KR102209364B1 - T 세포 수용체를 시퀀싱하기 위한 시스템 및 방법 및 이의 용도 - Google Patents

T 세포 수용체를 시퀀싱하기 위한 시스템 및 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

짧은 리드를 사용하여 TCR 서열을 재구성, 추출 및/또는 분석할 수 있는 방법 및 시스템이 본원에 개시된다. 상기 방법 및 시스템은 단일 세포 시퀀싱 데이터 및 벌크 시퀀싱 데이터 모두에 적용될 수 있다.

Description

T 세포 수용체를 시퀀싱하기 위한 시스템 및 방법 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 12월 9일에 출원된 미국 가출원 제62/432,525호 및 2017년 5월 19일에 출원된 미국 가출원 제62/508,667호의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로서 본원에 통합된다.
본 발명은 일반적으로 생물정보학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하여 세포 집단에서 T 세포 클론을 식별하는 시스템 및 방법, 및 벌크 시퀀싱을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 종양 반응과 환자 생존에 연관된 고빈도의 T 세포 클론을 식별한다.
면역 관문 억제제를 사용하는 단일 요법이나 병용 요법은 암 환자에서 상당한 치료 효능을 나타냈다. 그러나 대부분의 환자들은 반응하지 않거나 일시적인 반응만을 보임으로써, 차세대 면역 요법의 설계에 대한 근본적인 질문이 제기된다. 종양 미세환경의 면역억제 성질을 극복하고 지속적인 반응을 촉진하기 위해서는, 더 강한 T 세포 활성화를 유도하는 공억제성 및 공자극성 경로의 이중 표적화를 수행할 수 있다. 일부 시나리오에서, 항체를 조합하는 것은, 예를 들어 항상성 조절자의 균형을 복원하는 것에 의해 CD8+ T 세포 작동기 기능을 상승적으로 향상시켜 종양 거부와 장기 반응을 만들어낼 수 있다. T 세포 클론의 증식은 병용 요법의 분자 메커니즘을 나타내는 특이적 유전자 표지(gene signature)를 제공할 수 있다. 기존의 TCR 서열 분석 기술로는 짧은 리드(read) 시퀀싱 데이터에 기초하여 TCR 서열 및 클론 증식을 정확하고 신뢰성 있게 식별할 수 없다. 이러한 단점 및 다른 단점들을 본원에 기술된 방법 및 시스템에 의해 해결한다.
본 발명은 상기 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하여 세포 집단에서 T 세포 클론을 식별하는 시스템 및 방법, 및 벌크 시퀀싱을 위한 시스템 및 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
이하의 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적이고 설명하기 위한 것일 뿐이며 제한적이지 않다는 것을 이해해야 한다. T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하고(및/또는 이를 나타내는 서열 데이터를 수신하고), 짧은 리드를 기준 서열(TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하고, 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하고, 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하여, 하나 이상의 긴 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 생성하는 방법 및 시스템이 제공된다.
T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법이 개시되며, 상기 방법은: T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계; 짧은 리드를 기준 서열(TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하는 단계; 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하는 단계; 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계; 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계; TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열을 약 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, k-스트링을 상기 번역 단계 유래의 상응 아미노산 서열과 정렬하고, k-스트링에서 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하는 단계; 하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하는 단계; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하는 단계; 및 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, TCR 서열을 생성하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 프로세서; 및 프로세서에서 실행 가능한 명령을 포함하는 메모리를 포함하는 장치가 개시되며, 명령이 하나 이상의 프로세서에 의해 수행될 때, 명령은 장치가: T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 포함하는 서열 데이터를 수신하고; 짧은 리드를 기준 서열(TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬시켜 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성시키고; 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하고; 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하고; 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하고; TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열을 약 6개의 아미노산 서열로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, k-스트링을 상기 번역 단계 유래의 상응 아미노산 서열과 정렬하고, k-스트링에서 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하고; 하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하고; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하고; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, TCR 서열을 생성하도록 한다.
컴퓨터에서 실행 가능한 명령이 구현된 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시되며, 상기 명령은 다음을 포함하는 방법을 수행하도록 구성된다: T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계; 짧은 리드를 기준 서열(TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하는 단계; 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하는 단계; 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계; 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계; TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열을 약 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, k-스트링을 상기 번역 단계 유래의 상응 아미노산 서열과 정렬하고, k-스트링에서 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하는 단계; 하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하는 단계; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하는 단계; 및 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, TCR 서열을 생성하는 단계.
BCR을 시퀀싱하기 위한 방법이 개시되며, 상기 방법은: B 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계; 짧은 리드를 기준 서열(BCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하는 단계; 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하는 단계; 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계; 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계; BCR V 영역 및 BCR J 영역 아미노산 기준 서열을 약 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, k-스트링을 상기 번역 단계 유래의 상응 아미노산 서열과 정렬하고, k-스트링에서 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 BCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하는 단계; 하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하는 단계; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하는 단계; 및 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, BCR 서열을 생성하는 단계를 포함한다.
하나 이상의 프로세서; 및 프로세서에서 실행 가능한 명령을 포함하는 메모리를 포함하는 장치가 개시되며, 명령이 하나 이상의 프로세서에 의해 수행될 때, 명령은 장치가: B 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 포함하는 서열 데이터를 수신하고; 짧은 리드를 기준 서열(BCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬시켜 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성시키고; 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하고; 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하고; 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하고; BCR V 영역 및 BCR J 영역 아미노산 기준 서열을 약 6개의 아미노산 서열로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, k-스트링을 상기 번역 단계 유래의 상응 아미노산 서열과 정렬하고, k-스트링에서 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 BCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하고; 하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하고; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하고; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, BCR 서열을 생성하도록 한다.
컴퓨터에서 실행 가능한 명령이 구현된 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시되며, 상기 명령은 다음을 포함하는 방법을 수행하도록 구성된다: B 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계; 짧은 리드를 기준 서열(BCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열)과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하는 단계; 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하는 단계; 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계; 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계; BCR V 영역 및 BCR J 영역 아미노산 기준 서열을 약 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, k-스트링을 상기 번역 단계 유래의 상응 아미노산 서열과 정렬하고, k-스트링에서 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 BCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하는 단계; 하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하는 단계; 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하는 단계; 및 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, BCR 서열을 생성하는 단계.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 짧은 리드는 RNA의 무작위 프라이밍으로부터 수득된다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, T 세포는 인간 또는 마우스로부터 수득된다.
개시된 방법, 장치 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 기준 서열은 인간 게놈, 마우스 게놈, 인간 전사체, 또는 마우스 전사체를 포함한다.
개시된 방법, 장치 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 맵핑된 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하는 단계는, 약 35 염기쌍 미만이거나 낮은 서열 해상도를 갖는 맵핑되지 않은 짧은 리드를 리드 세트로부터 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 TCR 서열의 기준 데이터베이스 유래의 하나 이상의 TCR 서열에 대해 정렬하는 단계; 및 정렬에 기초하여 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 긴 리드로 조립하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, TCR C 영역 핵산 서열을 TCR 서열에 첨부하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100개 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계 이전에, T 세포가 수득되는 대상체에게 면역 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다. 일부 양태에서, 면역 요법은 단일 요법 또는 병용 요법을 포함한다. 일부 양태에서, 병용 요법은 공자극 작용제 및 공억제 길항제를 포함한다.
일부 양태에서, 대상체의 제1 복수의 T 세포에 대해 모든 단계를 반복하되, T 세포는 치료제를 투여하기 전에 채취되는 단계; 제1 복수의 T 세포에 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수를 결정하는 단계; 대상체에 치료제를 투여하는 단계; 대상체의 제2 복수의 T 세포에 대해 모든 단계를 반복하되, T 세포는 치료제를 투여한 후에 채취되는 단계; 제2 복수의 T 세포에 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수를 결정하는 단계; 및 제1 복수의 T 세포 및 제2 복수의 T 세포에 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수에 기초하여, 클론 증식이 발생한 하나 이상의 고유 TCR 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, 클론 증식이 발생한 하나 이상의 고유 TCR 서열에 기초하여 T 세포 클론 증식 표지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, T 세포 클론 증식 표지의 데이터베이스를 쿼리하고 T 세포 클론 증식 표지를 사용해 상응하는 치료 반응을 쿼리하는 단계; 쿼리에 기초하여 치료에 대한 대상체의 반응 가능성(likelihood)을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, 치료에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계; T 세포 클론 증식 표지를 데이터베이스에 저장하는 단계; 및 치료에 대한 대상체의 반응을 데이터베이스에서 T 세포 클론 증식 표지와 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, 치료에 반응하여 증식하는 T 세포 클론에 TCR 서열이 존재하는 것을 결정하는 단계; TCR 서열을 함유하는 하나 이상의 T 세포를 생산하는 단계; 하나 이상의 T 세포를 대상체에 투여하는 단계; 및 치료제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계는 복수의 T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 벌크 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 단계를 통해 짧은 리드를 정렬하는 단계; 정렬 정도에 점수를 매기는 단계; 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, 복수의 T 세포 각각에 대한 TCR 서열을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 단계를 통해 짧은 리드를 정렬하는 단계; 정렬 정도에 점수를 매기는 단계; 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, TCR 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것을 포함하여, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 단계를 통해 짧은 리드를 정렬하는 단계; 정렬 정도에 점수를 매기는 단계; 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, 복수의 T 세포 각각에 대한 TCR 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것은, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 단계를 통해 짧은 리드를 정렬하는 단계, 정렬 정도에 점수를 매기는 단계, 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, TCR 서열을 생성하는 단계 중 하나 이상의 적어도 일부를 작업으로서 분류하는 단계; 및 복수의 프로세서에 걸쳐 각각의 작업에 대한 작업량(workload)을 병렬로 분배하는 단계를 포함한다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, B 세포는 인간 또는 마우스로부터 수득된다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 리드 세트에 남아 있는 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 BCR 서열의 기준 데이터베이스 유래의 하나 이상의 BCR 서열에 대해 정렬하는 단계; 및 정렬에 기초하여 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 긴 리드로 조립하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양태에서, BCR C 영역 핵산 서열을 BCR 서열에 첨부하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, B 세포로부터 수득된 RNA의 약 100개 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계 이전에, B 세포가 수득되는 대상체에게 면역 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다. 일부 양태에서, 면역 요법은 단일 요법 또는 병용 요법을 포함한다. 일부 양태에서, 병용 요법은 공자극 작용제 및 공억제 길항제를 포함한다.
일부 양태에서, 대상체의 제1 복수의 B 세포에 대해 모든 단계를 반복하되, B 세포는 치료제를 투여하기 전에 채취되는 단계; 제1 복수의 B 세포에 존재하는 고유 BCR 서열의 발생 회수를 결정하는 단계; 대상체에 치료제를 투여하는 단계; 대상체의 제2 복수의 B 세포에 대해 단계 a 내지 i를 반복하되, B 세포는 치료제를 투여한 후에 채취되는 단계; 제2 복수의 B 세포에 존재하는 고유 BCR 서열의 발생 회수를 결정하는 단계; 및 제1 복수의 B 세포 및 제2 복수의 B 세포에 존재하는 고유 BCR 서열의 발생 회수에 기초하여, 클론 증식이 발생한 하나 이상의 고유 BCR 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, 클론 증식이 발생한 하나 이상의 고유 BCR 서열에 기초하여 B 세포 클론 증식 표지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, B 세포 클론 증식 표지의 데이터베이스를 쿼리하고 B 세포 클론 증식 표지를 사용해 상응하는 치료 반응을 쿼리하는 단계; 쿼리에 기초하여 치료에 대한 대상체의 반응 가능성(likelihood)을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, 치료에 대한 대상체의 반응을 결정하는 단계; B 세포 클론 증식 표지를 데이터베이스에 저장하는 단계; 및 치료에 대한 대상체의 반응을 데이터베이스에서 B 세포 클론 증식 표지와 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
일부 양태에서, 치료에 반응하여 증식하는 B 세포 클론에 BCR 서열이 존재하는 것을 결정하는 단계; BCR 서열을 함유하는 하나 이상의 B 세포를 생산하는 단계; 하나 이상의 B 세포를 대상체에 투여하는 단계; 및 치료제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, B 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계는 복수의 B 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 벌크 시퀀싱하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 것을 통해 짧은 리드를 기준 서열과 정렬하는 단계; 정렬 정도에 점수를 매기는 단계; 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, 복수의 B 세포 각각에 대한 BCR 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체가 개시된다.
개시된 방법, 장치, 및 컴퓨터 판독 가능 매체의 일부 양태에서, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 것을 통해 짧은 리드를 기준 서열과 정렬하는 단계; 정렬 정도에 점수를 매기는 단계; 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, TCR 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것을 포함하여, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 것을 통해 짧은 리드를 기준 서열과 정렬하는 단계; 정렬 정도에 점수를 매기는 단계; 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, 복수의 B 세포 각각에 대한 BCR 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것은, 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에서 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열을 하나 이상의 BCR J 유전자 기준 서열과 정렬하는 단계를 통해 짧은 리드를 기준 서열과 정렬하는 단계, 정렬 정도에 점수를 매기는 단계, 및 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드를 후보 BCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별함으로써, BCR 서열을 생성하는 단계 중 하나 이상의 적어도 일부를 작업으로서 분류하는 단계; 및 복수의 프로세서에 걸쳐 각각의 작업에 대한 작업량(workload)을 병렬로 분배하는 단계를 포함한다.
추가적인 이점은 하기와 같이 본 명세서에 부분적으로 제시되거나 실시를 통해 알 수 있을 것이다. 이점은 첨부된 청구범위에 특별히 언급된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
상기한 바와 같이 구성되는 본 발명은 T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하여 세포 집단에서 T 세포 클론을 식별하는 시스템 및 방법, 및 벌크 시퀀싱을 위한 시스템 및 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 구현예를 도시하며, 본 명에서와 함께 방법 및 시스템의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 짧은 리드를 무작위로 시퀀싱하고 맵핑되지 않는 리드를 음성 선별하여 TCR CDR3 서열을 식별하는 방법을 도시하는 흐름도이다.
도 2는 치료 후 종양내 CD8+ T 세포에서의 유의한 클론 증식을 도시한다.
도 3은 단일 요법과 비교해 aGITR/aPD1 병용 치료 후 종양 내 CD8+ T 세포에서의 유의한 클론 증식을 도시하는 막대 차트이다.
도 4는 단일 T 세포 시퀀싱을 사용하여 관찰한 클론 증식 후의 T 세포 계통을 도시한다.
도 5는 단일 세포 분류된 RNAseq 데이터에 기초한 종양내 CD8 T 세포 클론 분석을 도시한다.
도 6a 내지 도 6d는 종양 유래 TCR에 대한 T 세포 활성화 분석을 도시한다.
도 7a 내지 도 7b는 단일 T 세포 전사체의 유전자 발현 분석을 도시한다.
도 8은 예시적인 작동 환경을 도시한다.
도 9a 내지 도9e는 병용 요법이 종양내 고빈도 CD8+ T 세포 클론을 증식시킨다는 것을 보여주는 도면들로서,
도 9a는 종양 면역 요법 및 단일 세포 분류 연구 설계의 개략도.
도 9b는 종양 접종 후 8 및 11일차에 단일 세포 분류된 RNAseq 데이터에 기초한 종양내 CD8+ T 세포 클론 분석. 각각의 원은 단일 CD8+ T 세포를 나타낸다. 동일한 TCR 서열을 공유하는 T 세포는 컬러로 코딩되어 있고, 숫자는 개별 클론의 빈도를 나타내며 TCRb 사슬의 CDR3 영역 서열이 이어진다. 8일차: 아이소타입 - 서열번호 290; 항GITR - 서열번호 269; 항PD1 - 서열번호 270; 11일차: 아이소타입 - 서열번호 291, 서열번호 292 (각각, 상단에서 하단까지); 항GITR - 서열번호 271~273 (각각, 상단에서 하단까지); 항PD1 - 서열번호 274~279 (각각 상단에서 하단까지); 항GITR +항PD1 - 서열번호 280~289 (각각 상단에서 하단까지)
도 9c는 T 세포 클론형성능의 정량 분석. 데이터는 각각의 군으로부터 증식된 CD8+ T 세포 클론의 누적 빈도를 도시한다(*, p <0.05, **, p < 0.01, ***, p<0.001, 피셔 검정).
도 9d는 종양내 CD8+ T 세포 클론 유래 TCR의 식별, 발현 및 기능 검증. 고빈도 TCR 클론을 AP-1 루시퍼라아제 리포터 유전자를 사용해 J.RT3-T3.5 저캇 T 세포 내로 클로닝하였고, 비관련 종양 세포(B16F10.9 또는 TRAMP-C2)에 대한 MC38(종양 특이적)에 대해 이들의 반응성을 시험관 내에서 시험하였다.
도 9e는 병용 치료제로부터 단리한 MC38-특이적 CD8+ T 세포 클론을 사용한 대표적인 AP-1 루시퍼라아제 리포터 생물 검정 결과가 도시되어 있으며, 양성 대조군으로서는 항CD3 및 항CD28 자극을 사용하였다.
도 10a 내지 도 10d는 클로 증식된 CD8+ T 세포에서 고유 유전자 표지를 식별하는 것을 보여주는 도면들로,
도 10a는 아이소타입 치료제를 사용한 CD8+ T 세포 또는 병용 치료제를 사용한 CD8+ T 세포와 비교하여 병용 요법에 의해 클론 증식된 CD8+ T 세포에서 유전자가 상향 조절되었다(11일차). 벤다이어그램은 표시된 CD8+ T 세포 집단과 비교하여 유전자의 수가 상당히 증가(p < 0.01, 배율 변화 ₃ 2)하였음을 나타낸다. 열 지도(heat map)는 비교 대상 간에 30개의 유전자가 중첩됨을 나타낸다.
도 10b는 병용 요법에 의해 클론 증식된 CD8 T 세포에서 특이적으로 상향 조절된 유전자의 식별. 개략도와 벤다이어그램은 다른 대상과의 비교를 나타낸다.
도 10c는 누적 분포 함수(Cumulative distribution function, CDF) 플롯은 전체, 클론 증식되거나, 비증식 CD8+ T 세포에서 병용 치료제에 의해 고유하게 상향 조절된 유전자 및 CD226의 발현을 보여준다.
도 10d는 표시된 CD8+ T 세포 집단 간의 CD226 발현 수준의 배율 변화(숫자는 배율 변화이며; NS는 유의미하지 않음을 의미함).
도 11a 내지 도 11d는 항종양 면역력에 도움을 주는 CD226/TIGIT 경로를 상승적으로 조절하는 병용 치료제를 보여주는 도면들로,
도 11a는 비장 및 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포 집단에서의 CD226 발현의 FACS 분석(MFI)이며, 게이팅 전략은 FACS 플롯에 표시됨. 데이터는 2개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 실험을 나타낸다(n = 그룹 당 9~10마리 마우스). 그래프에서, 총 CD8은 좌측 4개의 막대이고, 비특이적 CD8은 중간의 4개이며, Ova-특이적 CD8은 우측 4개의 막대이다.
도 11b는 큰 단층 소포(LUV), 시토졸 티로신 키나제의 주 성분인 lck와 함께 리포좀에 대한 T 세포 신호 전달에 관여하는 재구성된 상이한 성분(CD3 및 CD226), Zap70, SLP76, 및 인산화 공자극 수용체에 의해 보강된 것으로 알려진 PI3K(p85a)를 도시하는 개략도이다.
도 11c는 CD226은 PD-1 결합 Shp2에 민감하지만, CD3ζ은 그렇지 않다. PD-1 농도를 증가시키면서 수행하는 Shp2-함유 반응은 30분만에 종료하고, SDS-PAGE와 포스포티로신 웨스턴 블롯(WB)을 수행한다.
도 11d는 비장 및 종양 T 세포 하위 집합에서의 TIGIT 발현에 대한 FACS 분석(종양 이식 후 8 일차). 데이터는 2개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 실험을 나타낸다(n = 그룹 당 9~10마리 마우스). (*, p <0.05, **, p < 0.01, ***, p<0.001, 단방향 ANOVA, 투키의 다중 비교 검정).
도 12a 내지 도 12h는 CD226 신호 전달 경로가 병용 치료제에 의해 유도된 항종양 반응을 매개하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 도면들로,
도 12a는 MC38 종양을 가진 마우스를 항GITR + 항PD1 또는 아이소타입 IgG로 면역치료하기 전에 CD226 차단 Ab 또는 아이소타입 IgG로 치료하였다. 생존율이 도시되어 있다. 데이터는 3개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 실험을 나타낸다(n = 그룹 당 5마리 마우스).
도 12b는 CD226 KO 마우스 또는 WT 한배새끼를 MC38 종양 세포로 접종하고, 종양 이식 후 6, 13일차에 항GITR + 항PD-1 Ab 또는 아이소타입 Ab 중 하나로 치료하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험 중 하나의 대표적인 실험을 나타낸다(n = 그룹 당 7~8마리 마우스). (12c 내지 12e) 병용 치료의 유효성은 CD28, OX40 및 4-1BB 경로에 의존하지 않는다.
도 12c는 CTLA-4-Ig(10 mg/kg)로 CD28 신호 전달 차단.
도 12d는 OX40L 차단 항체(10 mg/kg)로 OX40 신호 전달 차단.
도 12e는 4-1BBL 차단 항체(10 mg/kg)로 4-1BB 신호 전달 차단. 도시된 데이터는 생존 곡선(n=그룹 당 10마리 마우스)이다.
도 12f는 항PD1 임상 연구의 개략도.
도 12g는 종양 생검의 RNA-서열 분석은 암이 진행된 환자에서 항PD-1 Ab 치료 후에 CD226 전사물이 유의하게 증가하였음을 나타낸다(n=43, 짝비교 t 검정).
도 12h는 CD226 전사물 발현 수준 및 표시된 암 유형을 가진 환자에서의 전체 생존율에 대한 TCGA 데이터 분석. (*, p <0.05, **, p < 0.01, ***, p<0.001, 생존 분석을 위한 로그 순위 검정).
도 13은 TCR-음성 암 또는 비암 세포주를 MiTCR, TCRklass 및 rpStCR 파이프라인에 대한 음성 대조군으로서 사용하였음을 보여주는 표이다 - 음성 대조군: 인간 및 마우스 비-T 세포주(2x100 bp).
도 14는 단일 세포 시퀀싱에서 TCR 표적화 시퀀싱과 rpsTCR 파이프라인 간의 TCR 검출율 비교를 보여주는 표이다.
도 15는 11일차에 항체 치료로 클론 증식된 CD8+ T 세포에서 특이적으로 상향 조절된 경로를 보여주는 표이다.
도 16a 내지 16j는 항GITR + 항PD-1 조합이 자리잡은 종양을 상승적으로 거부하고 기능장애 T 세포를 재생시키는 것을 보여주는 도면들로,
도 16a는 항GITR 및/또는 항PD-1 Ab로 치료한 야생형 C57BL/6 마우스에서 MC38 종양의 성장(6, 13일차). 결과는 개별 마우스의 종양 성장 곡선을 도시한다(2개의 실험으로부터의 누적 데이터, n = 그룹 당 17 마리의 마우스). 상단의 숫자는 치료군의 마우스 총 마리수에 대한 무종양 마우스의 수를 나타낸다.
