KR102172987B1 - folic acid-poly(ε-caprolactone)-folic acid which has folate receptor targeting and endosomolytic activity, and use thereof - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to: a folic acid-poly(ε-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer in which folic acid (hereinafter referred to as ′F′) is covalently bonded to both ends of poly(ε-caprolactone) (PCL), and which has folate receptor targeting and endosomolytic activity at both ends of the polymer represented by chemical formula 1; nanoparticles prepared therefrom; and an anticancer composition or a composition for nanopharmaceutical delivery comprising the same. The FPCL polymer forms nanoparticles through self-assembly in the aqueous phase, and FPCL nanoparticles formed thereby can encapsulate a large amount of hydrophobic drugs inside the nanoparticles. Thus, the polymer and nanoparticles can serve as a drug delivery system capable of increasing the efficiency of drug delivery into the cytoplasm of target cells through overexpressed folate receptor targeting and endosomolytic activity.

Description

엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산 고분자 및 이의 용도{folic acid-poly(ε-caprolactone)-folic acid which has folate receptor targeting and endosomolytic activity, and use thereof}Folic acid-poly(ε-caprolactone)-folic acid which has folate receptor targeting and endosomolytic activity, and use thereof, which has folate receptor targeting and endosomolytic activity, and use thereof }

본 발명은 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산(FPCL) 고분자 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a folic acid-poly(epsilon-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer having folate receptor targeting ability and endosomal membrane resolution and uses thereof.

생체적합성 고분자는 나노약물전달체의 구성물질로 화학적 약물, 조영제, 펩타이드, 단백질 및 유전물질 등 다양한 치료제를 전달하기 위한 효과적인 시스템 개발에 사용되고 있다. 특히 장기, 조직, 세포 및 세포소기관(세포질, 미토콘드리아, 핵 등)을 표적할 수 있는, 위치 특이적 나노약물전달체는 환자에 의한 약물 투여량 및 부작용 등을 감소시키고, 표적 위치 내(체 내, 장기 내, 조직 내, 세포 내 또는 세포소기관 내 등) 약물 수준의 항상성 유지 및 치료 효과를 극대화 시키기 위해 지속적으로 성장하고 있다. 나노약물전달체는 질환 부위의 pH, 효소, 산화-환원, 화학물질 등 생리학적 또는 병리학적 차이를 이용하거나 특정 세포의 세포막에 특이적으로 발현된 수용체나 항원 등을 인지할 수 있는 리간드 또는 항체를 이용하고 있다. 그 중, 나노입자 표면에 단일클론항체(monoclonal antibody), RGD peptides, aptamer 및 엽산(folic acid) 등과 같은 다양한 표적지향 리간드를 도입함으로써 정상세포보다 암세포에 좀 더 선택적으로 약물을 전달할 수 있는 나노약물전달체가 개발하고 있다. Biocompatible polymers are constituents of nanopharmaceutical delivery systems and are used to develop effective systems for delivering various therapeutic agents such as chemical drugs, contrast agents, peptides, proteins and genetic materials. In particular, the site-specific nano-drug delivery system, which can target organs, tissues, cells and organelles (cytoplasm, mitochondria, nucleus, etc.), reduces drug dose and side effects by patients, and within the target site (in the body, It continues to grow in order to maintain the homeostasis of the drug level and maximize the therapeutic effect) in organs, tissues, cells or organelles. Nanopharmaceutical delivery systems use physiological or pathological differences such as pH, enzymes, oxidation-reduction, and chemical substances of disease sites, or use ligands or antibodies that can recognize receptors or antigens specifically expressed on the cell membrane of specific cells. I am using it. Among them, nanodrugs that can more selectively deliver drugs to cancer cells than normal cells by introducing various targeting ligands such as monoclonal antibodies, RGD peptides, aptamers and folic acid on the surface of nanoparticles. The delivery system is being developed.

엽산 수용체는 난소암, 결장암, 유선암, 폐암, 신장암, 악성 상피세포암 등의 다양한 암세포 표면에 엽산 수용체가 과발현 되어 있다. 정상조직인 상피세포의 첨단막(apical membrane) 부위에서도 엽산 수용체가 발현되어 있지만, 첨단막(apical membrane)의 위치적 제한으로 엽산이 엽산 수용체에 결합하는 것은 쉽지 않다. 따라서 엽산은 선택적인 종양 표적화기로서 기능을 한다. 필수적인 영양소로 알려진 엽산은 핵산 합성, 에너지 형성, 적혈구 생성에 반드시 필요하며, 세포증식과 성장에 특히 중요한 역할을 담당하고 있다. 또한, 엽산은 엽산 수용체와 높은 친화성으로 결합한 후, 크기에 상관없이 엽산결합물은 수용체-매개 엔도사이토시스에 의해 세포 내부로 유입될 수 있다. The folate receptor is overexpressed on the surface of various cancer cells such as ovarian cancer, colon cancer, mammary cancer, lung cancer, kidney cancer, and malignant epithelial cell carcinoma. Folic acid receptors are also expressed in the apical membrane of normal tissues, the apical membrane, but it is not easy for folic acid to bind to the folic acid receptor due to the local restriction of the apical membrane. Thus, folic acid functions as a selective tumor targeter. Folic acid, known as an essential nutrient, is essential for nucleic acid synthesis, energy formation, and red blood cell production, and plays a particularly important role in cell proliferation and growth. In addition, after the folic acid binds with the folate receptor with high affinity, the folic acid conjugate can be introduced into the cell by receptor-mediated endocytosis regardless of size.

나노약물전달체에 봉입된 화학적 약물 또는 생물학적 약물이 세포 내로 전달될 때, 이 나노약물전달체의 엔도솜 내 격리 현상은 약물 효과의 중요한 장애요인이다. 이러한 문제는 아민기, 설폰아마이드기, 인산기, 카르복실산기를 가진 저분자나 고분자에 의해 유도되는 엔도솜막 불안정화 또는 파괴를 통해 극복될 수 있다. 또한, 엔도솜 pH 하에서, 수소이온 완충화(proton buffering) 및 구조 전이(conformational transition) 특성은 엔도솜 지질막 불안정화 또는 파괴를 유도하는 것으로 알려져 있다. 엔도솜의 성숙과정(maturation process)에 의해 엔도솜 내부의 pH는 낮아지게 되고, 이 산성화 과정은 중성 pH에서 카르복실레이트(carboxylate; COO-)를 갖는 엽산을 양성자화된(protonated) 카르복실산(carboxylic acid; COOH)을 갖는 엽산으로 바뀌게 한다. 카르복실레이트를 갖는 엽산이 카르복실산으로 바뀌는 이 과정을 통해 엔도솜 내부의 pH를 완충하는 수소이온 완충화 활성을 통해, 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하는 엔도솜 분해능을 보이며, 이는 나노약물전달체에 봉입된 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도할 수 있다. 따라서 암표적능과 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산 리간드는 종양세포의 세포질에 약물을 고농도로 존재시킬 수 있어, 암세포에서 높은 약물 치료효과를 얻을 수 있다. When a chemical drug or a biological drug encapsulated in a nano drug delivery system is delivered into cells, the sequestration of the nano drug delivery system in the endosome is an important obstacle to the drug effect. This problem can be overcome through destabilization or destruction of the endosome membrane induced by a small molecule or polymer having an amine group, a sulfonamide group, a phosphoric acid group, or a carboxylic acid group. In addition, under endosome pH, proton buffering and conformational transition properties are known to induce destabilization or destruction of endosome lipid membranes. By endosomal maturation (maturation process) of endo pH of cotton inside is lowered, the acidification process carboxylate at neutral pH (carboxylate; COO -) protonated folic acid having the (protonated) carboxylic acid It turns into folic acid with (carboxylic acid; COOH). Through this process of converting folic acid with carboxylate into carboxylic acid, it shows endosome decomposition ability to destabilize or destroy the endosome membrane through hydrogen ion buffering activity that buffers the pH inside the endosome. Endosomal escape of the encapsulated drug can be induced. Therefore, folic acid ligands having cancer targeting ability and endosomal membrane decomposition ability can present a drug at a high concentration in the cytoplasm of tumor cells, thereby obtaining a high drug treatment effect in cancer cells.

이러한 약물전달 기술은 고부가가치 기술로서 전체 약물 개발 과정에서 갈수록 중요한 부문을 차지하고 있고, 환자들의 약물 순응도와 복용의 편리성을 제고시키는 방법으로 그 활용도가 증가하고 있다.Such drug delivery technology is a high value-added technology, occupying an increasingly important part in the entire drug development process, and its use is increasing as a method of improving patient compliance and ease of use.

