KR102176832B1 - 헤지호그 단백질 및 생체 적합성 물질을 포함하는 미세 입자 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

헤지호그 단백질 및 생체 적합성 물질을 포함하는 미세 입자 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헤지호그 단백질 및 생체 적합성 물질을 포함하는 미세 입자, 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면, 피부를 통해 헤지호그 단백질을 용이하게 체내로 전달할 수 있고, 결과적으로 상기 미세 입자로부터 우수한 효과를 갖는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

헤지호그 단백질 및 생체 적합성 물질을 포함하는 미세 입자 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물{A MICROPARTICLE COMPRISING HEDGEHOG PROTEIN AND BIOCOMPATIBLE MATERIAL AND A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING HAIR LOSS COMPRISING THE SAME}
본 발명은 헤지호그 단백질 및 생체 적합성 물질을 포함하는, 헤지호그 단백질을 피부로 흡수시키기 위한 미세 입자, 이를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.
과거에는 탈모가 노화가 진행됨에 따라 일어나는 현상으로 인식되어 왔으나, 최근에는 유전적 요인과 함께 환경적인 요인이 함께 작용하여 일어나는 것으로 알려져 있다. 탈모 유발의 환경적인 요인으로는 환경 오염물질에의 노출, 과도한 다이어트에 의한 영양 부족, 식생활 변화에 따른 영양 불균형 및 호르몬 분비 이상, 업무 및 사회활동에 따른 스트레스, 불규칙한 생활습관, 무분별한 화학제제의 사용 등이 있다. 이러한 환경적 요인으로 인해 20대 및 30대 젊은 남성들과 여성에게서도 탈모가 증가하고 있으며, 이에 대한 예방 및 치료 요구가 커짐에 따라 탈모를 극복하기 위한 다양한 연구가 시도되고 있다. 연구 결과, 현재까지 디하이드로테스토스테론이론(DHT Theory, Dihydrotestosterone Theory), 중력 이론(Gravity Theory), 혈액 공급 이론 등이 탈모에 대한 일반적 가설로 알려져 있으나, 아직까지 정확한 탈모나 발모의 원인 및 기작이 알려져 있지 않다.
현재 사용되고 있는 탈모완화 및 발모촉진제인 프로페시아와 미녹시딜 등은 적용을 중단하면 증상이 재발할 뿐 아니라 이미 진행된 탈모를 회복하기는 어렵다는 문제점이 있고, 또한 장기간 적용 시 피부염, 원하지 않는 부위의 발모, 발기부전 및 성욕 감퇴 등의 성기능 저하, 어지럼증, 두통 및 부종 등의 부작용이 나타난다고 보고되고 있다. 더욱이, 의약외품으로 허가 받은 대부분의 탈모 방지 제제에서 탈모방지나 모발의 굵기 증가 등 그 임상효과가 불분명하여 식약처에서 재심을 거쳐 기능성 화장품으로 관리하려고 하고 있는 실정이다.
이러한 탈모 관련 제제 외에, 두피 축소 수술, 모낭이식수술, 두피이식 수술 및 주사용법 등 탈모 예방 또는 치료 및 발모 촉진 등을 위한 외과적 치료 방법도 사용되고 있다. 그러나, 외과적 치료 방법은 수술 부위에 피부 괴사가 일어나거나 반흔(Scar) 및 켈로이드(Keloid) 등의 피부 경화증이 형성될 위험을 가지고 있음이 보고되어 있다.
이와 같이, 현재 사용되는 탈모 관련 제제 및 외과적 치료 방법은 그 효과가 충분하지 않거나, 부작용이 발생하는 등 여러 문제점이 있기 때문에 보다 효과적이고 안전한 탈모의 예방 또는 치료, 또는 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진을 위한 신규한 제제의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 헤지호그(hh) 단백질은 배아 발달 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 신호전달 단백질이다. 고등 생명체에서 hh 계열은 소닉(sonic), 인디안(indian) 및 데저트(desert) 헤지호그 단백질로 구성되며, 소닉 헤지호그(Shh) 단백질은 헤지호그 신호전달 경로에서 패치드(Pached) 수용체를 억제함으로써 스모(Smoothened) 막 단백질과 Gli 전사인자를 차례로 활성화시켜 목표 단백질의 전사를 개시하는 중요한 역할을 담당하고 있다.
이러한 헤지호그 단백질 등 유용 물질을 체내로 전달하기 위해 피부에 적용하는 방식은 지속적인 물질 전달이 가능하고, 통증이 없으며, 이용이 간편하다는 장점이 있다. 그러나, 피부 최외각의 10 μm 내지 60 μm 두께의 각질층이 외부 물질의 체내 침투를 막기 때문에, 유효 성분의 체내 흡수율이 매우 낮고, 특히 유효 성분이 친수성이거나 분자량이 크면 이의 체내 흡수율은 더욱 낮아진다. 따라서, 유용물질을 효과적으로 전달하기 위하여 주사를 이용한 투여 방법이 이용되고 있다. 그러나 주사 투여 방법은 대상자에게 상당한 통증을 주고, 주사는 일반적으로 병원이나 전문적인 피부 관리기관에서만 시술이 가능하기 때문에, 가정에서 용이하게 사용할 수 없다는 단점이 있다.
미국 공개특허 제2011-0306546호
본 발명은 목적은 헤지호그 단백질을 피부로 흡수시킴으로써 목적하는 효과를 나타내기 위한 미세 입자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 탈모의 예방 또는 치료용, 또는 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진에 우수한 효과가 있고, 남녀노소에 관계없이 적용될 수 있는 안전한, 상기 미세 입자를 포함하는 약학 조성물 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 헤지호그 단백질이 생체 적합성 물질 내에 포함된 미세 입자를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 미세 입자를 포함하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 미세 입자를 포함하는 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 미세 입자에 의하면 피부 흡수를 통해 헤지호그 단백질을 용이하게 체내로 전달할 수 있고, 결과적으로 상기 미세 입자로부터 우수한 효과를 갖는 탈모 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 pET-hShh 벡터로 형질 전환된 대장균에서 Shh 단백질이 발현되었음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 pET-hShh 벡터로부터 얻은 Shh 단백질 발현율보다 현저하게 발현율이 증가된 변이체 벡터들(RanShh-6, RanShh-10, RanShh-16 및 RanShh-22)을 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 유비퀴틴이 융합된 형태의 Shh 단백질이 발현되었음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 유비퀴틴이 융합된 형태의 Shh 단백질의 정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4b는 유비퀴틴이 제거된 Shh 단백질을 Ni-친화성 수지를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 것이다.
