KR102181440B1 - Complex of Nanostructure of Self-Assembled Amyloid Conjuated Thioflavin T and Method for Artificial Photosynthesis Using the Same - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a self-assembled amyloid hybrid nanostructure to which thioblavin-T (ThT) is bound, to a method for regenerating co-factors using the hybrid nanostructure, and to an artificial photosynthesis method using the hybrid nanostructure. When using the hybrid nanostructure in which thioblavine-T (ThT) is bound to self-assembled amyloid according to the present invention as a light harvester in an artificial photosynthesis system, regeneration ability of the co-factors is showed by enhancing the photoactivity of ThT molecules, reuse of light condensing materials is allowed, and artificial photosynthesis in a form of the complex is performed by directly binding oxidation-reduction enzyme.

Description

티오블라빈-티(ThT)가 결합된 자기조립형 아밀로이드 하이브리드 나노구조체 및 이를 이용한 인공광합성 방법{Complex of Nanostructure of Self-Assembled Amyloid Conjuated Thioflavin T and Method for Artificial Photosynthesis Using the Same}Complex of Nanostructure of Self-Assembled Amyloid Conjuated Thioflavin T and Method for Artificial Photosynthesis Using the Same}

본 발명은 티오블라빈-티(ThT)가 결합된 자기조립형 아밀로이드 하이브리드 나노구조체 및 이를 이용한 인공광합성 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 티오블라빈-티(ThT)가 결합된 자기조립형 아밀로이드 하이브리드 나노구조체, 상기 하이브리드 나노구조체를 이용한 보조인자의 재생방법 및 상기 하이브리드 나노구조체를 이용한 인공광합성 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a self-assembled amyloid hybrid nanostructure to which thioblavin-T (ThT) is bound, and an artificial photosynthesis method using the same, and in more detail, to a self-assembled amyloid hybrid to which thioblavin-T (ThT) is bound It relates to a nanostructure, a method for regenerating cofactors using the hybrid nanostructure, and an artificial photosynthesis method using the hybrid nanostructure.

자연계의 많은 생물학적 구조가 단백질성 빌딩 블록의 자기 조립을 통해 만들어진다. 예를 들어, 녹색식물의 광시스템에서 염료-단백질 혼성체의 자기조립 어레이는 광합성 반응 센터로의 광유도 전자전달을 위한 효율적인 경로를 제공하는 태양광 수확을 위한 핵심단위를 구성한다(M. R. Wasielewski, Acc. Chem. Res., 42:1910, 2009; P. Jordan et al., Nature, 411: 909, 2001). 광계(photosystem)의 복잡한 계층적 구조는 전자공여체와 전자수용체를 근접하게 하여 표적 발색단(chromophores)으로의 에너지 이동을 촉진시킨다. Many biological structures in nature are created through self-assembly of proteinaceous building blocks. For example, in the photosystem of green plants, a self-assembled array of dye-protein hybrids constitutes a key unit for solar harvesting that provides an efficient path for photoinduced electron transfer to the photosynthetic reaction center (MR Wasielewski, Acc. Chem. Res., 42: 1910, 2009; P. Jordan et al ., Nature, 411: 909, 2001). The complex hierarchical structure of the photosystem brings the electron donor and the electron acceptor closer together, facilitating energy transfer to target chromophores.

자연적 자기조립 과정은 단백질의 화학적 성질을 활용하여 기능성 생체재료를 설계하는데 응용되고 있으나, 맞춤형 인공 나노물질을 생성하기 위한 단백질 자기조립체를 개발하는 것에는 여전히 어려움이 있다. The natural self-assembly process is applied to design functional biomaterials by utilizing the chemical properties of proteins, but it is still difficult to develop a protein self-assembly to create custom artificial nanomaterials.

아밀로이드 생성 펩타이드와 단백질은 아밀로이드의 자기조립 과정에서 나노 크기의 정밀도로 위치하는 폴리펩티드 분자로 구성된 고도로 배열된 나노구조를 생성하기 때문에 유망한 빌딩블록으로 주목을 받고 있다(T. P. J. Knowles 및 R. Mezzenga, Adv. Mater., 28:6546, 2016). 아밀로이드는 전형적으로 섬유축에 직각을 이루는 β- 가닥으로 구성된 나노섬유 형태를 나타내며 단백질성 전구물질 (예: 인슐린, 베타-락토글로불린, 베타-아밀로이드, α-시누클린, 리소자임 등)의 자기 조립을 통해 쉽게 형성될 수 있다.Amyloid-producing peptides and proteins are attracting attention as promising building blocks because they generate highly arranged nanostructures composed of polypeptide molecules positioned with nano-sized precision in the self-assembly process of amyloid (TPJ Knowles and R. Mezzenga, Adv. Mater., 28:6546, 2016). Amyloid typically represents a nanofibrous form consisting of β-strands perpendicular to the fiber axis, and self-assembly of protein precursors (e.g. insulin, beta-lactoglobulin, beta-amyloid, α-synuclein, lysozyme, etc.) It can be easily formed through.

β- 시트가 풍부한 아밀로이드 구조의 네트워크는 분자간 수소 결합, 이온 결합 및 아미노산 측쇄 사이의 방향족 π-π 상호 작용에 의하여 고온 및 극한 pH와 같은 가혹한 조건에서도 높은 안정성을 나타낸다(S. Y. Cho et al., Nat. Commun.,6: 7145, 2015; T. Scheibel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4527, 2003; S. L. Shammas et al., Biophys. J., 100:2783, 2011). 이러한 특징으로 인해 아밀로이드 형성 단백질은 바이오센서, 광전지 플랫폼, 인공뼈, 광전자 공학, 조직 스캐폴드 제조에 유용한 빌딩 블록으로 사용된다. 예를 들어, 아밀로이드 나노섬유는 triplet exciton confinement를 향상시킨 인광성 이리듐 복합체와의 통합을 통해 유기 발광 다이오드 개발을 위한 골격 재료로 사용된다(A. Rizzo et al., Nano Lett. 10: 2225, 2010). 아밀로이드 나노섬유는 또한 전자 공여체-전자수용체 도메인의 상호간 침투를 허용하여 광전지 성능을 향상시킨다(S. Barrau et al., Appl. Phys. Lett.,93:023307, 2008).The β-sheet-rich amyloid-structured network exhibits high stability even under severe conditions such as high temperature and extreme pH due to intermolecular hydrogen bonds, ionic bonds, and aromatic π-π interactions between amino acid side chains (SY Cho et al ., Nat . Commun., 6: 7145, 2015; T. Scheibel et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4527, 2003; SL Shammas et al ., Biophys. J., 100:2783, 2011) . Due to these characteristics, amyloid-forming proteins are used as useful building blocks for biosensors, photovoltaic platforms, artificial bones, optoelectronics, and tissue scaffold manufacturing. For example, amyloid nanofibers are used as a framework material for the development of organic light-emitting diodes through integration with phosphorescent iridium complexes with improved triplet exciton confinement (A. Rizzo et al ., Nano Lett. 10: 2225, 2010 ). Amyloid nanofibers also allow for the mutual penetration of electron donor-electron acceptor domains to improve photovoltaic performance (S. Barrau et al ., Appl. Phys. Lett., 93:023307, 2008).

또한, 아밀로이드 나노섬유를 구성하는 아미노산은 아밀로이드 피브릴 구조 골격 내에서 융합 단백질의 결합을 통해 효소와 융합될 수 있으며, 이러한 특성 때문에 아밀로이드 나노섬유는 나노스케일 스캐폴드로서 효소 고정화에 적합하다.In addition, amino acids constituting amyloid nanofibers can be fused with enzymes through binding of fusion proteins within the amyloid fibril structure skeleton, and because of this property, amyloid nanofibers are suitable for enzyme immobilization as a nanoscale scaffold.

이에, 본 발명자들은 자연계의 광합성을 모방한 인공광합성 시스템에 있어서, 가시광선에 의한 NADH 재생과 산화환원효소에 의한 합성을 위한 광 수확 스캐폴드를 개발하고자 예의 노력한 결과, 자기조립형 아밀로이드 나노구조체에 티오플라빈-티(thioflavin T, ThT)를 접합시켜 집광재(light harvester)로 사용하는 경우, 광반응에 의하여 보조인자인 NADH를 효율적으로 재생하고, 산화환원효소에 의한 기질의 생전환을 유도할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop a light harvesting scaffold for NADH regeneration by visible light and synthesis by oxidoreductase in an artificial photosynthesis system that mimics natural photosynthesis, and as a result of self-assembled amyloid nanostructures. When using as a light harvester by conjugating thioflavin T (ThT), it is possible to efficiently regenerate NADH, a cofactor by photoreaction, and induce bioconversion of substrates by oxidoreductase. After confirming what can be done, the present invention was completed.

본 발명의 목적은 자기조립형 아밀로이드와 염료가 결합된 하이브리드 나노구조체를 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a hybrid nanostructure in which a self-assembled amyloid and a dye are combined.

본 발명의 다른 목적은 자기조립형 아밀로이드와 염료가 결합된 하이브리드 나노구조체에 산화환원효소가 결합된 인공광합성용 복합체를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a complex for artificial photosynthesis in which an oxidoreductase is bonded to a hybrid nanostructure in which a self-assembled amyloid and a dye are bonded.

본 발명의 또다른 목적은 상기 하이브리드 나노구조체를 함유하는 보조인자 재생용 조성물을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a composition for regeneration of cofactors containing the hybrid nanostructure.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이브리드 나노구조체를 이용한 보조인자의 재생방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for regenerating cofactors using the hybrid nanostructure.

본 발명의 또다른 목적은 상기 하이브리드 나노구조체 또는 인공광합성용 복합체를 함유하는 인공광합성용 조성물을 제공하는데 있다. Another object of the present invention is to provide a composition for artificial photosynthesis containing the hybrid nanostructure or a composite for artificial photosynthesis.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 하이브리드 나노구조체 또는 상기 인공광합성용 복합체를 이용한 인공광합성 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide an artificial photosynthesis method using the hybrid nanostructure or the artificial photosynthesis complex.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자기조립형 아밀로이드에 티오블라빈-티(ThT)가 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a hybrid nanostructure in which thioblavin-T (ThT) is bonded to self-assembled amyloid.

본 발명은 또한, 상기 하이브리드 나노구조체에 산화환원효소가 결합되어 있는 인공광합성용 복합체를 제공한다. The present invention also provides a complex for artificial photosynthesis in which an oxidoreductase is bound to the hybrid nanostructure.

본 발명은 또한, (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor) 및 (ⅲ) 집광재(light harvester)로서 상기 하이브리드 나노구조체를 함유하는 보조인자의 재생용 조성물을 제공한다.The present invention also includes (i) an oxidation-type cofactor selected from the group consisting of NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) an electron donor and (iii) a light harvester. It provides a composition for regeneration of cofactors containing the hybrid nanostructure.

본 발명은 또한, 상기 보조인자의 재생용 조성물에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 보조인자의 광학적 재생방법을 제공한다.The present invention also provides a method for optically reproducing cofactors comprising irradiating light to the composition for reproducing the cofactors.

본 발명은 또한, (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (ⅲ) 집광재(light harvester)로서 상기 하이브리드 나노구조체, (iv) 산화환원효소 및 (v) 산화환원효소의 기질을 함유하는 인공광합성용 조성물을 제공한다.The present invention also includes (i) an oxidation-type cofactor selected from the group consisting of NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) an electron donor, (iii) a light harvester. It provides a composition for artificial photosynthesis containing a substrate of the hybrid nanostructure, (iv) oxidoreductase and (v) oxidoreductase.

본 발명은 또한, (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (ⅲ) 상기 인공광합성용 복합체 및 (iv) 산화환원효소의 기질을 함유하는 인공광합성용 조성물을 제공한다.The present invention also provides an oxidation-type cofactor selected from the group consisting of (i) NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) an electron donor, (iii) the artificial photosynthesis complex and ( iv) It provides a composition for artificial photosynthesis containing a substrate of an oxidoreductase.

본 발명은 또한, (a) 상기 인공광합성 조성물에, 빛을 조사하여 보조인자를 광학적으로 재생시키는 단계; 및 (b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소의 기질의 산화환원 반응에 사용하여 유용물질을 제조하는 단계를 포함하는 인공광합성 방법을 제공한다.The present invention also includes the steps of: (a) optically regenerating a cofactor by irradiating light to the artificial photosynthetic composition; And (b) using the regenerated cofactor for a redox reaction of a substrate of an oxidoreductase to prepare a useful substance.

본 발명에 따른 자기조립형 아밀로이드에 티오블라빈-티(ThT)가 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체를 인공광합성계에서 집광재(light harvester)로 사용할 경우, ThT 분자의 광활성을 높여 보조인자 재생능을 나타내고, 집광재의 재사용이 가능하며, 산환환훤효소를 직접 결합시켜 복합체 형태로 인공광합성을 수행할 수 있는 장점이 있다. In the case of using a hybrid nanostructure in which thioblavine-T (ThT) is bound to the self-assembled amyloid according to the present invention as a light harvester in an artificial photosynthesis system, the photoactivity of the ThT molecule is increased to show cofactor regeneration ability. , It is possible to reuse the condensing material, and it has the advantage of performing artificial photosynthesis in the form of a complex by directly binding the acid-reducing enzyme.

