KR102172290B1 - Compositions for treating joint or connective tissue disease comprising dextran or poloxamer - Google Patents

Abstract

본 발명은 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물을 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물 또는 상기 조성물에 줄기세포를 더 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 완충 효과, 코팅 효과 또는 항염 효과에 의하여 관절 또는 결체조직의 손상부에 오래 머무르며 충격을 완화하고 손상부 특이적으로 손상부를 감싸주거나 유착된 부위의 염증을 줄일 수 있으므로, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a composition for treating joint disease or connective tissue disease comprising dextran, poloxamer or a mixture thereof, or to a composition for treating joint disease or connective tissue disease further comprising stem cells in the composition. The pharmaceutical composition of the present invention can stay for a long time in the damaged area of the joint or connective tissue due to the buffering effect, coating effect, or anti-inflammatory effect, relieve the impact, and specifically wrap the damaged area or reduce inflammation of the adhered area, It can be usefully used in the treatment of joint disease or connective tissue disease.

Description

덱스트란 또는 폴록사머를 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물{Compositions for treating joint or connective tissue disease comprising dextran or poloxamer}Compositions for treating joint or connective tissue disease comprising dextran or poloxamer}

본 발명은 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물을 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물 또는 상기 조성물에 줄기세포를 더 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for treating joint disease or connective tissue disease comprising dextran, poloxamer or a mixture thereof, or to a composition for treating joint disease or connective tissue disease further comprising stem cells in the composition.

관절은 뼈와 뼈가 만나는 부위로서, 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다. 관절염은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증 등을 동반한 기능 이상이 생긴 것으로, 이러한 관절 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 골 관절염, 가용성 대사산물이 관절주변의 결합조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.Joints are areas where bones meet with bones, and are composed of cartilage, joint capsule, synovium, ligaments, tendons, muscles, etc. so that bones and bones can move smoothly, and play a role in absorbing shocks generated by movement. Arthritis is a dysfunction of joints accompanied by inflammation due to various causes, such as chronic rheumatism of joints, which are understood to be caused by autoimmunity, infectious arthritis caused by bacterial infection, joint cartilage or joint cartilage due to various causes. It can be broadly classified into osteoarthritis where bone degeneration or destruction occurs, and crystalline arthritis in which soluble metabolites are deposited as crystals in the connective tissue around the joint.

결체조직(connective tissue)은 결합조직이라고도 하며, 동물에 있어 조직 사이를 결합하여 기관을 형성하는 조직으로, 예를 들면 추간원판, 피부, 힘줄, 인대 등을 들 수 있다.Connective tissue (connective tissue) is also referred to as connective tissue, as a tissue that forms an organ by combining tissues in animals, for example, intervertebral discs, skin, tendons, ligaments, and the like.

관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 등 대사성 산물 농도의 감소라는 주된 작용기전을 근거로 대별할 수 있는데, 많은 관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발적, 경직 등을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다. 그러나 이러한 소염 및 항염제 등은 질환의 치료보다는 통증을 완화하는 것이 주작용이며 약물을 장기간 복용시에는 여러 합병증이 많이 발생한다. 특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 무관하고 강하고 일시적인 항염 작용으로 인하여 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절을 과잉 사용하도록 유도할 소지가 있으며, 이는 관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.Drugs used in the treatment of arthritis can be classified on the basis of the main mechanisms of action of reducing inflammation, delaying disease progression, and decreasing the concentration of metabolic products such as uric acid, and many arthritis treatment drugs act to reduce inflammation. Inflammation is a pathological process that causes pain, swelling, heat sensation, redness, and stiffness. Drugs that rapidly relieve inflammation include nonsteroidal anti-inflammatory drugs including aspirin and steroidal anti-inflammatory drugs including cortisone. However, these anti-inflammatory and anti-inflammatory drugs are mainly to relieve pain rather than cure disease, and many complications occur when taking drugs for a long time. In particular, steroidal anti-inflammatory drugs are irrelevant to the cause of the disease and have a strong, temporary anti-inflammatory action, which can induce excessive use of joints by simply temporarily reducing pain, which is a factor that destroys joints and worsens disability. Therefore, it requires attention to use.

따라서 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성을 갖고, 명백한 유독성 부작용을 수반하며, 장기간 지속적으로 사용할 수 없어 그 유효성이 제한되므로, 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다Therefore, the conventional treatment used for joint damage such as arthritis has limited effectiveness, has obvious toxic side effects, and cannot be used continuously for a long time, so its effectiveness is limited, a new new treatment that overcomes the disadvantages of the existing treatment. There is an urgent need for a cure

