KR102211683B1 - 만성 뇌졸중 재활 보조제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만성 뇌졸중의 재활에 사용되는 조성물에 있어서, 작업 특이 훈련(task-specific training)과 병행하여 사용되는 조성물로서, DNA 메틸화(methylation) 저해제를 유효성분으로 포함하는 만성 뇌졸중 재활 보조제 조성물에 관한 것으로, 뇌졸중 후 TST 및 5-Aza-dC 병합 치료는 뇌졸중의 만성 기간에서 기능의 회복을 촉진한다.

Description

만성 뇌졸중 재활 보조제 조성물{AN AUXILIARY COMPOSITION TO BE USED IN CHRONIC STROKE RECOVERY}

본 발명은 만성 시기의 뇌졸중 재활 보조제 조성물에 관한 것이다.

전세계적으로 대략 15백만 명이 매년 뇌졸중으로 고통받고 있으며, 이로 인하여 사망 또는 감각운동(sensorimotor)과 다른 결함이 발생하고 있다. 뇌졸중은 선진국에서, 심장병과 암에 이은 세 번째 사망 원인이다. 2가지 형태의 뇌졸중이 존재한다: 혈류(blood flow)를 차단하거나 방해하는 혈전(blood clot)에 의해 유발되는 허혈성 뇌졸중 및 뇌 내로 또는 뇌 주변에 출혈에 의해 유발되는 출혈성 뇌졸중 허혈성 뇌졸중은 전체 뇌졸중 사례의 대략 80-86%를 차지한다.

재활을 제외하고는 현재 뇌졸중 후 기능적인 회복을 개선하기 위한 특별한 치료가 없다.

신경학적 회복은 뇌졸중 후 1-3개월 이내에 종결된다. 대부분의 자발적인 회복은 질환 후 6개월까지 일어난다. 따라서 뇌졸중 후 기능의 회복을 위해서 적당한 치료 기간이 매우 중요하고 뇌졸중 후 만성 단계에서 기능적인 회복을 촉진할 수 있는 효과적인 치료 수단의 개선이 필요하다.

그 중 하나의 방법이 기능적인 잇점을 제공하는 특별한 행동 경험이다. 작업 특이 훈련(task-specific training, 이하, 'TST'라 함)이 신경학적 회복에서 중요하다[Okabe, N.; Himi, N.; Maruyama-Nakamura, E.; Hayashi, N.; Narita, K.; Miyamoto, O. PLoS One 2017, 12, e0187413]. TST는 뇌에서 경험-의존적인 운동기능 학습 및 신경 가소성 변화를 촉진할 수 있다.

따라서 만성 단계 뇌졸중 회복에 대한 새로운 방법의 필요성이 존재한다.

[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 10-2008-0097446호

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로 본 발명의 목적은 만성 뇌졸중 회복을 위한 신규한 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 만성 뇌졸중의 재활에 사용되는 조성물에 있어서, 작업 특이 훈련(task-specific training)과 병행하여 사용되는 조성물로서, DNA 메틸화(methylation) 저해제를 유효성분으로 포함하는 만성 뇌졸중 재활 보조제 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 DNA 메틸화(methylation) 저해제는 5-Aza-2′-데옥시시티딘(5-Aza-dC)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 DNA 메틸화(methylation) 저해제를 유효성분으로 포함하는 만성 뇌졸중 재활용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 뇌졸중 후 만성 기간에 대한 운동 기능 회복용 조성물에 있어서, 작업 특이 훈련(task-specific training)과 병행하여 사용되는 조성물로서, DNA 메틸화(methylation) 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 후 만성 기간에 대한 운동 기능 회복용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 만성 뇌졸중의 운동 경로의 신경 가소성을 촉진하는 조성물에 있어서, 작업 특이 훈련(task-specific training)과 병행하여 사용되는 조성물로서, DNA 메틸화(methylation) 저해제를 유효성분으로 포함하는 만성 뇌졸중의 운동 경로의 신경 가소성 촉진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 작업 특이 훈련(task-specific training)과 DNA 메틸화(methylation) 저해제를 병행하여 사용되는 조성물로서, 대측성 피질 내 성숙 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor)의 레벨은 증가시키는 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는,멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액,말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.1ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

기능적인 측면 및 뇌 손상을 포함한 뇌졸중 후 장기간 변화

뇌졸중 후 2-3개월 동안 재활 치료의 효과를 확인하기 위하여 본 발명자들은 심한 뇌졸중 후 초기에서 만성 기간 동안(뇌졸중 1일부터 12주까지) 경색(infarction) 부피, 운동 기능 및 mNSS(modified neurological severity score) 변화를 평가하였다. 경색의 면적은 선조체, 운동 피질 및 감각운동 피질에 주목하였다. 경색 부피는 도 1A에 나타내었다.

