KR102202225B1 - 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 및 이를 이용한 원산지 판별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 및 이를 이용한 원산지 판별방법에 관한 것이다.
본 발명의 참깨의 원산지 판별용 바이오마커를 이용하면, 참깨 내 대사체의 수준변화를 이용하여 국내산 참깨인지 수입산 참깨인지의 여부를 판별할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는, 실제 단속에 이용하여 원산지를 속여 부당한 이익을 취하는 행위를 단속할 수 있는 중요한 도구로써 사용할 수 있으며, 이는 국내 유통 농산물의 시장질서 확립과 소비자들의 신뢰 확보에 기여할 수 있다.
본 발명의 참깨의 원산지 판별용 바이오마커를 이용하면, 참깨 내 대사체의 수준변화를 이용하여 국내산 참깨인지 수입산 참깨인지의 여부를 판별할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는, 실제 단속에 이용하여 원산지를 속여 부당한 이익을 취하는 행위를 단속할 수 있는 중요한 도구로써 사용할 수 있으며, 이는 국내 유통 농산물의 시장질서 확립과 소비자들의 신뢰 확보에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 및 이를 이용한 원산지 판별방법에 관한 것이다.
원산지란 그 물품이 성장했거나, 생산, 제조, 가공된 지역을 말하며, 수출입 물품의 경우 국적을 의미한다. 전 세계적인 자유무역협정(FTA)의 확대로 농산물들이 자유롭게 각국의 국경을 넘나들 수 있는 가능성이 커졌으나, 국가들 간의 교역을 통한 농산물의 원산지가 위조되어 판매되는 경우가 발생하여 시장 질서를 교란시키고 소비자들의 불신을 사고 있다. 우리나라 원산지 표시 제도는 1991년 7월 1일부터 시행되고 있으며, 대외무역법령에 '원산지 판정 기준', '원산지 표시 대상 물품', '위반시의 벌칙'등에 관한 규정을 두고 있다.
관세법령에는 통관 시의 원산지 및 그 표시의 확인 및 시중 유통 과정에서의 단속 등에 관한 규정을 두어 운영하고 있다. 국립농산물품질관리원은 2014년 4290개 업체가 농식품의 원산지를 속여 판매하다가 적발되었다고 밝힌 바 있으며, 2012년에는 4642개, 2013년에는 4443개 업체가 원산지를 위조하다 적발되었다. 해마다 적발되는 업체의 수가 소폭 감소하고 있지만, 여전히 하루에 10개 이상의 업체가 적발되고 있다. 정부에서는 "불량식품"을 4대 사회악 중 하나로 포함시켜서 이의 근절을 위해 다각적으로 심혈을 기울이고 있으나, 식품으로 직접 사용되거나 가공식품의 주요 원료가 되는 농산물의 원산지 변조를 막지 못하고 있다. 국내 농산물 및 식품의 위변조 규모는 정확하게 알려져 있지 않지만, 전 세계적인 추세를 감안하면, 국내 전체 시장 규모의 10% 정도 차지하는 것으로 예측된다.
또한, 이 중 약 5%, 즉 국내에서 유통되고 있는 전체 농산물 및 식품 중 약 0.5% 정도가 원산지가 위변조 되어 유통되고 있을 것으로 추정된다. 이에 농산물의 원산지를 과학적으로 판별하는 것은 국가적으로 중요한 사회문제로 대두되고 있으며, 과학적이고 객관적인 판별법의 확보가 시급한 실정이다.
현재까지 농산물의 원산지 판별은 주로 isotope-ratio mass spectrometry(IRMS), HPLC, visible micro-Raman spectroscopy, ultraviolet-visible absorption spectroscopy(UV-vis), elemental analysis-like inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry(ICP-AES) 등을 활용한 화학적 분석으로 이루어져 왔다. 그러나 이들 연구 방법들은 모두 특정 성분이나 그룹에 초점을 맞추어 온 targeted 접근방법으로써 한계점이 있다.
한편, 대사체학(metabolomics)은 농산물에 존재하는 대사체(metabolites) 들을 분석, 연구하는 학문으로 정의한다. 또한 대사체학은 농산물 내 전대사체(metabolome)를 비표적적인(non-targeted) 방식으로 분석하는 접근방법이며, 유전적 차이나 환경적 변화에 대한 차이를 효율적으로 규명할 수 있어서 대사체학을 활용한 농산물 및 약용작물의 원산지 판별에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.
2010년도 이후 농산물품질관리원에서 주로 유전체 정보를 활용한 단일염기다형성마커을 이용하여 곶감, 구기자, 쌀 등의 원산지 판별을 위한 키트를 개발하여 특허를 출원 중에 있거나 등록하였으나, 대사체를 이용해 국내에서 재배되는 참깨의 원산지를 판별하는 연구는 아직 이루어지지 않은 상태이다.
또한, 최근 농수산물 시장개방에 따라 농산물의 원산지 관리 등 국내 농산물에 대한 보호 및 육성에 대한 관심이 높아지고 있으며, 참깨의 경우 국내 생산량이 전체 소비량의 13% 정도로 수입 의존도가 높은 품목으로 원산지 부정 유통 사례가 끊이지 않고, 종래기술의 경우 참깨의 국내산과 수입산 여부를 판별하는 방법을 제시하고 있지는 못한 상황이므로, 과학적인 원산지 판별법 개발이 시급한 실정이다.
따라서, 국내산과 수입산 참깨를 정확히 구별하여 국내 생산 농가의 소득 보전과 부정유통 방지를 위한 판별법을 개발할 필요성이 있다.
이에, 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 대사체를 이용해 국내에서 재배되는 참깨의 원산지를 판별하는 방법을 개발하는 데 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 한국산 및 수입산 참깨의 원산지별로 발현량에서 차이를 나타내는 참깨 내 대사체를 분석하여 5 종의 참깨 원산지 판별용 마커로서, 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)를 확립하고, 이를 이용하여 한국산 및 수입산 참깨의 원산지를 신속 정확하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은, 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 참깨의 원산지 판별용 키트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 참깨의 원산지 판별용 바이오마커를 이용하여 참깨의 원산지를 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 대사체를 포함하는 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 참깨의 원산지 판별용 바이오마커는 원산지별 참깨의 대사체의 발현 수준 차이를 이용하여 참깨의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 대사체의 발현 수준은, 구체적으로, 수입산 중에서 가장 많이 고발현 또는 저발현되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "원산지"는, 그 물품이 성장했거나, 생산, 제조 가공된 지역을 말하여 수출입 물품의 경우 국적을 의미한다. 우리나라의 원산지 표시제도는 1991년 7월 1일 부터 시행되고 있으며, 대외무역법령에 「원산지 판정 기준」,「원산지 표시 대상 물품」,「위반시의 벌칙」등 에 관한 규정을 두고 있다. 관세법령에는 통관 시의 원산지 및 그 표시의 확인 및 시중 유통 과정에서의 단속 등에 관한 규정을 두어 운영하고 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "참깨"는, 참깨과의 한해살이풀, 또는 그 씨이다. 서아시아가 원산지인 한해살이풀로 한국을 비롯한 동아시아와 북아메리카, 아프리카 등에 널리 분포하는 유료작물(油料作物)이다. 참깨는 빛깔에 따라 검정깨, 흰깨, 누른깨로 나뉘고 특성에 따라 분류하기도 한다. 참깨는 지방이 45-55%, 단백질이 36% 들어있으며, 비타민 B1 및 E도 많다. 기름은 식용하고, 깨소금을 만들어 조미료로 쓰며, 떡, 엿, 과자 등에 넣기도 한다 인조버터, 비누원료, 올리브기름 대용으로도 쓴다. 지방유가 들어 있으므로 자양강장 및 변비치료에 좋고 다른 생약과 배합하면 허약체질, 병후 회복용으로 유효하며, 염증 등에 외용되고 해독제, 완화제, 연고 등으로 이용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "판별"은, 참깨의 원산지가 어느 곳인지 결정하여 구별하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "수준 차이"는, 참깨에서의 특정 대사체를 비교하고자 하는 그룹 간에서의 대사체 수준이 높거나 혹은 낮은 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "참깨 원산지 판별용 바이오마커"는 원산지로부터의 참깨 내에 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)인 대사체들이 발현되어 상기 대사체들의 발현 수준을 이용하여 원산지를 판별할 수 있는 바이오마커로 사용할 수 있다는 뜻이다.