도 16b는 표시된 치료제로 치료한 경우의 누적 생존 곡선.
도 16c는 병용 치료에 의해 매개된 CD8+ T 세포 의존성 장기 종양 보호. C57BL/6 마우스를 항CD8, CD4 또는 항CD25 제거 항체(depletion antibody)로 치료하고, 이어서 항GITR + 항PD-1 Ab 또는 대조군 Ab로 치료하였다(방법 참조). c. 상이한 Ab에 의한 제거 효율을 보여주는 대표적인 FACS 플롯.
도 16d는 상이한 제거 Ab로 치료할 때 평균 종양 성장 곡선이며, 2개의 실험 중 대표적인 하나를 도시한다(n = 그룹 당 5마리의 마우스).
도 16e 및 도 16f는 병용 치료는 종양 내 효과가 T 세포/Treg의 비율을 증가시킴을 보여주는 도면들로서,
도 16e는 11일차의 종양 T 세포 하위 집합을 보여주는 대표적인 FACS 플롯(FoxP3 대 CD8, 활세포/단일 세포/CD45+/CD3+에서 사전 게이팅된 세포).
도 16f는 종양 접종 후 8일차 및 11일차의 종양내 CD8+ T 세포 / Treg 및 CD4+ TEff 세포 / Treg 비율의 FACS 결과 요약. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다(n = 그룹 당 6~7마리의 마우스).
도 16g 내지 도 16i는 병용 치료제는 종양 내 기능장애 T 세포를 복구시킨다. 이식 후 11~12일차에 종양을 수확하고, BFA가 존재하는 중에 PMA/이오노마이신으로 재자극된 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. 세포를 고정시키고 투과성으로 만든 뒤, Ki67(도 16g), 그램자임 A (도 16h), 및 그랜자임 B(도 16i)로 세포내 염색하였다. 표시된 데이터는 양성 세포의 백분율이다. (n=그룹 당 5~10마리의 마우스).
도 16j는 항GITR + 항PD-1은 자리잡은 마우스 RENCA 종양을 상승적으로 거부한다. 0일차에 Balb/c 마우스를 1x106 RENCA 종양 세포로 피하 접종하고, 종양 이식 후 6, 13 및 20일차에 항GITR(5 mg/kg) 및/또는 항PD-1(5 mg/kg) Ab 치료제로 치료하였다. 표시된 데이터는 생존률이다(n = 그룹 당 10마리의 마우스). (*, p <0.05, **, p < 0.01, ***, p<0.001, ****, p<0.0001; 도 16b, 도 16j Log-순위 검정; 도 16f, 도 16g, 단방향 ANOVA, 투키의 다중 비교 검정).
도 17은 rpsTCR 파이프라인의 개요를 도시한다. 짧은 RNA-seq 데이터를 사용하여 TCR 레파토리를 분석하기 위한 생물정보학적 파이프라인, rpsTCR 파이프라인의 개략도.
도 18은 인간 및 마우스 1차 혈구를 사용하는 rpsTCR 파이프라인 플랫폼 검증을 보여준다. 건강한 인간 PBMC 샘플 또는 마우스 전혈(whole blood) 유래의 표적화된 TCR-seq 데이터를 양성 대조군으로서 사용하여 TCRklass 단독 요법과 비교하여 위양성 또는 위음성 비율을 평가하였다. 벤다이어그램 내의 숫자로 표시된 바와 같이, 고유 CDR3 서열의 대부분은 rpsTCR 파이프라인, MiTCR, 및 TCRklass에 의해 검출되었다. rpsTCR 파이프라인, MiTCR, 및 TCRklass 간의 상관계수(R2)를 도면에 표시하였다.
도 19는 LCMV-특이적 T 세포 클론(P14) 유래의 TCR이 생물검정 플랫폼에 대한 양성 대조군으로서 사용되었음을 보여준다. P14 TCR 조작된 리포터 세포주는 LCMV 감염 세포에 대한 특이성을 보이지만 종양 세포주에 대해서는 그렇지 않다. 항CD3 및 CD28 자극을 TCR 복합체 신호전달을 위한 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 20(a)-(c)은 병용 치료에 의해 클론 증식된 CD8+ T 세포에서 유의하게 풍부해진 30개 유전자의 발현 수준을 나타내는 바이올린 플롯(violin plot)을 보여준다. 표시된 데이터는 시퀀싱된 개별 CD8+ T 세포에서의 유전자 발현(Log2 RPMK)이다(cExp, 병용 치료, 클론 증식된 T 세포, cNon, 병용 치료, 비증식; 아이소타입, 아이소타입 치료군으로부터의 총 CD8).
도 21a 내지 21c는 병용 치료가 작동자 기능을 가진 종양-항원 특이적 CD8+ T 세포를 증식시킴을 보여주는 도면들로서,
도 21a는 FACS에 의한 MC38-OVA-β2m-Kb 세포에서의 OVA 펩티드-Kb 복합체의 표면 발현 검증. MC38-OVA-β2m-Kb 또는 빈 벡터 대조군 MC38 세포를 아이소타입 또는 항-Kb-SIINFEKL Ab로 염색되어 있다. 대표적인 히스토그램이 도시되어 있다.
도 21b는 항GITR 및/또는 항PD1 Ab로 치료한 MC38-OVA-β2m-Kb 보유 마우스 유래의 종양 및 비장 OVA-특이적 CD8+ T 세포의 빈도(좌측) 및 종양 중량에 대해 정규화된 수(수/mg, 우측). (2개의 실험을 대표함, n = 그룹 당 9~10마리 마우스).
도 21c는 비장 및 종양 CD8+ T 세포에서 병용 치료에 의한 OVA-특이적 리콜 반응의 증가. BFA의 존재하에, SIINFEKL 펩티드의 유무와 상관없이 세포를 재자극하였다. IFNg의 세포내 발현을 FACS로 분석하였다. 데이터는 2개의 실험을 대표함, n = 그룹 당 9~10마리의 마우스, (*, p <0.05, **, p < 0.01; ***, p < 0.001, b, 단방향 ANOVA, c, 양방향 ANOVA, 투키의 다중 비교 검정).
도 22a 내지 22d는 단일 세포 RNA에서의 TIGIT 발현 수준 및 상이한 T 세포 서브세트 상에서 TIGIT/CD226 발현 수준의 FACS 분석을 보여주는 도면들로서,
TIGIT RNA 발현을 보여주는 누적 분포 함수(CDF) 플롯(도 22a) 및 FACS 분석(도 22b)으로, 2개의 실험을 대표하며(n = 그룹 당 9~10마리의 마우스),전체, 클론 증식(OVA-특이적) 또는 비증식(OVA-비특이적) CD8+ T 세포에서의 TIGIT 발현을 보여줌.
도 22c는 MC38 야생형 종양 이식 후 8일차에 비장 및 종양 T 세포 서브세트 상에서의 TIGIT 발현에 대한 FACS 분석, 및 각 모집단 내에서 TIGIT+ 세포의 백분율이 도시되어 있다.
도 22d는 MC38 야생형 종양 이식 후 11일차에 비장 및 종양 T 세포 서브세트 상에서의 CD226 발현에 대한 FACS 분석, 및 각 모집단 내에서 CD226+ 세포의 백분율이 도시되어 있다. 데이터는 2개의 실험을 대표하고, n = 그룹 당 9~10마리의 마우스임(*, p <0.05, **, p < 0.01, ***, p<0.001, 단방향 ANOVA, 투키의 다중 비교 검정).
도 23a 내지 23f는 CD226-/- 마우스가 정상적인 T 세포 발생 및 항상성 기능을 나타냄을 보여주는 도면들로서,
도 23a는 표적화 전략. 마우스 CD226의 코딩 엑손 1 내지 2를 자체 결실 eGFP-Neo 카세트(eGFP-polyA-hUb-EM7-neo-polyA-Prm-Crei-polyA)로 치환하였다(코딩 엑손 1에서 시작 ATG에 대한 3'에서부터 코딩 엑손 2의 3' 말단 이전 13 bp까지). 코딩 엑손 1~2 사이의 인트론도 결실된다. 카세트 결실 후, eGFP, polyA LoxP 및 클로닝 부위들(1141 bp)은 남아있다.
도 23b는 T 세포 서브세트 상에서 CD226 결실의 FACS 검증.
도 23c는 흉선에서의 T 세포 발달에 대한 FACS 분석(Tconv, 종래의 T 세포; DP, CD4/CD8 이중 양성; SP, 단일 양성; DN, CD4/CD8 이중 음성).
도 23d는 FACS로 분석한 비장 및 혈액에서의 T 세포 서브세트.
도 23e는 TCR 자극 시의 염증성 사이토카인 분비. CD226-/- 또는 야생형(WT) 마우스 유래의 비장 세포를 항CD3 + 항CD28 Ab로 16시간 동안 생체 외 자극하였다. 표시된 사이토카인이 방출될 때 상청액을 채취하였다.
도 23f는 CD226-/- 또는 WT 마우스가 유래의 비장 및 혈액 T 세포 서브세트 상에서 PD1 및 GITR의 발현 수준. 표시된 데이터는 평균 형광 강도(MFI)이다(n=그룹 당 3마리의 마우스).
도 24a 내지 24g는 TIGIT-/- 마우스에서의 종양 감시를 강화하기 위해 CD226 신호 전달 경로를 필요했음을 보여주는 도면들로서,
야생형 또는 TIGIT-/- 마우스에 MC38 종양을 접종하고, 항CD226 또는 대조군 IgG로 전치료하고, 아이소타입 대조군 (도 24a) 또는 항GITR+항PD-1 병용 요법으로 치료하였다(도 24b). 표시된 데이터는 2개의 실험을 대표하는 평균 종양 성장 곡선을 나타낸다 (n = 그룹 당 4~5마리의 마우스).
도 24c는 조작된 MC38 종양 세포 상에서 CD155의 과발현을 FACS로 검증한다.
도 24d는 CD38 종양 세포 상에서 CD226/TIGIT에 대한 리간드인 CD155의 과발현은 종양 성장을 늦추며, 종양 거부 및 장기 생존을 촉진하는 데 있어서 (3, 6, 10 및 13일차의) 항GITR 또는 항PD-1 Ab 단일 요법과 상승작용을 한다. 표시된 데이터는 평균 종양 성장 곡선이다(n=그룹 당 10마리의 마우스).
도 24e는 생체 내에서 조작된 MC38 종양 세포 상에서 CD155의 과발현이 유지된다.
도 24f는 MC38 종양 세포 상에서 CD155의 과발현은 FACS에 의해 검출된 종양내 T 세포 서브세트 상에서 유리 CD226 수용체를 감소시키지만, 비장 T 세포 서브세트 상에서는 그렇지 않다.
도 24g는 마우스에 MC38 대조군 또는 CD155 과발현 세포를 접종하였다. 종양 접종 후 9일차에, 종양 및 비장 세포를 T 세포 활성화에 대해 FACS로 분석하였다. IFNg 발현을 위해, 세포 내 염색 이전에 세포를 PMA/이오노마이신으로 재자극하였다 (n=그룹 당 10마리의 마우스). (**, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001, 단방향 ANOVA, 투키의 다중 비교 검정).
도 25는 항GITR + 항PD-1 Ab 요법과 국소 방사선의 조합이 크게 자리잡은 MC38 종양에 대한 효능을 나타낸다는 것을 보여준다.
크게 자리잡은 MC38 종양을 가진 마우스를 100 μg의 항GITR 및/또는 항PD-1 Ab 또는 아이소타입 Ab로 치료하고(17, 20, 24 및 27일차), 0 또는 8Gy의 국소 방사선 치료를 병행하였다(18일차).
도 25a는 평균 종양 성장 곡선.
도 25b는 개별 마우스 종양 성장 곡선. 종양이 없는 마우스의 수는 상단 왼쪽 패널에 표시되어 있다.
도 25c, 도 25d의 생존 곡선. 데이터는 2개의 실험을 대표한다(n = 그룹 당 5~6마리의 마우스). (*, p <0.05, **, p < 0.01, Log-순위 검정).
도 26은 TCRαa/β 레파토리 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비 시 사용된 프라이머 목록이다.
도 27은 양성 및 음성 대조군 데이터 세트를 사용하는 3개의 방법의 비교를 보여준다.
도 28은 50 bp의 프라이밍 리드를 사용하여 miTCR, TCRklass, 및 rpsTCR 파이프라인에 의해 발견된 상위 CDR3을 도시한다.
도 29는 50 bp의 프라이밍 리드를 사용하여 전체 VI-다음 데이터 세트에서 발견된 상위 CDR3을 도시한다.
도 30은 100 bp의 프라이밍 리드를 사용하여 miTCR, TCRklass, 및 rpsTCR 파이프라인에 의해 발견된 상위 CDR3을 도시한다.
도 31은 100 bp의 프라이밍 리드를 사용하여 전체 VI-다음 데이터 세트에서 발견된 상위 CDR3을 도시한다.
도 32는 단일 세포 시퀀싱 및 벌크 RNA 시퀀싱 모두에서 검출된 CDR3을 도시한다.
본 방법 및 시스템이 개시되고 기술되기 전에, 본 방법 및 시스템은 특정 방법, 특정 컴포넌트, 또는 특정 실시를 한정하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것이고 제한하고자 하는 의도가 아닌 것으로 이해된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 언급하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 범위는 "약" 하나의 특정 값, 및/또는 "약" 또 다른 특정 값까지로서 본원에서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사값으로 표현될 때, 선행하는 "약"의 사용에 의해, 특정 값은 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 각 범위의 종점은 다른 종점과 관련하여, 그리고 다른 종점과 관계없이 모두 유의한 것으로 추가로 이해될 것이다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는, 후속으로 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있고, 그 기재가 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
본 명세서의 상세한 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 및 "포함하는" 및 "포함하고"와 같은 이의 변화형은 "포함하지만 이에 한정되지 않는"을 의미하며, 예를 들어, 다른 구성요소, 정수 또는 단계를 배제하고자 하는 것은 아니다. "예시적인"은 "~의 일례"를 의미하며, 바람직한 또는 이상적인 구현예의 표시를 나타내고자 하는 것은 아니다. "~와 같은"은 제한적인 의미로 사용되지 않고 설명을 목적으로 사용된다.
면역 관문 억제제를 사용하는 단일 요법이나 병용 요법이 암 환자에서 상당한 치료 효능을 나타냈음이 본 개시에 따라 관찰되었다. 그러나, 대부분의 환자들은 반응하지 않거나 일시적인 반응만을 보임으로써, 차세대 면역 요법의 설계에 대한 근본적인 질문이 제기된다. 종양 미세환경의 면역억제 성질을 극복하고 지속적인 반응을 촉진하기 위해서는, 더 강한 T 세포 활성화를 유도하는 공억제성 및 공자극성 경로의 이중 표적화를 수행할 수 있다. 일부 시나리오에서, 항체를 조합하는 것은, 예를 들어 항상성 조절자의 균형을 복원하는 것에 의해 CD8+ T 세포 작동기 기능을 상승적으로 향상시켜 종양 거부와 장기 반응을 만들어낼 수 있다. 치료의 결과로서 클론의 증식을 정확하게 측정하면 단일 또는 병용 요법에 대한 대상체의 반응을 나타내는 표지(signature)를 제공할 수 있다. 일 양태에서, 대상체의 하나 이상의 T 세포를 시퀀싱하여 수득된 짧은 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 생성할 수 있는 방법 및 시스템이 본원에 개시된다. 상기 방법 및 시스템은 하나 이상의 TCR 서열의 생성에 기초하여 클론 증식을 결정하여 대상체의 반응 및/또는 잠재적 반응을 나타내는 표지를 제공할 수 있다.
개시된 방법, 및 "rpsTCR" 파이프라인으로도 지칭되는 시스템을 수행하는 데 사용될 수 있는 컴포넌트가 개시되어 있다. 이들 및 다른 컴포넌트가 본원에 개시되어 있으며, 이러한 컴포넌트의 조합, 하위 집합, 상호작용, 군 등이 개시되어 있을 때, 이들의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합과 순열의 구체적인 언급이 명시적으로 개시될 수 없지만, 각각은 본 명세서에서 모든 방법 및 시스템에 대하여 구체적으로 고려되고 기술되어 있는 것으로 이해된다. 이는 개시된 방법의 단계를 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 따라서, 수행될 수 있는 다양한 추가의 단계들이 존재하는 경우, 이들 추가의 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 구현예 또는 구현예의 조합으로 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
본 방법 및 시스템은 하기의 바람직한 구현예의 상세한 설명 및 거기에 포함된 실시예 그리고 도면 및 이들의 상기 및 하기 설명을 참조로 더 쉽게 이해될 수 있다.
당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 방법 및 시스템은 완전한 하드웨어 구현예, 완전한 소프트웨어 구현예, 또는 소프트웨어 측면들과 하드웨어 측면들을 조합한 구현예의 형태를 취할 수 있다. 또한, 본 방법 및 시스템은 컴퓨터 판독가능 프로그램 명령어 (예컨대, 컴퓨터 소프트웨어)가 저장 매체에서 구현되는, 컴퓨터 판독가능 저장 매체 상의 컴퓨터 프로그램 제품의 형태를 취할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 방법 및 시스템은 웹 구현 컴퓨터 소프트웨어의 형태를 취할 수 있다. 하드 디스크, CD-ROM, 광 저장 장치, 또는 자기 저장 장치를 포함하는 임의의 적합한 컴퓨터 판독가능 저장 매체가 이용될 수 있다.
본 방법 및 시스템의 구현예는 방법, 시스템, 장치 및 컴퓨터 프로그램 제품의 블록 다이어그램 및 순서도 예시를 참조하여 아래에 기술된다. 블록 다이어그램 및 순서도 예시의 각각의 블록, 및 블록 다이어그램 및 순서도 예시의 블록들의 조합은 각각 컴퓨터 프로그램 명령어에 의해 구현될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이들 컴퓨터 프로그램 명령어는 범용 컴퓨터, 특수 목적 컴퓨터, 또는 다른 프로그래밍가능한 데이터 처리 장치 상에 로딩되어 머신(machine)을 생성할 수 있으며, 이에 따라 컴퓨터 또는 다른 프로그래밍가능한 데이터 처리 장치에서 실행되는 명령어는 순서도 블록 또는 블록들에 명시된 기능을 구현하기 위한 수단을 생성한다.
컴퓨터 또는 다른 프로그래밍가능한 데이터 처리 장치가 특정 방식으로 기능하도록 지시할 수 있는 이들 컴퓨터 프로그램 명령어는 또한 컴퓨터 판독가능 메모리에 저장될 수 있으며, 이에 따라 컴퓨터 판독가능 메모리에 저장된 명령어는 순서도 블록 또는 블록들에 명시된 기능을 구현하기 위한 컴퓨터 판독가능 명령어를 포함하는 제조 물품을 생성한다. 컴퓨터 프로그램 명령어는 또한 컴퓨터 또는 다른 프로그래밍가능한 데이터 처리 장치 상에 로딩되어 일련의 작동 단계가 컴퓨터 또는 다른 프로그래밍가능한 장치 상에서 수행되게 하여 컴퓨터 구현 프로세스를 생성할 수 있으며, 이에 따라 컴퓨터 또는 다른 프로그래밍가능한 장치 상에서 실행되는 명령어는 순서도 블록 또는 블록들에 명시된 기능을 구현하기 위한 단계를 제공할 수 있다.
따라서, 블록 다이어그램 및 순서도 예시의 블록은 명시된 기능을 수행하기 위한 수단들의 조합, 명시된 기능을 수행하기 위한 단계들의 조합 및 명시된 기능을 수행하기 위한 프로그램 명령어 수단을 지원한다. 블록 다이어그램 및 순서도 예시의 각각의 블록, 및 블록 다이어그램 및 순서도 예시의 블록들의 조합은 명시된 기능 또는 단계를 수행하는 특수 목적 하드웨어 기반 컴퓨터 시스템, 또는 특수 목적 하드웨어와 컴퓨터 명령어의 조합에 의해 구현될 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다.
다양한 사례에서, 이러한 상세한 개시는 주어진 엔티티가 일부 조치를 수행하는 것을 지칭할 수 있음을 유의한다. 이러한 표현은, 일부 경우에 주어진 엔티티가 소유 및/또는 제어하는 시스템(예를 들어, 컴퓨터)이 실제로 조치를 수행하는 것을 의미할 수 있는 것으로 이해해야 한다.
도 1에 도시된 일 양태에서, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하기 위한 rpsTCR 방법(100)이 개시된다. 상기 방법(100)의 단계는 임의의 순서로 또는 동시에 수행될 수 있다. 상기 방법(100)은 핵산 샘플을 시퀀싱하여 서열 데이터를 생성하는 단계 및/또는 (110)에서 서열 데이터를 수신하는 단계를 포함할 수 있다. 핵산 샘플을 시퀀싱하는 단계는 대상체의 T 세포로부터 수득된 RNA의 약 100 염기쌍 미만의 짧은 리드(예를 들어, 단일 말단의 75 염기쌍 리드)를 시퀀싱하는 단계를 포함할 수 있다. T 세포는 인간 또는 마우스로부터 수득될 수 있다. T 세포는 대상체에게 하나 이상의 치료제를 투여하기 전, 또는 그 후에 획득되고/되거나 시퀀싱될 수 있다. 짧은 리드는 RNA의 무작위 프라이밍으로부터 얻을 수 있다. 무작위 프라이머는 4~40 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 사례에서, 무작위 프라이머는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 핵산 샘플을 시퀀싱하는 단계에 의해 데이터 구조에 저장할 수 있는 서열 데이터를 생성할 수 있다. 데이터 구조는 하나 이상의 핵산 서열 및/또는 샘플 식별자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열 데이터는 임의의 방법을 통해 수득되거나 수신될 수 있다. 예를 들어, 서열 데이터는 샘플 상에서 시퀀싱 프로세스를 수행하는 것에 의해 직접 수득될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 서열 데이터는, 예를 들어, 제3자, 데이터베이스 및/또는 공개된 문헌으로부터 간접적으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 데이터는 컴퓨터 시스템에서, 예를 들어, 데이터 저장 장치로부터 또는 별도의 컴퓨터 시스템으로부터 수신된다.
