KR102176825B1 - Electrochemiluminescent probe for detection of homocysteine - Google Patents
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Abstract
본 발명은 호모시스테인과 반응하여 전기화학발광을 나타내는 호모시스테인 선택성을 갖는 전기화학발광 프로브에 관한 것이다.The present invention relates to an electrochemiluminescent probe having homocysteine selectivity that reacts with homocysteine to exhibit electrochemiluminescence.
Description
본 발명은 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브에 관한 것으로, 보다 상세하게는 호모시스테인과 반응하여 전기화학발광을 나타내는 호모시스테인 선택성을 갖는 이리듐 착화합물을 포함하는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브에 관한 것이다. The present invention relates to an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine, and more particularly, to an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine comprising an iridium complex compound having homocysteine selectivity that reacts with homocysteine to exhibit electrochemiluminescence.
호모시스테인(homocysteine; Hcy)은 메티오닌의 탈메틸화에 의해 생성되는 자연 발생적인 황 함유 아미노산으로, 동물과 식물 단백질에서 모두 발견되는 필수 아미노산이다. 혈장 내에서 5-15 μM 사이의 호모시스테인 농도는 일반적으로 정상으로 간주되고 있다. 호모시스테인의 농도가 증가하면 심혈관질환, 알츠하이머, 신경관 결함 및 골다공증의 원인이 된다. 미국인의 호모시스테인 농도는 평균 8 μM 이었으며, 1991-2004년 동안 호모시스테인 농도 증가(>13 μM)로 60세 이상의 고령자들의 20~30%가 고통받았다고 보고되었다. Homocysteine (Hcy) is a naturally occurring sulfur-containing amino acid produced by the demethylation of methionine and is an essential amino acid found in both animal and plant proteins. Homocysteine concentrations between 5-15 μM in plasma are generally considered normal. Increased homocysteine concentrations cause cardiovascular disease, Alzheimer's disease, neural tube defects and osteoporosis. The average homocysteine concentration in Americans was 8 μM, and it was reported that 20-30% of the elderly over the age of 60 suffered from an increase in homocysteine concentration (>13 μM) during 1991-2004.
호모시스테인 농도를 결정하는 방법으로 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 비색분석, 방사성 분석, 광발광(photoluminescence; PL) 면역 검정법 및 형광 분자센서와 같은 방법이 제시되었다[(a) Clin. Chem. 48, 941-944; (b) J. Am. Chem. Soc. 126, 438-439; (c) Lipid Res. 39, 925-933; (d) Inorg. Chem. 46, 11075-11108]. 상기와 같은 방법들은 호모시스테인 농도의 측정에 대해 우수한 성능을 나타내나, 이러한 접근법들은 부피가 큰 광원과 결합된 분광계측을 필요로 하는 단점이 있다. Methods such as high-performance liquid chromatography (HPLC), colorimetric analysis, radiometric analysis, photoluminescence (PL) immunoassay, and fluorescent molecular sensor have been suggested as methods for determining homocysteine concentration [(a) Clin. Chem. 48, 941-944; (b) J. Am. Chem. Soc. 126, 438-439; (c) Lipid Res. 39, 925-933; (d) Inorg. Chem. 46, 11075-11108]. The above methods show excellent performance for the measurement of homocysteine concentration, but these approaches have the disadvantage of requiring spectrometry in combination with a bulky light source.
전기화학적 발광은 전기화학적으로 생성된 라디컬들 사이의 전자 전달을 통한 발광과정을 의미하며, 별도의 광원이나 부피가 큰 장비를 필요로 하지 않기 때문에 장비의 소형화가 용이하고, 높은 감도를 가지므로 현장 진단 검출 시스템에 최적화되어 있다고 할 수 있다. 지금까지 발표된 대부분의 전기화학적 발광 시스템 기반의 센서들은 면역분석법에 그 기반을 두고 있으며, 이중 몇몇은 실제로 상용화되어 다양하게 활용되고 있다. 지금까지 발표된 면역분석법 기반의 ECL 센서들은 항원-항체 반응이나 DNA 혼성화와 같은 특정 생물학적 결합에 의존하기 때문에 분석대상이 단백질이나 일부 효소 또는 이들과 관련된 일부 단분자들로 제한되어 있다는 한계점이 있다. 또한, 이러한 생물학적 기반의 분석법은 대부분 신호 물질의 표지 여부에 의한 신호의 유무를 통해 특정 물질을 분석하기 때문에 떨어져 나간 신호 물질들을 씻어내 주기 위한 별도의 추가적인 세척 과정을 필요로 한다. 이에 대한 대안으로 특정 수용체를 가진 형광 단분자 화학 센서에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔지만, 형광 기반 센서의 경우 신호 변화 확인을 위해 별도의 광원을 통한 분자 여기(excitation) 과정이 필요하여 장비의 소형화 및 기기 가격 인하가 어렵다는 한계점이 있다. 또한, 상기와 같은 방법들은 전문가가 아닌 일반인이 분석기기를 다루거나 데이터를 해석하는 것이 용이하지 않으므로, 누구나 간편하고, 상시적으로 질병을 진단할 수 있는 개념의 현장 진단용 장비에 활용하기는 어렵다는 한계를 가진다. Electrochemical light emission refers to the process of light emission through electron transfer between electrochemically generated radicals, and because it does not require a separate light source or bulky equipment, it is easy to miniaturize the equipment and has high sensitivity. It can be said that it is optimized for field diagnosis detection system. Most of the electrochemical light-emitting system-based sensors published so far are based on immunoassays, and some of them are actually commercialized and used in various ways. Immunoassay-based ECL sensors that have been published so far have limitations in that analytes are limited to proteins, some enzymes, or some single molecules related to them because they rely on specific biological bindings such as antigen-antibody reactions or DNA hybridization. In addition, since most of these biological-based analysis methods analyze a specific substance through the presence or absence of a signal based on whether the signal substance is labeled or not, a separate additional washing process is required to wash away the separated signal substances. As an alternative to this, research on fluorescent monomolecular chemical sensors with specific receptors has been steadily progressing. However, in the case of fluorescence-based sensors, a molecular excitation process through a separate light source is required to check signal changes, thus miniaturizing the equipment and There is a limitation in that it is difficult to reduce device prices. In addition, since the above methods are not easy for ordinary people, not experts, to handle analyzers or interpret data, it is difficult for anyone to use them in field diagnosis equipment with a concept that is convenient and can diagnose diseases at all times. Have.
따라서, 심혈관 질환 등에 대하여 누구나, 쉽고, 경제적으로 심혈관 질환을 조기에 진단할 수 있도록 간단하고 쉬운 분석법을 통해 호모시스테인의 농도를 측정할 수 있는 방법이 요구된다.Therefore, there is a need for a method capable of measuring the concentration of homocysteine through a simple and easy analysis method so that anyone can easily and economically diagnose cardiovascular disease early with respect to cardiovascular disease.
본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 호모시스테인의 농도를 정성적 또는 정량적으로 측정할 수 있는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 제공하는 것이다. The first problem to be solved by the present invention is to provide an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine capable of qualitatively or quantitatively measuring the concentration of homocysteine.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 이용한 호모시스테인의 검출방법을 제공하는 것이다. A second problem to be solved by the present invention is to provide a method for detecting homocysteine using an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서를 제공하는 것이다.A third problem to be solved by the present invention is to provide an electrochemiluminescent sensor including an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine.
상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 제공한다:In order to solve the above problems, the present invention provides an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine comprising a compound represented by the following Formula 1:
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서, In Formula 1,
L는 비발광성 리간드이며;L is a non-luminescent ligand;
A는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 퀴놀린, 페난트리딘, β-안트라피리딘, 벤조티아졸, 벤조옥사졸 및 벤조이미다졸 중에서 선택되고; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C1 - 10알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환되며;A is a 2 to 3 ring condensed heteroaryl including N and Z 1 ; The condensed heteroaryl is selected from quinoline, phenanthridine, β-anthrapyridine, benzothiazole, benzoxazole and benzoimidazole; The condensed heteroaryl is unsubstituted, or C 1 - 10 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1 - 10 alkyloxy, nitro, and cyano is substituted with one to three is selected from;
R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 니트로, 시아노, C1 - 10알킬, C3 - 12시클로알킬, C5 - 12아릴, C1 - 10알킬옥시, C5-12아릴옥시 및 C5 - 12아릴C1 - 3알킬옥시 중에서 선택되고; 상기 C5 - 12아릴 또는 C5 - 12아릴옥시는 비치환되거나 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6알킬옥시로 치환되고;R 1, R 2 and R 3 are each the same or different, each independently represent hydrogen, hydroxy, halo, nitro, cyano, C 1 - 10 alkyl, C 3 - 12 cycloalkyl, C 5 - 12 aryl, C 1 - 10 alkyloxy, C 5-12 aryloxy and C 5 - is selected from 3-alkyl-oxy-C 1 12 aryl; The C 5 - 12 aryl or C 5 - 12 aryl-oxy are unsubstituted or C 1 - 6 alkyl or C 1 - 6 alkyl being substituted with aryloxy;
Z1은 C, O, S 및 NRa 중에서 선택되며; Ra는 H 또는 C1 - 10알킬이고, Z 1 is selected from C, O, S and NR a ; R a is H or C 1 - 10 alkyl, and,
A가 퀴놀린이고, R3이 수소인 경우, R1 및 R2는 각각 수소 또는 C1 - 10알킬옥시가 아니다.When A is quinoline, and the R 3 is hydrogen, R 1 and R 2 are each hydrogen or C 1 - 10 alkyloxy not.
본 발명에 의하면, 상기 A는 하기 구조로부터 선택되는 것일 수 있다:According to the present invention, A may be selected from the following structures:
상기 화학식에서, In the above formula,
R4는 수소, C1 - 10알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되고,R 4 is hydrogen, C 1 - is selected from the 10 alkyloxy, nitro, and cyano, - 10 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1
m은 0 내지 3의 정수이며, m is an integer from 0 to 3,
Z1은 C, O, S 및 NRa 중에서 선택되며; Ra는 H 또는 C1 - 10알킬이고, Z 1 is selected from C, O, S and NR a ; R a is H or C 1 - 10 alkyl, and,
A가 퀴놀린이고, R3이 수소인 경우, R1 및 R2는 각각 수소 또는 C1 - 10알킬옥시가 아니다.When A is quinoline, and the R 3 is hydrogen, R 1 and R 2 are each hydrogen or C 1 - 10 alkyloxy not.
