KR102177632B1 - 분리제 - Google Patents

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KR102177632B1
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Abstract

본 발명은 담체와, 담체의 표면에 화학 결합에 의해 담지된 리간드를 갖는 분리제에 있어서, 상기 담체가, 무공성의 코어와 다공성의 쉘을 포함하는 코어-쉘형 입자이며, 해당 쉘의 세공 직경이 9㎚ 이상이고, 해당 쉘이 폴리알콕시실록산의 가수분해물을 포함하고, 상기 리간드가 광학 활성 중합체, 광학 불활성의 폴리에스테르, 단백질, 핵산, 분자량 50 내지 1000의 광학 활성의 유기 화합물인 것을 특징으로 하는 분리제를 제공한다.

Description

분리제{SEPARATING AGENT}
본 발명은 특정한 담체와, 해당 담체의 표면에 화학적 결합에 의해 담지된 특정한 리간드를 갖는 분리제에 관한 것이다.
의약, 농약, 생화학 관련의 산업 분야에 있어서는, 생산 대상으로 하는 목적 물질을 분리·정제하는 것은 매우 중요한 과제이며, 그러한 분리 기술로서 분리제를 사용하는 방법은 예전부터 행해지고 있는 것이다. 그러한 분리제가 분리 대상으로 하는 물질을 분리하는 원리로서는, 분리제와 목적 물질의 친화성을 이용하는 것이나, 분리제와 목적 물질의 광학 활성을 이용하는 것이 있다.
상기 분리제로서는, 종래부터 전공성(全孔性)의 실리카 겔을 담체로 하고, 그 담체 상에 분리 대상으로 하는 목적 물질에 따라 다양한 리간드를 담지시킨 것이 알려져 있다.
전공성의 실리카 겔을 담체로서 사용하여 얻어지는 분리제로서는, 예를 들어 광학 활성 중합체를 담지시킨 것이 알려져 있다. 이러한 광학 활성 중합체가 담체에 담지된 분리제를 사용한 경우에는 광학 분할을 행하는 것이 가능해진다.
상기 광학 활성 중합체로서는, 셀룰로오스 등의 다당을 유도체화한 다당 유도체(예를 들어, 특허문헌 1 참조), 광학 활성의 폴리(메트)아크릴산아미드(예를 들어, 특허문헌 2 참조), 광학 활성의 폴리아미노산(예를 들어, 특허문헌 3 참조), 광학 활성의 폴리아미드(예를 들어, 특허문헌 4 및 5 참조)가 보고되고 있다.
한편, 광학 활성의 저분자 화합물(예를 들어 비나프틸 구조나 크라운에테르 구조를 갖는 화합물)이 담체에 화학적 결합에 의해 결합된 광학 이성체의 분리제도 알려져 있다(예를 들어, 특허문헌 6 참조).
또한, 가교 구조를 갖는 합성 고분자를 포함하는 입자를 담체로 하고, 그 담체 상에 리간드로서 단백질이나 당쇄를 갖는 당단백질을 담지하는 분리제도 보고되고 있다(예를 들어, 특허문헌 7 참조).
또한, 담체에 핵산을 담지시킨 것에 대해서는, 예를 들어 유리 기판 위에 키토산을 개재하여 DNA를 고정화하는 기술이 알려져 있다(예를 들어, 특허문헌 8 참조).
나아가, 이온성 고분자를 동정하기 위하여 사용하는 칩으로서, 유리와 같은 담체에 DNA나 RNA 등을 담지시키는 기술도 알려져 있다(예를 들어, 특허문헌 9 참조).
리간드를 담지하기 위하여 사용되는 담체로서는, 종래부터 전공성의 실리카 겔이 사용되고 있다. 이것에 대하여, 전공성의 입자뿐만 아니라, 무공성의 코어를 갖고, 그의 외면에 다공성의 쉘을 갖는 코어-쉘형의 입자도 알려져 있다(예를 들어, 특허문헌 10 참조). 이러한 코어-쉘형 입자 중, 세공 직경이 10㎚인 것에 셀룰로오스 트리스(4-클로로-3-메틸페닐카르바메이트)를 물리적 흡착에 의해 담지시켜 이루어지는 광학 이성체용 분리제도 알려져 있다(예를 들어, 비특허문헌 1).
국제 공개 제2008/102920호 국제 공개 제02/088204호 일본 특허 공개 (평)10-128089호 공보 일본 특허 공개 (평)11-335306호 공보 일본 특허 공개 제2009-91535호 공보 일본 특허 공개 제2003-327675호 공보 일본 특허 공개 제2012-18135호 공보 일본 특허 공개 제2010-77022호 공보 일본 특허 공개 제2003-284552호 공보 일본 특허 공개 (소)49-36396호 공보 일본 특허 공개 (평)07-138301호 공보 국제 공개 제2012/050124호
J. Chromatogr. A 1234, 50-55(2012) J. Chromatogr. 363, 173(1986)
본 발명은 담체로서 코어-쉘형의 입자를 사용하고, 이 위에 화학 결합에 의해 다양한 리간드를 담지시켜 얻어지는 신규한 분리제를 제공한다.
본 발명자들은 분리제에 사용하는 담체로서, 종래부터 사용되고 있는 실리카 겔과 같은 전공성의 입자가 아니라, 무공성의 코어와 다공성의 쉘을 포함하는 코어-쉘형의 입자를 사용하고, 이것에 다양한 리간드를 담지시켜 얻어지는 분리제가 다양한 목적 물질의 분리에 유용한 것을 발견했다.
즉 본 발명은, 담체와, 담체의 표면에 화학 결합에 의해 담지된 리간드를 갖는 분리제에 있어서, 상기 담체가 무공성의 코어와, 다공성의 쉘을 포함하는 코어-쉘형 입자이며, 해당 쉘의 세공 직경이 9㎚ 이상이고, 해당 쉘은 폴리알콕시실록산의 가수분해물을 포함하고, 상기 리간드가 광학 활성 중합체, 광학 불활성의 폴리에스테르, 단백질 또는 핵산인 것을 특징으로 하는 분리제를 제공한다.
<코어-쉘형 입자>
본 발명의 분리제에는, 무공성의 코어와 그의 외면에 다공성의 쉘을 갖는 코어-쉘형 입자를 사용한다. 또한, 그 코어-쉘형 입자 표면의 세공 직경은 9㎚ 이상이다.
코어-쉘형 입자의 세공 직경이 9㎚ 이상임으로써 비표면적이 크고, 리간드를 많이 도입할 수 있는 점에서, 목적 물질의 양호한 분리에 기여하는 것이 기대된다. 세공 직경은 통상 100㎚ 이하이다.
코어-쉘 입자의 세공 직경은 수은 압입법에 의해 측정할 수 있다.
수은 압입법은 압력을 가하여 수은을 개공부에 침입시켜, 압력값과 대응하는 침입 수은 부피를 사용하여, 원주상이라고 가정한 세공의 직경을 워시번(Washburn)의 식으로부터 산출하는 방법이며, 세라믹스 성형체에 대하여 규정된 JIS R1655를 준용할 수 있다.
여기서 본 발명에서 말하는 무공성이란, BET법에 의해 측정되는 코어 입자 표면의 비표면적(㎡/g)을 A로 하고, 코어 입자의 입경으로부터 구해지는 표면적(입자 반경 r로부터 산출되는 4πr2)으로부터 산출할 수 있는 단위 중량당의 표면적(㎡/g)을 B로 했을 때, (A-B)/B×100이 20 미만인 것을 말한다.
한편, 본 발명에서 말하는 다공성이란, BET법에 의해 측정되는 그의 표면의 비표면적이 10㎟/g 이상인 것을 말한다.
코어-쉘형 입자의 코어와 쉘의 두께의 비는 통상 1:9 내지 9:1이다. 이 비는 목적 물질의 양호한 분리 특성을 확보하는 관점에서, 4:1 내지 2:1인 것이 바람직하다. 이 비에 대해서는, 후술하는 바와 같이 코어-쉘 입자의 쉘 층의 두께를 조정함으로써 조정 가능하다.
여기서 코어의 두께란, 코어의 직경을 말한다.
코어-쉘형 입자를 구성하는 코어의 재료는 무기 물질이며, 그의 구체예로서는, 유리, 티타늄 및 지르코늄과 같은 금속 또는 그의 금속 산화물 및 벤토나이트나 운모 등의 점토 광물로 대표되는 것으로부터 선택되는 것이며 무공성의 입자를 바람직하게 들 수 있다.
상기 코어의 재료가 되는 입자는 그의 입경이 0.1㎛ 이상인 것이 바람직하고, 0.5㎛ 이상인 것이 보다 바람직하고, 1㎛ 이상인 것이 특히 바람직하다. 한편, 상기 코어의 재료가 되는 입자의 입경은 200㎛ 이하인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 100㎛ 이하인 것이 보다 바람직하고, 50㎛ 이하인 것을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
코어-쉘형 입자의 입경은 통상 0.2㎛ 이상, 1000㎛ 이하인 것을 사용한다. 또한, 본 발명에서 말하는 코어-쉘형 입자의 입경은, 원심 침강법에 의한 평균 입경의 측정 방법에 의해 측정되는 입경을 의미한다.
코어-쉘형 입자를 구성하는 쉘의 재료로서는, 알콕시실란의 부분 가수분해에 의해 얻어지는 폴리알콕시실록산을 더 가수분해시킨 것이다. 이러한 재료인 것이 코어-쉘형 입자를 용이하게 제조할 수 있는 관점에서 바람직하다.