일부 구현예에서, 서열 데이터는 벌크 서열 데이터를 포함할 수 있다. 용어 "벌크 시퀀싱(bulk sequencing)" 또는 "차세대 시퀀싱(next generation sequencing)" 또는 "초병렬 시퀀싱(massively parallel sequencing)"은 DNA 및/또는 RNA 시퀀싱 프로세스를 병렬화하는 임의의 고 처리량 시퀀싱 기술을 지칭한다. 예를 들어, 벌크 시퀀싱 방법은 일반적으로 단일 분석에서 100만 개가 넘는 폴리핵산 앰플리콘을 생산할 수 있다. 용어 "벌크 시퀀싱(bulk sequencing)", "초병렬 시퀀싱(massively parallel sequencing)" 및 "차세대 시퀀싱(next generation sequencing)"은 일반적인 방법만을 지칭하는 것이며, 단일 실행에서 100만 개가 넘은 서열 태그를 획득하는 것을 필수적으로 지칭하는 것은 아니다. 가역적 종결자 화학(예: Illumina), polony 유화 액적을 사용하는 파이로시퀀싱(예: Roche), 이온 반도체 시퀀싱(IonTorrent), 단분자 시퀀싱(예: Pacific Biosciences), 초병렬 표지 시퀀싱(massively parallel signature sequencing) 등과 같은 임의의 벌크 시퀀싱 방법이 개시된 방법 및 시스템에서 구현될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열 데이터는 복수의 시퀀싱 리드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시퀀싱 리드는 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 뉴클레오티드 이하의 평균 리드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 시퀀싱 리드는 적어도 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200 또는 250 뉴클레오티드의 평균 리드 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 시퀀싱 리드의 커버리지는 100x, 90x, 80x, 70x, 60x, 50x, 40x, 30x 또는 20x 이하이다. 일부 구현예에서, 시퀀싱 리드의 커버리지는 적어도 50x, 45x, 40x, 35x, 30x, 25x, 20x, 19x, 18x, 17x, 16x, 15x, 14x, 13x, 12x, 11x 또는 10x이다.
일부 구현예에서, 서열 데이터는 당업계에 공지된 임의의 시퀀싱 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시퀀싱 데이터는 사슬 종결 시퀀싱(chain termination sequencing), 연결에 의한 시퀀싱(sequencing by ligation), 합성에 의한 시퀀싱(sequencing by synthesis), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 이온 반도체 시퀀싱(ion semiconductor sequencing), 단분자 실시간 시퀀싱(single-molecule real-time sequencing), 태그 기반 시퀀싱(tag-based sequencing), dilute-`n`-go 시퀀싱, 및/또는 454 시퀀싱을 사용해 생성된다.
일부 구현예에서, 서열 데이터는, 핵산 증폭 프로세스가 수행되어 하나 이상의 게놈 유전자좌 또는 전사물의 적어도 일부를 증폭한 다음 생성된 증폭 산물의 시퀀싱이 수행되는 프로세스의 결과이다. 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 유용한 핵산 증폭 프로세스의 예는, 중합효소 연쇄 반응(PCR), LATE-PCR, 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 변위 증폭(SDA), 전사 매개 증폭(TMA), 자가 유지 서열 복제(3SR), Qβ 복제효소 기반 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 복구 연쇄 반응(RCR), 부메랑 DNA 증폭(BDA) 및/또는 회전환 증폭(RCA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플 상에서 시퀀싱 프로세스를 수행하는 단계를 포함한다. 샘플이 TCR을 암호화할 수 있는 DNA 및/또는 RNA를 함유하는 한, 임의의 샘플이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 미래의 기관, 세포 또는 조직 공여자 유래의 것이다. 일부 구현예에서, 샘플은 미래의 기관, 세포 또는 조직 수혜자 유래의 것이다. 샘플의 공급원은, 예를 들어, 신선하고, 동결되고/되었거나 보존된 기관, 조직 샘플, 생검 또는 흡인물 유래의 고상 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 성분, 혈청, 혈구; 뇌 척수액, 양생액, 복막액이나 간질액, 소변, 타액, 대변, 눈물과 같은 체액; 또는 세포일 수 있으며, 이들은 임신 중이거나 성장 중인 임의 시점의 대상체로부터 유래한다.
방법(100)은 짧은 리드를 기준 서열과 정렬시키는 단계(120)를 포함할 수 있다. 기준 서열은 종-특이적 RNA 서열의 기준 데이터세트를 포함할 수 있다. 기준 데이터세트는 데이터 구조에 저장될 수 있다. 데이터 구조는 하나 이상의 핵산 서열 및/또는 식별자를 포함할 수 있다. 기준 서열은 TCR 유전자 서열을 함유하지 않는다 (예를 들어, 적응성 면역 세포 수용체의 유전자좌에 상응하는 기준 서열 배제함). 이에 따라 정렬은 맵핑된 짧은 리드와 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성한다. 일 양태에서, 짧은 리드를 참조 서열과 정렬시키는 단계는 Trapnell C., 등의 TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq, Bioinformatics (2009) 25 (9):1105-1111에 기술된 하나 이상의 기술을 포함할 수 있다. 맵핑된 짧은 리드는 (130)에서 제거될 수 있다. 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 새로운 데이터 구조가 생성될 수 있다. 본 방법의 나머지 단계는, 정상적으로는 폐기되어 TCR 맥락에서 추가 분석의 대상이 되지 않는, 맵핑되지 않은 짧은 리드에 대해 수행될 수 있다. 맵핑된 짧은 판독을 필터링하는 이러한 단계는 첨단 TCR 분석에서 벗어나는 것을 나타내며, 정확도 및 정밀도 모두에서 후속적인 개선을 가져온다.
방법(100)은 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드에 대한 품질 관리 프로세스를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드에 대한 품질 관리 프로세스를 수행하는 단계는 저 품질의 뉴클레오티드를 제거하는 단계 또는 매우 짧은 리드를 제거하는 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 매우 짧은 리드를 제거하는 단계는 35 염기쌍 길이 미만인 임의의 리드를 제거하는 것을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 방법은(100)은 단계(140)에서 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립할 수 있다. 일 양태에서, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는 추가 프로세싱을 위해, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 TCR 서열의 기준 데이터베이스로부터의 하나 이상의 TCR 서열에 대해 정렬하는 단계, 및 TCR 서열의 기준 데이터베이스에 기초하여 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 긴 리드(후보 TCR 서열)로 조립하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는 추가 프로세싱을 위해, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 TCR 서열의 기준 데이터베이스를 사용하지 않고 긴 리드(후보 TCR 서열)로 조립하는 단계를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는 추가 프로세싱을 위해, Warren, R. L., B. H. Nelson, 및 R. A. Holt. 2009. Profiling model T-cell metagenomes with short reads. Bioinformatics 25: 458-464에 개시된 하나 이상의 기술(iSSAKE 플랫폼)을 포함할 수 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일 양태에서, 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는 추가 프로세싱을 위해, 원하는 적응성 면역 세포 수용체의 알려진, 선별된 V 유전자(curated V genes)에 대해 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 정렬하는 단계를 포함할 수 있다. V 정렬의 3'에서 일치되지 않는 뉴클레오티드를 갖는 V 유전자의 3' 말단에 대해 최선의 정상보성 또는 역상보성 정렬을 갖는 하나 이상의 짧은 리드는 드 노보 조립(de novo assembly)를 위한 시드(seeds)로서 표지될 수 있다. 수용체 V 유전자나 불변 영역 또는 J 유전자와 불변 영역 사이의 가능한 접합부에 대해 완전하게 정렬되는 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드는 향후 조립 시에 제거될 수 있다.
각각의 시드 서열(seed sequence)은 조립체의 핵을 이루는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 아서열(subsequence)의 길이(k)는 가장 긴 미조립 리드 길이에서 시작될 수 있다. 그런 다음, 3'에 가장 가깝고 k의 길이를 갖는 아서열이 생성될 수 있다(k-mer). k-mer가 하나 이상의 정상보성 또는 역상보성 리드(들) r의 5' 말단 염기와 일치하는 경우, 일치하는 리드(들) r 이 조립체를 연장하는 데 사용될 수 있다(돌출 연장 뉴클레오티드가 r 전반에 걸쳐 일치하지 않는 경우, 대부분의 룰이 컨센서스 조립체 서열을 구축하는 데 사용될 수 있다). 일치하는 것이 없고 k 가 사용자 지정 최소 아서열 길이보다 큰 경우, 일치시키는 단계는 1 염기만큼 짧은 새로운 k로 반복될 수 있다. 일치하는 것이 없고 k 가 사용자 지정 최소 아서열 길이와 같은 경우, 조립이 완료된다. 모든 시드 서열과 생성된 조립 서열이 (예를 들어, 사용자가 정의한) 최대치로 연장될 때 조립이 완료된다. 위의 단계는 새로운 조립 서열에서 반복될 수 있다. 그 결과 하나 이상의 긴 리드를 포함하는 리드 세트가 생성된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 맵핑되지 않는 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하기 위한 대안적인 접근법은 추가 프로세싱을 위해, Grabherr MG, Haas BJ, Yassour M, Levin JZ, Thompson DA, Amit I, 등의 Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature biotechnology. 2011;29(7):644-52에 개시된 하나 이상의 기술을 포함할 수 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.(Trinity 플랫폼). 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는 추가 프로세싱을 위해, 다단계 접근법을 포함할 수 있다. 제1 단계는, 전사물 조립을 위한 탐욕 k-mer 기반 접근법을 사용해 하나 이상의 맵핑되지 않는 짧은 리드를 전사물의 고유 서열로 조립하는 단계, (대안적인 스플라이싱, 유전자 복제 또는 대립유전자 변이로 인해) k-mer를 공유하는 대안적인 변이체 세트에 대해 하나의(최선의) 대표를 복구하는 단계를 포함한다. k-mer 기반 접근법은 모든 후보 TCR 서열로부터 k-mer 정상보성 및 역상보성 서열의 사전을 구축하는 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, k=25). 복잡도가 낮거나 단 한 번만 관찰된 k-mer를 제외하고, 가장 빈번한 k-mer가 콘틱 조립체(contig assembly)를 파종(seed)하도록 사전에서 선택될 수 있다. 시드는, 현재 조립체와 k-1 중첩부를 갖는 가장 많이 발생하는 k-mer를 발견하여 이의 돌출 뉴클레오티드를 성장 중인 조립 서열에 연결함으로써 어느 한 방향으로 연장될 수 있다. k-mer가 연장에 사용된 경우, 이는 사전에서 제거될 수 있다. 시드 연장은 조립체가 더 연장될 수 없을 때까지 반복될 수 있다. 가장 빈번한 k-mer의 선택과 시드 연장은 사전의 기능이 소실될 때까지, 그 다음으로 가장 빈번한 k-mer를 사용해 반복될 수 있다.
다단계 접근법의 제2 단계는, 대안적으로 스플라이싱된 전사물의 일부, 또는 달리 유사 유전자의 고유한 일부에 상응하는 관련 콘틱을 클러스터링하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 다음, 드브루인 그래프(de Bruijn grph)가 관련 콘틱의 각 클러스터에 대해 구성될 수 있는데, 각각의 그래프는 변이체들 간의 중첩부에 대한 복잡성을 반영한다. 콘틱 사이에 k-1 뉴클레오티드의 중첩부가 있는 경우, 및 (k-1)/2 뉴클레오티드가 일치하는 두 콘틱의 접합부를 가로지르는 최소 수의 리드가 (k1)-mer 접합부의 각 측부에 있는 경우, 콘틱은 클러스터로 그룹화될 수 있다. 그룹화(grouping)하는 단계는 임의의 그룹에 더 이상 콘틱이 추가될 수 없을 때까지 반복될 수 있다. 드브루인 그래프는, 노드를 나타내기 위한 k-1 및 노드를 연결하는 에지를 정의하기 위한 k의 한 단어 크기를 사용해 각 그룹에 대해 구성할 수 있다. 드브루인 그래프의 각 에지는 이를 지지하는, 원래 리드 세트에서의 k-mer의 수를 포함할 수 있다. 각각의 리드는 그룹이 가장 큰 수의 k-mer를 공유하는 그룹에 할당될 수 있고, 각각의 리드 내에서 그룹에 k-mer를 제공하는 영역이 결정될 수 있다.
다단계 접근법의 제3 단계는, 상응하는 드브루인 그래프의 맥락에서, 리드 및 리드 쌍에 의해 취해진 경로를 분석하는 단계, 및 타당한 전사 서열을 출력하고, 대안적으로 스플라이싱된 아이소폼 및 유사 유전자 유래의 전사물를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 리드 또는 리드 쌍에 의해 지지되는 경로를 식별하고, 이들 경로를 긴 리드(후보 TCR 서열)로서 반환하기 위해 노드를 병합하는 단계(merging nodes)와 에지를 잘라내는 단계(pruning edges) 간의 후속 반복(subsequent iteration)이 구현될 수 있다. 노드를 병합하는 단계는 후속 노드를 드브루인 그래프에서의 선형 경로에 병합하여, 더 긴 서열을 나타내는 노드를 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 에지는 잘라내는 단계는, 시퀀싱 오류에 상응할 가능성이 있는 리드가 비교적 적은 것에 의해 뒷받침되는 미미한 편차를 나타내는 에지를 잘라내는 단계를 포함할 수 있다. 제3 단계는, 드브루인 그래프에서 실제 리드와 리드 쌍에 의해 뒷받침되는 경로들을 식별하되, 이들 경로를 뒷받침하는 리드(및 리드 쌍)을 유지하는 상태로 그래프에서의 잠재 경로를 가로지르는 동적 프로그래밍 절차를 사용해 식별하여, 타당한 경로에 대해 점수를 매기는 단계를 더 포함할 수 있다. 리드와 서열 단편(짝을 이룬 리드)은 k보다 일반적으로 훨씬 길기 때문에, 모호성을 해결할 수 있고, 선형 서열로 나열된 훨씬 적은 수의 실제 전사물로 경로의 조합 수를 감소시킬 수 있다. 그 결과 하나 이상의 긴 리드를 포함하는 리드 세트가 생성된다.
TCR 서열의 조립은 iSSAKE 플랫폼 및 Trinity 플랫폼과 같은 여러 플랫폼 중 하나를 사용하여 수행될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 표 1은, 개시된 방법 및 시스템의 구성 요소로서의 Trinity 플랫폼과 iSSAKE 플랫폼이 단일 세포 시퀀싱에 효과적으로 동등하였음을 보여주지만, 벌크 시퀀싱에서는 iSSAKE 플랫폼이 우수하였다. iSSAKE 플랫폼은 TCR에 대한 시드 서열을 할용하는데, 이는 벌크 조립에서 rpsTCR 파이프라인의 성능을 개선할 수 있다.
CDR3 iSSAKE에 의해 검출된 단일 세포 Trinity에 의해 검출된 단일 세포 iSSAKE에 의한 벌크에서의 수 Trinity에 의해 벌크에서 발견된 수
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방법(100)은 단계(150)에서 하나 이상의 긴 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 생성할 수 있다. 일 양태에서, 하나 이상의 긴 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 생성하는 단계는 Yang, X. 등의 TCRklass: a new K-string-based algorithm for human and mouse TCR repertoire characterization. J. Immunol. 194, 446-454 (2015)에 개시된 하나 이상의 기술을 포함할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 하나 이상의 긴 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 생성하는 단계는: 모든 6개의 프레임 상에서 하나 이상의 긴 리드 각각을 번역하는 단계; 각각의 번역 프레임을 기준 가변(V) 및 결합(J) 아미노산 서열의 3-스트링 프로파일과 비교하는 단계; 일치하는 k-스트링의 수가 가장 많은 번역 프레임을 식별하는 단계; 일치하는 k-스트링의 수가 가장 많은 번역 프레임 유래의 긴 리드 내의 각 잔기에 대해 보존된 잔기의 지지 점수(Scr)를 결정함으로써, 긴 리드에 보존된 잔기의 위치를 결정하는 단계; 번역 프레임 유래의 긴 리드의 V 및 J 유전자 분절에서 Scr이 가장 높은 후보 보존된 잔기를 식별하는 단계; 및 V 및 J 유전자 분절 내 2개의 보존된 잔기 사이에 위치한 CDR3 영역을 TCR 서열로서 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 방법(100)은 TCR C 영역 핵산 서열을 TCR 서열에 첨부하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 긴 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 생성하는 단계는 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계를 포함할 수 있다. TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열은 약 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획될 수 있다. K-스트링은 상응 아미노산 서열과 정렬될 수 있다. 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기는 상응 아미노산 서열에 대해 매핑되는 k-스트링에서 검출될 수 있다. 검출된 보존 수준에 점수를 매길 수 있고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 갖는 상응 아미노산 서열을 선별할 수 있다. 그런 다음, 후보 CDR3 영역 아미노산 서열이 선별된 상응 아미노산 서열에서 검출될 수 있다.
하나 이상의 긴 리드에서 후보 CDR3 영역의 아미노산 서열의 핵산 서열이 식별될 수 있다. 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상류에 있는 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열은 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬될 수 있다. 정렬 정도(degree of alignment)에 점수를 매길 수 있고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드는 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별될 수 있다.
후보 CDR3 영역 핵산 서열의 하류에 있는 하나 이상의 긴 리드의 핵산 서열은 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬될 수 있다. 정렬 정도(degree of alignment)에 점수를 매길 수 있고, 임계 정렬 점수를 초과하는 긴 리드는 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별되어, TCR 서열이 생성될 수 있다. 일 양태에서, 방법(100)은 TCR C 영역 핵산 서열을 TCR 서열에 첨부하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
방법(100)은: 하나 이상의 TCR 서열을 알려진 TCR 서열로 이루어진 TCR 서열 라이브러리와 비교하고, 상응 치료 반응을 하나 이상의 치료제와 비교하는 단계; 하나 이상의 TCR 서열 중 어떤 서열이 TCR 서열 라이브러리에서 높은 상응 치료 반응과 일치하는 지 식별하는 단계; 및 하나 이상의 TCR 서열을 가진 대상체가 반응할 가능성이 있는 하나 이상의 치료제를 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대상체가 특정 치료제에 반응할 가능성이 있는 TCR 서열을 갖는 것으로 식별된 경우, 대상체에 특정 치료제를 투여할 수 있다.
방법(100)은, 클론 증식을 평가하기 위해 질환에 대한 대상체의 치료제를 투여하기 전 및 후에 상기 방법(100)을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 대상체의 제1 복수의 T 세포를 치료제의 투여 전에 채취할 수 있다. 제1 복수의 T 세포를 시퀀싱하고, 방법(100)을 수행할 수 있다. 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수를 결정할 수 있다. 치료제를 대상체에게 투여할 수 있고, 대상체의 제2 복수의 T 세포를 채취할 수 있다. 제2 복수의 T 세포를 시퀀싱하고, 방법(100)을 수행할 수 있다. 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수를 결정할 수 있다. 그런 다음, 제1 복수의 T 세포 및 제2 복수의 T 셀 간의 발생 회수를 결정할 수 있다. 일부 사례에서, 특이적 TCR 서열에서 클론 증식이 발생한 것으로 결정될 수 있다. 다른 사례에서, 제1 복수의 T 세포와 제2 복수의 T 세포 간에 클론 증식이 발생한 TCR 서열의 일부 또는 전부가 동일한 TCR 서열이거나, 어느 것도 동일한 TCR 서열이 아니다. 결과적으로 T 세포 클론 증식 표지가 생성된다. T 세포 클론 증식 표지는, 클론 증식이 발생한 다수의 T 세포, 클론 증식이 발생한 T 세포의 식별자, 클론 증식의 전체 수, T 세포 당 클론 증식의 양, 및 이들의 조합 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 치료제에 대한 대상의 반응을 기록할 수 있고, 이를 T 세포 클론 증식 표지와 관련시킬 수 있다. 상기 프로세스를 복수의 대상체에 대해 반복하여, T 세포 클론 증식 서명 및 상응 치료 반응에 대한 데이터베이스를 생성할 수 있다. 개시된 방법 및 시스템은 후속하여 새로운 대상체의 T 세포 클론 증식 표지를 데이터베이스와 비교하여, 대상체를 위해 치료제(들)에 대한 가능성 있는 반응을 확인할 수 있다.
방법(100)의 일부 양태에서, 시퀀싱을 위한 T 세포의 채취 이전에 면역 요법을 대상체에게 투여할 수 있다. 면역 요법은 단일 요법 또는 병용 요법일 수 있다. 예를 들어, 면역 요법은 공자극 작용제 및 공억제 길항제의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, PD1, PDL1, CTLA4, LAG3 및 TIM3을 포함하되 이들로 한정되지 않는, 종양 세포 상의 T 세포 억제 수용체 또는 수용체가 면역 요법 동안 표적화될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 면역 요법은 PD1, PDL1, CTLA4, LAG3 및 TIM3 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 면역 요법 처방의 일부로서, 대상체에게 PD1, PDL1, CTLA4, LAG3, 및 TIM3 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하거나, 둘 이상의 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 임의의 조합을 투여할 수 있다.
일부 양태에서, 면역 요법은 PD1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, PD1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 서열번호 21의 중쇄 가변 영역(HCVR) 서열 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역(LCVR) 서열을 포함한다. 양태들에서, PD1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나는 미국 특허 출원 제14/603,776호(공개 번호 US 2015-0203579)에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, PD1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 LCVR을 포함한다. 일부 구현예에서, PD1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 및 HCVR을 포함한다. 일부 구현예에서, PD1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 도시된 바와 같은 HCVR 및 LCVR 쌍을 포함한다. PD1에 결합하는 다른 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 사용될 수 있으며, 이에는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 더발루맙, 아테졸리주맙, 피일리주맙, 캄렐리주맙, PDR001, MED10680, JNJ-63723283, 및 MCLA-134가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
PD1 항체에 대한 아미노산 서열 식별자
HCVR
서열번호 		LCVR
서열번호 		HCVR
서열번호 		LCVR
서열번호
1 2 28 26
3 4 29 26
5 6 30 26
7 8 31 26
9 10 32 26
11 12 33 26
13 14 34 26
15 16 35 26
17 18 36 26
19 20 37 26
21 22 38 24
23 24 39 24
25 26 40 24
27 26
일부 양태에서, 면역 요법은 (CD223으로도 알려진) LAG3 단백질에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, LAG3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 서열번호 93의 HCVR 서열 및 서열번호 94의 LCVR 서열을 포함한다. 일부 양태에서, LAG3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나는 미국 특허 출원 제15/289,032호(공개 번호 US 2017-0101472)에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 예를 들어, 일부 양태에서, LAG3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 3에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 LCVR을 포함한다. 일부 양태에서, LAG3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 3에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 및 HCVR을 포함한다. 일부 구현예에서, LAG3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 3에 도시된 바와 같은 HCVR 및 LCVR 쌍을 포함한다. LAG3에 결합하는 다른 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 사용될 수 있으며, 이에는 BMS-986016 및 GSK2381781이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
LAG3 항체에 대한 아미노산 서열 식별자
HCVR
서열번호 		LCVR
서열번호 		HCVR
서열번호 		LCVR
서열번호
41 42 81 82
43 44 83 84
45 46 85 86
47 48 87 88
49 50 89 90
51 52 91 92
53 54 93 94
55 56 95 96
57 58 97 98
59 60 99 98
61 62 100 98
63 64 101 98
65 66 102 98
67 68 103 98
69 70 104 105
71 72 106 105
73 74 107 105
75 76 108 109
77 78 110 111
79 80
일부 양태에서, 면역 요법은 PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 서열번호 122의 HCVR 서열 및 서열번호 123의 LCVR 서열을 포함한다. 일부 양태에서, PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나는 미국 특허 출원 제14/603,808호(공개 번호 US 2015-0203580)에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 예를 들어, 일부 양태에서, PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 4에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 LCVR을 포함한다. 일부 양태에서, PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 4에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 및 HCVR을 포함한다. 일부 양태에서, PDL1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 4에 도시된 바와 같은 LCVR 및 HCVR 쌍 포함한다. PDL1에 결합하는 다른 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 사용될 수 있으며, 이에는 아벨루맙(avelumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 및 더발루맙(durvalumab)이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
PDL1 항체에 대한 아미노산 서열 식별자
HCVR
서열번호 		LCVR
서열번호 		HCVR
서열번호 		LCVR
서열번호
112 113 137 138
114 115 139 140
116 117 141 142
118 119 143 144
120 121 145 146
122 123 147 146
124 125 148 146
126 127 149 146
128 129 150 146
130 131 151 146
132 133 152 146
134 133 153 146
135 136 154 146
일부 양태에서, 면역 요법은 CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나는 2017년 7월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/537,753호에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 예를 들어, 일부 양태에서, CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 5에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 LCVR을 포함한다. 일부 양태에서, CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 5에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 및 HCVR을 포함한다. 일부 양태에서, CTLA4에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 5에 도시된 바와 같은 LCVR 및 HCVR 쌍 포함한다. CTLA4에 결합하는 다른 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 사용될 수 있으며, 이에는 이필리무맙(ipilimumab) 및 트레멜리무맙(tremelimumab) 중 하나 이상뿐만 아니라 미국 특허 제6,984,720호; 제7,605,238호; 또는 제7,034,121호에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나가 포함되지만, 이들로 한정되지 않으며, 상기 문헌 모두는 참조로서 본원에 통합된다.