도 4c는 최종 정제된 Shh 단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Shh 단백질의 생물학적 활성 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 도 6i는 Shh 단백질이 Shh 신호전달 과정 중에 주요한 유전자들의 발현을 증가시킨다는 것을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Shh 처리에 의한 인간 피부유두종세포 내 모발 관련 유전자들의 발현량을 정량적으로 나타낸 것이다.
도 8은 Shh 단백질이 함유된 미세입자를 포함하여 제조된 크림을 두피에 도포하고, 1개월 후의 모습을 관찰한 것이다.
도 9는 Shh 단백질이 함유된 미세입자를 포함하여 제조된 크림을 두피에 도포하고, 2.5개월 및 4개월 후의 모습을 관찰한 것이다.
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 헤지호그 단백질이 생체 적합성 물질 내에 포함된 미세 입자에 관한 것이다. 이때, 상기 미세입자는 헤지호그 단백질을 피부로 흡수시키기 위한 미세입자이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 헤지호그 단백질은 포유 동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래한 것일 수 있고, 소닉 헤지호그 단백질, 인디안 헤지호그 단백질 또는 데저트 헤지호그 단백질일 수 있으며, 소닉 헤지호그 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 헤지호그 단백질은 대장균으로부터 유래된 재조합 헤지호그 단백질일 수 있고, 상기 헤지호그 단백질은 소닉 헤지호그 단백질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 소닉 헤지호그 단백질은 전장(full-length) 아미노산 또는 단편일 수 있다. 상기 소닉 헤지호그 단백질이 단편일 경우 전장 소닉 헤지호그 단백질의 아미노산 서열의 25번째 아미노산인 글리신부터 197번째 아미노산인 글리신을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 소닉 헤지호그 단백질은 N-말단에 추가적으로 1개 또는 2개의 아미노산이 결합된 형태일 수 있고, 바람직하게는, 소닉 헤지호그 단백질의 N-말단에 추가적으로 2개의 이소류신(Ile)이 결합된 형태일 수 있다.
상기 소닉 헤지호그 단백질은 서열 번호 7로 표시되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하는 개념이다. 본원에서 용어 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 해당 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 상기 소닉 헤지호그 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 소닉 헤지호그 단백질의 N-말단에 유비퀴틴 단백질이 결합될 수 있고, 본원에서 서열 번호 8로 표시되는 단백질이 상기 서열 번호 7로 표시되는 단백질과 유비퀴틴 단백질이 융합된 형태의 단백질이다. 상기 서열 번호 8로 표시되는 단백질의 기능적 동등물을 포함하는 미세 입자 및 이를 포함하는 조성물도 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에서 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본원에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다.
본원에서 용어 "재조합 단백질"은 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 올리고단백질 및/또는 융합 단백질을 비롯하여, 아미노산을 코딩하는 재조합 유전 물질로부터 발현되는 임의의 단백질 또는 그 생물학적 활성 부분(예를 들어, 전체 단백질의 생물학적 활성을 보유하는 부분)을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 미세 입자는 고체일 수 있고, 상기 미세 입자의 각 면은 평평하거나, 요철이 있을 수 있으며, 속이 비어있을 수도 있다. 또한, 상기 미세 입자의 모서리나 꼭지점의 일부가 깨지는 등의 결함이 있을 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 생체 적합성 물질은 다당류, 폴리비닐알콜, 카르복시비닐 중합체, 키토산, 히알루론산, 셀룰로오스 중합체 및 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 히알루론산인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 미세 입자는 적어도 하나의 모서리 또는 꼭짓점을 갖는 입체 도형 형태일 수 있고, 바람직하게는 사면체, 오면체 또는 원뿔 형태일 수 있다. 상기 미세 입자를 피부 위에 바르고 손으로 두드리거나 문지르면 입체 도형의 꼭짓점이나 모서리 등이 각질에 미세 구멍을 형성하거나 각질의 일부를 제거한다. 피부 조직 중 최대의 물리적 장벽인 각질층에 형성된 미세 구멍 또는 얇아진 각질층을 통해 상기 헤지호그 단백질이 통과하면, 수분이 풍부하고 세포의 조밀도가 상대적으로 낮은 표피 및 진피층에서 상기 헤지호그 단백질이 비교적 용이하게 확산된다. 따라서, 상기 미세 입자에 의해, 헤지호그 단백질의 피부 흡수도가 높아진다. 이와 같은 작용이 일어나기 위해서, 다면체의 꼭지점이나 모서리가 예리한 각을 이루고 있어야 한다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 피부 각질층의 두께가 10 μm 내지 60 μm이고 피부가 탄력이 있기 때문에, 각질층에 미세 구멍을 형성하기 위해서 상기 미세 입자의 한 면의 가로 길이가 50 μm 내지 500 μm인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 미세 입자가 사면체 또는 오면체 등의 다면체일 경우 밑변과 높이가 각각 50 μm 내지 500 μm인 것이 바람직하고, 원뿔인 경우 밑면의 직경과 높이가 각각 50 μm 내지 500 μm인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 미세 입자가 용해되지 아니한 채로 그 형상을 계속 유지하고 있으면 사용자가 세척해야 하는 불편함이 있다. 더욱이, 상기 미세 입자가 각질층에 박혀 있으면 대부분의 미세 구멍을 막게 되므로, 피부미용물질의 피부 흡수도가 충분히 향상되지 않는다. 따라서 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 미세 입자는 체액 또는 물에 쉽게 용해, 분해 또는 팽윤되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 미세 입자의 적어도 하나의 면에 함몰부가 형성되어 있고, 상기 함몰부의 깊이는 상기 미세 입자의 높이의 1/2 이내일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 미세 입자를 포함하는, 탈모 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본원에서 용어, "예방"이란, 조성물의 투여로 탈모의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본원에서 용어, "치료"란, 본 발명의 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 탈모의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 미세 입자를 포함하는, 탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물 또는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 약학 조성물의 제제화 시에는 일반적으로 사용하는 약학적으로 허용 가능한 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 부형제 또는 희석제를 사용하여 제조될 수 있다. 