도 1은 아밀로이드 나노섬유로 구성된 광수확(light -harvesting) 및 생촉매 모듈의 개략도이다. 아밀로이드 나노섬유의 교차 β-시트 구조에 결합된 ThT 분자는 전자공여자 (즉, TEOA)로부터 전자매개체(즉, M)와 니코틴아미드 보조인자 (즉, NAD +)로 광유도된 전자를 전달한다. 이를 통해 생성된 NADH는 가시광선 조명 하에서 산화환원 효소반응을 일으킨다.
도 2의 a)는 인슐린 나노섬유의 ex situ AFM 이미지를 나타낸 것이다(스케일 막대:1 μm). b) ThT가 인슐린 나노 섬유의 CD 스펙트럼에 미치는 영향을 나타낸 것이고, c)는 인슐린 나노섬유의 유무에 따른 ThT의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다 (excitation wavelength : 420 nm).
도 3은 인슐린 단량체(2 mg / ml)와 나노섬유의 CD 스펙트럼을 나타낸 것으로, 인슐린 나노 섬유의 CD 스펙트럼은 베타-시트 2차 구조의 대표 피크를 보여주고 있으며, 대조적으로, 인슐린 단량체는 랜덤 코일 구조의 CD 스펙트럼을 나타내고 있다.
도 4는 인슐린 나노섬유(a)와 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유(b)를 나타낸 것이다.
도 5는 인슐린 나노섬유 (2mg/ml)의 유무에 따른 ThT(40mM)의 흡광도스펙트럼을 나타낸 것으로, 두 경우 모두, ThT는 약 420nm에서 피크를 갖는 유사한 흡수 스펙트럼을 나타냈다.
도 6의 a)는 3, 6, 12 및 24 시간 동안 인슐린 단량체를 배양하여 얻은 인슐린 나노섬유의 ex situ AFM 이미지를 나타낸 것이고, b)는 인슐린 나노섬유에 적용된 ThT의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 인슐린 단량체 용액과 나노섬유의 용액에서 ThT의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다(여기 파장 : 420 nm). ThT의 강한 형광은 인슐린 나노섬유 용액에서관찰되었지만 인슐린 단량체 용액에서는 무시할만한 반응이 확인되었다.
도 8은 인산버퍼 (100 mM, pH 7.5)의 유리 카본 디스크 전극에 인슐린 나노 섬유(2 mg / ml)의 유무에 따른 ThT (40μM)의 양극 광전류 반응을 나타낸 것이다.
도 9의 a)는 ThT의 농도를 변화시킨 인슐린 나노섬유 용액 (2 mg/mL)에서 ThT 형광의 변화를 나타낸 것이고(여기 파장 : 375 nm), b)는 서로 다른 농도의 ThT를 함유한 인슐린 나노섬유 용액(2 mg/mL)에서 시간 경과에 따른- ThT의 형광감쇄를 나타낸 것이다.
도 10은 인슐린 나노섬유에 조립 정렬된 ThT 분자 사이의 여기 에너지 전달 (EET)에 대한 설명을 나타낸 것이다. 유리된 형태의 단일 여기 ThT 분자는 분해가일어나는 이완 경로만 진행되고, 인슐린 나노섬유에 결합된 ThT 분자간에는 효과적인 EET(여기 에너지 저달)가 발생하여 분해를 억제하고 새로운 이완 경로가 유도된다.
도 11은 인산완충액(100 mM, pH 7.5)에서 ThT (1 mM)의 순환 전압 전류그래프를 나타낸 것으로, 스캔 속도는 50mVs-1이었고, ThT의 음극 피크는 약 -0.75V (vs Ag/AgCl) 및 -1.1V에서 각각 관찰되었다.
도 12의 a)는 서로 다른 농도의 M 하에서 유리 탄소 전극상의 ThT- 인슐린 나노섬유의 순환 전압 전류 그래프를 나타낸 것이고(스캔 속도 : 50mVs-1), b)는 서로 다른 농도의 M에서 인슐린 나노섬유 (2 mg/mL)의 존재 하에 ThT(40 X 10-6 M)의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이며(420 nm에서 여기), c)는 서로 다른 농도의 NAD +에서 M (500 X 10-6 M)의 존재 하에 유리 카본 전극상의 ThT- 인슐린 나노섬유의 선형 스윕 전압 전류 그래프를 나타낸 것이고, d)는 암 조건 또는 광 조건에서 ThT (100 X 10-6 M), 인슐린 나노섬유 (5mg/mL) 및 ThT-인슐린 나노섬유 (5mg/mL)를 함유하는 용액에 의한 NADH 재생 수율의 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 다양한 농도의 TEOA에서 인슐린 나노섬유(2 mg/ml)의 존재 하에 ThT (40μM)의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다(420 nm에서 여기). 형광 ??칭은 TEOA의 산화에 의해 나온 전자가 ThT에서 가장 높게 점유된 분자궤도 수준으로 이동하여 ThT가 환원되는 것에 기인한다.
도 14는 유리질 탄소 전극에 ThT-인슐린 나노섬유의 순환 전압-전류도에 미치는 M (500μM)과 NAD+ (500μM)의 영향을 나타낸 것이다(스캔 속도 : 50 mV/s)
도 15는 2시간 동안 가시광선 하에서 인슐린 나노섬유의 존재 하에 각 반응 성분(즉, ThT, TEOA 및 M)을 결실시켜 수행된 NADH 재생에 대한 일련의 대조군 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 광 유도 NADH 재생을 위한 ThT-인슐린 나노섬유의 재사용성을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 실험을 위해 2시간 동안 NADH 재생 후, 30분 동안 15,000rpm에서 원심분리하여 반응 매체로부터 ThT-인슐린 나노섬유를 분리하고 재사용하였다.
도 17의 a)는 본래의 인슐린 나노섬유 및 GDH- 접합 인슐린 나노섬유에 의한 NADH 소비 프로파일을 나타낸 것이고, b)는 암조건 또는 명조건에서 자유 ThT 분자, GDH- 인슐린 나노섬유 및 ThT-GDH-인슐린 나노섬유에 의한 NAD +로부터의 NADH 재생을 통해 α- 케토글루타레이트(5X10-3M)의 L-글루타메이트로의 광효소적 환원 결과를 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram of a light-harvesting and biocatalytic module composed of amyloid nanofibers. ThT molecules bound to the cross β-sheet structure of amyloid nanofibers transfer photo-induced electrons from an electron donor (i.e., TEOA) to an electron mediator (i.e., M) and a nicotinamide cofactor (i.e., NAD +). NADH generated through this causes a redox enzyme reaction under visible light.
2A shows an ex situ AFM image of insulin nanofibers (scale bar: 1 μm). b) The effect of ThT on the CD spectrum of insulin nanofibers is shown, and c) is the fluorescence spectrum of ThT according to the presence or absence of insulin nanofibers (excitation wavelength: 420 nm).
Figure 3 shows the CD spectrum of the insulin monomer (2 mg / ml) and the nanofiber, the CD spectrum of the insulin nanofiber shows a representative peak of the beta-sheet secondary structure, in contrast, the insulin monomer is a random coil The CD spectrum of the structure is shown.
Figure 4 shows the insulin nanofibers (a) and ThT-insulin hybrid nanofibers (b).
5 shows the absorbance spectrum of ThT (40mM) with or without insulin nanofibers (2mg/ml). In both cases, ThT showed a similar absorption spectrum with a peak at about 420nm.
6A shows ex situ AFM images of insulin nanofibers obtained by culturing insulin monomers for 3, 6, 12 and 24 hours, and b) shows the fluorescence spectrum of ThT applied to insulin nanofibers.
7 shows the fluorescence spectrum of ThT in the solution of insulin monomer solution and nanofibers (excitation wavelength: 420 nm). Strong fluorescence of ThT was observed in the insulin nanofiber solution, but a negligible response was confirmed in the insulin monomer solution.
8 shows the anode photocurrent response of ThT (40 μM) according to the presence or absence of insulin nanofibers (2 mg / ml) in a glass carbon disk electrode of a phosphate buffer (100 mM, pH 7.5).
9a) shows the change in ThT fluorescence in the insulin nanofiber solution (2 mg/mL) in which the concentration of ThT was changed (excitation wavelength: 375 nm), b) is the insulin containing different concentrations of ThT. It shows the fluorescence attenuation of ThT over time in nanofiber solution (2 mg/mL).
10 shows an explanation of excitation energy transfer (EET) between ThT molecules assembled and aligned in insulin nanofibers. A single excited ThT molecule in a free form proceeds only the relaxation pathway in which decomposition occurs, and effective EET (excitation energy low) occurs between ThT molecules bound to insulin nanofibers to inhibit decomposition and induce a new relaxation pathway.
FIG. 11 shows a circulating voltage current graph of ThT (1 mM) in a phosphate buffer (100 mM, pH 7.5), the scan rate was 50 mVs -1 , and the negative peak of ThT was about -0.75V (vs Ag/AgCl) And -1.1V, respectively.
12A shows a graph of circulating voltage current of ThT-insulin nanofibers on a glass carbon electrode under different concentrations of M (scan speed: 50mVs-1), b) is insulin nanofibers at different concentrations of M It shows the fluorescence spectrum of ThT (40 X 10 -6 M) in the presence of (2 mg/mL) (excitation at 420 nm), c) is M at different concentrations of NAD + (500 X 10 -6 M) It shows the linear sweep voltage current graph of ThT-insulin nanofibers on the glass carbon electrode in the presence of, d) is ThT (100 X 10 -6 M), insulin nanofibers (5 mg/mL) and It shows the change of the NADH regeneration yield by the solution containing ThT-insulin nanofibers (5mg/mL).
13 shows the fluorescence spectrum of ThT (40 μM) in the presence of insulin nanofibers (2 mg/ml) in various concentrations of TEOA (excitation at 420 nm). The fluorescence quenching is due to the reduction of ThT by moving electrons released by the oxidation of TEOA to the level of the highest occupied molecular orbit in ThT.
14 shows the effects of M (500 μM) and NAD+ (500 μM) on the circulating voltage-current degree of ThT-insulin nanofibers on a glassy carbon electrode (scan speed: 50 mV/s)
15 shows the results of a series of control experiments for NADH regeneration performed by deleting each reaction component (ie, ThT, TEOA and M) in the presence of insulin nanofibers under visible light for 2 hours.
16 shows the results of confirming the reusability of ThT-insulin nanofibers for light-induced NADH regeneration. For the experiment, after regeneration of NADH for 2 hours, ThT-insulin nanofibers were separated from the reaction medium by centrifugation at 15,000 rpm for 30 minutes and reused.
Figure 17a) shows the NADH consumption profile by the original insulin nanofibers and GDH-conjugated insulin nanofibers, b) is a free ThT molecule, GDH-insulin nanofibers and ThT-GDH- in dark or light conditions. It shows the result of photoenzymatic reduction of α-ketoglutarate (5X10 -3 M) to L-glutamate through NADH regeneration from NAD + by insulin nanofibers.

아밀로이드 생성 펩타이드는 독특한 물리 화학적 특성과 높은 안정성을 나타내는 교차 β- 시트가 풍부한 네트워크로 구성된 고도로 배열된 나노구조로 자가 조립될 수 있다. 본 발명에서는 빛을 수확하는 능력을 가지는 집광재(light harvestr)를 제작하기 위하여, 자기조립형 아밀로이드의 빌딩블록으로서 인슐린을 사용하고 아밀로이드-특이적 감광제로서 티오플라빈-티(thioflavin T, ThT)를 사용하였다. 자기조립된 아밀로이드 지지체는 표면상에 고밀도로 ThT를 수용하고 정렬시킬 수 있어, 자연적 광계와 유사한 방식으로 발색단으로부터 촉매 유닛으로의 효율적인 에너지 전달이 가능하였다. Amyloid-producing peptides can self-assemble into highly ordered nanostructures composed of networks rich in cross-β-sheets that exhibit unique physicochemical properties and high stability. In the present invention, in order to manufacture a light harvester having the ability to harvest light, insulin is used as a building block of self-assembled amyloid and thioflavin T, ThT as an amyloid-specific photosensitizer. Was used. The self-assembled amyloid support can receive and align ThT at a high density on the surface, allowing efficient energy transfer from the chromophore to the catalytic unit in a manner similar to that of a natural photosystem.

본 발명에서 자기조립형 아밀로이드로 사용한 인슐린 나노섬유는 중심 C - C 결합 주위의 비 방사성 구조적 이완을 억제하고 β-시트가 풍부한 아밀로이드 구조에 결합된 ThT 분자사이의 거리를 좁힘으로써 ThT의 광활성을 유의적으로 향상시켰다. 본 발명에서는 ThT-아밀로이드 하이브리드 나노구조가 빛을 수확하는 아밀로이드 모듈 (니코틴아미드 보조인자재생)과 산화환원 생촉매 모듈 (효소 환원용)을 통합함으로써 생촉매를 이용한 광화학적 변환에 적합하다는 것을 확인하였다. Insulin nanofibers used as self-assembled amyloid in the present invention inhibit the non-radioactive structural relaxation around the central C-C bond and reduce the distance between ThT molecules bound to the β-sheet-rich amyloid structure, thereby indicating the photoactivity of ThT. Improved as an enemy. In the present invention, it was confirmed that the ThT-amyloid hybrid nanostructure was suitable for photochemical conversion using a biocatalyst by integrating an amyloid module for harvesting light (nicotinamide cofactor regeneration) and a redox biocatalyst module (for enzyme reduction). .