아울러, 친수성 블록과 소수성 블록을 함께 가지고 있는 양친매성 고분자는 수용액에서 자기조립을 할 수 있는 독특한 성질을 가지고 있어서 나노의약(nanomedicine)과 나노입자 기반의 약물전달체에서 관심이 높아지고 있다. 이러한 양친매성 고분자는 소수성 블록과 친수성 블록이 다양한 형태로 연결되기 때문에 5 kDa 이상의 고분자량을 가지며, 고분자 구조와 친수성 블록-소수성 블록 간의 중량(또는 부피) 비율에 따라 팩킹 파라미터(packing parameter)가 결정된다. 또한, 팩킹 파라미터(packing parameter)는 자기조립된 나노구조체의 형태를 결정하게 되는데, 베시클 모양의 폴리머좀(polymersome)과 구형 또는 막대 모양의 고분자 미셀 등을 형성할 수 있어 다양한 성질의 친수성 화학약물, 소수성 화학약물 또는 생물학적 약물을 효율적으로 봉입할 수 있다. 또한, 일반적으로 사용되는 5 kDa 이상의 양친매성 고분자는 중량비율이 약 27% 에서 약 50% 수준의 친수성 부분을 주로 가지며, 특히 베시클 형태인 리포좀 제형에 일반적으로 사용되는 지질은 중량 비율이 약 20% 에서 약 26% 수준의 친수성 부분을 주로 갖는다. 이와 달리, FPCL 고분자는 5 kDa 보다 작은 분자량을 사용할 수 있으며, 친수성 부분이 양친매성 고분자 중량 중 62.5% 정도까지 늘릴 수 있으며, 소수성 PCL의 분자량을 크게 하면 친수성 부분을 15% 정도까지 줄일 수도 있다. 이는 FPCL 고분자를 이용한 약물전달체를 베시클 또는 미셀 형태로 전달하고자 하는 약물에 따라 나노구조체를 설계할 수 있음을 의미한다. In addition, the amphiphilic polymers, which have both a hydrophilic block and a hydrophobic block, have a unique property of self-assembly in an aqueous solution, and thus, interest in nanomedicine and nanoparticle-based drug delivery systems is increasing. These amphiphilic polymers have a high molecular weight of 5 kDa or more because the hydrophobic block and the hydrophilic block are connected in various forms, and the packing parameter is determined according to the weight (or volume) ratio between the polymer structure and the hydrophilic block-hydrophobic block. do. In addition, the packing parameter determines the shape of the self-assembled nanostructures, which can form vesicle-shaped polymersomes and spherical or rod-shaped polymer micelles, so hydrophilic chemicals of various properties , Hydrophobic chemical or biological drugs can be efficiently encapsulated. In addition, commonly used amphiphilic polymers of 5 kDa or more have a weight ratio of about 27% to about 50% of a hydrophilic portion, and in particular, lipids commonly used in vesicle-type liposome formulations have a weight ratio of about 20 % To about 26% level of hydrophilicity. In contrast, the FPCL polymer can use a molecular weight less than 5 kDa, the hydrophilic portion can be increased to about 62.5% of the weight of the amphiphilic polymer, and the hydrophilic portion can be reduced to about 15% by increasing the molecular weight of the hydrophobic PCL. This means that a drug delivery system using FPCL polymer can be designed according to the drug to be delivered in the form of vesicles or micelles.

나노약물전달체 또는 고분자-약물 접합체(polymer-drug conjugate)에서 친수성 성질을 가지는 부분으로 폴리에틸렌글리콜(poly(ethylene glycol); 이하 ‘PEG’)을 자주 사용되어 왔다. 친수성 폴리에틸렌글리콜 자체가 갖는 높은 수용해도와 사슬 유연성은 페길화된(PEGylated) 나노약물전달체 또는 PEG-약물 접합체가 수상에서 더 많은 약물을 가용화 할 수 있도록 하였으며, 혈액순환 중 망상내피계 (reticuloendothelial system; 이하 ‘RES’)에 의한 약물 소실을 줄일 수 있었다. 특히, PEG-단백질 접합체의 경우, 면역세포에 의한 단백질의 인지 및 항원 형성을 줄이는 효과도 보였다. 궁극적으로, 혈중 약물의 반감기를 연장시켜 약물의 효과가 개선되는데 도움을 주었다. Poly(ethylene glycol) (hereinafter'PEG') has been frequently used as a part having hydrophilic properties in nano-drug delivery systems or polymer-drug conjugates. The high water solubility and chain flexibility of the hydrophilic polyethylene glycol itself allowed the PEGylated nanodrug delivery system or PEG-drug conjugate to solubilize more drugs in the aqueous phase, and the reticuloendothelial system during blood circulation; It was possible to reduce the drug loss caused by hereinafter'RES'). In particular, in the case of the PEG-protein conjugate, the effect of reducing protein recognition and antigen formation by immune cells was also shown. Ultimately, it helped to improve the effectiveness of the drug by extending the half-life of the drug in the blood.

그러나, 폴리에틸렌글리콜이 의약품 뿐만 아니라 화장품, 식품 등에 다양하게 많이 사용됨에 따라, 페길화된 의약품에 노출되지 않았음에도 불구하고 폴리에틸렌글리콜에 이미 노출된 상황에 직면하게 되었다. However, as polyethylene glycol is widely used not only in pharmaceuticals, but also in cosmetics, foods, etc., despite not being exposed to pegylated pharmaceuticals, it has already been exposed to polyethylene glycol.

이러한 폴리에틸렌글리콜의 빈용에 따라, 면역세포가 폴리에틸렌글리콜을 인지하고 항원도 형성하게 되어 면역원성, 과민증 등을 일으키는 예가 보고되기 시작하였다. 특히, 페길화된 약물을 반복 주사하는 경우, 가속화된 혈중 청소율 (Accelerated Blood clearance; 이하 ‘ABC’) 현상에 의해 투여 약물의 빠른 손실이 발생되는 문제점이 관찰되었다. 이러한 폴리에틸렌글리콜의 대체 물질로 N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드(N-(2-hydroxyprolyl)methacrylamide; 이하 ‘HPMA’)와 폴리(카르복시베타인)(poly(carboxybetaine); 이하‘PCB’) 등의 친수성 고분자가 연구가 되고 있지만, 짧은 친수성 분자를 이용한 대체제 연구는 거의 되지 않았다. According to the poor use of polyethylene glycol, an example of causing immunogenicity, hypersensitivity, etc. has been reported by immune cells recognizing polyethylene glycol and forming antigens. In particular, in the case of repeated injections of a pegylated drug, a problem in which the administered drug is rapidly lost due to an accelerated blood clearance (hereinafter referred to as “ABC”) was observed. As a substitute for such polyethylene glycol, N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide (N-(2-hydroxyprolyl) methacrylamide; hereinafter'HPMA') and poly(carboxybetaine); hereinafter'PCB ') and other hydrophilic polymers are being studied, but there have been few studies on alternatives using short hydrophilic molecules.

이러한 배경 하에서, 본 발명에서는 생분해성인 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone)]의 양 말단에 엽산(Folic acid)이 공유결합된 고분자를 합성하여 [엽산(folic acid; F)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-엽산 (FPCL)] 구조를 갖는 고분자를 합성하였다. 본 발명에 따른 고분자는 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖으며, 특히, 본 발명의 FPCL 고분자는 중성 pH에서 양 말단에 있는 친수성 카르복실레이트(carboxylate)가 암세포 주변 환경이나 세포 내 소기관인 엔도솜 및 리소솜 등의 산성 pH에서 소수성인 카르복실산(carboxylic acid)으로 바뀔 수 있어 암세포 내로 쉽게 유입되거나 또는 엔도솜에서 세포질 내로 탈출할 수 있다. 이로 인해, 약물을 탑재한 FPCL 나노입자는 봉입된 약물을 세포질에서 방출시켜 약물의 효과를 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 나노약물전달체를 형성하는 FPCL 고분자는 친수성 카르복실레이트(carboxylate)를 이용하여 빈용되었던 친수성 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene gylcol; 이하 ‘PEG’) 고분자를 대체하였다. FPCL 나노약물전달체는 폴리에틸렌글리콜이 없기 때문에 PEG-매개 면역반응, 항원반응과 약효 저하 등의 문제로 부터 자유로우며, 친수성 카르복실레이트(carboxylate)에 의해 FPCL 나노약물전달체의 콜로이드 안정성을 향상시킬 수도 있다.Under this background, in the present invention, a polymer in which folic acid is covalently bonded to both ends of a biodegradable poly(epsilon-caprolactone) [poly(ε-caprolactone)] is synthesized and [folic acid (F)- A polymer having a poly(epsilon-caprolactone)[poly(ε-caprolactone; PCL)]-folic acid (FPCL)] structure was synthesized. The polymer according to the present invention has folic acid receptor targeting ability and endosomal membrane resolution, and in particular, the FPCL polymer of the present invention contains hydrophilic carboxylate at both ends at neutral pH in the environment around cancer cells or endosomal organelles. It can be converted into a hydrophobic carboxylic acid at acidic pH such as cotton and lysosome, so it can easily enter into cancer cells or escape into the cytoplasm from endosomes. For this reason, the drug-loaded FPCL nanoparticles can improve the effect of the drug by releasing the encapsulated drug from the cytoplasm. In addition, the FPCL polymer forming the nanopharmaceutical delivery system of the present invention replaced the poorly used hydrophilic polyethylene glycol (Polyethylene gylcol; hereinafter'PEG') polymer using a hydrophilic carboxylate. Because FPCL nanodrug delivery system does not contain polyethylene glycol, it is free from problems such as PEG-mediated immune response, antigen reaction, and decrease in drug efficacy, and the colloidal stability of FPCL nano drug delivery system can be improved by hydrophilic carboxylate. .