본 발명에 의하면, 비발광성 리간드 L은 하기 구조로부터 선택되는 것일 수 있다:According to the present invention, the non-luminescent ligand L may be selected from the following structures:
상기 화학식에서, In the above formula,
R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 10알킬, 할로C1 - 6알킬 및 C5 - 12아릴 중에서 선택된다. R 6, R 7, R 8 ,
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 호모시스테인과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있다.In the present invention, the compound of Formula 1 may selectively react with homocysteine to increase the electrochemiluminescence signal.
본 발명에 의하면, 상기 화학식 1의 화합물의 포밀기와 호모시스테인이 반응하여 육각 고리를 형성하며, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있다. According to the present invention, the formyl group of the compound of
본 발명에 의하면, 화학식 1의 화합물과 호모시스테인의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮은 것일 수 있다.According to the present invention, the LUMO energy level of the reaction product of the compound of Formula 1 and homocysteine may be lower than the HOMO energy level of the electrochemiluminescent co-reactant.
본 발명에 의하면, 상기 전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올일 수 있다. According to the present invention, the electrochemiluminescent co-reactant may be tripropylamine or 2-(dibutylamino)ethanol.
또한, 본 발명은 상기전기화학발광 프로브를 이용하는, 생체 내 호모시스테인의 검출 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for detecting homocysteine in vivo using the electrochemiluminescent probe.
또한, 본 발명은 상기 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서를 제공한다.In addition, the present invention provides an electrochemiluminescent sensor including the electrochemiluminescent probe.
본 발명에 있어서, 상기 전기화학발광 센서는 호모시스테인과의 반응에 의해 청색 이동된 영역에서 전기화학발광의 변화 검출을 이용하는 것일 수 있다.In the present invention, the electrochemiluminescence sensor may be used to detect a change in electrochemiluminescence in a blue-shifted region by reaction with homocysteine.
본 발명에 따른 전기화학발광 프로브는 전기화학발광 기반의 분석시스템과 단분자 화학센서를 융합시킨 것으로서, 호모시스테인에 대해 높은 선택성과 민감도를 동시에 가진다. 구체적으로 본 발명의 프로브는 수용액상에서 호모시스테인이 존재할 때 전기적인 트리거링(triggering)에 의해 강한 전기화학발광을 나타낸다. 본 발명에 따른 전기화학발광 프로브는 호모시스테인에 대한 선택성이 매우 우수하여, 여러 가지 다른 아미노산과 구별되는 현저한 전기화학발광을 나타내므로, 호모시스테인의 양을 정량적으로 용이하게 분석할 수 있다.The electrochemiluminescent probe according to the present invention is a fusion of an electrochemiluminescence-based analysis system and a single molecule chemical sensor, and has high selectivity and sensitivity to homocysteine at the same time. Specifically, the probe of the present invention exhibits strong electrochemiluminescence by electrical triggering when homocysteine is present in an aqueous solution. The electrochemiluminescent probe according to the present invention has very good selectivity for homocysteine and exhibits remarkable electrochemiluminescence distinguished from various other amino acids, so that the amount of homocysteine can be easily quantitatively analyzed.
체내에 존재하는 호모시스테인의 양은 심혈관 질환과 직접적으로 관련이 되어 있는 것으로 잘 알려져 있는 바, 본 발명에 따른 전기화학발광 프로브를 이용하면, 종래기술에 비해 간단하면서도 빠르고, 정확한 방법으로 체내에 있는 호모시스테인의 양을 정량할 수 있으므로, 현장 진단용 장비로 적용이 가능하기 때문에 산업상 유용하다. It is well known that the amount of homocysteine present in the body is directly related to cardiovascular disease. When the electrochemiluminescent probe according to the present invention is used, the homocysteine in the body is simpler, faster, and more accurate than the prior art. Since the quantity can be quantified, it is useful in the industry because it can be applied as a field diagnosis equipment.
도 1은 밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산으로 얻어진 본 발명의 일 실시예(a) 및 비교예(b)에 따른 프로브의 호모시스테인(Hcy) 감지를 열역학적으로 설명한 도이다.
도 2는 DFT 계산으로 얻어진 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 프로브 1, 프로브 4 및 프로브 5의 Hcy 감지를 열역학적으로 설명한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 프로브 1(a), 프로브 4(b) 및 프로브 5(c) (각각 10 μM)를 Hcy (5 mM) 존재(파랑)/부재(검정)하에서 측정한 인광 방출 스펙트럼을 확인한 결과이다(H2O/MeCN (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES). λex= 500 nm. (a)
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브를 이용하여 전기화학발광 특성을 평가한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브의 호모시스테인 농도에 따른 전기화학발광 특성을 평가한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로브의 호모시스테인 선택성을 평가한 결과이다. 1 is a diagram for thermodynamically explaining the detection of homocysteine (Hcy) of a probe according to an embodiment (a) and comparative example (b) of the present invention obtained by calculating a density functional theory (DFT).
2 is a diagram for thermodynamically explaining Hcy detection of
Figure 3 is a probe 1 (a), probe 4 (b) and probe 5 (c) (each 10 μM) prepared according to an embodiment of the present invention Hcy (5 mM) presence (blue) / absence (black) This is the result of confirming the phosphorescence emission spectrum measured under (H 2 O/MeCN (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES). λex= 500 nm. (a)
4 is a result of evaluating electrochemiluminescence characteristics using a probe according to an embodiment of the present invention.
5 is a result of evaluating electrochemiluminescence characteristics according to homocysteine concentration of a probe according to an embodiment of the present invention.
6 is a result of evaluating homocysteine selectivity of a probe according to an embodiment of the present invention.
특정 수용체나 반응자리에 발광체를 도입함으로써 특정 분석물과 결합 또는 반응시 선택적으로 신호 변화를 유발하는 단분자 화학센서는 분석 대상의 제한이 없고, 특히 분석물의 존재 여부에 따라 분자의 특성이 자체적으로 변화함으로써 신호의 변화를 유발하기 때문에 세척 등의 추가적인 분석 과정이 전혀 필요하지 않는다는 장점이 있다. A single-molecule chemical sensor that selectively causes a signal change when binding or reacting with a specific analyte by introducing a luminous substance at a specific receptor or reaction site has no limitations on the analyte. Since the change causes a change in the signal, there is an advantage that no additional analysis process such as washing is required at all.
전기화학발광(electrochemiluminescence; ECL)과 결합된 화학요법 접근법은 기존의 분석 기술에 비해 여러 가지 이점이 있다. 전기화학은 부피가 큰 장비, 추가 시약 또는 동위원소를 필요로 하지 않으며, 간단하고 경제적인 화학분석을 가능하게 한다. 발광은 전기화학적으로 유발된 화학 발광 과정을 통해서만 생성될 수 있기 때문에 배경(background) 형광 방출 없이 매우 민감하다. 또한 화학적인 방법은 합성 프로브와 표적 분자 사이의 비가역적인 화학반응으로 인해 표적분자를 우수하게 선택적으로 인식하고 감지할 수 있다. The chemotherapy approach combined with electrochemiluminescence (ECL) has several advantages over conventional analytical techniques. Electrochemistry does not require bulky equipment, additional reagents or isotopes, and allows simple and economical chemical analysis. Since luminescence can only be produced through an electrochemically induced chemiluminescence process, it is very sensitive without emitting background fluorescence. In addition, the chemical method can selectively recognize and detect the target molecule due to the irreversible chemical reaction between the synthetic probe and the target molecule.
본 발명의 발명자들은 고리형 이리듐 착화합물 기반의 단분자와 호모시스테인의 선택적 반응과 전기화학발광 기법을 통해 호모시스테인의 양을 정량적 또는/및 정성적으로 검출할 수 있는 전기화학발광 프로브를 개발하였으며, 이를 이용하여 다양한 심혈관계 질환 등의 조기 진단에 활용할 수 있는 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. The inventors of the present invention have developed an electrochemiluminescent probe capable of quantitatively or/and qualitatively detecting the amount of homocysteine through the selective reaction of a monomolecular and homocysteine based on a cyclic iridium complex and an electrochemiluminescence technique. Thus, the present invention was completed by confirming the possibility that it can be used for early diagnosis of various cardiovascular diseases.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브를 제공한다:The present invention provides an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine comprising a compound represented by the following Formula 1:
[화학식 1][Formula 1]
상기 화학식 1에서, In
L는 비발광성 리간드이며;L is a non-luminescent ligand;
A는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 퀴놀린, 페난트리딘, β-안트라피리딘, 벤조티아졸, 벤조옥사졸 및 벤조이미다졸 중에서 선택되고; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C1 - 10알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환되며;A is a 2 to 3 ring condensed heteroaryl including N and Z 1 ; The condensed heteroaryl is selected from quinoline, phenanthridine, β-anthrapyridine, benzothiazole, benzoxazole and benzoimidazole; The condensed heteroaryl is unsubstituted, or C 1 - 10 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1 - 10 alkyloxy, nitro, and cyano is substituted with one to three is selected from;
R1, R2 및 R3은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 전자 공여체(electron donationg group)일 수 있으며, 바람직하게는 H, 히드록시, 할로, 니트로, 시아노, C1 - 10알킬, C3 - 12시클로알킬, C5 - 12아릴, C1 - 10알킬옥시, C5 - 12아릴옥시 및 C5-12아릴C1 - 3알킬옥시 중에서 선택되고; 상기 C5 - 12아릴 또는 C5 - 12아릴옥시는 비치환되거나 C1 - 6알킬 또는 C1 - 6알킬옥시로 치환되고;R 1, R 2 and R 3 are each the same or different, may be each independently an electron donor (electron donationg group), preferably H, hydroxy, halo, nitro, cyano, C 1 - 10 alkyl, , C 3 - 12 cycloalkyl, C 5 - 12 aryl, C 1 - 10 alkyloxy, C 5 - 12 aryloxy and C 5-12 aryl C 1 - is selected from 3-alkyl-oxy; The C 5 - 12 aryl or C 5 - 12 aryl-oxy are unsubstituted or C 1 - 6 alkyl or C 1 - 6 alkyl being substituted with aryloxy;
Z1은 C, O, S 및 NRa 중에서 선택되며; Ra는 H 또는 C1 - 10알킬이고, Z 1 is selected from C, O, S and NR a ; R a is H or C 1 - 10 alkyl, and,
A가 퀴놀린이고, R3이 수소인 경우, R1 및 R2는 각각 수소 또는 C1 - 10알킬옥시가 아니다.When A is quinoline, and the R 3 is hydrogen, R 1 and R 2 are each hydrogen or C 1 - 10 alkyloxy not.
본 발명에 의하면, 할로는 플로오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도일 수 있다. In accordance with the present invention, halo may be fluoro, chloro, bromo or iodo.