따라서, 본 발명에서는 자연광 시스템을 모방하기 위해 빛에 반응하는 염료와 혼성화되어 있는 인슐린 기반 아밀로이드 나노섬유를 합성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 아밀로이드 염색에 광범위하게 사용되는 벤조티아졸 염료인 티오플라빈-티(thioflavin T, ThT)와 산화환원 효소를 자기조립 나노섬유에 도입하였다. ThT는 β-시트가 풍부한 아밀로이드 구조에 높은 결합 친화도를 나타내며 아밀로이드에 강한 형광을 방출하였다. Therefore, in the present invention, in order to mimic the natural light system, insulin-based amyloid nanofibers hybridized with a dye reacting to light were synthesized. As shown in FIG. 1, thioflavin T (ThT), a benzothiazole dye widely used for amyloid dyeing, and redox enzymes were introduced into self-assembled nanofibers. ThT exhibits high binding affinity to the β-sheet-rich amyloid structure and emits strong fluorescence to amyloid.

본 발명자들은 표면에 고밀도로 ThT를 수용하고 정렬시키는 자체 조립형 아밀로이드 지지체의 능력이 발색단에서 촉매 단위로의 효율적인 에너지 이동을 가능하게하고, 자연광 시스템과 비슷한 방식으로 NADH(nicotinamide adenine dinucleotide cofactor)의 환원형을 재생시킬 수 있는 것을 확인하였다. The present inventors believe that the ability of the self-assembled amyloid support to receive and align ThT at high density on the surface enables efficient energy transfer from the chromophore to the catalytic unit, and reduction of NADH (nicotinamide adenine dinucleotide cofactor) in a manner similar to the natural light system. It was confirmed that the mold could be regenerated.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 티오블라빈-티(ThT)가 결합된 자기조립형 아밀로이드 하이브리드 나노구조체에 관한 것이다.Accordingly, in one aspect, the present invention relates to a self-assembled amyloid hybrid nanostructure to which thioblavin-T (ThT) is bonded.

본 발명에 있어서, 상기 자기조립형 아밀로이드는 자기조립형 인슐린 나노섬유, 베타-락토글로불린 나노섬유, 베타-아밀로이드 나노섬유, α-시누클린 나노섬유, 리소자임 나노섬유, CsgA 단백질(major curlin subunit precursor), FapC 단백질, Silkmoth chorion 단백질, Sup35 단백질, Ure2p 단백질, Pmel17 단백질, Mfp/C.Coli curli, Mouse laminin-RGD, TTR1 단백질, 사람 펩타이드 호르몬(Human peptide hormones)를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the self-assembled amyloid is self-assembled insulin nanofiber, beta-lactoglobulin nanofiber, beta-amyloid nanofiber, α-synuclein nanofiber, lysozyme nanofiber, CsgA protein (major curlin subunit precursor) , FapC protein, Silkmoth chorion protein, Sup35 protein, Ure2p protein, Pmel17 protein, Mfp/C.Coli curli, Mouse laminin-RGD, TTR1 protein, human peptide hormones, but are not limited thereto.

본 발명의 일 양태에서, 암조건에서 신선한 인슐린 단량체(2 mg/mL)를 50℃에서 24시간 동안 반응시켜 인슐린 나노섬유를 제작하였다. 생성된 섬유는 길이가 수 ㎛, 높이가 10-15nm, 폭이 20nm인 나노 섬유 형태의 선형 배치를 나타냈다(도 2a). CD(Circular dichroism)을 이용한 분석에 따르면, 상기 나노섬유는 195nm에서 양성 피크를 보였고, 215nm에서 음의 피크를 보였으며 이는 전형적인 β-시트가 풍부한 아밀로이드 2차 구조에 해당하는 특성의 피크이다(도 3). 인슐린 나노섬유의 고밀도 코어는 β 시트 구조를 가지고, 아밀로이드 코어 나노 구조의 베타-시트 내의 수소결합을 통한 상호작용을 통하여, 섬유의 핵형성 의존에 의한 성장패턴이 형성된다. 무색인 인슐린 나노섬유는 ThT 분자의 자발적인 결합으로 인해 ThT 분자와 함께 조립되어 녹색의 펠렛을 형성한다(도 4). In one aspect of the present invention, insulin nanofibers were prepared by reacting fresh insulin monomer (2 mg/mL) at 50° C. for 24 hours under dark conditions. The resulting fibers exhibited a linear arrangement in the form of nanofibers having a length of several µm, a height of 10-15 nm, and a width of 20 nm (FIG. 2A). According to the analysis using circular dichroism (CD), the nanofibers showed a positive peak at 195 nm and a negative peak at 215 nm, which is a characteristic peak corresponding to a typical β-sheet-rich amyloid secondary structure (Fig. 3). The high-density core of insulin nanofibers has a β-sheet structure, and through the interaction through hydrogen bonds in the beta-sheet of the amyloid core nanostructure, a growth pattern is formed depending on the nucleation of the fibers. Colorless insulin nanofibers are assembled together with ThT molecules due to the spontaneous binding of ThT molecules to form green pellets (FIG. 4).

ThT- 결합 인슐린 나노섬유는 β- 시트 구조를 나타내는 유사한 CD 피크를 나타내었으며(도 2b), 또한, ThT 결합에 의해 인슐린 나노섬유의 자기조립 구조는 영향을 받지 않았다.ThT-binding insulin nanofibers showed a similar CD peak indicating a β-sheet structure (Fig. 2b), and the self-assembled structure of insulin nanofibers was not affected by ThT binding.

ThT 분자의 흡수스펙트럼 (λmax = 412 nm)은 인슐린 나노섬유에 결합한 후에도 변하지 않았다(도 5). 분광형광계 분석에 따르면, 자유 ThT 분자는 420nm에서의 여기에 의해, 460~550nm 사이의 약한 형광을 나타내었으며(도 2c), 이는 자유 형태의 비방사성 구조적 이완에 의한 여기 상태의 신속한 ??칭(quenching)에 기인하는 것으로 판단된다. 반면에 ThT와 결합한 인슐린 나노섬유로 강한 형광이 관찰되며, 이러한 증가된 ThT 형광은 여기된 전자 상태에서 중심 C- C 결합 주위의 구조 이완의 제한에 의해 야기될 것이다. The absorption spectrum (λmax = 412 nm) of the ThT molecule did not change even after binding to the insulin nanofibers (FIG. 5). According to spectrofluorimeter analysis, the free ThT molecule exhibited weak fluorescence between 460 and 550 nm by excitation at 420 nm (Fig. 2c), which is a rapid quench of the excited state due to the non-radioactive structural relaxation of the free form. quenching). On the other hand, strong fluorescence is observed with insulin nanofibers bound to ThT, and this increased ThT fluorescence will be caused by the limitation of structural relaxation around the central C-C bond in the excited electronic state.

ThT의 형광강도는 인슐린 섬유의 길이가 증가함에 따라 증가하였으며(도 6), 이는 길게 신장된 인슐린 섬유의 β-시트 구조에서 ThT 분자에 대한 결합 부위의 수가 증가된 것으로 판단하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 인슐린 나노 섬유의 존재 하에서는 ThT의 강한 형광이 관찰되었으나, 인슐린 단량체 존재 하에서의 ThT의 형광은 무시할 수 있는 정도의 수준이었다. 상기 결과는 ThT의 형광 방출에 베타 시트가 풍부한 인슐린 나노섬유가 현저한 효과를 가진다는 것을 나타낸다. The fluorescence intensity of ThT increased as the length of the insulin fiber increased (FIG. 6), which was determined to increase the number of binding sites for ThT molecules in the β-sheet structure of the long-stretched insulin fiber. As shown in FIG. 7, a strong fluorescence of ThT was observed in the presence of insulin nanofibers, but the fluorescence of ThT in the presence of an insulin monomer was at a negligible level. The above results indicate that beta-sheet-rich insulin nanofibers have a remarkable effect on the fluorescence emission of ThT.

본 발명의 또다른 양태에서는, ThT 결합 인슐린 나노섬유의 광 반응을 확인하기 위해 암조건과 명조건에서 광전류 프로파일을 측정하였다. ThT 결합 인슐린 나노섬유는 가시광선 조사시 양극성 광전류(= 0.1μA)를 생성하는 반면, ThT 단독 조건에서의 광전류 생성은 무시할 수 있는 수준이었다(도 8). 이러한 결과는 ThT가 인슐린 나노섬유에 결합함으로써 ThT 분자의 광활성이 크게 향상되었음을 나타낸다.In another embodiment of the present invention, the photocurrent profile was measured under dark and light conditions to confirm the photoreaction of ThT-binding insulin nanofibers. The ThT-binding insulin nanofibers generated bipolar photocurrent (= 0.1 μA) upon irradiation with visible light, while the photocurrent generation under ThT alone condition was negligible (FIG. 8). These results indicate that the photoactivity of ThT molecules was greatly improved by binding ThT to insulin nanofibers.

한편, 인슐린 나노섬유와 함께 조립된 ThT 분자는 향상된 여기 에너지 이동 (EET)을 나타냈다. 광 시스템에서 광감응제(photosensitizers)의 잘 정리된 공간정렬은 효율적인 에너지 전달에 중요하여, 더 나은 빛 수확을 가능하게하고, 전기화학 전위의 기울기를 생성하며, 양자 및 열역학적 효율을 향상시킨다. On the other hand, ThT molecules assembled with insulin nanofibers showed improved excitation energy transfer (EET). Well-ordered spatial alignment of photosensitizers in optical systems is important for efficient energy transfer, allowing better light harvesting, creating gradients of electrochemical potentials, and improving quantum and thermodynamic efficiencies.

본 발명의 다른 양태에서는 인슐린 나노섬유에 결합된 ThT 분자 사이의 EET를 조사하기 위해 분광형광 분석 및 형광수명 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 고정된 양의 인슐린 나노섬유에서 ThT의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 형광강도가 증가하였으며, 이는 인슐린 나노섬유와 ThT의 자발적 결합이 ThT의 중심 C-C 결합 주변의 회전 이완을 억제하는 것을 의미한다.In another embodiment of the present invention, spectroscopic fluorescence analysis and fluorescence lifetime analysis were performed to investigate EET between ThT molecules bound to insulin nanofibers. As a result, as shown in Figure 9a, as the concentration of ThT in a fixed amount of insulin nanofibers increased, the fluorescence intensity gradually increased, which means that the spontaneous binding of the insulin nanofibers to the ThT is around the central CC binding of the ThT. It means to suppress rotational relaxation.

또한, 형광수명 분광법을 사용하여 인슐린 나노섬유에서 ThT 분자의 구조적 이완의 제한을 분석하였다. 그 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이, ThT의 여기 상태 수명은 인슐린 나노섬유에 결합했을 때 0.867에서 1.894ns로 증가했다. In addition, the limitation of structural relaxation of ThT molecules in insulin nanofibers was analyzed using fluorescence lifetime spectroscopy. As a result, as shown in FIG. 9B, the excited state life of ThT increased from 0.867 to 1.894 ns when bound to insulin nanofibers.

N. Amdursky의 문헌에 따르면(N. Amdursky et al., Acc. Chem. Res. 45: 1548, 2012). ThT 분자의 형광 특성은 중심 C-C 결합 주위의 비 방사성 꼬인 분자 내 전하 이동 (TICT) 상태에 대한 국부적으로 여기된 상태의 ??칭 정도에 의해 결정된다. 자유 형태의 ThT 분자는 여기 상태가 TICT 상태로 전환되어는 것이방사능 비활성화보다 빠르기 때문에 수명이 짧다. 도 9b에 나타난 바에 따르면, ThT가 인슐린 나노섬유에 결합될 때 ThT의 비틀림 과정이 방사성 비활성화와 경쟁하며 TICT 형성이 느려져 ThT의 수명이 길어지는 것을 알 수 있다. According to the literature of N. Amdursky (N. Amdursky et al. , Acc. Chem. Res. 45: 1548, 2012). The fluorescence properties of ThT molecules are determined by the degree of quench of the locally excited state to the non-radioactive twisted intramolecular charge transfer (TICT) state around the central CC bond. The free-form ThT molecule has a short lifespan because the conversion of the excited state to the TICT state is faster than the radioactive inactivation. As shown in FIG. 9B, it can be seen that when ThT is bound to insulin nanofibers, the twisting process of ThT competes with radioactive inactivation, and TICT formation is slowed, so that the lifespan of ThT is prolonged.

