세포의 세포질내로 들어간다. 그런 다음, 낭충봉아부패병 단백질 합성과 RNA 복제가 일어난다. 세포가 용해되면서 새로운 조합의 바이러스가 방출된다. 낭충봉아부패병 바이러스는 애벌레의 장상피세포에 잘 부착하는 것으로 알려져 있고, 장상피세포내에서 증식하면서 수포를 형성하고 그 영향으로 애벌레가 짓무르는 증상을 보이게 된다.Cystoid rot virus shows symptoms in the host through processes such as attachment to host cells, nucleic acid synthesis and replication, and virus release, as with other viruses' pathology. After the cystoid rot virus attaches to the receptor of the larva, the RNA in the capsid enters the cytoplasm of the larval cell. Then, cystoid rot protein synthesis and RNA replication occur. As the cells dissolve, a new combination of viruses is released. The cystoid rot virus is known to adhere well to the intestinal epithelial cells of the larva, and while proliferating in the intestinal epithelial cells, they form blisters, and the effect of the larvae is sore.
일벌, 숫벌 등은 감염되나 증상이 없다. 여왕벌도 특별한 증상을 보이지 않으나, 낭충봉아부패병 바이러스에 감염된 여왕벌이 낳은 알이 낭충봉아부패병 바이러스를 가지고 태어날 수 있다. 감염된 소비는 정상소비에서와 달리 불규칙적인 봉개양상을 보이며 애벌레를 제거하면서 뚜껑이 제거된 소방을 빈번하게 관찰할 수 있다. 감염된 애벌레는 청소벌에 의해 제거되어 밖으로 빼내어 진다. 소문 앞에 감염된 애벌레를 버릴 수도 있으며, 봉군으로부터 몇 백 미터 떨어져서 버려질 수도 있다. 따라서, 빼내어진 애벌레가 발견되면 그 봉군은 낭충봉아부패병 바이러스 항원검사를 위해 시료를 채취하여 실험실로 보내서 검사결과에 따라 낭충봉아부패병 진위여부를 진단받아야 하며, 그러한 임상증상이 보이는 즉시 낭충봉아부패병 감염으로 상정한 방역조치를 취해야 피해를 최소화 할 수 있다. 낭충봉아부패병은 바이러스성 전염병이기 때문에 항생제로 치료되지 않으며, 증상을 보이는 봉군을 즉시 격리함으로써 타 봉군에 전염을 차단하는 것이 긴요하다. 감염이 확산 되면 토종벌의 경우, 애벌레가 거의 다 빼내어지고 일벌들도 봉군을 떠나 급기야 봉군붕괴현상을 보인다.Worker bees and male bees are infected but have no symptoms. The queen bee does not show any special symptoms, but eggs laid by queen bees infected with the cystoid rot virus can be born with the cystoid rot virus. Infected consumption shows irregular sealing patterns unlike normal consumption, and firefighting with the lid removed while removing the larva can be frequently observed. Infected larvae are removed by cleaning bees and taken out. Infected larvae can be discarded in front of rumors, or can be discarded a few hundred meters from the rebels. Therefore, when the larvae are found, the reticulum collects a sample for the virus antigen test and sends it to the laboratory to be diagnosed according to the results of the test for the authenticity of the cystoid rot disease. Damage can be minimized only by taking the quarantine measures assumed. Since cystic rot is a viral infectious disease, it is not treated with antibiotics, and it is imperative to block transmission to other rebels by immediately quarantining the rebels showing symptoms. When the infection spreads, in the case of native bees, almost all of the larvae are removed, and the worker bees also leave the rebel and show a collapse of the rebel.
일벌은 낭충봉아부패병 바이러스에 감염된 애벌레를 빼내는 과정에서 감염된다. 또한, 감염된 일벌의 육아과정에서 애벌레로 바이러스를 전염시킨다. 한편, 감염된 여왕벌은 바이러스를 난계대전염시켜 감염된 알을 낳는다. 한 봉군에 바이러스가 유입되면 봉군내에 있는 수만 마리의 벌들과 애벌레의 빈번한 접촉에 의해 빠른 속도로 바이러스를 전염시킨다. 이상증상을 보이는 애벌레는 일벌에 의해 소방 밖으로 빼내어 지는데, 빼내어진 애벌레는 땡비 등의 야생곤충 뿐 아니라 심지어 일벌의 먹이가 되기도 한다. 이러한 과정에서 감염된 일벌과 야생곤충들은 또하나의 바이러스 전염원으로 작용하여 타 봉군으로 전파하는 역할을 한다. 봉장내 하나의 봉군이 감염되면 감염된 봉군으로부터 유래한 일벌이 다른 봉군을 도봉시에도 바이러스를 전염시킬 수 있다. 꿀벌의 행동반경은 주로 500 m에서 2 km이나, 5 km까지도 활동할 수 있다고 볼 때, 감염된 봉장으로 부터 반경 5 km 이내에 있는 봉장들은 감염이 전파될 위험성이 매우 높다고 볼 수 있다. Worker bees become infected during the process of removing larvae infected with the cystoid rot virus. In addition, the virus is transmitted to the larvae during the raising of infected worker bees. On the other hand, the infected queen bee passes the virus to eggs, and lays infected eggs. When a virus enters a rebel, it transmits the virus at a rapid rate by frequent contact between tens of thousands of bees and larvae in the reef. Caterpillars showing abnormal symptoms are taken out of the fire station by worker bees, and the taken out caterpillars serve as food for not only wild insects such as bullseye, but even worker bees. In this process, infected worker bees and wild insects act as another source of virus transmission and spread to other rebels. If one bee is infected in the bongjang, worker bees derived from the infected bee can transmit the virus even when dominating the other bee. The bee's action radius is mainly from 500 m to 2 km, but considering that it can be active up to 5 km, it can be seen that the risk of spreading infection is very high if the bee is within 5 km of the infected bar.
주변 봉장에 낭충봉아부패병이 발생했을 때, 자기 봉장 및 봉군을 예방하기 위해서는 이산화염소, 티몰제제 등을 경구투여하는 것이 예방적 치료제로 효과를 볼 수 있다. 그러나 임상증상을 보이는 봉군이 있는 봉장에서는 예방적 치료제의 효과를 기대하기는 어렵다.When cystic rod rot occurs in surrounding rods, oral administration of chlorine dioxide, thymol preparations, etc. can be effective as a preventive treatment in order to prevent magnetic seals and seals. However, it is difficult to expect the effect of prophylactic treatment in Bongjang with Bonggun showing clinical symptoms.
양봉장에서 가장 큰 경제적인 피해를 주고 있는 질병인 낭충봉아부패병 을 예방할 수 있는 방법은 위생적인 사양관리, 소독뿐이며 근본적인 예방책이나 치료책이 없으므로 바이러스가 유입되지 않도록 하는 것이 최선으로, 벌의 낭충봉아부패 백신이 필요하다.Hygienic feeding management and disinfection are the only ways to prevent cystic rot, which is the disease causing the greatest economic damage in bee farms.Since there is no fundamental precaution or cure, it is best to prevent virus from entering. I need a vaccine.
상기 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료를 표적 하는 백신은 제조방법에 따라 사백신(killed vaccine), 약독화백신(attenuated vaccine), 성분백신(Component vaccine), DNA 백신 (DNA vaccine), 재조합 백신(recombinant vaccine) 등을 이용한 백신일 수 있으나 백신을 제조할 수 있는 방법이라면 모두 포함하는 것으로 하며, 이에 제한하지는 않는다.Vaccines targeting the prevention or/and treatment of cystoid rot are killed vaccines, attenuated vaccines, component vaccines, DNA vaccines, recombinant vaccines ( Recombinant vaccine) may be used, but any method capable of producing a vaccine is included, but is not limited thereto.
상기 사백신은 바이러스나 세균의 전부 도는 일부를 화학물질이나 열 등을 이용화여 불활화시켜 제조한 백신을 지칭한다.The dead vaccine refers to a vaccine prepared by inactivating all or part of a virus or bacteria using chemical substances or heat.
상기 약독화 백신은 질병을 일으키는 바이러스나 세균의 일부분을 변형시켜 자기 번식 및 면역 유발 능력은 있으나 독성을 일으키는 능력은 제거시켜 제조한 백신을 지칭한다.The attenuated vaccine refers to a vaccine manufactured by modifying a portion of a virus or bacteria causing a disease to have the ability to induce self-reproduction and immunity, but remove the ability to cause toxicity.
상기 성분 백신은 병원체의 대사과정에서 생성되거나 병원체 자체가 가지고 있는 독소(toxin)를 가열하거나 포르말린 등의 약품을 처리하여 제조한 백신을 지칭한다. 성분 백신은 소단위백신(subunit vaccine), 아단위백신, 특이항원 추출백신으로도 지칭될 수 있다.The component vaccine refers to a vaccine produced in the process of metabolism of a pathogen or by heating a toxin possessed by the pathogen itself or by treating a drug such as formalin. Component vaccines may also be referred to as subunit vaccines, subunit vaccines, and specific antigen extraction vaccines.
상기 DNA 백신은 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 사용하여 유전자를 전달하는 방법으로 제조된 백신을 지칭한다. 상기 플라스미드 DNA는 유전자를 발현하기 위한 여러 가지 유전 요소들을 가지고 있어, 세포 내에 들어가면 삽입되어 있는 유전자로부터 항원을 발현하게 하는 것을 의미한다.The DNA vaccine refers to a vaccine prepared by transferring genes using plasmid DNA. The plasmid DNA has various genetic elements for expressing a gene, and when it enters a cell, it means that the antigen is expressed from the inserted gene.
상기 재조합 백신은 병원체에서 항원으로 작용하는 부위만을 유전자조작을 통하여 만들어 제조된 백신을 지칭한다. 이 때, 유전자조작은 재조합기술을 이용하여 항원의 유전자를 다른 세포 내에 도입하여 발현시키는 기술을 지칭한다.The recombinant vaccine refers to a vaccine manufactured by genetic engineering only a site that acts as an antigen in a pathogen. In this case, genetic manipulation refers to a technology that introduces and expresses an antigen gene into another cell using recombinant technology.
상기 재조합 백신을 만들 때 사용되는 재조합기술은 벡터를 이용하는 방법, 비벡터를 이용하는 방법, 유전체 편집을 이용하는 방법 등 유전자조작이 가능한 기술이라면 이에 제한하지 않는다.The recombinant technology used when making the recombinant vaccine is not limited thereto as long as it is a technology capable of genetic manipulation such as a method using a vector, a method using a non-vector, and a method using genome editing.
상기 벡터는 비바이러스 벡터, 바이러스 벡터 등 통상적으로 유전자를 운반할 수 있는 기능을 가진 기능을 가진 모두를 포함할 수 있다.The vector may include all of a non-viral vector, a viral vector, and the like, which have a function capable of carrying a gene.
상기 바이러스 벡터의 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.The virus of the viral vector may be a DNA virus or an RNA virus.
상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(ds DAN)바이러스 또는 단일가닥 DNA(ss DNA)바이러스 일 수 있다.The DNA virus may be a double-stranded DNA (ds DAN) virus or a single-stranded DNA (ss DNA) virus.
상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.The viral vector may be an adenovirus vector, a retrovirus vector, a lentiviral vector, an adeno-associated virus (AAV) vector, a vaccinia virus vector, a poxvirus vector, a herpes simplex virus, etc., but is not limited thereto.
바이러스 벡터는 유전자전달 효율이 높으나 병원성이 있는 바이러스이므로 안전성의 문제 및 벡터 내 삽입 가능한 유전자의 크기에도 제한적일 수 있다.Viral vectors have high gene transfer efficiency, but because they are pathogenic viruses, safety issues and the size of genes that can be inserted into vectors may be limited.
상기 비바이러스 벡터는 플라스미드(Plasmid), 네이키드 DNA(naked DNA), 리포좀(Liposome) 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.The non-viral vector may be a plasmid, naked DNA, liposome, or the like, but is not limited thereto.
비바이러스 벡터는 인체 세포 내 바이러스 유전물질의 유입이 되지 않으며 생산의 용이성, 벡터 내 삽입 유전자의 크기 무제한성 및 숙주에 대한 면역 반응이 낮음에 따른 낮은 부작용 등이 장점이 될 수도 있으나, 바이러스 벡터에 비해 세포 내 도입 효율이 현저하게 낮은 단점이 발생할 수 있다.Non-viral vectors do not introduce viral genetic material into human cells, and their ease of production, unlimited size of the inserted gene in the vector, and low side effects due to low immune response to the host may be advantageous. Compared to this, there may be a disadvantage in that the efficiency of introduction into cells is significantly lower.
상기 비벡터는 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법, 일시적인 세포의 압축 또는 스퀴징, 지질-매개 형질감염, 나노입자, 실리카 등의 방법을 포함할 수 있으나 벡터를 사용하지 않는 방법이라면 이에 제한하지 않는다.The non-vector may include methods such as electroporation, gene gun, ultrasonic perforation, self-injection, temporary cell compression or squeezing, lipid-mediated transfection, nanoparticles, silica, etc. If so, it is not limited thereto.
상기 유전체 편집을 이용하는 방법은 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(transcription activator-like effector nucleases), CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated sequences)의 등을 포함할 수 있으나, 특정 DNA부위를 자르는데 사용하는 인공 효소를 이용하여 유전자의 표적 부위를 편집할 수 있는 기술이라면 이에 제한하지 않는다.The method of using the genome editing may include ZFN (Zinc-finger nucleases), TALEN (transcription activator-like effector nucleases), CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated sequences), etc. If it is a technology capable of editing a target site of a gene using an artificial enzyme used to cut a DNA site, it is not limited thereto.
상기 ZFN는 특정 DNA 염기서열을 인식하여 결합할 수 있는 Zinc finger protein과 DNA를 절단할 수 있는 FokI restriction endonuclease 도멘인으로 구성되어 있는 유전체 편집 기술을 지칭한다.The ZFN refers to a genome editing technology composed of a Zinc finger protein capable of recognizing and binding a specific DNA sequence and a FokI restriction endonuclease domain capable of cleaving DNA.
상기 TALEN은 DNA binding domain과 FokI nuclease domain으로 구성되어 있는 유전체 편집 기술을 지칭한다.The TALEN refers to a genome editing technology composed of a DNA binding domain and a FokI nuclease domain.
상기 CRISPR/Cas는 RGEN(RNA-guided endonuclease)로도 불리며, 상기 ZFN 및 TALEN과는 다르게 RNA에 의해 DNA 염기서열 특이성이 유도되는 유전체 편집 기술을 지칭한다.The CRISPR/Cas is also called RGEN (RNA-guided endonuclease), and refers to a genome editing technique in which DNA sequence specificity is induced by RNA, unlike ZFN and TALEN.
본 출원에서 개시되는 백신은 CRISPR/Cas를 이용하여 만든 벌의 낭충봉아부패 백신 일 수 있다.The vaccine disclosed in the present application may be a bee cystoid rot vaccine made using CRISPR/Cas.
특히, 본 출원에서 개시되는 백신은 spCas9을 이용하여 만든 벌의 낭충봉아부패 백신일 수 있다.In particular, the vaccine disclosed in the present application may be a bee cystoid rot vaccine made using spCas9.
CRISPR/Cas는 주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조의 반복(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats: CRISPR)과, 연관된 서열(cas)과의 조합된 것을 지칭한다.CRISPR/Cas refers to a combination of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and associated sequences (cas) distributed at periodic intervals.
상기 CRISPR/Cas 시스템은 가이드 RNA 및 Cas 단백질로 구성되어 있다.The CRISPR/Cas system consists of a guide RNA and a Cas protein.
상기 가이드 RNA는 표적 서열을 인식할 수 있는 RNA를 의미하며, Cas 단백질과 결합하여 Cas 단백질을 표적 서열로 안내할 수 있는 기능을 가진 것을 지칭한다.The guide RNA refers to an RNA capable of recognizing a target sequence, and refers to a function capable of guiding a Cas protein to a target sequence by binding to a Cas protein.
상기 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA) 또는/및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함할 수 있다. 상기 crRNA와 상기 tracrRNA의 특정 부위가 융합된 형태를 sgRNA(sinlge-chain guide RNA)로 지칭할 수 있다.The guide RNA may include crRNA (CRISPR RNA) or/and tracrRNA (trans-activating crRNA). The form in which the crRNA and the specific site of the tracrRNA are fused may be referred to as sgRNA (sinlge-chain guide RNA).