상기 참깨 원산지 판별용 바이오마커로 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)를 단독 또는 1 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 참깨 원산지 판별용 바이오마커 조성물은, 상기 참깨 원산지 판별용 바이오마커로서, 바람직하게는 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 5 종을 모두 포함할 수 있다. 총 5 종을 모두 포함하는 참깨 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 사용할 경우 국내 또는 해외 지역, 바람직하게는 중국 지역에서 생산되는 참깨의 원산지를 보다 정확하게 판별할 수 있다.
본 발명의 참깨 원산지 판별용 바이오마커는 원산지별 참깨의 대사체의 발현 빈도 차이를 이용하여 참깨의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다. 상기 대사체의 발현 빈도는 구체적으로, 한국산 또는 중국산에서 가장 많이 발현되는 것으로 이해되어야 한다.
상기 참깨 원산지 판별용 바이오마커로 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올, 아데노신 5'-모노포스페이트 및 D-라피노즈를 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 한국산 참깨의 경우, 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올 및 아데노신 5'-모노포스페이트가 다량 발현되는 특징이 있다.
또한, 중국산 참깨의 경우, D-라피노즈가 다량 발현되는 특징이 있다.
따라서, 이들을 원산지 판별을 위한 바이오마커로 사용하여 참깨의 원산지를 판별할 수 있는 것이다
이에 따라, 참깨의 원산지를 명확하게 확인할 수 있게 되어, 참깨의 원산지에 대한 신뢰성을 확보할 수 있어, 소비자는 믿고 국산 참깨를 구입할 수 있으며, 생산자는 신뢰성 확보를 통해 참깨 판매 시장을 더 활성화시킬 수 있게 된다.
즉, 본 발명은 국내 및 외국에서 수집된 참깨 품종을 대상으로 분자 마커로서 대사체를 이용한 참깨 원산지 판별 방법 및 체계를 확립하였다. 본 발명에 따르면, 국내산 및 수입산 참깨를 식별할 수 있으므로, 농산물 원산지표시제에도 활용할 수 있다. 나아가, 참깨 품종의 진위성 규명, 종자분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 분야에 기여할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 최초 동정된 총 243종 중 5 종을 모두 포함하는 참깨 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 사용할 경우 유의성있는 판별 효과가 없음을 확인함으로써, 본 발명의 5 종을 모두 포함하는 참깨 원산지 판별용 바이오마커 조합이 최적임을 확인하였다.
또한, 상기 조성물은 참깨 내 대사체의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함할 수 있으며, 상기 제제는 해외 지역으로부터 생산된 참깨 시료에서 대사체 각각의 수준을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 포함하는, 참깨의 원산지 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 참깨의 원산지 판별용 키트는 원산지가 의심되는 참깨시료로부터 상기 대사체를 검출하거나 정량분석하여 참깨시료의 원산지를 판별하는데 사용될 수 있으며, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 참깨의 원산지 판별용 키트는 대사체를 검출하기 위한 직접적인 수단뿐만 아니라 분석 방법에 사용되는 다른 구성 성분, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 그 예로써 테스트 튜브, 컨테이너, 반응 완충액, 분석용 효소, 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 참깨의 원산지 판별용 키트는 상술한 5 종 이상의 바이오마커를 포함하여 시료의 대사체를 정량 분석함으로써 참깨의 원산지를 판별할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트는 시료를 담지할 수 있는 통상의 웰 형태의 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다. 상기 웰 내에는 시료 및 하나 이상의 바이오마커를 흡수할 수 있는 다공성 지지체를 포함할 수 있다. 상기 지지체는 참깨 대사체 추출물의 첨가를 대비하여 내부 바이오마커를 미리 결정된 농도로 포함하고 있으며, 아울러 각 시료를 고정할 수 있다. 또한, 지지체의 다공성은 시료 분석 시 첨가되는 추출 용매에 최대한 노출되게 할 수 있다.
따라서, 상기 지지체는 높은 수준의 다공도를 가진 임의의 지지체일 수 있으며, 이러한 지지체는 종래 기술분야에서 공지되어 있으며, 또는 상업적으로 구입 가능하다.
구체적으로, 고형 지지체일 수 있다. 보다 구체적으로는 액체에 대한 흡수성 물질로 이루어져 있다. 상기 흡수성 물질은 흡착제 또는 흡착성 물질일 수 있다.
상기 액체 흡수성 물질은 바이오마커의 용액과 분석용 후속 시료가 기공을 통해 일정하게 흡착 또는 흡수되게 한다.
상기 흡수성 물질로 셀룰로오스와 같은 카보하이드레이트 물질, 유리 섬유, 유리 비드, 폴리아크릴아미드 젤, 다공성 플라스틱 불활성 폴리머 및 다공성 흑연 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 아가로오스, 아가, 셀룰로오스, 덱스트란, 키토산 또는 곤약과 같은 카보하이드레이트 물질이나 그 유도체, 카나기난, 젤란 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 가장 구체적으로는, 셀룰로오스 또는 유리 섬유일 수 있다.
본 발명의 키트에 포함된 바이오마커는 시료에 존재하는 대사체의 양을 정량하기 위해 유사 또는 동일한 유사체에 대한 비교로 사용되는, 양을 알고 있는 절대량의 비교물질인 것으로 이해할 수 있다. 상기 바이오마커는 시료의 대사체와의 적절한 구별을 위해 동위원소로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트에 사용할 수 있는 시료는 참깨 원산지별 대사체 추출물로서, 액체 시료의 형태로 키트에 제공될 수 있다.
상기 대사체의 추출방법은 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 용매추출법을 이용한다. 상기 용매는 참깨의 대사체를 용해할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지는 않는다. 예를 들어, 상기 용매로, 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올; 아세톤; 트리플루오로에탄올; 테트라하이드로퓨란; 디클로로메탄; 포스페이트; 및 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다.
예컨대, 상기 대사체 추출물은 메탄올 및 물의 혼합용매, 구체적으로 1:1 내지 9:1의 부피비, 보다 구체적으로는 7:3의 부피비로 혼합한 혼합용매에서 참깨를 균질화하여 얻을 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 대사체의 추출 범위를 보다 넓게 하기 위해 상기 용매 내에서 참깨 시료를 균질화하는 과정을 추가적으로 실시할 수 있다.
또한, 상기 마이크로타이터 플레이트는 분석물을 배출하기 위한 필터 및 배출구 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이들의 배치, 배출방법 등은 당업자 수준에서 이해될 수 있는 범위 내에서 조정 가능하다.
또한, 본 발명의 키트는 통상적으로 분석장치와 조합하여 대사체 범위를 정량 표적 분석하기 위하여 여러 가지 대사체를 준비할 수 있는 기구에 포함된 시약, 용매, 소프트웨어 시스템 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 상술한 조성물을 이용하므로, 상술한 바와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 참깨의 원산지 판별방법을 제공한다:
(a) 참깨로부터 대사체를 추출하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 대사체 중 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 대사체를 액체 크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)로 분석하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 대사체들 간의 발현 수준 차이로 한국산 및 수입산 참깨의 원산지를 판정하는 단계.
바람직하게는, 상기 수입산은 중국산이다.
바람직하게는, 상기 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올 및 아데노신 5'-모노포스페이트의 발현량은 수입산 참깨와 비교하여 한국산에서 증가한다.
바람직하게는, 상기 D-라피노즈의 발현량은 한국산 참깨와 비교하여 중국산에서 증가한다.
예컨대, 국내산 참깨는 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올, 및 아데노신 5'-모노포스페이트 같은 물질들은 많이 포함되어 있으나, 이에 비해 D-라피노즈는 상대적으로 적게 포함되어 있다.