본 발명의 또다른 양태에서는 여기 상태 수명이 인슐린 나노섬유의 존재 하에서 ThT 농도가 10 x 10-6M에서 40 x 10-6 M으로 증가함에 따라 1.894 ns에서 1.606 ns로 점차 감소g하는 것을 확인하였다. 여기상태 수명의 감소는 인슐린 나노섬유와 결합된 ThT 분자 사이의 EET가 나노초(nanosecond) 스케일에서 비 방사성 이완 채널을 통해 촉진된다는 것을 의미한다. 자연광 시스템에서, 자기조립 발색단은 8-10Å의 평균 분자간 거리로 밀접하게 배열되어 광자 플럭스 향상을 위한 EET 경로를 제공한다. M. Biancalana 등의 문헌에 따르면, 아밀로이드의 교차 β- 구조는 β- 가닥을 가로지르는 반복측쇄로 이루어져 있어, ThT가 결합할 수 있는 자리를 제공하고(M. Biancalana et al., Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics, 1804:1405, 2010), β- 가닥 및 β- 시트는 각각 4.8Å 및 10-11Å의 거리로 이격되어 인슐린 나노섬유 내의 ThT 분자의 보다 근접한 배열 및 적층을 가능하게 한다. In another aspect of the present invention, it was confirmed that the excited state lifespan gradually decreased from 1.894 ns to 1.606 ns as the ThT concentration increased from 10 x 10 -6 M to 40 x 10 -6 M in the presence of insulin nanofibers. . The reduction in excited state lifespan means that EET between insulin nanofibers and bound ThT molecules is promoted through non-radioactive relaxation channels at the nanosecond scale. In natural light systems, self-assembled chromophores are closely aligned with an average intermolecular distance of 8-10 Å, providing an EET pathway for photon flux enhancement. According to the literature of M. Biancalana et al., the cross β-structure of amyloid consists of a repeating side chain crossing the β-strand, providing a site for ThT to bind (M. Biancalana et al., Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics, 1804: 1405, 2010), β-strands and β-sheets are spaced apart by a distance of 4.8 Å and 10-11 Å, respectively, allowing closer alignment and stacking of ThT molecules in insulin nanofibers.

도 10에 나타낸 바와 같이, 단일 여기 ThT 분자는 분해되는 이완 경로만을 거치지만, 인슐린 나노섬유에 결합된 ThT 분자 간에는 EET가 일어나 분해를 억제하고 새로운 이완 경로를 유도한다. ThT 분자 사이의 EET로 인한 광자 에너지의 증가된 플럭스는 광 수확 능력을 향상시킨다.As shown in FIG. 10, a single excited ThT molecule goes through only a relaxation pathway to be degraded, but EET occurs between ThT molecules bound to insulin nanofibers to inhibit degradation and induce a new relaxation pathway. The increased flux of photon energy due to EET between ThT molecules improves the light harvesting ability.

본 발명의 다른 양태에서는 전압전류(voltammetric) 분석을 통해 ThT- 인슐린 하이브리드 나노섬유의 광전기 화학적 특성을 조사하였다. ThT 용액 (1 X 10-3M)의 전기화학적 환원은 각각 -0.75V (vs Ag/AgCl)와 -1.1V로 확인되었다(도 11). 또한, 유리질 탄소 전극 상에 증착된 ThT-인슐린 하이브리드로부터의 음극 전류는 산화 환원 매개체 M {[Cp*Rh (bpy) H2O]2+, Cp* = C5Me5, bpy=2,2'-bipyridine}의 존재 하에서 증가하였다 (도 12a). 로듐 기반의 유기 금속 매개체 M은 NAD +를 효소 적으로 활성 인 1,4-NAD (P) H 형태로 환원시킬 때 높은 입체 선택성을 나타내기 때문에 사용된다. M의 감소에 대한 ThT-인슐린 나노섬유의 광전촉매(photoelectrocatalytic) 활성은 ThT-인슐린 나노섬유에서 M으로의 전자 전달을 나타낸다. 분광형광 분석에 따르면 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 형광 세기는 M의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하였다(도 12b), 이는 전자공여체-전자수용체 관계를 형성함으로써 ThT- 인슐린 나노섬유로부터 M으로의 여기된 전자의 전달을 의미한다. In another aspect of the present invention, the photoelectrochemical properties of ThT-insulin hybrid nanofibers were investigated through voltammetric analysis. Electrochemical reduction of the ThT solution (1 X 10 -3 M) was confirmed to be -0.75V (vs Ag/AgCl) and -1.1V, respectively (FIG. 11). In addition, the cathode current from the ThT-insulin hybrid deposited on the glassy carbon electrode is the redox mediator M {[Cp*Rh (bpy) H 2 O] 2+ , Cp* = C 5 Me 5 , bpy=2,2 Increased in the presence of'-bipyridine} (Fig. 12a). Rhodium-based organometallic mediator M is used because it exhibits high stereoselectivity when reducing NAD+ to the enzymatically active 1,4-NAD(P)H form. The photoelectrocatalytic activity of ThT-insulin nanofibers on the reduction of M indicates electron transfer from ThT-insulin nanofibers to M. According to spectrofluorescence analysis, the fluorescence intensity of the ThT-insulin hybrid nanofibers gradually decreased as the concentration of M increased (Fig. 12b), which formed an electron donor-electron acceptor relationship, thereby excitation from ThT-insulin nanofibers to M. It means the transfer of electrons.

또한, 본 발명의 다른 양태에서는 전자공여체인 triethanolamine (TEOA)에 의한 ThT-인슐린 나노섬유의 형광 ??칭을 확인하였다. 이 경우 형광의 환원 ??칭은TEOA의 산화 전위가 ThT의 가장 높게 점유된 분자궤도 수준에 있기 때문이라고 생각된다(도 13).In addition, in another aspect of the present invention, fluorescence quenching of ThT-insulin nanofibers by triethanolamine (TEOA) as an electron donor was confirmed. In this case, the reduction of fluorescence is considered to be because the oxidation potential of TEOA is at the level of the highest occupied molecular orbital of ThT (Fig. 13).

효소의 고정화는 생촉매 광합성의 실제 적용하는데 있어서, 보다 높은 안정성, 재사용성 및 효소 불활성화의 완화 등의 이유로 유리하다. Immobilization of the enzyme is advantageous in the practical application of biocatalytic photosynthesis for reasons of higher stability, reusability, and relaxation of enzyme inactivation.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 자기조립형 아밀로이드에 티오블라빈-티(ThT)가 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체에 산화환원효소가 결합되어 있는 인공광합성용 복합체에 관한 것이다.Accordingly, from another viewpoint, the present invention relates to a complex for artificial photosynthesis in which an oxidoreductase is bound to a hybrid nanostructure in which thioblavin-T (ThT) is bound to self-assembled amyloid.

본 발명에 있어서, 상기 자기조립형 아밀로이드는 인슐린 나노섬유, 베타-락토글로불린 나노섬유, 베타-아밀로이드 나노섬유, α-시누클린 나노섬유 및 리소자임 나노섬유, CsgA 단백질(major curlin subunit precursor), FapC 단백질, Silkmoth chorion 단백질, Sup35 단백질, Ure2p 단백질, Pmel17 단백질, Mfp/C.Coli curli, Mouse laminin-RGD, TTR1 단백질 및 사람 펩타이드 호르몬(Human peptide hormones)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the self-assembled amyloid is insulin nanofibers, beta-lactoglobulin nanofibers, beta-amyloid nanofibers, α-synuclein nanofibers and lysozyme nanofibers, CsgA protein (major curlin subunit precursor), FapC protein , Silkmoth chorion protein, Sup35 protein, Ure2p protein, Pmel17 protein, Mfp/C.Coli curli, Mouse laminin-RGD, TTR1 protein, and human peptide hormones.It may be characterized by being selected from the group consisting of.

본 발명에 있어서, 상기 산화환원효소는 GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(Alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase), SDH(succinic dehydrogenase) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the oxidoreductase is GDH (glutamate dehydrogenase), ADH (Alcohol dehydrogenase), G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH (lactic dehydrogenase), MDH (malate dehydrogenase), SDH (succinic dehydrogenase), etc. Can be used, but is not limited thereto.

본 발명의 일 양태에서는 α- 케토글루타르산을 l-글루타메이트로 광유도 전환하기 위하여, NADH 의존성 산화환원효소인 L-글루타메이트 디하이드로게나아제(l-glutamate dehydrogenase, GDH)를 EDC(1- 에틸 -3- (3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드)와 NHS(N- 하이드록시 석신이미드)를 커플링제로 사용하여, ThT 인슐린 나노섬유에 고정화하였다.In one aspect of the present invention, in order to light-induced conversion of α-ketoglutaric acid to l-glutamate, L-glutamate dehydrogenase (GDH), which is an NADH-dependent oxidoreductase, is added to EDC (1-ethyl). -3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and NHS (N-hydroxysuccinimide) were used as a coupling agent to immobilize on ThT insulin nanofibers.

또다른 관점에서, 본 발명은 (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor) 및 (ⅲ) 집광재(light harvester)로서 상기 하이브리드 나노구조체를 함유하는 보조인자의 재생용 조성물 및 상기 보조인자의 재생용 조성물에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 보조인자의 광학적 재생방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides an oxidation-type cofactor selected from the group consisting of (i) NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) an electron donor and (iii) a light concentrator. Harvester), and a composition for regeneration of cofactors containing the hybrid nanostructures and a method for optical regeneration of cofactors comprising irradiating light to the composition for regeneration of the cofactors.

본 발명에 있어서, 상기 전자주개는 트리에탄올아민(TEOA, triethanolamine), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid), 시트르산(Citric acid), 포름산(Formic acid), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid), 물 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the electron donor is triethanolamine (TEOA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid, formic acid, ascorbic acid, oxalic acid ( Oxalic acid), water, etc. may be used, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 전자전달매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체, 로듐 III 복합체 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 로듐(III)복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H2O]2+인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the electron transport medium may be methylviologen, ruthenium II complex, rhodium III complex, etc., but is not limited thereto, and the rhodium (III) complex is (pentamethylcyclopentadienyl-2 ,2'-bipyridinechloro)rhodium(III):[Cp * Rh(bpy)H 2 O] 2+ .

본 발명에 있어서, 상기 빛은 텅스텐-할로겐 램프광, 제논 램프광, 단파장 레이저광, 태양광등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the light may be a tungsten-halogen lamp light, a xenon lamp light, a short wavelength laser light, or a solar light, but is not limited thereto.

본 발명의 일양태에서는 NAD+의 감소에 대한 산화 환원 매개체 M {[Cp*Rh (bpy) H2O]2+, Cp* = C5Me5, bpy=2,2'-bipyridine}의 촉매 활성을 확인하였다. 선형 스위프 전압전류 분석에 따르면, ThT 인슐린 나노섬유-변형 전극은 M 존재 하에서 약 -0.7V에서 전기화학적인 환원피크를 나타내었고, 전위에서의 음극 전류는 NAD+의 첨가에 의해 -1.3μA에서 -1.9μA로 증가하였다(도 12c). 또한, ThT- 인슐린 나노섬유의 순환 전압전류도(cyclic voltammograms)에서는 M과 NAD +에 의해 증가된 환원피크를 확인하였으며(도 14), 이러한 결과는 NAD +에 의한 M의 촉매 산화에 기인한다. 상기 결과를 종합하여, 분광 및 전기 화학적 분석 결과를 통하여 ThT-인슐린 나노섬유가 TEOA에서 M으로, 그리고 나서 NAD+로 광유도된 전자를 전달한다는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, the catalytic activity of the redox mediator M {[Cp*Rh (bpy) H 2 O] 2+ , Cp* = C 5 Me 5 , bpy=2,2'-bipyridine} for the reduction of NAD+ Was confirmed. According to the linear sweep voltammetry analysis, the ThT insulin nanofiber-modified electrode showed an electrochemical reduction peak at about -0.7V in the presence of M, and the cathode current at the potential was -1.9 at -1.3μA by the addition of NAD+. increased to μA (Fig. 12c). In addition, in the cyclic voltammograms of ThT-insulin nanofibers, the reduction peak increased by M and NAD + was confirmed (FIG. 14), and this result is due to the catalytic oxidation of M by NAD +. By synthesizing the above results, it was confirmed through spectroscopic and electrochemical analysis that ThT-insulin nanofibers transfer photo-induced electrons from TEOA to M and then to NAD+.

본 발명의 다른 양태에서는, ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 광 화학적 성질을 기반으로, 산화환원 생촉매 작용을 위해 가시광선에 의한 NADH의 재생을 수행하였다. 광조사 하에서 NADH 농도의 점진적인 증가를 관찰했다; 100분간의 광반응 후에 57.2X10-6M의 NADH가 형성되었다(도 12d). 반면, 암 조건 또는 광 조건에서 ThT- 인슐린 나노섬유의 부재 하에 NADH 농도의 변화는 무시할 수 있는 수준이었다. 각 반응 성분 (즉, ThT, TEOA, M)을 결실시켜 수행한 대조군 실험에서도 무시할 수 있는 수준으로 NADH 재생이 관찰되었다(도 15). 상기 결과는 광조사 하에서 인슐린 나노섬유와 하이브리드화된 ThT 분자의 여기전자 상태의 현저한 증가에 의해 NAD+를 NADH로 환원시키 것을 나타낸다. ThT-인슐린 나노섬유의 회전율(Turnover frequency, TOF)은 ≒0.343/h이었고, 이는 CdSe 양자점 (0.158/h), p 도핑된 TiO2(0.003/h) 또는 W2Fe4Ta2O17 (0.002/h)를 사용한 이전의 보고보다 훨씬 높은 것이다(D. H. Nam et al., Small 6:922, 2010).In another aspect of the present invention, based on the photochemical properties of ThT-insulin hybrid nanofibers, regeneration of NADH by visible light was performed for a redox biocatalytic action. A gradual increase in NADH concentration was observed under light irradiation; After 100 minutes of photoreaction, 57.2×10 −6 M of NADH was formed (FIG. 12D). On the other hand, the change in NADH concentration in the absence of ThT-insulin nanofibers in dark or light conditions was negligible. NADH regeneration was observed at negligible levels even in a control experiment performed by deleting each reaction component (ie, ThT, TEOA, M) (FIG. 15 ). The above results indicate that NAD+ is reduced to NADH by remarkable increase in the excitation electron state of ThT molecules hybridized with insulin nanofibers under light irradiation. The turnover frequency (TOF) of ThT-insulin nanofibers was ≒0.343/h, which is CdSe quantum dots (0.158/h), p-doped TiO 2 (0.003/h) or W 2 Fe 4 Ta 2 O 17 (0.002 /h) is much higher than previous reports using (DH Nam et al ., Small 6:922, 2010).