상기 Cas 단백질은 표적 서열 또는 유전자를 절단할 수 있는 기능을 수행하는 단백질을 지칭하며, 상기 Cas 단백질은 효소를 포함할 수 있으며 상기 효소는 뉴클레아제, 프로테아제, 제한효소 등을 포함할 수 있으나 이에 제한하지는 않는다.The Cas protein refers to a protein that performs a function of cleaving a target sequence or gene, and the Cas protein may include an enzyme, and the enzyme may include a nuclease, a protease, a restriction enzyme, etc. It is not limited.
상기 유전자가위 단백질은 자연 상태에 존재하는 또는 존재하지 않는 인위적으로 생성된 효소 또는 단백질의 형태 또는 그것들의 일부가 변형된 형태를 포함할 수 있다.The gene-scissor protein may include an artificially generated enzyme or protein that exists or does not exist in a natural state, or a form in which a part of them is modified.
상기 효소는 CRISPR 효소일 수 있다.The enzyme may be a CRISPR enzyme.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR-Cas 시스템을 구성하는 단백질로서, 가이드핵산과 결합하여 복합체를 형성하여 표적 서열을 절단 또는 위치를 변형시키는 기능을 수행할 수 있다.The CRISPR enzyme is a protein constituting the CRISPR-Cas system, and may perform a function of cleaving or modifying a target sequence by binding to a guide nucleic acid to form a complex.
상기 CRISPR 효소는 효소의 활성을 변경시켜 불완전 또는 부분 활성을 가지도록 변형한 형태를 포함할 수 있다.The CRISPR enzyme may include a form modified to have incomplete or partial activity by altering the activity of the enzyme.
상기 CRISPR 효소는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1 등의 자연상태로 존재하는 것 또는 인위적으로 변형된 형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.The CRISPR enzymes are Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csn1 and Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2 , Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csf3, Csf2, Csf4 , Cpf1, etc. may be present in a natural state or may include an artificially modified form, but is not limited thereto.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 시스템의 종류에 따라 크게 6가지의 Type으로 나눌 수 있다. Type I은 Cas1, Cas2, Cas3, Cas8 등으로 구성될 수 있고; Type II는 Cas1, Cas2, Cas2/Cas4, Cas9 등으로 구성될 수 있고; Type III는 Cas5, Cas6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cas5/Cmr1, Cam2, Cmr5 등으로 구성될 수 있고; Type IV는 Csf1, Csf2, Csf3 등으로 구성될 수 있고; Type V는 Cas1, Cas2, Cas1, Cas2, Cas4, Cpf1, Cpf2 등으로 구성될 수 있고; Type VI는 C2C2, Cas1, Cas2 등으로 구성될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.The CRISPR enzyme can be largely divided into 6 types according to the type of CRISPR system. Type I may be composed of Cas1, Cas2, Cas3, Cas8, and the like; Type II may be composed of Cas1, Cas2, Cas2/Cas4, Cas9, and the like; Type III may be composed of Cas5, Cas6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cas5/Cmr1, Cam2, Cmr5, and the like; Type IV may be composed of Csf1, Csf2, Csf3, and the like; Type V may be composed of Cas1, Cas2, Cas1, Cas2, Cas4, Cpf1, Cpf2, and the like; Type VI may be composed of C2C2, Cas1, Cas2, etc., but is not limited thereto.
상기 CRISPR 효소의 Type 중 Type II의 Cas9과 Type V의 Cpf1이 일반적으로 가장 많이 사용된다.Among the types of the CRISPR enzyme, Type II Cas9 and Type V Cpf1 are generally used most.
본 출원의 CRISPR/Cas 시스템에서 CRISPR 효소는 Cas9을 사용할 수 있다.In the CRISPR/Cas system of the present application, Cas9 may be used as the CRISPR enzyme.
상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas spp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece spp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus spp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc spp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira spp.), 링비아속(Lyngbya spp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria spp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.The Cas9 is Streptococcus pyogenes , Streptococcus thermophilus , Streptococcus spp., Staphylococcus aureus , Nocardiopsis dassonville ( Nocardiopsis dassonville ) , Streptomyces pristinaespiralis , Streptomyces viridochromogenes , Streptomyces viridochromogenes , Streptomyces viridochromogenes , Streptosporangium roseum , Streptosporangium roseum , AlicyclobacHlus acidocaldarius , Bacillus pseudomycoides , Bacillus selenitireducense , Bacillus selenitireducens Exiguobacterium sibiricum , Lactobacillus delbrueckii , Lactobacillus salivarius , Microscilla marina , Burkholderiales bacterium , Burkholderiales bacterium Lenny Boran's (Polaromonas naphthalenivorans), Pseudomonas genus (Polaromonas spp.), Black COSPA Era watts soniyi (Crocosphaera watsonii), cyano tese in (Cyanothece spp.), micro-hour seutiseu Ah labor (Microcystis aeruginosa) rugi in a polar , Cinecocoker Synechococcus spp., Acetohalobium arabaticum , Ammonifex degensii , Caldiceluloforsiruptor bescii , Candidatus desulforudis , Candidatus desulforudis Clostridium botulinum , Clostridium difficile , Finegoldia magna , Natranaerobius thermophilus , Pelotomaculum , Pelotomaculum thermopropionicum ), Acidithiobacillus caldus , Acidithiobacillus ferrooxidans , Allochromatium vinosum , Marinobacter sp., Nitrophilus halo Scotland (Nitrosococcus halophilus), nitroso Caucus watt Sony (Nitrosococcus watsoni), pseudo Alteromonas halo flan large teeth (Pseudoalteromonas haloplanktis), keute also Novak Hotel racemic Pere (Ktedonobacter racemifer), to be meta furnace Away Avenue Frosty the Tomb ( Methanohalobium evestigatum ), Anabaena variabilis , Nodularia spumigena , Nostoc spp., Arthrospira maxima , Arthrospira maxima , Arthrospira platen Cis ( Arthrospira platensis ), Arthrospira spp., Lyngbya spp., Microcoleus chthonoplastes , Oscillatoria spp., Petrotoga mobilis , Thermosipho africanus or Acaryochloris marina , etc. It may be a microbial-derived Cas9.
또한, 상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.In addition, the Cpf1 is Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacterium, Listtriceria, Paludidium, Francisaceae, Lepidella, Paludidium, Francis, , Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium or Cpf1 derived from Acidaminococcus.
상기 CRISPR 효소는 가이드핵산과 상호작용하여 복합체를 형성하여 표적 핵산 또는 유전자의 표적 서열을 절단 또는 위치를 변형시키는 기능을 수행할 수 있다. 이 때, 그 기능은 상기 CRISPR 효소가 직접적으로 인지하는 PAM(protospacer adjacent motif)을 포함해야 한다. 즉, 상기 PAM의 염기서열은 CRISPR 효소의 종에 따라 달라진다. 예를 들어, 일반적으로 많이 사용되는, Streptococcus pyogenes 에서 유래된 Cas9 단백질의 경우 5'-NGG-3'가 PAM 염기서열이 된다. 예를 들어, Staphylococcus aureus 에서 유래된 Cas9 단백질은 5'-NNGRRT-3'를 PMA 염기서열로 가진다. 결과적으로 상기 표적 핵산 또는 유전자의 표적 서열을 절단 또는 위치의 변형을 수행할 때, CRISPR 효소의 종의 선택에 따라 필수적으로 PAM의 염기서열이 바뀌며, 그것들에 의해 표적 서열을 절단 또는 위치의 변형이 결정된다. The CRISPR enzyme may interact with a guide nucleic acid to form a complex, thereby performing a function of cleaving or modifying a target sequence of a target nucleic acid or gene. In this case, the function should include a protospacer adjacent motif (PAM) that is directly recognized by the CRISPR enzyme. That is, the base sequence of the PAM varies depending on the species of CRISPR enzyme. For example, in the case of the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes , which is commonly used, 5'-NGG-3' becomes the PAM sequence. For example, the Cas9 protein derived from Staphylococcus aureus has 5'-NNGRRT-3' as the PMA sequence. As a result, when the target sequence of the target nucleic acid or gene is cut or modified, the base sequence of PAM is essentially changed according to the selection of the species of the CRISPR enzyme, thereby cutting the target sequence or modifying the position. Is determined.
본 출원의 CRISPR/Cas 시스템은 대상(target)을 조작하는데 사용될 수 있다.The CRISPR/Cas system of the present application can be used to manipulate a target.
상기 조작은 넉아웃(Knock-out), 넉인(Knock-in), 넉다운(Knock-down) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.The manipulation may be any one or more selected from knock-out, knock-in, and knock-down.
예를 들어, 상기 조작은 넉인일 수 있다.For example, the manipulation may be knock-in.
예를 들어, 상기 조작은 넉아웃일 수 있다.For example, the manipulation may be a knockout.
상기 대상은 표적 핵산 또는 유전자를 포함하는 유기체일 수 있다.The subject may be an organism containing a target nucleic acid or gene.
상기 유기체는 세포, 조직, 식물, 동물 또는 인간일 수 있다.The organism may be a cell, tissue, plant, animal or human.
예를 들어, 상기 유기체는 포유류일 수 있다.For example, the organism can be a mammal.
예를 들어, 상기 포유류는 벌일 수 있다.For example, the mammal may be a bee.
상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.The cells may be prokaryotic cells or eukaryotic cells.
따라서, 본 출원에 의해 개시되는 벌의 낭충봉아부패의 예방 또는/및 치료를 표적 하는 백신 조성물 및 제조방법은 기존의 벌의 낭충봉아부패 백신에 비해 효과가 월등히 뛰어날 수 있으며, 벌의 낭충봉아부패 원인체의 변이에도 신속하게 대응할 수 있을 것으로 기대된다.Therefore, the vaccine composition and manufacturing method targeting the prevention or/and treatment of cystic rod decay of bees disclosed by the present application can be significantly superior to the existing bee cystic rod rot vaccine, and can be It is expected that it will be able to respond quickly to the mutation of the causative agent.
3. 낭충봉아부패 백신 조성물3. Cystoid rot vaccine composition
전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 낭충봉아부패 백신 조성물이 제공된다.In order to solve the problems of the present application described above, according to an aspect of the present application, there is provided a cystic rod rot vaccine composition.
특히, 본 출원의 일 양태에 의하면, 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물이 제공된다.In particular, according to an aspect of the present application, there is provided a vaccine composition for cystoid rot of bees.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 i) 박테리아 유래 포자; 이 때, 상기 박테리아 유래 포자는 지노믹 DNA에 항원성 물질을 코딩하는 서열을 가지고 있는 포자이며, ii) 상기 박테리아 포자의 표면에 존재하는 포자 코트 단백질 및 iii) 상기 포자 코트 단백질에 연결된 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 포함할 수 있다.The bee cystic rod decay vaccine composition comprises i) spores derived from bacteria; At this time, the bacterial spores are spores having a sequence encoding an antigenic substance in genomic DNA, ii) a spore coat protein present on the surface of the bacterial spore, and iii) a bee cyst linked to the spore coat protein It may contain a bud rot antigenic substance.
본 출원에 의해 개시되는 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 병원 원인체의 변이에 신속하게 대응할 수 있다.The bee cystoid rot vaccine composition disclosed by the present application can quickly respond to mutations in pathogens.
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 박테리아 포자는 B. subtilis, B. anthrasis, B. thuringiensis, B. cereus 중 선택되는 포자일 수 있다.Bacterial spores of the bee cystocarp decay vaccine composition of the present application may be spores selected from B. subtilis, B. anthrasis, B. thuringiensis, and B. cereus .
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 박테리아 포자는 B. subtilis의 포자일 수 있다.For example, the bacterial spore of the bee cystoid decay vaccine composition of the present application may be a spore of B. subtilis .
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 포자 코트 단백질은 CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CotH, CotJA, CotJC, CotK, CotL, CotM 중 선택되는 포자 코트 단백질일 수 있다.The spore coat protein of the bee's cystic rod decay vaccine composition of the present application is CotA, CotB, CotC, CotD, CotE, CotF, CotG, CotN, CotS, CotT, CotV, CotW, CotX, CotY, CotZ, CotH, CotJA, CotJC , CotK, CotL, may be a spore coat protein selected from CotM.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 포자 코트 단백질은 CotB, CotC, CotG 중 선택되는 포자 코트 단백질일 수 있다.For example, the spore coat protein of the bee's cystoid decay vaccine composition of the present application may be a spore coat protein selected from CotB, CotC, and CotG.
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 삭브로드 바이러스를 포함할 수 있다.The antigenic material of the bee cystic rod decay vaccine composition of the present application may include sacbrod virus.
예를 들어, 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 삭브로드 바이러스의 구조단백질을 포함할 수 있다.For example, the antigenic material of the bee cystoid rot vaccine composition may include a structural protein of sacbrod virus.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.The antigenic substance of the bee cystic rod decay vaccine composition may include at least one selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 도 4에 도시된 VP1 내지 VP3 중 선택되는 1 이상을 포함할 수 있다.For example, the antigenic substance of the bee cystic rod decay vaccine composition may include at least one selected from VP1 to VP3 shown in FIG. 4.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition may include one selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 2개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition may include two selected from VP1, VP2, and VP3.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 VP1, VP3, VP3 중 선택되는 3개를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition may include three selected from VP1, VP3, and VP3.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 VP1, VP2, VP3중 선택되는 1 이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The antigenic substance of the bee cystic rod decay vaccine composition may include part or all of one or more sequences selected from VP1, VP2, and VP3.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상을 포함할 수 있다.The antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include one or more selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. May contain 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. May contain 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. May contain 3.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.The antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a part or all of one or more sequences selected from among three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3의 서열 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. It may include some or all of the sequence of 3.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1 내지 SEQ ID NO. 3 중 선택되는 1이상과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.The antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with at least one selected from among the three.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 1의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 1.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 2의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 2.
예를 들어, 본 출원에서 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물의 항원성 물질은 SEQ ID NO. 3의 서열과 상동성이 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%인 서열을 포함할 수 있다.For example, in the present application, the antigenic substance of the bee cystoid rot vaccine composition is SEQ ID NO. It may include a sequence of 70, 75, 80, 85, 90, 95 or 100% homology with the sequence of 3.
상기 조성물에서 항원성 물질의 농도는 약1010 내지 1020개/ml 정도의 농도일 수 있다.The concentration of the antigenic substance in the composition may be about 10 10 to 10 20 /ml.
예를 들어, 본 출원의 벌 낭충봉아부패 백신 조성물에서 항원성 물질의 농도는 약1010 내지 1015개/ml 정도의 농도일 수 있다.For example, the concentration of the antigenic substance in the bee cystic rod decay vaccine composition of the present application may be about 10 10 to 10 15 /ml.
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자, 1개의 포자 코트 단백질 및 1 개의 항원성 물질을 포함할 수 있다.The bee's cystic rod decay vaccine composition of the present application may include bacterial spores, one spore coat protein, and one antigenic substance.
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자, 1개의 포자 코트 단백질 및 2 이상의 항원성 물질을 포함할 수 있다.The bee's cystic rod decay vaccine composition of the present application may include bacterial spores, one spore coat protein, and two or more antigenic substances.
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자, 2 이상의 포자 코트 단백질 및 1개의 항원성 물질을 포함할 수 있다.The bee's cystic rod decay vaccine composition of the present application may include bacterial spores, two or more spore coat proteins, and one antigenic substance.