상기 알콕시실란으로서는 테트라알콕시실란인 것이 바람직하고, 그 중에서도, 테트라메톡실란, 테트라에톡시실란, 테트라프로폭시실란, 테트라부톡시실란을 사용하는 것이 바람직하고, 테트라에톡시실란을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자의 제작에 있어서는, 일본 특허 공개 (소)49-36396호 공보를 참조할 수 있다. 구체적으로는, 먼저, 알콕시실란에 대하여 부분 가수분해를 행하여 폴리알콕시실록산을 생성시킨다. 그리고, 그에 의해 얻어진 폴리알콕시실록산을 에테르, 아세톤, 디클로로메탄과 같은 용매에 용해시켜 폴리알콕시실록산의 용액을 제조한다. 이 용액을 상기 코어가 되는 입자에 도포 또는 상기 코어 입자를 이 용액에 침지시키고, 그 후에 용매를 제거함으로써, 코어 입자의 표면에 폴리알콕시실록산을 쉘로서 적층시킨다. 그리고 그 후, 적층시킨 폴리알콕시실록산에 대하여, 물의 존재 하에서 중축합(가수분해)을 행한다. 이에 의해, 코어-쉘형 입자를 얻을 수 있다.
코어-쉘형 입자를 구성하는 쉘의 두께는 0.1 내지 100㎛의 범위에서 적절히 조정하는 것이 가능하고, 그 방법으로서 쉘이 되는 알콕시실란의 점도를 조정하는 것을 들 수 있으며, 예를 들어 쉘의 두께를 두껍게 하는 경우에는 알콕시실란의 점도를 낮게 하는 것을 들 수 있다.
또한, 쉘의 비표면적 및 세공 직경의 조정 방법으로서는, 쉘을 적층하고, 중축합을 행할 때에 사용하는 수용액의 pH를 조정하는 것을 들 수 있으며, 예를 들어 비표면적 및 세공 직경을 크게 하는 경우에는 pH를 증가시키는 것을 생각할 수 있다.
여기서 쉘의 두께란, 코어-쉘형 입자의 직경으로부터 코어의 직경을 빼고, 그 값을 2로 나눈 값을 의미한다.
상기 코어-쉘형 입자는 시판품으로서 판매되고 있는 「코어-쉘형 실리카 겔」을 사용할 수도 있다. 그러한 시판품에서는, 카탈로그값으로서 상기 범위의 세공 직경이나 비표면적, 입경을 갖는 것이다. 또한, 그러한 시판되고 있는 코어-쉘형 실리카 겔에서는, 코어가 유리를 포함하고, 쉘이 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)을 포함하는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 분리제의 담체로서 사용하는 코어-쉘형 입자는 표면 처리를 행할 수도 있다. 표면 처리의 방법으로서는, 3-아미노프로필트리에톡시실란 등의 아미노기를 갖는 실란 커플링제를 사용하는 방법을 들 수 있다.
이러한 표면 처리에 의해 도입되는 아미노기는, 후술하는 리간드와의 화학 결합을 행할 때의 반응기로서 이용할 수도 있다.
<리간드>
본 발명에서 말하는 「리간드」란, 담체가 되는 코어-쉘형 입자에 담지되는 것으로서, 분리 대상으로 하는 목적 물질에 대하여 물리적인 친화성을 나타내거나 또는 비대칭 인식이 가능한 것을 의미한다.
1. 광학 활성 중합체
본 발명의 분리제에 사용할 수 있는 리간드로서, 광학 활성 중합체를 들 수 있다. 본 발명에서 말하는 광학 활성 중합체는 당해 중합체를 용해시킨 용액에 대하여, 평면 편광을 투과시켰을 때 편광면을 회전시키는 선광성, 즉 키랄성(chirality)을 갖는 중합체를 말한다.
보다 구체적으로는, 광학 활성 중합체를 구성하기 위한 단량체가 광학 활성을 갖거나, 광학 불활성의 단량체를 광학 활성의 중합 촉매를 사용하여 중합시켜, 분자량이 1,000 내지 1,000,000이다.
1-(1) 다당 또는 그의 유도체
본 발명에서 사용하는 리간드가 되는 광학 활성 중합체로서, 다당 또는 그의 유도체를 들 수 있다. 그러한 다당으로서는, 예를 들어 β-1,4-글루칸(셀룰로오스), α-1,4-글루칸(아밀로오스, 아밀로펙틴), α-1,6-글루칸(덱스트란), β-1,6-글루칸(푸스툴란), β-1,3-글루칸(커들란, 시조피란), α-1,3-글루칸, β-1,2-글루칸(크라운 골(crown-gall) 다당), β-1,4-갈락탄, β-1,4-만난, α-1,6-만난, β-1,2-프럭탄(이눌린), β-2,6-프럭탄(레반), β-1,4-크실란, β-1,3-크실란, β-1,4-키토산, β-1,4-N-아세틸키토산(키틴), 풀루란, 아가로오스, 알긴산, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 니게랑 및 아밀로오스를 함유하는 전분 등을 들 수 있다.
이 중에서, 바람직하게는 고순도의 다당을 용이하게 얻을 수 있는 셀룰로오스, 아밀로오스, β-1,4-키토산, 키틴, β-1,4-만난, β-1,4-크실란, 이눌린, 커들란, 풀루란, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 니게랑 등이며, 더욱 바람직하게는, 셀룰로오스, 아밀로오스, 풀루란, 니게랑이다.
다당의 수 평균 중합도(1분자 중에 포함되는 피라노오스 또는 푸라노오스환의 평균수)는 바람직하게는 5 이상, 보다 바람직하게는 10 이상이며, 특별히 상한은 없지만, 1000 이하인 것이 취급의 용이함 면에서 바람직하고, 보다 바람직하게는 5 내지 1000, 더욱 바람직하게는 10 내지 1000, 특히 바람직하게는 10 내지 500이다.
이들 다당에 대하여, 예를 들어 셀룰로오스나 아밀로오스를 화학적으로 수식한 에스테르 유도체나 카르바메이트 유도체 등을 본 발명의 리간드로서 사용할 수 있다.
이러한 다당 유도체는, 키랄 고정상으로서 높은 광학 분할능을 갖는 것이 알려져 있다.
에스테르 유도체나 카르바메이트 유도체의 구체예로서, 예를 들어 일본 특허 공고 (평)4-42371호 공보에는, 페닐카르바메이트의 방향족환의 수소의 일부가 할로겐(불소 또는 염소)으로 치환된 치환기에 의해, 셀룰로오스의 수산기가 수식되어 이루어지는 셀룰로오스 유도체나, 일본 특허 공개 제2005-315668호 공보에 기재되어 있는, 페닐카르바메이트의 방향족환의 수소의 일부가 불소, 알킬기 또는 알콕시기로 치환된 치환기에 의해, 셀룰로오스 또는 아밀로오스의 수산기가 수식된 셀룰로오스 유도체 및 아밀로오스 유도체에 대해서도 본 발명의 리간드로서 사용 가능하다.
상기한 다당 또는 그의 유도체 중, 분리 대상으로 하는 광학 이성체의 분리 성능의 관점이나 코어-쉘형 입자에 담지시킬 때의 용이함 때문에, 상기 다당 유도체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
다당 유도체에 대해서는, 상기한 것에 한하지 않고 적절히 사용하는 것이 가능하다.
상기 다당 또는 그의 유도체를 코어-쉘형 입자에 화학 결합에 의해 담지시키기 위해서는, 코어-쉘형 입자와 다당 유도체 사이에서의 화학 결합, 제3 성분을 사용한 화학 결합, 담체 상의 다당 유도체로의 광조사, γ선 등의 방사선 조사, 마이크로파 등의 전자파 조사 등에 의해 야기되는 반응, 라디칼 개시제 등을 사용하는 라디칼 반응에 의한 화학 결합을 들 수 있다.
코어-쉘형 입자와 다당 유도체 사이에서의 화학 결합은, 예를 들어 일본 특허 공개 (평)07-138301호 공보에 기재되어 있는 바와 같이, 환원 말단을 갖는 다당의 환원 말단을, 표면 처리한 담체와, 예를 들어 알데히드기와 아미노기로 시프 염기를 형성 후, 환원제 존재 하에서 환원하고, ２급 아민으로 하는 방법(문헌[Glycoconjugate J(1986) 3, 311-319, 엘리자베스 칼린(ELISABETH KALLIN)] 등 참조)(이후, 환원 아미노화법이라고 약칭함)에 의해 화학 결합시킨 후, 다당을 유도체화하여 원하는 광학 이성체 분리용 충전제를 얻는다는 방법을 사용할 수 있다.
코어-쉘형 입자 상의 다당 유도체를 제3 성분을 사용하여 화학 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어 일본 특허 공개 제2002-148247호 공보의 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 비닐기 등의 중합성기를 도입한 중합성 다당 유도체와, 역시 비닐기 등의 중합성기를 도입한 코어-쉘형 입자를, 비닐기 등을 갖는 제3 성분(중합성 단량체)의 존재 하에서 공중합시키는 방법을 사용할 수 있다.
코어-쉘형 입자와 다당 유도체를 광조사에 의해 화학 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어 일본 특허 공표 평(11)-510193호 공보의 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 다당 유도체를 코어-쉘형 입자 상에 도포하여 담지시킨 후, 이것에 침지성 수은등에 의해 광을 조사하여 다당 유도체를 광화학적으로 가교시키는 방법을 사용할 수 있다.
코어-쉘형 입자 상에 도포한 다당 유도체를 γ선 등의 방사선 조사, 마이크로파 등의 전자파 조사에 의해 화학 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어 일본 특허 공개 제2004-167343호 공보에 기재되어 있는 바와 같이, 다당 유도체를, 표면 처리한 코어-쉘형 입자 상에 도포한 후, 이것에 γ선을 조사하여 다당 유도체를 화학 결합시키는 방법을 사용할 수 있다.