광화학적 허혈증을 가진 랫트에서 경색 부피의 평균값은 뇌졸중 후 1일 및 1, 2, 4, 6, 8, 및 12 주에서 79.16±5.16 mm³ 이었다(n = 6 per group). 운동 측면은 mNSS을 사용하여 랫트에서 평가하였다. 높은 스코어는 랫트가 더 심한 신경적 손상을 입었다는 것을 나타낸다. 비록 mNSS가 뇌졸중 2 주후에 크게 감소하였지만(p < 0.01, n = 10,도 1C), 그 후에 변화없이 유지되었다(도 1C). 계단(Staircase) 테스트는 랫트가 뇌졸중 12 주후에 현저하게 손상된 기능적 측면을 가진다는 것을 나타낸다(p < 0.001,n = 10,도 1D). 허혈성 손상은 대조군 동물과 비교하여 섭취에 성공한 펠렛의 수에서 현저한 감소를 야기하고 뇌졸중 후의 시간 간의 차이는 없었다(p > 0.05, n = 10,도 1D).

중증 뇌졸중 후 만성 기간 동안 대측성 및 동측성 (Contralateral and Ipsilateral)DNA 메틸화의 증가

뇌졸중 후 대측성 및 동측성 피질에서 전체 DNA methylation의 레벨을 5-methylcytosine (5-mc)로 검출하였다. 본 발명자들은 대조군과 비교하여 대측성 피질 및 동측성 경색 부위 주변 면적 모두에서 뇌졸중 후 1에서 12 주 후(만성 기간) 동안 전체 DNA 메틸화 수준이 크게 증가한 것을 발견하였다(p < 0.01, n = 6,도 2). DNA 메틸화 레벨은 대측성 및 동측성 뇌 피질에서 뇌졸중 1주 후에 가장 높았으며 1주일과 비교하여 대측성 피질에서는 2, 4, 8, 및 12 주에 그리고 동측성 피질에서는 4 및 8 주에서 감소하였다. 뇌졸중 후 동측성 및 대측성 피질 간 5-mc 레벨은 뇌졸중 1 및 4 주에서는 차이가 있으나 8주 및 12 주 사이에는 큰 차이가 없었다(p < 0.05, n = 6,도 2).

본 발명자들은 대측성 DNA 메틸화 레벨의 조절 및 TST는 뇌졸중 후 만성 기간에 운동 회복에 기여할 것이라고 가정하였다. TST 및 DNA methyltransferase (DNMT) inhibitor 5-Aza-2′(5-Aza-dC)의 효과를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 광화학적 허혈성 뇌졸중이 유발된 편측성 병변을 가지는 랫트에 손상쪽 상지의 TST를 수행시켰으며, 대측성 병변 피질에 5-Aza-dC를 처리하였다.

상세한 실험 계획은 도 3A에 나타낸다. 본 발명자들은 먼저 뇌졸중 후 대측성 피질의 5-Aza-dC 처리 후 DNA 메틸화 레벨 및 DNMT1, DNMT3a, 및 DNMT3b 발현에서 변화의 존재를 확인하였다. 본 발명자들은 뇌졸중 대조군(S) 및 TST-치료된 뇌졸중 그룹(SR)의 대측성 피질 뉴런에서 5-mc의 증가된 레벨을 관찰하였고, 5-Aza-dC 처리된 뇌졸중 그룹(SA) 및 TST와 5-AzadC 병용 처리 뇌졸중 그룹(SAR)에서는 감소된 것을 관찰하였다(p < 0.001, n =6,도 3B,C). 뇌졸중 후 대측성 피질에서 DNMT3a, DNMT3b, 및 DNMT1의 레벨은 크게 증가하였다(p < 0.001, n = 6, 도 3D-G). 이 증가된 레벨은 SA 및 SAR 그룹에서 감소되었다(p < 0.05, n = 6, 도 3D-G).

경색 부피는 중증성 뇌졸중 후 만성 기간에서 5- Aza -dc를 포함하거나 포함하지 않는 TST에 의하여 변화되지 않음

허혈성 손상에 대한 TST 및 5-Aza-dC의 효과를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 Nissl 염색을 사용하여 경색 부피를 조사하였다. SR, SA, 및 SAR 그룹에서 경색 부피는 뇌졸중 대조군(S)에서 관찰된 것과 차이가 없었다(p = 0.895, n = 6,도 4A, 4B)

TST와 결합된 5- Aza -dC는 중증 뇌졸중 후 만성 기간에 대한 운동 기능의 회복을 개선함

본 발명자들은 Montoya staircase test, mNSS, 및 실린더 테스트를 사용하여 운동 회복 및 신경학적 기능을 조사하였다(도 5).