본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자, 2 이상의 포자 코트 단백질 및 2 이상의 항원성 물질을 포함할 수 있다.The bee's cystic rod decay vaccine composition of the present application may include bacterial spores, two or more spore coat proteins, and two or more antigenic substances.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자; CotB, CotC, CotG 중 선택되는 1이상의 포자 코드 단백질; 삭브로드 바이러스의 구조단백질 중 선택되는 1이상의 항원성 물질;을 포함할 수 있다.For example, the vaccine composition of the bee cystoid rot of the present application includes bacterial spores; At least one spore coding protein selected from CotB, CotC, and CotG; It may contain at least one antigenic substance selected from structural proteins of the sacbrood virus.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자; CotB, CotC, CotG 중 선택되는 1이상의 포자 코드 단백질; VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1이상의 항원성 물질;을 포함할 수 있다.For example, the vaccine composition of the bee cystoid rot of the present application includes bacterial spores; At least one spore coding protein selected from CotB, CotC, and CotG; At least one antigenic substance selected from VP1, VP2, and VP3; may include.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자; CotB, CotC, CotG 중 선택되는 1이상의 포자 코드 단백질; SEQ ID NO. 1 내지 3 중 선택되는 1이상의 항원성 물질;을 포함할 수 있다.For example, the vaccine composition of the bee cystoid rot of the present application includes bacterial spores; At least one spore coding protein selected from CotB, CotC, and CotG; SEQ ID NO. One or more antigenic substances selected from 1 to 3; may include.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 포자 코트 단백질 및 항원성 물질을 연결하는 링커(linker)를 더 포함할 수 있다.The bee cystic rod decay vaccine composition may further include a linker connecting the spore coat protein and the antigenic substance.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자; CotB, CotC, CotG 중 선택되는 1이상의 포자 코드 단백질; 삭브로드 바이러스의 구조단백질 중 선택되는 1이상의 항원성 물질; 링커를 포함할 수 있다.For example, the vaccine composition of the bee cystoid rot of the present application includes bacterial spores; At least one spore coding protein selected from CotB, CotC, and CotG; At least one antigenic substance selected from structural proteins of sacbrood virus; It may include a linker.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자; CotB, CotC, CotG 중 선택되는 1이상의 포자 코드 단백질; VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1이상의 항원성 물질; 링커를 포함할 수 있다.For example, the vaccine composition of the bee cystoid rot of the present application includes bacterial spores; At least one spore coding protein selected from CotB, CotC, and CotG; At least one antigenic substance selected from VP1, VP2, and VP3; It may include a linker.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 박테리아 포자; CotB, CotC, CotG 중 선택되는 1이상의 포자 코드 단백질; SEQ ID NO. 1 내지 3 중 선택되는 1이상의 항원성 물질; 링커를 포함할 수 있다.For example, the vaccine composition of the bee cystoid rot of the present application includes bacterial spores; At least one spore coding protein selected from CotB, CotC, and CotG; SEQ ID NO. At least one antigenic substance selected from 1 to 3; It may include a linker.
상기 링커는 효소, 절단효소, 폴리펩타이드, 단백질, 염기서열, 인위적인 화학적 결합을 형성하고 있는 인공 염기서열 등일 수 있으나 상기 포자 코트 단백질 및 항원성 물질을 연결할 수 있는 기능을 가진 것이라면, 이에 한정하지 않는다. The linker may be an enzyme, a cleavage enzyme, a polypeptide, a protein, a nucleotide sequence, or an artificial nucleotide sequence that forms an artificial chemical bond, but is not limited thereto as long as it has a function capable of linking the spore coat protein and an antigenic substance. .
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부 (subviral) 입자 보조제, 클로스트리디움 퍼프링겐스 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제2보조제를 추가로 포함할 수 있다.The bee's cystic rod decay vaccine composition includes stabilizers, emulsifiers, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, pH adjusters, surfactants, liposomes, iscom adjuvants, synthetic glycopeptides, extenders, carboxypolymethylene, bacterial cell walls, and bacterial cell walls. Derivatives, bacterial vaccines, animal poxvirus proteins, subviral particle adjuvants, Clostridium perfringens toxin, N, N-dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)-propane Diamine, monophosphoryl lipid A, dimethyldioctadecyl-ammonium bromide, and any one or more second adjuvants selected from the group consisting of a mixture thereof may be further included.
또한, 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 의학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 산화방지제, 용해보조제, 항원 보강제, 안정제, 보존제, 항균제, 항진균제, 흡착 지연제 등의 첨가제를 추가로 더 포함할 수 있다. In addition, the bee's cystic rod decay vaccine composition includes medically acceptable carriers, diluents, binders, disintegrants, lubricants, pH adjusters, antioxidants, solubilizers, adjuvants, stabilizers, preservatives, antibacterial agents, antifungal agents, adsorption delaying agents, etc. It may further include an additive of.
상기 담체는 세포 또는 조직내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO)를 사용할 수 있다.The carrier is defined as a compound that facilitates the addition of the compound into cells or tissues. For example, dimethyl sulfoxide (DMSO) can be used.
상기 희석제(버퍼 용액)는, 예를 들어, 슈가, 전분, 미결정셀룰로오스, 유당(유당수화물), 포도당, 디-만니톨, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜, 무수인산수소칼슘, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있으며; 결합제는 전분, 미결정셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 디-만니톨, 자당, 유당수화물, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 폴리비닐피롤리돈 공중합체(코포비돈), 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 천연검, 합성검, 코포비돈, 젤라틴, 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있다. The diluent (buffer solution) is, for example, sugar, starch, microcrystalline cellulose, lactose (lactose hydrate), glucose, di-mannitol, alginate, alkaline earth metal salt, clay, polyethylene glycol, anhydrous calcium hydrogen phosphate, or Mixtures thereof and the like can be used; Binders are starch, microcrystalline cellulose, highly dispersible silica, mannitol, di-mannitol, sucrose, lactose hydrate, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone (povidone), polyvinylpyrrolidone copolymer (copovidone), hypromellose , Hydroxypropyl cellulose, natural gum, synthetic gum, copovidone, gelatin, or a mixture thereof.
상기 붕해제는 예를 들어, 전분글리콘산나트륨, 옥수수전분, 감자전분 또는 전호화전분 등의 전분 또는 변성전분; 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 또는 비검(veegum) 등의 클레이; 미결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류; 알긴산나트륨 또는 알긴산 등의 알긴류; 크로스카멜로스(croscarmellose)나트륨 등의 가교 셀룰로오스류; 구아검, 잔탄검 등의 검류; 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone) 등의 가교 중합체; 중탄산나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.The disintegrant is, for example, starch or modified starch such as sodium starch glycolate, corn starch, potato starch or pregelatinized starch; Clay such as bentonite, montmorillonite, or veegum; Celluloses such as microcrystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, or carboxymethyl cellulose; Algins such as sodium alginate or alginic acid; Cross-linked celluloses such as croscarmellose sodium; Gums such as guar gum and xanthan gum; Crosslinked polymers such as crosslinked polyvinylpyrrolidone (crospovidone); Effervescent agents, such as sodium bicarbonate and citric acid, or mixtures thereof may be used.
상기 윤활제는 예를 들어, 탈크, 스테아린산, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 나트륨스테아릴푸마레이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노레이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.The lubricants are, for example, talc, stearic acid, magnesium stearate, calcium stearate, sodium lauryl sulfate, hydrogenated vegetable oil, sodium benzoate, sodium stearyl fumarate, glyceryl behenate, glyceryl monorate, glyceryl monostea Rate, glyceryl palmitostearate, colloidal silicon dioxide, or mixtures thereof.
상기 pH 조절제는 예를 들어, 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산)과 같은 산성화제와 침강 탄산 칼슘, 암모니아수, 메글루민, 탄산 나트륨, 산화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 구연산 나트륨, 삼염기칼슘인산염과 같은 염기성화제 등을 사용할 수 있다.The pH adjusting agent, for example, acidifying agents such as acetic acid, adipic acid, ascorbic acid, sodium ascorbate, sodium etherate, malic acid, succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, citric acid (citric acid), precipitated calcium carbonate, aqueous ammonia, A basifying agent such as meglumine, sodium carbonate, magnesium oxide, magnesium carbonate, sodium citrate, tribasic calcium phosphate, and the like can be used.
상기 산화방지제는 예를 들어, 디부틸 히드록시 톨루엔, 부틸레이티드 히드록시아니솔, 초산 토코페롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨 등을 사용할 수 있다. The antioxidant may be, for example, dibutyl hydroxy toluene, butylated hydroxyanisole, tocopherol acetate, tocopherol, propyl gallate, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrosulfite, or the like.
상기 용해보조제는 예를 들어, 라우릴황산나트륨, 폴리소르베이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테류, 도큐세이트 나트륨, 폴록사머(poloxamer) 등을 사용할 수 있다. The solubility aid may be, for example, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as sodium lauryl sulfate and polysorbate, sodium docusate, poloxamer, and the like.
또한, 지연방출성 제제를 만들기 위해 장용성 고분자, 수불용성 중합체, 소수성 화합물, 및 친수성 고분자를 포함할 수 있다. In addition, an enteric polymer, a water-insoluble polymer, a hydrophobic compound, and a hydrophilic polymer may be included to make a delayed-release preparation.
상기 장용성 고분자는 예를 들어, 히프로멜로오스아세테이트숙시네이트, 히프로멜로오스프탈레이트(히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 히드록시메틸에틸셀룰로오스프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 셀룰로오스아세테이트말레이트, 셀룰로오스벤조에이트프탈레이트, 셀룰로오스프로피오네이트프탈레이트, 메틸셀룰로오스프탈레이트, 카르복시메틸에틸셀룰로오스, 에틸히드록시에틸셀룰로오스프탈레이트 및 메틸히드록시에틸셀룰로오스과 같은 장용성 셀룰로오스 유도체; 스티렌-아크릴산 룰로오스, 아크릴산메틸-아크릴산 룰로오스, 아크릴산메틸메타크릴산 룰로오스(예컨대, 아크릴-이즈), 아크릴산부틸-스티렌-아크릴산 룰로오스, 및 아크릴산메틸-메타크릴산-아크릴산옥틸룰로오스와 같은 상기 장용성 아크릴산계 룰로오스; 폴리(메타크릴산 메틸 메타크릴레이트) 룰로오스(예컨대, 유드라짓 L, 유드라짓 S, 에보셀독일트, 카르 (메타크릴산 에틸아크릴레이트) 룰로오스 (예컨대, 유드라짓 L100-55)와 같은 장용성 카르메타크릴레이트 룰로오스; 아세트산비닐-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 스티렌-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 스티렌-말레인산모노에스테를 룰로오스, 비닐메틸에테르-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 에틸렌-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 비닐부틸에테르-말레인산틸셀룰물 룰로오스, 아크릴로니트릴-크릴산메틸ㆍ말레인산틸셀룰물 룰로오스, 및 아크릴산부틸-스티렌-말레인산틸셀룰물 룰로오스와 같은 장용성 말레인산계 룰로오스; 및 로니트릴알콜프탈레이트, 로니트릴아세탈프탈레이트, 폴리비닐부틸레이트프탈레이트 및 폴리비닐아세트아세탈프탈레이트와 같은 장용성 폴리비닐 유도체가 있다. The enteric polymer is, for example, hypromellose acetate succinate, hypromellose phthalate (hydroxypropylmethylcellulose phthalate), hydroxymethylethyl cellulose phthalate, cellulose acetate phthalate, cellulose acetate succinate, cellulose acetate malate. , Cellulose benzoate phthalate, cellulose propionate phthalate, methyl cellulose phthalate, carboxymethyl ethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose phthalate, and enteric cellulose derivatives such as methyl hydroxyethyl cellulose; Styrene-acrylate ulose, acrylate methyl-acrylate ulose, acrylate methyl methacrylate (e.g., acrylic-ise), butyl acrylate-styrene-acrylate ulose, and methyl acrylate-methacrylic acid-acrylate octyulose The enteric acrylic acid-based ulose, such as; Poly(methyl methacrylate methacrylate) ulose (e.g. Eudragit L, Eudragit S, Evoselgermant, Carr (ethyl methacrylate) ulose (e.g. Eudragit L100-55) ), such as enteric carmethacrylate ulose; vinyl acetate-maleateyl cellulose cellulose, styrene-maleate cellulose cellulose, styrene-maleic acid monoester ulose, vinyl methyl ether-maleate cellulose cellulose, Enteric properties such as ethylene-maleate cellulose cellulose, vinyl butyl ether-maleate cellulose cellulose, acrylonitrile-methyl acrylate, maleate cellulose cellulose, and butyl acrylate-styrene-maleate cellulose cellulose And enteric polyvinyl derivatives such as ronitrile alcohol phthalate, ronitrile acetal phthalate, polyvinyl butyrate phthalate and polyvinyl acetacetal phthalate.
상기 수불용성 중합체는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용 가능한 물에 용해되지 않는 고분자를 말한다. 예를 들어, 수불용성 중합체는 폴리비닐아세테이트(예컨대, 콜리코트 SR30D), 수불용성 폴리메타크릴레이트 공중합체[예컨대, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 NE30D, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트-트리메틸아미노에틸메타크릴레이트)공중합체(예컨대, 유드라짓RSPO)등], 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아실레이트, 셀룰로오스 디아실레이트, 셀룰로오스 트리아실레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트 및 셀룰로오스 트리아세테이트 등이 있다. The water-insoluble polymer refers to a pharmaceutically acceptable water-insoluble polymer that controls drug release. For example, the water-insoluble polymer is polyvinyl acetate (e.g., colicoat SR30D), a water-insoluble polymethacrylate copolymer (e.g., poly(ethylacrylate-methyl methacrylate) copolymer (e.g. Eudragit NE30D) , Poly(ethylacrylate-methyl methacrylate-trimethylaminoethylmethacrylate) copolymer (eg Eudragit RSPO), etc.], ethylcellulose, cellulose ester, cellulose ether, cellulose acylate, cellulose diacylate, Cellulose triacylate, cellulose acetate, cellulose diacetate, and cellulose triacetate.
상기 소수성 화합물은 예를 들어, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 글리세릴 비헤네이트, 세틸 팔미테이트, 글리세릴 모노 올레이트 및 스레아린산과 같은 지방산 및 지방산 에스테르류; 세토스테아릴 알코올, 세틸알코올 및 스테아릴알코올과 같은 지방산 알코올류; 카르나우바왁스, 밀납, 및 미결정왁스와 같은 왁스류; 탈크, 침강탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 산화아연, 산화티탄, 카올린, 벤토나이트, 몬모릴로나이트 및 비검과 같은 무기질 물질 등이 있다. The hydrophobic compounds include, for example, fatty acids and fatty acid esters such as glyceryl palmitostearate, glyceryl stearate, glyceryl bihenate, cetyl palmitate, glyceryl monooleate and srearic acid; Fatty acid alcohols such as cetostearyl alcohol, cetyl alcohol and stearyl alcohol; Waxes such as carnauba wax, beeswax, and microcrystalline wax; And inorganic substances such as talc, precipitated calcium carbonate, calcium monohydrogen phosphate, zinc oxide, titanium oxide, kaolin, bentonite, montmorillonite and veggies.
상기 친수성 고분자는 예를 들어, 덱스트린, 폴리덱스트린, 덱스트란, 펙틴 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 폴리갈락투론산, 자일란, 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 전분, 히드록시프로필스타치, 아밀로오스, 및 아밀로펙틴와 같은 당류; 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 구아검, 로커스트 콩 검, 트라가칸타, 카라기난, 아카시아검, 아라비아검, 젤란검, 및 잔탄검과 같은 검류; 젤라틴, 카제인, 및 제인과 같은 단백질; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트와 같은 폴리비닐유도체; 폴리(부틸 메타크릴레이트-(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트-메틸메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓E100, 에보닉, 독일), 폴리(에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이드-트리에틸아미노에틸- 메타크릴레이트 클로라이드) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 RL, RS, 에보닉, 독일)와 같은 친수성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리에틸렌 유도체; 카보머 등이 있다. The hydrophilic polymer is, for example, dextrin, polydextrin, dextran, pectin and pectin derivatives, alginate, polygalacturonic acid, xylan, arabinoxylan, arabinogalactan, starch, hydroxypropyl starch, amylose, And sugars such as amylopectin; Cellulose derivatives such as hypromellose, hydroxypropylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, methylcellulose, and sodium carboxymethylcellulose; Gums such as guar gum, locust bean gum, tragacanta, carrageenan, acacia gum, gum arabic, gellan gum, and xanthan gum; Proteins such as gelatin, casein, and zein; Polyvinyl derivatives such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, and polyvinyl acetaldiethylaminoacetate; Poly(butyl methacrylate-(2-dimethylaminoethyl)methacrylate-methylmethacrylate) copolymer (e.g. Eudragit E100, Evonik, Germany), poly(ethyl acrylate-methyl methacrylate- Hydrophilic polymethacrylate copolymers such as triethylaminoethyl-methacrylate chloride) copolymers (eg Eudragit RL, RS, Evonik, Germany); Polyethylene glycol, and polyethylene derivatives such as polyethylene oxide; Carbomer, etc.
이외에도 착색제, 향료 중에서 선택된 다양한 첨가제로서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 선택 사용하여 본 출원의 제제를 제제화할 수 있다. In addition, the formulation of the present application may be formulated by using pharmaceutically acceptable additives as various additives selected from colorants and fragrances.
본 출원에서 첨가제의 범위가 상기 첨가제를 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니며, 상기한 첨가제를 선택에 의하여 통상 범위의 용량을 함유하여 제제화할 수 있다.In the present application, the range of the additive is not limited to the use of the additive, and the additive may be formulated to contain a dosage in the usual range by selection.