기타, 코어-쉘형 입자와 다당 유도체를 화학적으로 결합시키는 방법으로서, 예를 들어 다당 유도체의 수산기 또는 아미노기의 일부에 알콕시실릴기를 도입한 다당 유도체를 코어-쉘형 입자 상에 도포하고, 적당한 용매 중에서 알콕시실릴기에 의한 가교를 형성시킴으로써, 다당 유도체를 화학적으로 결합시키는 방법을 사용할 수도 있다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 다당 또는 그의 유도체의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
1-(2) 폴리(메트)아크릴산아미드
본 발명에서는 리간드가 되는 광학 활성 중합체로서, 폴리(메트)아크릴산아미드를 들 수 있다. 이러한 폴리(메트)아크릴산아미드는 하기 화학식 (I)로 표시되는 (메트)아크릴산아미드 중, 광학 활성의 것을 중합시켜 얻어지는 것이 바람직하게 사용된다.
그러한 중합 반응으로서, 예를 들어 루이스산 촉매 존재 하, AIBN(아조비스이소부티로니트릴) 등의 라디칼 중합 개시제를 사용하는 라디칼 중합을 들 수 있다.
여기에서 사용되는 루이스산은 금속염(MX)인 금속 루이스산이 바람직하며, 예를 들어 스칸듐트리플레이트, 이트륨트리플레이트, 브롬화마그네슘, 염화하프늄, 이테르븀트리플레이트, 루테튬트리플레이트 등을 들 수 있다.
중합 반응에 있어서 (메트)아크릴산아미드가 상온, 상압에서 액체인 경우, 무용제 조건에서도 중합 반응을 행할 수 있지만, 고체인 경우에 사용하는 반응 용매로서는 라디칼 포착 효과가 없는 통상의 어떠한 유기 용제도 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 테트라히드로푸란, 클로로포름, 메탄올 등이다.
그 밖의 중합 조건은 국제 공개 제02/088204호를 참조하여 적절히 조정할 수 있다.
Figure 112015063218404-pct00001
(화학식 중 R1, R2 및 R3은 각각 상이하고, 수소 원자, 탄소수 1 내지 30의 1가 탄화수소기 또는 헤테로 원자를 함유하는 1가의 원자단을 나타내고, R4는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 30의 1가 탄화수소기를 나타내고, R5는 수소 원자 또는 메틸기를 나타냄)
상기 R1, R2 및 R3은 각각 상이하고, 수소 원자, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 아릴기, 아르알킬기, 카르보알콕시기, 카르바모일기, 아미노 치환 알킬기, 아미노기, 알콕시 치환 알킬기, 알콕시기 또는 실릴기이며, R4가 수소 원자, 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 아릴기 또는 아르알킬기인 것이 바람직하다. R4가 수소 원자인 것이 특히 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 폴리(메트)아크릴산아미드의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 상기 폴리(메트)아크릴산아미드를 화학적 결합에 의해 담지시키기 위해서는, 코어-쉘형 입자에 반응성 관능기를 결합시킴과 동시에, 이 반응성 관능기와 폴리(메트)아크릴산아미드가 갖는 아미드기를 반응시키거나, 상기 반응성 관능기와 반응할 수 있는 관능기를 상기 폴리(메트)아크릴산아미드에 도입하고, 이것을 반응시켜 결합시키는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 에폭시기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 코어-쉘형 입자에 에폭시기를 함유시켜 두고, 이 에폭시기와 폴리(메트)아크릴산아미드가 갖는 아미드기를 반응시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 비닐기, (메트)아크릴로일기와 같은 중합성 관능기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 코어-쉘형 입자에 중합성 관능기를 도입시켜 두고, 다른 한편으로 일본 특허 공개 제2006-177795호 공보에 기재된 바와 같이, 상기 폴리(메트)아크릴산아미드에 이소시안산에스테르를 사용함으로써 폴리(메트)아크릴산아미드에도 (메트)아크릴로일기와 같은 중합성 관능기를 도입시키고, 양자의 중합성 관능기를 반응시켜 공중합시켜 화학 결합을 일으키게 하는 방법을 들 수 있다.
1-(3) 폴리아미노산
본 발명에 사용되는 광학 활성 중합체로서, 폴리아미노산을 들 수 있다. 본 발명에서 말하는 폴리아미노산에는, 후술하는 단백질은 포함하지 않는다. 그러한 폴리아미노산으로서는, 하기 화학식 (II)로 표시되는 것을 들 수 있다. 이러한 폴리아미노산은 예를 들어 일본 특허 공개 (소)60-193538호 공보에 기재된 방법으로 합성할 수 있다.
Figure 112015063218404-pct00002
상기 화학식 (II)에 있어서, n은 5 이상이며, R6은 탄소수 1 내지 5의 알킬기, 페닐기 및 탄소수 7 내지 12의 아르알킬기 및 복소환기로부터 선택되는 기이다. 이들 기는, 히드록실기, 카르복실기, 머캅토기, 아미노기 및 메틸티오기와 같은 치환기를 갖고 있을 수도 있다. R7은 탄소수 1 내지 5의 알킬기이며, 메틸기 또는 에틸기인 것이 바람직하다.
복소환기를 구성하는 복소환으로서는, 5-피라졸론, 피라졸, 트리아졸, 옥사졸론, 이소옥사졸론, 바르비투르산, 피리돈, 피리딘, 로다닌, 피라졸리딘디온, 피라졸로피리돈, 멜드럼산 및 이들의 복소환에 탄화수소 방향환이나 복소환이 더 축환된 축합 복소환을 들 수 있다.
상기와 같은 폴리아미노산을 구성하기 위한 α-아미노카르복실산을 예시하면, 알라닌, 발린, 류신, 페닐알라닌, 프롤린, 글루탐산, 아스파라긴산을 들 수 있다. 또한, 아스파라긴산벤질, 글루탐산메틸, 글루탐산벤질, 카르보벤족실리신, 카르보벤족시오르니틴, 아세틸티로신, 벤질세린과 같은 아미노산 유도체도 폴리아미노산의 구성 재료로서 들 수 있다.
상기 화학식 (II)에 있어서, n은 100 이하인 것이 바람직하고, 10 내지 40이 보다 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 폴리아미노산의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 상기 폴리아미노산을 화학적 결합에 의해 담지시키기 위해서는, 코어-쉘형 입자에 반응성 관능기를 결합시킴과 동시에, 이 반응성 관능기와 폴리아미노산이 갖는 아미노기를 반응시키거나, 상기 반응성 관능기와 반응할 수 있는 관능기를 상기 폴리아미노산에 도입하고, 이것을 반응시켜 결합시키는 방법을 들 수 있다.
코어-쉘형 입자에 도입시키는 반응성 관능기로서는, 폴리아미노산이 갖는 아미노기와 반응하는 에폭시기를 도입하는 방법이 있다. 그의 구체적 방법으로서는, 에폭시기를 함유하는 실란 커플링제에 의해, 코어-쉘형 입자를 표면 처리하는 것을 들 수 있다.
또한, 비닐기, (메트)아크릴로일기와 같은 중합성 관능기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 코어-쉘형 입자에 중합성 관능기를 도입시켜 두고, 다른 한편으로 폴리아미노산의 아미노기와 반응할 수 있는 중합성 관능기를 갖는 단량체, 예를 들어 아크릴산클로라이드, 글리시딜메타크릴레이트, 클로로메틸스티렌을 폴리아미노산과 반응시켜, 말단에 비닐기와 같은 중합성 관능기를 도입한 폴리아미노산을 합성하고, 코어-쉘 입자상의 중합성 관능기와 폴리아미노산의 중합성 관능기를 반응시켜 공중합에 의해 화학 결합을 형성하는 방법도 들 수 있다.
1-(4) 폴리아미드
본 발명의 분리제에 사용되는 광학 활성 중합체로서, 폴리아미드를 들 수 있다. 이 폴리아미드로는, 반복 단위의 주쇄에 하나의 광학 활성 아미노산 잔기를 갖는 것이다.
이 광학 활성 폴리아미드의 합성에 관한 단량체 성분으로서, 광학 활성의 디카르복실산인 N-치환 아미노산과 디아민을 채용한 것이다. N-치환 아미노산으로서는, 예를 들어 N-치환 글루탐산이나 N-치환 아스파라긴산을 사용할 수 있고, 디아민으로서는 4,4'-디아미노디페닐메탄이나 1,3-페닐렌디아민과 같은 방향족 디아민을 사용할 수 있다.
상기 폴리아미드의 합성 방법의 일례를 설명한다. 상기 폴리아미드는 상기한 바와 같이 광학 활성의 디카르복실산인 N-치환 아미노산과, 디아민을 중합시킴으로써 합성할 수 있다. 구체적으로는, N-메틸피롤리돈(이하, 「NMP」라고 기재함)과 피리딘(이하, 「Py」라고 기재함)을 예를 들어 용량비 4:1로 혼합한 액에, 염화리튬(이하, 「LiCl」이라고 기재함)을 예를 들어 4중량％ 첨가한 액(이하, 「NMP-Py 혼합 용액」이라고 기재함), 예를 들어 7.5㎤에 소정량의, 예를 들어 3mmol의 벤조일-L-글루탐산(광학 활성의 디카르복실산인 N-치환 아미노산)과, 이들과 등몰량, 예를 들어 3mmol의 4,4'-디아미노디페닐메탄(디아민)과, 이들의 2배의 몰량, 예를 들어 6mmol의 아인산트리페닐을 소정 온도, 예를 들어 80℃에서 교반하면서 소정 시간, 예를 들어 3시간 가열한다. 반응 종료 후, 생성물을 메탄올 중에 적하한 후, 이들을 여과하여 중합체를 얻고, 감압 건조시킨다.
본 발명에 관한 폴리아미드의 합성 방법은 상기한 방법에 한정되는 것은 아니며, 상기 이외의 방법으로 합성할 수도 있다. 또한, 반응에 사용하는 각 시약 및 그의 양에 따라 적합한 반응 온도 및 반응 시간은 상이하다. 상기에 나타낸 반응 시간, 반응 온도 및 시약의 양은 본 발명에 관한 광학 활성 중합체를 얻을 수 있는 조건의 일례이며, 적절히 변경이 가능하다.