한편, 덱스트란은 다당류의 하나로 D-글루코스의 중합체를 지칭하는 것으로, 녹말이나 글리코겐과 유사한 구조를 가지고 있으며, D-글루코스가 α-1,6 결합으로 곧은 사슬 모양으로 이어지고 군데군데에 α-1,4 결합이 분지되어 있다. 이것은 녹말이나 글리코겐이 α-1,4 결합을 하고 있고, 분지점이 α-1,6 결합인 것과 대조적이다. 이 밖에 α-1,2 결합과 α-1,3 결합의 존재도 알려져 있으나, 그 양과 종류는 덱스트란의 기원에 따라 다르다. 고분자량의 덱스트란은 체내에서 알러지 반응을 자주 일으키는 것으로 알려져 있다. 덱스트란은 혈액증량제, 혈액응고방지제(유착방지제), 가교된 덱스트란(cross linked dextran)을 이용한 필러 등으로 사용되어 왔으나, 관절 질환이나 결체조직 질환의 치료제로 사용된 것으로 보고된 바는 없다. 폴록사머는 비이온성 계면 활성제를 지칭하고, 계면 활성제 외에 유화제, 안정화제, 용해보조제 등으로도 사용하는 것으로 알려져 있다.On the other hand, dextran is one of the polysaccharides and refers to a polymer of D-glucose, has a structure similar to starch or glycogen, and D-glucose leads to a straight chain through α-1,6 bonds, and there are α-1 ,4 bonds are branched. This is in contrast to starch or glycogen having α-1,4 bonds and branching point α-1,6 bonds. In addition, the existence of α-1,2 bonds and α-1,3 bonds is also known, but the amount and type differ depending on the origin of dextran. High molecular weight dextran is known to frequently cause allergic reactions in the body. Dextran has been used as a blood extender, an anticoagulant (anti-adhesion agent), a filler using cross-linked dextran, etc., but it has not been reported to be used as a treatment for joint disease or connective tissue disease. Poloxamer refers to a nonionic surfactant, and is known to be used as an emulsifier, stabilizer, solubilizer, etc. in addition to surfactant.

현재 관절 질환 또는 결체조직 질환에 대한 종래 치료법이 갖는 한계점인 한정적인 유효성, 명백한 유독성 부작용, 지속성의 부재에 따라 새로운 치료법 또는 치료제가 필요하며, 특히 체내에 투여할 경우 알러지 반응을 일으키지 않는 덱스트란 또는 폴록사머, 특히 저분자량의 덱스트란 또는 폴록사머를 이용한 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 대한 연구는 알려진 바가 없는 실정이다.New treatments or treatments are needed depending on the limitations of conventional treatments for joint disease or connective tissue disease, which are limited effectiveness, obvious toxic side effects, and lack of persistence.In particular, dextran or dextran that does not cause allergic reactions when administered into the body Studies on the treatment of joint disease or connective tissue disease using poloxamer, particularly low molecular weight dextran or poloxamer, are unknown.

이에 본 발명자들은 관절 또는 결체조직의 치료를 위한 연구를 수행한 결과, 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물이 알러지 반응을 일으키지 않으며 관절 및 결체조직 손상부에 대한 완충 효과, 보존 효과 또는 항염 효과에 의해 관절 및 결체조직을 보호하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors conducted a study for the treatment of joints or connective tissues, as a result of dextran, poloxamer or a mixture thereof, did not cause an allergic reaction, and due to the buffering effect, preservation effect, or anti-inflammatory effect on joint and connective tissue damage The present invention was completed by confirming that there is an effect of protecting joints and connective tissues.

본 발명의 목적은 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating joint disease or connective tissue disease, including dextran, poloxamer, or a mixture thereof.

본 발명의 목적은 줄기세포; 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is stem cells; Dextran (dextran), poloxamer (poloxamer) or a mixture thereof, to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of joint disease or connective tissue disease.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating joint disease or connective tissue disease, including dextran, poloxamer, or a mixture thereof.

또한, 본 발명은 줄기세포; 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention stem cells; Dextran (dextran), poloxamer (poloxamer), or a mixture thereof, to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating joint disease or connective tissue disease.

또한 본 발명은 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating joint disease or connective tissue disease, comprising a mixture of two selected from the group consisting of dextran 1, dextran 5 and poloxamer 188 do.

또한 본 발명은 줄기세포; 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention stem cells; It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating joint disease or connective tissue disease, comprising a mixture of two selected from the group consisting of dextran 1, dextran 5 and poloxamer 188.

본 발명의 약학적 조성물은 완충 효과, 코팅 효과 또는 항염 효과에 의하여 관절 또는 결체조직의 손상부에 오래 머무르며 충격을 완화하고 손상부 특이적으로 손상부를 감싸주거나 유착된 부위의 염증을 줄일 수 있으므로, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can stay for a long time in the damaged area of the joint or connective tissue due to the buffering effect, coating effect, or anti-inflammatory effect, relieve the impact, and specifically wrap the damaged area or reduce inflammation of the adhered area, It can be usefully used in the treatment of joint disease or connective tissue disease.

도 1은 정상 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 24시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 음성 대조군(nc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 2는 정상 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 48시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 음성 대조군(nc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 3은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 24시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 4는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 48시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 5는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 MMP-3 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 6은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 MMP-13 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 7은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 IL-10/IL-6 유전자 발현 비를 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 8은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 2형 콜라겐 생성량을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 9는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 아그리칸 생성량을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).1 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation ability of chondrocytes 24 hours after treatment with dextran, poloxamer or a mixture thereof for normal chondrocytes (*/**/*** are respectively It represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the negative control group (nc)).
Figure 2 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation ability of chondrocytes 48 hours after treatment with dextran, poloxamer or a mixture thereof for normal chondrocytes (*/**/*** are respectively It represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the negative control group (nc)).
3 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation ability of chondrocytes 24 hours after treatment with dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes of an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment ( */**/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the positive control (pc) for inflammation induction, respectively).
Figure 4 is a diagram showing the results of confirming the cell proliferation ability of chondrocytes 48 hours after treatment with dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes of an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment ( */**/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the positive control (pc) for inflammation induction, respectively).
5 is a diagram showing the result of confirming the expression level of MMP-3 gene according to treatment with dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes in an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment (*/**/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001, respectively, compared to the positive control for inflammation (pc)).
6 is a diagram showing the results of confirming the expression level of MMP-13 gene according to treatment of dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes of an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment (*/**/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001, respectively, compared to the positive control for inflammation (pc)).
7 shows the results of confirming the IL-10/IL-6 gene expression ratio according to treatment with dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes of an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment. It is a diagram shown (*/**/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the positive control for inducing inflammation (pc), respectively).
8 is a diagram showing the result of confirming the amount of type 2 collagen produced by treatment with dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes of an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment (*/ **/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the positive control for inflammation induction (pc)).
9 is a diagram showing the result of confirming the amount of agrican produced by treatment with dextran, poloxamer, or a mixture thereof for chondrocytes in an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment (*/ **/*** represents the significance of p<0.05/p<0.01/p<0.001 compared to the positive control for inflammation induction (pc)).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for treating joint disease or connective tissue disease, including dextran, poloxamer, or a mixture thereof.