본 발명의 일 구현예에 의하면, C1 - 10알킬은 직쇄 또는 분지형 C1 - 10알킬일 수 있으며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.According to one embodiment of the invention, C 1 - 10 alkyl is linear or branched C 1 - 10 alkyl may be, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t- butyl, It may be one selected from the group consisting of pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl and tequil.
본 발명의 일 구현예에 의하면, C1 - 10알킬옥시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, t-부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시, 헵틸옥시, 옥틸옥시, 노닐옥시 및 데킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. According to one embodiment of the invention, C 1 - 10 alkyloxy are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, t- butyloxy, pentyloxy, hexyloxy, heptyloxy, It may be one selected from the group consisting of octyloxy, nonyloxy, and dechyloxy.
본 발명의 일 구현예에 의하면, C3 - 12시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 및 시클로옥틸로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. According to one embodiment of the invention, C 3 - 12 cycloalkyl may be selected from cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and cyclooctyl group consisting of.
본 발명의 일 구현예에 의하면, C5 - 12아릴은 5 내지 6원의 단일환 또는 2환으로 이루어진 아릴일 수 있다. According to one embodiment of the invention, C 5 - 12 aryl group may be an aryl group consisting of a monocyclic or bicyclic 5-to 6-membered.
본 발명의 일 구현예에 의하면, A는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C1 - 6알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 6알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환된다. 직쇄 또는 분지형 C1 - 6알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸 또는 헥실일 수 있고, C3 - 8시클로알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸 또는 시클로옥틸일 수 있고, C1 - 6알킬옥시는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 이소부톡시, t-부틸옥시, 펜틸옥시 또는 헥실옥시일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, A is a 2 to 3 ring condensed heteroaryl including N and Z 1 ; The condensed heteroaryl is unsubstituted, or C 1 - 6 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1 - 6 alkyloxy substituted, nitro and cyano one to three is selected from the furnace. Straight-chain or branched C 1 - 6 alkyl is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t- butyl, pentyl or hexyl may silil, C 3 - 8 cycloalkyl are cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl , cyclohexyl, cycloheptyl or cyclooctyl may tilil, C 1 - 6 alkyloxy are methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, t- butyloxy, pentyloxy or hexyloxy seal I can.
본 발명의 일 구현예에 의하면, A는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은 비치환되거나, 또는 C1 - 4알킬, C3 - 6시클로알킬, C1 - 4알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되는 1 내지 3개로 치환된다. According to an embodiment of the present invention, A is a 2 to 3 ring condensed heteroaryl including N and Z 1 ; The condensed heteroaryl is unsubstituted, or C 1 - 4 alkyl, C 3 - 6 cycloalkyl, C 1 - 4 are substituted alkyloxy, nitro and cyano one to three is selected from the furnace.
본 발명에 있어서, 상기 A는 호모시스테인과의 반응에 영향을 주지 않으면서도 화학식 1의 화합물이 가지는 LUMO 에너지 레벨을 낮추는데 기여하는 구조로서, 호모시스테인과의 반응에도 전기화학발광을 방출할 수 있는 것이면 제한없이 이용이 가능하며, 바람직하게는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴 화합물이고, 보다 바람직하게는 하기 구조로부터 선택되는 것일 수 있다.In the present invention, A is a structure that contributes to lowering the LUMO energy level of the compound of
상기 화학식에서, In the above formula,
R4는 수소, C1 - 10알킬, C3 - 8시클로알킬, C1 - 10알킬옥시, 니트로 및 시아노 중에서 선택되고,R 4 is hydrogen, C 1 - is selected from the 10 alkyloxy, nitro, and cyano, - 10 alkyl, C 3 - 8 cycloalkyl, C 1
m은 0 내지 3의 정수이며, m is an integer from 0 to 3,
Z1은 C, O, S 및 NRa 중에서 선택되며; Ra는 H 또는 C1 - 10알킬이고, Z 1 is selected from C, O, S and NR a ; R a is H or C 1 - 10 alkyl, and,
A가 퀴놀린이고, R3이 수소인 경우, R1 및 R2는 각각 수소 또는 C1 - 10알킬옥시가 아니다.When A is quinoline, and the R 3 is hydrogen, R 1 and R 2 are each hydrogen or C 1 - 10 alkyloxy not.
A가 상기와 같은 구조를 가지는 경우, 제조되는 화학식 1의 화합물의 LUMO 에너지 레벨이 안정화되어, 낮은 LUMO 에너지 레벨을 가지며, 호모시스테인과의 반응 이후에도, 안정적으로 전기화학발광을 방출할 수 있다. 특히, 퀴놀린 또는 페난트리딘의 구조를 가지는 경우, 호모시스테인과의 반응에서 높은 전기화합발광 효율을 나타내는 것을 확인하였다. When A has the above structure, the LUMO energy level of the compound of
본 발명에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3은 전자 공여체(electron donationg group)일 수 있다. 상기 치환기는 이리듐 착화합물의 리간드장 안정화 에너지(ligand field stabilization energy; LFSE)에 영향을 미치며, 호모시스테인과의 반응속도를 향상시키는데 기여할 수 있다. 구체적으로 상기 R1 및 R2가 메톡시인 이리듐 착화합물은 적색 편이된 방출 및 높은 HOMO 수준을 나타내었으며, 반응속도가 비약적으로 향상되는 결과를 얻었다. 본 발명에 의하면, R1이 메톡시이고, R2가 수소인 이리듐 착화합물은 R1과 R2가 모두 수소인 이리듐 착화합물과 유사한 특성을 나타내었으며, R1이 수소이고, R2가 메톡시인 이리듐 착화합물은 위의 두 이리듐 착화합물보다 빠른 반응속도 및 낮은 검출 한계를 나타내었다.In the present invention, R 1 , R 2 and R 3 may be an electron donation group. The substituent affects the ligand field stabilization energy (LFSE) of the iridium complex and may contribute to improving the reaction rate with homocysteine. Specifically, the iridium complex compound in which R 1 and R 2 are methoxy showed red shifted release and high HOMO level, and the reaction rate was dramatically improved. According to the present invention, R 1 is methoxy, R 2 is showed a hydrogen iridium complex is R 1 and R 2 are both similar properties and are hydrogen iridium complex, and R 1 is hydrogen, R 2 is methoxy The iridium complex showed a faster reaction rate and a lower detection limit than the above two iridium complexes.
본 발명에 있어서, 상기 L은 이리듐 착물을 제조하는데 이용되는 리간드이면 제한은 없으나, 바람직하게는 비발광성 리간드이고, 보다 바람직하게는 호모시스테인과의 반응성에 직접적인 영향을 나타내지 않으면서, 동시에 전기화학발광 변화에 영향을 주지 않는 구조인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기 구조로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, if L is a ligand used to prepare an iridium complex, there is no limitation, but preferably it is a non-luminescent ligand, more preferably, it does not show a direct effect on the reactivity with homocysteine, and at the same time, electrochemiluminescence change It may have a structure that does not affect the structure, and most preferably may be selected from the following structures, but is not limited thereto.
상기 화학식에서, In the above formula,
R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 10알킬, 할로C1 - 6알킬 및 C5 - 12아릴 중에서 선택된다. R 6, R 7, R 8 ,
본 발명에 있어서, 상기 리간드를 구체적으로 예시하면 하기와 같다.In the present invention, the ligand is specifically illustrated as follows.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 호모시스테인과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 화학식 1의 화합물의 포밀기와 호모시스테인이 반응하여 육각 고리를 형성하며, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것일 수 있다. In the present invention, the compound of
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 이리듐 착화합물로서, 호모시스테인과 반응하여 서로 고리를 형성한다. 구체적으로 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 1의 포밀기가 호모시스테인과 반응하여 1,3-티아지내인(thiazinane) 고리를 형성하게 되며, 이때, 강한 전기화학발광(electrochemiluminescence; ECL)을 나타내게 된다. More preferably, the compound represented by
상기 전기화학발광은 화학식 1의 화합물과 호모시스테인의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮기 때문에 발생되는 것일 수 있다. The electrochemiluminescence may be generated because the LUMO energy level of the reaction product of the compound of
종래 기술에 따른 이리듐 착화합물, 예를 들어, 두 개의 2-페닐피리딘과 한 개의 4-(2-피리딜)벤즈알데히드 기반의 이리듐 착화합물(프로브 2), 또는 두 개의 4-(2-피리딜)벤즈알데히드와 한 개의 아세틸아세토네이트 기반의 이리듐 착화합물(프로브 3)은 LUMO 에너지 레벨이 높기 때문에, 호모시스테인과 반응하는 경우에 전기화학발광(ECL)이 오히려 감소하는 양상을 나타낸다. 따라서, 상기와 같은 이리듐 착화합물은 전기화학발광 프로브로서 이용이 불가능하였다. Iridium complexes according to the prior art, for example two 2-phenylpyridines and one 4-(2-pyridyl)benzaldehyde-based iridium complex (Probe 2), or two 4-(2-pyridyl)benzaldehydes Since and one acetylacetonate-based iridium complex (Probe 3) has a high LUMO energy level, when it reacts with homocysteine, electrochemiluminescence (ECL) is rather reduced. Therefore, the iridium complex as described above cannot be used as an electrochemiluminescent probe.
다른 한편으로, 전기화학적 관점에서 살펴보면, 반응에 의해 화합물에서 강한 전자 구인성 성질을 가지고 있는 포밀기가 사라지게 되면 LUMO 에너지 레벨이 불안정해지고, 환원 전위는 더 큰 음의 값을 가지게 된다. 이때, 환원 전위가 큰 음의 값을 가지게 되면, 전기화학발광 공반응물의 LUMO 에너지 레벨로의 전자 전달과정이 어려워져, 분자의 들뜬 상태를 형성하기 어려운 문제점이 있다.On the other hand, from an electrochemical point of view, when a formyl group having a strong electron withdrawing property disappears from a compound by a reaction, the LUMO energy level becomes unstable, and the reduction potential has a larger negative value. At this time, when the reduction potential has a large negative value, the electron transfer process of the electrochemiluminescent co-reactant to the LUMO energy level becomes difficult, and thus it is difficult to form an excited state of the molecule.
그러나, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 LUMO 에너지 레벨이 현저하게 낮도록 설계되었기 때문에 호모시스테인과의 반응으로 포밀기가 사라지면서 LUMO 에너지 레벨이 증가하더라도 전기화학발광 전자 전달 과정을 방해하지 않는 것이 특징이다.However, since the compound of
[반응식 1][Scheme 1]
상기 반응식 1에서 1은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물이며, 2는 종래기술에 따른 이리듐 착화합물(프로브 2)이다. In
본 발명에 있어서, 전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the electrochemiluminescent co-reactant may be tripropylamine or 2-(dibutylamino)ethanol, but is not limited thereto.