또한, 항응집제, 윤활제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속, 또는 지연된 방출을 제공하기 위해 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 경피 투여 제제 및 국소 적용을 위한 피부 외용 제제로 제제화될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 크림, 연고, 페이스트, 젤, 젤리, 세럼(serum), 에어로졸 스프레이, 비-에어로졸 스프레이, 폼, 로션, 용액 또는 현탁액의 제형으로 제제화될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 적절하게 선정하여 배합할 수 있다. 첨가 가능한 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 제형으로 제제화될 수 있으며, 헤어크림, 헤어페이스트, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 국소 적용 시 목적 부위에 1일 1 내지 6회 적용(투여)될 수 있고, 일일 적용량(투여량)은 헤지호그 단백질의 양을 기준으로 0.001 mg 내지 1000 mg/일/체중kg, 바람직하게는 0.01 mg 내지 100 mg/일/체중kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg 내지 10 mg/일/체중kg일 수 있다. 이러한 투여량 및 횟수는 환자의 나이, 성별, 탈모의 진행 정도에 따라 적절히 증감하여 사용될 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 소닉 헤지호그 ( Shh ) 단백질의 제조
실시예 1.1.Shh 단백질의 cDNA 유전자 클로닝
Shh을 재조합 단백질로 발현시키기 위하여, 인간 간암 유래 세포주인 Huh7 세포로부터 총(total) RNA를 추출하여 이로부터 cDNA를 합성하였다. 인간 간암 유래 세포주인 Huh7을 10% 혈청 배지에서 5% 이산화탄소 37℃ 조건하에서 배양한 후(1x106 cell)에, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충액을 첨가하여 2회 세척하고 0.5 ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)을 직접 가하였다. 상기 RNA 추출액이 가해진 혼합물을 10분간 상온에서 방치한 후 0.1 ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤, 12,000 xg로 10분간 원심분리하였다. 그 다음, 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고, 12,000 xg로 10분간 원심분리하고 액체를 제거한 후, 75% 에탄올로 1회 세척하고 상온에서 RNA를 건조시켰다. RNAase가 없는 정제 증류수 50 μl를 가하고, 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다.
cDNA를 합성하기 위해 정제된 총 RNA 2 μg에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행시킨 후, 10X 역전사반응 완충용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다. cDNA 합성반응 후, 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 다음, RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하고, 이를 성숙형 Shh 유전자의 중합효소 연쇄반응의 주형으로 사용하였다. 인간 간암 유래 세포주로부터 전장 소닉 헤지호그 단백질의 아미노산 서열의 25번째 아미노산인 글리신부터 197번째 아미노산인 글리신을 포함하고, N-말단에 추가적으로 2개의 이소류신이 결합된 소닉 헤지호그 단백질을 코딩하는 유전자를 얻기 위해 아미노 말단을 암호화하는 프라이머(NdeShh) 5'-GGA TCC CAT ATG ATC ATC GGA CCG GGC AGG GGG TTC GG-3'(서열 번호 9)과 카르복실 말단을 암호화하는 프라이머(XShh) 5'-AAA AAA CTC GAG TTA GCC TCC CGA TTT GGC CGC CAC-3'(서열 번호 10)를 합성한 다음, 상기에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
0.2 pmol 프라이머(NdeShh)와 0.2 pmol 프라이머(XShh)를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 단위(unit)의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 및 40초, 58℃ 및 30초, 72℃ 및 1분의 40주기로 증폭 반응을 수행하였다. 반응 후에 증폭된 0.55 kbp의 DNA절편을 1% 아가로스겔에서 전기 영동하여 분리한 다음, pGEMT easy(Promega, USA) 벡터에 T4 DNA 연결효소를 이용하여 삽입하고, 이렇게 얻어진 DNA들을 염기서열 분석한 결과, Shh 단백질을 암호화하는 cDNA를 얻었음을 확인할 수 있었다. 이 과정으로 얻어진 Shh 유전자를 pTA-hShh 라고 명명하였다(서열 번호 1).
실시예 1.2. Shh 유전자의 대장균 발현 벡터 제조 및 발현
상기 서열 번호 1로 표시되는 Shh 유전자를 재조합 단백질로 대장균에서 발현시키기 위하여, 대장균용 단백질 발현 벡터인, T7 프로모터를 갖는 pET15b 발현 벡터에 Shh 유전자를 삽입하였다. 먼저 염기서열이 확인된 pTA-hShh 유전자 2 μg을 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단한 다음, 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 530 bp에 해당하는 DNA 절편을 얻어 이를 pET15b 발현벡터의 NdeI과 XhoI 절단 부위로 삽입하였다. 이러한 방법으로 제조된 벡터를 pET-hShh 이라고 명명하였다. 상기에서 얻어진 플라스미드 pET-hShh을 사용하여 대장균 BL21(DE3)pLys.S 균주를 형질전환시키고, 항생제 앰피실린이 첨가된 Luria-Bertani(LB) 고체배지에서 선별하였다. 이렇게 얻어진 단일 콜로니를 LB 액상 배지에서 37℃ 진탕배양기에서 배양하여 세포밀도가 600 nm 에서 0.4 흡광도에 도달하는 시점에 최종 0.5 mM 농도가 되도록 이소프로필티오갈락토사이드(Isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가한 후 4시간 더 진탕 배양을 실시하였다.