본 발명에서 “덱스트란(dextran)”은 다당류의 하나인 D-글루코스의 중합체를 의미한다. 덱스트란은 녹말이나 글리코겐과 유사한 구조를 가지고 있으며, D-글루코스가 α-1,6 결합으로 곧은 사슬 모양으로 이어지고 군데군데에 α-1,4 결합이 분지되어 있다. 덱스트란은 혈액 증량제, 혈액 응고 방지제로 사용할 수 있으며, 목적에 따라 덱스트란의 분자량을 달리하여 사용할 수 있다. 본 발명에서, 상기 덱스트란은 500 내지 10,000Da의 분자량을 가질 수 있으며, 바람직하게는 500 내지 8,000Da, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 5,000Da의 분자량일 수 있다. 덱스트란은 분자량에 따라 분자량이 1,000Da인 경우 '덱스트란 1', 5,000Da 인 경우 '덱스트란 5', 분자량이 10,000Da 인 경우 '덱스트란 10' 등과 같이 명명하여 사용한다. In the present invention, "dextran" refers to a polymer of D-glucose, which is one of the polysaccharides. Dextran has a structure similar to starch or glycogen, and D-glucose leads to a straight chain shape with α-1,6 bonds, and α-1,4 bonds are branched in several places. Dextran can be used as a blood extender or as an anticoagulant agent, and depending on the purpose, the molecular weight of dextran can be varied. In the present invention, the dextran may have a molecular weight of 500 to 10,000 Da, preferably 500 to 8,000 Da, more preferably 1,000 to 5,000 Da. Depending on the molecular weight, dextran is named as'dextran 1'when the molecular weight is 1,000 Da,'dextran 5'when the molecular weight is 5,000 Da, and'dextran 10' when the molecular weight is 10,000 Da.

일반적으로, 8,000Da 이상의 덱스트란은 인체에 투여되어 알러지 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 상기 알러지 반응으로 항원-항체 면역 반응이 원인이 되어 발생하는 급격한 전신 반응인 아나필락시스(anaphylaxis)가 발생할 수 있는데, 이는 상당히 위험할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 저분자량의 덱스트란, 바람직하게는 1,000Da 내지 5,000Da 의 덱스트란을 사용하면 알러지 반응을 최소화 할 수 있는 장점이 있으며, 공지된 물질(예를 들어 히알루론산)에 비해서 체내에서 분해되는 속도가 느리므로 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료 효과가 오래 유지될 수 있다는 장점이 있다.In general, dextran of 8,000 Da or more is known to cause an allergic reaction when administered to the human body. In particular, the allergic reaction may cause anaphylaxis, which is a rapid systemic reaction caused by an antigen-antibody immune reaction, which can be quite dangerous. However, using a low molecular weight dextran according to the present invention, preferably 1,000 Da to 5,000 Da, has the advantage of minimizing allergic reactions, and compared to known substances (for example, hyaluronic acid) in the body Since the rate of decomposition in is slow, the therapeutic effect of joint disease or connective tissue disease can be maintained for a long time.

또한, 본 발명에 따른 저분자량의 덱스트란은 8,000Da 이상의 덱스트란에 비하여 알러지 반응이 없을 뿐만 아니라, 작용시간의 시작점(onset)이 빠르며, 넓은 범위에 분포하도록 퍼질 수 있는 특징이 있다. In addition, the low molecular weight dextran according to the present invention not only has no allergic reaction compared to the dextran of 8,000 Da or more, the onset of the action time is fast, and can be spread over a wide range.

본 발명은 바람직한 예시로, 덱스트란 1, 덱스트란 5 를 이용한 실시예를 제공한다. 이들은 덱스트란 1 및 덱스트란 5의 조합으로 사용될 수 있으며, 폴록사머 188과의 조합으로도 사용될 수 있다. As a preferred example, the present invention provides examples using dextran 1 and dextran 5. These may be used in combination with dextran 1 and dextran 5, and may also be used in combination with poloxamer 188.

본 발명에서, 상기 덱스트란의 농도는 용매 100cc 중 질량(g) 농도(w/v)의 백분율로서 나타내며, 예컨대 덱스트란 1은 단일 유효성분으로 조성물에 포함되는 경우, 2 내지 40 (w/v)% 의 농도로 포함될 수 있고, 덱스트란 5가 단일 유효성분으로 조성물에 포함되는 경우, 덱스트란 5는 2 내지 30 (w/v)% 의 농도로 포함될 수 있다. In the present invention, the concentration of dextran is expressed as a percentage of the mass (g) concentration (w/v) in 100 cc of the solvent, for example, when dextran 1 is included in the composition as a single active ingredient, 2 to 40 (w/v )%, and when dextran 5 is included in the composition as a single active ingredient, dextran 5 may be included in a concentration of 2 to 30 (w/v)%.