CTLA4 항체에 대한 아미노산 서열 식별자

HCVR
LCVR
HCVR
LCVR
155 156 187 188
157 158 189 190
159 160 191 192
161 162 193 192
163 164 195 194
165 166 197 196
167 168 199 198
169 170 201 200
171 172 203 202
173 174 205 204
175 176 207 206
177 178 209 208
179 180 211 210
181 182 213 212
183 184 215 214
185 186 217 216
일부 양태에서, 면역 요법은 GITR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, GITR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 서열번호 261의 HCVR 서열 및 서열번호 259의 LCVR 서열을 포함한다. 양태들에서, GITR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나는 미국 특허 출원 제15/619,068호에 기술된 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 문헌은 참조로서 본원에 통합된다. 예를 들어, 일부 양태에서, GITR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 HCVR 및 LCVR을 포함한다. 일부 구현예에서, GITR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6에 나열된 서열 중의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 및 HCVR을 포함한다. 일부 양태에서, GITR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6에 도시된 바와 같은 LCVR 및 HCVR 쌍 포함한다. GITR에 결합하는 다른 공지된 항체(또는 이의 항원 결합 단편)가 사용될 수 있다.
GITR 항체에 대한 아미노산 서열 식별자
HCVR LCVR HCVR LCVR
218 219 248 249
220 221 250 251
222 223 252 253
224 225 254 255
226 227 256 257
228 229 258 259
230 231 260 259
232 233 261 259
234 235 262 259
236 237 263 259
238 239 264 259
240 241 265 259
242 243 266 259
244 245 267 259
246 247 268 259
일부 양태에서, TCR 서열은 특정 치료제에 반응하여 증식하는 T 세포 클론에 존재하는 서열로서 식별될 수 있다. 이러한 식별된 TCR 서열은 T 세포 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 식별된 TCR 서열은 이러한 특정한 TCR 서열을 함유하는 T 세포를 생산하는데 사용될 수 있다. 그런 다음, 식별된 TCR 서열을 함유하는 이들 T 세포를 대상체에게 투여할 수 있고, 그런 다음 TCR 서열이 반응하는 것으로 결정된 특정 치료제로 상기 대상체를 차례로 치료할 수 있다. 일부 양태에서, T 세포 요법은, 특정 치료제에 반응하는 T 세포의 수를 증가시키기 위해 TCR 서열이 식별된 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, T 세포 요법은 TCR 서열이 식별된 대상체 이외의 대상체에게 투여될 수 있다. TCR 서열이 식별된 대상체 이외의 대상체에게 T 세포 요법을 투여하는 단계는, 달리 특정 치료제에 대해 반드시 반응하지 않을 수 있었던 대상체에게 특정 치료제에 반응할 수 있는 능력을 부여한다.
일부 양태에서, TCR 신호 전달은 식별된 TCR 서열을 함유하는 이들 T 세포에 대한 특정 약물에 대해 연구될 수 있다. 특정한 치료제에 의해 증식하는 T 세포에 존재하는 특이적 TCR 서열을 갖는 이들 수용체의 TCR 신호 전달은 종양 면역 감시(immune surveillance)에 대한 통찰력을 제공한다.
식별된 TCR 서열의 또 다른 용도는, 식별된 TCR 서열로 대상체에 존재하는 종양을 치료하기 위한 표적을 결정하기 위한 것일 수 있다. 식별된 TCR 서열에 결합하는 항원은 대상체에 존재하는 종양에 대한 표적이다. 표적이 식별되었으면 치료제를 결정할 수 있다.
일부 양태에서, 클론 증식에서의 TCR 서열을 식별하는 것은 바이러스 및 세균 감염 모두의 예후에 대해 사용될 수 있고, 암 및 감염성 질환의 질병 진행을 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
도 27 내지 33에 도시된 바와 같이, 단계(130)에서 맵핑된 짧은 리드를 제거하는 것은 첨단 TCR 분석 기술과 비교하여 정확성 및 정밀도 모두를 개선하는 데 기여한다.
도 27 내지 33의 방법은 TCR이 없을 것으로 예상되는 음성 대조군 데이터 세트를 사용한다. 이들 샘플은 모두 100 염기쌍(bp) 길이의 리드를 갖는 랜덤 프라이밍 RNA-Seq이다. 5개의 데이터세트는 다양한 마우스 종양 세포주로부터 유래한다(이들은 표 7에 도시됨). 2개의 데이터세트는 TCR의 형성에 필요한 유전자인 Rag1/2가 넉아웃된 마우스의 비장 샘플로부터 유래한다. 2개의 데이터세트는 인간 세포주로부터 유래하는데, 하나는 신경 전구 세포(NeuProgCell)의 것이고, 다른 하나는 근육아세포(LHCN-M2)의 것이다. 양성 대조군 데이터세트(VI-next-mouse-T cell)는 건강한 B6 마우스 샘플의 표적화 TCR 시퀀싱이며, 리드 길이는 300 bp이다. 이러한 데이터세트를 조작하여 다양한 시퀀싱 깊이(1000만, 5000만, 1억, 2억, 또는 5억 리드) 및 리드 길이(50 bp 또는 100 bp)로 시뮬레이션한 시험 데이터세트를 생성하였다.
또 다른 시험 데이터세트는 마우스 종양 샘플 유래의 분류된 T 세포의 벌크 무작위 프라이밍 RNA-Seq이며, 리드 길이는 80 bp이다. 상응하는 양성 대조군 데이터세트는, 벌크 데이터세트와 동일한 분류된 T 세포의 C1 Fluidigm 플랫폼유래의 단일 세포 RNA-Seq로 구성되며, 리드 길이는 75 bp이다.
TCR 파이프라인 벤치마킹에 대한 데이터세트가 표 7에 도시되어 있다.
구분 파일명 샘플 유형 시퀀싱 플랫폼 리드 길이
음성 대조군 M620270 MC38 대장 종양 세포주 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 M620272 MC38 대장 종양 세포주 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 M620295 B16F1 흑색종 종양 세포주 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 M620279 대장26 종양 세포주 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 M620343 Renca 신장 종양 세포주 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 T-ALL_neg1 Rag1/2 KO 마우스 유래의 비장 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 T-ALL_neg2 Rag1/2 KO 마우스 유래의 비장 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 NeuProgCell Rag1/2 KO 마우스 유래의 비장 무작위 프라이밍 100 bp
음성 대조군 LHCN-M2 인간 세포주 무작위 프라이밍 100 bp
양성 대조군 VI-next-mouse-T cell 건강한 B6 마우스 T 세포 표적화 PCR (fastq) 300 bp
양성 대조군 T-ALL T-All 샘플 표적화 PCR (fasta) 2x300 bp 병합
양성 대조군 Bulk RNA corresponding C1 data MC38/41BBL-Puro 종양 T 세포 무작위 프라이밍 75 bp
테스트 샘플 MP-100bp-10M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 100 bp
테스트 샘플 MP-100bp-50M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 100 bp
테스트 샘플 MP-100bp-100M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 100 bp
테스트 샘플 MP-100bp-200M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 100 bp
테스트 샘플 MP-100bp-500M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 100 bp
테스트 샘플 MP-50bp-10M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 50 bp
테스트 샘플 MP-50bp-50M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 50 bp
테스트 샘플 MP-50bp-100M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 50 bp
테스트 샘플 MP-50bp-200M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 50 bp
테스트 샘플 MP-50bp-500M 건강한 B6 마우스 T 세포 무작위 프라이밍 50 bp
테스트 샘플 T-ALL T-ALL 무작위 프라이밍 100 bp
테스트 샘플 Bulk RNA MC38/41BBL-Puro 종양 T 세포 무작위 프라이밍 80 bp
도 27은 rpsTCR 파이프라인의 민감도가 TCRklass와 매우 유사하고 MiTCR보다 더 양호하다는 것을 보여준다. 위양성이 아주 조금이라도 있는 경우, 이는 rpsTCR 파이프라인을 사용해 검출된다. rpsTCR 파이프라인은 음성 대조군 데이터세트에서 TCR을 식별하지 않는다. 비교하면, TCRklass는 거의 식별하지 않으며, MiTCR은 각 데이터세트에서 평균 수십 개의 TCR을 식별한다. rpsTCR 파이프라인 및 TCRklass는 VI-next-mouse-T cell 양성 대조군 데이터세트에서 TCR CDR3를 식별하는 데 약 80%에 가까운 민감도를 보이는 반면, MiTCR은 75%에 가까운 낮은 민감도를 가진다.
도 18은 MiTCR 또는 TCRklass에 의해 검출되지 않은 양성 데이터를 식별하는 rpsTCR 파이프라인의 능력을 도시한다. 양성 대조구 VI-next 데이터 세트에서 식별된 TCR 수에 있어서 세 가지 방법(MitCR, TCRklass, 및 rpStCR 파이프라인) 모두 사이에 강한 상관관계가 있으며, 총 TCR 중 약 10%는 rpsTCR 파이프라인 방법과 TCRklass에 의해 식별되었지만 MiTCR에 의해서는 식별되지 않았다.
도 28 및 30은, 마우스 T 세포의 50 bp 또는 100 bp의 무작위 프라이밍 리드를 각각 사용하는 MitCR, TCRklass, 및 rpStCR 파이프라인 간의 CDR3 검출 비교를 보여준다. 상위 CDR3 각각의 서열이 나열되어 있다. 도 29 및 31은 50 bp 또는 100 bp를 각각 사용하여 전체 VI-next 데이터세트에서 발견된 상위 CDR3을 보여준다. rpsTCR 파이프라인이 더 높은 민감도를 나타낸다.
도 28 및 29는 VI-next 양성 대조군 데이터 세트를 서브샘플링하여 형성된, 시뮬레이션된 50 염기쌍(bp) 길이 리드의 데이터세트에서 발견된 CDR3을 개략적으로 비교한다. MiTCR과 TCRklass와 달리, rpsTCR 파이프라인은 50 bp의 짧은 리드를 더 긴 콘틱으로 조립하여 TCR 서열을 더 잘 식별한다. 5억 리드로 이루어진 데이터세트(MP-50bp-500M)에서 MiTCR에 의해 발견된 상위 CDR3은 어떤 방법으로도 양성 대조군 데이터세트에서는 발견되지 않았으며, TCRklass 또는 rpsTCR 파이프라인에 의해서도 MP-50bp-500M에서 발견되지 않았다(도 28, 왼쪽 표). MP-50bp-500M에서 TCRklass에 의해 발견된 상위 CDR3은 시험 데이터 세트와 VI-next 데이터 세트 모두에서 다른 방법에 의해 발견되었다(도 28, 중간 표). rpsTCR 파이프라인에 의해 식별된 상위 CDR3은 VI-next 데이터세트에서 모든 방법에 의해 더 많은 수가 식별되었으며, MP-50bp-500M 데이터세트에서는 다른 두 가지 방법에 의해 부분적으로 식별되었다(도 28, 오른쪽 표). VI-next 데이터 세트에서 발견된 상위 CDR3은, 50 bp 길이의 1000만~5억 개의 리드에 대해 서브샘플링된 MP에서 rpsTCR에 의해 가장 흔하게 발견되었다(도 29).
도 30 및 31은 조립 단계가 없는 rpsTCR 파이프라인 방법을 MiTCR 및 TCRklass와 비교하기 위해, VI-next 양성 대조군 데이터세트 유래의 2억 개의 리드를 서브샘플링하여 형성된, 시뮬레이션된 100 bp 데이터 세트에서 발견된 CDR3에 대한 비교를 개략적으로 도시한다. 다시, 100 bp 길이의 5억 개의 리드(MP-100bp-500M)에서 MiTCR에 의해 발견된 상위 CDR3은 임의의 다른 방법으로는 발견되지 않았다(도 30, 왼쪽 표). TCRklass에 의해 발견한 상위 2개의 CDR3은 다른 방법 중 어느 하나에 의해 발견되지 않은 위양성인 것으로 보이지만(도 30, 중간 표), 다른 것들은 rpsTCR 파이프라인에 의해 발견된 상위 CDR3과 잘 상응한다 (도 30, 오른쪽 표). 모든 방법은, VI-next 데이터세트로부터 상위 CDR3를 식별함에 있어서 이러한 리드 길이에서는 비슷한 민감도를 가진다(도 31).
도 32는 단일 세포 시퀀싱에서 검출된 CDR3의 절반 이상이 벌크 RNA 시퀀싱에서 검출될 수 있음을 보여준다. 3가지 방법의 최종 비교는, 단일 세포 데이터에서 발견된 TCR 중 얼마나 많은 것이 동일한 샘플 유래의 벌크 RNA-Seq 데이터에서 발견될 수 있는 지를 정량화하는 단계를 포함한다. 단일 세포 데이터에서 식별된 상위 CDR3은 대부분 3개의 방법 모두에 의해 식별되며, 벌크 데이터세트에서는 모든 방법 전반에 걸쳐 일관되게 식별된다(도 32).
서열 조립이 필요하지 않은 경우, rpsTCR 파이프라인 방법은 100 bp의 리드 길이를 갖는 데이터세트는 기존 방법과 유사하다. 그러나, rpsTCR 파이프라인이 서열 조립을 구현하는 짧은 리드의 데이터세트에서는, 다른 방법들에 비해 민감도가 크게 개선된다.
도 2는 종양 이식된 마우스의 종양이나 (동일한 종양을 가진 마우스 유래의) 마우스 비장으로부터 단리된 T 세포로부터 결정된 CDR3 서열을 도시한 것이다(실시예 1). 3개 이상의 단일 T 세포로부터 검출된 동일한 CDR3 서열은 클로 증식된 T 세포인 것으로 결정되었다. 병용 요법으로 치료된 그룹(aGITR + aPD-1)은 (3개 이상의 클론을 갖는 T 세포로부터의 상이한 TCR 서열의 개수로 표시된 바와 같이) 콜론 증식된 T 세포의 다양한 분획을 나타내는 종양을 치료 후 11일까지 가지고 있었다. 본 실시예에서, 특이적 TCR 서열의 개수가 아니라, 증식된 T 세포 클론의 총 수가 치료 후 증론 증식을 결정하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 클론 증식은 아미노산 수준에서 TCR이 동일한 것에 의해 결정되지만, 핵산 서열은 변이를 포함할 수 있다. 비장으로부터 단리된 T 세포는 클론 증식되지 않았다. 주목할 것은, PD-1으로 치료한 일부 마우스에서 검출된 동일한 TCR CDR3 서열인데, 아직 이들은 클론 증식된 것으로 간주되지 않았다(<3 검출됨).
도 2는 공지된 TCR 서열의 예시적인 TCR 서열 라이브러리 및 하나 이상의 치료제에 대한 상응 치료 반응을 도시한다. 도 2에 도시된 바와 같이, TCR 서열 1 내지 TCR 서열 10은 aGITR 및 aPD1의 병용 치료에 대해 3 이상의 클론 증식 값을 갖는다. 클론 증식 값은 다수의 세포 중 특이적 TCR 서열이 발생한 수를 나타내며, 이는 세포가 클로닝된 회수를 나타낸다. TCR 서열 11 내지 TCR 서열 17은 aPD1에 의한 치료에 대해 3 이상의 클론 증식 값을 갖는다. TCR 서열 18 내지 TCR 서열 20은 aGITR에 의한 단독 치료에 대해 3 이상의 클론 증식 값을 갖는다. 세포 서열 데이터가 수득되었고 TCR 서열이 확인된 대상체의 경우, 도 2에 도시된 바와 같이 식별된 TCR 서열이 TCR 라이브러리와 비교될 수 있고 일치 여부가 결정될 수 있다. 일 양태에서, 일치 횟수는 특정 치료제에 대한 잠재 반응을 나타내는 것일 수 있다. 또 다른 양태에서, 각 치료제를 기준으로 일치와 연관시킨 클론 증식 값의 합을 사용하여 어떤 치료제가 대상체에 대한 더 높은 누적 클론 증식 값과 연관되는지 결정할 수 있다. 일 예로서, TCR 서열 1, TCR 서열 2, TCR 서열 13, TCR 서열 14, TCR 서열 15, 및 TCR 서열 16을 갖는 환자 서열 데이터는 aGITR과 aPD1의 조합에 대해 14의 누적 클론 증식 값을 가질 것이고, aPD1 한 가지에 대해서는 16의 누적 클론 증식 값을 가질 것이다. 따라서, 대상체는 aPD1 한 가지에 반응할 가능성이 더 높다.
도 3은 도 2에 포함된 결과를 그래픽으로 도시한 것이다. 도 3은, aGITR과 aPD1의 조합에 대한 증식된 클론의 백분율이 치료 후 11일 차에 31.9%이고, aPD1 한 가지에 대한 증식된 클론의 백분율이 치료 후 11일차에 26.7%이며(치료 후 8일차에는 4.8%), aGITR 한 가지에 대한 증식된 클론의 백분율은 치료 후 11일차에 20.3%임을 나타내는 막대 그래프이다. 일 양태에서, 도 2의 결과 및 도 3의 그래프는 하나 이상의 치료제를 하나 이상의 대상체에 투여한 후 얻어진 데이터에 기초한 것일 수 있다. 방법(100)은 대상체에게 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법(100)은 하나 이상의 치료제와 연관된 TCR 서열 및 상응하는 클론 증식에 대한 TCR 서열 라이브러리를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 도 3은 항PD1(aPD1) 또는 항GITR(aGITR)을 투여하는 한 가지(단일) 요법과 비교하여, 종양을 가진 마우스의 병용 치료에서 식별된 클론 증식된 T 세포의 수의 유의성을 보여준다. 항PD1(aPD1) 및 항GITR(aGITR) 치료제 모두는 아이소타입 대조군으로 치료한 마우스의 종양과 비교하여 증식된 클론의 백분율과 관련하여 상당히 증가된다.
도 4는 도 1의 방법(100)의 일 구현예의 예시적인 출력을 도시한다. 도 4는 클론 증식 후의 T 세포 계통을 도시한다. 치료제 유형 내에서(예를 들어, aGITR 및 aPD1의 조합, aPD1 단독, aGITR 단독) 클론 팽창은 다양한 세포 서브타입, 예컨대 미처리, T 세포 메모리(Tcm), T 세포 작동자 메모리(Tem), T 세포 작동자(Teff) 등에 걸쳐 일어난다. 도 4는 특정 치료제와 연관된 서열을 계수(예를 들어, 클론 증식 값)와 함께 나타내며, 클론 증식 값과 연관된 세포 서브타입에 대한 표시를 포함한다. 도 4는 클론의 각 세트 내 T 세포의 프로파일을 도시한다. 발현된 TCR CDR3 서열에 의해 식별된 각각의 T 세포 클론는 a) 작동기 기억 세포(Tem) (Cd62L-Cd44+Gzmb+), b) 작동기 T 세포 (Teff) (Cd62L-Cd44-Gzmb+), c) 미처리 T 세포 (Cd62L+Cd44-Gzmb-), 또는 d) 중앙 메모리 T 세포(Tcm) (Cd62L+Cd44+Gzmb-)로서 특성화하거나, 달리 미분류 세포(빈 타원)로서 특성화하였다(예를 들어, 세포 표면 마커별로 분류함).
하나 이상의 TCR 서열을 결정하는 방법이 개시되며, 상기 방법은: 대상체의 제1 세포 유래의 단일 세포 원시 리드를 포함하는 제1 서열 데이터를 수득하는 단계; 생물정보학 도구를 사용해 제1 서열 데이터를 복수의 비-T 세포 수용체 전사물을 포함하는 제2 서열 데이터에 맵핑하여 제1 서열 데이터에서 하나 이상의 맵핑되지 않은 리드를 식별하는 단계; 및 맵핑되지 않은 리드로부터 하나 이상의 TCR 서열을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 대상체의 제1 세포 유래의 단일 세포 원시 리드를 포함하는 제1 서열 데이터를 획득하는 단계는 제1 세포로부터 수득된 전사물에 대해 무작위 프라이머 RNA 시퀀싱을 수행하는 단계를 포함한다. 무작위 프라이머는 4~40 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 사례에서, 무작위 프라이머는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 양태에서, 제1 서열 데이터를 수득하기 전에, 대상물에게 면역 요법이 투여된다. 면역 요법은 단일 요법 또는 병용 요법일 수 있다. 예를 들어, 면역 요법은 공자극 작용제 및 공억제 길항제의 조합일 수 있다.
TCRβ 사슬의 CDR3 서열을 포함하는 벡터가 개시된다. 일부 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터일 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 일부 양태에서, CDR3 서열은 CASSRNTEVFF (서열번호 269), CASSIGNTEVFF (서열번호 270), CASSQPGKNTEVFF (서열번호 271), CASSLGQGNNSPLYF (서열번호 272), CASSQGQGGAETLYF (서열번호 273), CASSPPMGGQLYF (서열번호 274), CASSQEGANTEVFF (서열번호 275), CASSQVQGTGNTLYF (서열번호 276), CASSQEGDGYEQYF (서열번호 277), CTSAEGGGTEVFF (서열번호 278), CASSPPGGGTEVGG (서열번호 279), CASSGTDNQDTQYF (서열번호 280), CASSPGTGGYEQYF (서열번호 281), CASSLELGFYEQYF (서열번호 282), CASSLGGAPNERLFF (서열번호 283), CASSQEGDSYEQYF (서열번호 284), CASSRNTEVFF (서열번호 285), CASGDAMGGRDYAEQFF (서열번호 286), CGAREGQDTQYF (서열번호 287), CGARTGGEQYF (서열번호 288), 또는 CTCSAGNQAPLF (서열번호 289)를 암호화하는 핵산 서열이다. 따라서, 일부 양태에서, 서열번호 269 내지 289 중 어느 하나의 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 개시된다.