한국등록특허 제10-0180334호(1999.03.20 등록)Korean Patent Registration No. 10-0180334 (registered on March 20, 1999) 중국등록특허 제106883397호(2018.09.11. 등록)Chinese Patent No. 106883397 (registered on September 11, 2018)

본 발명의 발명자는 약물전달체로서 유용한 고분자 또는 나노입자를 고안하던 중, 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone)]의 양 말단에 엽산(Folic acid)이 공유결합된 고분자의 경우 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖으며, 이는 수상에서 자기조립하여 나노입자를 형성하는 바, 이러한 나노입자에 약물 중 특히 항암제를 봉입 시 약물 전달능이 우수하다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. The inventor of the present invention was devising a polymer or nanoparticle useful as a drug delivery system, and in the case of a polymer in which folic acid is covalently bonded to both ends of poly(epsilon-caprolactone)[poly(ε-caprolactone)], folic acid It has a receptor targeting ability and an endosome membrane resolution, which is self-assembled in an aqueous phase to form nanoparticles, and it was found that the drug delivery ability was excellent, especially when an anticancer agent was encapsulated in such nanoparticles, thereby completing the present invention.

이에, 본 발명의 목적은 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산(FPCL) 고분자를 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a folic acid-poly(epsilon-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer having folic acid receptor targeting ability and endosome membrane resolution.

또한, 본 발명의 다른 목적은 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산(FPCL) 고분자가 수상에서 자기조립된 FPCL 나노입자를 제공하는 것이다. In addition, another object of the present invention is to provide FPCL nanoparticles in which a folic acid-poly(epsilon-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer is self-assembled in an aqueous phase.

또한, 본 발명의 다른 목적은 FPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다. In addition, another object of the present invention is to provide an anticancer composition comprising FPCL nanoparticles as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 FPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a composition for nanopharmaceutical delivery comprising FPCL nanoparticles as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; 이하 ‘PCL’)]의 양 말단에 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)이 공유결합된, 화학식 1로 표시되는 양 말단에 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산(FPCL) 고분자를 제공한다; In order to achieve the above object, the present invention is a poly(epsilon-caprolactone) [poly(ε-caprolactone; hereinafter'PCL')] in which folic acid (hereinafter'F') is covalently bonded to both ends, A folic acid-poly(epsilon-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer having a folate receptor targeting ability and an endosome membrane resolution ability at both ends represented by 1 is provided;

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112019108345511-pat00001
Figure 112019108345511-pat00001

상기 화학식 1에서, x는 3 내지 20의 정수이다.In Formula 1, x is an integer of 3 to 20.

또한, 본 발명은 상기 FPCL 고분자가 수상에서 자기조립된 FPCL 나노입자를 제공한다.In addition, the present invention provides FPCL nanoparticles in which the FPCL polymer is self-assembled in an aqueous phase.

또한, 본 발명은 상기 FPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides an anticancer composition comprising the FPCL nanoparticles as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 FPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a nano-drug delivery composition comprising the FPCL nanoparticles as an active ingredient.

본 발명은 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)-폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; 이하 ‘PCL’)]-엽산(FPCL) 고분자 및 상기 고분자를 이용한 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖는 나노약물전달용 조성물에 관한 것으로서, FPCL 고분자는 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성할 수 있으며, 나노입자 내부에 다량의 소수성 약물을 봉입 시킬 수 있어 과발현된 엽산 수용체 표적능과 엔도솜막 분해능을 통해서 표적 세포의 세포질 내로 약물 전달 효율을 증가시킬 수 있는 약물전달체로의 역할도 할 수 있다. The present invention is a folic acid (folic acid; hereinafter'F')-poly(epsilon-caprolactone) [poly(ε-caprolactone; hereinafter'PCL')]-folic acid (FPCL) polymer and folic acid receptor targeting ability using the polymer and Regarding a composition for nano-drug delivery with endosome membrane resolution, FPCL polymer can form nanoparticles through self-assembly in an aqueous phase, and can encapsulate a large amount of hydrophobic drugs inside the nanoparticles, thereby targeting overexpressed folate receptors It can also play a role as a drug delivery system that can increase the efficiency of drug delivery into the cytoplasm of target cells through endosome membrane degradation.

도 1은 FPCL 고분자의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 2는 PCL0.5 디올(diol), 엽산(folic acid) 및 FPCL0.5 고분자의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 FPCL0.5 나노입자와 DOX@FPCL0.5 나노입자(항암제 독소루비신이 봉입된 FPCL 나노입자)의 입자크기와 제타전위를 나타낸 것이다.
도 4는 DOX@FPCL0.5 나노입자(항암제 독소루비신이 봉입된 FPCL 나노입자)의 독소루비신 항암제의 봉입량과 봉입효율을 나타낸 것이다.
도 5는 엽산 수용체(Folate receptor; 이하 ‘FR’)의 발현 정도가 다른 두 종류의 암세포(HepG2; FR(-), HeLa; FR(+))에서의 FPCL0.5 나노입자의 세포사멸 능력 평가를 통해 세포 독성이 없음을 나타낸 것이다.
도 6은 엽산 수용체의 발현 정도가 다른 두 종류의 암세포(HepG2; FR(-), HeLa; FR(+))에서 항암제인 독소루비신이 봉입된 FPCL0.5 나노입자의 세포사멸 능력을 나타낸 것이다.
도 7은 엽산 수용체가 과발현된 자궁경부암세포(HeLa)에서 클로로퀸(chloroquine) 또는 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1) 존재 시, DOX@FPCL0.5 나노입자(항암제 독소루비신이 봉입된 FPCL0.5 나노입자)에 의한 독소루비신의 세포 내에 유입량을 평가한 것이다.
도 8은 엽산 수용체가 과발현된 자궁경부암세포(HeLa)에서 클로로퀸(Chloroquine) 또는 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1) 존재 시, DOX@FPCL0.5 나노입자(항암제 독소루비신이 봉입된 FPCL0.5 나노입자)에 의한 독소루비신의 핵 내에 유입량을 평가한 것이다.
도 9는 엽산 수용체가 과발현된 자궁경부암세포(HeLa)에서 클로로퀸(Chloroquine) 또는 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1) 존재 시, DOX@FPCL0.5 나노입자(항암제 독소루비신이 봉입된 FPCL0.5 나노입자)에 의한 독소루비신의 미토콘드리아 내에 유입량을 평가한 것이다.
도 10은 DOX@FPCL0.5 나노입자(항암제 독소루비신이 봉입된 FPCL0.5 나노입자)가 처리된 자궁경부암세포(HeLa)에서 DOX@FPCL0.5 나노입자에 의해 전달된 독소루비신의 세포 내 분포를 나타낸 형광 이미지이다.1 shows the synthesis process of the FPCL polymer.
FIG. 2 shows 1 H-NMR spectra of PCL 0.5 diol, folic acid, and FPCL 0.5 polymer.
Figure 3 shows the particle size and zeta potential of FPCL 0.5 nanoparticles and DOX@FPCL 0.5 nanoparticles (FPCL nanoparticles encapsulated with the anticancer agent doxorubicin).
4 shows the encapsulation amount and encapsulation efficiency of the doxorubicin anticancer drug of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles (FPCL nanoparticles encapsulated with the anticancer agent doxorubicin).
5 is an evaluation of the apoptosis ability of FPCL 0.5 nanoparticles in two types of cancer cells (HepG2; FR(-), HeLa; FR(+)) with different levels of expression of the folate receptor (hereinafter'FR'). Shows no cytotoxicity.
Figure 6 shows the apoptosis ability of FPCL 0.5 nanoparticles encapsulated with doxorubicin, an anticancer agent, in two types of cancer cells (HepG2; FR(-), HeLa; FR(+)) with different levels of folate receptor expression.
Figure 7 is in the presence of chloroquine or bafilomycin A1 in folate receptor-overexpressed cervical cancer cells (HeLa), by DOX@FPCL 0.5 nanoparticles (FPCL 0.5 nanoparticles containing anticancer drug doxorubicin) The amount of doxorubicin introduced into the cells was evaluated.
Figure 8 is in the presence of chloroquine (Chloroquine) or bafilomycin A1 (Bafilomycin A1) in folic acid receptor overexpressed cervical cancer cells (HeLa), by DOX@FPCL 0.5 nanoparticles (FPCL 0.5 nanoparticles encapsulated with anticancer drug doxorubicin) This is an evaluation of the influx of doxorubicin into the nucleus.
Figure 9 is in the presence of chloroquine (Chloroquine) or bafilomycin A1 (Bafilomycin A1) in folic acid receptor overexpressed cervical cancer cells (HeLa), by DOX@FPCL 0.5 nanoparticles (FPCL 0.5 nanoparticles encapsulated with anticancer drug doxorubicin) This is an evaluation of the influx of doxorubicin into the mitochondria.
10 is DOX @ FPCL 0.5 nanoparticles (anticancer drug doxorubicin is filled with the FPCL 0.5 nano-particles) in cervical cancer cells (HeLa) treated DOX @ FPCL a fluorescence image showing the intracellular distribution of doxorubicin delivered by the 0.5 nm particles .