또한 덱스트란이 덱스트란 1 또는 5 의 혼합물, 덱스트란과 폴록사머의 혼합물로 조성물에 포함되는 경우, 덱스트란의 농도는 혼합 대상에 따라 상이하게 될 수 있다. 예컨대 덱스트란 5 및 덱스트란 1의 혼합물이 조성물에 포함되는 경우, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v) %, 상기 덱스트란 1의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) % 또는 덱스트란 5의 농도는 4 내지 40 (w/v) %, 덱스트란 1의 농도는 5 내지 40 (w/v) % 일 수 있다. In addition, when dextran is included in the composition as a mixture of dextran 1 or 5 or a mixture of dextran and poloxamer, the concentration of dextran may be different depending on the mixing object. For example, when a mixture of dextran 5 and dextran 1 is included in the composition, the concentration of dextran 5 is 2 to 40 (w/v)%, and the concentration of dextran 1 is 2.5 to 40 (w/v)% Alternatively, the concentration of dextran 5 may be 4 to 40 (w/v)%, and the concentration of dextran 1 may be 5 to 40 (w/v)%.

덱스트란이 조성물에 고농도로 존재하게 되는 경우, 다당류의 수분을 함유하는 특성상 점도가 지나치게 증가하여 성상을 만들기 어려운 단점이 있으므로 덱스트란은 일반적으로 5% 이하의 농도로 사용되어 왔다. 그러나, 본 발명의 조성물 내에 덱스트란은 분자량에 따라 최소 2 내지 최대 40 (w/v)% 농도로 포함되므로, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료 효과가 최대화될 수 있다. 이와 같은 덱스트란의 용해도를 높이거나 안정화시키기 위해서, 본 발명의 조성물은 추가적으로 첨가물을 더 포함할 수 있으며, 상기 첨가물은 솔비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 락티톨, 만니톨 및 말티톨 및 이들의 혼합물을 포함하는 당알콜류, 또는 에리트로오스(erythrose), 에리트루로오스(erythrulose), 트레오스(threose), 아라비노오스(arabinose), 리보오스(ribose), 리불로오스(ribulose), 목당, 자일룰로오스(xylulose), 릭소오스(lyxose), 알로오스(allose), 알트로오스(altrose), 프시코오스(psicose), 갈락토오스(galactose), 굴로오스(gulose), 이도오스(idose), 만노오스(mannose), 소르보오스(sorbose), 탈로오스(talose), 타가토오스(tagatose), 세도헵툴로오스(sedoheptulose), 만노헵툴로오스(mannoheptulose) 및 이들의 혼합물을 포함하는 단당류, 또는 CaCl₂를 포함하는 2가 양이온을 포함할 수 있다.When dextran is present in the composition at a high concentration, the viscosity of the polysaccharide is excessively increased due to the nature of the moisture content, so that it is difficult to form a property. Therefore, dextran has been generally used in a concentration of 5% or less. However, since dextran is contained in a concentration of at least 2 to maximum 40 (w/v)% according to the molecular weight in the composition of the present invention, the therapeutic effect of joint disease or connective tissue disease can be maximized. In order to increase or stabilize the solubility of dextran, the composition of the present invention may further include an additive, and the additive is a sugar comprising sorbitol, xylitol, erythritol, lactitol, mannitol, maltitol, and mixtures thereof. Alcohol, or erythrose, erythrulose, threose, arabinose, ribose, ribulose, wood sugar, xylulose , Lyxose, allose, altrose, psicose, galactose, gulose, idoose, mannose, sorbose Monosaccharides including sorbose, talose, tagatose, sedoheptulose, mannoheptulose and mixtures thereof, or _divalent including CaCl ₂ It may contain cations.

본 발명에서 “폴록사머(poloxamer)"는 소수성의 프로필렌옥사이드를 중심으로 양 끝에 친수성의 에틸렌옥사이드가 결합된 비이온성의 트리블록공중합체로서, 온도 민감성의 특징을 가지고 있어 농도와 온도에 따라 졸(Sol)과 젤(Gel)의 변환이 가능하고 폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌의 비율에 따라 폴록사머의 성질이 달라진다. 폴록사머는 계면 활성제 외에 유화제, 안정화제, 용해보조제 등으로도 사용한다.In the present invention, "poloxamer" is a nonionic triblock copolymer in which hydrophilic ethylene oxide is bonded at both ends with a hydrophobic propylene oxide as the center, and has a temperature sensitivity characteristic, so that the sol ( Sol) and gel can be converted, and the properties of poloxamer vary depending on the ratio of polyoxypropylene and polyoxyethylene. Poloxamer is used as an emulsifier, stabilizer, and solubility aid in addition to surfactants.

본 발명에서 상기 폴록사머는 100 내지 20,000Da의 평균 분자량을 가질 수 있다. In the present invention, the poloxamer may have an average molecular weight of 100 to 20,000 Da.