일 양태에서, 유사한 결합 특이성을 갖는 TCR 서열은 Gupta N.T. 등의 Hierarchical clustering can identify B cell clones with high confidence in Ig repertoire sequencing data. J. Immunol. 198(6), 2489-2499 (2017)에 개시된 바와 같이 클러스터로 그룹화될 수 있다. 간략하게, TCR 서열의 CDR3 영역은, 단일 결합 계층적 클러스터링을 사용하여 클러스터링될 수 있으며; 2개의 CDR3 서열 사이의 거리는 상기 2개의 서열 간의 뉴클레오티드 차이의 절대 개수로서 정의될 수 있고, 일 양태에서는, 전술한 참조 문헌에 개시된 바와 같은 서열 데이터세트로부터 추론될 수 있는 임계 값(threshold)으로서 정의될 수 있다.
또한, 서열번호 269 내지 289 중 어느 하나의 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 재조합 세포가 개시된다.
TCRβ 사슬의 CDR3 서열을 포함하는 재조합 세포가 개시된다. 일부 양태에서, CDR3 서열은 상이한 세포 유형이나 세포주, 또는 CDR3 서열을 포함하는 재조합 세포와 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, CDR3 서열은 일차 인간 T 세포로부터 유래할 수 있고, CDR3 서열을 포함하는 상기 세포는 CDR3 서열이 유래된 세포가 아인 임의의 T 세포로부터 유래된 T 세포주일 수 있다. 다른 예를 들어, CDR3 서열은 인간 세포로부터 유래할 수 있고, CDR3 서열을 포함하는 상기 세포는 비인간 세포일 수 있다. 일부 양태에서, CDR3 서열은 CASSRNTEVFF (서열번호 269), CASSIGNTEVFF (서열번호 270), CASSQPGKNTEVFF (서열번호 271), CASSLGQGNNSPLYF (서열번호 272), CASSQGQGGAETLYF (서열번호 273), CASSPPMGGQLYF (서열번호 274), CASSQEGANTEVFF (서열번호 275), CASSQVQGTGNTLYF (서열번호 276), CASSQEGDGYEQYF (서열번호 277), CTSAEGGGTEVFF (서열번호 278), CASSPPGGGTEVGG (서열번호 279), CASSGTDNQDTQYF (서열번호 280), CASSPGTGGYEQYF (서열번호 281), CASSLELGFYEQYF (서열번호 282), CASSLGGAPNERLFF (서열번호 283), CASSQEGDSYEQYF (서열번호 284), CASSRNTEVFF (서열번호 285), CASGDAMGGRDYAEQFF (서열번호 286), CGAREGQDTQYF (서열번호 287), CGARTGGEQYF (서열번호 288), 또는 CTCSAGNQAPLF (서열번호 289)의 서열을 포함하는 CDR 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 무작위 프라이밍 RNA 시퀀싱으로부터 TCR 서열을 식별하기 위한 개시된 방법은 B 세포 수용체(BCR)를 식별하는데에도 사용될 수 있다. 파이프라인의 단계는 다음의 단계를 제외하고 거의 동일하다: 1) 음성 선별 단계로서, BCR을 식별하는 단계가 복수의 종-특이적 비-B 세포 수용체 RNA 전사물을 포함하는 제1 기준 데이터세트에 대해 짧은 리드를 정렬하는 단계를을 포함하는 것인, 단계; 2) 조립 단계로서, BCR을 식별하는 단계가, 추가 프로세싱을 위해 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계를 포함하며, 상기 조립 단계는 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 BCR 서열의 기준 데이터베이스로부터의 하나 이상의 BCR 서열에 대해 정렬하는 단계, 및 BCR 서열의 기준 데이터베이스에 기초하여 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 긴 리드(후보 BCR 서열)로 조립하는 단계를 포함할 수 있는 것인, 단계; 및 3) 정렬 단계로서, BCR을 식별하는 단계가 후보 BCR 서열을 BCR V 및 J 유전자의 기준에 대해 정렬하는 단계를 BCR CDR3 영역을 식별하는 단계와 함께 포함하는 것인, 단계. 일 양태에서, 하나 이상의 긴 리드로부터 하나 이상의 BCR 서열을 생성하는 단계는 Alamyar, E., 등의 IMGT tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and t cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Mol. Biol. 882, 569-604 (2012)에 개시된 하나 이상의 기술을 포함할 수 있다.
예시적인 양태에서, 상기 방법 및 시스템은 도 8에 도시되고 아래 기술된 바와 같이 컴퓨터(801) 상에서 구현될 수 있다. 유사하게, 개시된 방법 및 시스템은 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 기능을 수행하기 위해 하나 이상의 컴퓨터를 이용할 수 있다. 도 8은 개시된 방법을 수행하기 위한 예시적인 운영 환경을 나타내는 블록 다이어그램이다. 이러한 예시적인 운영 환경은 운영 환경의 예시일 뿐이며 운영 환경 아키텍처의 사용 또는 기능의 범위에 대한 임의의 제한을 제시하도록 의도되지 않는다. 또한, 운영 환경은 예시적인 운영 환경에 도시된 컴포넌트 중 임의의 하나 또는 조합과 관련된 임의의 의존성 또는 요구사항을 갖는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 방법 및 시스템은 다수의 다른 범용 또는 특수 목적 컴퓨터 시스템 환경 또는 구성으로 작동 가능할 수 있다. 본 시스템 및 방법과 함께 사용하기에 적절할 수 있는 널리 공지된 컴퓨터 시스템, 환경, 및/또는 구성의 예는, 비제한적으로, 개인 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 랩톱 장치, 및 멀티프로세서 시스템을 포함한다. 추가의 예는 셋톱 박스, 프로그램 가능한 가전 제품, 네트워크 PC, 미니컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터, 상기 시스템 또는 장치 중 임의의 것을 포함하는 분산 컴퓨팅 환경 등을 포함한다.
개시된 방법 및 시스템의 처리는 소프트웨어 컴포넌트에 의해 수행될 수 있다. 개시된 방법 및 시스템은 하나 이상의 컴퓨터 또는 다른 장치에 의해 실행되는 프로그램 모듈과 같은, 컴퓨터로 실행가능한 명령어의 일반적인 맥락에서 기술될 수 있다. 일반적으로, 프로그램 모듈은 특정 태스크를 수행하거나 특정 추상 데이터 유형을 구현하는 컴퓨터 코드, 루틴, 프로그램, 객체, 컴포넌트, 데이터 구조 등을 포함한다. 개시된 방법은, 또한, 태스크가 통신 네트워크를 통해 연결된 원격 처리 장치에 의해 수행되는 그리드 기반 및 분산형 컴퓨팅 환경에서 실시될 수 있다. 분산형 컴퓨팅 환경에서, 프로그램 모듈은 메모리 저장 장치를 포함하는 로컬 및 원격 컴퓨터 저장 매체 둘 모두에 위치할 수 있다.
또한, 당업자는 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법이 컴퓨터(801) 형태의 범용 컴퓨팅 장치를 통해 구현될 수 있음을 인식할 것이다. 컴퓨터(801)의 구성 요소는, 하나 이상의 프로세서(803), 시스템 메모리(812), 및 시스템 메모리(812)에 하나 이상의 프로세서(803)를 포함하는 다양한 시스템 구성 요소를 결합시키는 시스템 버스(813)를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 시스템은 병렬 처리를 이용할 수 있다. 병렬 처리는 개시된 방법을 수행하기 위해 활용될 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법의 하나 이상의 단계의 적어도 일부를 수행하는 것을 작업(job)으로서 분류할 수 있다. 예를 들어, 개시된 방법은 복수의 샘플에 대해 병렬로 수행될 수 있다. 각 작업에 대한 작업량(workload)은 여러 개의 프로세서에 걸쳐 배분될 수 있다. 소프트웨어 애플리케이션을 사용해 데이터 처리를 위한 작업을 설계하고 실행할 수 있다. 작업은, 예를 들어, 하나 이상의 데이터 소스로부터 데이터를 추출하고, 데이터를 변환하고, 하나 이상의 새로운 위치에 로딩하는 것(예를 들어, 또 다른 작업에서의 처리를 위한 데이터를 단계별로 나누는 것)일 수 있다. 병렬 처리의 위상 배치(topology)에서, 각 작업에 대한 작업량은 연산 노드(compute nodes)라 불리는 하나 이상의 컴퓨터 상의 여러 프로세서에 걸쳐 배분될 수 있다. 일 양태에서, 사용자는 구성 파일을 변경하거나, 다르게는 다중 처리 노드를 정의하도록 구성된 소프트웨어와 인터페이스할 수 있다. 이들 노드는 동시에 업무를 수행하여 각각의 작업을 신속하고 효율적으로 완료한다. 지휘자 노드 컴퓨터(conductor node computer)는 업무를 조율할 수 있다. 병렬 처리 환경은 대칭적 다중 처리(SMP: symmetric multiprocessing) 시스템 또는 초병렬 처리(MPP: massively parallel processing) 시스템으로 분류될 수 있다. 대칭적 다중 처리(SMP) 환경에서는, 다수의 프로세서가 다른 하드웨어 자원을 공유한다. 예를 들어, 다수의 프로세서는 동일한 메모리 및 디스크 공간을 공유하되, 단일 운영 체제를 사용할 수 있다. 그러면, 병렬 작업에 대한 작업량이 시스템의 프로세서에 걸쳐 분배된다. 작업이 완료될 때의 실제 속도는 시스템의 공유 리소스에 의해 제한될 수 있다. 시스템의 규모를 늘이기 위해서는, 프로세서의 수를 증가시키거나, 메모리를 추가하거, 저장 용량을 증가시킬 수 있다. 초병렬 처리(MPP) 시스템에서는, 많은 컴퓨터가 동일한 섀시에 물리적으로 수용될 수 있다. MPP 시스템은 물리적으로 분산될 수 있다. MPP 환경에서는, 실제 컴퓨터 간에 리소수를 공유할 필요가 없으므로 성능이 향상된다. 시스템을 규모를 늘이기 위해서는, 컴퓨터를 관련 메모리 및 디스크 리소스와 함께 추가할 수 있다. MPP 시스템에서는, 네트워크를 통해 파일 시스템이 공통적으로 공유된다. 이러한 구성에서는, 프로그램 파일을 시스템의 개별 노드에 설치하는 대신에 공유할 수 있다.
시스템 버스(813)는 다양한 버스 아키텍처 중 임의의 것을 사용하는 메모리 버스 또는 메모리 컨트롤러, 주변기기 버스, 가속 그래픽 포트, 또는 로컬 버스를 포함하는 여러 가능한 유형의 버스 구조들 중 하나 이상을 나타낸다. 예시로서, 이러한 아키텍처는 산업 표준 아키텍처(ISA: Industry Standard Architecture) 버스, 마이크로 채널 아키텍처(MCA: Micro Channel Architecture) 버스, 향상된 ISA(EISA) 버스, 비디오 전자기기 표준 협회(VESA: Video Electronics Standards Association) 로컬 버스, 가속 그래픽 포트(AGP: Accelerated Graphics Port) 버스, 및 주변기기 구성요소 상호 연결(PCI: Peripheral Component Interconnects), PCI-Express 버스, 퍼스널 컴퓨터 메모리 카드 산업 협회(PCMCIA: Personal Computer Memory Card Industry Association), 범용 직렬 버스(USB: Universal Serial Bus) 등을 포함할 수 있다. 버스(813), 및 본 명세서에서 명시된 모든 버스는 또한 유선 또는 무선 네트워크 접속을 통해 구현될 수 있으며, 하나 이상의 프로세서(803), 대용량 저장 장치(804), 운영 체제(805), T 세포 파이프라인 소프트웨어(806), T 세포 파이프라인 데이터(807), 네트워크 어댑터(808), 시스템 메모리(812), 입/출력 인터페이스(810), 디스플레이 어댑터(809), 디스플레이 장치(811), 및 사용자-장치 인터페이스(802)를 포함하는 하위 시스템의 각각은 이러한 형태의 버스를 통해 접속된 물리적으로 별개의 위치에서 하나 이상의 원격 연산 장치(814a,b,c) 내에 포함되어 사실상 완전 분산형 시스템을 구현할 수 있다.
컴퓨터(801)는 일반적으로 다양한 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함한다. 예시적인 판독가능 매체는 컴퓨터(801)에 의해 접근 가능한 임의의 이용 가능한 매체일 수 있으며, 예를 들어 휘발성 및 비휘발성 매체, 착탈식 및 비착탈식 매체를 모두 포함하되 이들로 한정되지는 않는다. 시스템 메모리(812)는 임의 접근 메모리(RAM)와 같은 휘발성 메모리, 및/또는 읽기 전용 메모리(ROM)와 같은 비휘발성 메모리 형태의 컴퓨터 판독가능 매체를 포함한다. 시스템 메모리(812)는 일반적으로 T 세포 파이프라인 데이터(807)와 같은 데이터, 및/또는 하나 이상의 프로세서(803)에 즉시 접근 가능하고/하거나 이에 의해 현재 작동되는 운영 체제(805) 및 T 세포 파이프라인 소프트웨어(806)와 같은 프로그램 모듈을 포함한다.
또 다른 양태에서, 컴퓨터(801)는 다른 착탈식/비착탈식, 휘발성/비휘발성 컴퓨터 저장 매체를 포함할 수도 있다. 예로서, 도 8은 컴퓨터(801)를 위한 컴퓨터 코드, 컴퓨터 판독 가능 명령어, 데이터 구조, 프로그램 모듈, 및 다른 데이터의 비휘발식으로 저장할 수 있는 대용량 저장 장치(804)를 도시한다. 예를 들어 그리고 제한하고자 하는 것은 아니지만, 대용량 저장 장치(804)는 하드 디스크, 착탈식 자기 디스크, 착탈식 광 디스크, 자기 카세트 또는 다른 자기 저장 장치, 플래시 메모리 카드, CD-ROM, 디지털 다용도 디스크(digital versatile disk, DVD) 또는 다른 광 저장 장치, 무작위 접근 메모리 (RAM), 읽기 전용 메모리 (ROM), 전기적으로 삭제가능한 판독가능한 읽기 전용 메모리 (EEPROM) 등일 수 있다.
선택적으로, 예를 들어 운영 체제(805) 및 T 세포 파이프라인 소프트웨어(806)를 포함하여 임의의 수의 프로그램 모듈이 대용량 저장 장치(804)에 저장될 수 있다. 운영 체제(805)와 T 세포 파이프라인 소프트웨어(806) 각각(또는 이들의 일부 조합)은 프로그래밍 및 T 세포 파이프라인 소프트웨어(806)의 요소를 포함할 수 있다. T 세포 파이프라인 데이터(807)도 대용량 저장 장치(804)에 저장될 수 있다. T 세포 파이프라인 데이터(807)는 당업계에 공지된 하나 이상의 데이터베이스 중 임의의 것에 저장될 수 있다. 이러한 데이터베이스의 예는 DB2®, Microsoft® Access, Microsoft® SQL Server, Oracle®, mySQL, PostgreSQL 등을 포함한다. 데이터베이스는 집중화되거나 다수의 시스템에 걸쳐 분산될 수 있다.
또 다른 양태에서, 사용자는 입력 장치(미도시)를 통해 컴퓨터(801)에 명령어 및 정보를 입력할 수 있다. 이러한 입력 장치의 예는 키보드, 포인팅 장치(예: "마우스"), 마이크, 조이스틱, 스캐너, 글러브와 같은 촉감 입력 장치, 및 기타 입는 장치 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이들 및 다른 입력 장치는 시스템 버스(813)에 결합된 사용자-장치간 인터페이스(802)를 통해 하나 이상의 프로세서(803)에 연결될 수 있지만, 병렬 포트, 게임 포트, (Firewire 포트로도 지칭되는) IEEE 1394 포트, 직렬 포트, 또는 범용 직렬 버스(USB)와 같은 다른 인터페이스 및 버스 구조에 의해 연결될 수 있다.
또 다른 양태에서, 디스플레이 장치(811)도 디스플레이 어댑터(809)와 같은 인터페이스를 통해 시스템 버스(813)에 연결될 수 있다. 컴퓨터(801)는 2개 이상의 디스플레이 어댑터(809)를 가질 수 있고, 컴퓨터(801)는 2개 이상의 디스플레이 장치(811)를 가질 수 있는 것으로 간주한다. 예를 들어, 디스플레이 장치(811)는 모니터, LCD(액정 디스플레이), 또는 프로젝터일 수 있다. 디스플레이 장치(811) 이외에, 다른 주변 장치는 입/출력 인터페이스(810)를 통해 컴퓨터(801)에 연결될 수 있는 스피커(미도시) 및 프린터(미도시)와 같은 구성 요소를 포함할 수 있다. 본 방법의 임의의 단계 및/또는 결과는 임의의 형태로 출력 장치에 출력될 수 있다. 이러한 출력은 텍스트, 그래픽, 애니메이션, 오디오, 촉각 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 임의의 형태의 시각적 표현일 수 있다. 디스플레이(811) 및 컴퓨터(801)는 하나의 장치의 일부이거나 별도의 장치일 수 있다.
컴퓨터(801)는 하나 이상의 원격 연산 장치(814a, b, c)에 대한 논리 접속을 사용하여 네트워크 환경에서 작동할 수 있다. 예로서, 원격 연산 장치는 개인 컴퓨터, 휴대용 컴퓨터, 스마트폰, 서버, 라우터, 네트워크 컴퓨터, 피어 장치 또는 다른 공통 네트워크 노드 등일 수 있다. 컴퓨터(801)와 원격 연산 장치(814a, b, c) 사이의 논리 접속은 근거리 네트워크(LAN) 및/또는 일반 광역 네트워크(WAN)와 같은 네트워크(815)를 통해 이루어질 수 있다. 이러한 네트워크 접속은 네트워크 어댑터(808)를 통해 이루어질 수 있다. 네트워크 어댑터(808)는 유선 및 무선 환경 둘 모두에서 구현될 수 있다. 이러한 네트워킹 환경은 주택, 사무실, 전사적 컴퓨터 네트워크, 인트라넷, 및 인터넷에서 통상적이고 흔하다.
도시의 목적으로, 응용 프로그램 및 운영 체제(805)와 같은 다른 실행 가능한 프로그램 컴포넌트가 본 명세서에 별개의 블록으로 도시되어 있지만, 이러한 프로그램 및 컴포넌트는 연산 장치(801)의 다양한 시간에 상이한 저장 컴포넌트에 상주하며, 컴퓨터의 하나 이상의 프로세서(803)에 의해 실행되는 것으로 인식된다. T 세포 파이프라인 소프트웨어(806)의 구현은 일부 형태의 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장되거나 이를 통해 전송될 수 있다. 임의의 개시된 방법이 컴퓨터 판독가능 매체 상에 구현된 컴퓨터 판독가능 명령어에 의해 수행될 수 있다. 컴퓨터 판독가능 매체는 컴퓨터에 의해 액세스될 수 있는 임의의 이용 가능한 매체일 수 있다. 한정하고자 하는 것이 아니라 예로서, 컴퓨터 판독가능 매체는 "컴퓨터 저장 매체" 및 "통신 매체"를 포함할 수 있다. "컴퓨터 저장 매체"는 컴퓨터 판독가능 명령어, 데이터 구조, 프로그램 모듈, 또는 다른 데이터와 같은 정보의 저장을 위한 임의의 방법 또는 기술로 구현되는 휘발성 및 비휘발성, 착탈식 및 비착탈식 매체를 포함한다. 예시적인 컴퓨터 저장 매체는 RAM, ROM, EEPROM, 플래시 메모리 또는 다른 메모리 기술, CD-ROM, 디지털 다용도 디스크(DVD) 또는 다른 광 저장 장치, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 저장 장치 또는 다른 자기 저장 장치, 또는 원하는 정보를 저장하는 데 사용될 수 있고 컴퓨터에 의해 액세스될 수 있는 임의의 다른 매체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
다음의 실시예는 당업자에게 본 명세서에 청구된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 실시되고 평가되는지에 관한 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 순수하게 예시적인 것으로 의도되며, 본 방법 및 시스템의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다. 수치(예를 들어, 양 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력하였지만, 일부 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한, %(parts)는 중량%(parts by weight)이고, 온도는 ℃이거나 주변 온도이며, 압력은 대기압이거나 대기압 근처이다.
본 방법 및 시스템은 기계 학습 및 반복 학습과 같은 인공 지능 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기법의 예는 전문가 시스템, 사례 기반 추론, 베이지안 네트워크, 행동 기반 AI, 신경망, 퍼지 시스템, 진화 연산(예를 들어, 유전자 알고리즘), 군집 지능(예를 들어, 개미 알고리즘), 및 하이브리드 지능형 시스템(예를 들어, 신경망을 통해 생성된 전문가 추론 규칙 또는 통계 학습으로부터의 생성 규칙)을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
하기 실시예는 구현예를 보다 상세히 설명하기 위해 제공된다. 이들은 청구된 구현예를 도시하도록 의도되며, 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
생체 내 마우스 연구
MC38 종양 연구를 위해, 3x105 또는 5x105 MC38 세포를 C57BL/6 또는 인간화 GITR/GITRL 이중 넉인 마우스의 우측 옆구리에 각각 피하 주사하였다(0일차). 종양 이식 후 6일차에, 마우스를 종양 크기에 기초하여 그룹화하고, 5 mg의 kg-1 항GITR(DTA1) 및/또는 항PD-1(RPM1-14) Ab 또는 아이소타입 대조군 IgG(랫트 IgG2b, LTF-2 및 랫트 IgG2a, 2A3)의 표시된 용량(Bio X Cell로부터 수득한 Ab)으로 복강내 주사하여 치료하였다. 항체를 13일차에 다시 투여하였다. 항PD-1(aPD-1) 및 항GITR(aGITR) Ab의 조합으로 치료한 마우스는 80일이 넘는 기간 동안 무종양 상태로 있었다. 3 x 105의 MC38 및 2.5 x 105의 B16F10.9 세포로 이들 마우스의 양 옆구리에 다시 접종하였다. 미처리 마우스는 종양 이식 대조군으로서 사용하였다.