본 발명에 관한 폴리아미드는 광학 활성의 디카르복실산인 N-치환 아미노산을 사용하여 합성되고 있기 때문에, 그 중합체 내부에 D- 또는 L-광학 활성체 인식 부위를 갖고, 이 광학 활성체 인식 부위를 이용하여 광학 분할을 행할 수 있다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 폴리아미드의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 상기 폴리아미드를 화학적 결합에 의해 담지시키기 위해서는, 코어-쉘형 입자에 반응성 관능기를 결합시킴과 동시에, 이 반응성 관능기와 폴리아미드가 갖는 아미드기를 반응시키거나, 상기 반응성 관능기와 반응할 수 있는 관능기를 상기 폴리아미드에 도입하고, 이것을 반응시켜 결합시키는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 에폭시기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 코어-쉘형 입자에 에폭시기를 함유시켜 두고, 이 에폭시기와 폴리아미드가 갖는 아미드기를 반응시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 비닐기, (메트)아크릴로일기와 같은 중합성 관능기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 코어-쉘형 입자에 중합성 관능기를 도입시켜 두고, 다른 한편으로 일본 특허 공개 제2006-177795호 공보에 기재된 바와 같이, 상기 폴리아미드에 이소시안산에스테르를 사용함으로써 폴리아미드에도 (메트)아크릴로일기와 같은 중합성 관능기를 도입시키고, 양자의 중합성 관능기를 반응시켜 공중합시켜 화학 결합을 일으키게 하는 방법도 들 수 있다.
2. 광학 불활성의 폴리에스테르
본 발명에서 사용하는 리간드로서, 광학 불활성의 폴리에스테르를 들 수 있다. 그러한 폴리에스테르의 구체예로서, 폴리에스테르로서는, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌·폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리트리메틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리부틸렌나프탈레이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리ε카프로락톤 및 폴리(옥시카르보닐옥시-1,4-페닐렌-2,2-이소프로필리덴-1,4-페닐렌)(비스페놀 A의 폴리카르보네이트) 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 폴리에스테르의 중량 평균 분자량은, 중합체 용해 용매 점성 증가에 따른 취급 용이함의 관점에서 1만 내지 100만이 바람직하고, 2만 내지 20만인 것이 보다 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 상기 폴리에스테르를 화학적 결합에 의해 담지시키기 위해서는, 코어-쉘형 입자에 반응성 관능기를 결합시킴과 동시에, 이 반응성 관능기와 반응할 수 있는 관능기를 상기 폴리에스테르에 도입하고, 이것을 반응시켜 결합시키는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 코어-쉘형 입자에 에폭시기 등의 아미노기와 공유 결합을 형성하는 관능기를, 에폭시기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 도입시켜 두고, 한편 폴리에스테르에 대해서는, 폴리아민을 사용하여 화학 처리를 행하여 상기 폴리에스테르에 아미노기를 도입시킨다.
폴리아민으로서는, 탄소수 2 내지 8의 (폴리)알킬렌폴리아민이 포함되고, 에틸렌디아민, 프로필렌디아민, 부틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민 및 테트라에틸렌펜타민 등을 들 수 있다.
이들 폴리아민 중, 에틸렌디아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라민 및 테트라에틸렌펜타민, 특히 바람직하게는 디에틸렌트리아민을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 아미노기를 적어도 3개 포함하는 폴리아민을 사용하면, 상기 폴리에스테르에 대한 아미노기의 도입이 양호해진다. 또한, 아민은 저분자량이면, 화학 처리 후 제거가 용이하기 때문에 바람직하다.
아민에 의한 화학 처리로서는, 유기 용매와 아민을 포함하는 용액 중에서, 또는 물 및 유기 용매의 혼합 용매와 아민을 포함하는 용액 중에서, 상기 폴리에스테르를 가열 처리하는 방법을 들 수 있다.
상기한 화학 처리를 거친 폴리에스테르와 표면 처리가 실시된 코어-쉘형 입자를 진공 또는 공기 중에서 반응을 일으키게 하여, 코어-쉘형 입자에 폴리에스테르가 화학 결합한 분리제를 얻을 수 있다.
3. 단백질
본 발명의 분리제의 리간드로서, 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 단백질은 분자량 3 내지 300kDa, 바람직하게는 30 내지 150kDa이며, 분리 대상으로 하는 예를 들어 항체와 같은 단백질에 대하여 친화성이 있는 물질을 들 수 있다.
이들 중에서도, 리간드로서 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 알부민 및 이들의 기능성 변이체가 항체의 단백질 분리에 사용할 때의 선택률이 높아 바람직하다.
항체의 분리를 주목적으로 하는 경우, 리간드로서는 면역 글로불린의 일부와 특이적으로 결합 가능한 것이 바람직하다.
상기 기능성 변이체는 천연 아미노산 서열에 있어서 적어도 하나의 변성을 갖고, 천연 서열에 수반되어 있는 적어도 하나의 기능을 여전히 유지하고 있는 단백질을 가리킨다. 천연 서열에는, 본래 자연스럽게 발생하는 아미노산 서열이 포함된다. 아미노산의 변화로서는, 1개 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 1개 이상의 아미노산의 삭제 및/또는 1개 이상의 아미노산의 추가 또는 이들 중 어느 하나의 조합을 들 수 있다. 천연 서열에 대하여 행해지는 추가, 삭제 및 치환의 조합과 같은 형태도 들 수 있다. 기능성 변이체는 단백질의 단편 또는 도메인을 포함할 수도 있다. 기능성 변이체의 아미노산 서열은 천연 아미노산 서열과 적어도 70％ 동일, 적어도 75％ 동일, 적어도 80％ 동일, 적어도 85％ 동일, 적어도 90％ 동일, 적어도 95％ 동일, 적어도 98％ 동일할 수도 있고, 천연 서열에 수반되어 있는 적어도 하나의 기능을 여전히 유지하고 있다.
알부민으로서는, 난백 알부민이나 인간 혈청 알부민(분자량 약 66kDa)을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 단백질로서, 이하에 나타내는 셀로비오히드로라아제 I 및 II로서 알려지는 셀로비오히드로라아제(CBH)를 들 수 있다. 셀로비오히드로라아제 I(CBH I)과 셀로비오히드로라아제 II(CBH II)는 셀룰라아제의 대부분(양자로 80％ 이상, 이 밖에 엔도글루카나아제, β-글루코시다아제 등이 소량 포함됨)을 차지하는 주요 효소인 것이 알려져 있다. 그의 제조 방법으로서는, 유전자 재조합의 기술을 사용하여, 목적의 셀로비오히드로라아제를 숙주 세포에 있어서 대량으로 발현시키는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서는 단백질로서 α1-산성 당단백질을 사용할 수 있다. α1-산성 당단백질의 유래로서는, 인간, 소, 집토끼 등의 포유류, 닭, 백조, 칠면조 등의 조류를 들 수 있다. 그들 중, 바람직한 α1-산성 당단백질의 구체예로서는, 인간 α1-산성 당단백질(이하, 단순히 h-AGP라고도 함)이나 닭 AGP(이하, 단순히 c-AGP라고도 함)를 들 수 있다.
인간 α1-산성 당단백질(h-AGP)은 시판품(예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사)을 사용할 수 있고, 필요에 따라 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제할 수도 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 닭 α1-산성 당단백질(c-AGP)은, 닭 조(粗) 오보무코이드를 양이온 교환 담체(예를 들어, SP-세파로오스(SP-Sepharose))를 사용한 액체 크로마토그래피에 의해, 아세트산암모늄 완충액(pH 4.6)에 의한 단계적 용출법을 사용하여, 오보무코이드와 닭 α1-산성 당단백질(c-AGP)을 분리함으로써 얻어진다.
또한, c-AGP를 포함하는 획분을 분취하여, SP-세파로오스와 같은 이온 교환 크로마토그래피용 담체에 의해 정제를 행할 수도 있다.
상기한 인간 α1-산성 당단백질은, 183개의 아미노산 잔기와 5개의 당쇄를 포함하는 분자량 41000 내지 43000 정도의 당단백질이다. 닭 α1-산성 당단백질은 아미노산 잔기 및 당쇄가 인간 α1-산성 당단백질과 동일하지만, 분자량은 약 30000이다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 단백질의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
상기 코어-쉘형 입자에 상기 단백질을 화학적 결합에 의해 담지시키기 위해서는, 통상 이하와 같은 방법이 사용되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
고정화는, 코어-쉘형 입자에 반응성 관능기를 결합시킨 후에, 이 반응성 관능기와, 단백질이 갖는 관능기를 직접 반응시키는 방법이나, 또는 코어-쉘형 입자에 결합시킨 관능기 및 상기 단백질이 갖는 관능기와 각각 반응 가능한 관능기를 분자 내에 각각 1개 이상 갖는 저분자 또는 고분자 화합물(이하 이러한 화합물을 통합하여 「스페이서」라고 기재함)을 개재하여 결합시키는 방법이 사용된다.
예를 들어 프로테인 A와 같은 아미노기를 갖는 리간드를 고정화하는 경우, 전자의 방법으로서는, 코어-쉘형 입자에 에폭시기 등의 아미노기와 공유 결합을 형성하는 관능기를, 에폭시기를 함유하는 실란 커플링제 등에 의한 표면 처리에 의해 함유시켜 두고, 이들과 프로테인 A를 직접 반응시켜 고정화하는 방법을 예시할 수 있다.