또한, 상기 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calciumcarbonate), 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the bee's cystic rod decay vaccine composition may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. have. In the case of formulation, it can be prepared using diluents or excipients such as generally used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose in the lecithin-like emulsifier. , Gelatin, etc. can be mixed to prepare. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used. As liquid preparations for oral administration, suspensions, solvents, emulsions, syrups, etc. can be used. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, preservatives, etc. Can be included. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous agents, suspensions, emulsions, and freeze-dried formulations. As the non-aqueous preparation and suspension, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used, but are not limited thereto.
경구용 제형의 경우, 방출 위치는 위, 소장(십이지장, 공장(jejunum), 회장(ileum)) 또는 대장일 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 예컨대 장용 코팅을 사용함으로써 위에서는 용해되지 않지만 그 물질을 장내의 십이지장 또는 다른 곳에 방출하는 제형을 이용할 수 있다. 장용 코팅으로 사용되는 보다 일반적인 불활성 성분의 예는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 유드라짓(Eudragit) L30D, 아쿠아테릭(Aquateric), 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 유드라짓 L, 유드라짓 S 및 쉘락(Shellac)이다. 이들 코팅은 혼합된 필름으로 사용될 수 있다.For oral dosage forms, the location of release may be the stomach, small intestine (duodenum, jejunum, ileum) or large intestine. One of ordinary skill in the art can use formulations that do not dissolve in the stomach, but release the substance to the duodenum or elsewhere in the intestine, for example by using an enteric coating. Examples of more common inert ingredients used as enteric coatings include cellulose acetate trimellitate (CAT), hydroxypropylmethylcellulose phthalate (HPMCP),
또한, 코팅 또는 코팅의 혼합물은 위에 대한 보호를 목적으로 하지 않는 정제 위에 사용될 수 있다. 이것은 당 코팅 또는 상기 정제를 삼키기 쉽게 만드는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조된 치료제(즉, 분말)의 운반용으로 경질의 쉘(hard shell)(예컨대, 젤라틴)로 이루어질 수 있거나, 액체 형태의 경우 연질 젤라틴 쉘이 사용될 수 있다. 캡슐의 쉘 물질은 두꺼운 전분 또는 다른 식용 종이일 수 있다. 알약, 로젠지, 성형된 정제 또는 정제 연마물의 경우, 습기 매싱 기술(moist massing technique)이 사용될 수 있다. 캡슐 투여용 물질의 제형은 또한 분말, 가볍게 압착된 플러그 또는 심지어 정제의 형태일 수 있다. 상기 치료제는 압착에 의해 제조될 수 있다.In addition, coatings or mixtures of coatings can be used on tablets that are not intended for protection against the stomach. This may include a sugar coating or a coating that makes the tablet easier to swallow. The capsule may be made of a hard shell (eg, gelatin) for transporting the dried therapeutic agent (ie, powder), or a soft gelatin shell may be used in the case of a liquid form. The shell material of the capsule can be thick starch or other edible paper. For tablets, lozenges, molded tablets or polished tablets, a moisture massing technique can be used. The formulation of substances for capsule administration may also be in the form of powders, lightly compressed plugs or even tablets. The therapeutic agent can be prepared by compression.
4. 낭충봉아부패 백신 제조방법4. Method for manufacturing cystic rod decay vaccine
전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 낭충봉아부패 백신 제조방법이 제공된다.In order to solve the problems of the present application described above, according to an aspect of the present application, there is provided a method for manufacturing a cystic rod decay vaccine.
특히, 본 출원의 일 양태에 의하면, 벌의 낭충봉아부패 백신 제조방법이 제공된다.In particular, according to an aspect of the present application, there is provided a method for producing a bee cystic rod decay vaccine.
예를 들어 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신 제조 방법은, i) 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 CRISPR/Cas9을 이용하여 항원성 물질을 넉인(Knock-in) 시키는 단계; ii) 상기 박테리아의 포자를 형성시키는 단계; 및 iii) 상기 박테리아의 포자 표면에 항원성 물질을 발현시키는 단계;를 포함할 수 있다.For example, the method of manufacturing a bee's cystoid spoilage vaccine of the present application includes: i) knock-in of an antigenic substance using CRISPR/Cas9 in the bacterial genomic DNA; ii) forming spores of the bacteria; And iii) expressing an antigenic substance on the spore surface of the bacteria.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신 제조 방법은 박테리아의 지노믹 DNA에 도너(donor)로서 외래물질을 삽입시키는 단계를 포함할 수 있다. The method of manufacturing the bee cystic rod decay vaccine may include the step of inserting a foreign material as a donor into the bacterial genomic DNA.
상기 "도너(donor)"는 특정 펩타이드 또는 단백질을 발현시킬 수 있는, exogenous nucleotide를 의미하며, 예를 들어, HDR 메커니즘을 이용하여 지노믹 DNA 내로 삽입될 수 있다. 이때, 도너는 특정 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 특정 핵산을 포함할 수 있다. The "donor" refers to an exogenous nucleotide capable of expressing a specific peptide or protein, and may be inserted into genomic DNA using, for example, an HDR mechanism. In this case, the donor may include a specific nucleic acid encoding a specific peptide or protein.
상기 도너는 이중가닥 핵산 또는 단일가닥 핵산일 수 있다.The donor may be a double-stranded nucleic acid or a single-stranded nucleic acid.
상기 도너는 선형 또는 원형일 수 있다.The donor may be linear or circular.
상기 도너는 표적 유전자 또는 핵산에 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다.The donor may include a nucleic acid sequence having homology to a target gene or nucleic acid.
상기 도너는 항원성 물질을 코딩하는 핵산일 수 있다.The donor may be a nucleic acid encoding an antigenic substance.
예를 들어, 상기 도너는 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 코딩하는 핵산일 수 있다. 일 예로 낭충봉아부패 바이러스를 코딩하는 핵산일 수 있다.For example, the donor may be a nucleic acid encoding an antigenic substance for cystoid rot of a bee. For example, it may be a nucleic acid encoding a cystoid rot virus.
예를 들어, 본 출원의 상기 도너는 삭브로드 바이러스의 구조단백질 중 선택되는 1 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열일 수 있다.For example, the donor of the present application may be one or more proteins selected from structural proteins of Sachbrod virus or a nucleic acid sequence encoding the same.
예를 들어, 본 출원의 상기 도너는 VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열일 수 있다.For example, the donor of the present application may be one or more proteins selected from VP1, VP2, and VP3 or a nucleic acid sequence encoding the same.
예를 들어, 본 출원의 상기 도너는 SEQ ID NO. 1을 포함할 수 있다.For example, the donor of the present application is SEQ ID NO. May contain 1.
예를 들어, 본 출원의 상기 도너는 SEQ ID NO. 2를 포함할 수 있다.For example, the donor of the present application is SEQ ID NO. May contain 2.
예를 들어, 본 출원의 상기 도너는 SEQ ID NO. 3을 포함할 수 있다.For example, the donor of the present application is SEQ ID NO. May contain 3.
상기 도너는 박테리아의 지노믹 DNA 서열 중 특정 영역과 상동성을 가지는 핵산서열(예를 들어, 상동성 암;arm)과 결합된 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질일 수 있다. The donor may be an antigenic substance of a bee cystoid rot of a bee bound to a nucleic acid sequence (eg, an arm of homology) having homology to a specific region of the bacterial genomic DNA sequence.
본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신을 제조방법은 일 구체예서, CRISPR/Cas9을 이용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 변형을 가할 수 있다. The method for preparing the bee cystoid spoilage vaccine of the present application may be modified by using CRISPR/Cas9 to modify the bacterial genomic DNA.
상기 CRISPR/Cas9을 이용하는 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)에 변형은 넉인(Knock-in), 넉아웃(Knock-out), 넉다운(Knock-Downn) 중 선택되는 1 이상일 수 있다.The modification to the bacterial genomic DNA using the CRISPR/Cas9 may be one or more selected from knock-in, knock-out, and knock-down.
예를 들어, CRISPR/Cas9을 사용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 영역을 타겟하여 외래성 항원성 물질을 넉인시킬 수 있다.For example, CRISPR/Cas9 can be used to target specific regions of bacterial genomic DNA to knock-in foreign antigenic substances.
예를 들어 CRISPR/Cas9을 사용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 유전자를 넉아웃시킬 수 있다.For example, CRISPR/Cas9 can be used to knock out specific genes of bacterial genomic DNA.
예를 들어 CRISPR/Cas9을 사용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 유전자를 넉다운시킬 수 있다.For example, CRISPR/Cas9 can be used to knock down specific genes in bacterial genomic DNA.
이하, CRISPR/Cas9을 이용하여 박테리아의 지노믹 DNA(genomic DNA)의 특정 영역을 타겟팅하여 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 코딩하는 핵산을 삽입(넉인)하는 과정을 중심으로 설명한다.Hereinafter, a description will be made focusing on the process of inserting (knock-in) a nucleic acid encoding an antigenic substance for cystoid rot of a bee by targeting a specific region of the bacterial genomic DNA using CRISPR/Cas9.
이를 위해, 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 넉인 하기 위해서, 박테리아의 지노믹 DNA 내 표적 부위 서열 또는 표적 유전자의 염기서열을 결정한다. 이 때, 상기 표적 서열은 CRISPR 효소, 즉 Cas9 또는 Cpf1이 인식할 수 있는 PAM 서열에 근접한 위치에 위치한 염기서열일 수 있다. 상기 표적 서열은 가이드 RNA와 상보성을 가지거나 동일할 수 있다.To this end, in order to knock-in the antigenic substance of the bee cystoid rot, the target site sequence in the bacterial genomic DNA or the nucleotide sequence of the target gene is determined. In this case, the target sequence may be a CRISPR enzyme, that is, a base sequence located at a position close to a PAM sequence that can be recognized by Cas9 or Cpf1. The target sequence may have complementarity to or identical to the guide RNA.
예를 들어, 공지의 데이터베이스(예를 들어, NCBI)를 이용하여 표적 염기서열 데이터를 수집하고, 상기 염기서열 중 CRISPR/Cas9이 인식하는 부위인 PAM서열(예를 들어, 5'-NGG-3')을 고려한 가이드 RNA를 설계할 수 있다.For example, the target sequence data is collected using a known database (eg, NCBI), and the PAM sequence (eg, 5′-NGG-3), which is a site recognized by CRISPR/Cas9, is Guide RNA can be designed considering').
CRISPR/Cas9의 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 속(Streptococcus spp.) 유래를 사용할 수 있다. 예를 들어, Streptococcus pyogenes Cas9(spCas9)을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 이 때, 상기 PAM 서열은 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)일 수 있다.The Cas9 protein of CRISPR/Cas9 can be used from Streptococcus spp. For example, Streptococcus pyogenes Cas9 (spCas9) may be used, but is not limited thereto. In this case, the PAM sequence may be 5'-NGG-3' (N is A, T, G, or C).
CRISPR/Cas9을 이용하여 표적 유전자 또는 핵산이 절단될 수 있다. 상기 절단된 표적 핵산 부위는 NHEJ 또는 HDR 메커니즘을 통해 박테리아의 지노믹 DNA 상에 변형을 포함할 수 있다. Target genes or nucleic acids can be cleaved using CRISPR/Cas9. The cleaved target nucleic acid site may include modifications on the bacterial genomic DNA through NHEJ or HDR mechanisms.
본 출원에서 일 구체예로서 사용하는 CRISPR/Cas9는 원핵생물 유래 시스템이기 때문에, 박테리아의 지노믹 DNA의 변형에 높은 효율을 가지는 장점이 있다.Since CRISPR/Cas9 used as a specific example in the present application is a prokaryotic-derived system, it has the advantage of having high efficiency in modifying the genomic DNA of bacteria.
특히, 진핵세포와 비교하여, 박테리아 내에서 HDR 메커니즘이 보다 잘 작동하여, 매우 높은 효율로 박테리아의 지노믹 DNA 상에 특정 핵산을 삽입시킬 수 있다.In particular, compared to eukaryotic cells, the HDR mechanism works better in bacteria, allowing the insertion of specific nucleic acids onto the bacterial genomic DNA with very high efficiency.
박테리아의 지노믹 DNA에 항원성 물질이 삽입되면(형질전환 되면), 이는 박테리아 지노믹 DNA의 자체 발현 시스템을 이용하기 때문에, 계속해서 상기 항원성 물질이 발현될 수 있어, 백신의 제조 시마다 형질전환을 수행해야 하는 과정을 생략할 수 있는 장점이 있다.When an antigenic substance is inserted into the bacterial genomic DNA (transformation), it uses the bacterial genomic DNA's own expression system, so that the antigenic substance can be continuously expressed, so that it is transformed every time a vaccine is prepared. There is an advantage of being able to omit the process that needs to be performed.
임의의 실시예로 벌의 낭충봉아부패 바이러스의 항원성 물질 중 선택되는 1 이상의 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 높은 효율로 바실러스 내 지노믹 DNA 상에 삽입시켰다.In an arbitrary example, at least one bee cystic rod rot antigenic substance selected from among the antigenic substances of the bee cystic rod rot virus was inserted onto the genomic DNA in Bacillus with high efficiency.
임의의 실시예로, 삭브로드 바이러스의 구조단백질 중 선택되는 1 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열인 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 높은 효율로 바실러스 내 지노믹 DNA상에 삽입시켰다.In an arbitrary example, at least one protein selected from structural proteins of Sachbrod virus, or a bee cystic rot antigenic substance, which is a nucleic acid sequence encoding the same, was inserted onto genomic DNA in Bacillus with high efficiency.
임의의 실시예로, VP1, VP2, VP3 중 선택되는 1 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열인 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 높은 효율로 바실러스 내 지노믹 DNA상에 삽입시켰다.In an arbitrary example, at least one protein selected from VP1, VP2, and VP3, or a bee cystic rot antigenic substance, which is a nucleic acid sequence encoding the same, was inserted onto genomic DNA in Bacillus with high efficiency.
임의의 실시예로 SEQ ID NO. 1 내지 3에서 선택되는 1이상의 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 높은 효율로 바실러스 내 지노믹 DNA상에 삽입시켰다.In any embodiment, SEQ ID NO. One or more bees selected from 1 to 3 were inserted onto genomic DNA in Bacillus with high efficiency.
한편, 상기 CRISPR/Cas9을 이용하여 넉인 시키는 방법 이외에도 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(transcription activator-like effector nucleases)을 이용하는 방법 등 넉인이 가능한 기술이라면 이에 제한하지 않는다.On the other hand, in addition to the method of knock-in using CRISPR/Cas9, any technology capable of knock-in such as a method of using ZFN (Zinc-finger nucleases) and TALEN (transcription activator-like effector nucleases) is not limited thereto.
상기 넉인을 할 때 벡터를 이용할 수 있다.A vector can be used when performing the knock-in.
박테리아에 가이드 RNA, Cas9 및 항원성 물질을 이용하여 넉인 시키기 위해 벡터를 제조하여 형질전환 할 수 있다. CRISPR/Cas9 벡터와 항원성 물질 벡터는 하나의 벡터에 Cas9, 가이드 RNA 및 항원성 물질을 포함할 수도 있고, Cas9, 가이드 RNA 및 항원성 물질을 서로 동일한 또는 상이한 벡터에 각각 독립적으로 포함할 수도 있다.A vector can be prepared and transformed to knock-in bacteria using guide RNA, Cas9 and antigenic substances. The CRISPR/Cas9 vector and the antigenic substance vector may contain Cas9, a guide RNA and an antigenic substance in one vector, or may independently contain Cas9, a guide RNA and an antigenic substance in the same or different vector. .
상기 벡터는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터일 수 있다.The vector may be a viral vector or a non-viral vector.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 등의 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.The viral vector may be a viral vector such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus (AAV), vaccinia virus, poxvirus, etc., but is not limited thereto.
상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 네이키드 DNA 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.The nonviral vector may be a plasmid or naked DNA, but is not limited thereto.
또한, 벡터를 이용하는 방법 이외에도, 전기천공법, 유전자총, 자기주입법, 초음파천공법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.In addition, in addition to the method using the vector, an electroporation method, a gene gun, a magnetic injection method, an ultrasonic method, etc. may be used, but the present invention is not limited thereto.