Montoya 계단 테스트

Montoya staircase test는 중증 뇌졸중에 의하여 손상된 상지의 뻗기 및 잡기 기술(reaching and grasping skills)의 회복을 평가하는데 사용된다. 실험 동물에 18개의사료 펠렛을 주고 소비된 펠렛의 수를 확인하였다.도 5A는 실험 과정을 통하여 성공한 도달의 결과를 보여준다. 도달 성공은 병변이 일어난 상지의하여 회수되고 섭취된 펠렛의 수로서 평가하였다. 반복 측정된 two-way ANOVA에서 그룹간의 현저한 효과(F4,55 = 140.8; p < 0.001) 및 시간(F2,55 = 17.45; p < 0.001), 그리고 그룹과 시간 사이의 현저한 상호작용(F8,112 = 7.097; p < 0.001)을 검출하였다. 뇌졸중 대조군(S)은 도달 성공에서 심한 손상을 나타내었다(p < 0.001, n = 12,도 5A). 뇌졸중 후 TST를 받은 SR group 및 뇌졸중 후 TST 및 5-Aza-dC를 모두 받은 SAR 군은 S 그룹과 비교하여 유의적인 개선을 나타내었다(p < 0.001, n = 12,도 5A). SAR 그룹은 SR 그룹과 비교하여 수행에서 더 큰 개선을 나타내었다(p < 0.01, n = 12,도 5A). S 및 단지 5-Aza-dC를 받은 SA 그룹 사이에는 차이가 없었다.

mNSS

SR 및 SAR 그룹은 뇌졸중 4 주 후에서 S 그룹과 비교하여 mNSS에서 현저한 개선을 나타내었다. 반복 측정된 two-way ANOVA에서 시간(F3,44 = 33.38; p < 0.001) 및 그룹과 시간 사이의 상호작용(F6,88 = 2.944; p < 0.05)의 현저한 효과가 검출되었다. 뇌졸중 4주 후 TST (SR) 및 TST와 5-Aza-dC 병용 처리 군(SAR)은 현저한 개선을 나타내었다(p < 0.05, n = 12) (도 5B).

실린더 테스트

뇌졸중 4주 후에 SR 및 SAR 그룹에서 손상된 상지의 감소된 사용이 개선되었다(도 5C). ANOVA에서 그룹의 유의적인 주된 효과가 검출되었다 (F4,55 = 9.228; p < 0.001).

TST와 Aza -dC 병용 처리는 운동 경로의 신경 가소성을 촉진

먼저 본 발명자들은 뇌졸중 랫트에서 TST 및 5-Aza-dC 처리가 CST 섬유의 형성에 영향을 미치는지를 조사하였다. CST의 추적에서 대비병변(contralesional)의 RN으로부터 교차 섬유의 수가 SR 및 SAR 그룹에서 현저하게 증가하였다(도 6B). 정량적 데이터는 뇌졸중(S) 그룹과 비교하여 SR 및 SAR 그룹의 RN에서 교차 섬유의 평균수가 각각 251.32% ±8.37% 및 288.93%±24.69% 증가하였다 (p < 0.05, n = 6,도 6B); 반면 뇌졸중 후 SA 그룹에서는 현저한 감소가 관찰되었다(p < 0.05, n = 6,도 6B). SAR 그룹은 SR 그룹과 비교하여 교차 섬유의 수에서 증가를 나타내었다 (p < 0.001, n = 6,도 6B). 다음, 본 발명자들은 RF에서 허혈측을 향한 중간선을 교차하는 BDA-labeled CST 섬유를 정량화하였다(도 6C). 연수부위의 수체로부터 RF(망상체)로 향하는 교차 섬유가 증가하였다. 교차 섬유와 관련하여, one-way ANOVA를 사용한 통계분석에서 BDA-labeled 섬유가 TST 및 5-Aza-dC와 TST 병용처리 후 S 그룹과 비교하여 각각 146.18%±9.20% 및 197.84% ±7.45% 증가함을 나타내었다(p < 0.001, n = 6,도 6C). SAR 그룹에서 이들 섬유의 수는 뇌졸중 후 SR 그룹에서 관찰된 것에 비하여 현저하게 높았다(p < 0.001, n = 6,도 6C). 척수의 등과 옆 부분(dorsolateral parts of the spinal cord; dlCST)에서 섬유는 S 그룹과 비교하여 SR 및 SAR 그룹에서 각각 166.68% ±9.30% 및 221.68% ±9.83% 증가하였다(p < 0.01, n = 6,도 6D). SR 및 SAR 그룹에서 등 CST로부터 유래한 동측(ipsilateral) 회질에서 CST 섬유는 S 그룹과 비교하여 각각 150.60% ±16.22% 및 225.08% ±9.78% 증가하였다(p < 0.01, n = 6,도 6E).