또한, 후자의 방법으로서는, 스페이서로서 아미노산(아민카르복실산)류를 사용하여, 그의 아미노기 부위와 코어-쉘형 입자에 도입한 에폭시기를 반응시킨 후에, 다른 말단의 카르복실기에 의해 프로테인 A의 아미노기와 반응시키는 방법이나, 스페이서로서 디아민이나 디올과 (폴리)에틸렌글리콜디글리시딜에테르 등의 디글리시딜 화합물을 축차적으로 사용하여, 코어-쉘형 입자에 도입한 에폭시기와 디아민 또는 디올의 한쪽 말단을 결합시키고, 다른 말단에 디글리시딜 화합물의 한쪽 에폭시기를 결합시키고, 남은 말단의 에폭시기를 프로테인 A와 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
또한, 상기 방법에서 스페이서의 일부 성분으로서 사용되는 디아민으로서는, 테트라메틸렌디아민, 헥사메틸렌디아민 등의 지방족 디아민류를 들 수 있고, 디올로서는, 프로필렌글리콜, 부탄디올, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜 등의 지방족 디올이나 폴리에틸렌글리콜류를 들 수 있다.
스페이서로서는 리간드와의 반응성이나 고정화 시의 코어-쉘형 입자와의 입체 장해의 관계를 고려하면, 직쇄상의 구조를 갖고 있는 것이 바람직하다. 분지쇄상 구조의 스페이서를 사용하면 입체 장해가 커져, 리간드인 단백질과 분리 대상으로서의 항체와의 친화성 결합 형성을 억제하는 경우가 있어, 분리 성능이 나빠지는 경우가 있다.
또한, 코어-쉘형 입자에 도입하는 관능기로서는, 3-아미노프로필트리에톡시실란을 사용한 3-아미노프로필기도 들 수 있고, 이 경우에는, 코어-쉘형 입자를 미리 탄산디숙신산디이미드(N,N'-디숙신이미딜카르보네이트: DSC)를 반응시켜 두고, 이것에 단백질의 아미노산 잔기의 아미노기를 반응시킬 수도 있다.
4. 핵산
본 발명의 분리제의 리간드로서 핵산을 사용할 수 있다. 그러한 핵산으로서는 특별히 제한은 없지만, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 수식 올리고뉴클레오티드 등을 들 수 있다. 또한, DNA 및 RNA의 유도체도 사용할 수 있고, DNA나 RNA는 천연형일 수도 있고 인공형일 수도 있지만, 분리제로서의 안정성을 고려하면, 구조적으로 안정된 인공형을 사용하는 것이 바람직하다. 인공형에 있어서는 천연형에는 존재하지 않는 서열을 형성할 수 있다.
인공형의 핵산의 염기수는 50 내지 200 정도인 것이 바람직하고, 효율적인 합성을 가능하게 하는 관점에서, 100염기 정도의 것을 사용하는 것이 바람직하다. 인공형의 핵산에서는 티민의 이량체화를 방지하는 관점에서, 티민끼리 인접하지 않는 것이 바람직하다.
또한, 분리제로서의 내구성을 고려하여, 상기 핵산은 보호기에 의해 유도체화되어 있을 수도 있다. 구체적으로는, 5' 위치, 3' 위치 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 있는 수산기를 인산에스테르기, 아실기, 알콕시카르보닐기, 벤질기, 치환 벤질기, 알릴기 등을 사용하여 유도화할 수 있다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 상기 핵산의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다. 상기 핵산의 담지량이 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0중량부에 미치지 않는 경우에는, 상기 핵산을 분리제 중에 안정적으로 존재시킬 수 없게 되고 충분한 분리 성능을 얻지 못하게 되는 한편, 상기 핵산의 담지량이 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 25중량부를 초과하는 경우에는, 상기 핵산을 코어-쉘형 입자에 담지시킬 수 없게 되어, 자유 핵산이 발생하고 분리 성능에 악영향을 미칠 가능성이 있다.
상기 코어-쉘형 입자에 상기 핵산을 담지시키기 위해서는, 예를 들어 일본 특허 공개 제2010-259405호 공보에 기재한 바와 같이 키토산 및 해당 키토산의 아미노기를 개재하여 결합시키는 방법을 들 수 있다. 이 방법에서는 먼저, 코어-쉘형 입자를 3-아미노프로필트리에톡시실란과 같은 아미노실란, 글루타르알데히드, 키토산, 글루타르알데히드, 아비딘의 순으로 이하와 같이 수식한다.
코어-쉘형 입자에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 증착 반응시킨 후, 가열 처리한다.
3-아미노프로필트리에톡시실란 처리된 코어-쉘형 입자를 글루타르알데히드 용액에 침지시킨 후, 세정하고 풍건시킨다.
글루타르알데히드로 처리된 코어-쉘형 입자를 키토산 용액에 침지 처리한 후, 초순수로 세정한다. 이에 의해, 글루타르알데히드의 알데히드기에 키토산의 아미노기가 공유 결합되어, 코어-쉘형 입자의 표면 상에 다수의 아미노기가 얻어져, 핵산을 결합시키기 위한 표면적이 증대된다.
이어서, 키토산이 도입된 코어-쉘형 입자를 글루타르알데히드 용액에 침지시킨 후, 세정하고 풍건시킨다.
얻어진 코어-쉘형 입자에 아비딘 용액을 적하하고, 정치시킴으로써, 알데히드 기와 아비딘의 아미노기가 결합되어, 아비딘이 키토산을 개재하여 코어-쉘 입자 상에 고정된다.
그리고, 아비딘이 고정화된 코어-쉘 입자 상에 비오틴 표지된 핵산 용액을 적하하여 반응시킴으로써, 키토산을 개재하여 핵산이 고정화된 코어-쉘형 입자가 얻어진다.
5. 분자량 50 내지 1000의 광학 활성의 화합물
본 발명의 분리제의 리간드로서, 분자량 50 내지 1000의 광학 활성의 유기 화합물을 사용할 수 있다. 그러한 유기 화합물로서는, 비대칭 중심을 갖고, 분자량이 상기 50 내지 1000이며, 코어-쉘형 입자와 화학 결합에 의해 결합 가능한 것이면 특별히 한정되지 않는다.
5-(1) 비나프틸 구조 및 크라운에테르 유사 환상 구조를 갖는 화합물
분자 중에 비나프틸 구조 및 크라운에테르 유사 환상 구조를 갖는 화합물로서는, 예를 들어 일본 특허 공개 제2003-327675호 공보에 기재된 것을 들 수 있다.
그들 이외에도 예를 들어 하기 화학식 (III)으로 표시되는 것을 바람직하게 예시할 수 있다.
Figure 112015063218404-pct00003
화학식 (III) 중, R8 및 R9는 각각 수소, 치환기를 갖고 있을 수도 있는 페닐기, 치환기를 갖고 있을 수도 있는 나프틸기, 치환기를 갖고 있을 수도 있고 임의의 비연속의 메틸렌기가 산소일 수도 있는 탄소수 1 내지 8의 알킬기, 또는 각 알킬기의 탄소수가 1 또는 2인 트리알킬실릴기를 나타낸다. 또한, R8 및 R9에 있어서 페닐기 등이 갖고 있을 수도 있는 상기 치환기는 크라운에테르 유사 환상 구조의 산소 원자와 상호 작용하지 않는 기이며, 이러한 치환기로서는, 예를 들어 메틸기 및 클로로기를 들 수 있다. R8 및 R9는 분리 성능 향상의 관점에서, 페닐기인 것이 바람직하다.
화학식 (III) 중, A1 및 A2는 각각, 비나프틸환의 수소에 치환된, 담체의 표면에 결합되어 있는 기를 나타낸다. A1 및 A2의 크기는 특별히 한정되지 않지만, 합성의 용이함과 분리 성능 향상의 관점에서, 각각의 분자량이 100 내지 600인 것이 바람직하다. A1 및 A2는 탄소수 1 내지 30의 알킬렌기, 탄소수 6 내지 30의 아릴렌기, 에테르기, 카르보닐기, 이미노기 및 아미드기 등의 다양한 기로 구성할 수 있다.
A1 및 A2는 각각 화학식 (III)의 비나프틸의 수소에 치환된 하기 화학식 (IV)로 표시되는 구조를 포함하는 것이, 상기 비나프틸 화합물의 합성의 용이함의 관점에서 바람직하다.
Figure 112015063218404-pct00004
화학식 (IV) 중, o는 1 내지 30의 정수를 나타낸다. o는 합성의 용이함과 분리 성능 향상의 관점에서 4 내지 10인 것이 바람직하다.
화학식 (III) 중, l은 4 내지 6의 정수를 나타낸다. 이러한 l은 암모늄 이온의 포접 관점에서 바람직하고, 4인 것이 보다 바람직하다.
화학식 (III) 중, m 및 n은 각각 0 내지 5의 정수를 나타낸다. 단 m+n은 1 내지 10이다. m 및 n의 양쪽이 각각 1 이상인 것이, 상기 비나프틸 화합물의 합성의 용이함의 관점에서 바람직하고, m 및 n의 한쪽이 1이며 다른 쪽이 0인 것이 보다 바람직하다. 또한, m 또는 n이 0인 경우에는 담체와의 결합이 없는 것을 의미한다.
상기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물을 상기 코어-쉘형 입자에 화학 결합시키는 방법으로서는, 이하의 A 내지 D 공정을 거쳐 행할 수 있다.