대장균 세포의 일부를 원심 분리하여 수득한 다음, 세포를 파쇄한 후 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하여 19 kDa크기의 Shh 단백질이 약하게 발현되었음을 확인하였다(도 1).
실시예 1.3. Shh 5' 말단 코딩 영역 유전자의 변형에 따른 Shh 발현율 증가를유도하기 위한 염기서열 변이
상기 실시예 1.2에서 얻어진 Shh 단백질의 발현을 증가시키기 위하여 Shh 아미노 말단의 코딩 부위에 대해 아미노산 서열의 변화 없이 염기서열의 변이만을 통해 발현율 증가를 다음과 같이 유도하였다. Shh 유전자의 5' 말단 코딩영역의 개시코돈(메티오닌)을 제외한 12개의 코돈을 아미노산의 변화가 없는 워블염기(wobble sequence)가 축퇴된 프라이머(RanNdeShh) 5'-GGA TCC CAT ATG ATH ATH GGN CCN GGN AGR GGN TTY GGN AAR AGR AGR CAC CCC AAA AAG CTG ACC CCT TTA GC-3'(서열 번호 11)와 카르복실 말단을 암호화하는 프라이머(XShh) 5'-AAA AAA CTC GAG TTA GCC TCC CGA TTT GGC CGC CAC-3'(서열 번호 10)를 이용하여 pTA-hShh DNA를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 0.2 pmol 프라이머(RanNdeShh)와 0.2 pmol 프라이머(XShh)를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 단위의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 및 40초, 58℃ 및 30초, 72℃ 및 1분의 25주기로 증폭 반응을 수행하였다. 반응 후에 증폭된 0.55 kbp의 DNA절편을 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후 1% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 분리하였다. 그 후, 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단된 pET15b 벡터에 T4DNA 연결효소를 이용하여 삽입하여 플라스미드 pET-hRanShh을 얻었다.
플라스미드 pET-hRanShh을 사용하여 대장균 BL21(DE3)pLys.S 균주를 형질전환시켰다. 그 후, 항생제 앰피실린이 첨가된 Luria-Bertani(LB) 고체배지에서 얻어진 콜로니들을 LB 액상 배지에서 37℃ 진탕배양기에서 배양하여 세포밀도가 600 nm 에서 0.4 흡광도에 도달하는 시점에 최종 0.5 mM 농도가 되도록 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가하였다. 그 후, 4시간 더 진탕 배양을 실시하였다. 대장균 세포의 일부를 원심 분리하여 수득한 다음, 세포를 파쇄한 후 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하였다. 이를 근거로, 기존의 pET-hShh 으로부터 얻은 발현율보다 현저하게 발현율이 증가된 변이체 벡터들(RanShh-6, RanShh-10, RanShh-16 및 RanShh-22)을 선별하였다(도 2). 상기 발현율이 현저히 증가된 변이체들의 5' 말단 유전자 염기서열을 하기 표 1에 나타내었다(서열 번호 2, 3, 4 및 5).
서열 번호 구분 서열
2 RanShh-6 5'-ATG ATC ATT GGT CCA GGC AGA GGG TTT GGG AAG AGA AGG CACCCCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3'
3 RanShh-10 5'-ATG ATC ATT GGT CCC GGC AGG GGA TTC GGG AAG AGA AGA CACCCCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3'
4 RanShh-16 5'-ATG ATT ATA GGG CCG GGC AGG GGG TTT GGT AAG AGA AGG CACCCCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3'
5 RanShh-22 5'-ATG ATA ATA GGG CCG GGG AGG GGG TTT GGG AAG AGA AGA CACCCCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3'
실시예 1.4.유비퀴틴이 융합된 Shh 발현벡터 제조 및 발현
개시코돈인 메티오닌이 제거된 Shh를 제조하기 위하여 유비퀴틴이 융합된 형태의 Shh를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제조하였다. 유비퀴틴 유전자를 얻기 위하여 프라이머(NdeUB) 5'-GGA TTC CAT ATG CAA CTT TTC GTC AAA ACT CTA AC-3'(서열 번호 12)과 프라이머(T2UB) 5'-ATG ACC ACC GCG GAG TCT CAA CAC CAA-3'(서열 번호 13)를 제조하고, 또한 상기 실시예 1.3.에서 얻은 변이체 RanShh-6을 유비퀴틴 융합 형태로 제조하기 위하여 프라이머(T2RanShh-6) 5'-GGA TCC CCG CGG TGG TAT CAT TGG TCC AGG CAG AGG G-3'(서열 번호 14)를 합성하였다. 0.2 pmol 프라이머(NdeUB)와 0.2 pmol 프라이머(T2UB)를 dNTP 0.2nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 단위의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 및 40초, 58℃ 및 30초, 72℃ 및 1분의 25주기로 증폭 반응을 수행하여 유전자 UB를 얻었다.
한편 0.2pmol 프라이머(T2RanShh-6)와 0.2 pmol 프라이머(XShh)를 dNTP 0.2 nM, 1x AccuPrime Taq DNA 중합효소 반응 완충용액(Invitrogen, USA) 및 1 단위의 AccuPrime Taq DNA 중합효소를 섞은 후, 중합효소 연쇄 반응 장치에서 95℃ 및 40초, 58℃ 및 30초, 72℃ 및 1분의 25주기로 증폭 반응을 수행하여 유전자 T2RanShh-6을 얻었다. 유전자 UB를 제한효소 NdeI과 SacII로 절단하고 유전자 T2RanShh-6를 제한효소 SacII 와 XhoI으로 절단하여 2% 아가로스 겔 전기영동하여 각각 210 bp와 550 bp의 DNA 단편을 얻은 후에 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단된 pET15b 벡터에 T4 DNA 연결효소를 이용하여 삽입하여 플라스미드 pET-UB-hRanShh을 얻었다. 이 과정으로 얻어진 유비퀴틴이 융합된 성숙형 Shh 유전자의 염기서열을 서열 번호 6으로 나타내었다.