본원발명의 바이오마커로서 이용되는 경우, 국내산 참깨 내 대사체인 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올, 아데노신 5'-모노포스페이트 및 D-라피노즈의 분포 비율은 1.53: 1.86: 1.32: 1.27: 0.53이다.
중국산 참깨는 아데노신 5'-모노포스페이트와 D-라피노즈 같은 물질들은 많이 포함되어 있으나, 이에 비해 발린, L-글루타시온 및 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올은 상대적으로 적게 포함되어 있다. 본원발명의 바이오마커로서 이용되는 경우, 중국산 참깨 내 대사체인 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올, 아데노신 5'-모노포스페이트 및 D-라피노즈의 분포 비율은 0.97: 0.86: 0.86: 1.01: 1.17이다.
그 외 수입산 참깨는 D-라피노즈 같은 물질은 많이 포함되어 있으나, 이에 비해 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올 및 아데노신 5'-모노포스페이트은 상대적으로 적게 포함되어 있다. 본원발명의 바이오마커로서 이용되는 경우, 수입산 참깨 내 대사체인 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올, 아데노신 5'-모노포스페이트 및 D-라피노즈의 분포 비율은 0.50: 0.28: 0.81: 0.72: 1.30이다.
본 발명의 일 구현예에서, 하기와 같은 방법으로 서로 다른 원산지의 참깨 시료 간의 대사체의 차별성을 판별한다:
(1) 국내산 및 수입산 참깨 시료에서 차이를 보이는 5 가지 대사체(발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올, 아데노신 5'-모노포스페이트 및 D-라피노즈)를 선별 후, 선별된 대사체에 대해 부분최소제자승판별(PLS-DA)를 이용하여 다변량 방식으로 반응 변수 모형화;
(2) 기체 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 상대적 수준 차이 비교;
(3) ROC 곡선 (Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여 AUC(Area Under the Curve) 값 비교; 및
(4) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증을 통하여 참깨 시료로부터 대사체 바이오마커 분석.
또한, 각 그룹별 t-검정을 통하여 그룹에 특이적인 대사체를 확인할 수 있었다. 대사체의 유의적 차이의 크기를 폴드 체인지로 비교하여 (fold changd) 그 양이 증가 혹은, 감소하는 패턴을 분석하여, 그룹 특이적 대사체를 선별하였다.
본 발명에서, 상기 참깨시료에서 대사체의 수준차이를 측정하는 방법은 질량분석기(Mass Spectrometer), 크로마토그래피(Chromatography) 기기, 크로마토그래피가 결합된 질량분석기(Chromatography- mass spectrometer), 핵자기공명분광분석기(Nuclear Magnetic Resonance spectrometer), 라만 분광기(Raman spectroscopy), 광흡수분석(light absorption analysis)기, 유동주입분석(flow injection analysis)기 등의 기기장치를 이용한 분석법; 상기 대사체에 특이적인 항체, 엡타머, 펩타이드, 핵산 또는 고분자와 대사체 간의 특이적인 결합을 이용한 대사체의 정량분석법; ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이(microarray) 분석법 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 이에 제한하지 않는다. 바람직하게는, 상기 대사체의 수준을 측정하는 방법으로 액체 크로마토그래피 분석법 및 질량분석법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피(Chromatography)는 액체 크로마토그래피(Liquid- Chromatography, LC), 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피 (Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피 (Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하며, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피이다.
바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 액체 크로마토그래피를 이용한 액체 크로마토그래피-질량분석기(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)이다.
본 발명에서 국내산 또는 수입산 참깨 시료에서 발현 수준이 차이나는 5 종의 대사체를 참깨의 원산지를 판별할 수 있는 바이오 마커로 선정하였고, 이를 이용하는 경우 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 원산지 판별을 가능하게 함으로써 실제 원산지 단속에 적용 가능하도록 하였다.
따라서, 본 발명의 참깨의 원산지 판별용 바이오마커를 이용한 참깨의 원산지 판별방법을 이용하였을 때, 보다 일관성 있고 신뢰도 높게 참깨의 원산지를 판별할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이는 실제 원산지 단속에 적용할 수 있으며, 참깨 외 다양한 농산물에도 적용할 수 있다.
본 발명의 참깨의 원산지 판별용 바이오마커를 이용하면, 참깨 내 대사체의 수준 차이를 이용하여 참깨의 원산지를 판별할 수 있다. 본 발명의 바이오마커는, 실제 단속에 이용하여 원산지를 속여 부당한 이익을 취하는 행위를 단속할 수 있는 중요한 도구로써 사용할 수 있으며, 이는 국내 유통 농산물의 시장질서 확립과 소비자들의 신뢰 확보에 기여할 수 있다.
도 1은 국내산 및 수입산 참깨의 휘발성 대사체의 PCA 스코어 plot을 나타낸다.
도 2는 국내산, 수입산 참깨의 휘발성 대사체의 PLS-DA 스코어 plot을 나타낸다.
도 3은 SAM 분석을 나타낸다.
도 4는 PLS-DA 분석을 나타낸다.
도 5는 ROC 분석을 나타낸다.
도 6은 참깨 시료의 전처리 시 액체질소 유무에 따른 FT-IR 스펙트럼을 보여준다; (A) 각 스펙트럼의 층배열 (stack) (B) 각 스펙트럼의 겹침배열 (overlay)
도 7은 참깨 시료의 주요 대사체 작용기를 동정한 결과를 보여준다.
도 8은 각 정규화 방법별 참깨 시료의 PCA 및 PLS-DA 분석 스코어 plot (FT-IR spectrum 전체 영역 사용) 결과를 보여준다: (A) area normalization: FT-IR 피크의 면적을 동일하게 맞춰주는 방법; (B) min-max normalization: FT-IR 피크의 최소점을 0, 최대점을 1로 맞춰주는 방법; (C) amide normalization: FT-IR 피크 중 amide Ⅰ 피크를 기준으로 정규화하는 방법; (D) vector 1차 normalization: FT-IR 피크를 1차 미분 후 Euclidean norm으로 정규화하는 방법; (E) vector 2차 normalization: FT-IR 피크를 2차 미분 후 Euclidean norm으로 정규화하는 방법.
도 9는 참깨 시료의 (A) PCA, (B) PLS-DA 및 (C) OPLS-DA 분석 스코어 plot (FT-IR sepctrum ①번 region (C-H stretching region, 3,050-2,800 cm-1) 사용) 결과를 보여준다.
도 10은 단독추출법과 Bligh & Dyer추출법으로 추출한 참깨 내 수용성 성분 (A)과 지용성 성분 (B)의 NMR 분석 스펙트럼을 보여준다.
도 11은 참깨 시료에 대한 1H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 12는 (A) 한국, 중국산 참깨의 PLS score plot, (B) 한국, 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 예측 PLS-DA model의 permutation 결과, (C) 한국, 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 OPLS-DA score plot, (D) 한국, 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 OPLS-DA model의 permutation 결과, (E) 한국, 중국산 참깨의 HCA 결과를 보여준다.
도 13은 (A) 한국 5지역 분리, (B) 한국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PCA score plot, (C) 한국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PLS-DA score plot, (D) 한국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 예측 PLS-DA model의 permutation 결과를 보여준다.
도 14는 (A) 중국 3지역으로 분리, (B) 중국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PCA score plot, (C) 중국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PLS-DA score plot, (D) 중국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 예측 PLS-DA model의 permutation 결과를 보여준다.
도 2는 국내산, 수입산 참깨의 휘발성 대사체의 PLS-DA 스코어 plot을 나타낸다.
도 3은 SAM 분석을 나타낸다.
도 4는 PLS-DA 분석을 나타낸다.
도 5는 ROC 분석을 나타낸다.
도 6은 참깨 시료의 전처리 시 액체질소 유무에 따른 FT-IR 스펙트럼을 보여준다; (A) 각 스펙트럼의 층배열 (stack) (B) 각 스펙트럼의 겹침배열 (overlay)
도 7은 참깨 시료의 주요 대사체 작용기를 동정한 결과를 보여준다.