본 발명의 크로마토그래피용 분리제는, 하기 화학식 (V)로 표시되는 비나프틸 유도체 A의 비나프틸환에 담체 연결기를 도입하여 비나프틸 유도체 B를 얻는 A 공정과, 비나프틸 유도체 B의 2,2' 위치의 메톡시기를 가수분해하여 상기 메톡시기가 수산기로 된 비나프틸 유도체 C를 얻는 B 공정과, 비나프틸 유도체 C의 상기 수산기 각각을 폴리에틸렌글리콜 유도체로 가교하여 크라운에테르 유사 환상 구조를 갖는 비나프틸 유도체 D를 얻는 C 공정과, 비나프틸 유도체 D의 담체 연결기를 개재하여 비나프틸 유도체 D를 코어-쉘형 입자의 표면에 화학 결합에 의해 결합하는 D 공정을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure 112015063218404-pct00005
화학식 (V)에 있어서, R8 및 R9는 화학식 (III)의 R8 및 R9와 동일하다. 비나프틸 유도체 A는 시판품으로서 얻을 수 있다. 이러한 시판품으로서는, 예를 들어 2,2'-디메톡시-1,1'-비나프틸 및 3,3'-디브로모-2,2'-디메톡시-1,1'-비나프틸(모두 도쿄 가세이 고교 가부시끼가이샤의 제품)을 들 수 있다. 이러한 시판품의 사용은, 상기 비나프틸 화합물의 합성의 용이함의 관점에서 바람직하다.
또한 비나프틸 유도체 A는 합성에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 비나프틸 유도체 A는 3,3'-디브로모-2,2'-디메톡시-1,1'-비나프틸로부터 합성함으로써 얻을 수 있다. 이렇게 본 발명의 방법이 3,3'-디브로모-2,2'-디메톡시-1,1'-비나프틸의 브로모기를 각각 R8 및 R9로 치환하여 비나프틸 유도체 A를 얻기 위한 공정을 더 포함하는 것은, 상기 비나프틸 화합물의 R8 및 R9의 다양성을 얻는 관점에서 바람직하다.
A 공정에서 담체 연결기는 코어-쉘형 입자 상의 표면의 관능기와 결합하는 기일 수도 있고, 코어-쉘형 입자의 표면에 직접 결합하는 기일 수도 있다. 담체 연결기는 1종일 수도 있고 2종 이상일 수도 있다. 또한 담체 연결기는 적어도 1개 있을 수도 있고, 2개 이상 있을 수도 있다. 또한 담체 연결기가 2개 이상 있는 경우에는, 담체 연결기는 비나프틸의 2개의 나프틸환의 한쪽에만 결합되어 있을 수도 있고, 양쪽에 각각 결합되어 있을 수도 있다. 담체 연결기는 상기 비나프틸 유도체 D와 코어-쉘형 입자의 결합의 용이함의 관점에서, 코어-쉘형 입자의 표면 처리에 의한 관능기와 결합하는 기인 것이 바람직하다.
이러한 바람직한 A 공정으로서는, 예를 들어 비나프틸 유도체 A와 탄소수 4 내지 33의 지방족 디카르복실산모노메틸에스테르모노클로라이드를 염화철의 존재 하에서 반응시켜 비나프틸 유도체 B를 얻는 공정을 들 수 있다.
상기 B 공정은, 비나프틸의 2,2' 위치가 비나프틸 유도체 B 중에서도 반응성이 높은 점에서, 온화한 조건에서의 반응에 의해 행할 수 있다. 이러한 반응의 조건으로서는, 예를 들어 빙냉하부터 실온 중에서의 삼브롬화붕소에 의한 탈알킬 반응을 들 수 있다. 이러한 조건에서 B 공정을 행하는 것은 비나프틸 유도체 B의 다른 구조로의 영향을 억제하여, 보다 양호한 수율로 비나프틸 유도체 C를 얻는 관점에서 바람직하다.
상기 C 공정은, 비나프틸 유도체 C의 2,2' 위치의 수산기에 폴리옥시에틸렌이 가교시켜지는 조건에 의해 행할 수 있다. 이러한 가교는 가수분해를 이용하여 행할 수 있으며, 예를 들어 옥시에틸렌기의 반복수가 5 내지 7인 폴리옥시에틸렌글리콜디토실레이트를 알칼리 조건 하에서 반응시킴으로써 행할 수 있다.
상기 D 공정은, 담체 연결기나 코어-쉘형 입자의 표면 처리 종류에 따라 공지 기술의 범주에서 적절하게 행할 수 있다. 예를 들어, D 공정은 표면 처리된 코어-쉘형 입자를 사용하는 경우에는 비나프틸 유도체 D의 담체 연결기와 코어-쉘형 입자의 표면 처리에 의한 관능기를 화학 결합시킴으로써 행할 수 있다.
상기 코어-쉘형 입자의 표면 처리제로서, 실란 커플링제를 사용할 수 있다. 이러한 실란 커플링제로서는, 예를 들어 3-아미노프로필트리에톡시실란 및 3-(2-아미노에틸아미노프로필)트리메톡시실란을 들 수 있다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 상기 화학식 (III)으로 표시되는 화합물의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
5-(2) N-아실화아미노산, N-카르바모일아미노산, N-카르바모일-α-방향족 아미노산
본 발명의 분리제에서는, 리간드로서 N-아실화아미노산, N-카르바모일아미노산, N-카르바모일-α-방향족 아미노산(이하, 본 발명에 관한 아미노산류라고 함)을 화학 결합에 의해 상기 코어-쉘형 입자에 담지시켜, 광학 이성체용의 분리제로 할 수 있다.
N-아실화아미노산으로서는, 예를 들어 N-피발로일-L-발린, N-3,5-디니트로벤조일-D-페닐글리신 등을 들 수 있다. N-카르바모일아미노산으로서는, 예를 들어 N-카르바모일-류신, N-카르바모일-발린 등을 들 수 있다. 또한, N-카르바모일-α-방향족 알킬아민으로서는, 예를 들어 N-카르바모일-α-(노나프틸)에틸아민 등을 들 수 있다.
상기 본 발명에 관한 아미노산류는, 본 발명의 분리제에 있어서 키랄 부위로서 기능한다.
상기 본 발명에 관한 아미노산류를 상기 코어-쉘형 입자에 화학적으로 결합시키는 방법으로서, 이하의 방법을 들 수 있다. 구체적인 조작으로서는, 일본 특허 공개 (평)5-4045호 공보에 기재되어 있다.
먼저, 상기 코어-쉘형 입자를 3-아미노프로필트리에톡시실란과 같은 아미노기를 갖는 실란 커플링제를 사용하여 표면 처리하여, 아미노프로필기를 코어-쉘형 입자에 도입한다. 도입된 아미노프로필기는 앵커 부위로서 기능한다. 3-아미노프로필트리에톡시실란 이외의 실란 커플링제로서는, 6-아미노헥실알콕시실란, 6-아미노헥실할로게노실란, 3-아미노프로필트리할로게노실란 등을 들 수 있다. 3-아미노프로필할로게노실란의 바람직한 예로서는, 3-아미노프로필트리클로로실란을 들 수 있다.
상기한 키랄 부위와 앵커 부위 사이에 서브 앵커 부위로서 -NH-(CH2)n-CO-를 더 도입한다. 여기서, n은 5 이상, 바람직하게는 5 내지 10이다. n이 5 미만이면 충전제의 분리능이 저하된다. 한편, n이 10을 초과하면 분자 식별에 불필요한 소수기간의 상호 작용 및 키랄 부위간의 상호 작용이 증대되어 분리능이 저하된다.
상기 서브 앵커 부위를 구성하기 위하여 사용하는 화합물로서, 아미노알칸산을 들 수 있다. 이 아미노알칸산을 메틸에스테르와 같은 에스테르로 보호하는 조작을 행한다.
다음에 상기 본 발명에 관한 아미노산류와 N-히드록시숙신산이미드와 같은 카르복실산의 활성화 시약을 반응시켜 에스테르화를 행한다. 이것과, 상기에서 에스테르화를 행한 아미노알칸산의 메틸에스테르를 반응시켜, 키랄 부위와 서브 앵커 부위를 결합시킨다. 그리고, 서브 앵커 부위의 카르복실기와 앵커 부위의 아미노기를 반응시킴으로써, 상기 본 발명에 관한 아미노산류를 코어-쉘형 입자에 화학 결합에 의해 담지시킬 수 있다.
상기 코어-쉘형 입자에 대한 상기 본 발명에 관한 아미노산류의 담지량은, 코어-쉘형 입자 100중량부에 대하여 1.0 내지 25중량부인 것이 바람직하다.
본 발명의 분리제는, 리간드로서 광학 활성의 것을 사용하는 경우에는 광학 이성체용의 분리제로서 사용할 수 있고, 리간드로서 광학 활성이 없는 것을 사용하는 경우에는 친화 크로마토그래피용의 분리제로서 사용할 수 있다. 이들 분리제는 가스 크로마토그래피용, 전기 영동용, 특히 캐필러리 일렉트로 크로마토그래피용(CEC용), CZE(캐필러리 존 전기 영동)법, MEKC(미셀 동전 크로마토)법의 캐필러리 컬럼의 충전제로서도 사용할 수 있다.
<실시예>
본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다. 또한 이하의 예에 있어서의 이론 단수(N), 유지 계수(k'), 분리 계수(α)는 하기 수학식으로 정의된다.
<이론 단수>
N=16×[(유지 시간)/(피크 폭)]2
<유지 계수>
k'=[(대장체의 유지 시간)-(데드 타임)]/(데드 타임)
<분리 계수>
α=(보다 강하게 유지되는 대장체의 유지 계수)/(보다 약하게 유지되는 대장체의 유지 계수)
이때, 데드 타임은 트리-tert-부틸벤젠의 용출 시간을 데드 타임으로 했다.
<실시예 1>
셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트)를 광가교 고정화에 의해 2중량％ 담지시킨 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)의 합성
시판품의 3,5-디클로로페닐이소시아네이트와 셀룰로오스를 피리딘 용매 중에서 반응시켜, 백색 고체 (1)을 얻었다. 반응 조건은 비특허문헌 2를 참고로 했다.