이렇게 얻어진 단일 콜로니를 LB 액상 배지에서 37℃ 진탕 배양기에서 배양하여 세포밀도가 600 nm 에서 0.4 흡광도에 도달하는 시점에 최종 0.5 mM 농도가 되도록 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)를 첨가한 후 4시간 더 진탕 배양을 실시하였다. 대장균 세포의 일부를 원심 분리하여 수득한 다음, 세포를 파쇄한 후 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동을 실시하여 27 kDa 크기의 유비퀴틴이 융합된 형태의 Shh 단백질이 발현되었음을 확인하였다(도 3).
실시예 1 . 5.대장균 유래 재조합 Shh 단백질 분리 및 정제
유비퀴틴이 융합된 Shh를 발현하는 BL21(DE3)pLys.s 생산 균주를 LB 액상배지에 접종하고 37℃ 진탕 배양기에서 배양하여 흡광도가 OD600에서 0.4에 도달할 때 0.5 mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 추가 진탕 배양하여 유비퀴틴이 융합된 Shh 단백질을 발현시켰다. 배양 종료 후 원심분리를 이용하여 세포를 회수하고, 회수된 세포는 PBS를 이용하여 1회 세척한 다음 20 mM 소듐포스페이트, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8.0 용액을 이용하여 세포를 현탁시키고, 현탁된 세포는 소니케이터를 이용하여 파쇄공정을 수행하였다. 파쇄된 세포는 고속 원심분리기를 이용하여 원심분리 한 후 상등액을 회수하고, 회수된 상등액은 0.45 μm 필터를 이용하여 필터한 후 미리 패킹된 니켈 크로마토그래피 컬럼에 로딩하여 1차 정제를 수행하였다. 유비퀴틴이 융합된 Shh가 포함된 파쇄 용액을 로딩 후에 20 mM 소듐포스페이트, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8.0 용액을 이용하여 결합하지 않는 불순물이 검출되지 않을 때까지 세척용액을 흘려주고 20 mM 소듐포스페이트, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8.0 용액을 이용하여 용출하였으며, 단백질은 250 mM 이미다졸 농도에서 용출되었다. 1st 니켈 크로마토그래피에서 회수한 용출용액의 단백량을 측정한 후 유비퀴틴이 융합된 Shh 단백질로부터 유비퀴틴 단백질을 제거하고자 상기에서 1차 정제된 단백질과 효소 유비퀴틴 카복실-말단 하이드록실레이즈 1(UBP-1)을 70:1 비율로 첨가하여 20℃에서 12시간 동안 반응시켜 유비퀴틴을 특이적으로 제거하였다(도 4a).
절단된 유비퀴틴과 숙주 유래 단백질을 제거하기 위하여 반응 용액을 SP 양이온교환수지가 미리 패킹된 컬럼에 로딩하여 2차 크로마토그래피를 수행하였다. 반응 용액을 컬럼에 로딩하고 20 mM 트리스, pH 8.0 용액을 이용하여 결합되지 않는 불순물이 검출되지 않을 때까지 세척한 후, 20 mM 트리스, 1 M NaCl, pH 8.0 용액을 이용하여 500 mM NaCl 농도에서 유비퀴틴이 제거된 Shh 단백질(서열 번호 7)을 용출하였다(도 4a). 유비퀴틴이 융합된 Shh는 아미노 말단에 6개의 히스티딘 잔기가 결합되어 있으므로 상기 SP 양이온 교환수지(2nd SP chromatography)에서 유비퀴틴이 절단되지 않고 존재하는 유비퀴틴이 융합된 Shh 단백질로부터 유비퀴틴이 제거된 Shh 단백질을 순수 분리하기 위하여 Ni-친화 크로마토그래피(3rd Nickel chromatography)를 다시 수행하여 유비퀴틴이 제거된 Shh 단백질을 회수하였다(도 4b). 회수된 최종 Shh 단백질은 단백정량 및 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다(도 4c).
실시예 2. 재조합 Shh 단백질을 포함하는 수용성 미세 입자 및 이를 포함하는 크림 제조
2 g의 히알루론산, 4 g의 물 및 2,000 ㎍의 정제된 Shh 단백질을 배합한 혼합용액을 모서리가 뾰족하게 각이 진 다면체 형태의 작은 구멍이 형성된 플라스틱 판에 로딩하여 건조시킴으로써, 끝이 뾰족하게 각이 진 미세입자를 다량 제조하였다. 상기 제조된 끝이 각이 진 수용성 미세입자 1 g과 아스코빅애씨드 등과 같은 증량용 부형제 입자 11 g을 올리브오일을 포함하는 유상 성분 82 g에 가열한 상태에서 혼합한 후 교반기에서 천천히 1시간 이상 충분히 균일하게 혼합하였다. 이후, 상기 혼합물을 30℃까지 냉각시켜, Shh 단백질이 포집된(entrapped) 끝이 각이 진 형태의 수용성 미세입자가 유상 성분에 현탁(Suspension)된 페이스트 형태의 크림 조성물을 제조하였다.
비교예 1. 재조합 Shh 단백질을 포함하지 않는 수용성 미세 입자를 포함하는 조성물의 제조
2,000 ㎍의 Shh 단백질을 혼합하지 않은 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법으로 페이스트 형태의 조성물을 제조하였다.