대측성 피질 내 mature BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)의 레벨은 TST 치료와 결합된5 - Aza -dc 에 의하여 증가함

본 발명자들은 대비병변 피질 조직 유래 단백질 추출물을 면역블럿하였다. 대비병변에서 proBDNF (BDNF 전구체) 레벨은 대조군과 비교하여 S 및 SR 그룹에서 증가하였다 (p < 0.001,도 7A,B). 그러나, mature BDNF 레벨 (mBDNF, 성숙 BDNF)은 대조군과 비교하여 S, SR, SA, 및 SAR 그룹에서 더 높았다(p < 0.001, n = 6,도 7A,C). SR 및 SAR 그룹은 S 그룹과 비교하여 mBDNF 발현에서 증가를 나타내었다(도 7A,C).

Mature BDNF 레벨은 SAR 그룹에서 더 높았다(도 7A,C). 다음으로 본 발명자들은 뇌에서 proBDNF의 성숙 BDNF로의 가공에 관여하는 세포내(furin) 및 세포외 tPA(tissue plasminogen activator) 프로테아제의 발현에 대한 TST 및 5-Aza-dC의 효과를 조사하였다. 대비병변 피질에서 Furin 및 tPA 발현은 뇌졸중 후 S, SR, SA, 및 SAR 그룹에서 크게 증가하였다 (p < 0.05, n = 6,도 7A,D,E). 본 발명자들은 그룹간 furin 또는 tPA 및 proBDNF의 비율을 측정하고 비교하였다. furin 대 proBDNF의 비율은 S, SR, SA, 및 SAR 그룹에서 크게 증가하였다. SAR 그룹에서 관찰된 비율은 S 또는 SR 그룹에서 검출된 것보다 더 높았다(p < 0.001, n = 6,도 7F). tPA 대 proBDNF의 비율은 대조군과 비교하여 SR, SA, 및 SAR 그룹에서 더 높았다. SA 및 SAR 그룹은 SR 그룹 대비 비율에서 큰 증가를 나타내었다(p < 0.01; p < 0.001, n = 6,도 7G).

본 발명에 사용된 약어의 Full name은 아래 표1과 같다.

TST	Task specific training
DNMTs	DNA methyltransferases
5-mc	5-methylcytosine
mNSS	Modified neurological severity score
5-Aza-dC	5-aza-2′
C	Sham Control group
S	Stroke group
SA	5-Aza-dC treated stroke group
SR	TST treated stroke group
SAR	5-Aza-dC combined with TST treated stroke group
ANOVA	Analysis of variance
RN	Red nucleus
RF	Reticular formation
CST	Corticospinal tract
BDA	Biotinylated dextran amine
dlCST	Dorsolateral parts of the spinal cord
Pro-BDNF	Pro-brain-derived neurotrophic factor
mBDNF	Mature BDNF
t-PA	Tissue plasminogen activator

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 뇌졸중 후 TST 및 5-Aza-dC 병합 치료는 뇌졸중의 만성 기간에서 기능의 회복을 촉진하는 우수한 치료방안이라는 것을 알 수 있다.