도 8은 각 정규화 방법별 참깨 시료의 PCA 및 PLS-DA 분석 스코어 plot (FT-IR spectrum 전체 영역 사용) 결과를 보여준다: (A) area normalization: FT-IR 피크의 면적을 동일하게 맞춰주는 방법; (B) min-max normalization: FT-IR 피크의 최소점을 0, 최대점을 1로 맞춰주는 방법; (C) amide normalization: FT-IR 피크 중 amide Ⅰ 피크를 기준으로 정규화하는 방법; (D) vector 1차 normalization: FT-IR 피크를 1차 미분 후 Euclidean norm으로 정규화하는 방법; (E) vector 2차 normalization: FT-IR 피크를 2차 미분 후 Euclidean norm으로 정규화하는 방법.
도 9는 참깨 시료의 (A) PCA, (B) PLS-DA 및 (C) OPLS-DA 분석 스코어 plot (FT-IR sepctrum ①번 region (C-H stretching region, 3,050-2,800 cm-1) 사용) 결과를 보여준다.
도 10은 단독추출법과 Bligh & Dyer추출법으로 추출한 참깨 내 수용성 성분 (A)과 지용성 성분 (B)의 NMR 분석 스펙트럼을 보여준다.
도 11은 참깨 시료에 대한 1H NMR 스펙트럼을 보여준다.
도 12는 (A) 한국, 중국산 참깨의 PLS score plot, (B) 한국, 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 예측 PLS-DA model의 permutation 결과, (C) 한국, 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 OPLS-DA score plot, (D) 한국, 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 OPLS-DA model의 permutation 결과, (E) 한국, 중국산 참깨의 HCA 결과를 보여준다.
도 13은 (A) 한국 5지역 분리, (B) 한국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PCA score plot, (C) 한국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PLS-DA score plot, (D) 한국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 예측 PLS-DA model의 permutation 결과를 보여준다.
도 14는 (A) 중국 3지역으로 분리, (B) 중국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PCA score plot, (C) 중국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 PLS-DA score plot, (D) 중국 내 참깨의 원산지 판별을 위한 예측 PLS-DA model의 permutation 결과를 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 참깨 시료 내 휘발성 대사체 분석
1-1. 참깨 시료의 휘발성 대사체 추출
본 발명자들은 참깨 시료 내 휘발성 대사체를 분석하기 위하여, 국내산 27개 지역의 참깨 시료는 국립농산물품질관리원으로부터 2018년에 생산된 것을 제공받았고, 중국 현지에서 중국산 6종, 추가로 수입산 6종(에티오피아산 1종, 나이지리아산 2종, 파키스탄산 1종, 인도산 1종과 추가 구입한 중국산 1종)을 구입하여 사용하였다. QC 시료로는 2018년에 전라남도 해남군 화원면에서 생산된 참깨를 사용하였다. 분석에 사용된 모든 시료는 보관, roasting, 추출 등의 전처리 과정 중의 수분으로 인한 실험 오차를 줄이기 위해 50℃의 dry oven에서 24시간 동안 건조하여 수분함량 2.5% 미만으로 조절한 후 사용되었다.
SPME용 20 mL vial에 참깨 시료 4.0g을 넣어 crimp cap으로 밀봉하였다. GC/MS에 부착된 MPS에서 180℃로 10분간 로스팅하였으며, 재현성을 높이기 위해 바이얼 6개씩 한 세트로 진행하였다. 일간 SPME 방법의 재현성 확보를 위해 시료 4개마다 QC 시료를 1개씩 분석하여 오차를 보정하였고, QC 시료는 예외로 바이얼 1개씩 한 세트로 진행하였다. 180℃에서 로스팅한 시료는 1±2℃의 냉장고에서 15분간 냉각시킨 후 10 μL 실린지를 사용하여 내부표준물질 각 100 mg/L 2종을 6 μL씩 첨가하였다. 내부표준물질로는 에틸 2-메틸 부티레이트(ethyl 2-methyl butyrate)(CAS 7452-79-1, Sigma-Aldrich, St. Louis, M.O., USA)와 메틸 살리실레이트(methyl salicylate)(CAS 119-36-8, Sigma-Aldrich)를 사용하였으며, 용매는 메탄올을 사용하였다. 바이얼에 담긴 시료의 휘발성 성분을 흡착하기 위해 DVB/CAR/PDMS SPME fiber (Supelco)를 사용하였다. 시료의 휘발성 성분을 포집하기 위하여 시료를 담은 20 mL 바이얼을 65℃에서 250 rpm으로 10분간 교반하며 평형을 이룬 뒤 휘발성 성분을 30분간 흡착, 230℃에서 5분간 탈착하였다.
1-2. 참깨 시료의 기체 크로마토그래피 분석
본 발명자들은 참깨 시료에서 추출한 샘플 내 대사체 검출을 위해, 상기 실시예 1-1의 샘플 4g을 Multi-Purpose Sampler (MPS, Gerstel, Mlheim an der Ruhr, Germany)를 이용해 기체 크로마토그래피에 주입하였다. 기체 크로마토 그래피는 7890B GC system (Agilent Technologies, Wilmington, DE)과 HP-5MS (length 30m × inner diameter 0.250mm × film thickness 0.25 μm, Agilent Technologies)를 사용 하였다. Oven은 40℃에서 3분간 유지하고, 280℃까지 4℃/min으로 온도를 높여 63분간 분석하였다. 이동상 기체는 헬륨(helium)을 사용하여 0.8 mL/min로 흐르게 하였고, splitless mode로 설정하였다.
1-3. 질량 분석기 분석
본 발명자들은 참깨 시료에서 추출한 샘플 내 대사체 검출을 위해 질량 분석기를 이용하여 질량 분석을 실시하였다. 질량 분석에는 5977A MSD (Agilent Technologies) 질량 분석기를 이용하였으며, 35-350m/z의 질량 범위에서 초당 4.5 스펙트럼의 속도로 대사체들의 질량 스펙트럼을 확보하였고, 전자 충격 이온화 (electron impact ionization) 는 70 eV로 시행하였다.
1-4. 대사체 정성 및 통계 분석
본 발명자들은 대사체를 정성 및 통계 분석하였다.
SPME법으로 추출한 참깨의 휘발성 대사체는 non-targeted analysis 되었으며, mass profiler professional software (MPP, Agilent Technologies)가 사용되었다. hexane에 희석한 saturated alkanes C7~C30 (1 mg/mL in hexane)을 외부 표준물질로 사용하여 각 휘발성분의 RI (Retention Index)를 구한 후 문헌상의 RI값과 비교하였다. 분석된 모든 휘발성 대사체는 내부표준물질인 ethyl 2-methyl butyrate (100 mg/L)와 methyl salicylate (100 mg/L)를 기준으로 RT (Retention Time)값이 보정되었다. MPP에서 추출한 데이터로 SIMCA P+ software (SIMCA-P version 11.0, Umetrics, Umea, Sweden)를 사용하여 다변량 통계분석을 실시하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 주성분 분석(principal component analysis, PCA)을 통해 국내산(파란색) 및 수입산(빨간색) 참깨 시료 간의 차이를 명확하게 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 부분 최소 제곱 판별 분석(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)을 통해 국내산 및 수입산 참깨 시료 간의 차이를 명확하게 확인하였다.
또한, PLS-DA 분석을 통해 Variable Important Plot (VIP) list를 얻어 PLS component 1과 PLS component 2의 구분에 영향을 미치는 주요 피크(peak)를 추출하여 RI를 계산한 후 이를 문헌상의 RI와 비교하여 주요 성분을 분석하였고, 하기 표 1에 참깨 휘발성 대사체 PLS-DA component1의 VIP(Variable Important Plot) 리스트(>1.0)를 나타냈고, 하기 표 2에 참깨 휘발성 대사체 PLS-DA component2의 VIP 리스트(>1.0)를 나타내었다.
그 결과, 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, VIP가 1.0이상인 휘발성 대사체만 선정해 분석하였고, PLS-DA component 1에 대한 VIP로는 alcohol류 1개, aldehyde류 7개, ester류 1개, hydrocarbons 3개, ketone류 2개, fatty acid 1개, phenol류 1개의 성분이 동정되었고, PLS-DA component 2에 대한 VIP로는 alcohol류 1개, aldehyde류 8개, ester류 1개, hydrocarbons 3개, ketone류 2개, fatty acid 1개, furan 계열 1개, phenol류 1개의 성분이 동정되었다.