실험예 1. 재조합 Shh 단백질 활성 측정 시험
상기 실시예 1.5.에서 얻은 Shh 단백질의 생물학적 활성을 측정하기 위하여 리포터 유전자를 이용한 세포기반 분석을 수행하였다. 세포 외에서 Shh의 활성은 세포 내 Gli 전사인자의 활성을 유도함에 따라, Gli 전사인자가 결합할 수 있는 염기서열 5'-GACCACCCA-3'(서열 번호 15)이 8번 반복된 유전자를 리포터 유전자인 루시퍼레이즈에 결합시킨 플라스미드 p8XGli-Luc와 베타-갈락토시데이즈 발현벡터인 플라스미드 pRSVb-gal을 마우스 상피세포인 NIH3T3 세포에 리포펙타민 방법으로 형질전환 시켰다. 이후, 6시간 뒤에 Shh 단백질을 100 ng/ml, 200 ng/ml, 500 ng/ml, 1,000 ng/ml 농도별로 처리하였다. 이때 대조군으로는 PBS를 사용하여 처리하였다. 이렇게 처리한 세포를 18시간동안 배양한 후에 루시퍼레이즈 활성을 측정하여 분석하였으며 이때 형질전환의 효율성을 보정하기 위하여베타갈락토시데이즈의 활성을 측정하여 얻어진 값으로 나누어진 루시퍼레이즈 값을 보정 루시퍼레이즈 값으로 결정하였다. Shh 단백질을 처리한 세포에서 얻어진 보정 루시퍼레이즈 값을 PBS만을 처리하여 얻어진 보정 루시퍼레이즈 값 대비 배수(fold) 값을 계산하여 Shh 활성 정도를 결정하였다(도 5).
실험예 2. 인간피부 유두종(dermal papilla) 세포에서 재조합 Shh 단백질 처리에 따른 헤지호그 신호전달 유전자의 발현 증가 시험
모낭에 존재하는 인간 피부 유두종 세포에서상기 실시예 1.5.에서 얻어진 Shh 단백질의 처리에 따른 유전자의 발현 증가 여부를 알아보기 위하여 다음과 세포기반 분석 실험을 진행하였다. 인간 피부 유두종 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 5x105 세포를 6-웰 플레이트에 배양을 하여 24시간 후에 100 ng/ml과 500 ng/ml의 농도로 Shh 단백질을 처리한 뒤 24시간을 더 배양하였다. 이후 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충용액을 첨가하여 2회 세척하고 0.5 ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)을 직접 가하였다. 10분간 상온에서 방치한 후 0.1 ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤 12,000 xg로 10분간 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고 12,000 xg로 10분간 원심분리한 뒤 액체를 제거한 후 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에서 건조시켰다. RNAase가 없는 정제 증류수 50 μl를 가하여 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다.
cDNA를 합성하기 위해 정제된 총 RNA 2 μg에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행 시킨 후 10X 역전사반응 완충용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다. 반응 후 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 뒤 RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하여 cDNA를 얻었다. 헤지호그 신호전달 경로에서 Shh에 의해 활성화 되는 것으로 알려진 유전자들의 발현 변화 여부를 하기 표 2에 나타난 프라이머들을 이용하여 정량적 중합연쇄반응(Quantitative RT-PCR)을 수행하였다. 이때 보정을 위한 유전자로서 β-액틴 유전자와 18S 유전자를 함께 정량화 하여 발현의 차이를 보정하였다. 실시예 1.5에서 제조된 Shh 단백질은 농도 의존적으로 Shh 신호전달 과정 중에 주요한 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(도 6a 내지 6i).
유전자 포워드 리버스
Gli1 5'-GGGATGATCCCACATCCTCAGTC-3'
(서열 번호 16)		 5'-CTGGAGCAGCCCCCCCAGT-3'
(서열 번호 17)
Gli2 5'-ACACGGGCTTTGGTCTCA-3'
(서열 번호 18)		 5'-CCCTTGGGCATAGCTTCT-3'
(서열 번호 19)
Cyclin D 5'-GCTCCTGTGCTGCGAAGT-3'
(서열 번호 20)		 5'-TGTTCCTCGCAGACCTCCAG-3'
(서열 번호 21)
Ptch1 5'-GGGTGGCACAGTCAAGAACAG-3'
(서열 번호 22)		 5'-TACCCCTTGAAGTGCTCGTACA-3'
(서열 번호 23)
Smo 5'-ACGAGGACGTGGAGGGCTG-3'
(서열 번호 24)		 5'-CGCACGGTATCGGTAGTTCT-3'
(서열 번호 25)
noggin 5'-CCATCATTTCCGAGTGCAAGTGCT-3'
(서열 번호 26)		 5'-AAGCTAGGTCTCTGTAGCCCAGAA-3'
(서열 번호 27)
Igfbp3 5'-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3'
(서열 번호 28)		 5'-GGATGACACAGCGTGAGAGA-3'
(서열 번호 29)
FGFR2 5'-GATAAATACTTCCAATGCAGAAGTGCT-3'
(서열 번호 30)		 5'-TGCCCTATATAATTGGAGACCTTACA-3'
(서열 번호 31)
D2 5'-ACTTCCTGCTGGTCTACATTGATG-3'
(서열 번호 32)		 5'-CTTCCTGGTTCTGGTGCTTCTTC-3'
(서열 번호 33)
실험예 3. 인간 피부 유두종 세포에서 Shh 단백질 처리에 따른 유전자 발현 비교
모낭에 존재하는 인간 피부 유두종 세포에서 Shh 단백질 처리에 따른 모발 관련 유전자의 발현 변화 여부를 알아보기 위하여, 다음과 같이 세포기반 분석 실험을 진행하였다. 먼저, 인간 피부 유두종 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 인간 피부유두종 세포 약 2x105 세포를 6-웰 플레이트에 배양을 하여 24시간 후에 다음과 같은 조건으로 단백질을 처리하였다:
1) 단백질을 처리하지 않은 대조군
2) 5 ㎍/ml의 Shh를 처리하여 24시간 동안 배양한 군.