도 1은 광화학적 허혈성 뇌졸중 후 급성에서 만성 단계로 경색 부피 및 운동 기능의 평가에 대한 그림:
(A) 뇌졸중 후 몇 특정 시간에서 Nissl-염색된 절편의 광원 현미경 사진;
(B) 경색 크기의 정량화는 뇌졸중 후 시간 간의 차이가 없었다. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 6;
(C) 변화된 NSS 레벨은 뇌졸중 2주 후 다소 개선되었고 12주까지 계속되었다. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 10. ** p < 0.01 vs.;
(D) 운동 기능 손상은 뇌졸중 12주 동안 유지되었다. 계단 테스트의 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 10. *** p < 0.001 vs. 샴 대조군(C). 스케일 바 = 5 mm.
도 2는 뇌졸중 후 병변 대비측 및 손상측(contralesional and ipsilesional) 피질에서 5-mc(5-methylcytosine)의 위치를 나타낸 그림.
(A) 형광 공초점 현미경 분석을 통해 뇌졸중 1에서 12주에 5-mc (녹색)가 대측성(contra) 및 동측성(Ipsi) 피질 모두에서 주로 위치한다는 것을 보여줌;
(B) 5-mc 레벨을 정량화한 결과 광화학적 허혈성 뇌졸중 후 증가함. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 6. ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs sham 대조군
(C); # p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 vs. 뇌졸중 1일 후; @ p < 0.05, @@ p < 0.01 vs 각 시간에 대측성 값. 스케일 바= 50 μm.
도 3은 뇌졸중 후 대비병변 피질에서 5 mc, Dnmt3a, Dnmt3b, 및 Dnmt1의 발현 측정 실험.
(A) 만성 뇌졸중의 기능 회복에 대한 TST 및 DNMT 저해제 투여 효과에 대한 연구를 위하여, sham 대조군 (C) 및 TST를 하거나 하지 않은 뇌졸중 랫트(S 또는 SR) 그리고 5-Aza-dC를 처리하거나 하지 않은 랫트 (SA 또는 SAR)를 행동 테스트, 신경 가소성 단백질 발현 및 면역조직화학적 분석에 사용하였다;
(B) 뇌졸중 후 대비병변 피질에서 5-mc (green)와 NeuN (red)의 단독 발현 변화 및 5-mc 와 NeuN이 함께 발현되는 세포(yellow) 및 D) Dnmt3a, Dnmt3b, 또는 Dnmt1 면역염색의 대표적인 광학현미경 사진;
(C,E-G) 5-mc, Dnmt3a, Dnmt3b, 또는 Dnmt1가 발현된 세포의 수 측정. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 6/group. *** p < 0.001 vs. C, ## p < 0.01; ### p < 0.001 vs. S, 스케일 바 = 20 μm.
도 4는 광화학적 허혈성 뇌졸중 후 경색 볼륨에 대한 TST 및 5-Aza-dC 처리의 효과를 나타낸 그림.
(A) 뇌졸중 후 처리 4주 후 Nissl-염색된 절편의 대표적 광학현미경 사진;
(B) 경색 크기의 정량화는 photothrombic 허혈성 뇌졸중 후 처리 그룹에서 차이가 없었음. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 6. 스케일 바 = 5 mm.
도 5는 광화학적 허혈성 만성 뇌졸중 후 TST 및 5-Azd-dC 처리에 대한 운동 기능 회복을 나타낸 그림. TST 및 TST와 5-Aza-dC 병합 처리는 뇌졸중 후 운동기능의 회복을 개선시킴;
계단 테스트(A) 및 mNSS (B), 손상된 팔다리의 사용 스코어(C). TST와 5-Aza-dC 병합 처리는 계단 테스트 수행에서 알 수 있는 바와 같이 운동 회복을 증가시켰다(A). Pre는 뇌졸중 후 재활치료 시작 1일 전을 나타냄. ** p < 0.01; ***p < 0.001 vs. C (sham 대조군), # p < 0.05; ## p < 0.01, ### p < 0.001 vs. S (뇌졸중). @ p < 0.05 vs. SR (TST 처리된 뇌졸중. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 12/group. Lt. paw: 손상된 좌측 발.
도 6은 TST 및 TST와 결합된 5-Aza-C 처리가 만성 뇌졸중에서 대비병변 CST의 가소성을 촉진한다는 것을 보여주는 그림.
(A) 대비병변 RN(red nucleus), 연수 내 망양체(RF), 후외 척수 신경로(dorsolateral spinal tract;dlCST) 및 척수 내 손상 동측 회백질을 포함하는 CST의 도식적 그림. 굵은 사각 박스는 본 발명에서 CST 가소성을 위한 분석면적을 나타냄;
(B-E) 대비병변 RN, 연수 내 RF, dlCST 및 척수 절편의 손상측 회백질에서 BDA 염색의 광학현미경 사진.
(B,C) RN 및 RF의 점선은 중뇌의 정중선을 나타냄;
(E) 정중선-교차 섬유는 검은 화살표로 나타냄. dCST: dorsal CST; dlCST: dorsolateral CST; vCST: ventral CST. 스케일 바 = 50 μm. RN (B), RF (C), dlCST (D), 및 척수의 회백질(E)에서 BDA-양성 축색돌기 교차 섬유의 평균 밀도를 sham 대조군(C)의 % 증가로 보여줌. 결과는 평균±SEM로 나타냄. n = 6. 유의성은 * p < 0.05; *** p < 0.001 vs. sham 대조군(C)으로 기재, # p < 0.05; ## p<0.01; ### p < 0.001 vs. Stroke (S), @@@ p < 0.001 vs. SR.
도 7은 뇌졸중 후 대비병변 피질의 단백질 추출물에서 mature BDNF의 발현에 대한 TST 및 TST와 5-Aza-dC 병합처리의 효과를 나타냄.
(A) 뇌졸중 후 4주 동안 처리한 후 얻은 대비병변 피질의 전체 파쇄액에서 proBDNF, mBDNF, furin, tPA 및 베타-액틴 단백질에 대한 웨스턴블럿의 대표적인 사진.
(B-E) proBDNF, mBDNF, furin 및 tPA의 발현 강도는 Quantity One software를 사용하여 측정하였고 대조군의 퍼센트로 나타냄.
(F, G) furin 대 proBDNF 및 tPA 대 proBDNF의 비율의 발현 강도를 대조군의 퍼센트로 나타냄. Beta-actin, 내부 대조군. 결과는 평균±SEM로 나타냄, n = 6. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs. C, # p < 0.05; ## p < 0.01; ### p < 0.001 vs. S, @@@ p < 0.001 vs. SR.