박테리아의 지노믹 DNA에 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 코딩하는 도너를 삽입한 후, 포자 디스플레이(spore display) 시스템을 이용하기 위하여 상기 박테리아로부터 포자를 형성시키는 단계를 수행한다.After inserting a donor encoding the antigenic substance of bee cystoid decay into the bacterial genomic DNA, a step of forming spores from the bacteria is performed to use a spore display system.
상기 ii) 상기 박테리아의 포자를 형성시키는 단계는 영양분이 고갈된 영양학적 조건, 고온 또는 저온의 온도적 조건, 고수분 또는 저수분의 수분적 조건, 살균제, 보존제 등의 화학적 조건, 산성 또는 알칼리성의 pH적 조건 등을 이용하여 포자를 형성시킬 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.The step of ii) forming spores of the bacteria may include nutrient-depleted nutritional conditions, high or low temperature temperature conditions, high or low moisture moisture conditions, chemical conditions such as disinfectants and preservatives, acidic or alkaline Spores may be formed using pH conditions, etc., but are not limited thereto.
예를 들어, 본 출원의 벌의 낭충봉아부패 백신을 제조할 때 박테리아의 포자를 형성시키는 단계는 영양분이 고갈된 영양학적 조건, 고온 또는 저온의 온도적 조건 중 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어 질 수 있다.For example, the step of forming spores of bacteria when preparing the bee's cystic rod decay vaccine of the present application may consist of any one or more selected from nutrient depleted nutritional conditions, high temperature or low temperature temperature conditions. have.
다음으로, 상기 형성된 박테리아의 포자에서, 포자 표면에 항원성 물질을 발현시키는 단계를 수행한다(상기 iii) 단계).Next, in the spores of the formed bacteria, a step of expressing an antigenic substance on the spore surface is performed (step iii).
상기 항원성 물질은 박테리아의 포자 표면에 발현된 포자 코트 단백질과 a) 직접적으로 연결되어 발현되거나 또는 b)간접적으로 연결되어 발현될 수 있다. The antigenic substance may be expressed by a) direct linkage with the spore coat protein expressed on the spore surface of bacteria, or b) indirectly linking to the expression.
상기 a) 직접 발현은 박테리아의 포자 표면에 존재하는 포자 코트 단백질과 항원성 물질이 매개물질(예를 들어, 링커)없이 직접적으로 연결되어 있는 형태를 의미한다.The a) direct expression refers to a form in which a spore coat protein present on the spore surface of a bacteria and an antigenic substance are directly linked without a mediator (eg, a linker).
상기 b) 간접 발현은 박테리아의 포자 표면에 존재하는 포자 코트 단백질과 항원성 물질 사이를 연결시켜주는 링커(linker)에 의해 간접적으로 연결되어 있는 형태를 의미한다. The b) indirect expression refers to a form in which the spore coat protein present on the spore surface of bacteria is indirectly linked by a linker that connects the antigenic substance.
본 출원의 일 구체예서, 포자 코트 단백질과 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 링커로 연결하여 발현시킬 수 있다.In one embodiment of the present application, the spore coat protein and the antigenic substance of the bee cystoid rot can be connected to each other with a linker.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신을 제조하는 방법은 큐어링(curing)단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다.The method of manufacturing the bee cystic rod decay vaccine may optionally further include a curing step.
상기 큐어링 단계는 벌의 낭충봉아부패 백신의 조성에서 목적하는 물질만 수득하거나 원하지 않는 물질을 제거하는 것일 수 있다.The curing step may be to obtain only a target substance or remove an unwanted substance from the composition of the bee cystoid rot vaccine.
예를 들어, 큐어링 단계는 항생제 내성 유발 물질을 제거하는 것일 수 있다.For example, the curing step may be to remove a substance causing antibiotic resistance.
예를 들어, 큐어링 단계는, 백신 제조과정에서 첨가된 외래 플라스미드를 제거하는 것일 수 있다.For example, the curing step may be to remove the foreign plasmid added during the vaccine manufacturing process.
상기 큐어링 단계는 2회 이상의 계대 배양으로 수행될 수 있으나, 통상의 큐어링 방법이라면 이에 제한하지는 않는다.The curing step may be performed in two or more passages, but is not limited thereto if it is a conventional curing method.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신을 제조하는 방법은 부가적인 물질을 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.The method of preparing the bee cystic rod decay vaccine may further include the step of adding an additional substance.
이 때, 부가적인 물질은 백신 제조시, 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 첨가제라면 모두 포함하는 것으로 한다.In this case, the additional substances are to include all additives that are usually pharmaceutically acceptable during vaccine production.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 근육내(intramuscular), 비강내(intranasal), 경구(oral), 복강내(intraperitoneal), 피하(subcutaneous), 국소(topical), 피내(intradermal)와 경피(transdermal) 전달용으로 조제된다.The bee's cystic rod decay vaccine is intramuscular, intranasal, oral, intraperitoneal, subcutaneous, topical, intradermal, and transdermal. Prepared for delivery.
백신의 투여 경로는 근육내, 비강내, 경구, 복강내, 피하, 국소, 피내 그리고 경피 전달에서 선택된다.The route of administration of the vaccine is selected from intramuscular, intranasal, oral, intraperitoneal, subcutaneous, topical, intradermal and transdermal delivery.
5. 낭충봉아부패 치료방법5. How to treat cystoid rot
전술한 본 출원의 과제를 해결하기 위하여, 본 출원의 일 양태에 의하면, 낭충봉아부패 치료방법이 제공된다.In order to solve the problems of the present application described above, according to an aspect of the present application, a method for treating cystic rod rot is provided.
특히, 본 출원의 일 양태에 의하면, 벌의 낭충봉아부패 치료방법이 제공된다.In particular, according to an aspect of the present application, there is provided a method for treating cystoid rot of a bee.
상기 벌의 낭충봉아부패 치료방법은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하여 벌의 낭충봉아부패를 치료하는 방법이 제공된다.The method of treating cystic rod rot of a bee is provided with a method of treating cystic rod rot of a bee by administering a composition containing the composition as an active ingredient.
본 출원에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 포유류에 본 출원의 약학조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 출원의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 포유류는 벌, 소, 양, 염소 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.In the present application, the term "administration" means introducing the pharmaceutical composition of the present application to a mammal by any suitable method, and the route of administration of the pharmaceutical composition of the present application is administered through any general route as long as it can reach the target tissue. Can be. Oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, endothelial administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration, intrathecal administration, but not limited thereto. In addition, the mammal may include bees, cattle, sheep, goats, etc., but is not limited thereto.
또한, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 방법은 다음의 예시와 같이 투여될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. In addition, a method of administering a composition containing the composition as an active ingredient may be administered as the following example, but is not limited thereto.
예를 들어 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물 투여시, 벌에 대한 투여용량은 벌의 나이, 무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병 정도에 따라 달라질 수 있으며, 수의사 또는 농장주의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.For example, when administering a composition containing the composition as an active ingredient, the dose to be administered may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the bee. It may be administered in divided doses from once to several times a day at time intervals.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신의 투여량은 동물 당 유도체 1 ㎍ 내지 100 ㎍이 바람직한데, 이 투여량은 동물의 크기에 따라 부분적으로 달라질 수 있다. 예를 들어, 벌의 경우, 매우 적합한 투여량은 20 ㎍ 내지 80 ㎍이다. 예를 들어, 벌의 경우, 매우 적합한 투여량은 10 ㎍ 내지 100 ㎍이다.The dose of the bee cystoid rot vaccine is preferably 1 µg to 100 µg of derivative per animal, and this dose may vary depending on the size of the animal. For bees, for example, a very suitable dosage is between 20 μg and 80 μg. For bees, for example, a very suitable dosage is between 10 μg and 100 μg.
상기 벌의 낭충봉아부패 백신의 투여 방법은 근육내(intramuscular) 투여, 비강내(intranasal) 투여, 경구(oral) 투여, 복강내(intraperitoneal) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 국소(topical) 투여, 피내(intradermal) 투여, 경피(transdermal) 투여 등의 방법으로 투여될 수 있으나, 통상적인 투여 방법이라면 사용할 수 있다.The method of administering the bee cystoid rot vaccine is intramuscular, intranasal, oral, intraperitoneal, subcutaneous, topical, It may be administered by intradermal (intradermal) administration, transdermal (transdermal) administration, or the like, but any conventional administration method may be used.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 근육내 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystic rod decay vaccine of the present application may use an intramuscular administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 비강내 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may use an intranasal administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 경구 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may use an oral administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 복강내 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may use an intraperitoneal administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 피하 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may use a subcutaneous administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 국소 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystic rod decay vaccine of the present application may use a topical administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 피내 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystoid rot vaccine of the present application may use an intradermal administration method.
예를 들어, 본 출원의 상기 벌의 낭충봉아부패 백신은 경피 투여 방법을 사용할 수 있다.For example, the bee's cystic rod decay vaccine of the present application may use a transdermal administration method.
본 출원에 의해 개시되는 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 벌의 낭충봉아부패 백신 조성물이 포유류에 투여될 때 농도가 1mg/kg 내지 100mg/kg으로 투여될 수 있다.When the bee cystoid rot vaccine composition comprising the composition disclosed by the present application as an active ingredient is administered to a mammal, the concentration may be administered at a concentration of 1 mg/kg to 100 mg/kg.
본 출원은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포유류에 투여하여 벌의 낭충봉아부패를 치료하는 방법을 제공할 수 있다.The present application may provide a method of treating cystoid rot of a bee by administering a composition comprising the composition as an active ingredient to a mammal.
예를 들어, 본 출원은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 벌에 투여하여 벌의 낭충봉아부패를 치료하는 방법을 제공할 수 있다.For example, the present application may provide a method of treating cystoid rot of a bee by administering a composition containing the composition as an active ingredient to a bee.
예를 들어, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 벌에 1mg/kg 내지 100mg/kg 투여하면 벌의 낭충봉아부패를 치료하는 방법을 제공할 수 있다.For example, if a composition containing the composition as an active ingredient is administered to a bee from 1 mg/kg to 100 mg/kg, it is possible to provide a method of treating cystoid rot of a bee.
따라서, 본 출원에 의해 개시되는 조성물로 벌의 낭충봉아부패를 치료하면 병원 원인체의 변이가 일어나더라도 신속하게 대응할 수 있을 뿐만 아니라 기존 벌의 낭충봉아부패 백신 보다 효과가 더 좋을 수도 있다.Therefore, if the composition disclosed by the present application is used to treat the bee's cystoid rot, even if the pathogen is mutated, not only can it respond quickly, but it may be more effective than the existing bee's cystoid rot vaccine.
[출원의 실시를 위한 형태][Forms for enforcement of application]
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present application will be described in more detail through examples.
본 출원의 하기 일 실시예는 벌의 낭충봉아부패 백신을 위한 항원, 항체 및 백신 제조에 관한 것이나, 이들 실시예는 오로지 본 출원을 예시하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.The following examples of the present application relate to the preparation of antigens, antibodies, and vaccines for a bee cystoid rot vaccine, but these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present application is not limited by these examples. It will be apparent to those of ordinary skill in the art to which this application belongs.
실시예 1 : 바실러스 실험종과 벡터제작Example 1: Bacillus experimental species and vector production
i)바실러스 실험종i) Bacillus test species
실험에 사용한 바실러스 종은 Bacillus subtilis 168로 Bacillus Genetic Stock Center에서 분양받아 Luria-Bertani (LB) broth와 LB 평판배지를 이용하여 37°C에서 배양하였다. 분양받은 cell stock은 LB 고체배지에서 1차 스크리닝(18hs)을 수행하였고, 1개의 colony를 확보하여 2차 액체 배양(18hs)을 수행하였다.Bacillus species used in the experiment was Bacillus subtilis 168, which was pre-sold at the Bacillus Genetic Stock Center and cultured at 37°C using Luria-Bertani (LB) broth and LB plate medium. The pre-sold cell stock was first screened (18hs) in LB solid medium, and a second liquid culture (18hs) was performed by securing one colony.
ii)ii) B. subtilisB. subtilis 포자 형성 Spore formation
B. subtilis를 sporulation salt (1 M CaCl2 1ml/L, 0.1 M MnCl2 1 ml/L, 0.01 M FeSO4 1 ml/L)가 포함된 NB 배지 (nutrient broth 8 g/L, MgSO4 - 0.25 g/L, KCl - 1 g/L)를 사용하여 37℃ 에서 진탕 배양 (48 h) 후 8,000 rpm 15 min 원심분리, harvest를 수행하였다. A B. subtilis sporulation salt (1 M CaCl 2 1ml / L, 0.1
Cold water (D.W.)를 이용해 60% 농축하여 재현탁하고 4℃ overnight (18 h) 반응시켜 주었다. 그 후 80℃에서 30분 heat inactivation을 수행한다. 8,000 rpm 15 min 원심분리, harvest 후 1 X PBS로 재현탁 후 생성된 포자를 4℃ 보관하여 사용하였다.It was concentrated and resuspended at 60% using cold water (D.W.) and reacted at 4° C. overnight (18 h). After that, heat inactivation is performed at 80°C for 30 minutes. After centrifugation at 8,000 rpm 15 min, resuspended in 1 X PBS after harvesting, the resulting spores were stored and used at 4°C.
iii)벡터 제작iii) Vector production
(a) pHCas9 발현 벡터 (도 1)(a) pHCas9 expression vector (Fig. 1)
B. subtilis 내 S. pyogenes Cas9(SpCas9) 단백질 발현을 위한 pHCas9 벡터로 pHCas9 발현벡터는 한국생명공학연구원에서 분양받아 사용하였다. As a pHCas9 vector for the expression of S. pyogenes Cas9 (SpCas9) protein in B. subtilis , the pHCas9 expression vector was distributed and used by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
(b) 항원결정기 벡터(b) epitope vector
B. subtilis coat protein (CotG)의 가이드 RNA 그리고 promoter를 포함하는 CotG CDS와 항원결정기를 포함하는 유전자복합체인 공여체 DNA를 포함하는 벡터를 제작하였다.A vector containing the guide RNA of B. subtilis coat protein (CotG), the CotG CDS containing the promoter, and the donor DNA, which is a gene complex containing the epitope, was constructed.
B. subtilis 유전체에서 가이드RNA 제작 프로그램 CCTOP (https://crispr.cos.uni-heidelberg.de)를 이용하여 CotG 영역의 가이드 RNA (SEQ ID NO. 4 : TACGTTCATCCTTAACATATTTTTAAAAGGA)를 제작하였고, 제한효소 NcoI 과 EcoRV를 이용하여 pHY300PLK 벡터에 도입하였고 pJB라 명명했다(도 2). Using the guide RNA production program CCTOP (https://crispr.cos.uni-heidelberg.de) in the B. subtilis genome, a guide RNA (SEQ ID NO. 4: TACGTTCATCCTTAACATATTTTTAAAAGGA) of the CotG region was prepared, and restriction enzyme Nco I And EcoR V were introduced into the pHY300PLK vector and named pJB (Fig. 2).
이 때, 항원결정기로 GFP, VP1(SEQ ID NO. 1), VP2(SEQ ID NO. 2), VP3(SEQ ID NO. 3)를 각각 포함하는 벡터를 제작하였다.At this time, a vector including GFP, VP1 (SEQ ID NO. 1), VP2 (SEQ ID NO. 2), and VP3 (SEQ ID NO. 3) were constructed as epitopes.
● pJB-GFP (도 3)● pJB-GFP (Figure 3)
B. subtilis 포자 표면에 목적한 항원결정기가 위치하는지 확인하기 위해 녹색형광단백질 (eGFP)이 삽입된 발현벡터를 제작하였다. GFP 유전자는 MDH1-PGK-GFP_2.0 벡터에서 primer를 제작(표 1의 SEQ ID NO. 5, 6)하여 PCR을 통해 증폭하였고, 5'말단에 제한효소 PstI를, 3'말단에 BamHI을 제작하였다. 증폭된 GFP DNA는 제한효소 PstI과 BamHI을 이용하여 pJB015 벡터에서 VP1 부위를 제거하고 도입하여 pJB-GFP를 제작하였다. In order to check whether the target epitope is located on the surface of B. subtilis spores, an expression vector containing a green fluorescent protein (eGFP) was constructed. The GFP gene was amplified through PCR by making a primer from the MDH1-PGK-GFP_2.0 vector (
● pJB-VP (pJB015 내지 pJB017) (도 5 내지 도 7)PJB-VP (pJB015 to pJB017) (Figs. 5 to 7)
B. subtilis 포자 표면에 항원결정부위를 올리기 위해 B. subtilis gDNA에서 CotG-Full_F와 CotG-Full_R 프라이머(표 1; SEQ ID NO. 7, 8; 서열에서 bold는 enzyme site)를 사용하여 coat protein (CotG)의 프로모터와 CDS부분을 증폭하였고, 5'말단에 제한효소 HindIII을, 3'말단에 15 bp의 링커를 포함한 제한효소 PstI을 제작하였다. To raise the epitope on the surface of B. subtilis spores, coat protein (enzyme site in B. subtilis gDNA) using CotG-Full_F and CotG-Full_R primers (Table 1; SEQ ID NO. 7, 8; bold in the sequence). CotG) promoter and CDS portion were amplified, and restriction enzyme Pst I including a restriction enzyme Hind III at the 5'end and a 15 bp linker at the 3'end was prepared.