본 발명의 또다른 양태에서는, 빛에 의해 유도되는 NADH 재생에 사용한 ThT- 인슐린 나노섬유의 재사용성을 확인하였다. 그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, ThT-인슐린 나노섬유가 세번째 사용 후에도 원래 활성의 94% 이상을 유지하는 것을 알 수 있었다. In another aspect of the present invention, the reusability of the ThT-insulin nanofibers used for NADH regeneration induced by light was confirmed. As a result, as shown in FIG. 16, it was found that the ThT-insulin nanofibers maintained 94% or more of the original activity even after the third use.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (ⅲ) 집광재(light harvester)로서 하이브리드 나노구조체, (iv) 산화환원효소 및 (v) 산화환원효소의 기질을 함유하는 인공광합성용 조성물 및 (a)상기 인공광합성 조성물에, 빛을 조사하여 보조인자를 광학적으로 재생시키는 단계; 및 (b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소의 기질의 산화환원 반응에 사용하여 유용물질을 제조하는 단계를 포함하는 인공광합성 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides an oxidation-type cofactor selected from the group consisting of (i) NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) an electron donor, (iii) a light concentrator. (a) a composition for artificial photosynthesis containing a hybrid nanostructure as a harvester, (iv) an oxidoreductase and (v) a substrate of an oxidoreductase, and (a) the artificial photosynthetic composition is irradiated with light to optically regenerate a cofactor. step; And (b) using the regenerated cofactor for a redox reaction of a substrate of an oxidoreductase to prepare a useful substance.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (ⅲ) 상기 인공광합성용 복합체 및 (iv) 산화환원효소의 기질을 함유하는 인공광합성용 조성물 및 (a)상기 인공광합성 조성물에, 빛을 조사하여 보조인자를 광학적으로 재생시키는 단계; 및 (b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소의 기질의 산화환원 반응에 사용하여 유용물질을 제조하는 단계를 포함하는 인공광합성 방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides an oxidation-type cofactor selected from the group consisting of (i) NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) an electron donor, (iii) for the artificial photosynthesis. A composition for artificial photosynthesis containing a complex and (iv) a substrate of an oxidoreductase, and (a) optically regenerating a cofactor by irradiating light to the artificial photosynthetic composition; And (b) using the regenerated cofactor for a redox reaction of a substrate of an oxidoreductase to prepare a useful substance.

본 발명에 있어서, 상기 빛은 텅스텐-할로겐 램프광, 제논 램프광, 단파장 레이저광, 태양광등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the light may be a tungsten-halogen lamp light, a xenon lamp light, a short wavelength laser light, or a solar light, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 유용물질은 GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(Alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase), SDH(succinic dehydrogenase)등의 산환환원 효소에 의하여 환원되는 물질인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the useful substances are GDH (glutamate dehydrogenase), ADH (Alcohol dehydrogenase), G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH (lactic dehydrogenase), MDH (malate dehydrogenase), SDH (succinic dehydrogenase), etc. It may be characterized in that it is a material that is reduced by an acid-reduction enzyme, but is not limited thereto.

본 발명의 일 양태에서는 α- 케토글루타르산을 l-글루타메이트로 광유도 전환하기 위하여, NADH 의존성 산화환원효소인 L-글루타메이트 디하이드로게나아제(l-glutamate dehydrogenase, GDH)를 EDC(1- 에틸 -3- (3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드)와 NHS(N- 하이드록시 석신이미드)를 커플링제로 사용하여, ThT 인슐린 나노섬유에 고정화하였다. ThT- 인슐린 나노섬유에서 결합되지 않은 GDH를 제거하기위한 투석 후, α-케토글루타레이트 및 NH4+ 이온의 존재하에 1,4-NADH의 산화를 모니터링하여 이들의 촉매활성을 측정하였다. GDH가 결합 된 ThT-인슐린 나노섬유는 NADH 농도가 점차적으로 감소하였으며 (약 10 x 10-6M/min), 이는 GDH 활성이 정제 과정 후에 잘 보존되었음을 나타낸다(도 17a).In one aspect of the present invention, in order to light-induced conversion of α-ketoglutaric acid to l-glutamate, L-glutamate dehydrogenase (GDH), which is an NADH-dependent oxidoreductase, is added to EDC (1-ethyl). -3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and NHS (N-hydroxysuccinimide) were used as a coupling agent to immobilize on ThT insulin nanofibers. After dialysis to remove unbound GDH from ThT-insulin nanofibers, their catalytic activity was measured by monitoring the oxidation of 1,4-NADH in the presence of α-ketoglutarate and NH 4+ ions. In ThT-insulin nanofibers bound to GDH, the NADH concentration gradually decreased (about 10 x 10 -6 M/min), indicating that the GDH activity was well preserved after the purification process (FIG. 17A).

본 발명의 또다른 양태에서는 α- 케토글루타르산을 l-글루타메이트로 효소적으로 전환시키는 것과 짝지어 일어나는 NAD+에서 광화학적 NADH 재생에 ThT-GDH- 인슐린 나노섬유를 적용하였다(도 17b). 암조건에서는 효소적 전환이 확인되지 않았으며, ThT가 결합되지 않은 본래의 인슐린 나노섬유의 존재 하에서 광조사를 한 경우에도 효소적 전환이 확인되지 않았다. 자유 ThT 분자는 3시간 반응 (TOF 약 0.098/h) 후에 거의 전환을 일으키지 않았다. ThT-GDH- 인슐린 나노섬유로의 광조사 시에, 효소적 전환의 급격한 증가가 관찰되었으며, 이는 TOF가 0.92/h로 3 시간 후에 0.917 x 10-3M의 l-글루타메이트의 전환율을 나타내었으며, 이는 ThT-인슐린 나노섬유가 결합된 GDH와 광화학적 NADH 재생의 효과적인 결합을 나타낸다In another embodiment of the present invention, ThT-GDH-insulin nanofibers were applied to photochemical NADH regeneration in NAD+ that occurs in conjunction with enzymatic conversion of α-ketoglutaric acid to l-glutamate (FIG. 17B). Enzymatic conversion was not confirmed under dark conditions, and enzymatic conversion was not confirmed even when light irradiation was performed in the presence of the original insulin nanofibers to which ThT was not bound. Free ThT molecules caused little conversion after a 3 hour reaction (TOF about 0.098/h). Upon light irradiation with ThT-GDH-insulin nanofibers, a rapid increase in enzymatic conversion was observed, which showed a conversion rate of l-glutamate of 0.917 x 10 -3 M after 3 hours with a TOF of 0.92/h, This indicates the effective binding of GDH to which ThT-insulin nanofibers are bound and photochemical NADH regeneration.

아밀로이드 형성성 펩타이드의 자기조립은 나노수준의 아미노산 잔기를 가진 나노구조를 형성할 수 있다. 아밀로이드 나노 섬유는 다른 섬유질 생체 물질 (예 : 액틴, 튜불린)과 비교하여 교차 β 시트 2차 구조에서 강한 분자간 상호 작용으로 인해 훨씬 높은 탄성 계수를 나타낸다. 견고한 특성과 쉬운 자기조립 과정은 다양한 기능성 나노물질의 생성을 위한 천연 (및 인공) 아밀로이드 구조의 응용을 촉진시켰다. 인슐린 나노섬유는 가혹한 조건 (예를 들어, 고온) 및 변성제 존재 하에서 우수한 기계적 특성을 나타내며 아밀로이드 구조를 유지한다. ThT는 과거에는 신경 퇴행성 질환과 관련된 아밀로이드 응집체를 검출하기 위한 형광탐침으로 널리 사용되어 왔다. 본 발명에서는 아밀로이드 기반 스캐폴드를 사용하여 생촉매적 광화학 변환에 적합한 ThT 분자의 광수확능을 처음으로 확인하였다. 지금까지 아밀로이드 나노 구조의 β- 시트 간격 내에서 조립된 염료가 광안테나로서 작용할 수 있다는 것을 보여주어 빛을 수확하데 응용하기 위한 아밀로이드의 잠재력을 암시하는 연구는 거의 없었다. 본 발명의 ThT- 아밀로이드 하이브리드 나노섬유의 광 수확 시스템은 정교한 화학처리 없이 아밀로이드 구조의 β 시트 골격에 자발적 및 특이적 결합과 같은 ThT의 독특한 광물리 특성을 이용하여 만들어졌다. Self-assembly of amyloid-forming peptides can form nanostructures with nanoscale amino acid residues. Compared to other fibrous biomaterials (e.g., actin, tubulin), amyloid nanofibers exhibit a much higher modulus of elasticity due to strong intermolecular interactions in the cross-β sheet secondary structure. The robust properties and easy self-assembly process facilitated the application of natural (and artificial) amyloid structures for the creation of a variety of functional nanomaterials. Insulin nanofibers exhibit excellent mechanical properties under harsh conditions (eg, high temperature) and the presence of a denaturant and maintain an amyloid structure. ThT has been widely used in the past as a fluorescence probe to detect amyloid aggregates associated with neurodegenerative diseases. In the present invention, for the first time, the light harvesting ability of ThT molecules suitable for biocatalytic photochemical transformation was confirmed using an amyloid-based scaffold. To date, few studies have shown that dyes assembled within the β-sheet spacing of amyloid nanostructures can act as optical antennas, suggesting the potential of amyloid for application in harvesting light. The light harvesting system of the ThT-amyloid hybrid nanofibers of the present invention was made using the unique photophysical properties of ThT such as spontaneous and specific binding to the β-sheet skeleton of the amyloid structure without elaborate chemical treatment.

현재까지 광유도 전자가 전자 매개체를 통해 산화환원효소로 전달되는 자연 광합성 메커니즘을 모방하기 위해 많은 노력이 있어 왔다. 본 발명에서는 자연의 광시스템을 모방하여 산화환원효소와 자기조립 나노섬유의 결합을 통해 효소적 환원 반응 (즉, 암 반응)을 위한 산화환원 생촉매 모듈과 NADH 재생 (즉, 광반응)을 위한 수확 모듈을 성공적으로 결합시켰다.Until now, many efforts have been made to mimic the natural photosynthetic mechanism in which photoinduced electrons are transferred to oxidoreductases through electron mediators. In the present invention, the redox biocatalyst module for enzymatic reduction reaction (i.e., cancer reaction) and NADH regeneration (i.e., photoreaction) through the combination of oxidoreductase and self-assembled nanofibers by mimicking the natural optical system The harvest module was successfully combined.

따라서, 본 발명에서는 NADH의 광감작 재생 및 산화환원 생촉매 작용을 위해 자기조립, 광 수확 인슐린 아밀로이드 나노섬유를 구축하여 자연의 자기조립 광 시스템을 모방하였다. ThT는 아밀로이드 응집체와의 특이적인 결합 및 아밀로이드 나노섬유에 삽입시 현저히 증가되는 형광 양자 수율과 같은 독특한 특성 때문에 감광염료로 사용하였다. 자기조립된 아밀로이드 나노섬유는 베타 시트가 풍부한 아밀로이드 구조에서 자유 회전을 막음으로써 ThT 분자의 광활성을 현저히 향상시켰으며 나노 섬유에 결합된 ThT 분자 사이의 거리를 좁혀 EET를 유발했습니다. 인슐린 나노섬유에 결합된 ThT의 증가된 광활성은 가시광선 조사 하에서 로듐-매개 매개체 M의 존재하에 효소적으로 NAD+로부터 활성 NADH를 재생하여 산화환원효소적 생산의 증가를 가져왔다. 본 발명에서는 가시광선에 의한 NADH 재생과 산화환원효소에 의한 합성을 위한 광 수확 스캐폴드로서 자기조립된 아밀로이드 나노섬유의 잠재성을 제시하였다.Therefore, in the present invention, self-assembled, light-harvesting insulin amyloid nanofibers were constructed to mimic the natural self-assembled optical system for photosensitive regeneration and redox biocatalytic action of NADH. ThT was used as a photosensitive dye because of its unique properties such as specific binding to amyloid aggregates and the fluorescence quantum yield significantly increased upon insertion into amyloid nanofibers. Self-assembled amyloid nanofibers significantly improved the photoactivity of ThT molecules by preventing free rotation in the amyloid structure rich in beta sheets, and caused EET by narrowing the distance between ThT molecules bound to the nanofibers. The increased photoactivity of ThT bound to insulin nanofibers resulted in an increase in oxidoreductase production by enzymatically regenerating active NADH from NAD+ in the presence of rhodium-mediated mediator M under visible light irradiation. In the present invention, the potential of self-assembled amyloid nanofibers as a light harvesting scaffold for NADH regeneration by visible light and synthesis by oxidoreductase was presented.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are

오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.It will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples, as merely illustrative of the present invention.