본 발명에서는 총 142 수컷 Wistar 랫트(8 주령, Orent Bio Inc., Seongnam, Korea; 24 sham 대조군 (C) 및 118 광화학적-뇌졸중 랫트, Stroke)를 사용하였다. 실험 동물은 온도 조절 룸(23±0.5℃에서 노출시켰다. 모든 실험과정은 건국대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 받았다(Permit Number: KU17042, March 21, 2017). 마취 등을 포함하는 동물 케어는 Principle of Laboratory Animal Care (NIH publication No. 85-23, revised 1985)에 따라 수행하였다.

실시예 1:광화학적 허혈증 수술

대뇌 피질 경색은 Rose Bengal 처리 후에 빛을 감각 운동 및 운동 피질 상으로 투사하여 만들었다. 방법을 간단하게 요약하면, 랫트를 ketamine (50 mg/kg) 및 xylazine (5 mg/kg)의 혼합물로 복강내 주사하여 마취시키고 고정된 침대 프레임에 위치시켰다.

두개골을 노출시키고 4 mm caliber KL1500 LCD 냉광원(Carl Zeiss, Jena, Germany)의 섬유 다발을 두개골의 전두천문부(bregma)에 위치시키고 우측 감각 운동의 정중선 4.0 mm 측면에 위치시켰다. 광화학적 염료 Rose Bengal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 i.p. 주사로 투여하였다. 주사 5분 후(20 mg/kg), 빛을 30분간 조사하였다. Sham 대조군 동물은 Rose Bengal의 주사없이 30분간 빛을 조사하였다.

실시예 2: 동물 그룹화

80 마리 랫트중, 70 마리는 허혈성 뇌졸중 수술을 수행하고, 70 마리의 생존 동물을 뇌졸중 후 1 일, 1 주, 2, 4, 6, 8, 및 12 주로 동일하게 분류하였다(n = 10 rats/group). 10 sham 대조군은 광원에 노출한 것만을 제외하고는 유사하게 처리하였다. 재활 치료 연구에서, 60 마리의 랫트를 사용하였으며, 12마리는 sham 대조군 수술을 수행하고, 나머지 48마리는 광화학적 허혈성 뇌졸중 수술을 수행하였다. 광화학적 허혈성 수술을 수행한 랫트중 24마리의 랫트는 삼투압 미니펌프를 사용하여 5-Aza-dC (10ug/day, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 주사하였다. 3일 후, 5-Aza-dC 처리된 24마리의 뇌졸중 랫트 중12 마리에TST(task-specific training)를 제공하였다. 12마리 뇌졸중 랫트 및 12마리 sham 대조군 랫트는 5-Azd-dC 또는 TST를 처리하지 않았다. 모든 실험 그룹의 처리 그룹은 모두 랜덤하게 할당하였다: sham 대조군(C, n = 12), 뇌졸중 대조군(S, n = 12), TST-처리된 뇌졸중 랫트(SR, n = 12), 5-Aza-d-C 처리된 랫트(SA, n = 12), TST 및 5-Aza-dC 동시 처리된 뇌졸중 랫트(SAR, n = 12). 동물들은 숫자로 암호화하였고 조사자들은 데이터 분석의 끝까지 처리 군에 대해서 암맹평가 하였다.

실시예 3: 대측성 운동 피질 부위에 5- Aza -dC의 투여

5-Aza-dC (10 ug/day)를 28일 동안 삼투압 펌프시스템을 사용하여 대비병변 반구의 감각운동 피질로에 투여시켰다. 삼투압 미니 펌프에 5-Aza-dC 충진을 위하여 이식 수술 2일전에 0.9% 식염수를 포함하는 15ml 코니컬 튜브에 3% DMSO 용액에 녹인 10 mg 5-Aza-dC 200 ul를 넣은 후 삼투 미니펌프(0.25 ug/h, 200 ul volume, model 2004, Alzet, USA)를 넣어 37 ℃배양기에서 전처리하였다.

동물을 ketamine (50 mg/kg) 및 xylazine (5 mg/kg)의 혼합물로 복강내 주사하여 마취시키고 고정된 stereotaxic 프레임(Stoelting Co., Wood Dale, IL, Cupertino, CA, USA)고정된 침대 프레임에 위치시켰다.

두개골을 노출시키고 튜브를 통하여 삼투 펌프와 연결된 캐눌라(Brain infusion kit3, Alzet, Cupertino, CA,USA)를 대비병변 반구의 감각운동 피질(ML 2, AP 0.5, DV-2) 상에 이식하였다. 나사(2 mm diameter)를 두개골에 박아서 이식체를 보호하였으며, 그 후 덴탈 시멘트(Poly-F standard kit, Dentsply, York, PA, USA)를 두개골 위에 도포하였다. 삼투 미니펌프를 각 랫트의 등의 피하로 위치시킨다.