단백질 처리 후 약 24시간을 더 배양한 후, 배양액을 제거하고 세포에 PBS 완충용액을 첨가하여 2회 세척하고, 0.5 ml의 RNA 추출액(Trizol reagent, Thermo Fisher Scientific)을 직접 가하였다. 10분간 상온에서 방치한 후 0.1 ml의 클로로포름을 첨가하여 15초간 교반한 뒤 12,000 xg로 10분간 원심분리 하였다. 분리된 상층액을 취하여 동일 부피의 이소프로필알콜을 첨가하고 12,000 xg로 10분간 원심분리한 뒤, 액체를 제거한 후 75% 에탄올로 1회 세척을 하고 상온에서 건조시켰다. RNAase가 없는 정제 증류수 50 ul를 가하여 분광광도계를 이용하여 RNA의 정량 및 순도를 측정하였다. cDNA를 합성하기 위해 정제된 총 RNA 2 ug에 oligo dT와 결합 반응을 70℃에서 5분간 진행시킨 후 10X 역전사반응 완충용액, 10 mM dNTP, RNAse 저해제, 및 M-MLV 역전사효소(Enzynomics, Korea)를 가하여 cDNA 합성반응을 42℃에서 60분간 수행하였다. 반응 후 72℃에서 5분간 가열하여 역전사효소를 불활성화시킨 뒤, RNase H를 첨가하여 단일가닥의 RNA를 제거하여 cDNA를 얻었다. Shh에 의해 활성화되는 것으로 알려진 유전자들의 발현 변화 여부를 하기 표 3에 나타난 프라이머들을 이용하여 정량적 중합연쇄반응(Quantitative RT-PCR)을 수행하였다.
프라이머 서열
hVersican
 forward 5'-GGG ATT GAA GAC ACA CAA GAC ACG-3'(서열번호 34)
reverse 5'-TGC TCT GGA GTT GCT ATG ACT GCC-3'(서열번호 35)
hβ-catenin
 forward 5'-CCC ACT AAT GTC CAG CGT TT-3'(서열번호 36)
reverse 5'-AAC CAA GCA TTT TCA TCA CCA GG-3'(서열번호 37)
이때, 보정을 위한 유전자로서 β-액틴 유전자와 18S 유전자를 함께 정량화하여 발현의 차이를 보정하였다. 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1.5에서 제조된 Shh는 Versican 유전자와 β-catenin 유전자를 증가시키는 것을 알 수 있었다.
실험예 4. Shh 단백질이 포함된 수용성 미세입자의 효능 확인
상기 실시예 2에서 제조된 Shh 단백질이 포집된 수용성 미세입자가 현탁된 크림 조성물을 두 명의 피험자 두피에 매일 도포하여 발모 효과를 확인하였다. 이때, 피험자 정보는 다음과 같다: 1. 피험자 A(임xx, 49세), 2. 피험자 B(정xx, 52세). 구체적으로, 피험자 A는 1개월간 매일 크림 0.2 g을 두피에 바르고 20 내지 30초 정도 스크럽하여 문지른 후, 물이 함유된 미스트를 3 내지 4회 골고루 뿌려주고, 다시 20 내지 30초 정도 마사지 하듯이 부드럽게 문질러 수용성 미세입자를 완전히 녹였다. 피험자 B는 4개월간 피험자 A와 동일한 방법으로 매일 0.2 g의 크림을 두피에 도포하여 사용하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 두 명의 피험자 A 및 B 모두에서 모발 숱이 많아지고 굵어지는 효과를 확인할 수 있었다.
<110> Paean Biotechnology Inc. <120> A MICROPARTICLE COMPRISING HEDGEHOG PROTEIN AND BIOCOMPATIBLE MATERIAL AND A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING HAIR LOSS COMPRISING THE SAME <130> FPD/201810-0023 <150> KR 10-2017-0161721 <151> 2017-11-29 <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTA-hShh <400> 1 atcatcggac cgggcagggg gttcgggaag aggaggcacc ccaaaaagct gaccccttta 60 gcctacaagc agtttatccc caatgtggcc gagaagaccc taggcgccag cggaaggtat 120 gaagggaaga tctccagaaa ctccgagcga tttaaggaac tcacccccaa ttacaacccc 180 gacatcatat ttaaggatga agaaaacacc ggagcggaca ggctgatgac tcagaggtgt 240 aaggacaagt tgaacgcttt ggccatctcg gtgatgaacc agtggccagg agtgaaactg 300 cgggtgaccg agggctggga cgaagatggc caccactcag aggagtctct gcactacgag 360 ggccgcgcag tggacatcac cacgtctgac cgcgaccgca gcaagtacgg catgctggcc 420 cgcctggcgg tggaggccgg cttcgactgg gtgtactacg agtccaaggc acatatccac 480 tgctcggtga aagcagagaa ctcggtggcg gccaaatcgg gaggc 525 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RanShh-6 <400> 2 atgatcattg gtccaggcag agggtttggg aagagaaggc accccaaaaa gctgacccct 60 tta 63 <210> 3 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RanShh-10 <400> 3 atgatcattg gtcccggcag gggattcggg aagagaagac accccaaaaa gctgacccct 60 tta 63 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RanShh-16 <400> 4 atgattatag ggccgggcag ggggtttggt aagagaaggc accccaaaaa gctgacccct 60 tta 63 <210> 5 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RanShh-22 <400> 5 atgataatag ggccggggag ggggtttggg aagagaagac accccaaaaa gctgacccct 60 tta 63 <210> 6 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin-fused matured shh gene sequence <400> 6 atgcaacttt tcgtcaaaac tctaacaggg aagactgtaa ccctagaggt tgaatcttcc 60 gacactattg acaacgtcaa aagtaaaatt caagataaag aaggtatccc tccggatcag 120 cagagattga tttttgctgg taagcaacta gaagatggta gaaccttgtc tgactacaac 180 atccaaaagg aatctactct tcacttggtg ttgagactcc gcggtggtat cattggtcca 240 ggcagagggt ttgggaagag aaggcacccc aaaaagctga cccctttagc ctacaagcag 300 tttatcccca atgtggccga gaagacccta ggcgccagcg gaaggtatga agggaagatc 360 tccagaaact ccgagcgatt taaggaactc acccccaatt acaaccccga catcatattt 420 aaggatgaag aaaacaccgg agcggacagg ctgatgactc agaggtgtaa ggacaagttg 480 aacgctttgg ccatctcggt gatgaaccag tggccaggag tgaaactgcg ggtgaccgag 540 ggctgggacg aagatggcca ccactcagag gagtctctgc actacgaggg ccgcgcagtg 600 gacatcacca cgtctgaccg cgaccgcagc aagtacggca tgctggcccg cctggcggtg 660 gaggccggct tcgactgggt gtactacgag tccaaggcac atatccactg ctcggtgaaa 720 gcagagaact cggtggcggc caaatcggga ggctaa 756 <210> 7 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shh protein <400> 7 Ile Ile Gly Pro Gly Arg Gly Phe Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys 1 5 10 15 Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys 20 25 30 Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Arg Asn Ser 35 40 45 Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe 50 55 60 Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys 65 70 75 80 Lys Asp Lys Leu Asn Ala Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Trp Pro 85 90 95 Gly Val Lys Leu Arg Val Thr Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His 100 105 110 Ser Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr 115 120 125 Ser Asp Arg Asp Arg Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val 130 135 140 Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His 145 150 155 160 Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly 165 170 175 <210> 8 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin-fused Shh protein <400> 8 Met Gln Leu Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Val Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ser Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Ile Gly Pro 65 70 75 80 Gly Arg Gly Phe Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu 85 90 95 Ala Tyr Lys Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala 100 105 110 Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Ser Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys 115 120 125 Glu Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu 130 135 140 Asn Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys Asp Lys Leu 145 150 155 160 Asn Ala Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Gln Trp Pro Gly Val Lys Leu 165 170 175 Arg Val Thr Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Ser Glu Glu Ser 180 185 190 Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser Asp Arg Asp 195 200 205 Arg Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe 210 215 220 Asp Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Val Lys 225 230 235 240 Ala Glu Asn Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly 245 250 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NdeShh primer <400> 9 ggatcccata tgatcatcgg accgggcagg gggttcgg 38 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XShh primer <400> 10 aaaaaactcg agttagcctc ccgatttggc cgccac 36 <210> 11 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RanNdeShh primer <400> 11 ggatcccata tgathathgg nccnggnagr ggnttyggna aragragrca ccccaaaaag 60 ctgacccctt tagc 74 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NdeUB primer <400> 12 ggattccata tgcaactttt cgtcaaaact ctaac 35 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2UB primer <400> 13 atgaccaccg cggagtctca acaccaa 27 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2RanShh-6 primer <400> 14 ggatccccgc ggtggtatca ttggtccagg cagaggg 37 <210> 15 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequences which can be binded by Gli transcription factor <400> 15 gaccaccca 9 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Gli 1, forward) <400> 16 gggatgatcc cacatcctca gtc 23 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Gli 1, reverse) <400> 17 ctggagcagc ccccccagt 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Gli 2, forward) <400> 18 acacgggctt tggtctca 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Gli 2, reverse) <400> 19 cccttgggca tagcttct 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(cyclin D, forward) <400> 20 gctcctgtgc tgcgaagt 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(cyclin D, reverse) <400> 21 tgttcctcgc agacctccag 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Ptch1, forward) <400> 22 gggtggcaca gtcaagaaca g 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Ptch1, reverse) <400> 23 taccccttga agtgctcgta ca 22 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Smo, forward) <400> 24 acgaggacgt ggagggctg 19 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Smo, reverse) <400> 25 cgcacggtat cggtagttct 20 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(noggin, forward) <400> 26 ccatcatttc cgagtgcaag tgct 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(noggin, reverse) <400> 27 aagctaggtc tctgtagccc agaa 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Igfbp3, forward) <400> 28 tgcccagaaa atgaaaaagg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(Igfbp3, reverse) <400> 29 ggatgacaca gcgtgagaga 20 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(FGFR2, forward) <400> 30 gataaatact tccaatgcag aagtgct 27 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(FGFR2, reverse) <400> 31 tgccctatat aattggagac cttaca 26 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(D2, forward) <400> 32 acttcctgct ggtctacatt gatg 24 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(D2, reverse) <400> 33 cttcctggtt ctggtgcttc ttc 23 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVersican forward primer <400> 34 gggattgaag acacacaaga cacg 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVersican reverse primer <400> 35 tgctctggag ttgctatgac tgcc 24 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h beta-catenin forward primer <400> 36 cccactaatg tccagcgttt 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h beta-catenin reverse primer <400> 37 aaccaagcat tttcatcacc agg 23

Claims (13)

  1. 헤지호그 단백질이 생체 적합성 물질 내에 포함된 미세 입자를 포함하되,
    상기 생체 적합성 물질은 다당류, 폴리비닐알콜, 카르복시비닐 중합체, 키토산, 히알루론산, 셀룰로오스 중합체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 미세 입자는 체액 또는 물에 용해되고, 적어도 하나의 꼭짓점을 갖는 입체 도형 형태로서 한 면의 가로 길이가 50 μm 내지 500 μm인,
    탈모 예방 또는 치료용 외용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 헤지호그 단백질은 소닉 헤지호그 단백질인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 미세 입자는 사면체, 오면체 또는 원뿔 형태인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 미세 입자의 적어도 하나의 면에 함몰부가 형성되어 있고, 상기 함몰부의 깊이는 상기 미세 입자의 높이의 1/2 이내인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 크림, 연고, 페이스트, 젤, 젤리, 세럼(serum), 에어로졸 스프레이, 비-에어로졸 스프레이, 폼, 로션, 용액 또는 현탁액의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  12. 헤지호그 단백질이 생체 적합성 물질 내에 포함된 미세 입자를 포함하되,
    상기 생체 적합성 물질은 다당류, 폴리비닐알콜, 카르복시비닐 중합체, 키토산, 히알루론산, 셀룰로오스 중합체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 미세 입자는 체액 또는 물에 용해되고, 적어도 하나의 꼭짓점을 갖는 입체 도형 형태로서 한 면의 가로 길이가 50 μm 내지 500 μm인,
    탈모 방지, 모발 성장 또는 발모 촉진용 화장료 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 헤어크림, 헤어페이스트, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
KR1020180150740A 2017-11-29 2018-11-29 헤지호그 단백질 및 생체 적합성 물질을 포함하는 미세 입자 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 치료용 조성물 KR102176832B1 (ko)

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