상기 폴록사머는 폴록사머 101， 폴록사머 105, 폴록사머 105 벤조에이트， 폴록사머 108, 폴록사머 122, 폴록사머 123, 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 182, 폴록사머 182 디벤조에이트, 폴록사머 183, 폴록사머 184, 폴록사머 185, 폴록사머 188, 폴록사머 212, 폴록사머 215, 폴록사머 217, 폴록사머 231, 폴록사머 234, 폴록사머 235, 폴록사머 237, 폴록사머 238, 폴록사머 282, 폴록사머 284, 폴록사머 288, 폴록사머 331, 폴록사머 333, 폴록사머 334, 폴록사머 335, 폴록사머 338, 폴록사머 401, 폴록사머 402, 폴록사머 403 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴록사머 188을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The poloxamer is poloxamer 101, poloxamer 105, poloxamer 105 benzoate, poloxamer 108, poloxamer 122, poloxamer 123, poloxamer 124, poloxamer 181, poloxamer 182, poloxamer 182 dibenzoate, poloxamer Summer 183, Poloxamer 184, Poloxamer 185, Poloxamer 188, Poloxamer 212, Poloxamer 215, Poloxamer 217, Poloxamer 231, Poloxamer 234, Poloxamer 235, Poloxamer 237, Poloxamer 238, Poloxamer 282 , Poloxamer 284, Poloxamer 288, Poloxamer 331, Poloxamer 333, Poloxamer 334, Poloxamer 335, Poloxamer 338, Poloxamer 401, Poloxamer 402, Poloxamer 403 and Poloxamer 407. It may, and preferably includes poloxamer 188, but is not limited thereto.

본 발명에서, 상기 폴록사머의 농도는 용매 100cc 중 질량(g) 농도(w/v)의 백분율로서, 1 내지 50 (w/v)%의 농도, 2 내지 30 (w/v)%의 농도로 조성물에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대 폴록사머 188은 조성물 내 단독 유효성분으로 포함되는 경우 1 내지 15 (w/v)% 또는 1 내지 10 (w/v)% 농도로 조성물에 포함될 수 있다. In the present invention, the concentration of the poloxamer is a percentage of the mass (g) concentration (w / v) in 100 cc of the solvent, a concentration of 1 to 50 (w / v)%, a concentration of 2 to 30 (w / v)% It may be characterized as being included in the composition, for example, poloxamer 188 is included in the composition at a concentration of 1 to 15 (w/v)% or 1 to 10 (w/v)% when included as a sole active ingredient in the composition. I can.

이와 같은 폴록사머의 용해도를 높이거나 안정화시키기 위해서, 본 발명의 조성물은 추가적으로 당알콜류, 단당류, 2가 양이온과 같은 첨가물을 더 포함할 수 있으며, 별도의 첨가물 없이 멸균수 또는 생리 식염수가 조성물에 포함될 수도 있다. In order to increase or stabilize the solubility of such poloxamer, the composition of the present invention may further include additives such as sugar alcohols, monosaccharides, and divalent cations, and sterile water or physiological saline solution without additional additives may be included in the composition. May be.

본 발명에서 상기 약학적 조성물은 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히 폴록사머 188을 덱스트란과 혼합하여 사용하는 경우, 덱스트란 1 또는 덱스트란 5 와 혼합하여 사용할 수 있으며, 예컨대 덱스트란 5와 혼합하는 경우, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v)%, 상기 폴록사머 188의 농도는 1 내지 20 (w/v)% 일 수 있고, 또는 덱스트란 5의 농도가 4 내지 40 (w/v)%, 폴록사머 188의 농도가 2 내지 10 (w/v)%일 수 있다.In the present invention, the pharmaceutical composition may include a mixture of dextran and poloxamer. In particular, when poloxamer 188 is mixed with dextran, it can be used in combination with dextran 1 or dextran 5. For example, when mixed with dextran 5, the concentration of dextran 5 is 2 to 40 (w/ v)%, the concentration of poloxamer 188 may be 1 to 20 (w/v)%, or the concentration of dextran 5 is 4 to 40 (w/v)%, and the concentration of poloxamer 188 is 2 to 10 (w/v)%.

또한 예컨대 덱스트란 1과 혼합하는 경우, 상기 덱스트란 1 의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) %, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 5 (w/v)% 일 수 있거나, 덱스트란 1의 농도가 45 내지 55 (w/v)%, 폴록사머 188의 농도가 1 내지 2 (w/v)%일 수 있다. In addition, for example, when mixed with dextran 1, the concentration of dextran 1 may be 2.5 to 40 (w/v)%, the concentration of poloxamer may be 1 to 5 (w/v)%, or The concentration may be 45 to 55 (w/v)%, and the concentration of poloxamer 188 may be 1 to 2 (w/v)%.

폴록사머 188은 고농도, 예컨대 25(w/v)%을 초과하여 조성물 내에 포함되는 경우 독성을 나타낼 수 있으며, 덱스트란과 혼합하는 경우 농도를 적절하게 조절하여 사용할 수 있다. Poloxamer 188 may exhibit toxicity when contained in the composition at a high concentration, for example, in excess of 25 (w/v)%, and when mixed with dextran, the concentration may be appropriately adjusted and used.