Figure 112015063218404-pct00006
(2) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 물리적 흡착에 의해 2중량％ 담지된 충전제의 제작
(1)에서 얻어진 셀룰로오스 유도체 (1) 0.081g을 30mL의 테트라히드로푸란에 용해시켰다. 그 용액에, 코어-쉘형 실리카 겔(가부시끼가이샤 크로마닉 테크놀로지스사제 특수 칼럼 φ4.6㎝×L15㎝(입경 2.6㎛, 세공 직경 9㎚, C4 코어-쉘)로부터 충전제를 발취하여, 전기로에서 600도까지 1시간 승온시키고, 그 후 5시간 유지하고 방냉한 후, 4N 염산에 분산시키고, 밤새 교반시키고, 순수로 세정, 건조시킨 것, 입경: 2.6㎛, 세공 직경 9㎚(카탈로그값), 코어의 직경 1.6㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)) 3.9g을 추가하고, 수분간의 진탕 교반을 행한 후에, 용제를 감압 증류 제거시킴으로써, 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 2중량％ 담지된 충전제를 제작했다.
(3) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 고정화에 의해 2중량％ 담지된 충전제의 제작
셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 2중량％ 담지된 충전제 2.76g을 아세토니트릴/물=60/40(부피/부피) 500mL에 현탁하고, 교반했다. 현탁액을 침지성 수은등(필립스(Philips), HPK-125와트, 석영 피포)으로 10분간 조사했다. 침전을 여과 취출하여, 테트라히드로푸란으로 세정하고, 건조시켰다.
(4) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 고정화에 의해 2중량％ 담지된 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(3)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<응용예 1>
<실시예 1>에서 제작된 광학 이성체 분리 칼럼을 사용하여, 액체 크로마토그래피법에 의해, 하기 구조를 갖는 화합물(트랜스-스틸벤옥시드)을 사용하여 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능(N값) 및 분리 계수의 평가를 행했다.
Figure 112015063218404-pct00007
비교예로서, 실시예 1에 기재된 방법으로 전공형 실리카 겔(입경 5㎛, 세공 직경 12㎚)에 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)을 2.0중량％ 담지시킨 충전제를 사용한 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능(k'값, α값, N값)을 나타냈다. 또한, 평가 조건은 실시예 1 및 비교예의 어떤 경우든 이동상으로서 n-헥산/2-프로판올=90/10을 사용하고, 유속을 0.15mL/분, 온도를 25℃로 설정했다.
Figure 112015063218404-pct00008
<실시예 2>
셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트)를 광가교 고정화에 의해 10중량％ 담지시킨 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 물리적 흡착에 의해 10중량％ 담지된 충전제의 제작
실시예 1의 (1)에서 얻어진 셀룰로오스 유도체 (1) 0.4g을 4mL의 테트라히드로푸란에 용해시켰다. 그 용액을, 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(Advanced Materials Technology: AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경: 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께: 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)을 전기로에서 600℃까지 1시간 승온시키고, 그 후 5시간 유지하고 방냉한 후, 4N 염산에 분산시키고, 밤새 교반시키고, 순수로 세정, 건조시킨 것) 3.5g에 균일하게 도포한 후에, 테트라히드로푸란을 감압 증류 제거하여 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 10중량％ 담지된 충전제를 제작했다.
(2) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 고정화에 의해 10중량％ 담지된 충전제의 제작
셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 10중량％ 담지된 충전제 3.6g을 아세토니트릴/물=60/40(부피/부피) 500mL에 현탁하고, 교반한다. 현탁액을 침지성 수은등(필립스, HPK-125와트, 석영 피포)으로 10분간 조사한다. 침전을 여과 취출하여, 테트라히드로푸란으로 세정하고, 건조시킨다. 원소 분석의 결과로부터 담지율은 9.5％였다.
(3) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)이 고정화에 의해 10중량％ 담지된 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(2)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<실시예 3>
알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)를 고정화시킨 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)의 합성
셀룰로오스와 3,5-디클로로페닐이소시아네이트 및 3,5-(트리에톡시실릴)프로필이소시아네이트를 반응시켜, 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)를 얻었다. 반응 조건은 특허문헌 1의 실시예 2에 기재된 방법을 참고로 합성했다. 1H-NMR의 결과로부터 3,5-디클로로페닐이소시아네이트와 알콕시실릴기(에톡시실릴기)의 도입률은 각각 97.4％, 2.6％였다.
Figure 112015063218404-pct00009
(2) 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)가 물리적 흡착에 의해 10중량％ 담지된 충전제의 제작
(1)에서 얻어진 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 유도체 (2) 0.4g을 3.2mL의 테트라히드로푸란에 용해시켰다. 그 용액을, 표면을 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리한 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경: 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께: 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)로부터 기지의 방법에 따라 제조) 3.6g에 균일하게 도포한 후에, 테트라히드로푸란을 감압 증류 제거하여, 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)가 10중량％ 담지된 충전제를 제작했다.
(3) 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)를 고정화시킨 충전제의 제작
(2)에서 얻어진 충전제 3g을 에탄올/물/클로로트리메틸실란(27.5mL/7mL/0.45mL)에 분산시키고, 110℃의 오일 배스에서 비등시키면서 10분간 반응을 행하여, 실리카 겔 상으로의 고정화를 행했다. 메탄올로 세정하고, 건조시킨다. 원소 분석의 결과로부터 담지율은 5.6％였다.
(4) 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)를 고정화시킨 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(3)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<실시예 4>
셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)을 화학 결합한 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)을 화학 결합한 충전제의 제작
표면을 아미노프로필트리에톡시실란으로 처리한 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)을 전기로에서 600℃까지 1시간 승온시키고, 그 후 5시간 유지하고 방냉한 후, 4N 염산에 분산시키고, 밤새 교반시키고, 순수로 세정, 건조시킨 것으로부터 기지의 방법에 따라 제조)에 셀룰로오스를 화학 결합시킨 물질 5g을, 특허문헌 11의 실시예 1에 기재된 방법을 참고로 합성했다. 단, 이때의 셀룰로오스 투입량을 특허문헌 기재량보다도 5배 많게 하여, 셀룰로오스가 코어-쉘형 실리카 겔에 화학 결합된 물질을 얻었다. 얻어진 셀룰로오스 결합 코어-쉘형 실리카 겔 4g을 N,N-디메틸아세트아미드, 피리딘 혼합 용제 중에 현탁시키고, 이것에 3,5-디클로로페닐이소시아네이트 3.1g을 첨가하여, 80℃에서 48시간의 반응을 행했다. 현탁액을 여과하고, 메탄올로 세정하고, 건조시킨다. 원소 분석의 결과로부터 담지율은 0.9％였다.
(2) 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)을 화학 결합한 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(1)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<실시예 5>
폴리부틸렌테레프탈레이트를 화학 결합한 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) 폴리부틸렌테레프탈레이트 (3)이 물리적 흡착에 의해 10중량％ 담지된 충전제의 제작
폴리부틸렌테레프탈레이트(Duranex300FP) (3) 0.4g을 4mL의 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올(HFIPA)에 용해시켰다. 그 용액을, 표면을 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리한 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경: 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께: 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)로부터 기지의 방법에 따라 제조) 3.6g에 균일하게 도포한 후에, HFIPA를 감압 증류 제거하여, 폴리부틸렌테레프탈레이트 (3)이 10중량％ 담지된 충전제를 제작했다.
(2) 폴리부틸렌테레프탈레이트 (3)을 화학 결합한 충전제의 제작
(1)에서 얻어진 충전제 2.5g을, 200℃의 오븐에서 3시간 반응을 행하여 실리카 겔 상으로의 고정화를 행했다. HFIPA로 세정하고, 건조시킨다. 원소 분석의 결과로부터 담지율은 7.7％였다.
(3) 폴리부틸렌테레프탈레이트 (3)을 화학 결합한 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(2)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<실시예 6>
폴리에틸렌테레프탈레이트를 화학 결합한 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) 폴리에틸렌테레프탈레이트(데이진 가세이사제 TR8550FF) (4)가 물리적 흡착에 의해 10중량％ 담지된 충전제의 제작
폴리에틸렌테레프탈레이트 (4) 0.4g을 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올(HFIPA) 2.0mL과 디클로로메탄 2.0mL의 혼합 용액에 용해시켰다. 그 용액을, 표면을 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리한 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경: 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께: 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)로부터 기지의 방법에 따라 제조) 3.6g에 균일하게 도포한 후에, HFIPA와 디클로로메탄을 감압 증류 제거하여, 폴리에틸렌테레프탈레이트 (4)가 10중량％ 담지된 충전제를 제작했다.
(2) 폴리에틸렌테레프탈레이트 (4)를 화학 결합한 충전제의 제작
(1)에서 얻어진 충전제 2.5g을, 200℃의 오븐에서 3시간 반응을 행하여 실리카 겔 상으로의 고정화를 행했다. HFIPA로 세정하고, 건조시킨다. 원소 분석의 결과로부터 담지율은 7.1％였다.
(3) 폴리에틸렌테레프탈레이트 (4)를 화학 결합한 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(2)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<실시예 7>
(S)-[1,2-[6-(5-카르복시펜타노일)]-(3-페닐나프토)]-[1',2'-(3'-페닐나프토)]-1,6,9,12,15,18-헥사옥사-시클로에이코사-2,4-디엔을 화학 결합한 충전제의 제조법 및 충전 칼럼의 제작법
(1) (S)-[1,2-[6-(5-카르복시펜타노일)]-(3-페닐나프토)]-[1',2'-(3'-페닐나프토)]-1,6,9,12,15,18-헥사옥사-시클로에이코사-2,4-디엔 (5)의 합성
키랄크라운에테르 (5)는 특허문헌 12의 실시예 [0057] 내지 [0064]에 기재된 방법으로 합성했다.