실시예 1: ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 합성 Example 1: Synthesis of ThT-insulin hybrid nanofibers

인슐린 단량체로는 인슐린 헥사머를 사용하였다(Sigma-Aldrich Co, USA). 상기 인슐린 단량체를 2mg/mL의 농도로 40x 10-3M HCl (pH 1.5)에 녹인 후, 30분 동안 수조에서 초음파처리 하였다. 50℃에서 24시간 동안 용액을 항온 처리하여 인슐린의 섬유화를 유도하고, Slide-A-Lyzer MINI 투석장치(10000 MWCO, Thermo Fisher Scientific,미국)를 사용하여 탈이온 (DI)수에서 투석하여, 인슐린 단량체를 제거하였다. 15,000rpm에서 30분간 원심분리한 후, 상등액을 제거하여 인슐린 나노섬유를 수득하였다. Insulin hexamer was used as an insulin monomer (Sigma-Aldrich Co, USA). The insulin monomer was dissolved in 40x 10 -3 M HCl (pH 1.5) at a concentration of 2 mg/mL, followed by sonication in a water bath for 30 minutes. The solution was incubated at 50°C for 24 hours to induce fibrosis of insulin, and then dialyzed in deionized (DI) water using a Slide-A-Lyzer MINI dialysis device (10000 MWCO, Thermo Fisher Scientific, USA). The monomer was removed. After centrifugation at 15,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was removed to obtain insulin nanofibers.

수득된 인슐린 나노섬유 샘플(2 mg/mL)을 ThT 용액 (40 x 10-6M)과 혼합하고, 어두운 곳에서 온화한 조건(64rpm)으로 1 시간 동안 반응시켰다(도 4). 마지막으로 얻어진 녹색 펠렛을 탈이온수로 3 회 세척하여 결합되지 않은 ThT 분자를 제거한 후, 추가 측정을 위해 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 반응시켜, ThT-인슐린 나노섬유 하이브리드 구조체를 수득하였다.The obtained insulin nanofiber sample (2 mg/mL) was mixed with a ThT solution (40 x 10 -6 M), and reacted for 1 hour in a dark place under mild conditions (64 rpm) (FIG. 4). Finally, the obtained green pellet was washed three times with deionized water to remove unbound ThT molecules, and then reacted in the dark for 1 hour at room temperature for further measurement, thereby obtaining a ThT-insulin nanofiber hybrid structure.

실시예 2: ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 CD 스펙트럼 및 형광스펙트럼 분석 Example 2: CD spectrum and fluorescence spectrum analysis of ThT-insulin hybrid nanofibers

실시예 1에서 수득한 인슐린 나노섬유의 형태를 AFM(Atomic Force Microscope)를 이용하여 분석하였다. 시료 용액(10 μL)의 일부를 절단된 운모 기판에 떨어뜨렸다. 10 분 후, 기판을 탈이온수로 헹구고 진공 하에서 30분 동안 건조시켰다. 샘플을 멀티모드 AFM 장치 (Digital Instruments Inc., USA)를 사용하여 분석하였다.The morphology of the insulin nanofibers obtained in Example 1 was analyzed using AFM (Atomic Force Microscope). A portion of the sample solution (10 μL) was dropped onto the cut mica substrate. After 10 minutes, the substrate was rinsed with deionized water and dried under vacuum for 30 minutes. Samples were analyzed using a multimode AFM device (Digital Instruments Inc., USA).

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 인슐린 나노섬유는 길이가 수 ㎛, 높이가 10-15nm, 폭이 20nm인 나노 섬유 형태의 선형 배치를 나타내었다. As a result, as shown in Fig. 2a, the insulin nanofibers exhibited a linear arrangement in the form of nanofibers having a length of several µm, a height of 10-15 nm, and a width of 20 nm.

인슐린 나노섬유와 ThT-인슐린 나노섬유 하이브리드 구조체의 CD 스펙트럼을 분석하여, 형태를 확인하였다. 용액(100μL)의 CD 스펙트럼은 spectropolarimeter (Jasco Inc., 일본)를 사용하여 20℃, N2 대기 하에서 190-260 nm의 범위에서 측정하였고 Savitzky-Golay 스무딩에 의해 처리하였다. The morphology was confirmed by analyzing the CD spectrum of the insulin nanofiber and ThT-insulin nanofiber hybrid structure. The CD spectrum of the solution (100 μL) was measured using a spectropolarimeter (Jasco Inc., Japan) in the range of 190-260 nm in a 20° C., N 2 atmosphere, and processed by Savitzky-Golay smoothing.

CD(Circular dichroism)을 이용한 분석에 따르면, 상기 인슐린 나노섬유는 195nm에서 양성 피크를 보였고, 215nm에서 음의 피크를 보였으며 이는 전형적인 β-시트가 풍부한 아밀로이드 2차 구조에 해당하는 특성의 피크이다(도 3). ThT- 결합 인슐린 나노섬유는 β- 시트 구조를 나타내는 유사한 CD 피크를 나타내었으며(도 2b), 또한, ThT 결합에 의해 인슐린 나노섬유의 자기조립 구조는 영향을 받지 않았다.According to the analysis using circular dichroism (CD), the insulin nanofibers showed a positive peak at 195 nm and a negative peak at 215 nm, which is a characteristic peak corresponding to a typical β-sheet-rich amyloid secondary structure ( Fig. 3). ThT-binding insulin nanofibers showed a similar CD peak indicating a β-sheet structure (Fig. 2b), and the self-assembled structure of insulin nanofibers was not affected by ThT binding.

또한, 인슐린 나노섬유의 유무에 따른 ThT의 형광 스펙트럼을 변화를 확인하였다. ThT의 형광은 Spectrofluorophotometer (Shimadzu Inc., 일본)를 사용하여 측정하였다. ThT-인슐린 용액 샘플의 여기 상태 수명은 여기 원(excitation source)으로서 375nm 다이오드 레이저가 장착된 TCSPC(time-correlated single-photon counting) 분광계(FL920 모델, Edinburgh Instruments Ltd., 영국)를 사용하여 기록하였다. TCSPC 분광계는 전하 결합 소자 (CCD) 검출기와 펄스 레이저로 구성되었으며 90ㅀ의 각도로 설치하였으며, 레이저로부터 반사된 파동의 영향을 피하기 위해 검출기 앞에 395 nm 광학 필터를 설치하였다. 감쇄 시간은 각 ThT-인슐린 시료 용액의 방출 스펙트럼의 피크 파장에서 측정하였다. In addition, it was confirmed that the fluorescence spectrum of ThT according to the presence or absence of insulin nanofibers was changed. The fluorescence of ThT was measured using a Spectrofluorophotometer (Shimadzu Inc., Japan). The excited state lifetime of the ThT-insulin solution sample was recorded using a time-correlated single-photon counting (TCSPC) spectrometer (FL920 model, Edinburgh Instruments Ltd., UK) equipped with a 375 nm diode laser as the excitation source. . The TCSPC spectrometer was composed of a charge-coupled device (CCD) detector and a pulsed laser, and was installed at an angle of 90°, and a 395 nm optical filter was installed in front of the detector to avoid the influence of waves reflected from the laser. The decay time was measured at the peak wavelength of the emission spectrum of each ThT-insulin sample solution.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, ThT 분자의 흡수스펙트럼 (λmax = 412 nm)은 인슐린 나노섬유에 결합한 후에도 변하지 않았다. 분광형광계 분석에 따르면, 자유 ThT 분자는 420nm에서의 여기에 의해, 460~550nm 사이의 약한 형광을 나타내었으며(도 2c), 이는 자유 형태의 비방사성 구조적 이완에 의한 여기 상태의 신속한 ??칭(quenching)에 기인하는 것으로 판단된다. 반면에 ThT와 결합한 인슐린 나노섬유로 강한 형광이 관찰되며, 이러한 증가된 ThT 형광은 여기된 전자 상태에서 중심 C- C 결합 주위의 구조 이완의 제한에 의한 것으로 판단된다. As a result, as shown in FIG. 5, the absorption spectrum (λmax = 412 nm) of the ThT molecule did not change even after binding to the insulin nanofibers. According to spectrofluorimeter analysis, the free ThT molecule exhibited weak fluorescence between 460 and 550 nm by excitation at 420 nm (Fig. 2c), which is a rapid quench of the excited state due to the non-radioactive structural relaxation of the free form. quenching). On the other hand, strong fluorescence is observed with the insulin nanofibers bound to ThT, and this increased ThT fluorescence is believed to be due to the limitation of structural relaxation around the central C-C bond in the excited electronic state.

ThT의 형광강도는 인슐린 섬유의 길이가 증가함에 따라 증가하였으며(도 6), 이는 길게 신장된 인슐린 섬유의 β-시트 구조에서 ThT 분자에 대한 결합 부위의 수가 증가된 것으로 판단하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 인슐린 나노 섬유의 존재 하에서는 ThT의 강한 형광이 관찰되었으나, 인슐린 단량체 존재 하에서의 ThT의 형광은 무시할 수 있는 정도의 수준이었다. 상기 결과는 ThT의 형광 방출에 베타 시트가 풍부한 인슐린 나노섬유가 현저한 효과를 가진다는 것을 나타낸다. The fluorescence intensity of ThT increased as the length of the insulin fiber increased (FIG. 6), which was determined to increase the number of binding sites for ThT molecules in the β-sheet structure of the long-stretched insulin fiber. As shown in FIG. 7, a strong fluorescence of ThT was observed in the presence of insulin nanofibers, but the fluorescence of ThT in the presence of an insulin monomer was at a negligible level. The above results indicate that beta-sheet-rich insulin nanofibers have a remarkable effect on the fluorescence emission of ThT.

실시예 3: ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 전기화학적 특성 분석 Example 3: Analysis of electrochemical properties of ThT-insulin hybrid nanofibers

전위차 측정은 유리 전극 카본 디스크 (워킹 전극), Ag/AgCl (기준 전극, 0.197V vs 정상 수소 전극) 및 백금 와이어 (상대 전극)를 사용하여 3 전극 시스템에서 다채널 potentiostat/galvanostat (WonATech, 모델 WMPG1000, 한국)에 연결하여 수행하였다. 스캔 속도는 50 mV s-1이었다. 광전류 측정을 위해 ThT- 인슐린 나노섬유로 수식된 전극에 0.4V (Ag/AgCl)의 전위를 가했다. Potentiometric measurements were made in a multi-channel potentiostat/galvanostat (WonATech, model WMPG1000) in a three-electrode system using a glass electrode carbon disk (working electrode), Ag/AgCl (reference electrode, 0.197V vs normal hydrogen electrode) and platinum wire (relative electrode). , Korea). The scan speed was 50 mV s-1. To measure the photocurrent, a potential of 0.4V (Ag/AgCl) was applied to the electrode modified with ThT-insulin nanofibers.

ThT 결합 인슐린 나노섬유의 광 반응을 확인하기 위해 암조건과 명조건에서 광전류 프로파일을 측정하였다. ThT 결합 인슐린 나노섬유는 가시광선 조사시 양극성 광전류(= 0.1μA)를 생성하는 반면, ThT 단독 조건에서의 광전류 생성은 무시할 수 있는 수준이었다(도 8). 이러한 결과는 ThT가 인슐린 나노섬유에 결합함으로써 ThT 분자의 광활성이 크게 향상되었음을 나타낸다. The photocurrent profile was measured under dark and light conditions to confirm the photoresponse of ThT-binding insulin nanofibers. The ThT-binding insulin nanofibers generated bipolar photocurrent (= 0.1 μA) upon irradiation with visible light, while the photocurrent generation under ThT alone condition was negligible (FIG. 8). These results indicate that the photoactivity of ThT molecules was greatly improved by binding ThT to insulin nanofibers.

인슐린 나노섬유와 함께 조립된 ThT 분자는 향상된 여기 에너지 이동 (EET)을 나타냈다. 광 시스템에서 광감응제(photosensitizers)의 잘 정리된 공간정렬은 효율적인 에너지 전달에 중요하여, 더 나은 빛 수확을 가능하게하고, 전기화학 전위의 기울기를 생성하며, 양자 및 열역학적 효율을 향상시킨다. ThT molecules assembled with insulin nanofibers showed enhanced excitation energy transfer (EET). Well-ordered spatial alignment of photosensitizers in optical systems is important for efficient energy transfer, allowing better light harvesting, creating gradients of electrochemical potentials, and improving quantum and thermodynamic efficiencies.

본 발명의 다른 양태에서는 인슐린 나노섬유에 결합된 ThT 분자 사이의 EET를 조사하기 위해 분광형광 분석 및 형광수명 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 고정된 양의 인슐린 나노섬유에서 ThT의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 형광강도가 증가하였으며, 이는 인슐린 나노섬유와 ThT의 자발적 결합이 ThT의 중심 C-C 결합 주변의 회전 이완을 억제하는 것을 의미한다.In another embodiment of the present invention, spectroscopic fluorescence analysis and fluorescence lifetime analysis were performed to investigate EET between ThT molecules bound to insulin nanofibers. As a result, as shown in Figure 9a, as the concentration of ThT in a fixed amount of insulin nanofibers increased, the fluorescence intensity gradually increased, which means that the spontaneous binding of the insulin nanofibers to the ThT is around the central CC binding of the ThT. It means to suppress rotational relaxation.

또한 형광수명 분광법을 사용하여 인슐린 나노섬유에서 ThT 분자의 구조적 이완의 제한을 분석하였다. 그 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이, ThT의 여기 상태 수명은 인슐린 나노섬유에 결합했을 때 0.867에서 1.894ns로 증가했다.In addition, the limitation of structural relaxation of ThT molecules in insulin nanofibers was analyzed using fluorescence lifetime spectroscopy. As a result, as shown in FIG. 9B, the excited state life of ThT increased from 0.867 to 1.894 ns when bound to insulin nanofibers.