본 발명자는 약물전달체로 유용한 고분자 또는 나노입자를 고안하던 중, 생체적합성과 생분해성을 갖는다고 알려진 소수성 고분자인 폴리(입실론-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone); 이하 ‘PCL’)의 양 말단에 엽산 수용체 표적능과 엔도솜막 분해능을 가진 엽산을 화학적으로 결합시켜 엽산-PCL-엽산(FPCL) 고분자를 합성하였다. 본 발명에 따른 FPCL 고분자의 경우, 수상에서 자기조립을 통해 나노입자를 형성하였고, 이는 엽산 수용체가 과발현된 암세포에 표적능과 수소이온 완충능력을 가짐으로써 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여, 표적 세포 내로 전달된 약물을 엔도솜에서 세포질 내로 탈출시킬 수 있는 생기능성(biofunctional)이 있다는 것을 알게 되었다. 나아가, 엔도솜을 탈출한 약물전달체는 다양한 약물을 세포질 내로 전달할 수 있는 전달체로의 역할도 할 수 있다는 것을 확인하게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. The present inventors were devising a polymer or nanoparticle useful as a drug delivery system, while the amount of poly(epsilon-caprolactone), a hydrophobic polymer known to have biocompatibility and biodegradability; hereinafter'PCL') Folic acid-PCL-folate (FPCL) polymer was synthesized by chemically binding folic acid, which has folic acid receptor targeting ability and endosomal membrane resolution, at the terminal. In the case of the FPCL polymer according to the present invention, nanoparticles were formed through self-assembly in the aqueous phase, which destabilizes or destroys the endosome membrane by having a targeting ability and hydrogen ion buffering ability on cancer cells overexpressed in folic acid receptors, and into target cells. It was found that there is a biofunctional ability to escape the delivered drug from the endosome into the cytoplasm. Furthermore, it was confirmed that the drug delivery system that escaped the endosome can also serve as a delivery system capable of delivering various drugs into the cytoplasm, thereby completing the present invention.

따라서, 본 발명은 폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; 이하 ‘PCL’)]의 양 말단에 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)이 공유결합된, 화학식 1로 표시되는 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산(FPCL) 고분자를 제공한다.Accordingly, the present invention is a folic acid represented by Formula 1 in which folic acid (hereinafter'F') is covalently bonded to both ends of poly(epsilon-caprolactone) [poly(ε-caprolactone; hereinafter'PCL')] -Poly(epsilon-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer is provided.

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112019108345511-pat00002
Figure 112019108345511-pat00002

상기 화학식 1에서, x는 3 내지 20의 정수이다.In Formula 1, x is an integer of 3 to 20.

본 발명의 일 실시예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 고분자는 생분해성 폴리(입실론-카프로락톤)의 양 말단에 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)이 공유결합된 것으로, 엽산 수용체 표적능과 엔도솜막 분해능을 갖는 고분자일 수 있다.As an embodiment of the present invention, the polymer represented by Formula 1 is a biodegradable poly(epsilon-caprolactone) in which folic acid (hereinafter'F') is covalently bonded to each other, and the folic acid receptor targeting ability and It may be a polymer having endosome membrane resolution.

또한 본 발명은 상기 고분자가 수상에서 자기조립된, 나노입자를 제공한다.In addition, the present invention provides nanoparticles in which the polymer is self-assembled in an aqueous phase.

본 발명의 FPCL 고분자의 양 말단에 있는 친수성인 카르복실레이트(carboxylate)는 암세포 주변 환경이나 세포 내 소기관인 엔도솜 및 리소솜 등의 산성 pH에서 소수성인 카르복실산(carboxylic acid)으로 바뀔 수 있어 암세포 내로 쉽게 유입되거나 또는 엔도솜에서 세포질 내로 탈출할 수 있다. 그래서 약물을 탑재한 FPCL 나노입자는 봉입된 약물을 세포질에서 방출시켜 약물의 효과를 개선시킬 수 있다.Hydrophilic carboxylate at both ends of the FPCL polymer of the present invention can be changed to a hydrophobic carboxylic acid in the environment around cancer cells or at acidic pH such as endosomes and lysosomes, which are organelles. It can easily enter cancer cells or escape from endosomes into the cytoplasm. So, FPCL nanoparticles loaded with drugs can improve the effects of drugs by releasing the enclosed drugs from the cytoplasm.

상기 나노입자는 평균 입경이 20 내지 400 nm 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The nanoparticles may have an average particle diameter of 20 to 400 nm, but are not limited thereto.

상기 나노입자는 과발현된 엽산 수용체 표적능을 가지고 있다. 다시 말해, 엽산 수용체가 과발현된 세포 내 엽산 수용체에 리간드 결합하는 엽산 수용체 표적능을 가진다.The nanoparticles have an overexpressed folate receptor targeting ability. In other words, the folic acid receptor has a folate receptor targeting ability to bind to the folate receptor in the overexpressed cell.

상기 나노입자는 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어서, 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여 전달된 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도함으로써 엔도솜막 분해능을 나타낼 수 있다. The nanoparticles have proton buffering activity, and thus destabilize or destroy the endosome membrane to induce endosomal escape of the delivered drug, thereby exhibiting endosomal membrane resolution.

본 발명의 일 실시예로서, 상기 화학식 1로 표시되는 FPCL0.5 고분자는 수상에서 자기조립되어 FPCL0.5 나노입자를 제조할 수 있고, FPCL0.5 나노입자의 제조방법은 하기 예와 같으며, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, which was FPCL 0.5 polymer of the formula (1) can be produced self-assembled FPCL 0.5 nanoparticles in water, a method of FPCL 0.5 nanoparticles are listed in the following examples, limited to It is not.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 화학식 1로 표시되는 FPCL0.5 고분자를 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; 이하 ‘DMSO’)에 녹여 30분 동안 교반한 후, 정제수를 첨가하고 30분 동안 더 교반하였다. FPCL0.5 나노입자가 포함된 분산액을 투석막에 넣어 수상에서 투석을 통해 DMSO를 제거한다. 투석막 안에 남은 분산액을 종이필터로 여과한 후, 최종적으로 FPCL0.5 나노입자를 얻었다. According to an embodiment of the present invention, FPCL 0.5 polymer represented by Formula 1 was dissolved in dimethyl sulfoxide (hereinafter'DMSO') and stirred for 30 minutes, then purified water was added and stirred for 30 minutes. The dispersion containing FPCL 0.5 nanoparticles is put into a dialysis membrane to remove DMSO from the aqueous phase through dialysis. After the dispersion liquid remaining in the dialysis membrane was filtered through a paper filter, FPCL 0.5 nanoparticles were finally obtained.

본 발명에서는, 분자량이 530 Da인 PCL을 이용을 하였고, 이의 고분자를 FPCL0.5 으로 명명하였으며, 상기 방법을 통해 만들어진 나노입자를 FPCL0.5 나노입자(Nanoparticles; NPs)로 명명하였다.In the present invention, PCL having a molecular weight of 530 Da was used, and its polymer was named FPCL 0.5 , and the nanoparticles made through the method were named FPCL 0.5 nanoparticles (Nanoparticles; NPs).

또한, 본 발명은 FPCL 나노입자를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 구강암, 식도암, 방광암, 대장암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 암은 간암 또는 자궁경부암이다.In addition, the present invention provides an anti-cancer composition comprising FPCL nanoparticles as an active ingredient. Preferably, the cancer is any one selected from the group consisting of thyroid cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, liver cancer, breast cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, oral cancer, esophageal cancer, bladder cancer, colon cancer, and cervical cancer. I can. More preferably, the cancer is liver cancer or cervical cancer.

또한 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 나노약물전달용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a nano-drug delivery composition comprising the nanoparticles as an active ingredient.