한편, 본 발명은 상기 전기화학발광 프로브를 이용하는, 생체 내 호모시스테인의 검출 방법을 제공한다. Meanwhile, the present invention provides a method for detecting homocysteine in vivo using the electrochemiluminescent probe.
상기 생체는 인간의 생체거나 또는 인간이 아닌 것의 생체 내일 수 있다. The living body may be a human body or a non-human body.
또한, 본 발명은 전기화학발광 프로브를 포함하는 전기화학발광 센서를 제공한다. In addition, the present invention provides an electrochemiluminescent sensor comprising an electrochemiluminescent probe.
상기 전기화학발광 센서를 이용하여 생체 외 검출시료의 호모시스테인의 레벨의 검출에 이용할 수 있다. The electrochemiluminescent sensor can be used to detect the level of homocysteine in an in vitro detection sample.
본 발명에 따르면, 상기 전기화학발광 프로프를 포함하는 전기화학발광 센서는 호모시스테인과의 반응에 의해 청색 이동된 영역에서 전기화학발광의 변화가 나타나는 것일 수 있다. According to the present invention, the electrochemiluminescent sensor including the electrochemiluminescent probe may exhibit a change in electrochemiluminescence in a blue-shifted region due to a reaction with homocysteine.
또한, 본 발명은 4-포밀페닐보로닉산과 1-할로이소퀴놀린을 반응하여, 4-(이소퀴놀린-1-일)벤즈알데히드를 제조하는 단계; 4-(이소퀴놀린-1-일)벤즈알데히드를 이리듐 클로라이드 하이드레이트와 반응하여 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체를 제조하는 단계; 및 상기 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체, 탄산나트륨 및 아세틸아세톤을 반응시켜 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계;를 포함하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of preparing 4-(isoquinolin-1-yl)benzaldehyde by reacting 4-formylphenylboronic acid and 1-haloisoquinoline; Reacting 4-(isoquinolin-1-yl)benzaldehyde with iridium chloride hydrate to prepare a metal-cyclized iridium (III) chloro-linked dimer; And preparing a compound represented by
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 성명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred embodiments. These examples are for clarifying the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.
시약 및 기기Reagents and instruments
모든 물질은 시그마-알드리치 또는 TCI에서 구매하였으며 어떤 추가적인 정제과정 없이 사용하였다. NMR을 찍기 위한 중수소화된 용매(deuterated solvent)는 CIL에서 구매하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker Advance DPX-300을 이용하여 측정하였다. ESI-MS 자료는 QUATTRO LC Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer를 이용하여 측정하였으며, m/z 단위로 표기하였다. MALDI-TOF는 Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation을 이용하여 측정하였다. 분석용 박막크로마토그래피(thin layer chromatography)는 Kieselgel 60 F254 plate를 Merck에서 구입하여 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피(Column chromatography)는 Merck silica gel 60과 Merck aluminium oxide 60을 사용하였다.All materials were purchased from Sigma-Aldrich or TCI and used without any further purification. A deuterated solvent for NMR was purchased from CIL. The NMR spectrum was measured using Bruker Advance DPX-300. ESI-MS data were measured using a QUATTRO LC Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometer and expressed in m/z. MALDI-TOF was measured using the Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation. For analysis thin layer chromatography,
전기화학 및 전기화학발광 측정Electrochemistry and electrochemiluminescence measurement
전기화학 연구는 CH Instruments 650B을 이용하여 측정하였다. CV와 DPV는 전기화학적 산화/환원 특성을 조사하기 위하여 개별의 용액에 대하여 각각 측정하였다. ECL 스펙트럼은 CCD 카메라를 통해 얻었으며, ECL 세기에 대한 정보는 PMT 모듈을 통해 얻었다. 10 mL 사이즈의 ECL cell을 CCD 혹은 PMT 모듈에 직접 연결시켜서 ECL 신호를 측정하였다. 모든 ECL 데이터는 CV 실험과 동시에 수집하였다. ECL 용액은 일반적으로는 10 mM의 TPA(트리프로필아민)를 공반응물(coreactant) 사용하였으며 50% 또는 99.9%의 물이 포함되어 있는 수용액에서 실험하였다. TPA를 공반응물로 이용한 이유는 TPA가 가장 널리 사용되고 전기화학적인 특징들이 가장 잘 연구되어 있기 때문이다. ECL 측정은 실온에서 별다른 처리를 하지 않은 채로 진행되었다. 전기화학 실험들은 유기 용매에서는 Ag/Ag+ 기준 전극을, 수용액에서는 Ag/AgCl 기준 전극을 이용하였다. 페로센(Ferrocene)을 내부기준으로 이용하였으며, 이를 이용하여 다른 물질들의 전기화학적 특성들을 비교하였다. Pt 작업 전극은 0.05 M 알루미나가 뿌려져 있는 패드에 polishing 한 뒤에 5분동안 물과 에탄올에서 sonication 시켜주는 방법을 통해 세척하였다. 하나의 용액은 오직 한 번의 실험에만 사용하였으며 데이터를 얻은 후에는 모두 버려 주었다. 보고한 ECL 값들은 적어도 세번 혹은 다섯 번 이상의 반복 실험을 통해 얻은 평균값으로 높은 신뢰성을 보여주었다.Electrochemical studies were measured using CH Instruments 650B. CV and DPV were measured for each individual solution to investigate the electrochemical oxidation/reduction properties. The ECL spectrum was obtained through a CCD camera, and information on the ECL intensity was obtained through the PMT module. The ECL signal was measured by connecting a 10 mL size ECL cell directly to a CCD or PMT module. All ECL data were collected simultaneously with the CV experiment. In general, the ECL solution was tested in an aqueous solution containing 10 mM TPA (tripropylamine) as a coreactant and 50% or 99.9% water. The reason for using TPA as a co-reactant is that TPA is the most widely used and electrochemical characteristics are best studied. ECL measurements were carried out at room temperature without any treatment. The electrochemical experiments used an Ag/Ag+ reference electrode in an organic solvent and an Ag/AgCl reference electrode in an aqueous solution. Ferrocene was used as an internal standard, and electrochemical properties of other materials were compared using this. The Pt working electrode was polished on a pad sprinkled with 0.05 M alumina and cleaned by sonication in water and ethanol for 5 minutes. One solution was used only in one experiment and all was discarded after data was obtained. The reported ECL values are average values obtained through repeated experiments at least three or five times, showing high reliability.
ECL ECL 프로브의Of the probe 구조 설계 Structure design
강한 빛을 내는 이리듐 컴플렉스인 비교예 1의 (piq)2Ir(acac)를 프로브 1과 프로브 1과 호모시스테인의 반응물(1-Hcy)에 대한 모델 물질로 선택하였다.(Piq) 2 Ir (acac) of Comparative Example 1, which is an iridium complex emitting strong light, was selected as a model material for the reaction product of
밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산을 통해 하기 실시예의 프로브 1 내지 18을 디자인하였다. 계산된 DFT는 하기 도 1, 2 및 표 1에 나타내었다. 산화 전위는 서포트 전해질로서 0.1M 테트라-n-부틸암모늄 퍼클로레이트를 포함한 아세토니트릴 용액에서 주사 속도(scan rate) 0.1 V/s로 순환 전압전류를 사용하여 측정되었고, 값은 표준으로 1 mM 페로센(Fc/Fc+)의 산화에 대해 보정하였고, SCE를 참고하였다. 에너지 갭(△E)는 흡수스펙트럼과 방출스펙트럼 사이의 단면 파장으로부터 계산하였다. The
(V vs SCE)E 0 'ox
(V vs SCE)
(eV)HOMO
(eV)
(eV)LUMO
(eV)
(HOMO-LUMO)△E
(HOMO-LUMO)
-는 미계산-Is not calculated
표 1에서 확인할 수 있듯이, 하기 화학식 1의 화합물에서 R1 및 R2은 HOMO 에너지 레벨에는 관여하였으나, LUMO 에너지 레벨에는 관여하지 않았다. 프로브 4는 HOMO-LUMO 에너지 갭 차이가 프로브 1, 5-16에 비해 크게 감소하였으며, 광발광(photoluminescence, PL)이 감소하였으며, 적색 편이된 영역에서 전기화학발광을 방출하였다.As can be seen from Table 1, in the compound of
프로브 1은 약 0.74V에서 산화하며 TPA가 있는 조건에서 615 nm 부근에서 강한 주황색(orange-red)의 ECL 발광을 나타내었다. 또한 가장 널리 사용되는 ECL 물질인 Ru(bpy)32+에 비해 약 2배 정도 강한 세기를 나타내었다. 프로브 1은 비교예인 (piq)2Ir(acac)에 비해 주 리간드의 페닐링의 4번 위치에 추가적으로 포밀기(formyl group)를 도입한 형태이며, 포밀기의 강한 전자 구인성(electron-withdrawing) 능력으로 인해 비교예와는 달리 거의 빛이 나지 않고 또한 655 nm 정도의 매우 적색 편이(red-shift)된 영역에서 발광 특성을 나타내었다. 하지만, Hcy을 넣어주면 613 nm 부근에서 원래의 강한 PL을 회복하는 모습을 보였으며, 이는 (piq)2Ir(acac)의 특성과 매우 유사하였다. 청색 편이(Blue-shift)된 영역에서 강한 빛을 보이는 이유는 HOMO-LUMO 에너지 차이가 증가하는 것과 관련이 있다. 즉, 포밀기가 사라짐으로 인해 LUMO 레벨이 급격하게 상승하게 되며, 이로 인하여 에너지 차이 역시 증가하기 때문이다.