여기 상태 수명이 인슐린 나노섬유의 존재 하에서 ThT 농도가 10 x 10-6M에서 40 x 10-6 M으로 증가함에 따라 1.894 ns에서 1.606 ns로 점차 감소g하는 것을 확인하였다. 여기상태 수명의 감소는 인슐린 나노섬유와 결합된 ThT 분자 사이의 EET가 나노초(nanosecond) 스케일에서 비 방사성 이완 채널을 통해 촉진된다는 것을 의미한다. It was confirmed that the excited state lifespan gradually decreased from 1.894 ns to 1.606 ns as the ThT concentration increased from 10 x 10 -6 M to 40 x 10 -6 M in the presence of insulin nanofibers. The reduction in excited state lifespan means that EET between insulin nanofibers and bound ThT molecules is promoted through non-radioactive relaxation channels at the nanosecond scale.

도 10에 나타낸 바와 같이, 단일 여기 ThT 분자는 분해되는 이완 경로만을 거치지만, 인슐린 나노섬유에 결합된 ThT 분자 간에는 EET가 일어나 분해를 억제하고 새로운 이완 경로를 유도한다. ThT 분자 사이의 EET로 인한 광자 에너지의 증가된 플럭스는 광 수확 능력을 향상시킨다.As shown in FIG. 10, a single excited ThT molecule goes through only a relaxation pathway to be degraded, but EET occurs between ThT molecules bound to insulin nanofibers to inhibit degradation and induce a new relaxation pathway. The increased flux of photon energy due to EET between ThT molecules improves the light harvesting ability.

전압전류(voltammetric) 분석을 통해 ThT- 인슐린 하이브리드 나노섬유의 광전기 화학적 특성을 조사하였다. 그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, ThT 용액 (1 X 10-3M)의 전기화학적 환원은 각각 -0.75V (vs Ag/AgCl)와 -1.1V로 확인되었다. The photoelectrochemical properties of ThT-insulin hybrid nanofibers were investigated through voltammetric analysis. As a result, as shown in Figure 11, the electrochemical reduction of the ThT solution (1 X 10 -3 M) was confirmed to be -0.75V (vs Ag/AgCl) and -1.1V, respectively.

도 12a에 나타난 바와 같이, 유리질 탄소 전극 상에 증착된 ThT-인슐린 하이브리드로부터의 음극 전류는 산화 환원 매개체 M {[Cp*Rh (bpy) H2O]2+, Cp* = C5Me5, bpy=2,2'-bipyridine}의 존재 하에서 증가하였다. 로듐 기반의 유기 금속 매개체 M은 NAD +를 효소적으로 활성인 1,4-NAD (P) H 형태로 환원시킬 때 높은 입체 선택성을 나타내기 때문에 사용된다. M의 감소에 대한 ThT-인슐린 나노섬유의 광전촉매(photoelectrocatalytic) 활성은 ThT-인슐린 나노섬유에서 M으로의 전자 전달을 나타낸다. 분광형광 분석에 따르면 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 형광 세기는 M의 농도가 증가함에 따라 점차 감소하였다(도 12b), 이는 전자공여체-전자수용체 관계를 형성함으로써 ThT- 인슐린 나노섬유로부터 M으로의 여기된 전자의 전달을 의미한다. As shown in Figure 12a, the cathode current from the ThT-insulin hybrid deposited on the glassy carbon electrode is a redox mediator M {[Cp*Rh (bpy) H 2 O] 2+ , Cp* = C 5 Me 5 , It increased in the presence of bpy=2,2'-bipyridine}. Rhodium-based organometallic mediator M is used because it exhibits high stereoselectivity when reducing NAD + to the enzymatically active 1,4-NAD (P) H form. The photoelectrocatalytic activity of ThT-insulin nanofibers on the reduction of M indicates electron transfer from ThT-insulin nanofibers to M. According to spectrofluorescence analysis, the fluorescence intensity of the ThT-insulin hybrid nanofibers gradually decreased as the concentration of M increased (Fig. 12b), which formed an electron donor-electron acceptor relationship, thereby excitation from ThT-insulin nanofibers to M. It means the transfer of electrons.

실시예 4: ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유를 이용한 전자전달 및 보조인자 재생 Example 4: Electron transfer and cofactor regeneration using ThT-insulin hybrid nanofibers

전자공여체인 triethanolamine (TEOA)에 의한 ThT-인슐린 나노섬유의 형광 ??칭을 확인하였다.It was confirmed the fluorescence quenching of ThT-insulin nanofibers by triethanolamine (TEOA), an electron donor.

ThT (100 x 10-6M)과 결합된 인슐린 나노섬유 (5mg/mL)를 1 X 10-3M의 NAD +, 500 X 10-6mM 및 15w / v %의 TEOA를 포함하는 아르곤-퍼지된 포스페이트 버퍼(100 X 10-3M, pH 7.5)에 분산시켰다. 가시광선에 의한 NADH 재생은 420nm 컷오프 필터가 장착된 450 WXe 램프를 사용하여 수행하였다. 재생된 NADH의 농도는 340nm에서의 UV-vis 흡광도 (NADH의 흡광 계수 = 6220/M/cm)의 변화에 의해 측정하였다. 이 경우 형광의 환원 ??칭은 TEOA의 산화 전위가 ThT의 가장 높게 점유된 분자궤도 수준에 있기 때문이라고 생각된다(도 13).ThT (100 x 10 -6 M) and conjugated insulin nanofibers (5 mg/mL) to 1 x 10 -3 M of NAD +, 500 x 10 -6 mM and 15w / v% of TEOA containing argon-purged Phosphate buffer (100 X 10 -3 M, pH 7.5). NADH regeneration by visible light was performed using a 450 WXe lamp equipped with a 420 nm cut-off filter. The concentration of regenerated NADH was measured by the change in UV-vis absorbance at 340 nm (absorption coefficient of NADH = 6220/M/cm). In this case, the reduction of fluorescence is considered to be because the oxidation potential of TEOA is at the level of the highest occupied molecular orbital of ThT (Fig. 13).

또한, NAD+의 감소에 대한 M의 촉매 활성을 확인하였다. 선형 스위프 전압전류 분석에 따르면, ThT 인슐린 나노섬유-변형 전극은 M 존재 하에서 약 -0.7V에서 전기화학적인 환원피크를 나타내었고, 전위에서의 음극 전류는 NAD+의 첨가에 의해 -1.3μA에서 -1.9μA로 증가하였다(도 12c). 또한, ThT-인슐린 나노섬유의 순환 전압전류도(cyclic voltammograms)에서는 M과 NAD +에 의해 증가된 환원피크를 확인하였으며(도 14), 이러한 결과는 NAD +에 의한 M의 촉매 산화에 기인한다. 상기 결과를 종합하여, 분광 및 전기 화학적 분석 결과를 통하여 ThT-인슐린 나노섬유가 TEOA에서 M으로, 그리고 나서 NAD+로 광유도된 전자를 전달한다는 것을 확인하였다. In addition, the catalytic activity of M for the reduction of NAD+ was confirmed. According to the linear sweep voltammetry analysis, the ThT insulin nanofiber-modified electrode showed an electrochemical reduction peak at about -0.7V in the presence of M, and the cathode current at the potential was -1.9 at -1.3μA by the addition of NAD+. increased to μA (Fig. 12c). In addition, in the cyclic voltammograms of the ThT-insulin nanofibers, the reduction peak increased by M and NAD + was confirmed (FIG. 14 ), and this result is due to the catalytic oxidation of M by NAD +. By synthesizing the above results, it was confirmed through spectroscopic and electrochemical analysis that ThT-insulin nanofibers transfer photo-induced electrons from TEOA to M and then to NAD+.

또한, ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 광 화학적 성질을 기반으로, 산화환원 생촉매 작용을 위해 가시광선에 의한 NADH의 재생을 수행하였다. 광조사 하에서 NADH 농도의 점진적인 증가를 관찰하였다. 그 결과, 도 12d에 나타난 바와 같이, 100분간의 광반응 후에 57.2X10-6M의 NADH가 형성되었다. 반면, 암 조건 또는 광 조건에서 ThT- 인슐린 나노섬유의 부재 하에 NADH 농도의 변화는 무시할 수 있는 수준이었다. 각 반응 성분 (즉, ThT, TEOA, M)을 결실시켜 수행한 대조군 실험에서도 무시할 수 있는 수준으로 NADH 재생이 관찰되었다(도 15).In addition, based on the photochemical properties of ThT-insulin hybrid nanofibers, regeneration of NADH by visible light was performed for the redox biocatalytic action. A gradual increase in the NADH concentration was observed under light irradiation. As a result, as shown in FIG. 12D, 57.2×10 −6 M of NADH was formed after 100 minutes of photoreaction. On the other hand, the change in NADH concentration in the absence of ThT-insulin nanofibers in dark or light conditions was negligible. NADH regeneration was observed at negligible levels even in a control experiment performed by deleting each reaction component (ie, ThT, TEOA, M) (FIG. 15 ).

실시예 5: ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유의 재사용성 확인Example 5: Confirmation of reusability of ThT-insulin hybrid nanofibers

광 유도에 의한 NADH 재생에 사용한 ThT- 인슐린 나노섬유의 재사용성을 확인하였다. 실험을 위해 실시예 4의 방법으로 2시간 동안 NADH 재생 후, 30분 동안 15,000rpm에서 원심분리하여 반응 매체로부터 ThT-인슐린 나노섬유를 분리하고 재사용하였다.Reusability of the ThT-insulin nanofibers used for NADH regeneration by light induction was confirmed. For the experiment, after regeneration of NADH for 2 hours by the method of Example 4, ThT-insulin nanofibers were separated from the reaction medium by centrifugation at 15,000 rpm for 30 minutes and reused.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, ThT-인슐린 나노섬유가 세번째 사용 후에도 원래 활성의 94% 이상을 유지하는 것을 알 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 16, it was found that the ThT-insulin nanofibers maintained 94% or more of the original activity even after the third use.

실시예 6: 산화한원효소가 결합된 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유 복합체의 제조Example 6: Preparation of ThT-Insulin Hybrid Nanofiber Composite Conjugated with Oxidative Hanwon Enzyme

산화환원효소로 L-글루타메이트 디하이드로게나아제(l-glutamate dehydrogenase, GDH)를 사용하여, 상기 산화환원효소를 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유에 결합시켜 인공광합성용 복합체를 제조하였다. Using L-glutamate dehydrogenase (GDH) as an oxidoreductase, the oxidoreductase was bound to ThT-insulin hybrid nanofibers to prepare a composite for artificial photosynthesis.

40U의 GDH를 함유한 100 x 10-3M 포스페이트 버퍼(pH 7.5)에 EDC(1- 에틸 -3- (3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드)와 NHS(N- 하이드록시 석신이미드)를 첨가하여 최종농도 10 x 10-3M EDC와 5 x 10-3M NHS의 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 진탕기에서 반응시켰다. 상기 혼합물에 인슐린 나노섬유 (5mg/mL)를 첨가하고, 접합 반응을 위해 3시간 동안 반응시킨 후, 4 ℃에서 밤새 보관하였다. 생성된 인슐린-GDH 용액을 Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치 (10000 MWCO, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 3 회 투석한 후, 포스페이트 버퍼 (100 X 10-3M, pH 7.5)로 세척하여, GDH가 결합된 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유를 수득하였다. EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and NHS (N-hydroxysuccinimide) in 100 x 10 -3 M phosphate buffer (pH 7.5) containing 40 U of GDH ) Was added, and a mixture of a final concentration of 10 x 10 -3 M EDC and 5 x 10 -3 M NHS was reacted on a shaker at room temperature for 1 hour. Insulin nanofibers (5mg/mL) were added to the mixture, and after reacting for 3 hours for the conjugation reaction, the mixture was stored at 4°C overnight. The resulting insulin-GDH solution was dialyzed 3 times using a Slide-A-Lyzer MINI dialysis device (10000 MWCO, Thermo Fisher Scientific, USA), and then washed with phosphate buffer (100 X 10 -3 M, pH 7.5). , GDH-bound ThT-insulin hybrid nanofibers were obtained.

실시예 7: 산화한원효소가 결합된 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유 복합체를 이용한 NADH 재생 및 L-글루타메이트 제조Example 7: NADH regeneration and L-glutamate preparation using ThT-insulin hybrid nanofiber composite with oxidative hanwon enzyme conjugated

실시예 6에서 제조한 산화한원효소로 GDH가 결합된 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유 복합체 또는 ThT-인슐린 하이브리드 나노섬유를 이용하여, NADH의 농도 변화 및 α- 케토글루타레이트를 L-글루타메이트로 전환을 확인하였다. Using the ThT-insulin hybrid nanofiber complex or ThT-insulin hybrid nanofiber conjugated with the oxidative hanwon enzyme prepared in Example 6, the concentration of NADH and α-ketoglutarate converted to L-glutamate Was confirmed.