Figure 112015063218404-pct00010
(2) (S)-[1,2-[6-(5-카르복시펜타노일)]-(3-페닐나프토)]-[1',2'-(3'-페닐나프토)]-1,6,9,12,15,18-헥사옥사-시클로에이코사-2,4-디엔 (5)를 화학 결합한 충전제의 제작
표면을 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리한 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경: 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께: 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)로부터 기지의 방법에 따라 제조) 1.97g에 키랄크라운에테르 (5) 0.21g, O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 0.16g 및 N-메틸모르폴린 42μL을 N,N-디메틸포름아미드 15mL에 용해시켜 첨가하고, 실온에서 4시간 반응을 행했다. 희염산/메탄올 용액, N,N-디메틸포름아미드로 세정한다. 얻어진 충전제를 N,N-디메틸포름아미드 15mL에 분산시키고, 피리딘 3.2g, 무수아세트산 1.87g을 추가하여, 실온에서 3시간 반응을 행했다. N,N-디메틸포름아미드, 메탄올로 세정하고, 건조시킨다. 원소 분석의 결과로부터 담지율은 7.1％였다.
(3) (S)-[1,2-[6-(5-카르복시펜타노일)]-(3-페닐나프토)]-[1',2'-(3'-페닐나프토)]-1,6,9,12,15,18-헥사옥사-시클로에이코사-2,4-디엔 (5)를 화학 결합한 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(2)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<실시예 8>
인간 혈청 알부민(Human serum albumin; HSA)을 화학 결합한 충전제의 제조 방법 및 충전 칼럼의 제작 방법
(1) 인간 혈청 알부민(HSA)을 화학 결합한 충전제의 제작
표면을 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 처리한 코어-쉘형 실리카 겔(어드밴스드 머티리얼스 테크놀로지(AMT)사제, 입경: 2.7㎛, 세공 직경: 16㎚(카탈로그값), 코어의 직경: 1.7㎛, 코어의 재질: 유리; 쉘의 두께: 0.5㎛, 쉘의 재질: 실리카 겔(폴리알콕시실록산의 가수분해물)로부터 기지의 방법에 따라 제조) 1.0g 및 N,N'-디숙신이미딜카르보네이트(DSC) 1.0g을 아세토니트릴 50mL에 용해시킨 용액에 현탁하고, 30℃에서 17시간 교반했다. 그 용액을 여과하고, 아세토니트릴, 물, 메탄올, 아세토니트릴의 순으로 세정했다. 여과 잔존물을 건조시켜 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성화 실리카 겔을 얻었다.
얻어진 NHS 활성화 실리카 겔 0.5g을 20mM 인산염 완충액(pH 6.8) 20mL에 넣고, HSA(시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH), 순도≥99％) 30㎎을 20mM 인산염 완충액(pH 6.8) 20mL에 용해시킨 용액을 pH 6.8로 유지하면서 30분에 걸쳐 첨가하고, 4℃에서 17시간 교반했다. 그 용액을 여과하고, 물 100mL로 세정했다. 여과 잔존물에 염산글루코사민 1.4g을 20mM 인산 완충액(pH 6.8) 20mL에 용해시킨 용액을 첨가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 그 용액을 여과하고, 물, 10％ 에탄올수의 순으로 세정함으로써 HSA를 고정화시킨 충전제를 얻었다. 브래드포드(Bradford)법에 의해 반응 여과액 중의 HSA를 정량한 결과로부터 담지율은 3.5％였다.
(2) 인간 혈청 알부민(HSA)을 화학 결합한 충전제를 사용한 충전 칼럼의 제작
(1)에서 제작된 담지형 충전제를 φ0.21㎝×L15㎝의 스테인리스제 칼럼에 슬러리 충전법에 의해 가압, 충전을 행하여 칼럼의 제작을 행했다.
<응용예 2>
실시예 2에서 제작된 광학 이성체 분리 칼럼을 사용하여, 액체 크로마토그래피법에 의해, 상기에서 구조를 나타낸 트랜스-스틸벤옥시드를 사용하여 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능의 평가를 행했다. 비교예 1로서, 실시예 2에 기재된 방법으로 전공형 실리카 겔(입경: 3㎛, 세공 직경: 30㎚)에 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (1)을 10중량％ 담지시킨 충전제(원소 분석의 결과로부터 담지율은 8.6％였음)를 사용한 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능(k'값, α값, N값)을 나타냈다. 또한, 평가 조건은 실시예 2 및 비교예 1의 어떤 경우든 이동상으로서 n-헥산/2-프로판올=90/10을 사용하고, 유속을 0.15mL/분, 온도를 25℃로 설정했다.
<응용예 3>
실시예 3에서 제작된 광학 이성체 분리 칼럼을 사용하여, 액체 크로마토그래피법에 의해, 트랜스-스틸벤옥시드를 사용하여 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능 평가를 행했다. 비교예 2로서, 실시예 3에 기재된 방법으로 전공형 실리카 겔(입경: 3㎛, 세공 직경: 30㎚)에 알콕시실릴기를 갖는 셀룰로오스 트리스(3,5-디클로로페닐카르바메이트) (2)를 고정화시킨 충전제(원소 분석의 결과로부터 담지율은 4.6％였음)를 사용한 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능(t값, α값)을 나타냈다. 또한, 평가 조건은 실시예 3 및 비교예 2의 어떤 경우든 이동상으로서 n-헥산/2-프로판올=90/10을 사용하고, 유속을 0.15mL/분, 온도를 25℃로 설정했다.
Figure 112015063218404-pct00011
<응용예 4>
실시예 5, 6에서 제작된 광학 이성체 분리 칼럼을 사용하여, 액체 크로마토그래피법에 의해, 이하의 o-터페닐, m-터페닐 및 p-터페닐을 사용하여 칼럼 성능(t값, α1값(o-터페닐과 m-터페닐의 분리 계수), α2값(m-터페닐과 p-터페닐의 분리 계수))의 평가를 행했다. 비교예 3으로서, 실시예 5에 기재된 방법으로 전공형 실리카 겔(입경: 3㎛, 세공 직경: 12㎚)에 폴리부틸렌테레프탈레이트 (3)을 고정화시킨 충전제(원소 분석의 결과로부터 담지율은 8.5％였음)를 사용한 칼럼의 칼럼 성능(t값, α1값, α2값)을 나타냈다. 또한, 평가 조건은 실시예 5, 실시예 6 및 비교예 3의 어떤 경우든 이동상으로서 n-헥산/2-프로판올=100/1을 사용하고, 유속을 0.15mL/분, 온도를 25℃로 설정했다.
Figure 112015063218404-pct00012
Figure 112015063218404-pct00013
<응용예 5>
실시예 7에서 제작된 광학 이성체 분리 칼럼을 사용하여, 액체 크로마토그래피법에 의해, 이하의 화합물(티로신, 알라닌, 글루탐산, α-아미노-ε-카프로락탐)을 사용하여 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능의 평가를 행했다. 비교예 4로서, 실시예 7에 기재된 방법으로 전공형 실리카 겔(입경: 3㎛, 세공 직경: 30㎚)에 (S)-[1,2-[6-(5-카르복시펜타노일)]-(3-페닐나프토)]-[1',2'-(3'-페닐나프토)]-1,6,9,12,15,18-헥사옥사-시클로에이코사-2,4-디엔 (5)를 화학 결합한 충전제(원소 분석의 결과로부터 담지율은 9.1％였음)를 사용한 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능(t값, α값)을 나타냈다. 또한, 평가 조건은 실시예 7 및 비교예 4의 어떤 경우든 이동상으로서 과염소산 수용액(pH 1.5)/아세토니트릴=80/20을 사용하고, 유속을 0.10mL/분, 온도를 25℃로 설정했다.
Figure 112015063218404-pct00014
Figure 112015063218404-pct00015
<응용예 6>
실시예 8에서 제작된 광학 이성체 분리 칼럼을 사용하여, 액체 크로마토그래피법에 의해, 이하에 나타낸 화합물(헥소바르비탈)을 사용하여 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능 평가를 행했다. 비교예 5로서, 실시예 8에 기재된 방법으로 전공형 실리카 겔(입경: 5㎛, 세공 직경: 12㎚)에 인간 혈청 알부민(HSA)을 화학 결합한 충전제(브래드포드법에 의해 반응 여과액 중의 HSA를 정량한 결과로부터 담지율은 8.0％였음)를 사용한 광학 이성체 분리 칼럼의 칼럼 성능(t값, Rs값, N값)을 나타냈다. 또한, 평가 조건은 실시예 8 및 비교예 5의 어떤 경우든 이동상으로서 10mM 아세트산암모늄 수용액(pH 7.0)/2-프로판올=95/5를 사용하고, 유속을 0.10mL/분, 온도를 25℃로 설정했다.
Figure 112015063218404-pct00016
Figure 112015063218404-pct00017

Claims (8)

  1. 담체와, 담체의 표면에 화학 결합에 의해 담지된 리간드를 갖는 분리제에 있어서,
    상기 담체가, 무공성의 코어와 다공성의 쉘을 포함하는 코어-쉘형 입자이며, 해당 쉘의 세공 직경이 9㎚ 이상이고, 해당 쉘은 폴리알콕시실록산의 가수분해물을 포함하며,
    상기 리간드가, 광학 활성 중합체, 광학 불활성의 폴리에스테르, 단백질, 또는 분자량 50 내지 1000의 광학 활성의 유기 화합물이고,
    상기 광학 활성 중합체가 다당 또는 그의 유도체이며,
    상기 광학 불활성의 폴리에스테르가 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리부틸렌테레프탈레이트 및 폴리락트산으로부터 선택되는 것이고,
    상기 단백질이 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 알부민 및 이들의 기능성 변이체로부터 선택되는 것이며,
    상기 분자량 50 내지 1000의 광학 활성의 유기 화합물이, 비나프틸 구조 및 크라운에테르 유사 환상 구조를 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는, 분리제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 코어-쉘형 입자가, 코어가 무기 재료를 포함하고, 코어와 쉘의 두께의 비가 4:1 내지 2:1인, 분리제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분리제가 크로마토그래피용 분리제인, 분리제.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
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  8. 삭제
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