실시예 4: 작업 특히 훈련(Task-Specific Training)

광화학적 뇌졸중 유도 9 주 후, 5-Aza-dC를 운반하는 삼투 펌프를 이식하였으며, 수술후 회복을 위해 3일 후 재활 훈련을 시작하였다. 동물 처리 군은 랜덤화하였다: sham 대조군(C, n = 12), 뇌졸중 대조군 (S, n = 12), 작업 특이 훈련을 받는 뇌졸중 군(SR, n = 12), 5-aza-d-C를 투여한 뇌졸중 군(SA, n = 12), TST와 5-aza-dC와 결합된 뇌졸중 군(SAR, n = 12). 작업 특이 훈련(TST)은 Choi, D.H.; 외 BMB Rep 2016, 49, 635-640 기재된 것과 같이 4주간 수행하였다.

실시예 5: 계단 테스트

수술 8주 후부터 훈련을 시작하고 동물은 1주일간 매일 핸들링을 받았다. 그들은 계단 훈련 동안 2주간 제한급식하였다 (매일 2회 시도, 각 15 min). 그리고 체중은 매일 체크하였다; 체중은 시작 체중의 85% 미만으로 감소되지는 않았다. 동물을 Choi, D.H.; 외 BMB Rep 2016, 49, 635-640 기재된 것에 따라서 변형된 계단 장치 (각 사이드 상 6 스텝에 스텝 당 3 펠렛)에서 상지를 이용하여 사료 펠렛에 도달하게 훈련시키고, 섭취한 펠렛의 총수를 계수하였다. 수행 스코어를 공식에 따라 계산하였다: 섭취한 펠렛의 수/펠렛의 전체 수.

실시예 6; 변형된 신경학적 중증도 스코어

동물을 재활 하루 전 및 재활 후 1,2,3 및 4주에 변형된 신경학적 중증도 스코어(modified neurological severity score;mNSS)를 조사하였다. 이 평가는 조사자에 의하여 암맹평가되었다. mNSS는 운동, 감각, 반사 및 균형 테스트로 구성되었다. 스코어는 0에서 최대 14 범위이었다.

실시예 7: 실린더 테스트(비대칭적 앞다리 사용)

동물을 유리 플레이트와 캠코더가 구비된 투명 Plexiglas 실린더(diameter 20 mm)에 위치시켰다. 싱글(동측성 및 대측성) 및 양쪽 앞다리 벽 접촉을 5분간 기록(또는 15 벽 접촉때가지 관찰).

대측성 앞다리 사용은 아래수식에 의한 계산값으로 나타내었다: ([대측성 앞다리 접촉 + 0.5 X 양쪽 앞다리 접촉]/앞다리 접촉의 총 수) X100.

실시예 8: 비디오 기록

광화학적 허혈증 후 재활 하루 전 및 훈련 또는 5-Aza-dC 처리 1, 2, 3 및 4 주 후에 Sony HDR-CX350 Handycam (Tokyo, Japan)를 사용하여 촬영하였다. 동물을 앞 및 배쪽에서 촬영하였다. 촬영영상은 Sony DV cam HDR-CX350 player로 보았다. 대표적인 이동을 GOM Player v2.3 (Seoul, South Korea) 프로그램에서 Windows 10 computer를 사용하여 캡쳐하였다.

실시예 9: Nissle 염색

랫트(n = 6/group)를 ketamine (50 mg/kg) 및 xylazine (5 mg/kg) (ip) 혼합액으로 마취시키고0.5% sodium nitrite 및 10 U/mL heparin sulfate를 함유한 식염수를 투여하여 뇌관류 시킨 후 4% formaldehyde를 함유한 0.1 M PBS (pH 7.2) 냉장 고정 용액으로 관류하고 동일한 용액으로 밤새 후고정하였고 30% sucrose를 스며들였다. 저온유지장치를 사용하여, 정수리점 유래 부유 절편(40 um)을 얻어서 유리 슬라이드에 마운트하고 Nissl로 염색하였다.

실시예 10: 경색볼륨의 측정

Nissl 염색된 절편을 사용하여, 경색 볼륨(총 피질 및 추방 피질)을 이미지 분석 소프트웨어(Image J v1.3 (Bethesda, Maryland, USA), NIH)를 사용하여 정량화하고 하기 식에 따라서 뇌부종을 측정하였다: CIV = (LHA - RHA - RIA) x 두께, CIV는 보정된 경색 볼륨, LHA는 좌측 반구, RHA는 우측 반구, RIA는 우측 반구 경색 면적. 전체 경색 크기는 각 개별 뇌 절편 사이의 너비 및 보정된 경색 면적을 사용하여 평가하였다.