도 3은 프로브 1, 4 및 5의 인광 방출 스펙트럼을 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 프로브 4는 Hcy 부재하에서는 인광(phosphorescence)을 나타내지 않으며, 프로브 1는 670 nm에서 약한 방출을 나타내었고, 프로브 5는 프로브 1보다 약한 방출을 나타내는 것이 확인되었다. 이는 전자공여기의 도입의 영향으로, 공여기가 R2에 위치할 때, 전자공여기에 의한 이점이 보다 증가되는 것으로 확인되었다. 3 shows phosphorescence emission spectra of
HcyHcy 결합 전후에 따른 밀도함수이론 값 계산 Calculation of density function theory values before and after bonding
밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산을 통해 Hcy 결합 전 후의 HOMO, LUMO 에너지 레벨을 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에서 살펴볼 수 있듯이 본 발명에 따라 설계된 화합물은 Hcy 결합 후에도 HOMO-LUMO 에너지 갭 차이가 비교예의 프로브에 비해 현저하게 큰 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 Hcy 검출용 전기화학발광 프로브로서 효과적으로 작용될 수 있다.The HOMO and LUMO energy levels before and after Hcy bonding are shown in Table 2 below through density functional theory (DFT) calculation. As can be seen in Table 2, it can be seen that the HOMO-LUMO energy gap difference in the compound designed according to the present invention is remarkably larger than that of the probe of the comparative example even after Hcy binding. Therefore, the compound of
(eV)HOMO
(eV)
(eV)LUMO
(eV)
(eV)HOMO
(eV)
(eV)LUMO
(eV)
실시예 1. 화학식 1의 화합물(프로브 1)Example 1. Compound of Formula 1 (Probe 1)
실시예 1.1. 4-(이소퀴놀린-1-일)벤즈알데히드(5)의 합성Example 1.1. Synthesis of 4-(isoquinolin-1-yl)benzaldehyde (5)
THF (40 mL) 및 H2O(40 mL)에 4-포밀페닐보로닉산 (1.15 g, 7 mmol), 1-클로로이소퀴놀린 (1.05 g, 7 mmol), Pd(PPh3)4 (404 mg, 0.35 mmol) 및 탄산칼륨 (1.93 g, 14 mmol)의 혼합물을 넣고 24시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시키고 반응 혼합물을 디클로로메탄(DCM)으로 추출하였다. 유기층은 염수로 세척하고, Na2SO4으로 건조하였다. 용매는 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(에틸아세테이트/헥산=1:5)으로 정제하여 흰색 고체를 수득하였다(1.37 g, 84% 수율). 4-formylphenylboronic acid (1.15 g, 7 mmol), 1-chloroisoquinoline (1.05 g, 7 mmol), Pd(PPh 3 ) 4 (404) in THF (40 mL) and H 2 O (40 mL) mg, 0.35 mmol) and potassium carbonate (1.93 g, 14 mmol) were added and refluxed for 24 hours. Next, it was cooled to room temperature and the reaction mixture was extracted with dichloromethane (DCM). The organic layer was washed with brine and dried over Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate/hexane = 1:5) to obtain a white solid (1.37 g, 84% yield).
300 MHz 1H NMR (chloroform-d): δ 10.15 (s, 1 H), 8.65 (d, 1H, J=6.3 Hz), 8.02-8.08 (m,3H), 7.93 (d, 1H, J=10.1 Hz), 7.89 (d, 2H, J=10.1 Hz), 7.73 (t, 1H, J=7.8 Hz), 7.72 (d, 2H, J=7.1 Hz), 7.58 (t, 1H, J=8.0 Hz).300 MHz 1 H NMR (chloroform-d): δ 10.15 (s, 1 H), 8.65 (d, 1H, J=6.3 Hz), 8.02-8.08 (m,3H), 7.93 (d, 1H, J=10.1 Hz), 7.89 (d, 2H, J=10.1 Hz), 7.73 (t, 1H, J=7.8 Hz), 7.72 (d, 2H, J=7.1 Hz), 7.58 (t, 1H, J=8.0 Hz) .
실시예 1.2. 화합물 6의 합성Example 1.2. Synthesis of
2-에톡시에탄올 (30 mL) 및 H2O(10 mL)에 실시예 1의 (5) (1 g, 4.29 mmol) 및 이리듐 클로라이드 하이드레이트 (576 mg, 1.93 mmol)을 넣고 12시간 동안 환류하였다. 다음으로 상온에서 냉각시킨 후, 차가운 물을 (~50 mL) 반응 혼합물에 부었다. 생성된 진한 갈색 침전물을 여과하여, 조질(Crude) 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) 6을 얻었다. 2-ethoxyethanol (30 mL) and H 2 O (10 mL) of Example 1 (5) (1 g, 4.29 mmol) and iridium chloride hydrate (576 mg, 1.93 mmol) were added and refluxed for 12 hours. . Next, after cooling at room temperature, cold water (~50 mL) was poured into the reaction mixture. The resulting dark brown precipitate was filtered to obtain a crude (Crude) metalcyclized iridium (III) chloro-linked dimer (chloro-bridged dimer) 6.
실시예 1.3. 화합물 1의 합성Example 1.3. Synthesis of
2-에톡시에탄올 (10 mL)에 실시예 2의 조질(Crude) 금속고리화된 이리듐(III) 클로로로 연결된 이량체(chloro-bridged dimer) (6, 330 mg, 0.245 mmol), 탄산나트륨 (260 mg, 2.45 mmol) 및 아세틸아세톤 (0.252 mL, 2.45 mmol)을 넣고 8시간 동안 환류하였다. 다음으로 상온에서 냉각시키고, 반응 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척한 뒤, Na2SO4으로 건조하였다. 용매는 감압하여 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(DCM/메탄올=20:1)으로 정제하였으며, 진한 갈색 고체를 수득하였다. (229 mg, 61% 수율). 2-ethoxyethanol (10 mL) in Example 2 crude (Crude) metalcyclized iridium (III) chloro-linked dimer (chloro-bridged dimer) (6, 330 mg, 0.245 mmol), sodium carbonate (260 mg, 2.45 mmol) and acetylacetone (0.252 mL, 2.45 mmol) were added and refluxed for 8 hours. Next, it was cooled at room temperature, and the reaction mixture was extracted with DCM. The organic layer was washed with water and then dried over Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (DCM/methanol=20:1), and a dark brown solid was obtained. (229 mg, 61% yield).
300 MHz 1H NMR (DMSO-d6): δ 9.59 (s, 2H), 9.06 (d, 2H, J=8.9 Hz), 8.46 (m, 4H), 8.24 (d, 2H, J=7.1 Hz), 7.98 (m, 6H), 7.40 (d, 2H, J=8.3 Hz), 6.70 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.70 (s, 6H). 300 MHz 1 H NMR (DMSO-d 6 ): δ 9.59 (s, 2H), 9.06 (d, 2H, J=8.9 Hz), 8.46 (m, 4H), 8.24 (d, 2H, J=7.1 Hz) , 7.98 (m, 6H), 7.40 (d, 2H, J=8.3 Hz), 6.70 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.70 (s, 6H).
75 MHz 13C NMR (CDCl3): δ 193.268, 185.179, 152.895, 151.009, 140.470, 137.315, 135.466, 134.930, 131.164, 129.581, 128.464, 127.605, 126.898, 126.500, 121.723, 121.592, 28.690. 75 MHz 13 C NMR (CDCl 3 ): δ 193.268, 185.179, 152.895, 151.009, 140.470, 137.315, 135.466, 134.930, 131.164, 129.581, 128.464, 127.605, 126.898, 126.500, 121.723, 121.592, 28.690.
HRMS (FAB+, m-NBA): m/z 측정치 756.1602 (계산치 C37H27N2IrO4 [M]+756.1600).HRMS (FAB + , m-NBA): m/z found 756.1602 (calculated C 37 H 27 N 2 IrO 4 [M] + 756.1600).
실시예 2. 프로브 4Example 2.
실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(EA/Hex=1:1)으로 정제하여 검정색 고체의 프로브 4를 제조하였다(31.6 % 수율). It was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (EA/Hex=1:1) to prepare a black solid probe 4 (31.6% yield).
300 MHz 1H NMR (chloroform-d): δ 10.21(s, 2H); 8.94-8.97 (m, 2H); 8.50 (d, 2H J = 6.3 Hz); 7.99-8.02 (m, 2H); 7.92 (s, 2H); 7.78-7.81 (m, 4H); 7.61 (d, 2H, J = 6.39 Hz); 6.80 (m, 2H); 5.19 (s, 1H); 3.95 (s, 6H), 1.76 (s, 6H). 300 MHz 1 H NMR (chloroform-d): δ 10.21 (s, 2H); 8.94-8.97 (m, 2H); 8.50 (d, 2H J = 6.3 Hz); 7.99-8.02 (m, 2H); 7.92 (s, 2H); 7.78-7.81 (m, 4H); 7.61 (d, 2H, J = 6.39 Hz); 6.80 (m, 2H); 5.19 (s, 1H); 3.95 (s, 6H), 1.76 (s, 6H).
실시예 3. 프로브 5Example 3.
실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(EA/Hex=1:1)으로 정제하여 검정색 고체의 프로브 4를 제조하였다(22.7 % 수율). It was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (EA/Hex=1:1) to prepare a black solid probe 4 (22.7% yield).
300 MHz 1H NMR (chloroform-d): δ 9.46 (s, 2H); 8.44 (d, 2H J = 6.23 Hz); 8.34 (d, 2H J = 8.24 Hz); 7.94 (t, 2H, J = 7.97 Hz, 7.78 Hz ); 7.60-7.65 (m, 4H); 6.96 (s, 2H); 6.27 (s, 2H); 5.23 (s, 1H); 3.85 (s, 6H), 1.75 (s, 6H). 300 MHz 1 H NMR (chloroform-d): δ 9.46 (s, 2H); 8.44 (d, 2H J = 6.23 Hz); 8.34 (d, 2H J = 8.24 Hz); 7.94 (t, 2H, J = 7.97 Hz, 7.78 Hz); 7.60-7.65 (m, 4H); 6.96 (s, 2H); 6.27 (s, 2H); 5.23 (s, 1H); 3.85 (s, 6H), 1.75 (s, 6H).
실시예 4. 프로브 6Example 4.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 6을 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(MC/MeOH=200:1)으로 정제하여 갈색 고체의 프로브 6를 제조하였다(32.1 % 수율).
400 MHz 1H NMR (chloroform-d) δ 9.53 (s, 2H), 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.87 7.82 (m, 2H), 7.58 7.41 (m, 6H), 6.95 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 4.60 (s, 1H), 1.46 (s, 6H).400 MHz 1 H NMR (chloroform-d) δ 9.53 (s, 2H), 8.36 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.29 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 8.8 Hz , 2H), 7.97 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.87 7.82 (m, 2H), 7.58 7.41 (m, 6H), 6.95 (d, J = 1.4 Hz, 2H), 4.60 (s, 1H) , 1.46 (s, 6H).
실시예 5. 프로브 7Example 5.
실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(MC/MeOH=200:1)으로 정제하여 검은색 고체의 프로브 7을 제조하였다(25.3 % 수율). It was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (MC/MeOH=200:1) to prepare a black solid probe 7 (25.3% yield).