상기 약물은 항암제일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. The drug may be an anticancer agent, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신, 파크리탁셀, 에피루비신, 젬시타빈, 실로리무스, 에토포사이드, 빈블라스틴, 빈카알칼로이드, 도세탁셀, 시스플라틴, 글리벡, 시클로포스파미드, 테니포사이드, 5-플로오로우라실, 캠토세신, 타목시펜, 아나스테로졸, 플록슈리딘, 류프로리드, 플로타미드, 졸레드로네이트, 빈크리스틴, 스트렙토조토신, 카보플라틴, 이포스파마이드, 토포테칸, 벨로테칸, 이리노테칸, 비노렐빈, 히도록시우레아, 발루비신, 메소트렉세이트, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 프레드니손, 테스토스테론, 미토산트론, 비노렐빈 및 프레드니솔론으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 항암제는 독소루비신일 수 있다.Preferably, the anticancer agent is doxorubicin, paclitaxel, epirubicin, gemcitabine, silolimus, etoposide, vinblastine, vinca alkaloid, docetaxel, cisplatin, gleevec, cyclophosphamide, teniposide, 5-flo Auroracil, camptocecin, tamoxifen, anasterosol, phloxridin, leuprolide, floatamide, zoledronate, vincristine, streptozotocin, carboplatin, ifosfamide, topotecan, belotecan , Irinotecan, vinorelbine, hyrogoxiurea, valubicin, mesotrexate, mechloretamine, chlorambucil, busulfan, doxyfluridine, prednisone, testosterone, mitosantrone, vinorelbine and prednisolone It can be any one selected. More preferably, the anticancer agent may be doxorubicin.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 화학식 1로 표시되는 FPCL0.5 고분자가 자기조립된 FPCL0.5 나노입자는 수불용성 화학약물을 담지할 수 있어 약물전달체로 응용 가능하다. 또한, FPCL0.5 나노입자는 과발현된 엽산 수용체 표적능과 동시에 엔도솜막 분해능을 가져 표적 세포의 세포질 내로 약물을 전달하는 약물전달체로 응용 가능하다.According to an embodiment of the present invention, the FPCL 0.5 nanoparticles self-assembled with the FPCL 0.5 polymer represented by Formula 1 can carry a water-insoluble chemical drug and thus can be applied as a drug delivery system. In addition, FPCL 0.5 nanoparticles have the ability to target overexpressed folic acid receptors and at the same time have the ability to decompose the endosomes, and thus can be applied as a drug delivery system that delivers drugs into the cytoplasm of target cells.

본 발명에 따른 항암용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 약물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. The anticancer composition or drug delivery composition according to the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of a drug alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents.

상기에서 약학적으로 유효한 양이란 약물이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.In the above, the pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient for the drug to be administered to an animal or human to exhibit a desired physiological or pharmacological activity. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed according to the age, weight, health status, sex, administration route, and treatment period of the subject to be administered.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition, "pharmaceutically acceptable" as used herein refers to a physiologically acceptable and when administered to a human, usually does not cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness or similar reactions. Examples of the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oils. In addition, fillers, anti-aggregating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifying agents and preservatives may additionally be included.

본 발명에 따른 항암용 조성물 또는 약물 전달용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 약물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 고분자 조성물은 약물이 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.The anticancer composition or the drug delivery composition according to the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, and the dosage of the drug is the route of administration, the patient's age, sex, weight, and patient It can be appropriately selected according to several factors such as the severity of the. In addition, the polymer composition for drug delivery of the present invention can be administered in parallel with a known compound capable of enhancing the desired effect of the drug.

본 발명에서 사용되는 상기 "약물"은 동물 또는 사람의 체내에서 생리적인 기능을 촉진 또는 억제하여 목적하는 생물학적 또는 약리학적 효과를 유도할 수 있는 물질로서, 동물 또는 사람에게 투여하기 적합한 화학적 또는 생물학적 물질 또는 화합물을 의미하며, (1) 감염 예방과 같은 원하지 않은 생물학적 효과를 예방하여 유기물에 대한 예방효과를 가지고, (2) 질병으로 생기는 컨디션을 경감시키며, 예를 들어 질병의 결과로 생기는 고통 또는 감염을 완화시키며, (3) 유기물로부터 질병을 완화, 감소 또는 완전히 제거할 수 있는 역할을 할 수 있다. The "drug" used in the present invention is a substance capable of inducing a desired biological or pharmacological effect by promoting or inhibiting a physiological function in the body of an animal or human, and a chemical or biological substance suitable for administration to an animal or human Or it means a compound, (1) has a preventive effect on organic matter by preventing unwanted biological effects such as infection prevention, (2) alleviates the condition caused by a disease, for example, pain or infection resulting from a disease It can alleviate, (3) alleviate, reduce or completely eliminate diseases from organic matter.

이하, 하기 실시예 및 실험예를 통해 본 발명인 생분해성 폴리(입실론-카프로락톤)의 양 말단에 엽산 수용체 표적능과 엔도솜막 분해능을 갖는 고분자 및 상기 고분자를 이용한 약물 전달용 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예 및 실험예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, a polymer having folate receptor targeting ability and endosomal membrane resolution at both ends of the biodegradable poly(epsilon-caprolactone) of the present invention and a composition for drug delivery using the polymer will be described in more detail through the following examples and experimental examples. do. However, the present invention is not limited by these Examples and Experimental Examples.

<실시예 1> FPCL 고분자의 합성 및 분석<Example 1> Synthesis and analysis of FPCL polymer

도 1에서 나타낸 바와 같이, FPCL 고분자는 폴리(입실론-카프로락톤)(PCL)의 양 말단에 있는 수산화기(OH)와 엽산 수용체 표적기와 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)을 화학적으로 결합시켜 얻었다. 구체적으로, 분자량 530 달톤(Dalton)인 폴리카플로락톤디올(PCL-diol) 1 mmol과 2 mmol의 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)을 10 ㎖의 디메틸설폭사이드 (dimethyl sulfoxide; 이하 ‘DMSO’)에 녹여 용액을 준비하였다(이하 ‘A 용액’). As shown in FIG. 1, the FPCL polymer contains a hydroxyl group (OH) at both ends of a poly(epsilon-caprolactone) (PCL) and folic acid (folic acid; hereinafter'F') having a folic acid receptor target group and endosome membrane resolution. Obtained by chemical bonding. Specifically, 1 mmol of polycaflolactonediol (PCL-diol) having a molecular weight of 530 Dalton and 2 mmol of folic acid (hereinafter referred to as'F') were added to 10 mL of dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as'DMSO'). ') to prepare a solution (hereinafter'A solution').

다음으로, 4 mmol의 디사이클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide; 이하 ‘DCC’)와 4 mmol의 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; 이하 ‘DMAP’)을 7 ㎖의 DMSO에 녹여 용액을 준비하였다(이하 ‘B 용액’).Next, 4 mmol of dicyclohexylcarbodiimide (hereinafter'DCC') and 4 mmol of 4-dimethylaminopyridine (hereinafter'DMAP') were dissolved in 7 ml of DMSO to prepare a solution. (Hereinafter'B solution').

상기 B 용액을 A 용액에 점적한 후, 0.1 ㎖의 트리에틸아민(triethylamine; 이하 ‘TEA’)을 첨가하고, 질소 충전 하에서 2일 동안 상온에서 교반 반응시켰다.After dropping the solution B onto the solution A, 0.1 ml of triethylamine (hereinafter “TEA”) was added, followed by stirring at room temperature for 2 days under nitrogen filling.

반응 종료 후, 여과지를 이용해 생성된 부산물인 디사이클로헥실우레아(dicyclohexylurea; 이하 ‘DCU’)를 제거하고, 용매인 DMSO를 n-헥산(n-hexane)에 침전시킨 후, 침전물을 진공 건조하여 고분자량의 FPCL 고분자를 얻었다(하기 화학식 1 참조).After the reaction was completed, dicyclohexylurea (hereinafter referred to as'DCU'), a by-product generated using a filter paper, was removed, and DMSO, a solvent, was precipitated in n-hexane, and the precipitate was vacuum dried to A molecular weight FPCL polymer was obtained (see Formula 1 below).

[화학식 1][Formula 1]

Figure 112019108345511-pat00003
Figure 112019108345511-pat00003

아울러, 도 2와 같이 1H-NMR을 이용하여 PCL0.5 디올, 엽산(Folic acid; 이하 ‘F’) 및 FPCL0.5 고분자들의 화학구조를 확인하였고, FPCL0.5 고분자에 공유결합된 엽산(Folic acid)의 수는 2개임을 확인하였다.In addition, chemical structures of PCL 0.5 diol, folic acid (hereinafter'F') and FPCL 0.5 polymers were confirmed using 1 H-NMR as shown in FIG. 2, and folic acid covalently bonded to the FPCL 0.5 polymer It was confirmed that the number of is 2.