일 실시예로서, 본 발명의 약학적 조성물 내 덱스트란:폴록사머는 예를 들면 (w/v)% 비율로서 5:0.05, 5:0.5, 5:5, 5:10, 5:20, 5:30, 5:40, 5:50, 5:100, 5: 150, 5:200, 10:0.1. 10:1, 10:10, 10:20, 10:30, 10:40, 10:50, 10: 100, 10: 150, 10:300, 10:400, 50: 0.5, 50:1, 50:5, 50:10, 50:20, 50:30, 50:40, 50:50으로 포함될 수 있으며, 예컨대 1:0.01 내지 1:40, 예시적인 조합으로 폴록사머 188 1(w/v)% 와 덱스트란 1 40(w/v)%를 혼합하는 경우 1:40, 폴록사머 188 20(w/v)% 와 덱스트란 5 2(w/v)%를 혼합하는 경우 1:0.1인 비를 반영하여 1:0.1 내지 1:40 으로 포함될 수 있다. 여기서 상기 덱스트란의 평균 분자량은 1,000Da 또는 5,000Da일 수 있으며, 상기 폴록사머의 평균 분자량은 8,500Da인, 폴록사머 188을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예로서 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는 경우, 각각의 성분은 1:1의 부피비로 혼합하여 조성물에 포함될 수 있다. As an example, the dextran:poloxamer in the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 5:0.05, 5:0.5, 5:5, 5:10, 5:20, 5 as a (w/v)% ratio. :30, 5:40, 5:50, 5:100, 5: 150, 5:200, 10:0.1. 10:1, 10:10, 10:20, 10:30, 10:40, 10:50, 10: 100, 10: 150, 10:300, 10:400, 50: 0.5, 50:1, 50: 5, 50:10, 50:20, 50:30, 50:40, 50:50 may be included, for example, 1:0.01 to 1:40, as an exemplary combination poloxamer 188 1 (w / v)% and When mixing 40 (w/v)% of dextran 1, 1:40, when mixing 20 (w/v)% of poloxamer 188 and 2 (w/v)% of dextran 5 reflects a ratio of 1:0.1 It may be included as 1:0.1 to 1:40. Here, the average molecular weight of the dextran may be 1,000 Da or 5,000 Da, and the average molecular weight of the poloxamer may include poloxamer 188, which is 8,500 Da. In addition, as an embodiment of the present invention, when containing two mixtures selected from the group consisting of dextran 1, dextran 5, and poloxamer 188, each component is mixed in a volume ratio of 1:1 to the composition. Can be included.

또한 본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 약학적 조성물은 덱스트란 1 및 덱스트란 5 의 혼합물을 포함하며, 약학적 조성물 내 덱스트란 1 : 덱스트란 5는 예를 들면 (w/v)% 비율로서 5:0.05, 5:0.5, 5:5, 5:10, 5:20, 5:30, 5:40, 5:50, 5:100, 10:0.1. 10:1, 10:10, 10:20, 10:30, 10:40, 10:50, 10: 100, 10: 150, 10:200, 50:0.5, 50:1, 50:5, 50:10, 50:20, 50:30, 50:40, 50:50, 50:1000 으로 포함될 수 있으며, 예컨대 1:0.01 내지 1:20, 예시적인 조합으로 덱스트란 1 2.5(w/v)% 와 덱스트란 5 40(w/v)% 를 혼합하는 경우 1:16, 덱스트란 1 40 (w/v)% 와 덱스트란 5 2(w/v)% 를 혼합하는 경우 1:0.05 인 비를 반영하여 1:0.05 내지 1:16로 포함될 수 있다. In addition, as an embodiment of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention comprises a mixture of dextran 1 and dextran 5, and dextran 1 in the pharmaceutical composition: dextran 5 is, for example, (w/v)% As a ratio of 5:0.05, 5:0.5, 5:5, 5:10, 5:20, 5:30, 5:40, 5:50, 5:100, 10:0.1. 10:1, 10:10, 10:20, 10:30, 10:40, 10:50, 10: 100, 10: 150, 10:200, 50:0.5, 50:1, 50:5, 50: 10, 50:20, 50:30, 50:40, 50:50, 50:1000 may be included, for example, 1:0.01 to 1:20, dextran 1 as an exemplary combination 2.5 (w / v)% and When mixing 40 (w/v)% dextran 5, 1:16, when mixing 40 (w/v)% dextran 5 and 2 (w/v)% dextran 5 reflects a ratio of 1:0.05 It may be included as 1:0.05 to 1:16.

본 발명의 조성물이 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물을 포함하는 경우, 폴록사머의 소수성 성분이 덱스트란 또는 병용 약물의 용해도를 증진시킬 수 있으며 폴록사머의 친수성 성분인 PEG(polyethylene glycol)는 세포막을 보존하고 유착을 방지하여 조직을 보존할 수 있다. 다만, 폴록사머는 체액에 의해 쉽게 희석될 수 있으며, 체액에 쉽게 흡수될 수 있는 단점이 있으므로, 덱스트란과의 혼합으로 체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물의 경우, 덱스트란 단독 또는 폴록사머 단독을 포함하는 경우에 비하여 점성이 오래 유지되어 손상된 관절 또는 결체조직 부위를 감싸줄 수 있으며, 조직의 병리적인 유착을 막아 마찰력에 의한 염증성 소견이 감소함으로써 영양물질의 공급이 원활해지고 조직의 재생이 증진되는 효과가 있다. 상기 효과는 덱스트란 및 폴록사머 혼합물의 완충 효과(cushion effect) 또는 코팅 효과(coating effect) 또는 항염 효과(anti-inflammatory effect)에 의하여 유도될 수 있다.When the composition of the present invention contains a mixture of dextran and poloxamer, the hydrophobic component of poloxamer can enhance the solubility of dextran or concomitant drugs, and PEG (polyethylene glycol), which is a hydrophilic component of poloxamer, preserves the cell membrane. And prevent adhesion to preserve the organization. However, since poloxamer can be easily diluted by body fluids and can be easily absorbed into body fluids, the stability in the body can be increased by mixing with dextran. Therefore, in the case of a mixture of dextran and poloxamer, compared to the case of containing dextran alone or poloxamer alone, the viscosity is maintained longer and can cover damaged joints or connective tissues, and prevent pathological adhesion of tissues due to frictional force. By reducing the inflammatory findings, the supply of nutrients is smoothed and tissue regeneration is enhanced. The effect may be induced by a cushioning effect or a coating effect or an anti-inflammatory effect of the dextran and poloxamer mixture.