400 MHz 1H NMR (chloroform-d) δ 9.58 (s, 2H), 9.08 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.72 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.38 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.28 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.84 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.64 7.52 (m, 4H), 7.42 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.13 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.75 (s, 6H).400 MHz 1 H NMR (chloroform-d) δ 9.58 (s, 2H), 9.08 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.72 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.54 (d, J = 8.2 Hz , 2H), 8.38 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.28 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.96 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.84 (t, J = 7.7 Hz, 2H ), 7.64 7.52 (m, 4H), 7.42 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.13 (s, 2H), 5.28 (s, 1H), 1.75 (s, 6H).
실시예 6. 프로브 8Example 6.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 8을 합성하였다.
실시예 7. 프로브 9Example 7.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 9를 제조하였다.
실시예 8. 프로브 10Example 8.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 10을 제조하였다.
실시예 9. 프로브 11Example 9. Probe 11
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 11을 제조하였다.Probe 11 was prepared in the same manner as in Example 1.
실시예 10. 프로브 12Example 10.
실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(EA/Hex=1:1)으로 정제하여 검정색 고체의 프로브 12를 제조하였다(28.2 % 수율). It was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (EA/Hex=1:1) to prepare a black solid probe 12 (28.2% yield).
400 MHz 1H NMR (chloroform-d δ 10.29 (s, 2H), 8.41 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 8.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.77 (s, 2H), 7.71 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.54 (dd, J = 15.0, 7.3 Hz, 4H), 7.49 7.39 (m, 10H), 7.36 (d, J = 6.2 Hz, 4H), 6.74 (s, 2H), 5.18 (s, 1H), 1.69 (s, 6H).400 MHz 1 H NMR (chloroform-d δ 10.29 (s, 2H), 8.41 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 8.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.77 (s, 2H), 7.71 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.54 (dd, J = 15.0, 7.3 Hz, 4H), 7.49 7.39 (m, 10H), 7.36 (d, J = 6.2 Hz, 4H), 6.74 (s, 2H), 5.18 (s, 1H), 1.69 (s, 6H).
실시예 11. 프로브 13Example 11. Probe 13
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 13을 제조하였다. Probe 13 was prepared in the same manner as in Example 1.
실시예 12. 프로브 14Example 12.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 14를 제조하였다.
실시예 13. 프로브 15Example 13.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 15을 제조하였다.
실시예 14. 프로브 16Example 14.
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 16을 제조하였다.
실시예 15. 프로브 17Example 15. Probe 17
실시예 1과 동일한 방법으로 프로브 17을 제조하였다. Probe 17 was prepared in the same manner as in Example 1.
실시예 16. 프로브 18Example 16.
실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법( EA/Hx=1:1)으로 정제하여 붉은색 고체의 프로브 18를 제조하였다(15.4 % 수율).It was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (EA/Hx=1:1) to prepare a red solid probe 18 (15.4% yield).
400 MHz 1H NMR (acetone) δ 10.72 (s, 1H), 10.42 (s, 1H), 9.68 (s, 1H), 9.51 (s, 1H), 8.59 (s, 2H), 8.19 (dd, J = 49.1, 7.8 Hz, 3H), 7.98 (d, J = 32.0 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.44 (s, 2H), 7.34 (d, J = 5.2 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.31 (s, 1H), 5.31 (s, 1H), 1.70 (s, 6H).400 MHz 1 H NMR (acetone) δ 10.72 (s, 1H), 10.42 (s, 1H), 9.68 (s, 1H), 9.51 (s, 1H), 8.59 (s, 2H), 8.19 (dd, J = 49.1, 7.8 Hz, 3H), 7.98 (d, J = 32.0 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.44 (s, 2H), 7.34 (d, J = 5.2 Hz, 2H) , 7.18 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.31 (s, 1H), 5.31 (s, 1H), 1.70 (s, 6H).
실시예 17. 프로브 19Example 17. Probe 19
실시예 1과 동일한 방법으로 합성하였으며, 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(MC/MeOH=100:1)으로 정제하여 갈색 고체의 프로브 19를 제조하였다(20.2 % 수율). It was synthesized in the same manner as in Example 1, and purified by silica gel column chromatography (MC/MeOH=100:1) to prepare a brown solid probe 19 (20.2% yield).
400 MHz 1H NMR (chloroform-d) δ 10.18 (s, 2H), 8.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.43 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 8.26 (s, 2H), 8.06 7.94 (m, 2H), 7.88 7.69 (m, 4H), 7.63 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 6.83 (s, 2H), 5.19 (s, 1H), 1.73 (s, 6H).400 MHz 1 H NMR (chloroform-d) δ 10.18 (s, 2H), 8.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.43 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 8.26 (s, 2H), 8.06 7.94 (m, 2H), 7.88 7.69 (m, 4H), 7.63 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 6.83 (s, 2H), 5.19 (s, 1H), 1.73 (s, 6H).
비교예 1. 프로브 2Comparative Example 1.
비교예 1.1. 화합물 7의 합성Comparative Example 1.1. Synthesis of
THF (40 mL) 및 N2-버블된 H2O (40 mL)에 4-포밀페닐보로닉산 (1.15 g, 7 mmol), 2-브로모피리딘 (0.667 mL, 7 mmol), Pd(PPh3)4 (404 mg, 0.35 mmol) 및 탄산칼륨 (1.93 mg, 14 mmol)을 넣고 24시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시킨 다음, 반응 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 유기층을 물로 세척한 뒤, Na2SO4으로 건조하였다. 용매는 감압하여 증발시켰다. 잔류물은 실리카겔 컬럼크로마토그래피법(에틸아세테이트/헥산=1:5)으로 정제하였으며, 흰색 고체를 수득하였다 (836 mg, 76% 수율).In THF (40 mL) and N 2 -bubbled H 2 O (40 mL) 4-formylphenylboronic acid (1.15 g, 7 mmol), 2-bromopyridine (0.667 mL, 7 mmol), Pd(PPh 3 ) 4 (404 mg, 0.35 mmol) and potassium carbonate (1.93 mg, 14 mmol) were added and refluxed for 24 hours. Then, after cooling to room temperature, the reaction mixture was extracted with DCM. The organic layer was washed with water and then dried over Na 2 SO 4 . The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel column chromatography (ethyl acetate/hexane = 1:5), and a white solid was obtained (836 mg, 76% yield).
비교예 1.2. 화합물 8의 합성Comparative Example 1.2. Synthesis of
2-에톡시에탄올 (45 mL) 및 H2O (15 mL)에 화합물 7 (1 g, 6.44 mmol) 및 이리듐 클로라이드 하이드레이트 (865 mg, 2.90 mmol)을 넣고 12시간 동안 환류시켰다. 다음으로 상온으로 냉각시킨 다음, 반응 혼합물에 차가운 물(~100 mL)을 부었다. 생성된 노란색 침전은 여과하여 조질 금속고리화된 Ir(III) 클로로로 연결된 이량체 (8)을 수득하였다. Compound 7 (1 g, 6.44 mmol) and iridium chloride hydrate (865 mg, 2.90 mmol) were added to 2-ethoxyethanol (45 mL) and H 2 O (15 mL) and refluxed for 12 hours. Next, after cooling to room temperature, cold water (~100 mL) was poured into the reaction mixture. The resulting yellow precipitate was filtered to obtain a dimer (8) linked by crude metalcyclized Ir(III) chloro.
비교예 1.3. 프로브 2의 합성Comparative Example 1.3. Synthesis of
디글라임 (diglyme) (10 mL) 중의 화합물 7 (360 mg, 2 mmol), 화합물 8 (214 mg, 0.2 mmol) 및 실버 트리플루오로메탄술포네이트 (109 mg, 0.4 mmol)을 반응용기에 넣고 탈기시켰다. 반응 혼합물을 110 ℃로 24시간 동안 계속 교반하면서 가열하였다. 생성된 진한 주황색(dark orange-red) 용액을 실온으로 냉각시킨 뒤, 물을 가하였다. 현탄액을 여과하고, 잔사를 DCM에 용해시켰다. 용액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피법으로 정제하여 적색 고체를 수득하였다 (20% yield). Put compound 7 (360 mg, 2 mmol), compound 8 (214 mg, 0.2 mmol) and silver trifluoromethanesulfonate (109 mg, 0.4 mmol) in diglyme (10 mL) into a reaction vessel and degassing. Made it. The reaction mixture was heated to 110° C. for 24 hours with continued stirring. After cooling the resulting dark orange-red solution to room temperature, water was added. The suspension was filtered and the residue was dissolved in DCM. The solution was purified by silica gel column chromatography to obtain a red solid (20% yield).
300 MHz 1H NMR (CDCl3): δ 9.71 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J=4.4 Hz), 7.92 (d, 2H, J=4.4 Hz), 7.77 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.69 (m, 6H), 7.51 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.48 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.31 (d, 1H, J=9.5 Hz), 7.01 (t, 2H, J=6.7 Hz), 6.96 (m, 7H), 6.79(d, 1H, J=7.4 Hz). 300 MHz 1 H NMR (CDCl 3 ): δ 9.71 (s, 1H), 7.99 (d, 1H, J=4.4 Hz), 7.92 (d, 2H, J=4.4 Hz), 7.77 (d, 1H, J= 8.7 Hz), 7.69 (m, 6H), 7.51 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.48 (d, 1H, J=8.7 Hz), 7.31 (d, 1H, J=9.5 Hz), 7.01 (t , 2H, J=6.7 Hz), 6.96 (m, 7H), 6.79 (d, 1H, J=7.4 Hz).
75 MHz 13C NMR (CDCl3): δ 194.603, 166.658, 166.593, 165.331, 161.738, 160.245, 159.804, 149.961, 147.505, 147.070, 146.960, 145.799, 143.679, 143.524, 141.489, 137.166, 137.027, 136.469, 136.270, 136.191, 130.925, 130.202. 129.979, 128.840, 124.119, 124.014, 123.310, 122.053, 121.975, 120.330, 120.102, 120.065, 118.966, 118.920. 75 MHz 13 C NMR (CDCl 3 ): δ 194.603, 166.658, 166.593, 165.331, 161.738, 160.245, 159.804, 149.961, 147.505, 147.070, 146.960, 145.799, 143.679, 143.524, 141.489, 137.166, 137.027, 136.191, 136.469, 136. , 130.925, 130.202. 129.979, 128.840, 124.119, 124.014, 123.310, 122.053, 121.975, 120.330, 120.102, 120.065, 118.966, 118.920.
HRMS (FAB+, m-NBA): m/z observed 683.1538 (calculated for C37H27N2IrO4 [M]+683.1548).HRMS (FAB+, m-NBA): m/z observed 683.1538 (calculated for C 37 H 27 N 2 IrO 4 [M] + 683.1548).
비교예 2. 프로브 3Comparative Example 2.