<실시예 2> FPCL<Example 2> FPCL 0.50.5 나노입자 제조, 물리화학적 특성 및 세포독성 Preparation of nanoparticles, physicochemical properties and cytotoxicity

FPCL0.5 나노입자를 제조하기 위해 FPCL0.5 고분자를 DMSO 용액에 녹인 후, 고분자 용액을 교반하면서 정제수를 첨가하였다. FPCL0.5 고분자는 물과 만나 자기조립되어 FPCL0.5 나노입자를 형성하였다. FPCL0.5 나노입자가 포함된 분산액을 투석막에 넣어 수상에서 투석을 통해 DMSO를 제거하였다. 투석막 안에 남은 분산액을 여과지로 필터한 후, 최종적으로 FPCL0.5 나노입자를 얻었다.To prepare FPCL 0.5 nanoparticles, FPCL 0.5 polymer was dissolved in DMSO solution, and then purified water was added while stirring the polymer solution. The FPCL 0.5 polymer met with water and self-assembled to form FPCL 0.5 nanoparticles. DMSO was removed from the aqueous phase through dialysis by putting a dispersion containing 0.5 FPCL nanoparticles in a dialysis membrane. After the dispersion liquid remaining in the dialysis membrane was filtered with a filter paper, FPCL 0.5 nanoparticles were finally obtained.

이렇게 얻은 FPCL0.5 나노입자의 평균 입자크기는 65 ± 6 nm이었으며, 엽산의 음전하로 인하여 평균 제타전위는 -(38 ± 1) mV이었다(도 3 참조).The average particle size of the FPCL 0.5 nanoparticles thus obtained was 65 ± 6 nm, and the average zeta potential was -(38 ± 1) mV due to the negative charge of folic acid (see FIG. 3).

다음으로, 엽산 수용체가 거의 발현이 되지 않는 5,000개의 간암세포(이하 ‘HepG2 세포’)와 엽산 수용체가 과발현된 자궁경부암세포(이하 ‘HeLa 세포’)를 96-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, FPCL0.5 나노입자에 48시간 동안 노출시켜 FPCL0.5 나노입자의 다양한 농도에서 암세포의 세포독성을 MTT 방법을 이용하여 평가했다.Next, 5,000 hepatic cancer cells with little expression of folic acid receptors (hereinafter referred to as'HepG2 cells') and cervical cancer cells with overexpressing folate receptors (hereinafter referred to as'HeLa cells') were spread on a 96-well plate and cultured for 24 hours. after that, by exposure for 48 hours in 0.5 FPCL nanoparticles it was evaluated using the MTT assay of cytotoxicity of tumor cells in the various concentrations of the FPCL 0.5 nanoparticles.

도 5와 같이, FPCL0.5 나노입자는 간암세포(HepG2)와 자궁경부암세포(HeLa)에서 50% 생존능을 보이는 농도인 IC50가 500 ㎍/㎖ 이하에서는 관찰되지 않았기 때문에, 약물이 봉입되지 않은 FPCL 나노입자는 낮은 독성을 보임을 확인할 수 있다.As shown in Figure 5, FPCL 0.5 nanoparticles because the IC 50, which is a concentration showing 50% viability in hepatocellular carcinoma cells (HepG2) and cervical cancer cells (HeLa), was not observed at 500 μg/ml or less, FPCL without drug encapsulation. It can be seen that the nanoparticles show low toxicity.

<실시예 3> 항암제 독소루비신이 봉입된 DOX@FPCL<Example 3> DOX@FPCL containing anticancer drug doxorubicin 0.50.5 나노입자의 제조 및 이의 물리화학적 특성 Preparation of nanoparticles and their physicochemical properties

소수성 약물인 독소루비신(doxorubicin free base; 이하 ‘DOX’)을 FPCL0.5 나노입자에 봉입시키기 위해 0.5 ㎎에 해당하는 DOX 용액을 2 ㎎의 FPCL0.5 고분자가 녹여진 0.1 ㎖의 DMSO 용액과 섞고, 이 약물-고분자 용액을 교반하면서 4 ㎖의 정제수를 약물-고분자 용액에 점적하고 30분 동안 더 교반하였다. 수상에서 투석을 통해 DMSO와 나노입자에 봉입되지 않은 DOX를 제거하였고, 여전히 남은 미봉입 DOX는 종이 여과지를 이용하여 제거하였다. To encapsulate the hydrophobic drug doxorubicin free base (hereinafter referred to as'DOX') in FPCL 0.5 nanoparticles, 0.5 mg of DOX solution was mixed with 2 mg of FPCL 0.5 polymer dissolved in 0.1 ml DMSO solution. -While stirring the polymer solution, 4 ml of purified water was added dropwise to the drug-polymer solution, followed by stirring for 30 minutes. DMSO and DOX not encapsulated in the nanoparticles were removed from the aqueous phase through dialysis, and the remaining unenclosed DOX was removed using paper filter paper.

상기와 같은 방법으로 합성된 나노입자를 DOX@FPCL0.5 나노입자로 명명하였다.The nanoparticles synthesized by the above method were designated as DOX@FPCL 0.5 nanoparticles.

제조된 DOX@FPCL0.5 나노입자의 평균 입자크기는 165 ± 22 nm이었고, 평균 제타전위는 -(22 ± 3) mV이었다.The average particle size of the prepared DOX@FPCL 0.5 nanoparticles was 165 ± 22 nm, and the average zeta potential was -(22 ± 3) mV.

약물의 목표 무게함량을 20 중량%로 해서 DOX를 FPCL0.5 나노입자 내부에 봉입했을 때, DOX@FPCL0.5 나노입자의 실제 약물의 평균 무게함량은 14.1 ± 1.1 중량%이었고, 약물의 평균 봉입효율은 65.7 ± 6.0 %이었다.To a target weight amount of the drug to 20% by weight, when filled with a DOX inside FPCL 0.5 nanoparticles, DOX @ average weight of the content of the actual drug in the FPCL 0.5 nanoparticles was 14.1 ± 1.1% by weight, average drug loading efficiency of a drug is 65.7 ± 6.0%.

<실시예 4> 항암제 독소루비신이 봉입된 DOX@FPCL<Example 4> DOX@FPCL containing anticancer drug doxorubicin 0.50.5 나노입자의 항암효과 확인 Confirmation of anticancer effect of nanoparticles

실시예 3으로부터 준비된 DOX@FPCL0.5 나노입자의 항암효과를 평가하기 위해 엽산 수용체가 거의 없는 5,000개의 HepG2세포와 엽산 수용체가 과발현된 5,000개의 HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, 암세포에 다양한 약물농도를 갖는 DOX@FPCL0.5 나노입자를 48시간 동안 처리하여 MTT 방법으로 약물의 효과를 평가했다.In order to evaluate the anticancer effect of the DOX@FPCL 0.5 nanoparticles prepared in Example 3, 5,000 HepG2 cells with little folate receptor and 5,000 HeLa cells overexpressing the folate receptor were spread on a 96-well plate and cultured for 24 hours. , DOX@FPCL 0.5 nanoparticles having various drug concentrations in cancer cells were treated for 48 hours to evaluate the effect of the drug by the MTT method.

도 6과 같이, 간암세포(HepG2)에 대한 DOX의 IC50는 약 2.07 ㎍/㎖이었고, DOX@FPCL0.5 나노입자의 IC50는 2.16 ㎍/㎖이었다. 이 결과는 DOX의 항암효과와 DOX@FPCL0.5 나노입자의 항암효과가 거의 같다는 것을 의미한다. 또한 엽산 1 mM 과 경쟁반응에 대한 DOX의 IC50는 약 2.05 ㎍/㎖이었고, DOX@FPCL0.5 나노입자의 IC50는 2.11 ㎍/㎖이었다. 간암세포(HepG2)는 엽산 수용체가 거의 존재하지 않아서 엽산의 유, 무와 상관없이 DOX와 DOX@FPCL0.5 나노입자가 유사한 항암효과를 보였다. As shown in FIG. 6, the IC 50 of DOX for liver cancer cells (HepG2) was about 2.07 μg/ml, and the IC 50 of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles was 2.16 μg/ml. This result means that the anticancer effect of DOX and the anticancer effect of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles are almost the same. In addition, the IC 50 of DOX for the competition reaction with 1 mM folic acid was about 2.05 µg/ml, and the IC 50 of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles was 2.11 µg/ml. Hepatic cancer cells (HepG2) rarely had folate receptors, so DOX and DOX@FPCL 0.5 nanoparticles showed similar anticancer effects regardless of the presence or absence of folic acid.