실시예 2. LC-MS를 사용한 참깨 시료 내 원산지 특이적 지표 발굴
2-1. 참깨 시료의 LC-MS 분석
본 발명자들은 참깨의 2차 대사산물을 LC-Orbitrap MS를 이용하여 분석하였으며 데이터 프로세스 결과 총 138개의 대사체를 동정하였다.
2-2. 단변량 통계 분석 (Univariate statistics)
본 발명자들은 Student’s T-Test를 이용하여 국내산과 외국산을 비교했을 때 대사물질들의 변화를 통계적으로 검증하고, 각 반도별로 유의 수준 있게 변화하는 대사물질 리스트를 하기 표 3에 나타내었다(Student's T-Test < 0.05).
2-3. SAM (Significane Analysis for Microarrays) 분석
본 발명자들은 SAM (Significane Analysis for Microarrays) 분석을 통해 국내산과 수입산을 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 4 종의 대사 물질(N2-Methylguanosine, 4-Coumaric acid, Valine, L-Glutathione(환원형))의 발현 수준이 특징적으로 분석되었다. 대체적으로 국내산은 수입산에 비해 상향조절(up-regulated)되었으며, 수입산은 하향조절(down-regulated)된 것을 확인하였다.
2-4. 감독 다변량 통계(Supervised multivariate statistics)
본 발명자들은 감독 다변량 통계를 분석한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 부분최소자승판별 분석 (PLS-DA, Partial least squares-discriminant analysis)를 적용하였을 때, 그룹간의 대사체 프로파일이 잘 분리되었음을 확인하였다(R2Y = 0.955, Q2 = 0.794).
2-5. ROC 곡선 분석(Receiver operating characteristic Curve analysis)
본 발명자들은 VIP (Variable importance) 스코어를 고려하여 여러 가지 대사물질을 조합하였고, 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 5개의 대사물질(D-Raffinose, L-Glutathione (reduced), Adenosine 5'-monophosphate, Valine, 2-Amino-1,3,4-octadecanetriol)을 선별하였다. 각각의 AUC value는 0.954이다.
2-6. 참깨 시료에 존재하는 대사체(metabolic features)의 정량적 DB 구축
본 발명자들은 국내산과 수입산 참깨 시료에 존재하는 대사체(metabolic features)의 정량적 DB를 구축하였다. 그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, LC-MS 분석을 통해 참깨의 이차대사산물 및 기능성 대사산물의 표적물질 프로파일링 플랫폼을 구축하였다.
Metabolite name | Molecular Weight | Metabolite name | Molecular Weight |
Choline | 103.09966 | 3-Hydroxypicolinic acid | 139.0269 |
Pyrrole-2-carboxylic acid | 111.03204 | Guvacoline | 141.079 |
Cytosine | 111.04327 | DL-Stachydrine | 143.0946 |
Histamine | 111.0796 | 8-Hydroxyquinoline | 145.0527 |
Uracil | 112.02726 | 4-Guanidinobutyric acid | 145.0851 |
Creatinine | 113.05894 | Acetylcholine | 145.1103 |
N-Methylhydantoin | 114.04294 | Spermidine | 145.1579 |
D-(+)-Proline | 115.06329 | Coumarin | 146.0368 |
Betaine | 117.07894 | D-(-)-Glutamine | 146.069 |
Valine | 117.07894 | 5,6-Dimethylbenzimidazole | 146.0844 |
L-Threonine | 119.05822 | L-Lysine | 146.1055 |
4-Hydroxybenzaldehyde | 122.03676 | L-Glutamic acid | 147.053 |
Nicotinamide | 122.04803 | Methionine | 149.0511 |
Nicotinic acid | 123.03208 | 7-Methyladenine | 149.0701 |
Maltol | 126.03159 | N6-Methyladenine | 149.0702 |
Phloroglucinol | 126.03161 | 4'-Methoxyacetophenone | 150.068 |
Dihydrothymine | 128.05851 | Guanine | 151.0494 |
L-Pyroglutamic acid | 129.04262 | 2-Phenylglycine | 151.0634 |
Isoquinoline | 129.05782 | L-(-)-Arabitol | 152.0684 |
Pipecolic acid | 129.07896 | D-(+)-Camphor | 152.1201 |
Skatole | 131.07352 | 3-Hydroxyanthranilic acid | 153.0426 |
Leucine | 131.09463 | L-Histidine | 155.0695 |
L-Norleucine | 131.09467 | Imidazolelactic acid | 156.0535 |
Ornithine | 132.08991 | 3-(2-Hydroxyethyl)indole | 161.084 |
L-Aspartic acid | 133.03738 | DL-Carnitine | 161.1051 |
Adenine | 135.0545 | 4-Hydroxycoumarin | 162.0316 |
Hypoxanthine | 136.03854 | 7-Hydroxycoumarine | 162.0317 |
3-Methoxybenzaldehyde | 136.05245 | 4-Methoxycinnamaldehyde | 162.068 |
Trigonelline | 137.04761 | Methyl cinnamate | 162.068 |
3,4-Dihydroxybenzaldehyde | 138.03166 | 4-Coumaric acid | 164.0473 |
7-Methylguanine | 165.0651 | Indole-3-pyruvic acid | 203.0581 |
L-Phenylalanine | 165.0789 | Neocuproine | 208.1 |
Uric acid | 168.0283 | Valylproline | 214.1318 |
Norharman | 168.0687 | Kinetin | 215.0808 |
Pyridoxine | 169.0738 | N-α-L-Acetyl-arginine | 216.1222 |
1-Methylhistidine | 169.0851 | (+)-ar-Turmerone | 216.1515 |
Glycylproline | 172.0847 | Nootkatone | 218.1671 |
Tryptoline | 172.1001 | Sinapinic acid | 224.0684 |
DL-Arginine | 174.1117 | Prolylleucine | 228.1474 |
N-Methyltryptamine | 174.1157 | Radicinin | 236.0681 |
Indole-3-acetic acid | 175.0633 | Cytidine | 243.0854 |
Cotinine | 176.0949 | Coenzyme Q1 | 250.1217 |
Esculetin | 178.0265 | 2'-Deoxyadenosine | 251.1018 |
Kanosamine | 179.0792 | Palmitoleic acid | 254.2244 |
Caffeic acid | 180.0422 | Hexadecanamide | 255.256 |
L-Tyrosine | 181.0739 | Indirubin | 262.0742 |
L-threo-3-Phenylserine | 181.0739 | Thiamine | 264.1044 |
L-Iditol | 182.079 | Adenosine | 267.0966 |
4'-(Imidazol-1-yl)acetophenone | 186.0792 | Inosine | 268.0806 |
Indole-3-acrylic acid | 187.0633 | Galangin | 270.0526 |
Glycyl-L-leucine | 188.1161 | Υ-L-Glutamyl-L-glutamic acid | 276.0957 |
N6,N6,N6-Trimethyl-L-lysine | 188.1524 | L-Saccharopine | 276.132 |
Kynurenic acid | 189.0425 | α-Aspartylphenylalanine | 280.1058 |
Methyl indole-3-acetate | 189.079 | 2'-O-Methyladenosine | 281.1123 |
5-Hydroxyindole-3-acetic acid | 191.0583 | Oleamide | 281.2717 |
Scopoletin | 192.0422 | Argininosuccinic acid | 290.1223 |
trans-3-Hydroxycotinine | 192.09 | 9-Oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid | 294.2193 |
Isoferulic acid | 194.0578 | 5'-S-Methyl-5'-thioadenosine | 297.0895 |
Ferulic acid | 194.0579 | N2-Methylguanosine | 297.1073 |
N3,N4-Dimethyl-L-arginine | 202.1429 | Diosmetin | 300.0633 |
Isotretinoin | 300.2088 | N-Acetylsphingosine | 341.2929 |
L-Glutathione (reduced) | 307.0836 | α-Lactose | 342.116 |
Isorhamnetin | 316.0581 | Adenosine 5'-monophosphate | 347.0629 |
2-Amino-1,3,4-octadecanetriol | 317.2929 | S-Adenosylhomocysteine | 384.1215 |
15-Deoxy-Δ12,14-prostaglandin A1 | 318.2194 | Nobiletin | 402.131 |
Adenosine 3'5'-cyclic monophosphate | 329.0524 | Kuromanin | 448.1003 |
Aflatoxin G2 | 330.0739 | Glycerophospho-N-palmitoyl ethanolamine | 453.2853 |
Prostaglandin B1 | 336.2299 | Scutellarin | 462.0797 |
18-β-Glycyrrhetinic acid | 470.3394 | D-Raffinose | 504.1687 |
실시예 3. FT-IR 기반 대사체 분석
3-1. 참깨 시료의 전처리 방법 확립
본 발명자들은 액체 질소(Liquid nitrogen) 사용유무에 따른 스펙트럼 상의 차이를 확인하고자, 참깨를 액체 질소에 10초간 담근 후 바로 꺼내어 분쇄기에 넣고 20초간 분쇄한 후 동결건조하였고, 비교 대조군인 참깨는 아무 처리를 하지 않고 분쇄기에서 20초간 분쇄한 후 동결건조하여 사용하였다.