실시예 11: Biotinylated Dextran Amine을 사용한 CST 프로젝션

biotinylated dextran amine (BDA)를 영구적인 국소 뇌 허혈증을 유발시킨 랫트에서 뇌졸중의 추체로(pyramidal tract) 가소성을 평가하는데 사용하였다 . 1%의 BDA를 광화학적 허혈성 랫트(n = 6/group)에서 재활치료 4주 후 운동 피질로 주사하였다, BDA 주사 10일 후, 랫트를 마취시키고 BDA를 대측성 부위의 운동 피질에 주사하였다(coordinate: AP, -1.5, 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 mm; ML 1.5, 2.0, 1.8, 2.5, 2.5, 2.5, 3 mm; dorsoventral (DV), -1.5 mm). 냉장 멸균 PBS 내 BDA 주사제를 각 투여 부위에 1 ul씩 모든 동물에 사용하였고, 주사 속도는 0.2 ul/min이었고, BDA를 면역조직염색으로 확인하였다.

실시예 12; 면역조직화학 염색

RN(red nucleus) 및 피라미드(AP에서 -8.72에서 -11.60 mm), 및 척수(SP)를 포함하는 뇌의 40um 두께 두정부 냉동절편 각 6장씩을 BDA 표지를 검출하는데 사용하였다. 요약하면, 자유 부유 절편을 0.3% H₂O₂ in 0.1 M PBS, pH 7.4로 20분간 배양하고 0.1 M PBS로 세척한 후, 5% 정상 말 혈청 및 0.3% Triton X-100을 포함하는 0.1 M PBS에서 1시간 배양하였다. 그 절편들을 avidin-biotin-peroxidase 복합체(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 가 함유된 PBS/TritonX-100 용액으로 4 ℃에서 3일간 배양하고 BDA 표지를 0.05% 3,3′iaminobenzidine 및 0.003% H₂O₂ (Vector Laboratories)으로 발색한 후 광원 현미경 하에서 관찰하였다.

실시예 13: 웨스턴 블럿 분석

PBS로 세척한 대비병변 피질을 포로테이즈 저해제 및 포스파타제 저해제를 포함하는 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.25% Na-deoxycholate, 및 0.1% SDS)내에서 파쇄하였다. 30 ug의 가용성 단백질을 SDS-PAGE하고 PVDF 막 상으로 전기이동하였다. 특정 단백질 밴드들을 특정 항체(BDNF, tPA, furin: Santa Cruz biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA, 및 β-액틴:Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 enhanced 화학발광액을 사용하여 검출하였다.

실시예 14: 조직의 이중 형광 면역염색

자유 부유 절편들(40 ㎛)을 5% 정상 donkey 혈청 및 0.3% Triton X-100을 함유한 0.1 M PBS에서 1시간 동안 배양하고 특정 1차 항체들(NeuN: Millipore, Burlington, MA, USA, 5-mc: Active Motif, Carlsbad, CA, USA, Dnmt3a, Dnmt3b, and Dnmt 1: Santa Cruz biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA)로 4 ℃에서 오버나잇 배양하고 1:200 희석의 Alexa Fluor-conjugated donkey anti-rabbit (488) 또는 donkey anti-mouse (546) 항체 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)로 상온에서 1시간 동안 배양하고 Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 유리 슬라이드 상에 마운트하였다. 형광 신호들을 공초점 현미경(LSM 710, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 상에서 평가하였다.

실시예 15: 정량적 분석

그룹 당 6 마리 랫트 유래 피질 절편들을 분석하였다. 한 절편 당 0.1 mm² 다섯 관심 부위(ROIs)를 선택하였다. NeuN, 5 mc, DNMT1, DNMT3a, 및 DNMT3b-양성 세포의 수는 각 ROI에서 카운트하고 평균화하였다. 데이터는 전체 세포의 퍼센트로 나타내었다. 모든 정량적 분석은 암맹평가로 수행하였다.

실시예 16: CST 프로젝션의 분석

이미지들은 Axio Vision으로 10x 또는 20x 대물렌즈(Carl Zeiss, Jena, Germany)를 가지는 도립 광학 현미경에 부착된 CCD camera (Jena, Germany)를 사용하여 캡쳐하고 분석하였다. 축삭돌기 섬유의 평균 수를 자동화된 프로그램 위자드, 즉 Axio Vision의 'Measument' plug-in을 사용하였다. 허상은 대상의 선택된 그룹으로부터 수동으로 삭제하였다. 교차 축삭돌기 섬유(um²)의 수를 캡쳐된 이미지의 전체 면적에 기반하여 측정하였다. 각 그룹 당 다섯 캡쳐된 이미지들을 분석하였다.

Claims (10)

1. 5-Aza-2′-데옥시시티딘(5-Aza-dC)을 유효성분으로 포함하는 만성 뇌졸중의 치료용 조성물에 있어서, 뇌졸중 치료 대상에 상기 5-Aza-2′-데옥시시티딘(5-Aza-dC)을 작업 특이 훈련(task-specific training)과 병행하여 뇌졸중 유발 후 4주간 사용하는 경우에 상기 치료 대상에서 운동 기능이 회복되는 것을 특징으로 하는 만성 뇌졸중 치료용 조성물.
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