T 세포 하위 집합 제거 실험을 위해, 병용 요법 또는 아이소타입 대조군 IgG로 치료한 마우스를 항CD4, 클론 GK1.5; 항CD8 클론 2.43 및 랫트 IgG2b 아이소타입(BioX Cell) 및 항CD25, 클론 PC61(eBioscience)을 포함하는 300 μg의 제거 mAb로 치료하고, 랫트 IgG1 아이소타입(HPRN, BioX Cell) 제거 Ab를 종양 접종 하루 전(-1일차) 및 매주 2회 씩, 총 8회 용량을 투여하였다. 말초 혈액 샘플의 FACS 분석에 의해 제거 효율을 확인하였다. 디지털 캘리퍼스(VWR, Radnor, PA)를 사용하여 주당 2~3회 수직 종양 직경을 맹검 측정하였다. 식 L Х W Х 0.5를 사용해 체적을 계산하였는데, 여기서 L은 가장 긴 치수이고 W 는 수직 치수이다. 각 그룹별 생존 차이를 카플란-메이어 방법(Kaplan-Meier method)로 결정하고, Prism 버전 6(GraphPad Software Inc.)에 의한 생존 분석을 이용하여 log-순위 검정에 의해 전체 P 값을 계산하였다. 사망률을 최소화하기 위해, 최대 종양 체적에 있어서 종양 부담이 2000 mm3의 프로토콜 규정 크기에 도달한 경우 이벤트를 사망으로 정의하였다.
실시예 2
단일 세포 분류 RNA- seq 분석
종양 접종 후 8 및 11일차에, 마우스 종양 해리 키트(Miltenyi Biotec)에 의해 종양의 단일 세포 현탁액을 제조하였고, 비장을 gentleMACS Octo 해리기로 해리하였다. 동일한 치료 그룹 유래의 종양 및 비장을 하나의 풀로 모으고, 생존 가능한 CD8+ T 세포를 FACS에 의해 분류하였다. FACS로 분류한 T 세포를 C1 세포 현탁 시약(Fluidigm)과 혼합한 다음, 5 내지 10 μm의 C1 Integrated Fluidic Circuit(IFC; Fluidigm) 상에 로딩하였다. 2.5 μL의 에티듐 동종 이량체-1 및 0.625 μL의 calcein AM(Life Technologies)을 1.25 mL의 C1 Cell Wash Buffer(Fluidigm)에 첨가하여 LIVE/DEAD 염색액(Thermo Fisher)을 제조하고, 이 중 20 μL을 C1 IFC 상에 로딩하였다. 각각의 포획 부위를 명시야(bright field)의 Zeiss 현미경, 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 Texas Red 채널 하에서 세포 더블릿(cell doublets) 및 생존력에 대해 주의깊게 검사하였다. 제조사가 규정한 바와 같이(프로토콜 100-7168 E1), C1 Single-Cell Auto Prep IFC 상에서 세포 용해, 역전사 및 cDNA 증폭을 수행하였다.
포획된 T 세포 요약.
치료 종양 이식후 경과일 조직 C1 칩의 수 포획된 세포의 수 QC 통과 세포의 수
아이소타입 대조군 8 종양 2 98 47
비장 2 102 51
11 종양 3 194 105
비장 2 157 128
18 종양 1 66
비장 1 69
aGITR + aPD -1 8 종양 2 135 81
비장 2 115 78
11 종양 3 184 141
비장 2 134 113
aGITR 단독 8 종양 4 255 127
비장 4 240 86
11 종양 2 113 79
비장 1 83 72
aPD1 단독 8 종양 2 115 63
비장 1 57 42
11 종양 4 177 120
비장 1 63 46
계 2,357 1,379
이들 세포 각각의 원시 서열 데이터(BCL 파일)를 Illumina Casava 1.8.2를 통해 FASTQ 포맷으로 변환하였다. 리드를 이들의 바코드에 기초하여 해독하였다. 리드 품질을 FastQC를 사용하여 평가하였다(www.bioinformatics.babrah am.ac.uk/p -rojects/fastqc/). TCR 분석을 위해, 무작위 프라이밍 짧은 RNA 시퀀싱 리드로부터 TCR 서열, 특히 TCR-CDR3 서열을 재구성하고 추출하는 개시된 방법이 사용되었으며, 상기 방법은 무작위 프라이밍(random-priming) 짧은 리드 TCR(rpsTCR) 분석을 포함한다(도 1 참조). rpsTCR 방법은 페어드-엔드 및 싱글-엔드 짧은 리드를 제공하였고, 기본 파라미터를 갖는 TopHat43을 사용해 이들 리드를 마우스 또는 인간 게놈과 전사체에 맵핑하였지만, TCR 유전자좌와 전사물에는 맵핑하지 않았다. 따라서, 음성 선별은 맵핑된 리드가 제거될 수 있게 하고, 맵핑되지 않은 리드는 TCR 서열의 추출을 위해 재활용되었다. 맵핑되지 않은 리드에서의 저 품질의 뉴클레오티드를 트리밍하였다(즉, HTQC 툴킷을 사용하여 길이가 35 bp미만인 리드를 걸러 냈음). QC 합격한 짧은 리드를 iSSAKE 기본 설정을 사용하여 더 긴 리드로 조립하였다. TCRklass를 사용하여, 기본값 1.7 내지 2까지 설정된 Scr(보존된 잔기 지지 점수)을 갖는 CDR3 서열을 식별하였다.
실시예 3
종양 보유 마우스로부터 단리된 종양 침윤 T 세포의 분석.
개시된 방법(파이프라인)은 단일 세포 분류된 RNAseq 데이터를 사용하여 TCR 서열을 재구성하고, 추출하고 분석하여, 종양 반응성과 환자 생존에 잠재적으로 연관된 고 빈도의 T 세포 클론의 식별을 가능하게 하였다.파이프라인을 사용하여 종양 보유 마우스로부터 단리된 1379 CD8+ T 세포의 전사체를 프로파일링하였다. 초기 시점(8일차)에는, 모든 치료군에서 (동일한 TCR 서열을 공유하는 적어도 3개의 T 세포로서 정의된) 고 빈도 T 세포의 클론이 거의 검출되지 않았다(도 2). 11일차가 되어서야, 시퀀싱된 5.7%의 단일 CD8+ T 세포를 나타내는 2개의 고 빈도 T 세포 클론을 아이소타입 대조군 샘플로부터 식별하였는데; 3개의 클론/20.3%는 항GITR 샘플에 대한 것, 6개의 클론/26.7%는 항PD-1 샘플에 대한 것이며, 10개의 클론/31.9%는 병용 치료된 샘플에 대한 것이었다. 이러한 결과는 8일차와 11일차 사이에, 종양 내 CD8+ T 세포의 강력한 클론 증식이 주로 항PD-1 치료에 의해 주도되었음을 나타낸다. 항PD1(aPD1) 또는 항GITR(aGITR)을 투여하는 한 가지(단일) 요법과 비교하여, 종양 보유 마우스의 병용 치료에서 식별된 클론 증식된 T 세포의 수의 유의성이 도 3에 도시되어 있다. 항GITR 및/또는 항PD-1은 말초/비장 T 세포의 클론 형성능에 영향을 미치지 않았으며(도 2), 이는 항PD-1(펨브롤리주맙) 치료가 말초 혈액 T 세포의 클론 형성능에 영향을 미치지 않았음을 보여주는 환자 데이터와 일관된다. 단일 제제 요법이 종양 내 CD8+ T 세포 클론을 증식시키고 임계 유전자 경로를 조절하였지만, 이는 완전한 종양 거부 반응에 충분하지 않았다. 데이터는 완전한 종양 거부 반응을 위해, 기능이 상실된 종양 침윤 T 세포를 병용 요법으로 심도있게 재프로그램해야 한다는 것을 시사한다.
실시예 4
종양 유래 TCR에 대한 T 세포 활성화 분석.
식별된 CDR3 서열을 포함하는 단리된 TCR을 발현하는 JRT3 세포주에서의 루시퍼라아제 발현에 의해 T 세포 분석을 측정하였다(도 6a 내지 6d). 항GITR로 치료하여 고도로 증식된(10개의 클론이 식별됨) 종양 T 세포로부터 단리된 CDR3 서열(TCR 서열 Seq.17)을 포함하는 TCR을 JRT3 세포주에서 발현시켰다. JRT3은 원래 항원인 MC38을 발현하는 종양이 있을 때 활성화되는데(도 6a), 이는 상기 형질감염된 세포주가 항원을 인식한다는 것을 나타낸다. 항CD3/항CD28에 의해 자극되는 경우, TCR 서열 Seq.17-발현 세포주도 활성화된다(도 6b). TCR 서열 Seq.12-발현 세포주를 사용한 유사성 연구(TCR CDR3 서열을 8 클론 크기를 갖는 aPD-1 자극된 T 세포로부터 단리함). TCR 서열 Seq.12-발현 세포주를 원래 항원의 존재 하에 활성화시키고(도 6c), 항CD3/항CD28의 존재 하에 활성화시켰다(도 6d).
실시예 5
유전자 발현 분석
종양 보유 마우스로부터 단리된 1379 CD8+ T 세포들의 전사체(서열의 맵핑된 부분)를 프로파일링하는 데에도 유전자 발현 분석 도구를 이용하였다. 병용 치료 샘플 유래의 클론 증식된 CD8+ T 세포에서 고유한 유전자 표지를 식별하기 위해, 치료 그룹 전체를 비교하였다. 클론 증식 후의 T 세포 계통을 발현된 TCR CDR3 서열에 의해 식별하고, 세포 표면 마커의 발현 패턴과 상관시켰다. 도 4 참조. 이와 같이, 클론 T 세포는 작동자 기억 세포(Tem)(Cd62L-Cd44+Gzmb+), 작동자 T 세포(Teff)(Cd62L-Cd44-Gzmb+)로 (또는, 미처리 T 세포(Cd62L+Cd44-Gzmb-)나 중앙 기억 T 세포(Tcm)(Cd62L+Cd44-Gzmb-)와 같이, 발현된 TCR을 갖는 T 세포가 3개 미만인 경우 미분류 세포, 즉 클론 미증식으로) 분류하였다.
유전자 발현 분석을 통해 치료 그룹 각각에서 클론 증식된 세포 및 클론 미증식 세포 전체에 대한 차등 발현된 유전자 프로파일을 또한 수득하였다. CD226은 상이한 비교쌍 전체에 걸쳐 공유된 두 유전자 중 하나로서 식별하였다(도 5). 도 5는, 치료 11일차에 aGITR+aPD1 치료 그룹의 증식된 종양 내 CD8+ T 세포에서 바람직하게 발현된 유전자를 도시하는 벤다이어그램이다. 벤다이어그램은 치료 그룹 사이에서 클론 증식/미증식 CD8+ T 세포의 유전자 표지 분석에 대한 요약이다. CD226 및 PDE4D를 상이한 비교쌍 전체에 걸쳐 공유된 두 유전자로서 식별하였다.
도 5는, aGITR 및 aPD1로 병용 치료하여 발현된 유전자를 모든 다른 치료제와 비교하여, 두 유전자가 바람직하게 발현된다는 것을 나타낸다. 두 유전자는 CD226 및 Pde4d이다. 벤다이어그램의 아래에 있는 표는 aGITR 및 aPD1로 병용 치료하여 발현된 유전자를 모든 다른 치료제와 비교하여, 각각의 유전자의 발생을 나타낸다. 따라서, 개시된 방법은 종양 세포에 대한 면역 반응에서 역할을 하는 특정 유전자를 식별하는데 사용될 수 있다.
CD226은 항종양 반응에서 중요한 역할을 하는 공자극 분자이다. 치료 그룹 전체에 대한 종양내 CD8+ T 세포의 상이한 하위 집합(총, 클론 증식된, 또는 미증식)에서의 발현 분석을 통해, 클론 증식된 T 세포 상에서 CD226 mRNA 수준이 병용 치료에 의해 유의하게 증가한 반면(도 7a), 총 및 미증식 CD8+ T 세포에서는 이러한 차이가 희석된 것으로 밝혀졌다. 이러한 관찰은 추정 유전자 변화를 밝혀내기 위해 추정 종양 반응성 클론(고 빈도 T 세포 클론)에 대한 게놈 프로파일링을 수행하는 것의 중요성을 강조하고, T 세포 활성에 영향을 미치는 효과적인 치료에 대한 유익한 정보인 바이오마커의 식별도 가능하게 한다.
도 7a는 조절된 주요 유전자인 CD226의 발현을 총, 클론 증식된, 또는 미증식 CD8+ T 세포로 보여주는 누적 분포 함수(Cumulative distribution function, CDF) 플롯을 도시한다. 클론 증식된 CD8 세포는 CD226의 가장 높은 발현을 나타낸다. 개시된 방법은 특정 유전자와 더 양호하게 상관되거나 특정 유전자가 더 양호하게 발현되는 대상체를 분류하는 데 유용하다. 이러한 데이터는, 발현이 특정 치료 동안의 T 세포 증식과 상관 관계가 있는 지를 알려줌으로써 효능 여하를 가늠할 수 있게 하는 예후 유전자를 식별하는 데 상기 방법이 유용성이 있음을 또한 보여준다. CD226은 흑색종, 폐 편평 상피 세포 암종 및 육종을 가진 환자의 T 세포로부터 분석했을 때 생존율의 개선과 유의한 상관 관계가 있다(도 7b). 도 7b는 흑색종, 폐 편평 상피 세포 암종 및 육종을 가진 환자에서 CD226 발현 수준 및 전체 생존율에 대한 TCGA 데이터 분석을 도시한다. 선별된 관련 비교 간에 *, P <0.05, **, P < 0.01; ***, P < 0.001, ****, P <0.0001임). 도시된 바와 같이, CD226은 생존율 개선과 상관 관계가 있다.
실시예 6a
CD226/ TIGIT 축은 PD-1 및 GITR 병용 면역요법에서 지속적인 항종양 반응을 매개한다
소개
면역 관문 PD-1 및 CTLA-4를 표적으로 하는 단일 또는 병용 요법은 특정 암 환자 모집단에서 유의한 임상적 이점을 나타낸다. 그러나, 대부분의 환자들은 내성이 있거나 일시적으로 반응하여, 환자 특이적 종양 민감도를 다루기 위한 최적의 면역 조절 표적의 선별에 대한 근본적인 질문이 제기된다. 특정한 공억제성 및 공동자극 경로를 표적화하여 더 강한 T 세포 활성화를 유도하는 병용 치료는 보다 지속적인 항종양 방응을 유도할 수 있다. 여기서, 전임상에서 검증된 방법으로서, 현재 초기 임상 시험 단계에 있는 PD1 및 GITR 병용 요법을 사용하여 장기적인 반응을 유도하는 분자 경로를 특성화하였다. 2,000개가 넘는 종양 침윤 CD8+ T 세포로부터 제조된 단일 세포 RNA-seq 라이브러리를 시퀀싱한 결과, GITR 및 PD-1 항체의 조합이 주요 항상성 조절자 CD226 및 TIGIT의 균형을 복원함으로써 CD8+ T 세포 작동자 기능을 상승적으로 강화하여 유의한 생존 혜택을 나타낸다는 것을 발견하였다. 실제로, 항PD-1 치료는 CD226 세포 표면 발현을 향상시켰다. 그러나, PD-1 단일 요법은 TIGIT에 의해 매개되는 억제성 신호 전달을 극복하기에 불충분하였다. 항GITR 항체는 T 세포에서 TIGIT 발현을 감소시켰다. 따라서, 병용 요법은 CD8+ T 세포 반응의 강도를 상승적으로 조절하였고, 강력한 적응 면역을 이끌어 냈다. 실제로, CD226의 유전적 불활성화 또는 약리학적 억제가 병용 치료에 의해 매개된 종양 퇴행을 역전시킨 반면, 다른 TNF-수용체 또는 B7 수퍼패밀리 멤버의 억제는 효과가 없었으므로, CD226을 통한 공자극은 항종양 면역에 필수적이다. 중요하게는, 항PD-1 치료 전 및 후의 43명의 진행 암 환자로부터의 종양 생검에 대한 RNA-seq 분석 결과, CD226 발현은 항PD-1 치료 후에 상당히 증가한 것으로 나타났다. 또한, 상이한 유형의 암 환자에 있어서는 높은 수준의 CD226이 더 나은 예후와 상관 관계가 있었다. PD-1/PDL-1에 추가하여 이러한 바이오마커로 환자 선별을 개선할 수 있었다. 항상성 조절자의 균형을 복구함으로써 지속적인 항종양 반응을 유도하는 분자 경로를 밝혀내는 체계적인 접근법은 병용 면역 요법을 최적화하는 데 중요할 수 있다.
PD-1 및 CTLA4 항체 치료제의 임상적 성공에 이어, 면역 요법에 있어서 치료 무기(therapeutic arsenal)로서의 제제가 급속히 늘어나고 있다. 핵심 목표는 암 환자에서 단일 요법 접근법으로 달성된 항종양 반응의 제한된 반응률 및/또는 지속성을 개선하는 것이다. 특정 공억제(PD-1) 및 공자극(GITR, 글루코코르티코이드에 의해 유도된 TNFR-관련 단백질, TNFRSF18) 경로를 표적으로 하여 보다 강한 T 세포 활성화를 유도하는 병용 치료제가 전이성 흑색종 및 기타 고형 종양을 가진 환자에 대상으로 하는 초기 임상 시험 단계에서 평가 중이다. 실제로, 다양한 조합의 인간 암을 조절함에 있어서 T 세포의 임상적 관련성은 이제 의심의 여지가 없다. GITR은 Treg 세포 상에서 높은 수준으로 구성적으로 발현되며, 활성화 시 다른 림프구 상에서 유도될 수 있다. 작용성 항마우스 GITR Ab인 DTA-1은 종양 내 Treg 세포를 감소시키고 FcγR-의존성 종양 거부 반응을 매개한다. 또한, GITR 수용체를 작용성 Ab와 결합시키면 공자극 신호가 작동자 T 세포에 직접 전달된다. 항GITR 및 항PD-1 Ab 단일 요법은 크거나 불량한 면역원성 종양에서는 제한된 효능을 가지지만, 병용 요법은 난소 및 유방 종양 모델에서 장기 생존을 촉진한다. 그러나, 시너지 효과의 근본 분자 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 없다. 여기에서, PD1 및 GITR 병용 요법을 사용하였고, 마우스 MC38 결장 선암종 모델에서 2000개가 넘은 종양 침윤 CD8+ T 세포를 유전적으로 프로파일링하였다. 체계적인 접근법은 지속적인 항종양 반응을 유도하는 분자 경로를 밝혀냄으로써, 기존의 병용 면역 요법을 최적화하고 새로운 잠재적 바이오마커를 식별하는 기초를 제공하여, 환자의 층화 및 종양 민감도를 향상시켰다.
방법
세포주 및 조직 배양. MC38 마우스 결장 암종 세포 및 RENCA 마우스 신장 선암종 세포를 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 수득하고, 10% FBS, 100U mL-1 페니실린 및 100 μg ml-1 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 100 μM NEAA (ThermoFisher Scientific)가 공급된 37℃의 DMEM 배지에서 5% CO2로 배양하였다. 내인성 TCR 발현이 결여된 J. RT3-T3.5 돌연변이 Jurkat 세포주를 ATCC로부터 수득하여, 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에서 유지시켰다. IMPACT 시험에 의하면, 종양 세포주는 마이코플라스마 및 흔한 설치류 병원균에 대해 음성으로 검사되었다. SIINFEKL의 펩티드-스페이서-β2 마이크로글로불린-스페이서 MHC 클래스 I (Kb) 중쇄로 이루어진 단일 3량체를 암호화하는 렌티바이러스 벡터(LV)로 MC38 종양 세포를 형질도입하여 MC38- OVA-β2m-Kb를 생성하였다. 단일 3량체의 표면 발현을 25D-1.16 Ab(eBioscience)로 확인하였다(도 21a). 1.25 μμg ml-1 푸로마이신(ThermoFisher Scientific)을 함유하는 선별 배지로 MC38-OVA-β2m-Kb를 유지시켰다. CD155를 과발현하는 MC38 종양 세포를 마우스 전장 CD155를 암호화하는 LV로 형질 도입하여 생성하고, FACS로 상위 5% 발현 세포를 분류하였다. CD155의 발현 수준은 FACS 분석에 의해 확인하였다(도 24c).
마우스. 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory로부터 입수하였다. C57BL/6 백그라운드에서 CD226-/- 및 TIGIT-/- 마우스를 VelociGene® 방법을 사용하여 Regeneron에서 생성하였다. 간략하게, EGFP(CD226의 경우) 또는 LacZ cDNA(TIGIT의 경우)를 시작 코돈에 프레임 내(in-frame) 삽입하고, 이어서 선별 카세트에 프레임 내 삽입하였는데, 이는 유전자 몸체의 전사를 방해하여 CD226 또는 TIGIT 널 대립유전자(null allele)를 생성한다. 표적화된 이형접합체 마우스를 교배시켜 연구를 위한 동형접합체 넉아웃 마우스를 생산하였다. 모든 동물을 무병원균 조건 하에 유지시켰고, 실험은 Regeneron Pharmaceuticals, Inc.의 동물 보호 및 사용 위원회(Institute of Animal Care and Use Committee, IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행하였다.
생체 내 마우스 연구. MC38 종양 연구를 위해, 3x105개의 MC38 세포를 동일 주령(age-matched)의 C57BL/6 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다(0일차). 종양 이식 후 6일차에, (상이한 그룹에 무작위로 분산된) 마우스를 종양 크기에 기초하여 그룹화하고, kg당 5 mg의 항GITR(DTA1) 및/또는 항PD-1(RPM1-14) Ab 또는 아이소타입 대조군 IgG(랫트 IgG2b, LTF-2 및 랫트 IgG2a, 2A3)을 표시된 용량으로 복강내 주사하여 치료하였다(항체는 Bio X Cell로부터 수득하였음). 항체를 13일차에 다시 투여하였다. 항체 제거 실험을 위해, 병용 요법 또는 아이소타입 대조군 IgG로 치료한 마우스를, 항CD4(클론 GK1.5); 항CD8(클론 2.43) 및 랫트 IgG2b 아이소타입(클론 LTF-2), 랫트 IgG1 아이소타입(클론 HPRN, Bio X Cell) 및 항CD25(클론 PC61, eBioscience)를 포함하는 300 μg의 제거 또는 아이소타입 대조군 mAb로 치료하였다. 제거 Ab를 종양 접종 하루 전(-1일차)에 투여하고 주 2회 투여하여 총 8회 용량을 투여하였다. 말초 혈액 샘플의 FACS 분석에 의해 제거 효율을 확인하였다(도 16c). 본 연구에 사용된 차단 항체들은 항CD226 Ab(클론 10E5, 랫트 IgG2b, eBioscience, 25 mg/kg), CD28 차단 항체(CTLA4-Fc, Orencia, BMS, 10 mg/kg), 항OX40L(클론 RM134L, 랫트 IgG2b, Bio X Cell, 10 mg/kg) 및 항4-1BBL(클론 TKS-1, 랫트 IgG2a, Bio X Cell, 10 mg/kg)을 포함한다. 차단 Ab는 면역 요법의 1~2일 전에 시작하여 2주 동안 i.p. 주사에 의해 주 2회 투여하였다. 디지털 캘리퍼스(VWR, Radnor, PA)를 사용하여 주당 2~3회 수직 종양 직경을 맹검 측정하였다. 식 L Х W Х 0.5를 사용해 체적을 계산하였는데, 여기서 L은 가장 긴 치수이고 W는 수직 치수이다. 각 그룹별 생존 차이를 카플란-메이어 방법(Kaplan-Meier method)로 결정하고, Prism 버전 6(GraphPad Software Inc.)에 의한 생존 분석을 이용하여 log-순위 검정에 의해 전체 p 값을 계산하였다. 사망률을 최소화하기 위해, 최대 종양 체적에 있어서 종양 부담이 2000 mm3의 프로토콜 규정 크기에 도달한 경우 이벤트를 사망으로 정의하였다.