항원결정부위는 도 4에 도시된 VP1 내지 VP3을 사용하였다.As the epitope, the VP1 to VP3 shown in FIG. 4 were used.
또한, 항원결정부위는 낭충봉아부패의 항원 후보 부위의 항원 후보 부위의 5' 말단에 PstI을, 3'말단에 BamHI 제한효소 자리를 추가하여 유전자 합성을 진행(표 1; SEQ ID NO. 9 내지 14; VP1_F, VP1_R, VP2_F, VP2_R, VP3_F, VP3_R; 서열에서 bold는 enzyme site)하여 3개의 낭충봉아부패 항원 후보 유전자들을 확보하였다.In addition, as for the antigenic determinant site, Pst I was added to the 5'end of the antigen candidate site of the antigen candidate site of the cystic rod decay, and the BamH I restriction enzyme site was added to the 3'end to proceed with gene synthesis (Table 1; SEQ ID NO. 9 to 14; VP1_F, VP1_R, VP2_F, VP2_R, VP3_F, VP3_R; bold is an enzyme site in the sequence) to obtain three candidate cystoid rot antigen candidate genes.
확보된 coat protein과 낭충봉아 부패병의 항원 후보 유전자를 PstI 제한효소를 사용하여 절단하고 T4 Ligase를 이용하여 공여체 DNA를 제작하였다. 제작된 공여체 DNA는 제한효소 HindIII과 BamHI을 이용하여 pJB 벡터에 도입하여 VP1이 삽입된 pJB015, VP2이 삽입된 pJB016, VP3이 삽입된 pJB017를 각각 제작하였고 명명하였다.The obtained coat protein and the antigen candidate gene of cystoid spoilage were digested with Pst I restriction enzyme, and donor DNA was prepared using T4 Ligase. The prepared donor DNA was introduced into the pJB vector using restriction enzymes Hind III and BamH I, and pJB015 with VP1, pJB016 with VP2, and pJB017 with VP3 were respectively constructed and named.
(c) 항생제결손 벡터(pJB-sg02 내지 pJB-sg03) (도 8 내지 9)(c) antibiotic-deficient vector (pJB-sg02 to pJB-sg03) (Figs. 8 to 9)
항생제 저항성유전자의 결손을 위해 ampicillin 저항성유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA (SEQ ID NO. 15 :CGATACGTGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGA)와 neomycin 저항성 유전자를 목적으로 하는 가이드 RNA (SEQ ID NO. 16 :GACGAGT TATTAATAGCTGAATAAGAACGGT)를 제작하였고, 제한효소 NcoI 과 EcoRV를 이용하여 pJB 벡터에 도입하였고, 항생제 저항성 유전자의 가운데의 염기서열을 결손시킨 공여체 DNA를 사용하여, pJB-sg02 (amp deletion), pJB-sg03 (neo deletion) 벡터를 제작하였다.For the deletion of the antibiotic resistance gene, guide RNA (SEQ ID NO. 15: CGATACGTGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGA) for the purpose of the ampicillin resistance gene and guide RNA (SEQ ID NO. 16: GACGAGT TATTAATAGCTGAATAAGAACGGT) for the neomycin resistance gene were prepared and restricted. The enzymes Nco I and EcoR V were used to introduce the pJB vector, and the pJB-sg02 (amp deletion) and pJB-sg03 (neo deletion) vectors were constructed using the donor DNA having the central nucleotide sequence of the antibiotic resistance gene deleted. I did.
실시예 2 : 바실러스 수용성 세포 제작 (Example 2: Preparation of Bacillus soluble cells ( B. subtilisB. subtilis 수용성 세포 (Competent cell) 제작) Soluble cell (Competent cell) production)
B. subtilis 세포 내에 외래 물질(plasmid, phage DNA 등)을 도입할 수 있도록 다음과 같이 수행하였다. In order to introduce foreign substances (plasmid, phage DNA, etc.) into B. subtilis cells, it was performed as follows.
B. subtilis 수용성 세포의 제작은 하나의 B. subtilis colony를 Growth medium (LB broth + 0.5M sorbitol)를 이용하여 37°C 진탕배양기에서 1차 배양 (18hs) 후 Growth medium에 1/16 희석하여 O.D600 에서 0.85-0.95가 될 때까지 2차 배양하였다. For the production of B. subtilis soluble cells, one B. subtilis colony was first cultured (18 hs) in a shaking incubator at 37°C using Growth medium (LB broth + 0.5M sorbitol), and then diluted 1/16 in the growth medium. Second culture was performed until 0.85-0.95 at .D600.
배양액을 얼음상에서 10분간 반응하여 차갑게 해주고, 4°C, 5000 X g에서 5분간 원심분리를 수행하여 상층액을 버린고 차가운(ice-cold) Wash buffer (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10 % glycerol)에 반복하여 4회 세척하였다. 1 - 1.3 * 1010 cfu/mL이 되도록 electroporation solution (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10 % glycerol)희석하여 수용성 세포를 제작한 후 60 μl 식 분주하여 -80°C 에서 보관하였다.Cool the culture solution by reacting on ice for 10 minutes, centrifugation at 4 °C, 5000 X g for 5 minutes to discard the supernatant, and ice-cold Wash buffer (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10%) glycerol) repeatedly washed 4 times. Water-soluble cells were prepared by diluting electroporation solution (0.5 M sorbitol, 0.5 M mannitol, 10% glycerol) to 1-1.3 * 10 10 cfu/mL, and then aliquoted into 60 μl and stored at -80 °C.
실시예 3 : Example 3: B. subtilisB. subtilis 형질전환체 생성 Generating transformants
실시예 2에서 제작된 B. subtilis 수용성 세포 (Competent cell)에 실시예 1에서 제작된 벡터들을 각각 도입하여 형질전환 시키기 위해 다음과 같이 수행하였다.In order to transform the vector prepared in Example 1 into each of the B. subtilis soluble cells prepared in Example 2 (Competent cell), it was carried out as follows.
B. subtilis의 형질전환은 Gene Pulser System (BIO-RAD. USA)를 이용하여 Electroporation방법 (Xue. et al. 1999)으로 수행하였다. 제작된 B. subtilis 수용성 세포 (60 μl)에 형질전환 발현벡터 5μl (200 ng/μl)를 첨가하여 섞어주고 얼음에서 3분간 반응 후 electroporation cuvette (0.1 cm gap)에 넣어준다. voltage; 2,100 V, time constant; 5 ms, No. of pulses; 1 조건하에서 전기충격을 주어 형질전환 발현벡터를 세포 내 도입되도록 유도한다. 그 후 37°C에서 3시간 배양하며 형질전환 세포의 회복을 유도하고 항생제 선택배지에 도말하여 37°C에서 배양한다.Transformation of B. subtilis was performed by the Electroporation method (Xue. et al. 1999) using the Gene Pulser System (BIO-RAD. USA). To the prepared B. subtilis soluble cells (60 μl), 5 μl (200 ng/μl) of the transgenic expression vector was added and mixed, reacted on ice for 3 minutes, and then put in an electroporation cuvette (0.1 cm gap). voltage; 2,100 V, time constant; 5 ms, No. of pulses; Under 1 condition, electric shock is applied to induce the transduction expression vector to be introduced into the cell. Then, incubate at 37°C for 3 hours to induce recovery of the transformed cells, spread on an antibiotic selective medium, and incubate at 37°C.
(a) pHCas9 벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체(a) B. subtilis transformant into which pHCas9 vector was introduced
pHCas9 벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체는 Neomycin (10 μg/mL)을 첨가하여 배양하였다.The B. subtilis transformant into which the pHCas9 vector was introduced was cultured by adding Neomycin (10 μg/mL).
(b) pJB-GFP 벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체(b) B. subtilis transformant introduced with pJB-GFP vector
pJB-GFP 벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체는 Ampicillin (100 μg/mL)과 Neomycin (10 μg/mL)이 첨가된 LB 고체배지에 배양하였다. B. subtilis transformants into which the pJB-GFP vector was introduced were cultured in LB solid medium supplemented with Ampicillin (100 μg/mL) and Neomycin (10 μg/mL).
(c) pJB-VP (pJB015 내지 pJB017)벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체(c) B. subtilis transformant into which the pJB-VP (pJB015 to pJB017) vector was introduced
pJB011 내지 pJB013 벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체는 Ampicillin (100 μg/mL)과 Neomycin (10 μg/mL)이 첨가된 LB 고체배지에 배양하였다. The B. subtilis transformants into which the pJB011 to pJB013 vectors were introduced were cultured in LB solid medium to which Ampicillin (100 μg/mL) and Neomycin (10 μg/mL) were added.
(d) 항생제결손 벡터(pJB-sg02 내지 pJB-sg03)가 도입된 B. subtilis 형질전환체(d) B. subtilis transformants introduced with antibiotic-deficient vectors (pJB-sg02 to pJB-sg03)
항생제 저항성 유전자의 결손을 위해 pJB-sg02 또는 pJB-sg03 벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체는 항생제를 넣지 않은 LB 고체배지에 1차 배양 후 각 colony를 항생제 배지에 옮겨 확인하였고, 항생제 배지에서 자라지 않는 colony를 선별하였다.For the deletion of the antibiotic resistance gene, the B. subtilis transformants into which the pJB-sg02 or pJB-sg03 vector was introduced were first cultured in LB solid medium without antibiotics, and then each colony was transferred to the antibiotic medium. Colony that did not grow was selected.
실시예 4 : Example 4: B. subtilisB. subtilis 형질전환체 내의 벡터 도입여부 확인 Confirmation of vector introduction in transformants
B. subtilis의 포자에 GFP 발현벡터가 도입되어 포자의 표면에 GFP가 발현되는지 확인하기 위해, PCR 분석 및 유세포 분석을 통해 확인하였다. In order to confirm whether the GFP expression vector was introduced into the spores of B. subtilis and GFP was expressed on the surface of the spores, PCR analysis and flow cytometry were performed.
● PCR 분석● PCR analysis
형질전환체 B. subtilis의 colony를 LB broth에서 배양하여 gDNA를 분리하였다. Primer를 제작 (표 2의 SEQ ID NO. 17, 18; In-GFP_F, In-GFP_R)하여 PCR을 수행하여 형질전환체와 야생형의 DNA에서 도입유전자의 여부를 확인하였다.The colony of transformant B. subtilis was cultured in LB broth to isolate gDNA. Primer was prepared (SEQ ID NO. 17, 18 in Table 2; In-GFP_F, In-GFP_R) and PCR was performed to confirm the presence of a transgene in the transformant and wild-type DNA.
B. subtilis 세포의 게놈 내에 GFP 발현 벡터가 도입되어 B. subtilis 포자 표면에 GFP 의 발현을 확인하기 위해 수행한 PCR 결과는 도 10에 도시하였다. 도 10에서 GFP의 밴드가 확인되는 것으로 보아, B. subtilis 세포 포자의 표면에 GFP가 발현됨을 알 수 있었다. The result of PCR performed to confirm the expression of GFP on the surface of B. subtilis spores by introducing a GFP expression vector into the genome of B. subtilis cells is shown in FIG. 10. As the band of GFP was confirmed in FIG. 10, it was found that GFP was expressed on the surface of the spores of B. subtilis cells.
● 유세포 분석 (FACS)● Flow cytometry (FACS)
B. subtilis의 형질전환체 내의 도입된 유전자 단백질의 표면 발현 검증을 위해 pJB-GFP 벡터를 이용하여 유세포분석을 수행하여 확인하였다. To verify the surface expression of the introduced gene protein in the transformant of B. subtilis , it was confirmed by performing flow cytometry using the pJB-GFP vector.
유동세포 계측법에 의한 분석을 위해 pJB-GFP 벡터로 형질전환 한 B. subtilis를 0.22 ㎛의 여과된 1.5 x PBS로 세척하고, 희석하였다. 미소구의 농도는 106 beads-1 범위로 계산하였고, B. subtilis 세포는 재현탁 후 몇 분 이내에 유세포 분석기에 주입되었다. FACScalibur (Becton Dickinson, Oxford, UK) 계측기를 사용하여 분석을 수행하였다.For analysis by flow cytometry, B. subtilis transformed with the pJB-GFP vector was washed with 0.22 μm filtered 1.5×PBS and diluted. The concentration of microspheres was calculated in the range of 106 beads -1 , and B. subtilis cells were injected into the flow cytometer within a few minutes after resuspension. Analysis was performed using a FACScalibur (Becton Dickinson, Oxford, UK) instrument.
600V의 전압에서 설정된 형광검출기를 통해 515-545nm 범위의 형광을 검출하였다. 전방산란 (FS)은 증폭 계수가 10 인 다이오드로 수집하고 로그 값으로 계산하였다. 366V로 설정된 광전자 증 배관에 의해 로그 값에서 사이드 스캐터 (SS)가 검출되었다. 모든 출력 신호 [형광 (FL), FS 및 SS]에 대해 대수 채널수를 선형 강도로 변환하고 'G 평균'이 있는 기하 평균은 다음과 같이 정의됩니다. G 평균 = 10ΣlogX (i) / n; 각 측정에 대해 10,000 개의 신호를 측정하였다.Fluorescence in the range of 515-545nm was detected through a fluorescence detector set at a voltage of 600V. Forward scattering (FS) was collected with a diode with an amplification factor of 10 and calculated as a log value. Side scatter (SS) was detected at log values by photomultiplier pipe set to 366V. For all output signals [Fluorescence (FL), FS and SS], the number of logarithmic channels is converted to linear intensity and the geometric mean with'G mean' is defined as: G mean = 10ΣlogX (i) / n; 10,000 signals were measured for each measurement.
B. subtilis 세포내 pJB-GFP 발현 벡터 도입여부를 확인하기 위해 수행한 유세포분석 결과는 도 11에 도시하였다. The results of flow cytometry performed to confirm the introduction of the pJB-GFP expression vector into B. subtilis cells are shown in FIG. 11.
도 11에서 pJB-GFP 발현 벡터가 도입되지 않은 wild type 그래프에 비해 pJB-GFP 발현 벡터가 도입된 pJB-GFP그래프에서 GFP 발현이 shifting된 것이 확인되는 것으로 보아, PCR 결과와 동일하게, B. subtilis 세포 포자의 표면에 GFP가 발현됨을 알 수 있었다.In FIG. 11, it was confirmed that GFP expression was shifted in the pJB-GFP graph into which the pJB-GFP expression vector was introduced compared to the wild type graph into which the pJB-GFP expression vector was not introduced. In the same manner as the PCR result, B. subtilis It was found that GFP was expressed on the surface of cell spores.
실시예 5 : Example 5: B. subtilisB. subtilis 포자 표면에 목적한 항원결정기의 확인 Identification of the target epitope on the spore surface
실시예 4에서 B. subtilis의 포자에 GFP 발현벡터가 도입되어 포자의 표면에 GFP가 발현되는지 확인하였고, GFP 발현벡터 대신 목적하는 항원발현벡터가 포자의 표면에 발현되는지 확인하기 위해, 목적발현벡터(pJB015 내지 pJB017)의 발현여부를 PCR 분석을 통해 확인하였다.In Example 4, a GFP expression vector was introduced into the spores of B. subtilis to confirm that GFP was expressed on the surface of the spore, and to confirm whether the desired antigen expression vector was expressed on the surface of the spore instead of the GFP expression vector, the target expression vector Expression of (pJB015 to pJB017) was confirmed through PCR analysis.