실시예 1과 유사한 방법으로 (piq)2Ir(acac) (프로브 3)를 합성하였다.In a similar method to Example 1, (piq) 2 Ir(acac) (probe 3) was synthesized.
시험예 1. 프로브 1의 ECL 특성 검증Test Example 1. ECL characteristics verification of
ECL 측정은 50 μM의 프로브 1과 10 mM TPA가 녹아 있는 수용액에서 진행하였다. 프로브 1은 그 자체로는 순환 전압전류법(cyclic voltammetry; CV) 과정 동안 거의 ECL 신호를 보여주지 않았지만, Hcy을 넣어줌에 따라 점차적으로 ECL이 증가하는 양상을 보였다. ECL 발광 증가에 대한 결과는 도 4a에 나타내었다. ECL measurement was performed in an aqueous solution in which 50 μM of
Hcy가 없을 때에는 발광이 관측되지 않지만, 5 mM의 Hcy을 넣어준 후에는 1.3 V와 1.6 V 부근에서 두 개의 최대(maximum) ECL 피크가 생겨나는 것을 볼 수 있었다. 또한 10 mM의 Hcy을 넣어 주었을 때에는 1.3 V에서의 피크는 사라지고 1.6 V 부근에서의 피크만 점점 증가하면서 관측되는 것을 확인할 수 있었다. 다양한 농도의 Hcy을 첨가하였을 때의 ECL 최대 피크 값을 통해 결합 적정 곡선을 얻을 수 있었으며 이를 도 4b에 나타내었다. 프로브 1의 농도를 50 μM로 유지시킨 상태에서 0-10 mM의 Hcy 농도 범위에서 ECL 신호가 선형적으로 증가하는 것을 확인되었다. 측정된 검출 한계값은 41 μM이다. 한편 동일한 실험조건에서, 프로브 4는 Hcy의 부재하에서는 ECL 신호를 전혀 내지 않았지만, Hcy을 넣어줌에 따라 약 1.2 V에서 강렬한 ECL 강도를 나타내었다. 측정된 검출 한계값은 0.44 μM로 매우 우수하였다.In the absence of Hcy, luminescence was not observed, but after adding 5 mM Hcy, it was observed that two maximum ECL peaks were formed around 1.3 V and 1.6 V. In addition, when 10 mM Hcy was added, it was confirmed that the peak at 1.3 V disappeared and only the peak near 1.6 V was gradually increased. A binding titration curve could be obtained through the maximum peak value of ECL when various concentrations of Hcy were added, and this is shown in FIG. 4B. While maintaining the concentration of
도 4a을 참고하면, ECL 적정 결과 두 개의 발광 피크가 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 첫 번째 5 mM의 Hcy를 넣어줄 때까지는 1.3 V와 1.6 V에서 두 개의 피크가 점차적으로 증가하였다. Hcy를 더 넣어주었을 경우에는 1.3 V의 피크가 점차적으로 줄어들고 1.6 V에서의 피크는 계속해서 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 도 4c는 1.3 V와 1.6 V에서의 ECL 피크의 세기의 변화를 나타낸 것이다. 100 당량의 Hcy을 넣어줄 때까지는 1.3 V와 1.6 V에서 두 개의 피크가 점차적으로 증가하며, 그 후에는 1.6 V에서의 피크가 증가하여 200 당량의 Hcy를 넣어주면 포화되는 현상을 보여주었고 1.3 V의 피크는 점점 감소하였다. 프로브 1은 두 개의 포밀기를 가지고 있기 때문에 처음 스테이지에서는 Hcy과 프로브 1이 1:1로 결합하다가 Hcy의 양이 점점 증가함에 따라 1:2 최종 결합물이 생성될 것이라고 예상할 수 있다. 따라서, 1.3 V에서의 피크는 1:1 결합물에 대한 것이고 1.6 V에서의 피크는 1:2 최종 결합물에 대한 것으로 예측된다. 두 가지의 다른 ECL 신호의 비율을 통해 적정 곡선을 그릴 수 있었고, 6-17 mM의 Hcy 농도 범위에서 선형적으로 증가하는 양상을 얻어낼 수 있었으며, 이를 도 4d에 나타내었다. Referring to FIG. 4A, it can be seen that two emission peaks are observed as a result of ECL titration. Two peaks gradually increased at 1.3 V and 1.6 V until the first 5 mM Hcy was added. When Hcy was added, the peak at 1.3 V gradually decreased and the peak at 1.6 V continued to increase. 4C shows changes in the intensity of the ECL peak at 1.3 V and 1.6 V. Two peaks gradually increased at 1.3 V and 1.6 V until 100 equivalents of Hcy were added, and then the peak at 1.6 V increased, showing a phenomenon of saturation when 200 equivalents of Hcy was added. The peak of was gradually decreased. Since
혈액 내에 존재하는 Hcy의 양은 일반적으로 5-15 μM 사이이며, 따라서 약 5 μM 정도의 Hcy를 검출할 수 있어야 실제 환자들의 잠재적인 위험 요소를 진단할 수 있다. 본 발명에 따른 프로브 1의 LOD 값 (41 μM)은 Hcy 이상을 진단하기 위해 필요한 검출 한계 값에 비해 더 높은 값을 갖는다. 이에, 본 발명에 따른 프로브 1를 이용하여 Hcy에 대한 검출 한계를 낮출 수 있는지를 증명하기 위하여 25 μL의 양으로도 측정이 가능한 ECL 셀을 추가로 제작하였다. 상기 ECL 셀은 PMT 모듈에 1 mm 정도의 거리만을 두고 바로 맞닿아 있을 수 있도록 설계되었으며, 이를 통해 높은 ECL 민감도(sensitivity)를 가지게 될 것이라고 기대하였다. The amount of Hcy present in the blood is generally between 5-15 μM, and therefore approximately 5 μM of Hcy must be detectable to diagnose potential risk factors in real patients. The LOD value (41 μM) of
새로운 시스템을 이용하여 99.9% 수용액 상에서 0.1 μM의 프로브 1을 다양한 농도에 Hcy을 넣어 주어 ECL을 측정하였으며, 이를 통해 0-40 μM 범위의 Hcy 농도에 대해 선형 증가 곡선을 얻었으며, 이를 도 5에 나타내었다. 상기 농도 범위는 실제 진단에서 요구하는 범위를 거의 포함하고 있으며, 또한 이전에 보고되었던 PL 기반의 Hcy 프로브들과 비교해 보았을 때에도 거의 비슷한 수준을 보여주는 결과이다. 이 실험을 통해 얻은 LOD값은 7.9 μM이었다.Using the new system, 0.1 μM of
시험예 2. 선택성 테스트Test Example 2. Selectivity test
Hcy에 대한 본 발명의 프로브의 선택성을 측정하기 위해, 다른 아미노산들과의 경쟁 결합 실험을 진행하였다. 먼저 프로브 1 50 μM에 10 mM의 다른 아미노산들 또는 글루타티온을 넣어준 후, 추가적으로 5 mM의 Hcy을 넣어주었다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, 200 당량의 아미노산을 넣어주었을 때에는 ECL 변화가 거의 없다가 추가적으로 100 당량의 Hcy를 넣어주자 눈에 띄는 ECL 증가를 보였다. 즉, 200 당량의 아미노산이 첨가되어 있는 상태에도 100 당량의 Hcy를 넣어 주었을 때, 아미노산이 없을 때 같은 양의 Hcy을 넣어 주었을 때와 비교하여 54-97% 정도의 ECL 세기를 보여주었다. PL 경쟁 실험 역시 비슷한 결과를 보여주었고, 이를 통해 다른 아미노산들의 존재 하에서도 별다른 방해를 받지 않고 Hcy을 선택적으로 잘 인식한다는 사실을 증명하였다.In order to measure the selectivity of the probe of the present invention for Hcy, competition binding experiments with other amino acids were conducted. First, 10 mM of other amino acids or glutathione was added to 50 μM of
한편, 시스테인(Cys)의 경우는 Hcy와의 구조적 유사성에 기인하여 간섭기(interference)로 작용할 수 있기 때문에 이에 대한 영향을 확인하였다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 10 mM의 Cys이 존재하에서 약한 ECL 신호가 관측되었다. 그러나, Hcy에 대해서는 Cys에 비해 3.2배 강한 ECL 세기를 나타내는 것으로 측정되었다. 이는 본 발명의 프로브가 호모시스테인에 대한 선택성이 우수한 것을 입증한다.Meanwhile, since Cysteine (Cys) can act as an interference due to structural similarity with Hcy, the effect on this was confirmed. As shown in FIG. 6B, a weak ECL signal was observed in the presence of 10 mM Cys. However, for Hcy, it was measured to show an ECL intensity that is 3.2 times stronger than that of Cys. This proves that the probe of the present invention has excellent selectivity for homocysteine.
다음으로, 프로브 4에 대한 선택성을 측정하였다. 프로브 4 10 μM에 10 mM의 여러가지 아미노산(Ala, Gly, His, Lys, Phe, Ser), 글루타티온 및 음이온(Br-, I-, OAc-, N3-, NO3 2-, PO4 3- 및 SO3 2-)을 각각 넣어준 후 선택성을 확인하였다. 도 6c 및 6d에 나타낸 바와 같이, 프로브 4는 시스테인, 글루타티온 및 설파이드에서만 유의적이지 않은 수준의 아주 약한 신호의 변화를 보였을 뿐이며, Hcy에 대해서만 강한 ECL 세기를 나타내는 것으로 측정되었다. Next, the selectivity for
시험예 3. 다른 이리듐 기반 프로브와 성능 비교Test Example 3. Performance comparison with other iridium-based probes
본 발명에 따른 프로브의 우수성을 확인하기 위하여, 화학식 1로 표시되는 화합물과 구조적으로 유사한 프로브와의 성능을 비교평가 하였다. In order to confirm the superiority of the probe according to the present invention, the performance of the compound represented by
PL 실험을 통해 Hcy을 검출한 연구들이 다른 연구진들에 의해 이전에 보고된 바 있다. 구체적으로, Huang 그룹에서는 두개의 4-(2-피리딜)벤즈알데히드와 한개의 아세틸아세토네이트 기반의 이리듐 컴플렉스인 (pba)2Ir(acac) (프로브 3)을 개발하여 인광의 증가를 통해 효과적으로 Hcy을 검출했다고 보고한 바 있으며, Schmittel 그룹에서는 비슷한 접근법을 이용하여 Hcy에 대한 PL 센서를 개발하였다고 보고하였으나, ECL 변화는 거의 관측되지 않았다.Studies of Hcy detection through PL experiments have been previously reported by other researchers. Specifically, Huang Group developed two 4-(2-pyridyl)benzaldehyde and one acetylacetonate-based iridium complex (pba) 2 Ir(acac) (probe 3) to effectively increase Hcy through phosphorescence. Was reported to be detected, and Schmittel group reported that a PL sensor for Hcy was developed using a similar approach, but ECL changes were hardly observed.