유세포 분석. 생체 내 실험의 유세포 분석을 위해, 혈액, 비장, 흉선, 림프절 및 종양을 치료 후 지시된 일자에 채취하였다. 단일 세포 현탁액을 제조하고, ACK 용해 완충액(ThermoFisher Scientific)을 사용해 적혈구를 용해시켰다. 활 세포/죽은 세포 고정식 청색 죽은 세포 염색 키트(LIVE/DEAD fixable blue dead cell staining kit, ThermoFisher Scientific)를 사용해 활 세포/죽은 세포를 구별하였다. 우선, 표면 마커를 위해 4℃에서 20~30분 동안 Ab로 세포를 염색하였다. 세포내 염색은 고정/투과화 키트(fixation/permeation kit, eBioscience)를 사용하여 수행하였다. OVA-특이적 CD8 T 세포를 정량화하기 위해, 표면 마커 염색에 앞서 실온에서 10분 동안 H-2Kb/SIINFEKL-5량체(ProImmune)로 단일 세포 현탁액을 먼저 염색하였다. 세포 내 사이토카인 염색(ICS)의 경우, SIINFEKL 펩티드의 유무와 상관없이 36시간 동안 세포를 자극하고, 마지막 4시간 동안은 단백질 수송 억제제(Protein Transport Inhibitor, BD Bioscience)로 자극하였다. 자극 후, 표면 및 세포내 단백질에 대해 전술한 바와 같이 세포를 염색하였다. 조직 내 세포 수를 정량화하기 위해, 샘플을 획득하기 전에 고정된 수의 CountBright Absolute Counting Beads(ThermoFisher Scientific)를 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 Fortessa X20 또는 LSR II (BD Bioscience) 상에서 획득하고 FlowJo 소프트웨어(TreEstar)를 사용하여 분석하였다. 사용된 항체 목록에 대해서는 보충적 방법(Supplementary Metho -ds)을 참조한다.
단일 세포 분류 RNA- seq 분석. 종양 접종 후 8 및 11일차에, 마우스 종양 해리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용해 종양의 단일 세포 현탁액을 제조하였고, 비장을 gentleMACS Octo 해리기로 해리하였다. 동일한 치료 그룹 유래의 종양 및 비장을 하나의 풀로 모으고, 생존 가능한 CD8+ T 세포를 FACS에 의해 분류하였다. FACS로 분류한 T 세포를 5 내지 10 μm의 C1 Integrated Fluidic Circuit(IFC; Fluidigm) 상에 로딩하기 전에 C1 세포 현탁 시약(Fluidigm)과 혼합하였다. 2.5 μL의 에티듐 동종 이량체-1 및 0.625 μL의 calcein AM(Life Technologies)을 1.25 mL의 C1 Cell Wash Buffer(Fluidigm)에 첨가하여 LIVE/DEAD 염색액을 제조하고, 이 중 20 μL을 C1 IFC 상에 로딩하였다. 각각의 포획 부위를 명시야(bright field)의 Zeiss 현미경, GFP, 및 Texas Red 채널 하에서 세포 더블릿(cell doublets) 및 생존력에 대해 주의 깊게 검사하였다. 제조사가 규정한 바와 같이(프로토콜 100-7168 E1), C1 Single-Cell Auto Prep IFC 상에서 세포 용해, 역전사 및 cDNA 증폭을 수행하였다. 단일 세포로부터 cDNA를 합성하는 데에는 SMARTer Ultra Low RNA 키트(Clontech)를 사용하였다. 제조사의 권고에 따라(프로토콜 100-7168 E1), Nexter -a XT DNA Sample Prep 키트(Illumina)를 사용하여 Illumina NGS 라이브러리를 구성하였다. 75 사이클로 실행된 다중화 단일 리드에 의해 Illumina NextSeq (Illum -ina) 상에서 총 2,222개의 단일 세포를 시퀀싱하였다. 원시 서열 데이터(BCL 파일)를 Illumina Casava 1.8.2를 통해 FASTQ 포맷으로 변환하였다. 리드를 이들의 바코드에 기초하여 해독하였다. 리드 품질을 FastQC를 사용하여 평가하였다(bioinf -ormatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
큰 단층 소포체( LUV ). 인지질(79,7% POPC + 10% POPS + 10% DGS-NTA-Ni + 0,3% 로다민-PE)을 아르곤 스트림 하에 건조시키고, 적어도 1시간 동안 건조시키고, 1x 반응 완충액(50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM TCEP)에서 현탁시켰다. 전술한 바와 같이, LUV는 200 nm의 기공 크기를 갖는 한 쌍의 폴리카보네이트 필터를 통해 20회 압출시켜 제조하였다.
LUV 재구성 및 포스포티로신 웨스턴 블롯 . 관심 단백질을 0.5 mg/ml BSA가 함유된 1Х 반응 완충액 중에서 원하는 비율로 사전 혼합한 다음, LUV(1 mM 총 지질)와 혼합하였다. 단백질-LUV 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였고, 그 동안 His-태그된 단백질은 리포좀에 결합된 반면 다른 단백질은 혈관외 용액 내에 남아 있었다. 이어서, 2 mM의 ATP를 주입하고 신속하게 혼합하여 막 표면에서 인산화, 탈인산화 및 단백질 상호작용을 유발하였다. 반응물을 실온에서 30~60분 동안 진행시키고, SDS 샘플 완충액으로 종결시켰다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하고, SDS-PAGE를 실시하였다. iBloTtM 드라이 블롯팅 시스템(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 0.1% Tween-20으로 트리스-완충된 식염수(pH 7.4)에서 5%BSA로 차단하고, 원하는 포스포티로신 특이적 항체와 인큐베이션하고, HRP 기반 증진된 화학발광으로 검출하였다. 사용된 일차 항체는 다음과 같다: 항Py142-CD3ζ(BD Biosciences #558402), 항pY20 (Santa Cruz Biotechnology #sc-1624, 재구성 분석에서 티로신 인산화 CD28 검출용), 항pY418-Src (BD Biosciences #560095, pY394-Lck 검출용), 항pY505-Lck (Cell Signaling #2751), 항pY315-ZAP70 (Abcam #ab60970), 항pY493-ZAP70 (Cell Signaling #2704).
임상적 생검 취급, RNA 추출 및 RNA- seq .생검을 Omni Shredder(Omni-Inc) 상의 메르캅토에탄올(Sigma Aldrich)이 첨가된 적어도 600uLs의 RLTPlus 중에서 1분 동안 22,000 RPM으로 균질화시켰다. AllPrep DNA/RNA Mini Handbook" (2005년 11월)에 있는 제조사 지침에 따라 26페이지의 "프로토콜: 동물 조직으로부터 게놈 DNA와 총 RNA의 동시 정제(Protocol: Simultaneous Purification of Genomic DNA and Total RNA from Animal Tissues)"을 사용해 Qiagen Allprep DNA/RNA 미니 키트(Qiagen)를 사용해 RNA와 DNA를 추출하였다. RNA 추출 동안에는 부록 E에 개괄된 선택적인 DNAse 소화를 사용하였다. 완충액 AW2 세척 후, 그러나 마지막 회전 건조 이전에, 추가 500uL의 70% 에탄올로 2분 간 회전 세척하여 DNA 추출물로부터 과량의 염을 제거하였다. RNA를 나노드롭 (ThermoFisher Scientific) 상에서 정량화하고, 제조의 프로토콜에 따라 '표준 감도 RNA 분석 키트(Standard Sensitivity RNA Analysis Kit)' (Advanced Analytical)를 사용하여 단편 분석기(Fragment Analyzer, Advanced Analytical) 상에서 품질을 평가하였다. DNA를, 맞춤형 프로토콜인 'Using the Tecan Microplate Reader for DNA Quantification(BR dsDNA Assay)'에 따라 Infinite M200 Pro (Tecan) 상에서 Qubit dSdNA BR 분석 키트(ThermoFisher Scientific)로 정량화하였다. 완료된 샘플을 -80℃에서 바코드가 표지된 나사 캡 튜브에 보관하였다. RNA-seq, 가닥-특이적 RNA-seq 라이브러리를 카파 가닥 mRNA-Seq 키트(KAPA stranded mRNA-Seq Kit, KAPA Biosystems)를 사용하여 100 ng의 총 RNA로부터 제조하였고, 400 내지 600 bp 크기의 라이브러리를 Pippin 시스템(Sage Science)을 사용하여 선별하였다. 페어 엔드 2x100 bp 시퀀싱을 Illumina 2500을 사용하여 수행하였다. RNA-seq 리드를 품질 검사하고 기준 게놈에 대해 정렬하였으며, 어레이 스튜디오(Array Studio, Omicsoft)를 사용하여 유전자 발현을 정량화하였다.
통계 분석. 샘플 크기를 경험적으로 선택하여 적절한 통계적 검증력을 보장하고 연구에 사용된 기술에 대한 업계 표준과 일치시켰다. 통계적 유의성은 P < 0.05의 (또는 도면의 범례에 표시된) 유의 수준에서 불균등 분산을 가정하는 ANOVA 또는 비대응 양측 분포 스튜던트 t 검정으로 결정하였다.
결과
병용 면역 요법의 효과를 조사하기 위해 면역원성이 불량한 종양 모델(MC38 및 RENCA)을 사용하였다. 종양 체적의 다양한 감소 및 다소 연장된 생존이 보고되었지만, 항PD-1 또는 항GITR Ab를 사용하는 단일요법은 확립된 종양에서 완전하고 지속적인 종양 퇴행을 유도하는 데 효과적이지 않다. 여기서, 항체는 종양이 감지될 수 있을 때인 종양 접종 후 6일 및 13일차에 투여하였다. 공개된 데이터와 일관되게, 항GITR이나 항PD-1의 단독 치료는 효과를 나타내지 않았거나 거의 나타내지 않았다. 병용 요법은 대부분의 마우스에서 CD8+ T 세포 의존적인 방식으로(도 16c 및 16d) 종양을 상승적으로 근절시키고(17마리 중 12마리에서 종양이 사라짐, 도 16a), 장기 생존을 조장하였으며(~70%의 마우스가 80일이 넘도록 종양이 없었음, 도 16b), 이전 데이터와 일치하여 세포 내 CD8+/Treg 비율 및 CD4+ T 작동자 비율(Teff)/Treg 세포(도 16e, 16f)을 증가시켰다. 50일 후, 단일 요법 치료 그룹에서는 17마리의 마우스 중 0~2마리에게만 종양이 없었으며, 0~10%가 살아 남았다(도 16a, 16b). 또한, 종양내 CD8+ T 세포의 기능 장애 상태는, 생체 외 증식 가능성의 회복(Ki67의 발현, 도 16g) 및 작동자 기능의 회복(그랜자임 A 및 그랜자임 B의 발현, 도 16h 및 16i)으로 나타난 바와 같이 병용 치료에 한해 유의하게 역전되었다. 더 양호한 생존율과 관련된 병용 치료의 상승 항종양 효과는 제2 마우스 RENCA 종양 모델에서도 확인되었다(도 16j).
병용 치료 샘플 유래의 클론 증식된 CD8+ T 세포(11일차에 채취한 종양)에서 고유한 유전자 표지를 식별하기 위해, 치료 그룹 전체에 대한 포괄적인 비교를 수행하였다. 우선, 병용 치료 후 30개의 유전자에서의 RNA 표지 변화가 관찰되었는데, 이는 증식된 CD8 T 세포 모집단 내에서 훨씬 더 유의미하였다(도 10a 및 도 20). 다음으로, 모든 그룹 전체에 걸쳐 4방향 비교를 수행하여 병용 치료 시 및 단일 요법 치료 시에 특이적으로 조절된 유전자를 식별하였다(도 10b). CD226은 상이한 비교쌍 전체에 걸쳐 공유된 두 유전자 중 하나로서 식별하였다(도 10b). CD226은 항종양 반응에서 중요한 역할을 하는 공자극 분자이다. 치료 그룹 전체에 대한 종양내 (총, 클론 증식된, 또는 미증식) CD8+ T 세포의 상이한 하위 집합의 발현 분석을 통해(도 10c), 클론 증식된 T 세포 상에서 CD226 mRNA 수준이 병용 치료에 의해 유의하게 증가한 반면(배수 변화 = 10.7), 벌크(배수 변화 = 3.5) 및 미증식 CD8+ T 세포(무의미함)에서는 이러한 차이가 희석된 것으로 밝혀졌다(도 10d). 또한, CD226 mRNA 수준은 항PD-1(배수 변화 = 6.5) 및 항GITR(배수 변화 = 9.2)과 비교하여 클론 증식된 CD8 T 세포에 대한 병용 치료에 의해 유의하게 증가되었다(배수 변화 = 9.2) (도 10d). 이러한 관찰은 추정 유전자 변화를 밝혀내기 위해 추정 종양 반응성 클론(고 빈도 T 세포 클론)에 대한 게놈 프로파일링을 수행하는 것의 중요성을 강조한다.
병용 치료 후 종양 내 CD8 T 세포 상에서의 CD226의 발현 수준을 평가하기 위해, 최근 공개된 돌연변이된 MC38 종양 에피토프를 사용해 생체 내에서 MC38 특이적 TCR 클론을 추적하였다. 이러한 접근법은 성공적이지 못했다. 이전에 특성화된 MC38 종양 네오에피토프를 이러한 T 세포 클론이 인식할 수 없었던 것은, 어쩌면 종양 세포의 게놈 불안정성으로 인해 실험실들 간의 종양 세포주의 상이한 돌연변이 상태가 반영된 것일 수 있다. 이러한 결과를 기능적으로 확인하기 위해, SIINFEKL 펩티드 및 β2m (OVA-β2m-Kb)을 갖는 MHC 클래스 I의 H-2Kb 단일 사슬 3량체를 발현하는 MC38 종양 세포주를 생성하고(도 21a), SIINFEKL을 대용 종양 에피토프(surrogate tumor epitope)로서 사용하였다. TCR 클론 형성능 분석과 일관되게, 항PD-1 Ab 또는 항GITR과의 병용 치료는 종양 침윤 T 세포에서 (Kb/OVA 5량체 염색을 사용해) OVA-특이적 CD8+ T 세포의 유의한 클론 증식을 유도하였지만, 병용 치료만이 Ag-특이적 CD8+ T 세포 클론의 종양내 밀도를 유의하게 증가시켰다(도 21b). 또한, 병용 치료만이 대조군에 비해 비장에서 OVA-특이적 CD8+ T 세포를 유의하게 증식시켜 (도 21b), 이전의 결과를 연장시켰다. 이러한 클론 증식된 OVA-특이적 T 세포는 기능적이었으며 대조군보다는 OVA 펩티드로 재자극 시보다 높은 수준의 IFNγ를 생성하였다(도 21c). 중요하게는, MC38-OVA-β2m-Kb 모델을 사용하는 경우, CD226의 베이스라인 수준이 비장 항PD1 치료 후에 OVA-특이적 CD8+ 상에서 가장 높았고(도 11a), 항GITR 및 항PD-1 Ab로 병용 치료에 의해 추가로 상승됨을 발견하였다. 동일한 치료는 비-특이적 CD8+ T 세포의 CD226 레벨에 유의한 영향을 미치지 않았다. 전체적인 항PD-1 치료는 CD226의 증가를 유도하는 데 지배적 역할을 하여(도 11a) 항종양 면역성에 있어서 항PD-1의 작용 방식에 대한 핵심 정보를 제공하였다.
다음으로, PD1과 CD226 분자 사이의 연관성을 조사하였다. 최근의 데이터는, PD1의 세포질 도메인이 T 세포의 원형질막을 모방하는 큰 단층 소포체(LUV)의 표면에 결합된 무세포 재구성 시스템에서 형광 에너지 전달(FRET) 기반 분석을 이용하여 PD1에 의한 Shp2의 고도로 특이적인 보강을 입증하였다. CD226이 PD1-Shp2 복합체에 의한 탈인산화의 표적인지 여부를 검사하기 위해, T 세포 신호전달에 관여하는 상이한 성분(CD3, CD226, 및 범례/방법)을 리포솜 상에서 재구성하였다(도 11b). LUV에 대한 PD-1 적정에 반응하는 각 성분의 민감도를 포스포티로신(pY) 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. TCR/CD3ζ가 PD-1-Shp2에 의한 탈인산화에 민감한 표적이 아니었음을 나타내는 이전의 공개 데이터가 확인되었다(도 11c).중요하게는, CD226은 PD1-Shp2에 의해 용량 의존적인 방식으로 매우 효율적으로 탈인산화되는 것을 발견하였다(도 11c). 데이터는 PD-1과 CD226 사이의 연관성을 입증한다.
최근에는, CD8+ T 세포 반응의 강도는 CD226과 공억제 수용체 TIGIT 사이의 전체적인 균형에 의해 영향을 받는다는 것이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 단일 세포 RNA-seq를 사용하는 경우, 항GITR Ab 치료가 고빈도 T 세포 클론에서 TIGIT 전사물을 증가시키는 반면(도 22a), FACS 분석에서는 OVA-특이적 CD8+ T 세포 상에서 TIGIT 발현의 유의한 감소가 나타나는 것으로 밝혀졌다(도 22b). 이러한 결과는, TIGIT 발현이 전사 후 수준에서 엄격하게 조절된다는 이전의 결과와 일관된다. TIGIT/CD226 신호 전달 경로로 시스- 및 트랜스-억제 메커니즘 둘 모두가 제안되었으므로, CD8+ T 세포 상에서 CD226의 발현 수준과 CD8+ T 세포 및 예비 림프구 둘 모두에서 TIGIT의 발현 수준 간의 균형에 기인해 순 결과가 만들어질 수 있다. 실제로, 병용 치료는 TIGIT+ 세포의 백분율 및 수준 벌크 종양 침윤 CD8+, CD4+ Teff 및 Treg 세포에 대한 세포당 기준의 발현 수준유의하게 감소시켰는데, 그 효과는 주로 항GITR Ab 치료에 의해 주로 유도되었다(도 11d 및 도 22c). 놀랍게도, 이러한 효과는 비장 T 세포 하위 집합에서도 발견되었다(도 11d 및 도 22c). 병용 및/또는 단일 요법 치료는 벌크 CD226+ 종양 침윤 또는 비장 CD4+ 및 Treg 세포에 영향을 미치지 않았다(도 22d). 전체 단일-세포 분류된 RNA-seq 및 FACS 표현형 데이터는 항PD-1이 CD226의 발현에 유리한 반면, 항GITR 치료는 TIGIT의 표면 발현을 하향 조절시켜, 항상성 T 세포 기능을 상승적으로 복원하였음을 보여주었다.
CD226 차단 mAb를 사용한 경우, 병용 치료에 의해 매개되는 항종양 면역에는 CD226을 통한 공자극 신호전달이 필요한 것으로 나타났다(도 12a). 그러나, CD226 Ab가 CD8 T 세포의 하위 집합에 대한 잠재적인 제거 효과를 가질 수 있으므로, 본 연구를 반복하기 위해 CD226을 C57BL/6 백그라운드 마우스에서 유전적으로 불활성화시켰다(도 23a, b). CD226-/- 마우스는 T 세포(CD4+, CD8+, Treg) 항상성에 있어서 결함을 보이지 않았으며(도 23c 내지 e), TCR 활성화에 대해서는 야생형 마우스와 유사하게 반응하였다(도 23f). 중요하게는, 병용 치료가 CD226-/- 마우스에서 더 이상 항종양 효과 또는 생존 이점을 부여하지 않는다는 것이 밝혀졌고, 이는 CD226이 관찰된 병용 요법의 항종양 효과에 필수적이라는 것을 나타낸다(도 12b). 또한, CTLA4-Ig를 사용하여 TNF 수용체 수퍼패밀리의 다른 구성원(OX40L 또는 4-1BBL)을 억제하거나 B7 공자극 분자(CD28)를 차단하는 것이 병용 요법에 의해 매개되는 항종양 효과를 보존하므로, 영향을 매개하는 CD226 경로의 특이성을 검증하였다(도 12c 내지 e).
또한, TIGIT-/- 마우스에서의 종양 감시를 강화하기 위해 CD226 신호 전달 경로가 필요했다(도 24a, b). 흥미롭게도, CD226, CD155/PVR에 대한 주요 리간드를 과발현하는 MC38 종양 세포 보유 마우스(도 24c)는 항PD-1 또는 항GITR 또는 병용 요법으로 치료 시, MC38-공벡터(MC38-EV) 종양 세포, 또는 아이소타입 대조군으로 치료한 마우스에 비해 종양 성장의 상당한 지연을 보였다(도 24d). MC38-CD155가 이식된 마우스의 면역 프로파일링 분석을 통해, 이식 후의 MC38-CD155 세포에서 M38-EV155(공벡터) 보다 더 높은 CD155 발현 수준이 지속됨을 확인하였(도 24e). MC38 종양 세포에서의 CD155 과발현은 CD4+, CD8+ T 및 Treg 세포 상에서 검출 가능한 CD226 발현 감소와 관련이 있었지만, 종양 내 T 세포 상에서 IFNγ 및 4-1BB 발현의 증가로 나타난 바와 같이 T 세포 활성화를 촉진시켰다(도 24f, 24g). 예상대로, 주변에서 아무런 영향이 관찰되지 않았다.
다음으로, PD-1 억제 및 CD226 발현 사이의 관계를 임상 환경에서 조사하였다. PD-1 표적화 치료 전과 후에 43명의 진행암 환자로부터 채취한 종양 생검에 대한 RNA-seq 분석을 수행하였다(도 12f). 중요하게는, 항hPD-1 치료제를 2회 투여한 후 암환자에서 CD226 발현이 유의하게 증가되었다(도 12g). 또한, CD226 발현 수준이 전체 T 세포 활성화 강도와 상관 관계가 있고, 암 환자에서 더 나은 예후를 예측할 수 있는지를 조사하기 위해 암 게놈 지도(The Cancer Genome Atlas, TCGA)의 임상 데이터를 조사하였다. 실제로, CD226 발현의 베이스라인이 높은 환자는 본원에서 평가한 20가지의 상이한 유형의 암 중 5가지(피부 흑색종, 폐 선암종, 두경부 편평 암종, 자궁 내막 암종 및 육종)에서 상당히 높은 생존 확률을 갖는다(도 12h 및 도 25). 전반적으로, 이들 결과는 T 세포 활성화를 최대화하기 위해 TIGIT를 차단하면서 동시에 CD226 신호 전달을 증가시키는 면역 요법 전략을 뒷받침한다.