● PCR 분석● PCR analysis
형질전환체 B. subtilis의 colony를 LB broth에서 배양하여 gDNA를 분리하였다. 도입된 낭충봉아부패 항원 후보유전자 3개의 영역 안쪽에서 primer를 제작 (표 2의 SEQ ID NO. 21 내지 26; In-VP1_F, In-VP1_R, In-VP2_F, In-VP2_R, In-VP3_F, In-VP3_R)하여 PCR을 수행하였고, 형질전환체와 야생형의 DNA에서 도입유전자의 여부를 확인하였다.The colony of transformant B. subtilis was cultured in LB broth to isolate gDNA. Construct primers inside the three regions of the introduced cystic rod rot antigen candidate genes (SEQ ID NOs 21 to 26 in Table 2; In-VP1_F, In-VP1_R, In-VP2_F, In-VP2_R, In-VP3_F, In- VP3_R) was performed to perform PCR, and the presence of a transgene in the transformant and wild-type DNA was confirmed.
B. subtilis 포자 표면에 목적한 항원의 발현 벡터 발현여부를 확인하기 위해 수행한 PCR 결과는 도 12에 도시하였다. The results of PCR performed to confirm whether the expression vector of the target antigen was expressed on the surface of B. subtilis spores is shown in FIG. 12.
도 12에서 VP1, VP2 및 VP3의 증폭 밴드를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 B. subtilis의 포자 표면에 목적하는 항원이 발현됨을 알 수 있었다.In FIG. 12, the amplification bands of VP1, VP2 and VP3 could be identified, and through this, it could be seen that the target antigen was expressed on the spore surface of B. subtilis .
실시예 6 : 항체형성 확인Example 6: Confirmation of antibody formation
B. subtilis 포자의 게놈내에 삽입되어진 항생제 저항성 유전자(예를 들어, neo, amp 등)를 제거하기 위하여, pJB-VP 발현벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체를 pJB-sg02, 03 벡터로 형질전환을 수행하여 항생제 저항성 유전자의 결손을 유도하였다. 형질전환체를 항생제가 첨가되지 않은 LB 평판 배지에 도말 한 후 형성된 각각의 단일 colony를 항생제 LB 평판 배지에 음성 선택 배양하였고, 항생제 LB 평판 배지에서 자라지 않는 colony를 선별하여 항생제 유전자 결손 B. subtilis를 확보하였다. In order to remove the antibiotic resistance gene (eg, neo, amp, etc.) inserted into the genome of B. subtilis spores, the B. subtilis transformant into which the pJB-VP expression vector was introduced was transformed with pJB-sg02, 03 vectors. Conversion was performed to induce deletion of the antibiotic resistance gene. The transformants were plated on LB plate medium to which antibiotics were not added, and then each single colony formed was negatively cultured on the antibiotic LB plate medium, and colonies that did not grow on the antibiotic LB plate medium were selected for antibiotic gene deletion B. subtilis . Secured.
● PCR 분석● PCR analysis
Primer를 제작 (표 3의 SEQ ID NO. 27 내지 30)하여 PCR을 수행하여 낭충봉아부패의 항원 유전자가 도입된 형질전환체 B. subtilis의 항생제 유전자 결손 여부를 확인하였다.Primer was produced (SEQ ID NOs 27 to 30 in Table 3) and PCR was performed to confirm whether the antibiotic gene of the transformant B. subtilis , into which the antigen gene of cystoid rot was introduced, was defective.
pJB-ASF 발현벡터가 도입된 B. subtilis 형질전환체의 항생제 유전자가 결손된 것을 확인하기 위해 수행한 PCR 결과는 도 13 및 도14에 도시하였다. 도 13 및 도 14에서 AmpR 및 NeoR의 밴드가 확인되지 않는 것으로 보아, B. subtilis 형질전환체 내에 항생제 유전자가 결손되었음을 알 수 있었다.The results of PCR performed to confirm the deletion of the antibiotic gene of the transformant of B. subtilis into which the pJB-ASF expression vector was introduced are shown in FIGS. 13 and 14. As the bands of AmpR and NeoR were not found in FIGS. 13 and 14, it could be seen that the antibiotic gene was deleted in the B. subtilis transformant.
항생제 유전자가 결손된 목적 항원이 발현되는 B. subtilis의 형질전환체를 이용한 면역형성을 확인하기 위하여 B. subtilis 포자는 80˚C에서 20분 동안 고온처리하여 불활화 단계를 거쳐 동물실험에 사용하였다. Mouse는 C57BL/6, 암컷, 8주령을 사용하였고, 5마리의 mouse를 한 그룹으로 설정하였다. B. subtilis spores were subjected to an inactivation step by high temperature treatment at 80˚C for 20 minutes to confirm immunity formation using a transformant of B. subtilis expressing the target antigen with a deficient antibiotic gene. . Mouse was C57BL/6, female, 8 weeks old, and 5 mice were set as one group.
투여 경로는 점막을 통한 면역형성을 확인하기 위해 mouse용 존데를 이용하여 위내 직접 투여하였고, dose는 5x10^10 spore/0.2ml로 하였다. 투여는 총 3회로 진행하였고, 1회 투여 시 3일 연속으로 투여하고 각 회 차의 간격은 2주로 하였다. The route of administration was to confirm the formation of immunity through the mucous membrane, and was administered directly into the stomach using a mouse sonde, and the dose was 5x10^10 spore/0.2ml. The administration was performed three times in total, and for one administration, it was administered for 3 consecutive days, and the interval between each dose was 2 weeks.
항체형성확인 실험은 동물실험을 이용한 ELISA와 western blot으로 분석하였다.The antibody formation confirmation experiment was analyzed by ELISA and western blot using animal experiments.
ELISA와 western blot에 필요한 혈청은 투여 하루 전 가벼운 마취 후 안와채혈하여 실온에서 30~60분간 비동화한 후 6000rpm, 7min, 4℃에서 원심분리하여 상층액만 분리하여 수행하였다.Serum required for ELISA and western blot was collected one day prior to administration, after light anesthesia, orbital blood was collected, immobilized at room temperature for 30-60 minutes, and then centrifuged at 6000 rpm, 7 minutes, and 4°C to separate the supernatant.
● Indirect ELISA 분석● Indirect ELISA analysis
Plate에 항원을 coating 하는 방법을 사용하였고 벌의 낭충봉아부패 특이적 항체형성 검출을 위해 정제된 정제된 항원후보유전자 단백질을 100 ng/well의 농도로 코팅하였다. 코팅용액은 0.05M의 Carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6)을 사용하였다. A method of coating antigen on the plate was used, and the purified antigen candidate gene protein was coated at a concentration of 100 ng/well in order to detect the formation of antibodies specific for cystic rod decay in bees. As the coating solution, 0.05M Carbonate/bicarbonate buffer (pH 9.6) was used.
항체의 희석 배수 그리고 이차 항체의 희석배수를 결정하여 ELISA 분석 조건을 확립하기 위해 고정화 용액 (1% BSA)을 사용하여 분석하였다. 일차 항체의 희석배수를 1:10 부터 1:10,000까지, 이차 항체는 Goat-anti-mouse IgG-HRP를 사용하였으며, 희석 배수는 1:5,000부터 1:160,000까지의 범위로 정하여 분석 분석하였다. 반응 정도 (BT/B0)의 값이 50%를 유지하는 농도 (1:10,000)를 선택하여 분석 실험에 사용하는 최적 농도로 결정하였다.The dilution factor of the antibody and the dilution factor of the secondary antibody were determined and analyzed using an immobilization solution (1% BSA) to establish ELISA assay conditions. The dilution factor of the primary antibody was 1:10 to 1:10,000, the secondary antibody was Goat-anti-mouse IgG-HRP, and the dilution factor was set in the range of 1:5,000 to 1:160,000, and analyzed. The concentration (1:10,000) in which the value of the reaction degree (B T /B 0 ) is maintained at 50% was selected and determined as the optimum concentration used in the assay.
세척 용액은 0.05%의 Tween 20을 첨가한 PBS buffer를 사용하였고, 각 단계의 반응은 상온에서 2시간 배양하여 반응시켰다. 기질 용액은 TMB를 사용하였고, 반응의 종결은 0.16 M H2SO4 (stop solution) 100 ul을 주입하여 반응을 멈춘 후 ELISAreader (TECAN SUNRISE, BioSurplus)에서 450 nm의 파장에서 O.D값을 측정하였다(도 15).The washing solution was a PBS buffer to which 0.05
도 15에는 Indirect ELISA 분석 결과를 도시하였다.15 shows the results of the Indirect ELISA analysis.
도 15의 ELISA 결과를 통해, 항원을 투여한 쥐의 혈액에서 벌의 낭충봉아부패 항원 특이적 항체 중 VP1과 VP2는 4주차에, VP3는 6주차에 생성됨 (0.8 이상)을 도 15의 결과를 통해 알 수 있었다.Through the ELISA results of FIG. 15, VP1 and VP2 were generated at
● Western blot 분석● Western blot analysis
항원 후보 단백질의 특성에 따라 GST 또는 6His가 tagging 된 재조합 단백질을 glutathione 또는 Ni-NTA resin에 항원 후보 단백질을 binding시킨 후, washing buffer로 wash하여 resin에 binding 하지 않은 단백질을 제거하였다. Elution buffer를 column에 loading하여 resin에 붙어 있던 타겟 단백질을 분리시켜 추출하였다. SDS-PAGE를 이용하여 추출한 단백질이 타겟단백질과 동일한 사이즈에 위치하는지 확인하여 항원 후보단백질을 정제하였다. Depending on the characteristics of the antigen candidate protein, the recombinant protein tagged with GST or 6 His was bound to glutathione or Ni-NTA resin, and then washed with a washing buffer to remove the protein that was not bound to the resin. The elution buffer was loaded onto the column, and the target protein attached to the resin was separated and extracted. The antigen candidate protein was purified by checking whether the extracted protein is located in the same size as the target protein by using SDS-PAGE.
정제된 벌의 낭충봉아부패 후보유전자 단백질을 500 ng/ml를 10% SDS-PAGE gel에 loading하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질은 4℃ cold room에서 polyvinylidene difluoride membrane (PVDF, Bio-rad)에 100 mA로 2시간 동안 전사시킨 후, 5% skim milk가 포함된 TBST (Tris buffered saline with Tween 20, pH 7.5) 용액으로 상온에서 1시간 동안 blocking하였다. Mouse에서 채취한 혈액의 혈청 (serum)을 5% skim milk에 1:10 또는 1:100으로 희석하여 사용하였다. 각각 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후 TBST로 5분씩 3회 세정하였다. 2차 항체로는 horse radish peroxidase (HRP)가 결합된 goat anti-mouse IgG H&L (abcam)를 1:20,000으로 5% skim milk에 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBST로 3회 세정하였다. ECL (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 기질과 1~3분간 반응한 후 각각의 단백질 밴드는 LAS-3000으로 가시화하였다 (도 16). The protein was separated by loading 500 ng/ml of the purified bee's cystoid rot candidate gene protein onto a 10% SDS-PAGE gel. The separated protein was transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF, Bio-rad) for 2 hours at 100 mA in a cold room at 4°C, and then a TBST (Tris buffered saline with
도 16에는 Western blot 분석 결과를 도시하였다.16 shows the results of Western blot analysis.
도 16의 결과를 통해, 항원을 투여한 쥐의 혈액에서 낭충봉아부패 항원 특이적 항체 중 VP1과 VP2는 4주차에, VP3는 6주차에 생성됨을 도 16을 통해 확인할 수 있었다.Through the results of FIG. 16, it was confirmed through FIG. 16 that VP1 and VP2 were generated at
도 15 및 16의 Indirect ELISA 및 Western blot 분석을 통해 본 출원의 방법으로 만들어진 CRISPR/Cas9 기반의 Bacillus subtilis 포자는 목적하는 항원인 벌의 낭충봉아부패 항원이 B. subtilis의 포자의 표면에 발현되어 항체를 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다.In the CRISPR/Cas9-based Bacillus subtilis spores made by the method of the present application through Indirect ELISA and Western blot analysis of FIGS. 15 and 16, the target antigen, the bee cystoid rot antigen, is expressed on the surface of the spore of B. subtilis , and the antibody is antibody It was confirmed that can be formed.