3-2. FT-IR 가동조건 확립
본 발명자들은 ATR 모드를 적용함으로써 투과/반사법에 비해 샘플두께 제한이 없어 샘플 전처리를 간소화하였으며, 견고한 재질인 diamond plate를 사용함으로써 분석의 재현성을 높였다. Bruker사 기기(TENSOR27)를 활용하였고 scan수 32, 측정범위 400-4,000 cm-1, resolution 4 cm-1을 적용함. 샘플 분석 전 background scan을 측정하여 H2O와 CO2 피크를 제거함으로써 백그라운드 노이즈를 감소시키고 시그널에 대한 비율 값을 증가시켰다.
3-3. 대사체 동정 방법 확립
본 발명자들은 대사체 동정 방법을 확립하기 위해 OMNIC 소프트웨어 및 참고문헌을 이용하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 참깨 시료의 전처리 시 액체질소 사용 유무에 따른 스펙트럼 상 나타나는 피크의 종류와 크기의 차이는 거의 없었으나, 참깨 내 존재하는 효소 작용 억제를 위해 액체 질소를 사용하여 분쇄한 샘플을 본 실험에 사용하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 참깨 시료에서 나타난 주요 대사체 작용기는 에스테르류(esters), 아류민(amines), 카르복실산류(carboxylic acids), 방향족 화합물류(aromatics), 페놀류(phenols) 등으로 나타났다. 작용기별로 ① C-H stretching region (3,050-2,800 cm-1), ② C=O stretching region (1,800-1,600 cm-1), ③ C-O-C stretching and C-H bending region (1,600-650 cm-1)으로 구별이 가능했다.
3-4. 데이터 전처리 및 다변량 통계분석
본 발명자들은 다양한 정규화(normalization) 방법(area, min-max, amide, vector 1차, vector 2차)별 전처리 데이터를 SIMCA P+, Metaboanalyst를 이용하여 다변량 통계 분석을 실시하였다. 다변량 통계 분석 방법 중 하나인 PCA, PLS-DA, OPLS-DA를 이용하여 국내산과 중국산 참깨 시료의 분리 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, FT-IR spectrum의 전체 영역 (4,000~400 cm-1)을 사용하였을 때 각 normalization방법별로 PCA와 PLS-DA분석 시 모델의 적합성과 예측력 지표, component value, score plot상 observations의 분리도 및 validation parameter의 부적합으로 인해 국내산과 중국산 참깨 시료의 분리가 불충분함을 확인하였다.
이에 따라, 작용기 별 영역을 나누어 분석을 진행하였고, 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 1번 작용기 영역 (C-H stretching region, 3,050-2,800 cm-1)에서 PCA, PLS-DA 및 OPLS-DA분석 시 score plot상 분포도, PCA모델의 R2X, Q2X값 (0.891, 0.840), PLS-DA모델의 R2Y, Q2Y값 (0.708, 0.614) OPLS-DA모델의 R2Y, Q2Y값 (0.759, 0.641), 및 permutation test 적합으로 인해 국내산과 중국산의 분리가 가능함을 확인하였다.
실시예 4. NMR 기반 대사체 분석
4-1. NMR 기반 참깨 유래 대사체 분석을 위한 시료 추출법 및 분석법의 최적화
본 발명자들은 NMR 기반 참깨 유래 대사체 분석을 위한 시료 추출법 및 분석법을 최적화하였다.
간략하게, NMR을 이용한 참깨의 대사체 분석을 위한 전처리 방법으로 참깨를 액체 질소에 10초간 담근 후 바로 꺼내어 분쇄기에 넣고 20초간 분쇄한 후 동결건조하여 사용하였다. 참깨의 수용성 대사체 성분분석을 위해 메탄올, 물을 용매로 이용하여 수용성 성분을 단독추출하는 방법과 메탄올, 클로로포름, 물을 용매로 이용하여 수용성과 지용성 성분을 혼합추출하는 Bligh & Dyer 분석법을 사용하여 수용성 대사체 성분의 검출도를 비교하였다.
단독추출법은 동결건조된 참깨 0.1 g에 methanol-d (0.05% 3-(tetramethylsilyl)-propionic-2,2,3,3-d4 acid sodium salt (TSP))와 D2O를 4:1의 비율로 넣은 후 1분간 vortexing하고, 10분간 sonication한 후 원심분리하여 상등액을 0.45 μm PTFE syringe filter로 여과하여 여과액 600 μL를 5 mm NMR tube에 옮겼다.
Bligh & Dyer 분석법은 동결건조된 참깨 0.10g에 cold mixture solvent (cold mixture (CHCl3:MeOH:H2O=2:2:1) 1.8 mL를 넣고 1분간 vortexing 하였다. 4℃ 에서 1시간 반응 후 원심분리하여 상층액(hyrosoluble phase)과 하층액(organic phase)을 각각 따로 채취하고 추출액을 0.45 μm PTFE syringe filter로 여과하였다. 여과액을 300~500 μL 씩 질소가스로 건조시키고, 건조가 완료되면 D2O, CDCl3를 각각 500 μL 넣고 재용해 한 후 500 μL를 NMR tube에 옮겼다. NMR 측정 시 signal이 이동하는 것을 방지하기 위하여 D2O에 인산칼륨을 첨가한 buffer 용액을 만들어주고, 1 N NaOD를 첨가하여 D2O의 pH를 6으로 조정하였다. MeOD용매 안에 함유된 0.05% 3-(tetramethylsilyl)-propionic-2,2,3,3-d4 acid sodium salt (TSP)는 내부표준물질로서 NMR shift의 교정 기준(calibration reference)으로서 사용하였다.
4-2. NMR 가동조건 확립
본 발명자들은 펄스 시퀀스를 적용함으로서 참깨시료 내에 포함된 물이 불필요한 피크를 형성시켜 다른 대사체의 피크 감도를 낮추는 것을 방지하고 재현성을 높였다. 1D 1H-NMR 가동조건으로 NMR spectometer는 JNM-ECZ 600R (600.17 MHz, Jeol사) 기기를 활용하였다. 참깨 시료 추출물은 298 K (25 ℃)에서 측정하였다. Pulse sequence로서 물 피크를 저하시키는 zqpr presaturation pulse sequence를 이용하였으며, relaxation delay는 5초, 128 스캔수, 9,024.4 Hz의 spectral width를 적용하였다.
4-3. 대사체 동정 방법 확립
본 발명자들은 Chenomx software program 내에 구축되어 있는 대사체 library, HMDB web site 등을 이용하여 각 metabolite들의 정성 분석을 수행하였다. 또한, Mestrenova software program을 이용하여 대사체들의 chemical shift(δ), splitting pattern, integral, 예상 농도 정보 등을 matching 시킴으로써 참깨 시료 내에 함유된 대사체의 정성분석을 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 참깨의 분석법 확립을 위한 예비실험 결과 수용성 성분의 경우, 두 가지 추출법의 스펙트럼의 비교 시 단독 추출 시 피크의 세기가 더 큰 것으로 나타났고 지용성 성분의 경우, 피크 개수와 세기에 큰 차이는 없었다.