여기서, 공자극 작동자 및 공억제 길항제의 강력한 시너지 효과를 유도하는 분자 메커니즘을 밝히기 위한 기술 플랫폼을 사용함으로써 지속적인 항종양 반응을 위해 요구되는 파라미터를 설명하였고, 차세대 종양 특이적 병용 요법을 형성할 수 있는 주요 기능적 T 세포 조절 경로에 대한 단서를 제공하였다.
실시예 6b
TCR 레퍼토리 분석 생물정보학 파이프라인 rpsTCR 및 이의 검증
TCR 서열의 추출 및 조립. V 및 J 대립유전자 정보, 및 CDR3 아미노산 서열을 고려하여, V 및 J 대립유전자의 아미노산 서열을 IMGT 데이터베이스(imgt.org)로부터 추출하였다. 다음으로, CDR3 서열을 V 서열의 C-말단 및 J 서열의 N-말단과 정렬시켜, 연속 VDJ 아미노산 서열을 생성하였다. 그런 다음, 각각의 V 대립유전자에 대한 리더 서열(L)이 있는 경우, 이를 IMGT로부터 식별하여 VDJ 서열의 C-말단에 첨부하였다. 리더 서열이 없을 경우, 가장 빈번한 리더 서열을 사용하였다. 그런 다음, EMBOSS Backtranseq 도구(ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq)를 사용하여 LVDJ 아미노산 서열을 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열로 역번역하였다. 마지막으로, (IMGT 유래의) TCRA/TCRB의 불변 (C) 영역의 뉴클레오티드 서열을 LVDJ 뉴클레오티드 서열의 N-말단에 첨부함으로써, 클로닝을 위한 전체 LVDJC 서열을 수득하였다.
생물정보학 파이프라인은 분류된 단일 세포로부터 생성된 무작위 프라이밍 RNAseq 데이터를 사용하여 TCR 서열을 추출, 재구성 및 분석함으로써, 종양 반응성 및 환자 생존과 잠재적으로 관련되는 T 세포 클론의 식별을 가능하게 하기 위해 개발되고 및 검증되었다. 긴 리드(2x300 bp)를 갖는 표적화된 TCR 앰플리콘 시퀀싱을 사용하는 종래의 TCR-seq 방법과 달리, 무작위 프라이밍 RNA-seq 리드의 매우 작은 일부가 TCR 서열이고 리드 길이는 짧은데(보통 =< 100 bp), 이는 일반적으로 TCR의 V(D)J 영역의 일부만을 커버한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, TCR 서열의 음성 선별 단계 및 짧은 리드 조립 단계를 파이프라인에 통합하였다. 간단히 말하면, 파이프라인은 페어드 엔드 또는 싱글 엔드 짧은 리드를 수반하고, 이러한 리드를 인간 또는 마우스 게놈 및 전사체에 맵핑하지면, TCR 유전자좌와 전사물에는 맵핑하지 않는다(도 17 및 방법). 그 결과는, 상기 방법이 무작위 프라이밍 RNA-seq 데이터에 대해 매우 민감하고 정확한 CDR3 조립자(assembler)라는 것을 나타냈다(도 18, 도 13 및 상기 실시예 6a 방법). 마지막으로, 파이프라인을 1,379개의 CD8+ 단일 세포 RNA-seq 데이터로 이루어진 라이브러리에 적용하였다. TCRB-CDR3, TCRA-CDR3 및 TCRB와 TCRA 쌍의 검출률(각각 86%, 78.2% 및 73.1%)은 단일 T 세포로부터 표적화된 TCR 시퀀싱을 사용하는 보고된 검출률(73.1%)과 비슷하였다(도 14).
항체는 종양이 감지될 수 있을 때인 종양 접종 후 6일차에 투여하였다(도 9a). 상기 생물정보학 도구를 사용하여, 종양 보유 마우스로부터 종양 접종 후 8 및 11일차에 분류한 1,379개의 CD8+ T 세포의 전사체를 프로파일링하였다. 초기 시점(8일차)에는, 모든 치료군에서 (동일한 TCR 서열을 공유하는 적어도 3개의 T 세포로서 정의된) 고 빈도 T 세포의 클론이 거의 검출되지 않았다(도 9b). 11일차가 되어서야, 시퀀싱된 5.7%의 단일 CD8+ T 세포를 나타내는 2개의 고 빈도 T 세포 클론을 아이소타입 대조군 샘플로부터 식별하였는데; 3개의 클론/20.3%는 항GITR 샘플에 대한 것, 6개의 클론/26.7%는 항PD-1 샘플에 대한 것이며, 10개의 클론/31.9%는 병용 치료된 샘플에 대한 것이었다. 실제로, 8일차와 11일차 사이에, 항PD-1 단일 요법에 의해 종양 내 CD8+ T 세포의 유의한 클론 증식이 유도되었다. 이러한 결과는 항PD-1 요법(펨브롤리주맙) 후 TCR 클론 형성능의 증가를 검출하는 공개된 데이터와 일치한다. 상기 결과는, 항PD-1 Ab가 클론 증식의 주요 동력(driver)인 것으로 나타난다는 것, 및 PD-1과 GITR의 이중 표적화가 종양 내 CD8 T 세포 TCR 클론 형성능을 더욱 강화한다는 것을 보여 줌으로써 이러한 결과를 연장시킨다(도 9b 및 9C). 항GITR 및/또는 항PD-1은 말초/비장 T 세포의 클론 형성능에 영향을 미치지 않았으며(도 9c), 이는 펨브롤리주맙 치료를 사용한 환자 데이터와 일관된다.
병용 치료 시, MC38 종양 내에 풍부한 TCR의 종양 항원 특이성을 검증하기 위해, 생물정보학 분석을 수행하여 전장 페어드 TCR 알파/베타 서열을 추출하고 조립하였다(실시예 6a 방법). 증식된 CD8+ T 세포로부터 유래된 전장 TCR 쌍을 렌티바이러스 작제물에 클로닝하고 내인성 TCR 발현이 없는 Jurkat T 세포주 내로 형질도입하였다. AP-1에 의한 유도된 루시페라아제 리포터를 이들 조작된 T 세포주의 TCR 특이성에 대한 판독값(read-out)으로서 사용하였다(도 9d). 본 분석은 잘 특성화된 LCMV TCR (P14)를 사용해 검증하였다(도 19). 고 빈도 클론(동일한 TCR을 공유하는 5개의 세포)유래의 TCR은 야생형 MC38 종양 세포에 의해 특이적으로 제시되지만 무관한 공통 유전자 C57BL/6 종양 세포주(B16F10.9 또는 TRAMP-C2)에 의해서는 제시되지 않는 에피토프를 인식함으로써(대표 TCR 클론을 나타내는 도 9e), 그들의 특이성을 검증할 수 있다.
또한, 항GITR 및 항PD-1이 이들 클론 증식된 CD8+ T 세포에서 별개의 분자 경로를 조절하는 것으로 결정되었다(도 15). 병용 치료는 단일 제제 치료에 의해 조절된 경로를 상승적으로 통합하고, 강력한 적응 면역 반응을 촉진하고, 경로에서 세포 주기 및 대사 활동과 관련된 반응을 촉진하였다. 단일 제제 요법이 종양 내 CD8+ T 세포 클론을 증식시키고 임계 유전자 경로를 조절하였지만, 이는 완전하고 장기 지속성 종양 거부 반응에는 충분하지 않았다. 상기 결과는 완전한 종양 거부 반응을 위해, 기능이 상실된 종양 침윤 T 세포를 병용 요법으로 심도있게 재프로그램해야 한다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는, CD8+ T 세포가 종양 발생의 초기 단계에는 제대로 기능하지 않다가 점진적으로 덜 유연한 상태로 진화한다는 것을 보여주는 최근의 연구에 의해 뒷받침된다.
차세대 시퀀싱 기술은 전체 게놈 시퀀싱 및 전사체 시퀀싱을 일상적인 것으로 만들었고, 전체 게놈 유전자 발현의 검출과 TCR 서열의 추출을 동시에 수행할 수 있는 기회를 제공하였다. 그러나, 긴 리드(2x300 bp)를 갖는 표적화된 TCR 앰플리콘 시퀀싱을 사용하는 종래의 TCR-seq 방법과 달리, 무작위 프라이밍 RNA-seq 리드의 매우 작은 일부가 TCR 서열이면서 리드 길이는 짧은데(보통 =< 100 bp), 이는 일반적으로 TCR의 V(D)J 영역의 일부만을 커버한다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 무작위 프라이밍 짧은 RNA 시퀀싱 리드로부터 TCR-CDR3 서열을 조립하고 추출하기 위한 rpsTCR 파이프라인을 개발하였다(도 17). rpsTCR은 페어드-엔드 및 싱글-엔드 짧은 리드를 취하고, 기본 파라미터를 갖는 Tophat을 사용해 이들 리드를 마우스 또는 인간 게놈과 전사체에 맵핑하였지만, TCR 유전자좌와 전사물에는 맵핑하지 않았다. 맵핑된 리드를 제거하였고, 맵핑되지 않은 리드는 TCR 서열의 추출을 위해 재활용하였다. 맵핑되지 않은 리드 내의 저 품질의 뉴클레오티드를 잘라냈다. 그런 다음, 35 bp미만의 길이를 갖는 리드를 HTQC 툴킷을 사용하여 걸러냈다. QC 합격한 짧은 리드를 iSSAKE 기본 설정을 사용하여 더 긴 리드로 조립하였다. TCRklass를 사용하여, 기본값 1.7 내지 2까지 설정된 Scr(보존된 잔기 지지 점수)을 갖는 CDR3 서열을 식별하였다. 건강한 인간 PBMC 샘플로부터의 표적화된 TCR-seq 데이터를 양성 대조군으로서 사용하여, 파이프라인에 도입된 추가 단계가 TCRklass 하나와 비교하여 더 높은 위양성율 또는 위음성율을 초래하는지 여부를 평가하였다. TCRB(64,031) 또는 TCRA(51,448)로부터의 고유 CDR3 서열의 대부분이 rpsTCR과 TCRklass 모두에 의해 검출되었다. rpsTCR과 TCRklass 간의 상관계수는 TCRB-CDR3 및 TCRA-CDR3에 대해 각각 0.9999 및 0.9365였다 (도 17). 6개의 TCR 음성 암 또는 비암 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였다. rpsTCR은 어떤 CDR3 서열도 검출하지 않은 반면, TCRklass는 이들 TCR 음성 암 세포주의 일부로부터 몇 개의 CDR3 서열을 추출하였다(도 13). 파이프라인의 성능을 더 검증하기 위해, 표적화된 TCR-seq 및 무작위 프라이밍 RNA-seq 접근법 (200M, 2x100 bp)을 사용하여, 건강한 마우스 PBMC 샘플을 시퀀싱하였다. RNA-seq 데이터로부터 조립된 CDR3 서열의 수가 표적화된 TCR-seq 접근법에서의 수보다 훨씬 작았지만, rpsTCR을 사용하여 RNA-seq 데이터로부터 식별된 CDR3 서열의 약 45%는 표적화된 TCR-seq로부터의 CDR3 서열 중에서도 관찰되었다. 표적화된 TCR-seq의 기술 제한 때문에, RNA-seq 데이터로부터 추출된 CDR3 서열의 분획이 TCR-seq 결과에 존재하지 않았다는 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들어, 표적화된 TCR-seq에 사용된 5' race 어댑터의 효율은 일반적으로 낮으며, 다중 PCR은 고 빈도 TCR을 증폭시키는 경향이 있으므로, TCR의 작은 부분만을 표적화할 수 있다. 예상한 바와 같이, rpsTCR을 사용하여 RNA-seq 데이터로부터 식별된 CDR3 서열의 훨씬 더 높은 백분율(~ 70%)이 표적화된 TCR-seq 유래의 고빈도 CDR3 서열 간에서도 관찰된 반면(>= 0.1%), TCRklass 하나를 사용한 경우 약 40%만이 추출되었다. 또한, 100 bp 리드 길이를 50 bp 분절로 절단하고 200 M 리드를 무작위로 선별하였다. 표적화된 TCR-seq 접근법에 의해 순위를 매긴 상위 10개의 CDR3 서열 중에서, 8개의 CDR3 서열이 rpsTCR에 의해 검출된 반면, TCRklass에 의해서는 3개의 CDR3 서열만이 검출되었다. 그런 다음, rpsTCR 파이프라인을 적용하여 상이한 항체로 치료한 MC38의 종양내 CD8 T 세포로부터 생성된 단일 세포 RNA-seq 데이터로부터 CDR3 서열을 추출하였다. 표적화된 TCR-seq 접근법을 사용해 CDR3_베타 및 CDR3_알파 서열 검출률을 공개된 데이터와 비교하여(도 14) T 세포의 단일 세포 시퀀싱 유래의 TCR 서열을 검출하였다.
본 방법 및 시스템은 바람직한 구현예 및 특정 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본원의 구현예는 모든 면에서 제한적이 아니라 예시적이므로 본 발명의 범주가 제시된 특정 구현예에 한정되는 것으로 의도되지 않아야 한다.
달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 임의의 방법은 그 단계가 특정 순서로 수행될 것을 요구하는 것으로서 간주되도록 의도되지 않는다. 따라서, 방법 청구항이 방법의 단계들이 따라야 할 순서를 실제로 나열하지 않거나, 단계들이 특정 순서로 한정될 것을 청구범위 또는 명세서에서 달리 구체적으로 기재하지 않는 한, 어떤 면에서도 순서가 이에 따라 추론되는 것으로 의도되지 않는다. 이는, 다음을 포함하여, 해석을 위한 모든 가능한 비 명시적 근거를 포함한다: 단계 또는 작동 순서의 배치에 관한 논리적 문제; 문법적 구조 또는 구두점에서 파생된 명백한 의미; 명세서에 기술된 구현예의 수 또는 유형.
본 출원 전반에 걸쳐, 다양한 간행물이 참조된다. 이들 간행물의 개시는, 본 방법 및 시스템이 속하는 분야의 상태를 더욱 완전하게 설명하기 위해 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
다양한 변형 및 변화가 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예가 본 명세서 및 본 명세서에 개시된 실시의 고려로부터 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로만 간주되어야 하며, 진정한 범주 및 사상은 다음의 청구범위에 의해 표시된다.

Claims (40)

  1. T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) T 세포로부터 수득된 RNA의 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계;
    b) 상기 짧은 리드를 TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드 및 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하는 단계;
    c) 맵핑된 짧은 리드를 상기 리드 세트로부터 제거하는 단계;
    d) 리드 세트에 남아있는 상기 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계;
    e) 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계;
    f) TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열을 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, 상기 k-스트링을 (e) 단계로부터의 상기 상응 아미노산 서열과 정렬하고, 상기 k-스트링에서 상기 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 상기 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하는 단계;
    g) 상기 하나 이상의 긴 리드에서 상기 후보 CDR3 영역의 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하는 단계;
    h) 상기 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상기 하나 이상의 긴 리드 상류(upstream)의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 정렬 점수를 가진 긴 리드를 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하는 단계; 및
    i) 상기 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상기 하나 이상의 긴 리드 하류(downstream)의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 정렬 점수를 가진 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, TCR 서열을 생성하는 단계;
    를 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 짧은 리드는 RNA의 무작위 프라이밍으로부터 수득되는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 T 세포는 인간 또는 마우스로부터 수득되는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기준 서열은 인간 게놈, 마우스 게놈, 인간 전사체, 또는 마우스 전사체를 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 맵핑된 짧은 리드를 상기 리드 세트로부터 제거하는 단계는, 35 염기쌍 미만인 맵핑되지 않은 짧은 리드를 상기 리드 세트로부터 제거하는 단계를 추가로 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 리드 세트에 남아 있는 상기 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계는:
    상기 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 TCR 서열의 기준 데이터베이스 유래의 하나 이상의 TCR 서열에 대해 정렬하는 단계; 및
    상기 정렬에 기초하여, 상기 하나 이상의 맵핑되지 않은 짧은 리드를 긴 리드로 조립하는 단계;
    를 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, TCR C 영역 핵산 서열을 상기 TCR 서열에 첨부하는 단계를 추가로 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 T 세포로부터 수득된 RNA의 100 염기쌍 미만의 상기 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계 이전에, 상기 T 세포가 수득되는 대상체에게 면역 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 대상체는 인간 이외의 동물인, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 면역 요법은 단일 요법 또는 병용 요법을 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 병용 요법은 공자극 작용제 및 공억제 길항제를 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    대상체의 제1 복수의 T 세포에 대해 a) 단계 내지 i) 단계를 반복하되, 상기 T 세포는 치료제를 투여하기 전에 채취되는 단계;
    상기 제1 복수의 T 세포에 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수를 결정하는 단계;
    상기 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계;
    상기 대상체의 제2 복수의 T 세포에 대해 a) 단계 내지 i) 단계를 반복하되, 상기 T 세포는 상기 치료제를 투여한 후에 채취되는 단계;
    상기 제2 복수의 T 세포에 존재하는 고유 TCR 서열의 발생 회수를 결정하는 단계; 및
    상기 제1 복수의 T 세포 및 상기 제2 복수의 T 세포에 존재하는 고유한 TCR 서열의 발생 회수에 기초하여, 클론 증식이 발생한 하나 이상의 고유 TCR 서열을 결정하는 단계;
    를 추가로 포함하되, 상기 대상체는 인간 이외의 동물인, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 클론 증식이 발생한 상기 하나 이상의 고유 TCR 서열에 기초하여 T 세포 클론 증식 표지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    T 세포 클론 증식 표지의 데이터베이스를 쿼리(query)하고 상기 T 세포 클론 증식 표지를 사용해 상응 치료 반응을 쿼리(query)하는 단계;
    상기 쿼리(query)에 기초하여, 상기 치료에 대한 대상체의 반응 가능성(likelihood)을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 치료에 대한 상기 대상체의 반응을 결정하는 단계;
    상기 T 세포 클론 증식 표지를 데이터베이스에 저장하는 단계; 및
    상기 치료에 대한 상기 대상체의 반응을 상기 데이터베이스에서 상기 T 세포 클론 증식 표지와 연관시키는 단계;
    를 추가로 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    치료에 반응하여 증식하는 T 세포 클론에 상기 TCR 서열이 존재하는 것을 결정하는 단계;
    상기 TCR 서열을 함유하는 하나 이상의 T 세포를 생산하는 단계;
    상기 하나 이상의 T 세포를 대상체에게 투여하는 단계; 및
    치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계;
    를 추가로 포함하되, 상기 대상체는 인간 이외의 동물인, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, T 세포로부터 수득된 RNA의 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계는 복수의 T 세포로부터 수득된 RNA의 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 벌크 시퀀싱하는 단계를 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 복수의 T 세포 각각에 대해 b 단계 내지 i 단계를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    b 단계 내지 i 단계를 수행하는 단계를 포함하는 상기 복수의 T 세포 각각에 대해 b 단계 내지 i 단계를 수행하는 단계는:
    b 단계 내지 i 단계 중 하나 이상의 적어도 일부를 작업으로서 분류하는 단계; 및
    복수의 프로세서에 걸쳐 각각의 작업에 대한 작업량(workload)을 병렬로 분배하는 단계;
    를 포함하는, T 세포 수용체(TCR)를 시퀀싱하는 방법.
  19. 장치에 있어서,
    하나 이상의 프로세서; 및
    프로세서에서 실행 가능한 명령을 포함하는 메모리;
    를 포함하며,
    상기 명령은, 상기 하나 이상의 프로세서에 의해 실행될 때, 상기 장치가:
    a) T 세포로부터 수득된 RNA의 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 포함하는 서열 데이터를 수신하고;
    b) 상기 짧은 리드를 TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드 및 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성시키고;
    c) 맵핑된 짧은 리드를 상기 리드 세트로부터 제거하고;
    d) 상기 리드 세트에 남아있는 상기 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하고;
    e) 상기 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하고;
    f) TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열을 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, 상기 k-스트링을 (e) 단계로부터의 상기 상응 아미노산 서열과 정렬하고, 상기 k-스트링에서 상기 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 상기 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하고;
    g) 상기 하나 이상의 긴 리드에서 상기 후보 CDR3 영역의 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하고;
    h) 상기 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상기 하나 이상의 긴 리드 상류(upstream)의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 정렬 점수를 가진 긴 리드를 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하고;
    i) 상기 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상기 하나 이상의 긴 리드 하류(downstream)의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 정렬 점수를 가진 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, TCR 서열을 생성하도록 야기하는, 장치.
  20. 컴퓨터에서 실행 가능한 명령이 구현되어 있으며, 다음의 단계들을 포함하는 방법을 수행하도록 구성된, 컴퓨터 판독 가능 매체로서, 다음의 단계들은:
    a) T 세포로부터 수득된 RNA의 100 염기쌍 미만의 짧은 리드를 시퀀싱하는 단계;
    b) 상기 짧은 리드를 TCR 유전자 서열을 함유하지 않는 기준 서열과 정렬하여, 맵핑된 짧은 리드 및 맵핑되지 않은 짧은 리드를 포함하는 리드 세트를 생성하는 단계;
    c) 맵핑된 짧은 리드를 상기 리드 세트로부터 제거하는 단계;
    d) 상기 리드 세트에 남아있는 상기 맵핑되지 않은 짧은 리드를 하나 이상의 긴 리드로 조립하는 단계;
    e) 상기 하나 이상의 긴 리드를 상응 아미노산 서열로 번역하는 단계;
    f) TCR V 영역 및 TCR J 영역 아미노산 기준 서열을 6개의 아미노산으로 이루어진 k-스트링으로 분획하고, 상기 k-스트링을 (e) 단계로부터의 상기 상응 아미노산 서열과 정렬하고, 상기 k-스트링에서 상기 상응 아미노산 서열에 맞게 맵핑되는 하나 이상의 보존된 TCR CDR3 잔기를 검출하고, 검출된 보존 수준에 점수를 매기고, 임계 보존 점수를 초과하는 보존 점수를 가진 상응 아미노산 서열을 선별하고, 상기 선별된 상응 아미노산 서열에서 후보 CDR3 영역 아미노산 서열을 검출하는 단계;
    g) 상기 하나 이상의 긴 리드에서 상기 후보 CDR3 영역의 아미노산 서열의 핵산 서열을 식별하는 단계;
    h) 상기 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상기 하나 이상의 긴 리드 상류(upstream)의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR V 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 정렬 점수를 가진 긴 리드를 후보 TCR V 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하는 단계; 및
    i) 상기 후보 CDR3 영역 핵산 서열의 상기 하나 이상의 긴 리드 하류(downstream)의 핵산 서열을 하나 이상의 TCR J 유전자 기준 서열과 정렬하고, 정렬 정도에 점수를 매기고, 임계 정렬 점수를 초과하는 정렬 점수를 가진 긴 리드를 후보 TCR J 유전자 서열을 포함하는 것으로 식별하여, TCR 서열을 생성하는 단계;
    를 포함하는 컴퓨터 판독 가능 매체.
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