반면에, 자궁경부암세포(HeLa)에서는 DOX의 IC50는 약 3.82 ㎍/㎖이었고, DOX@FPCL0.5 나노입자의 IC50는 0.57 ㎍/㎖이었다. 이 결과는 DOX의 항암효과보다 DOX@FPCL0.5 나노입자의 항암효과가 6.7배 좋다는 것을 의미한다. 자궁경부암세포(HeLa)는 표면에 엽산 수용체가 과발현된 상태이기 때문에 엽산을 가지고 있는 나노입자가 엽산 수용체와 수용체-리간드 결합을 통해 더 좋은 약물 효과를 갖는다. 또한 엽산 1 mM과 경쟁반응에 대한 DOX의 IC50는 약 3.87 ㎍/㎖이었고, DOX@FPCL0.5 나노입자의 IC50는 5.92 ㎍/㎖이었다. 이 결과는 DOX는 확산현상과 분배현상을 이용해 세포막을 통해 세포 내로 유입이 되기 때문에 엽산 수용체에 영향을 받지 않아 유사한 항암효과가 나타나고, 반면에 DOX@FPCL0.5 나노입자는 엽산과의 경쟁반응으로 인해 엽산 수용체를 거의 이용하지 못하기 때문에 항암효과가 낮아졌다. 이것을 통해, DOX@FPCL0.5 나노입자는 엽산 수용체를 이용하여 세포 내로 유입이 되는 것을 알 수 있다.On the other hand, in cervical cancer cells (HeLa), the IC 50 of DOX was about 3.82 μg/ml, and the IC 50 of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles was 0.57 μg/ml. This result means that the anticancer effect of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles is 6.7 times better than that of DOX. Because the folate receptor is overexpressed on the surface of cervical cancer cells (HeLa), nanoparticles containing folic acid have a better drug effect through the combination of the folate receptor and the receptor-ligand. In addition, the IC 50 of DOX against the competition reaction with 1 mM folic acid was about 3.87 μg/ml, and the IC 50 of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles was 5.92 μg/ml. This result shows that DOX is not affected by folate receptors because DOX enters the cell through the cell membrane using diffusion and distribution phenomena, and thus a similar anticancer effect appears.On the other hand, DOX@FPCL 0.5 nanoparticles have a competitive reaction with folic acid. Because folic acid receptors are hardly available, the anticancer effect is lowered. Through this, it can be seen that the DOX@FPCL 0.5 nanoparticles are introduced into the cell using the folate receptor.

<실시예 5> 항암제 독소루비신이 봉입된 DOX@FPCL<Example 5> DOX@FPCL containing anticancer drug doxorubicin 0.50.5 나노입자의 세포 및 세포소기관별 내 약물 유입량 및 약물 분포 확인 Confirmation of drug inflow and drug distribution by nanoparticles by cells and organelles

일반적으로 고분자 약물전달체가 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포로 들어가는 경우, 엔도솜으로부터의 탈출이 약물 효과를 결정하는 여러 중요한 요인 중 하나이다. 고분자 약물전달체가 엔도사이토시스(endocytosis)를 이용해 세포로 유입되는지 평가하기 위해 엔도솜 막을 파괴하는 시약인 클로로퀸(chloroquine; 50 μM) 또는 엔도솜의 성숙화 과정을 억제하는 시약인 바필로마이신 A1(Bafilomycin A1; 100 nM)을 배지에 같이 넣어준 뒤에 실시예 3으로부터 준비된 DOX@FPCL0.5 나노입자의 세포 내 약물 유입량(Cellular uptake; 이하 ‘CU’), 핵 내 약물 유입량 (Nuclear uptake; 이하 ‘NU’) 및 미토콘드리아 내 약물 유입량(Mitochondrial uptake; 이하 ‘MU’) 평가하기 위해 자궁경부암세포(HeLa)(5×105 cells in 2 ㎖)를 6-웰 플레이트에 깔아 24시간 동안 배양한 후, DOX와 DOX@FPCL0.5 나노입자([DOX]= 3 ㎍/㎖)를 4시간 동안 처리하고 그들의 세포 및 세포소기관 별 약물 유입량을 분석하였다.In general, when a polymeric drug delivery system enters a cell through endocytosis, escape from an endosome is one of several important factors determining the drug effect. To evaluate whether a polymeric drug delivery system enters cells using endocytosis, chloroquine (50 μM), a reagent that destroys the endosome membrane, or Bafilomycin A1, a reagent that inhibits the maturation process of the endosome. A1; 100 nM) was added to the medium, and then the intracellular drug influx of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles prepared in Example 3 (Cellular uptake; hereinafter'CU'), the intranuclear drug inflow amount (Nuclear uptake; hereinafter'NU') ) And mitochondrial uptake (hereinafter referred to as'MU'), cervical cancer cells (HeLa) (5×10 5 cells in 2 ml) were spread on a 6-well plate and incubated for 24 hours, followed by DOX and DOX@FPCL 0.5 nanoparticles ([DOX]= 3 μg/ml) were treated for 4 hours, and the amount of drug inflow by cells and organelles was analyzed.

DOX와 DOX@FPCL0.5 나노입자의 세포 내 유입량(CU)을 평가하기 위해 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)로 분리했다. 핵 내 유입량(NU)과 미토콘드리아 내 유입량(MU)은 Nuclei PURE Prep kit와 Mitochondrial Fractionation kit의 프로토콜로 각각 분리하여 FACSCantoTM Ⅱ flow cytometer(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, Nj, USA), primary argon laser를 이용하여 세포 내에 유입된 약물의 형광을 측정하여 분석하였다.To evaluate the intracellular influx (CU) of DOX and DOX@FPCL 0.5 nanoparticles, cells were washed twice with DPBS and separated with trypsin-EDTA (trypsin-EDTA). Nucleus inflow (NU) and mitochondrial inflow (MU) were separated by protocols of Nuclei PURE Prep kit and Mitochondrial Fractionation kit, respectively, and FACSCanto TM Ⅱ flow cytometer (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, Nj, USA), primary argon laser. The fluorescence of the drug introduced into the cells was measured and analyzed.

도 7과 같이, 엽산 수용체가 과발현된 자궁경부암세포(HeLa)에서 세포 내 약물 유입량(CU)을 확인하면 DOX보다 DOX@FPCL0.5 나노입자가 2배 더 유입이 되었다. 또한 클로로퀸과 바필로마이신 A1의 존재 유무와 상관없이 DOX와 DOX@FPCL0.5 나노입자의 세포 내 유입량은 영향을 미치지 않았다. As shown in FIG. 7, when checking the intracellular drug influx (CU) in cervical cancer cells (HeLa) in which folic acid receptors were overexpressed, DOX@FPCL 0.5 nanoparticles were introduced twice as much as DOX. In addition, the influx of DOX and DOX@FPCL 0.5 nanoparticles into cells did not affect the presence or absence of chloroquine and bapilomycin A1.

도 8에는, DOX의 핵 내 약물 유입량(NU)을 1로 놓았을 때, DOX@FPCL0.5 나노입자 단독일 때는 2배, DOX@FPCL0.5 나노입자와 바필로마이신 A1과 함께일 때는 0.8배, DOX@FPCL0.5 나노입자와 클로로퀸과 함께일 때는 2.1배 핵 내로 유입이 되었다. In FIG. 8, when the influx of drug in the nucleus of DOX (NU) is set to 1, when DOX@FPCL 0.5 nanoparticles are alone, 2 times, DOX@FPCL 0.5 nanoparticles and baphylomycin A1 are 0.8 times. When combined with DOX@FPCL 0.5 nanoparticles and chloroquine, it was introduced into the nucleus 2.1 times.

도 9에서는 DOX의 미토콘드리아 내 약물 유입량(MU)을 1로 놓았을 때, DOX@FPCL0.5 나노입자 단독일 때는 3.3배, DOX@FPCL0.5 나노입자와 바필로마이신(Bafilomycin) A1과 함께일 때는 1.2배, DOX@FPCL0.5 나노입자와 클로로퀸(chloroquine)과 함께일 때는 3.4배 핵 내로 유입이 되었다. In Figure 9, when the drug inflow amount (MU) in the mitochondria of DOX is set to 1, when DOX@FPCL 0.5 nanoparticles are alone, 3.3 times, and when DOX@FPCL 0.5 nanoparticles and Bafilomycin A1 are together, 1.2 Pear, DOX@FPCL 0.5 nanoparticles and chloroquine were introduced into the nucleus 3.4 times when combined.

도 8과 도 9의 결과는 클로로퀸과 바필로마이신 A1을 둘 다 넣지 않은 약물전달체와 비교하여, 클로로퀸을 넣으면 약물전달체가 빨리 엔도솜으로부터 탈출되고, 바필로마이신 A1을 넣으면 엔도솜으로 탈출이 어렵기 때문에 약물전달체가 엔도사이토시스(endocytosis)를 경유하는 것을 알 수 있는데, DOX@FPCL0.5 나노입자 단독일 때보다 DOX@FPCL0.5 나노입자와 바필로마이신 A1과 함께일 때 유입량이 낮아지는 것으로 보아 DOX@FPCL0.5 나노입자는 엔도사이토시스(endocytosis)를 경유하는 것을 알 수 있다. 또한, DOX@FPCL0.5 나노입자 단독인 경우와 DOX@FPCL0.5 나노입자와 클로로퀸과 함께일 때 유사하게 유입되는 것으로 보아, DOX@FPCL0.5 나노입자는 엔도솜을 탈출할 수 있는 충분한 능력을 지니고 있다는 것을 알 수 있다. 즉 DOX@FPCL0.5 나노입자는 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포 내로 들어가고, 수소이온 완충에 의해 엔도솜 막을 파괴하여 엔도솜을 탈출할 수 있음을 보여준다. 그리고 DOX는 확산현상과 분배현상을 이용해 세포막을 통해 세포 내로 유입이 되기 때문에 클로로퀸과 바필로마이신 A1에 영향을 받지 않았음을 알 수 있다. The results of FIGS. 8 and 9 show that when chloroquine is added, the drug delivery system quickly escapes from the endosome, compared to the drug delivery system in which both chloroquine and bapilomycin A1 are not added, and it is difficult to escape to the endosome when bapilomycin A1 is added. group, because there is a drug delivery system can be seen that via an endocytosis (endocytosis), DOX @ FPCL 0.5 nanoparticles than when solely one DOX @ FPCL 0.5 nanoparticles and bar pillow viewed as azithromycin which inflow is lowered when working with A1 It can be seen that the DOX@FPCL 0.5 nanoparticles pass through endocytosis. In addition, as DOX@FPCL 0.5 nanoparticles alone and DOX@FPCL 0.5 nanoparticles and chloroquine are similarly introduced, DOX@FPCL 0.5 nanoparticles have sufficient ability to escape endosomes. Can be seen. In other words, it shows that DOX@FPCL 0.5 nanoparticles enter the cell through endocytosis, destroy the endosome membrane by hydrogen ion buffering, and escape the endosome. In addition, it can be seen that DOX is not affected by chloroquine and bapilomycin A1 because it enters the cell through the cell membrane through the diffusion and distribution phenomena.