<110> JBBiotech <120> sacbrood vaccine of bees using CRISPR/Cas9 based Bacillus subtilis genome editing mechanism <130> CP19-061 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1(Viral Protein 1) <400> 1 tcactgcagg ataaaccgaa ggatataagt agtataacaa taattccgaa acctcgtttg 60 ggttttcccc atgggaaagg taagagtgat gcggttgcta tgcgagtaaa tccggtggca 120 ttaacgtctt ttcaagatgt gaatgcttat cctgatgagc ctcgtactac gttggatata 180 gctcgtatat ggggcttgag gagtacgttt aattggggat caggcgatgc gcatggcaaa 240 gagttattta ataccgtttt ggacccatgt ttgagatttt atgatcagga ttatgaagga 300 caaataaccc cgatggaata tgtaactggg ttgtataatt tttggtcagg gccaatagag 360 ttacgttttg attttgtttc aaatgcgttt cacactggaa ctgtgattat atcagcggag 420 tataatcgat catctaccaa tacggatgag tgccaatctc actccactta tacaaaaacg 480 ttccatttgg gagaacaaaa atccgtacat tttactgtgc cgtatatata tgataccgtg 540 ttacgtagaa atacggctag cgcctattta ccggttactg ataatgataa ggtagataat 600 gttagtaagg cgcaggctac ggggattaga gcagagtcta aaatgagagt gaaagtgaga 660 gtagttaatg ttttaaggcc tgttgcctct actacctcaa ctatagaagt tttggtgtat 720 atgcgaggag gaaagaacta tgcattgcat ggtttaaaac agtcaactta ttggccatca 780 agaagtgtgg tacccataga tagttttcca cctgatggtt atgatccagt taaaccgcca 840 aataggccaa gaagggaatc agataatcca catagattcc tgcccgcgaa tgtttctaat 900 agttggaatg agtattcgag tgcttattta ccgcgagtac aataaggatc ctct 954 <210> 2 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2(Viral Protein 2) <400> 2 tcactgcagc agggggacgc tacacagcaa agttccaagg aggagaatac aataattaca 60 cgcgatcaac aacaaactgt gtcggaaaag ataccatcaa ctgttgggga tttagtgata 120 gcctcttctg aaccaacgca acaatttagg agtttaacta atcgttggat gcctattaat 180 tcaattagag taacagtaga tggtaaaagg aatgatcttc tggcgcaata ttatatccca 240 gaagattttt tgtcaacaca tgccaagtgt gcgcctaaca ctataccatt tgagacttac 300 gtgtatggaa aatatgagtt ggagatgaag tttgtagcta ctggtaataa gtttcagtgt 360 gggaaagtta taatttctgt aaagtctgat agttatcaag cagataatat aaacacagga 420 tttcaagctg cactatcgcg accgcatatt atgttagatt tgtccaccaa taatgaagga 480 gttctaaaaa taccatttag atatcatcgt gcctttgtta ggaatcaaac gcataaaaca 540 gctacggcag gtgtaagacc tgggaagttt gctagtattt atgtgcaggt gttgtcacca 600 ttacagacgg gggagggagg agcgaatgat atgtttatac gaccttttta tcgatatacg 660 cgtgctgaat tcgcgggaat gtcgtataaa gtcccattga cccagtaagg atcctct 717 <210> 3 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3(Viral Protein 3) <400> 3 tcactgcagg atactggtgc taaagaagat gaagatgaaa ctgctaattt cagtgatggg 60 gttaccgcga tgggtttcca atctttggat acccaagtat caattaagga cattttgcgt 120 agaccagtgt tgttgtttaa tcatgtagta ttggatcctg catatacagg tttttttata 180 cctataatgc cgccttctag aatgatgcaa tataaatcag gggataggga aacatctttt 240 cagcgattaa ttggtcgtac gcctcaagca gcaataatga atttatttag gttttggaga 300 gggtcattgc gttatactat tattatacat agtaccgatg gacatcctat atatgtaacg 360 catgtacccc atacgggaaa tagagtgtat ggtttaatga aagtaaataa tttgcacgag 420 tatacgaaag ttcctatttt tgggtgtggt ttaacaactg aaatgattat tcctagtgtg 480 aatccgagta tatgtgtaga agtaccattt gatactgaaa ataattgggc tgtgaccttt 540 gaggaagatg ctcagcggaa ctactcatgg agagacaaag gcgatactgt gaccggacat 600 ttggttgtaa cacctgtagt gccagttaat atgtctgtgt gggtagaagc tggggatgat 660 tttgaggtgt ctaactttta tgggccaccg actgttaaga cgaatgattg gaaatacgca 720 ttctctgatg agcatgcgcg agttcagatg gatgatagta cagaaagagt atacgatgaa 780 ggaaaccagg tgtattatta tccggcccct aagccagagg gttttagttt gaacaatgta 840 cggacttcgg ttagtacgtt gtgtaatatg ctcggaaaag tagtaactcc tgagcgcgca 900 atgagaacag cgttgtgcgc aactccctac tttgggtcag cttatatgac agctactaca 960 cttgatgcga taggcagtat gcagaacacc gttacgggag cagcacacca gtaaggatcc 1020 tct 1023 <210> 4 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG_gRNA <400> 4 tacgttcatc cttaacatat ttttaaaagg a 31 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_F <400> 5 ataaagctta tggtgagcaa g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_R <400> 6 tatggatcct tacttgtaca g 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG-Full_F <400> 7 ataaagctta gtgtccctag ctccg 25 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG-Full_R <400> 8 tatctgcagt gaacccccac ctcctttgta tttctttttg 40 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1_F <400> 9 ggtgggggtt cactgcagga taaaccgaag gatat 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1_R <400> 10 gtcgactcta gaggatcctt attgtactcg cggta 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2_F <400> 11 ggtgggggtt cactgcagca gggggacgct acaca 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2_R <400> 12 gtcgactcta gaggatcctt actgggtcaa tggga 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3_F <400> 13 ggtgggggtt cactgcagga tactggtgct aaaga 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3_R <400> 14 gtcgactcta gaggatcctt actggtgtgc tgctc 35 <210> 15 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ampicillin_gRNA <400> 15 cgatacgtgc tccggttccc aacgatcaag ga 32 <210> 16 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neomycin_gRNA <400> 16 gacgagttat taatagctga ataagaacgg t 31 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-GFP_F <400> 17 atcatggccg acaagcagaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-GFP_R <400> 18 tctcgttggg gtctttgctc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_F <400> 19 tcgcggtttc gctgcccttt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_R <400> 20 aagtcccgca acgagcgcaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP1_F <400> 21 gctagcgcct atttaccggt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP1_R <400> 22 ttcgcgggca ggaatctatg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP2_F <400> 23 ttcaagctgc actatcgcga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP2_R <400> 24 cattcccgcg aattcagcac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP3_F <400> 25 ctgtgtgggt agaagctggg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP3_R <400> 26 aagtagggag ttgcgcacaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR_F <400> 27 tgataacact gcggccaact 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR_R <400> 28 tgactccccg tcgtgtagat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeoR_F <400> 29 acgggccagt ttgttgaaga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeoR_R <400> 30 aagcggccaa tctgattcca 20 <110> JBBiotech <120> sacbrood vaccine of bees using CRISPR/Cas9 based Bacillus subtilis genome editing mechanism <130> CP19-061 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 954 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 (Viral Protein 1) <400> 1 tcactgcagg ataaaccgaa ggatataagt agtataacaa taattccgaa acctcgtttg 60 ggttttcccc atgggaaagg taagagtgat gcggttgcta tgcgagtaaa tccggtggca 120 ttaacgtctt ttcaagatgt gaatgcttat cctgatgagc ctcgtactac gttggatata 180 gctcgtatat ggggcttgag gagtacgttt aattggggat caggcgatgc gcatggcaaa 240 gagttattta ataccgtttt ggacccatgt ttgagatttt atgatcagga ttatgaagga 300 caaataaccc cgatggaata tgtaactggg ttgtataatt tttggtcagg gccaatagag 360 ttacgttttg attttgtttc aaatgcgttt cacactggaa ctgtgattat atcagcggag 420 tataatcgat catctaccaa tacggatgag tgccaatctc actccactta tacaaaaacg 480 ttccatttgg gagaacaaaa atccgtacat tttactgtgc cgtatatata tgataccgtg 540 ttacgtagaa atacggctag cgcctattta ccggttactg ataatgataa ggtagataat 600 gttagtaagg cgcaggctac ggggattaga gcagagtcta aaatgagagt gaaagtgaga 660 gtagttaatg ttttaaggcc tgttgcctct actacctcaa ctatagaagt tttggtgtat 720 atgcgaggag gaaagaacta tgcattgcat ggtttaaaac agtcaactta ttggccatca 780 agaagtgtgg tacccataga tagttttcca cctgatggtt atgatccagt taaaccgcca 840 aataggccaa gaagggaatc agataatcca catagattcc tgcccgcgaa tgtttctaat 900 agttggaatg agtattcgag tgcttattta ccgcgagtac aataaggatc ctct 954 <210> 2 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2 (Viral Protein 2) <400> 2 tcactgcagc agggggacgc tacacagcaa agttccaagg aggagaatac aataattaca 60 cgcgatcaac aacaaactgt gtcggaaaag ataccatcaa ctgttgggga tttagtgata 120 gcctcttctg aaccaacgca acaatttagg agtttaacta atcgttggat gcctattaat 180 tcaattagag taacagtaga tggtaaaagg aatgatcttc tggcgcaata ttatatccca 240 gaagattttt tgtcaacaca tgccaagtgt gcgcctaaca ctataccatt tgagacttac 300 gtgtatggaa aatatgagtt ggagatgaag tttgtagcta ctggtaataa gtttcagtgt 360 gggaaagtta taatttctgt aaagtctgat agttatcaag cagataatat aaacacagga 420 tttcaagctg cactatcgcg accgcatatt atgttagatt tgtccaccaa taatgaagga 480 gttctaaaaa taccatttag atatcatcgt gcctttgtta ggaatcaaac gcataaaaca 540 gctacggcag gtgtaagacc tgggaagttt gctagtattt atgtgcaggt gttgtcacca 600 ttacagacgg gggagggagg agcgaatgat atgtttatac gaccttttta tcgatatacg 660 cgtgctgaat tcgcgggaat gtcgtataaa gtcccattga cccagtaagg atcctct 717 <210> 3 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3 (Viral Protein 3) <400> 3 tcactgcagg atactggtgc taaagaagat gaagatgaaa ctgctaattt cagtgatggg 60 gttaccgcga tgggtttcca atctttggat acccaagtat caattaagga cattttgcgt 120 agaccagtgt tgttgtttaa tcatgtagta ttggatcctg catatacagg tttttttata 180 cctataatgc cgccttctag aatgatgcaa tataaatcag gggataggga aacatctttt 240 cagcgattaa ttggtcgtac gcctcaagca gcaataatga atttatttag gttttggaga 300 gggtcattgc gttatactat tattatacat agtaccgatg gacatcctat atatgtaacg 360 catgtacccc atacgggaaa tagagtgtat ggtttaatga aagtaaataa tttgcacgag 420 tatacgaaag ttcctatttt tgggtgtggt ttaacaactg aaatgattat tcctagtgtg 480 aatccgagta tatgtgtaga agtaccattt gatactgaaa ataattgggc tgtgaccttt 540 gaggaagatg ctcagcggaa ctactcatgg agagacaaag gcgatactgt gaccggacat 600 ttggttgtaa cacctgtagt gccagttaat atgtctgtgt gggtagaagc tggggatgat 660 tttgaggtgt ctaactttta tgggccaccg actgttaaga cgaatgattg gaaatacgca 720 ttctctgatg agcatgcgcg agttcagatg gatgatagta cagaaagagt atacgatgaa 780 ggaaaccagg tgtattatta tccggcccct aagccagagg gttttagttt gaacaatgta 840 cggacttcgg ttagtacgtt gtgtaatatg ctcggaaaag tagtaactcc tgagcgcgca 900 atgagaacag cgttgtgcgc aactccctac tttgggtcag cttatatgac agctactaca 960 cttgatgcga taggcagtat gcagaacacc gttacgggag cagcacacca gtaaggatcc 1020 tct 1023 <210> 4 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG_gRNA <400> 4 tacgttcatc cttaacatat ttttaaaagg a 31 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_F <400> 5 ataaagctta tggtgagcaa g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP_R <400> 6 tatggatcct tacttgtaca g 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG-Full_F <400> 7 ataaagctta gtgtccctag ctccg 25 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CotG-Full_R <400> 8 tatctgcagt gaacccccac ctcctttgta tttctttttg 40 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1_F <400> 9 ggtgggggtt cactgcagga taaaccgaag gatat 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1_R <400> 10 gtcgactcta gaggatcctt attgtactcg cggta 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2_F <400> 11 ggtgggggtt cactgcagca gggggacgct acaca 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP2_R <400> 12 gtcgactcta gaggatcctt actgggtcaa tggga 35 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3_F <400> 13 ggtgggggtt cactgcagga tactggtgct aaaga 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP3_R <400> 14 gtcgactcta gaggatcctt actggtgtgc tgctc 35 <210> 15 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ampicillin_gRNA <400> 15 cgatacgtgc tccggttccc aacgatcaag ga 32 <210> 16 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neomycin_gRNA <400> 16 gacgagttat taatagctga ataagaacgg t 31 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-GFP_F <400> 17 atcatggccg acaagcagaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-GFP_R <400> 18 tctcgttggg gtctttgctc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_F <400> 19 tcgcggtttc gctgcccttt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S_R <400> 20 aagtcccgca acgagcgcaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP1_F <400> 21 gctagcgcct atttaccggt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP1_R <400> 22 ttcgcgggca ggaatctatg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP2_F <400> 23 ttcaagctgc actatcgcga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP2_R <400> 24 cattcccgcg aattcagcac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP3_F <400> 25 ctgtgtgggt agaagctggg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> In-VP3_R <400> 26 aagtagggag ttgcgcacaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR_F <400> 27 tgataacact gcggccaact 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AmpR_R <400> 28 tgactccccg tcgtgtagat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeoR_F <400> 29 acgggccagt ttgttgaaga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NeoR_R <400> 30 aagcggccaa tctgattcca 20
Claims (10)
ii) 상기 바실러스 유래 포자의 표면에 존재하는 포자 코트 단백질인 CotG 단백질;
iii) 상기 포자 코트 단백질에 연결된 펩타이드성 링커(linker);
iv) 상기 링커에 연결되어 발현하는, SEQ ID NO. 1 내지 3 중 선택되는 어느 하나의 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질;
을 포함하고,
상기 바실러스 유래 포자의 지노믹 DNA의 내인성(endogenous) CotG 로커스(locus)에 외래성(exogenous) CotG를 코딩하는 서열, 링커를 코딩하는 서열, 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질을 인코딩 코딩하는 서열이 순서대로 연결되어 있는 서열이 삽입되어 있는 지노믹 DNA를 가진 포자인 것을 특징으로 하는,
면역원성 조성물.
i) Spores from Bacillus;
ii) CotG protein, which is a spore coat protein present on the surface of the Bacillus-derived spores;
iii) a peptide linker linked to the spore coat protein;
iv) linked to the linker and expressed, SEQ ID NO. Any one bee selected from 1 to 3 cystoid rot antigenic substances;
Including,
Sequence encoding an exogenous CotG to the endogenous CotG locus of the genomic DNA of the Bacillus-derived spores, a sequence encoding a linker, a sequence encoding a bee cystoid spore antigenic substance. It is characterized in that it is a spore having a genomic DNA into which a sequence that is connected to each other is inserted,
Immunogenic composition.
상기 바실러스는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
The method of claim 1,
The Bacillus is an immunogenic composition, characterized in that Bacillus subtilis (Bacillus subtilis).
상기 조성물에서 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질의 농도는 상기 조성물 기준으로 1010 ~1015개/ml 농도인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
The method of claim 1,
Immunogenic composition, characterized in that the concentration of the antigenic substance for cystoid rot of the bee in the composition is 10 10 to 10 15 pcs/ml based on the composition.
상기 조성물은 경구 투여용, 복강내 투여용, 정맥내 투여용, 근육내 투여용, 피하 투여용, 내피 투여용, 비내 투여용, 폐내 투여용, 직장내 투여용, 강내 투여용, 복강내 투여용, 경막내 투여용 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
The method of claim 1,
The composition is for oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, endothelial administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration Immunogenic composition, characterized in that any one or more selected from for, for intrathecal administration.
안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤 (iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 바이러스 일부 (subviral) 입자 보조제, 클로스트리디움 퍼프링겐스 독소, N, N-디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 중 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
The method of claim 1,
Stabilizer, emulsifier, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, pH adjuster, surfactant, liposome, iscom adjuvant, synthetic glycopeptide, extender, carboxypolymethylene, bacterial cell wall, derivative of bacterial cell wall, bacterial vaccine, animal poxvirus protein , Subviral particle adjuvant, Clostridium pufflingens toxin, N, N-dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)-propanediamine, monophosphoryl lipid A, dimethyl Immunogenic composition, characterized in that it further comprises any one or more selected from dioctadecyl-ammonium bromide.
i) Cas9 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산;
ii) 서열번호 4로 코딩되는 핵산 또는 이로부터 전사된 가이드 RNA(guide RNA);
iii) CotG를 코딩하는 핵산, 링커를 코딩하는 핵산, 벌의 낭충봉아부패 항원성 물질인 SEQ ID NO. 1 내지 3 중 적어도 어느 하나를 코딩하는 핵산 및 항생제 저항성 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 도너;
항생제를 처리하여 바실러스의 게놈 DNA 서열 중 CotG를 코딩하는 서열 내에 상기 도너가 삽입된 게놈 DNA를 가지고 있는 바실러스를 선택하는 단계;
상기 선택되는 바실러스의 게놈 내에 삽입된 상기 항생제 저항성 유전자를 넉아웃 시키는 단계;
상기 항생제 저항성 유전자가 넉아웃된 바실러스로 포자를 형성시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 조성물 제조방법.
Steps to introduce the following into Bacillus:
i) Cas9 protein or nucleic acid encoding it;
ii) the nucleic acid encoded by SEQ ID NO: 4 or guide RNA transcribed therefrom;
iii) a nucleic acid encoding CotG, a nucleic acid encoding a linker, SEQ ID NO, which is an antigenic substance of bee cystoid rot. A donor comprising a nucleic acid encoding at least one of 1 to 3 and a nucleic acid encoding an antibiotic resistance gene;
Selecting a Bacillus having genomic DNA into which the donor is inserted in a sequence encoding CotG from among the genomic DNA sequences of Bacillus by treatment with antibiotics;
Knocking out the antibiotic resistance gene inserted into the genome of the selected Bacillus;
Forming spores with Bacillus knocked out of the antibiotic resistance gene;
The method for preparing the composition of claim 1, comprising a.
상기 도입은 벡터를 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 7,
The introduction method, characterized in that using a vector.
포자를 형성시키는 단계는 영양분이 고갈된 영양학적 조건을 이용하는 방법; 및
고온 또는 저온의 온도적 조건을 이용하는 방법;
중 선택되는 어느 하나 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
The method of claim 7,
The step of forming spores may include using nutrient-depleted nutritional conditions; And
A method of using hot or cold temperature conditions;
A manufacturing method characterized in that it is carried out with any one or more selected from.
상기 항생제 저항성 유전자를 넉아웃 시키는 단계는,
항생제 저항성 유전자 영역을 표적으로 하는 가이드 RNA인 서열번호 15 또는 서열번호 16 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 벡터를 추가로 도입하여 상기 항생제 저항성 유전자를 코딩하는 핵산 서열 내에 인델을 형성시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.The method of claim 7,
The step of knocking out the antibiotic resistance gene,
Characterized in that the indel is formed in the nucleic acid sequence encoding the antibiotic resistance gene by additionally introducing a vector containing any one selected from SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16, which is a guide RNA targeting the antibiotic resistance gene region. Manufacturing method.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020190134910A KR102212505B1 (en) | 2019-10-28 | 2019-10-28 | sacbrood vaccine of bees using CRISPR/Cas9 based Bacillus subtilis genome editing mechanism |
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KR102212505B1 true KR102212505B1 (en) | 2021-02-05 |
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ID=74558837
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KR (1) | KR102212505B1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US12031128B2 (en) | 2021-04-07 | 2024-07-09 | Battelle Memorial Institute | Rapid design, build, test, and learn technologies for identifying and using non-viral carriers |
-
2019
- 2019-10-28 KR KR1020190134910A patent/KR102212505B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Sung Oh, Journal of Apiculture, 2019, 34(2) pp.149-156 (2019.06.)* * |
Zhang et al., J. Microbiol. Biotechnol., 2019, 29(2), pp.179-190 (online 2018.12.14.)* * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US12031128B2 (en) | 2021-04-07 | 2024-07-09 | Battelle Memorial Institute | Rapid design, build, test, and learn technologies for identifying and using non-viral carriers |
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