효소전환반응은 1 X 10-3M NAD +, 500 X 10-6mM, 5 X 10-3M α- 케토글루타레이트, 100 X 10-3M (NH4)2SO4, 40U의 GDH 및 1M TEOA을 함유하는 아르곤 - 퍼지된 100 X 10-3M 포스페이트 완충액 (pH 7.5)을 사용하여 수행하였다. L-글루타메이트의 농도는 Atlantis T3 컬럼 (Waters, USA)이 장착된 1260 Infinity 액체 크로마토그래피 시스템 (Agilent Technologies, US)을 사용하여 측정하였으며, 샘플은 1.0 mL/min의 유속에서 인산(0.05 %)으로 용리시키고 214nm에서 검출하였다.Enzyme conversion reaction is 1 X 10 -3 M NAD +, 500 X 10 -6 mM, 5 X 10 -3 M α-ketoglutarate, 100 X 10 -3 M (NH 4 )2SO 4 , 40U of GDH and This was done using argon-purged 100 X 10 -3 M phosphate buffer (pH 7.5) containing 1M TEOA. The concentration of L-glutamate was measured using a 1260 Infinity liquid chromatography system (Agilent Technologies, US) equipped with an Atlantis T3 column (Waters, USA), and the sample was phosphoric acid (0.05%) at a flow rate of 1.0 mL/min. It was eluted and detected at 214 nm.

도 17a에 나타난 바와 같이, GDH가 결합된 ThT-인슐린 나노섬유를 사용한 경우에는 NADH 농도가 점차적으로 감소하였으며 (약 10 x 10-6M/min), 이는 GDH 활성이 정제 과정 후에 잘 보존되었음을 나타낸다(도 17a).As shown in FIG. 17A, when using ThT-insulin nanofibers bound to GDH, the NADH concentration gradually decreased (about 10 x 10 -6 M/min), indicating that GDH activity was well preserved after the purification process. (Fig. 17a).

α- 케토글루타르산을 l-글루타메이트로 효소적으로 전환시키는 것과 짝지어 일어나는 NAD+에서 광화학적 NADH 재생에 ThT-GDH- 인슐린 나노섬유를 적용하였다.ThT-GDH-insulin nanofibers were applied to photochemical NADH regeneration in NAD+ that occurs in conjunction with enzymatic conversion of α-ketoglutaric acid to l-glutamate.

그 결과, 도 17b에 나타난 바와 같이, 암조건에서는 l-글루타메이트로의 효소적 전환이 확인되지 않았으며, ThT가 결합되지 않은 본래의 인슐린 나노섬유의 존재 하에서 광조사를 한 경우에도 l-글루타메이트로의 효소적 전환이 일어나지 않았다. 자유 ThT 분자는 3시간 반응 (TOF 약 0.098/h) 후에도 거의 전환을 일으키지 않았다. ThT-GDH-인슐린 나노섬유로의 광조사 시에, l-글루타메이트로의 효소적 전환이 급격한 증가되었으며, 이는 TOF가 0.92/h로 3 시간 후에 0.917 x 10-3M의 l-글루타메이트의 전환율을 나타내었으며, 이는 ThT-인슐린 나노섬유가 결합된 GDH와 광화학적 NADH 재생과 산호환원효소에 의한 효소적 전환이 효과적으로 결합되어 일어나는 것을 알 수 있다. As a result, as shown in FIG. 17B, enzymatic conversion to l-glutamate was not confirmed under dark conditions, and even when irradiated with light in the presence of the original insulin nanofibers to which ThT was not bound, it was converted to l-glutamate. Enzymatic conversion of did not occur. Free ThT molecules did little conversion even after 3 hours reaction (TOF about 0.098/h). Upon light irradiation with ThT-GDH-insulin nanofibers, enzymatic conversion to l-glutamate was rapidly increased, which resulted in a TOF of 0.92/h, resulting in 0.917 x 10 -3 M conversion of l-glutamate after 3 hours. It can be seen that GDH to which ThT-insulin nanofibers are bound, photochemical NADH regeneration, and enzymatic conversion by coral reductase are effectively combined.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby. will be. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (23)

삭제delete 삭제delete 인슐린 나노섬유 자기조립형 아밀로이드에 티오블라빈-티(ThT)가 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체에 산화환원효소가 결합되어 있는 인공광합성용 복합체.
Insulin nanofiber self-assembled amyloid and thioblavin-T (ThT) hybrid nanostructures are bonded to the oxidoreductase complex for artificial photosynthesis.
 제3항에 있어서, 상기 산화환원효소는 GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(Alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase) 및 SDH(succinic dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인공광합성용 복합체.
The method of claim 3, wherein the oxidoreductase is GDH (glutamate dehydrogenase), ADH (Alcohol dehydrogenase), G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH (lactic dehydrogenase), MDH (malate dehydrogenase), and SDH (succinic dehydrogenase). Artificial photosynthesis complex, characterized in that selected from the group consisting of.
 제3항에 있어서, 상기 산화환원효소는 상기 복합체의 자기조립형 아밀로이드에 커플링제를 매개로 아미노결합으로 결합되는 것을 특징으로 하는 인공광합성용 복합체.
4. The complex for artificial photosynthesis according to claim 3, wherein the oxidoreductase is coupled to the self-assembled amyloid of the complex through an amino bond via a coupling agent.
 (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (iii) 전자전달매개체 및 (iv) 집광재(light harvester)로서 인슐린 나노섬유 자기조립형 아밀로이드에 티오블라빈-티(ThT)가 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체를 함유하는 보조인자의 재생용 조성물.
(i) NAD + , NADP + , oxidized cofactor selected from the group consisting of FAD + and FMN + , (ii) electron donor, (iii) electron transport medium and (iv) light harvester ) As a composition for regeneration of cofactors containing a hybrid nanostructure in which thioblavin-T (ThT) is bound to insulin nanofiber self-assembled amyloid.
 제6항에 있어서, 상기 전자주개는 트리에탄올아민(TEOA, triethanolamine), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid), 시트르산(Citric acid), 포름산(Formic acid), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid) 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 6, wherein the electron donor is triethanolamine (TEOA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid, formic acid, ascorbic acid, oxalic acid. (Oxalic acid) and a composition, characterized in that selected from the group consisting of water.
 제6항에 있어서, 상기 전자전달매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
The composition of claim 6, wherein the electron transport medium is selected from the group consisting of methylviologen, ruthenium II complex, and rhodium III complex.
 제8항에 있어서, 상기 로듐(III)복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H2O]2+인 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 8, wherein the rhodium (III) complex is (pentamethylcyclopentadienyl-2,2'-bipyridinechloro) rhodium (III): [Cp * Rh(bpy)H 2 O] 2+ Composition characterized by.
 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항의 보조인자의 재생용 조성물에 빛을 조사하는 단계를 포함하는 보조인자의 광학적 재생방법.
An optical reproduction method of a cofactor comprising the step of irradiating light to the composition for reproduction of any one of claims 6 to 9.
 제10항에 있어서, 상기 빛은 텅스텐-할로겐 램프광, 제논 램프광, 단파장 레이저광 및 태양광으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보조인자의 광학적 재생방법.
11. The method of claim 10, wherein the light is selected from the group consisting of tungsten-halogen lamp light, xenon lamp light, short wavelength laser light, and sunlight.
 (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (iii) 전자전달매개체, (iv) 집광재(light harvester)로서 인슐린 나노섬유 자기조립형 아밀로이드에 티오블라빈-티(ThT)가 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체, (v) 산화환원효소 및 (vi) 산화환원효소의 기질을 함유하는 인공광합성용 조성물.
(i) Oxidation type cofactor selected from the group consisting of NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) electron donor, (iii) electron transport medium, (iv) light harvester ) As insulin nanofiber self-assembled amyloid with thioblabine-T (ThT) is a hybrid nanostructure, (v) an oxidoreductase and (vi) a composition for artificial photosynthesis containing a substrate of an oxidoreductase.
 제12항에 있어서, 상기 전자주개는 트리에탄올아민(TEOA, triethanolamine), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid), 시트르산(Citric acid), 포름산(Formic acid), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid) 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 12, wherein the electron donor is triethanolamine (TEOA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid, formic acid, ascorbic acid, and oxalic acid. (Oxalic acid) and a composition, characterized in that selected from the group consisting of water.
 제12항에 있어서, 상기 전자전달매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는조성물.
The composition of claim 12, wherein the electron transport medium is selected from the group consisting of methylviologen, ruthenium II complex, and rhodium III complex.
 제14항에 있어서, 상기 로듐(III)복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H2O]2+인 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 14, wherein the rhodium (III) complex is (pentamethylcyclopentadienyl-2,2'-bipyridinechloro) rhodium (III): [Cp * Rh(bpy)H 2 O] 2+ Composition characterized by.
 제12항에 있어서, 상기 산화환원효소는 GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(Alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase) 및 SDH(succinic dehydrogenase)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 12, wherein the oxidoreductase is GDH (glutamate dehydrogenase), ADH (Alcohol dehydrogenase), G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH (lactic dehydrogenase), MDH (malate dehydrogenase), and SDH (succinic dehydrogenase). Composition, characterized in that selected from the group consisting of.
 (i) NAD+, NADP+, FAD+ 및 FMN+으로 구성된 군에서 선택되는 산화형 보조인자, (ⅱ) 전자주개(electron donor), (iii) 전자전달매개체 및 (iv)제3항의 인공광합성용 복합체 및 (v) 산화환원효소의 기질을 함유하는 인공광합성용 조성물.
(i) Oxidative cofactor selected from the group consisting of NAD + , NADP + , FAD + and FMN + , (ii) electron donor, (iii) electron transport medium and (iv) artificial photosynthesis of paragraph 3 A composition for artificial photosynthesis containing a complex and (v) an oxidoreductase substrate.
 제17항에 있어서, 상기 전자주개는 트리에탄올아민(TEOA, triethanolamine), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid), 시트르산(Citric acid), 포름산(Formic acid), 아스코르빈산(Ascorbic acid), 옥살산(Oxalic acid) 및 물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 17, wherein the electron donor is triethanolamine (TEOA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid, formic acid, ascorbic acid, and oxalic acid. (Oxalic acid) and a composition, characterized in that selected from the group consisting of water.
 제17항에 있어서, 상기 전자전달매개체는 메틸비올로겐, 루테늄 II 복합체 및 로듐 III 복합체로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는조성물.
The composition of claim 17, wherein the electron transport medium is selected from the group consisting of methylviologen, ruthenium II complex, and rhodium III complex.
 제19항에 있어서, 상기 로듐(III)복합체는 (펜타메틸사이클로펜타디에닐-2,2'-비피리딘클로로)로듐(III):[Cp*Rh(bpy)H2O]2+인 것을 특징으로 하는 조성물.
The method of claim 19, wherein the rhodium (III) complex is (pentamethylcyclopentadienyl-2,2'-bipyridinechloro) rhodium (III): [Cp * Rh(bpy)H 2 O] 2+ Composition characterized by.
 다음 단계를 포함하는 인공광합성 방법:
(a) 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항의 인공광합성 조성물에 빛을 조사하여 보조인자를 광학적으로 재생시키는 단계; 및
(b) 상기 재생된 보조인자를 산화환원효소의 기질의 산화환원 반응에 사용하여 유용물질을 제조하는 단계.
Artificial photosynthesis method comprising the following steps:
(a) optically regenerating a cofactor by irradiating light to the artificial photosynthetic composition of any one of claims 12 to 20; And
(b) preparing a useful substance by using the regenerated cofactor in a redox reaction of a substrate of an oxidoreductase.
 제21항에 있어서, 상기 빛은 텅스텐-할로겐 램프광, 제논 램프광, 단파장 레이저광 및 태양광으로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.
The artificial photosynthesis method according to claim 21, wherein the light is selected from the group consisting of tungsten-halogen lamp light, xenon lamp light, short wavelength laser light, and sunlight.
 제21항에 있어서, 상기 유용물질은 GDH(glutamate dehydrogenase), ADH(Alcohol dehydrogenase), G6PDH(glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH(lactic dehydrogenase), MDH(malate dehydrogenase) 및 SDH(succinic dehydrogenase)로 구성되는 군에서 선택되는 효소에 의하여 환원되는 물질인 것을 특징으로 하는 인공광합성 방법.
The method of claim 21, wherein the useful substance is GDH (glutamate dehydrogenase), ADH (Alcohol dehydrogenase), G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase), LDH (lactic dehydrogenase), MDH (malate dehydrogenase) and SDH (succinic dehydrogenase). Artificial photosynthesis method, characterized in that the material reduced by an enzyme selected from the group consisting of.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999006545A2 (en) * 1997-08-01 1999-02-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
KR20130117548A (en) * 2012-04-18 2013-10-28 한국과학기술원 Method for regenerating cofactors using hydrogen-terminated silicon nanowires and method of biocatalyzed artificial photosynthesis using the same
KR20140020533A (en) * 2012-08-09 2014-02-19 한국과학기술원 Self-assembled dipeptide/porphyrin nanotube and photocatalytic production method of oxidoreductase cofactors using the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999006545A2 (en) * 1997-08-01 1999-02-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
KR20130117548A (en) * 2012-04-18 2013-10-28 한국과학기술원 Method for regenerating cofactors using hydrogen-terminated silicon nanowires and method of biocatalyzed artificial photosynthesis using the same
KR20140020533A (en) * 2012-08-09 2014-02-19 한국과학기술원 Self-assembled dipeptide/porphyrin nanotube and photocatalytic production method of oxidoreductase cofactors using the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem Soc Rev.,46:4661-4708(2017.)* *
J Phys Chem B.,113(31):10830-10837(2009.8.6.)* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113789171A (en) * 2021-08-24 2021-12-14 北京化工大学 Compound for beta-amyloid protein in vivo detection and preparation method and application thereof

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