본 발명에 있어서, “완충 효과 (cushion effect)” 란, 투여된 부위, 예컨대 관절에서 마찰을 줄임으로써 가해지는 충격을 완충하는 쿠션과 같은 역할을 하는 효과를 의미하며, “코팅 효과(coating effect)” 는 뻑뻑해진 부위, 예컨대 관절 안의 손상된 연골 조직을 빠른 속도로 덮어 코팅함으로써 무릎 관절을 편하게 움직일 수 있게 하는 효과를 의미한다. 이들 효과에 의하여 손상된 관절 부위의 염증 반응이 감소할 수 있다. In the present invention, the "cushion effect" means an effect that acts like a cushion to buffer an impact applied by reducing friction in an administered site, such as a joint, and "coating effect" "" means the effect of allowing the knee joint to move comfortably by covering and coating the stiffened area, such as damaged cartilage tissue in the joint at a high speed. These effects can reduce the inflammatory response of the damaged joint.

그러므로, 완충 효과와 코팅 효과 또는 항염 효과를 유도하는 본 발명의 조성물은 재생 또는 손상된 조직을 개선하기에 적합하므로 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 상기와 같은 효과는 현재 관절 질환 치료를 위해서 사용되고 있는 줄기세포 치료제와 유사한 효과이며, 고도의 기술력 및 비용이 요구되는 줄기세포 치료제와 비교하여 경쟁력을 가질 수 있다. Therefore, the composition of the present invention, which induces a buffering effect, a coating effect, or an anti-inflammatory effect, is suitable for improving regeneration or damaged tissue, and thus can be effectively used in the treatment of joint disease or connective tissue disease. The above effects of the composition of the present invention are similar to those of stem cell therapeutics currently used for treating joint diseases, and can have a competitive edge compared to stem cell therapeutics that require high technology and cost.

또한, 본 발명은 줄기세포; 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention stem cells; Dextran (dextran), poloxamer (poloxamer), or a mixture thereof, to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating joint disease or connective tissue disease.

본 발명에서 용어 "줄기세포"는, 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.In the present invention, the term "stem cell" refers to a cell having the ability to differentiate into two or more cells while having self-replicating ability, totipotent stem cells, pluripotent stem cells, c It can be classified as a multipotent stem cell.

본 발명의 줄기세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.The stem cells of the present invention may be derived from any type of animal including humans and non-human mammals, and whether the stem cells are derived from an adult or an embryo is not limited thereto.

본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방(또는 지방 조직세포), 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반(또는 태반 조직세포), 뇨 등으로부터 유래된 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Stem cells of the present invention include embryonic stem cells or adult stem cells, wherein the adult stem cells are mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells derived from human tissue, mesenchymal stem cells derived from human tissue, and multipotent It may be stem cells or amniotic epithelial cells. The stem cells may be stem cells derived from umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat (or adipose tissue cells), muscle, nerve, skin, amnion and placenta (or placental tissue cells), urine, etc., but is not limited thereto.

상기 줄기세포는 줄기세포 또는 이의 농축액, 줄기세포 배양액 또는 이의 농축액, 줄기세포의 배양 분비물 또는 이의 농축액, 또는 이들의 배합물일 수 있다. The stem cells may be stem cells or a concentrate thereof, a stem cell culture solution or a concentrate thereof, a culture secretion product of a stem cell or a concentrate thereof, or a combination thereof.

상기 조성물 내의 덱스트란 또는 폴록사머는 줄기세포를 관절 또는 결체조직의 손상된 병변부로 특이적으로 운반하는 역할을 할 수 있으며, 또한 줄기세포가 운반된 병변부에 정착하여 손상된 조직의 재생을 유도하는 것을 상승시키는 효과가 있다.Dextran or poloxamer in the composition may play a role of specifically transporting stem cells to damaged lesions of joints or connective tissues, and also to induce regeneration of damaged tissues by fixing stem cells to the transported lesions. It has a synergistic effect.

따라서, 본 발명의 조성물이 줄기세포를 포함하는 경우, 손상된 조직 특이적으로 줄기세포를 운반 및 부착시킴으로써 관절 질환 또는 결체조직 질환을 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.Therefore, when the composition of the present invention includes stem cells, it is possible to more effectively treat joint disease or connective tissue disease by transporting and attaching stem cells specifically to damaged tissue.

본 발명에서 "예방"은 조성물의 투여에 의해 관절 질환 또는 결체조직 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. In the present invention, "prevention" refers to any action that suppresses or delays the onset of joint disease or connective tissue disease by administration of the composition.

본 발명에서 "치료"는 조성물의 투여에 의해 관절 질환 또는 결체조직 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.In the present invention, "treatment" refers to any action in which symptoms of joint disease or connective tissue disease are improved or beneficially changed by administration of the composition.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화 시킬 수 있다. 또한, 상기 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클, 방부제, 또는 결합제 등과 조합하여, 약학적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable additive, and may be formulated into a unit dosage form suitable for intra-body administration of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field. In addition, the formulation may be combined with a pharmaceutically acceptable carrier or medium such as sterile water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, excipient, vehicle, preservative, or binding agent, It can be formulated by blending into an accepted unit dosage form.

상기 약학적 조성물은 용액 상태 또는 분말 상태일 수 있으며, 상기 약학적 조성물이 분말 상태인 경우, 투여 직전에 용매에 용해하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약물의 제조시 발생할 수 있는 여러 가지 상황을 고려하여 가장 적합한 방식으로 제조될 수 있다. The pharmaceutical composition may be in a solution state or a powder state, and when the pharmaceutical composition is in a powder state, it may be dissolved in a solvent immediately before administration, but is not limited thereto, and various It can be manufactured in the most suitable way taking into account the situation.