전기화학적인 관점에서 볼 때, 포밀기의 반응에 의한 프로브의 LUMO 분포의 불안정화는 환원 전위가 보다 더 음수 값으로 이동함을 유발한다. 따라서, 종래 기술에 따른 프로브 3이 Hcy과 반응하였을 경우 생성되는 3-Hcy의 경우 3에 비해 환원 전위가 더 음수 값으로 이동하게 될 것으로 예상된다. 하지만 ECL 과정에 있어서, 환원 전위가 지나치게 음수 값을 가질 경우, TPA 라디컬에서 결합 물질의 LUMO 레벨로의 전자 전달을 힘들게 만들기 때문에 들뜬 상태가 거의 형성되지 못하고 이로 인해 ECL 발광 현상이 잘 일어나지 않게 된다. 2-페닐피리딘을 주 리간드로 가지는 이리듐 컴플렉스는 TPA 라디컬에 비해 조금 더 음수 값의 환원 전위를 가지는 것으로 알려져 있으며, 따라서 3-Hcy의 LUMO 레벨의 상승은 전자 전달을 차단함으로써 오히려 ECL 발광을 더 힘들게 만든다.From an electrochemical point of view, destabilization of the LUMO distribution of the probe due to the reaction of the formyl group causes the reduction potential to shift to a more negative value. Therefore, in the case of 3-Hcy generated when
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 포함하는 프로브(프로브 1)은 상기와 같은 문제점들을 고려하여 효율적인 Hcy에 대한 ECL 프로브로써 디자인된 것이다. 즉, 피리딘 링을 더 강한 전자 구인성(electron-withdrawing) 성질을 가지는 이소퀴놀린으로 바꿔 줌으로써 LUMO 레벨을 안정화시키고자 하였고, 이를 통해 PL 뿐 아니라 ECL에서도 Hcy 존재 하에 발광이 증가하는 프로브를 개발하였다.The probe (Probe 1) containing the compound of
밀도함수이론(Density functional theory; DFT) 계산은 1-Hcy의 LUMO 레벨이 TPA 라디컬의 HOMO 레벨보다 낮을 것이라고 예측하고 있고, 이러한 예측을 통해 프로브 1이 Hcy과 반응한 후에 효과적으로 ECL을 생성할 것이라고 기대할 수 있다. 반면에, 프로브 3은 Hcy과의 반응 후에 LUMO 레벨이 급격하게 상승하여 TPA 라디컬의 HOMO 레벨보다도 높아질 것으로 예측되며, 이 경우, TPA 라디컬에서의 전자 전달이 잘 일어나지 않아 ECL 발광 생성 과정이 원활히 일어나지 않을 것으로 예상되었다. Density functional theory (DFT) calculation predicts that the LUMO level of 1-Hcy will be lower than the HOMO level of TPA radicals, and through this prediction,
이러한 예측들을 실제로 실험적으로 증명하기 위해, 두 가지의 이리듐 컴플렉스 2(프로브 2) 및 3(프로브 3)을 합성하였다. 프로브 3은 종래에 Huang 그룹에서 발표했던 물질이고, 프로브 2는 3에 대한 유사체(analogue)로써 프로브 3과 거의 같은 특성을 보여줄 것으로 예상되는 것이다. 프로브 2에 Hcy을 첨가해 주었을 때는 프로브 3과 마찬가지로 PL이 급격하게 증가하는 양상을 보여주었다. 그러나, 예상했던 것과 같이, 프로브 2에 Hcy을 넣어줌에 따라 ECL 세기는 오히려 조금씩 감소하는 양상이 확인되었다. 즉, 50 μM의 프로브 2에 10 mM Hcy를 첨가한 후 0-1.5V의 전압을 걸어주었을 때, 프로브 2가 약한 ECL을 1.2 V 부근에서 보여주는 것에 비해 2-Hcy는 더 약한 ECL 세기를 보여주었다. 프로브 3과 3-Hcy의 ECL 성질 역시 2, 2-Hcy과 거의 유사한 경향을 보여주었다. 하지만, 본 발명에 따른 프로브 1은 PL과 ECL 모두 Hcy을 넣어 주었을 때 비슷한 양상을 보이며 크게 증가하는 것이 관찰되었다. To prove these predictions practically and experimentally, two iridium complexes 2 (probe 2) and 3 (probe 3) were synthesized.
이와 같은 사실을 보다 확실하게 규명하기 위하여 CV 실험을 실시하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 산화 전위는 서포트 전해질로서 0.1M 테트라-n-부틸암모늄 퍼클로레이트를 포함한 아세토니트릴 용액에서 주사 속도(scan rate) 0.1 V/s로 순환 전압전류를 사용하여 측정되었고, 값은 표준으로 1 mM 페로센(Fc/Fc+)의 산화에 대해 보정하였고, SCE를 참고하였다. 환원 전위(E0' red)값은 여기 에너지(E0 -0) 및 산화 전위(E0' ox)로부터 계산하였다. In order to clarify this fact more reliably, a CV experiment was conducted, and the results are shown in Table 3. Oxidation potential was measured using a cyclic voltammetry at a scan rate of 0.1 V/s in an acetonitrile solution containing 0.1 M tetra-n-butylammonium perchlorate as a support electrolyte, and the value was 1 mM ferrocene (Fc /Fc+) was corrected for oxidation, and SCE was referenced. Reduction potential (E 0 'red) value of the excitation energy (E 0 -0) and the oxidation potential (E 0' was calculated from ox).
화합물구분
Compound classification
(V vs SCE)E 0 'ox
(V vs SCE)
(V vs SCE)E 0 'red *
(V vs SCE)
(eV)E 0 -0 *
(eV)
표 3에 나타낸 바와 같이, 프로브 3의 환원 전위는 -1.66 V이며, Hcy을 첨가해 준 뒤에는 -1.99V로 이동하는 것을 확인할 수 있다. TPA 라디컬의 환원 전위는 약 -1.7V 정도로 알려져 있으며, 따라서 이러한 데이터는 왜 3-Hcy이 ECL 과정 중에 들뜬 상태를 거의 형성할 수 없는지에 대한 설명의 근거가 될 수 있다. 하지만, 프로브 1의 경우 Hcy과의 반응 후에 생성되는 1-Hcy의 환원 전위가 -1.28 V로써 상대적으로 마일드하며, TPA 라디칼의 환원 전위에 비해 덜한 음수 값을 가지기 때문에 효과적으로 들뜬 상태가 형성될 수 있을 것으로 예상할 수 있다.As shown in Table 3, it can be seen that the reduction potential of
시험예 4. 반응속도 평가Test Example 4. Evaluation of reaction rate
실시예 1 내지 3에 따른 프로브 1, 4 및 5 (10 μM)에 각각 Hcy (5 mM)을 첨가하여 반응속도를 측정하였으며, 이를 하기 도 7에 나타내었다. 측정은 H2O/MeCN (1:1 v/v, pH 7.4, 10 mM HEPES) (λex= 500 nm)에서 수행하였다. 프로브 1은 최대인광세기 90%에 도달하는데 170분이 소요되었으며, 프로브 4는 최대강도의 90%에 도달하는데 85분이 채 걸리지 않았다. 또한 프로브 5는 프로브 1보다 조금 빠른 것이 확인되었다. 이는 DFT 계산값과도 일치한다. Hcy (5 mM) was added to each of the
Claims (10)
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
L는 비발광성 리간드이며;
A는 N 및 Z1을 포함하는 2 내지 3환의 축합헤테로아릴이며; 상기 축합헤테로아릴은
R1 및 R2은 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 할로, 시아노, C1-10알킬 및 C1-10알킬옥시로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고;
R3은 수소이고,
Z1는 C 이고,
A가
[Formula 1]
In Formula 1,
L is a non-luminescent ligand;
A is a 2 to 3 ring condensed heteroaryl including N and Z 1 ; The condensed heteroaryl is
R 1 and R 2 are the same as or different from each other, and each independently is any one selected from the group consisting of hydrogen, hydroxy, halo, cyano, C 1-10 alkyl and C 1-10 alkyloxy;
R 3 is hydrogen,
Z 1 is C,
A is
비발광성 리간드 L은 하기 구조로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브:
상기 화학식에서,
R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12는 서로 동일하거나 또는 상이하고, 각각 독립적으로 수소, C1 - 10알킬, 할로C1 - 6알킬 및 C5 - 12아릴 중에서 선택된다.The method of claim 1,
The non-luminescent ligand L is an electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine, characterized in that it is selected from the following structures:
In the above formula,
R 6, R 7, R 8 , R 9, R 10, R 11 and R 12 are the same or different and are each independently hydrogen, C 1 - 10 alkyl, halo C 1 - 6 alkyl and C 5 - 12 It is selected from aryl.
상기 화학식 1의 화합물은 호모시스테인과 선택적으로 반응하여 전기화학발광 신호를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.The method of claim 1,
The compound of Formula 1 is characterized in that to increase the electrochemiluminescent signal by selectively reacting with homocysteine, homocysteine detection electrochemiluminescent probe.
상기 화학식 1의 화합물의 포밀기와 호모시스테인이 반응하여 육각 고리를 형성하며, 전기화학발광 신호를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.The method of claim 1,
An electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine, characterized in that the formyl group of the compound of Formula 1 reacts with homocysteine to form a hexagonal ring and increases an electrochemiluminescent signal.
화학식 1의 화합물과 호모시스테인의 반응 생성물의 LUMO 에너지 레벨이 전기화학발광 공반응물의 HOMO 에너지 레벨보다 낮은, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브. The method of claim 5,
An electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine in which the LUMO energy level of the reaction product of the compound of Formula 1 and homocysteine is lower than the HOMO energy level of the electrochemiluminescent co-reactant.
전기화학발광 공반응물은 트리프로필아민 또는 2-(디부틸아미노)에탄올인 것을 특징으로 하는, 호모시스테인 검출용 전기화학발광 프로브.The method of claim 6,
Electrochemiluminescent probe for detecting homocysteine, characterized in that the electrochemiluminescent co-reactant is tripropylamine or 2-(dibutylamino)ethanol.
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| 김훈준, '이리듐 복합체를 이용한 전기화학적 발광 기반의 화학센서의 개발에 관한 연구', 서울대학교 대학원 이학박사학위논문, (2017.02.). 1부.* |
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