또한, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, NMR 기반 단독추출법과 Bligh & Dyer추출법으로 추출한 참깨 내 수용성 대사체 성분 리스트(예비실험 결과)에서, 피크의 세기 차이가 있었던 수용성 대사체 성분의 동정 결과 단독 추출 방법에서는 58개의 수용성 대사체 성분이 검출되었고, Bligh & Dyer 분석법을 사용하였을 때는, 64개의 수용성 대사체 성분이 검출되었다.
따라서, Bligh & Dyer 분석법을 사용하였을 때, 수용성 성분과 지용성 성분을 분리추출하여 artifacts를 최소화함으로써 metabolite의 identification이 더욱 효과적임을 확인할 수 있었다.
이에, 국가별 참깨 대사체를 분석하는 본 실험에서는 Bligh & Dyer 분석법을 사용하였고, 최종적으로 확립한 분석법은 다음과 같다:
동결건조된 참깨 0.10g에 cold mixture solvent (cold mixture (CHCl3:MeOH=1:1) 1.6 mL를 넣고 1분간 볼텍싱하였다. 쉐이커에서 4℃, 1시간동안 추출한 후 원심분리(10,000 Xg, 4℃, 10분)하여 상층액을 채취하고, 물 400 μL를 첨가하여 층을 분리하였다. 상층액 (hydrosoluble phase)을 0.45 μm PTFE 실린지 필터로 여과 시킨 후, 여과액 600 μL를 질소건조하고, 건조가 완료되면 70% 메탄올-d (D2O:MeOD (0.05% 3-(tetramethylsilyl)-propionic-2,2,3,3-d4 acid sodium salt (TSP)), pH 6) 600 μL을 첨가하여 재용해하여 5 mm NMR 튜브에 옮겼다.
상술한 최종 확립한 추출방법을 토대로 한국과 중국산 참깨를 1H NMR (600MHz)을 통해 검출된 대사체 목록을 분석한 결과, 하기 표 6 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 총 28개의 수용성 대사체가 검출되었고, 그 중 아미노산 11 종(Isoleucine, Leucine, Valine, Alanine, Proline, Asparagine, Betaine, Threonine, Tyrosine, Phenylalanine, Tryptophan), 유기산(Oranic acids) 7 종 (Valerate, Acetate, Malate, Succinate, Ascorbate, Gallate, Formate), 탄수화물류(Carbohydrates) 5 종(Glucose, Xylose, Glyerol, Sucrose, Arabinose), 기타 5 종(Butyrate, Choline, Indol-3-acetate, Uridine, Trigonelline)으로 나타났다.
Compounds | Bligh&Dyer (64) | 단독추출 (58) |
Alcohol | Myo-Inositol | Myo-Inositol |
Ethanol | Ethanol | |
Ethylene glycol | Ethylene glycol | |
Amino acids | 2-Aminoadipate | 2-Aminoadipate |
5-Hydroxytryptophan | 5-Hydroxytryptophan | |
Alanine | Alanine | |
Anserine | ND | |
Arginine | Arginine | |
Asparagine | Asparagine | |
Aspartate | Aspartate | |
Betaine | Betaine | |
Cysteine | Cysteine | |
Glutamate | Glutamate | |
Guanidoacetate | Guanidoacetate | |
Homoserine | ND | |
Isoleucine | ND | |
N-Acetylglutamate | N-Acetylglutamate | |
N-Acetylglycine | N-Acetylglycine | |
Phenylalanine | Phenylalanine | |
Proline | Proline | |
Pyroglutamate | Pyroglutamate | |
Serine | ND | |
S-Sulfocysteine | S-Sulfocysteine | |
Threonine | Threonine | |
trans-4-Hydroxy-L-proline | trans-4-Hydroxy-L-proline | |
Tryptophan | Tryptophan | |
Valine | Valine | |
Benzoic aicds | Anthranilate | Anthranilate |
Protocatechuate | Protocatechuate | |
Fatty acids | 2-Hydroxy-3-methylvalerate | 2-Hydroxy-3-methylvalerate |
2-Octenoate | 2-Octenoate | |
3-Hydroxy-3-methylglutarate | 3-Hydroxy-3-methylglutarate | |
Caprylate | Caprylate | |
ND | Isobutyrate | |
Imidazoles | Imidazole | Imidazole |
Urocanate | Urocanate | |
Organic acid | 2-Oxoglutarate | 2-Oxoglutarate |
Acetate | Acetate | |
cis-Aconitate | cis-Aconitate | |
Fumarate | Fumarate | |
Gallate | Gallate | |
Lactate | Lactate | |
Malate | ND | |
O-Phosphoethanolamine | ND | |
Pyruvate | Pyruvate | |
Succinate | ND | |
trans-Aconitate | trans-Aconitate | |
Purines | 1,7-Dimethylxanthine | 1,7-Dimethylxanthine |
Oxypurinol | Oxypurinol | |
Sugars | Fructose | Fructose |
Sucrose | Sucrose | |
ND | Xylitol | |
Fructose | ND | |
Sugar acids | 2-Phosphoglycerate | 2-Phosphoglycerate |
Threonate | Threonate | |
Sugar alcohols | Glycerol | Glycerol |
Glucitol | ND | |
Others | 1,6-Anhydro-β-D-glucose | 1,6-Anhydro-β-D-glucose |
2'-Deoxyadenosine | 2'-Deoxyadenosine | |
3,4-Dihydroxymandelate | 3,4-Dihydroxymandelate | |
Cytosine | Cytosine | |
Epicatechin | ND | |
Ethanolamine | Ethanolamine | |
Mandelate | ND | |
ND | Glucarate | |
ND | Acetone | |
ND | N-Acetylglucosamine | |
ND | Acetoin | |
Nicotinate | ND | |
O-Phosphocholine | O-Phosphocholine | |
Trigonelline | Trigonelline |
NO. | Compound | Chemical shift | Assignment method | Reference |
1 | Valerate | 0.87(t), 1.28-1.32(m), 2.14(t) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 |
2 | Butyrate | 0.88(t), 2.15(t) | 1D | Roverto consonni et al., 2012 |
3 | Isoleucine | 0.94(t), 0.99(d) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 A. I. Olagunju et al., 2013 |
4 | Leucine | 0.96(t) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014Augusta Scuibba et al., 2014 A. I. Olagunju et al., 2013 |
5 | Valine | 0.96(d), 1.02(d), 3.60(d) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014Augusta Scuibba et al., 2014 A. I. Olagunju et al., 2013 |
6 | Threonine | 1.33(d), 3.60(d) | 1D | Hong-Seok Son et al., 2009 Xiangyu Wu et al., 2014 |
7 | Alanine | 1.48(d), 3.79(q) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 A. I. Olagunju et al., 2013 Xiangyu Wu et al., 2014 |
8 | Acetate | 1.90(s) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 |
9 | Proline | 2.01-2.07(m), 2.00-2.07(m), 2.37-2.29(m) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014A. I. Olagunju et al., 2013 |
10 | Malate | 2.38(dd), 2.67(dd) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 Hong-Seok Son et al., 2009 |
11 | Succinate | 2.39(s) | 1D | Augusta Scuibba et al., 2014 Xiangyu Wu et al., 2014 |
12 | Asparagine | 2.92-2.98(m) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014Augusta Scuibba et al., 2014 |
13 | Choline | 3.22(s), 3.48-3.51(m) | 1D | Augusta Scuibba et al., 2014 |
14 | Betaine | 3.24(s), 3.89(s) | 1D | Xiangyu Wu et al., 2014 |
15 | Glucose | 3.38-3.42(m), 3.40-3.44(m), 3.51-3.55(dd), 3.82-3.86(m) |
1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 Hong-Seok Son et al., 2009 |
16 | Xylose | 3.41(t) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 |
17 | Glycerol | 3.51-3.55(m) | 1D | Augusta Scuibba et al., 2014 Hong-Seok Son et al., 2009 |
18 | Indol-3-acetate | 3.64(s) | 1D | Augusta Scuibba et al., 2014 |
19 | Ascorbate | 3.70-3.76(m) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 |
20 | Sucrose | 3.75(t), 3.79-3.84(m), 3.81-3.85(m), 3.82-3.87(m), 4.02(t), 5.40(d) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 |
21 | Arabinose | 3.77(dd), 3.80(dd), 4.00-4.04(m) | 1D | Xiangyu Wu et al., 2014 |
22 | Trigonelline | 4.45(s), 9.11(s) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 |
23 | Uridine | 5.88(d), 5.89(d), 7.84(d) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014Augusta Scuibba et al., 2014 |
24 | Tyrosine | 6.88-6.91(m), 7.15-7.18(m) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 A. I. Olagunju et al., 2013 |
25 | Gallate | 7.03(s) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 |
26 | Phenylalanine | 7.33(d), 7.35-7.40(m) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014Xiangyu Wu et al., 2014 |
27 | Tryptophan | 7.15-7.19(m), 7.32(s),7.53(d), 7.71(d) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 A. I. Olagunju et al., 2013 |
28 | Formate | 8.45(s) | 1D | Pabio Scuibba et al., 2014 Augusta Scuibba et al., 2014 |
4-4. 다변량 통계분석
본 발명자들은 SIMCA P+, Metaboanalyst를 이용하여 다변량 통계 분석을 실시하였다. 다변량 통계 분석 방법으로 PCA, PLS-DA, OPLS-DA를 이용하여 국가별 (한국, 중국), 국가 내 참깨의 분리를 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 한국산과 중국산 참깨 분리 시 총 정규화(total (area) normalization)을 사용하였고, PCA 스코어 plot상에서는 분리가 잘 되지 않았으나, PLS-DA와 OPLS-DA 분석 시에는 분리가 되는 것을 확인하였다.