아울러, 약물전달체의 이용에 따른 전달된 DOX의 세포소기관 분포를 확인하기 위해 자궁경부암세포(HeLa)를 콘포칼디쉬(confocal dish)에 깔고 24시간 동안 배양한 후 DOX 또는 DOX@FPCL0.5 나노입자를 처리하고 4시간 동안 더 배양하였다. 실험 종료 전, Hoechst 33342(5 ㎍/㎖)를 10분 동안 처리하여 핵을 염색을 하고, MitoTracker Deep Red FM(200 nM)를 15분 동안 처리하여 미토콘드리아를 염색했다. DPBS로 두 번 세척하고 세포내 분포와 독소루비신의 형광을 공초점 현미경의 excitation laser(405 nm for diode, 543 nm for HeNe, 633 nm for HeNe)와 bandpass emission filters(LSM710; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용해 관찰하였다. In addition, in order to check the distribution of organelles of the delivered DOX according to the use of the drug delivery system, cervical cancer cells (HeLa) were spread on a confocal dish and cultured for 24 hours, and then DOX or DOX@FPCL 0.5 nanoparticles were added. Treatment and incubation for an additional 4 hours. Before the end of the experiment, Hoechst 33342 (5 μg/ml) was treated for 10 minutes to stain the nuclei, and MitoTracker Deep Red FM (200 nM) was treated for 15 minutes to stain mitochondria. After washing twice with DPBS, the intracellular distribution and fluorescence of doxorubicin were measured with excitation laser (405 nm for diode, 543 nm for HeNe, 633 nm for HeNe) and bandpass emission filters (LSM710; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) of a confocal microscope. It was observed using.

도 10은 자궁경부암세포(HeLa)의 핵, 미토콘드리아 내로 유입된 DOX@FPCL0.5 나노입자의 형광 이미지이다. 이 결과를 통해 DOX보다 DOX@FPCL0.5 나노입자가 더 많이 세포 내에 유입이 되는 것을 알 수 있고, 또한 DOX뿐만 아니라 DOX@FPCL0.5 나노입자에 의한 전달되는 DOX도 핵 보다는 미토콘드리아에 주로 분포된다는 것을 보여준다. 10 is a fluorescence image of DOX@FPCL 0.5 nanoparticles introduced into the nucleus and mitochondria of cervical cancer cells (HeLa). This result shows that more DOX@FPCL 0.5 nanoparticles are introduced into the cell than DOX, and also DOX delivered by DOX@FPCL 0.5 nanoparticles as well as DOX is mainly distributed in the mitochondria rather than the nucleus. .

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.As described above, although the present invention has been described by the limited embodiments and drawings, the present invention is not limited thereto, and the technical spirit of the present invention and the following by those of ordinary skill in the technical field to which the present invention pertains. It goes without saying that various modifications and variations are possible within the equal range of the claims to be described.

Claims (10)

폴리(입실론-카프로락톤)[poly(ε-caprolactone; PCL)]의 양 말단에 엽산(folic acid; 이하 ‘F’)이 공유결합된, 화학식 1로 표시되는 양 말단에 엽산 수용체 표적능 및 엔도솜막 분해능을 갖는 엽산-폴리(입실론-카프로락톤)-엽산(FPCL) 고분자;
[화학식 1]
Figure 112019108345511-pat00004

상기 화학식 1에서, x는 3 내지 20의 정수이다.
Folic acid receptor targeting ability and endo for both ends represented by Formula 1 in which folic acid (hereinafter'F') is covalently bonded to both ends of poly(epsilon-caprolactone)[poly(ε-caprolactone; PCL)] Folic acid-poly(epsilon-caprolactone)-folic acid (FPCL) polymer having cotton membrane resolution;
[Formula 1]
Figure 112019108345511-pat00004

In Formula 1, x is an integer of 3 to 20.
 제1항에 따른 FPCL 고분자가 수상에서 자기조립된, 나노입자.
The FPCL polymer according to claim 1 is self-assembled in an aqueous phase, nanoparticles.
 제2항에 있어서,
상기 나노입자는 평균 입경이 20 내지 400 nm인 것을 특징으로 하는, 나노입자.
The method of claim 2,
The nanoparticles, characterized in that the average particle diameter of 20 to 400 nm, nanoparticles.
 제2항에 있어서,
상기 나노입자는 엽산 수용체가 과발현된 세포 내 엽산 수용체에 리간드 결합하는 엽산 수용체 표적능을 가지는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
The method of claim 2,
The nanoparticles, characterized in that the folic acid receptor has a folate receptor targeting ability to bind a ligand to the folic acid receptor in cells overexpressed, nanoparticles.
 제2항에 있어서,
상기 나노입자는 수소이온 완충화(proton buffering) 활성을 가지고 있어 엔도솜 막을 불안정화 또는 파괴하여 전달된 약물의 엔도솜 탈출(Endosomal escape)을 유도함으로써 엔도솜막 분해능을 나타내는 것을 특징으로 하는, 나노입자.
The method of claim 2,
The nanoparticles have proton buffering activity, and thus destabilize or destroy the endosome membrane to induce endosomal escape of the delivered drug, thereby exhibiting endosomal membrane resolution.
 제2항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 항암용 조성물.
An anticancer composition comprising the nanoparticles according to claim 2 as an active ingredient.
 제6항에 있어서,
상기 암은 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 구강암, 식도암, 방광암, 대장암, 및 자궁경부암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항암용 조성물.
The method of claim 6,
The cancer is any one selected from the group consisting of thyroid cancer, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, liver cancer, breast cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, oral cancer, esophageal cancer, bladder cancer, colon cancer, and cervical cancer. , Anticancer composition.
 제2항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 나노약물전달용 조성물.
A composition for nano-drug delivery comprising the nanoparticles according to claim 2 as an active ingredient.
 제8항에 있어서,
상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는, 나노약물전달용 조성물.
The method of claim 8,
The drug is an anticancer agent, characterized in that, nano-drug delivery composition.
 제9항에 있어서,
상기 항암제는 독소루비신, 파크리탁셀, 에피루비신, 젬시타빈, 실로리무스, 에토포사이드, 빈블라스틴, 빈카알칼로이드, 도세탁셀, 시스플라틴, 글리벡, 시클로포스파미드, 테니포사이드, 5-플로오로우라실, 캠토세신, 타목시펜, 아나스테로졸, 플록슈리딘, 류프로리드, 플로타미드, 졸레드로네이트, 빈크리스틴, 스트렙토조토신, 카보플라틴, 이포스파마이드, 토포테칸, 벨로테칸, 이리노테칸, 비노렐빈, 히도록시우레아, 발루비신, 메소트렉세이트, 메클로레타민, 클로람부실, 부술판, 독시플루리딘, 프레드니손, 테스토스테론, 미토산트론, 비노렐빈 및 프레드니솔론으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 나노약물전달용 조성물.
The method of claim 9,
The anticancer agents doxorubicin, paclitaxel, epirubicin, gemcitabine, silolimus, etoposide, vinblastine, vinca alkaloid, docetaxel, cisplatin, gleevec, cyclophosphamide, teniposide, 5-fluorouracil, campto Cesine, Tamoxifen, Anasterosol, Phloxridine, Leuprolide, Flotamide, Zoledronate, Vincristine, Streptozotocin, Carboplatin, Ifosfamide, Topotecan, Belotecan, Irinotecan, Vino Any one selected from the group consisting of relvin, hygrosiurea, valubicin, mesotrexate, mechloretamine, chlorambucil, busulfan, doxyfluridine, prednisone, testosterone, mitosantrone, vinorelbine and prednisolone Characterized in that, nano drug delivery composition.
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