또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 한국 내에서 지역 분리 시에는 표준 정규화를 사용하였고, PCA, PLS-DA 분석 결과 5개 도(강원도, 경기도, 충청도, 경상도 및 전라도)로 분리되는 것을 확인하였다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 중국 내에서 지역 분리 시에는 표준 정규화를 사용하였고, PCA, PLS-DA 분석 결과 북부 지역(northest region), 중부 지역(middle region), 남부 지역(south region)의 3 지역으로 분리가 되는 것을 확인하였다.
또한, 한국과 중국산 참깨 대사체 분리에 관여하는 주요 바이오마커 탐색을 위해 PLS-DA model에 사용된 조건(Total area normalization, Pareto scaling, 6 components)을 적용하여 VIP value에 따른 최적의 PLS-DA model을 선정하였다.
표 7에 한국과 중국산 참깨의 원산지 판별을 위해 VIP(Variable Importance of Projection)로 얻은 PLS 모델 매개변수(parameter)를 나타내었다.
그 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, VIP cut-off value 0.4로 지정하여 선정된 최종 바이오마커는 valerate, sucrose, arabinose, proline, valine, indol-3-acetate, alanine, xylose, betaine, glucose, choline, tyrosine, asparagine, threonine, succinate, butyrate, malate, ascorbate, acetate, isoleucine, glycerol, leucine, trigonelline 및 tryptophan의 총 24 종으로 나타났다.
또한, HCA(Hierarchical Cluster AnalysisA)를 이용하여 국가별(한국, 중국) 분리를 확인하여 표 8에 한국과 중국산 참깨의 원산지 판별을 위한 바이오 마커 목록을 나타내었다.
그 결과, 하기 도 12에 나타낸 바와 같이, HCA 분석결과에서 한국과 중국 내 참깨가 뚜렷하게 분리됨을 볼 수 있었으나, 한국 내 그리고 중국 내 참깨의 분리는 뚜렷하지 못했다.
VIP cutoff | R 2 Y | Q 2 Y | R 2 Y intercept | Q 2 Y intercept |
Total normalization (Pareto Scaling, 6 components) | ||||
0.2 | 0.915 | 0.821 | 0.335 | -0.702 |
0.3 | 0.915 | 0.822 | 0.293 | -0.722 |
0.4 | 0.917 | 0.825 | 0.273 | -0.803 |
0.5 | 0.916 | 0.821 | 0.211 | -0.801 |
0.7 | 0.903 | 0.813 | 0.221 | -0.792 |
0.8 | 0.875 | 0.776 | 0.235 | -0.798 |
0.9 | 0.885 | 0.795 | 0.179 | -0.833 |
1.0 | 0.784 | 0.624 | 0.109 | -0.78 |
No | Compound | VIP value |
1 | Valerate | 2.017 |
2 | Sucrose | 1.739 |
3 | Arbinose | 1.613 |
4 | Proline | 1.328 |
5 | Valine | 1.274 |
6 | Indol-3-acetate | 1.207 |
7 | Alanine | 1.182 |
8 | Xylose | 1.095 |
9 | Betaine | 1.066 |
10 | Glucose | 1.049 |
11 | Choline | 0.984 |
12 | Tyrosine | 0.931 |
13 | Asparagine | 0.911 |
14 | Threonine | 0.910 |
15 | Succinate | 0.909 |
16 | Butyrate | 0.896 |
17 | Malate | 0.889 |
18 | Ascorbate | 0.845 |
19 | Acetate | 0.753 |
20 | Isoleucine | 0.544 |
21 | Glycerol | 0.520 |
22 | Leucine | 0.472 |
23 | Trigonelline | 0.461 |
24 | Tryptophan | 0.406 |
결론적으로, 본 발명을 통해 선정된 참깨 원산지 판별 대사체 마커들은 신속하고 높은 정확도로 수입산, 특히 중국산 참깨 원산지를 판별할 수 있으며, 향후 국내 참깨 산업 유통체계의 혼란을 막는데 도움을 줄 수 있는 바이오마커 개발의 초석이 될 것으로 사료된다.
Claims (9)
- 한국산 및 수입산 참깨의 원산지별로 발현량에서 차이를 나타내는 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 대사체를 포함하는, 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 수입산은 중국산인 것을 특징으로 하는, 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올 및 아데노신 5'-모노포스페이트의 발현량은 수입산 참깨와 비교하여 한국산에서 증가하는 것을 특징으로 하는, 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 D-라피노즈의 발현량은 한국산 참깨와 비교하여 중국산에서 증가하는 것을 특징으로 하는, 참깨의 원산지 판별용 바이오마커 조성물.
- 제1항의 참깨 원산지 판별용 바이오마커 조성물을 포함하는, 참깨의 원산지 판별용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 참깨의 원산지 판별방법:
(a) 참깨로부터 대사체를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출된 대사체 중 발린(Valine), L-글루타시온(L-Glutathione), 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올(2-Amino-1,3,4-octadecanetriol), 아데노신 5'-모노포스페이트(Adenosine 5'-monophosphate) 및 D-라피노즈(D-Raffinose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 대사체를 액체 크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)로 분석하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 대사체들 간의 발현 수준 차이로 한국산 및 수입산 참깨의 원산지를 판정하는 단계.
- 제6항에 있어서,
상기 수입산은 중국산인 것을 특징으로 하는, 참깨의 원산지 판별방법.
- 제6항에 있어서,
상기 발린, L-글루타시온, 2-아미노-1,3,4-옥타데칸트리올 및 아데노신 5'-모노포스페이트의 발현량은 수입산 참깨와 비교하여 한국산에서 증가하는 것을 특징으로 하는, 참깨의 원산지 판별방법.
- 제6항에 있어서,
상기 D-라피노즈의 발현량은 한국산 참깨와 비교하여 중국산에서 증가하는 것을 특징으로 하는, 참깨의 원산지 판별방법.
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노정해 외., 한국식품과학회지, Vol. 34, No. 6, 2002, pp. 1062-1066. |
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최진영 외., 한국식품과학회지, Vol. 44, No. 5, 2012, pp. 503-525. |
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