상기 약학적 조성물의 투여형태는 특별히 한정되지 않지만, 경구투여, 주사, 수액에 의한 투여 등의 일반적인 투여 경로를 거칠 수 있다.The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may be taken through a general route of administration such as oral administration, injection, or administration by infusion solution.

경구투여의 경우에는, 상기 조성을 갖는 조성물로서, 또는 의약상 허용되는 담체, 부형제(excipient)와 함께 정제, 알약, 캡슐, 겔, 시럽 등의 제제로서 이용해도 된다. 다만, 정제나 산제 등의 고형제로는 흡수에 시간이 걸리는 경우가 많으므로 액제 등에 의한 경구투여가 바람직하다. 그 경우에는 적당한 첨가물, 예를 들면 염화나트륨 등의 염류, 완충제, 킬레이트제 등과 함께 수용액으로서 투여하는 것이 바람직하다.In the case of oral administration, it may be used as a composition having the above composition, or as a formulation such as tablets, pills, capsules, gels, and syrups together with a pharmaceutically acceptable carrier and excipient. However, in many cases it takes time to absorb solid substances such as tablets and powders, so oral administration by liquid preparations is preferable. In that case, it is preferable to administer it as an aqueous solution together with an appropriate additive such as a salt such as sodium chloride, a buffering agent, or a chelating agent.

경구로 이용될 수 있는 제약학적 조성물은 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐과 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 만들어진 연성 캡슐을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐에는 활성 성분과 락토오즈와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 또는 선택적으로 안정화제를 포함할 수 있다. 연성 캡슐에는 활성화합물을 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.Pharmaceutical compositions that can be used orally include push-fit capsules made of gelatin and soft capsules made of gelatin and a plasticizer such as glycerol or sorbitol. Push-fit capsules may contain the active ingredient and fillers such as lactose, binders such as starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, or optionally stabilizers. In soft capsules, the active compound can be dissolved or suspended in a suitable liquid such as fatty oil, liquid paraffin, or liquid polyethylene glycol.

또한, 관절 질환 또는 결체조직을 표적으로 하는 특이 항체로 피복된 리포좀과 같은 표적 약물 수송 시스템으로 약물을 투여할 수 있다. 리포좀은 병이 있는 조직에 선택적으로 취해질 수 있다.In addition, drugs may be administered through a target drug transport system such as a liposome coated with a specific antibody targeting joint disease or connective tissue. Liposomes can be selectively taken on diseased tissues.

본 발명의 약학적 조성물이 국부투여용 제제로 투여되는 경우, 적당한 완충제, 등장제 등을 첨가하고 멸균증류수에 용해한 것을 이용하여, 개체의 관절강, 결체조직, 정맥내, 피하, 피내, 관절내 또는 근육 등으로 직접 주입하거나 피부에 도포하거나 패취(patch) 형태일 수 있다. When the pharmaceutical composition of the present invention is administered as a formulation for topical administration, an appropriate buffer, isotonic agent, etc. are added and dissolved in sterile distilled water, and the joint cavity, connective tissue, intravenous, subcutaneous, intradermal, intra-articular or It may be injected directly into the muscle or the like, applied to the skin, or in the form of a patch.

상기 개체는 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 양, 쥐, 및 원숭이를 포함한 포유동물로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.The individual may be any one selected from mammals, including humans, dogs, cats, pigs, horses, cows, sheep, mice, and monkeys, preferably humans.

본 발명에서 용어 "관절내"는 본 발명의 약학적 조성물로의 관절의 경피 주사를 말한다.In the present invention, the term "intra-joint" refers to transdermal injection of a joint into the pharmaceutical composition of the present invention.

본 발명에서 용어 "국부 투여"는 염증이 있는 관절 내에 또는 그 부근에 대한 경피 주사를 말한다. 그러므로 국부 투여 주사는 표피, 진피, 근육 또는 임의의 심부 기관에 관련된 것이다.In the present invention, the term "local administration" refers to transdermal injection into or near an inflamed joint. Therefore, topical injections are related to the epidermis, dermis, muscle or any deep organ.

국부 투여에 대한 주요 이점은 손상된 영역에 대한 진통 효과를 선택적으로 제한한다는 것이다. 게다가, 국부 투여는 전신 방출이 거의 없이 또는 아주 없이 높은 국부 농도 수준을 가능하게 한다. The main advantage over topical administration is that it selectively limits the analgesic effect on the damaged area. Moreover, topical administration allows for high local concentration levels with little or no systemic release.

상기 약학적 조성물은 안정화제, 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 규산칼슘, 폴리비닐피롤리돈 및 셀룰로오즈를 추가로 포함할 수 있다. 당해 조성물은 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁화제; 보존제, 예를 들면, 티머로살, 벤질 알콜, 파라벤, 메틸- 또는 프로필하이드록시벤조에이트; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 디하이드로퀴논, 부틸화된 하이드록시톨루엔 및 디티오트레이톨; 및 완충제, 예를 들면, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 나트륨 벤조에이트, 칼륨 벤조에이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 타르트레이트; 킬레이트제, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산; 및 등장성 조절제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈를 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition is a stabilizer such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, tragacanth, calcium silicate, polyvinylpyrrolidone and It may further contain cellulose. The composition may contain lubricants such as magnesium stearate and mineral oil; Humectants; Emulsifying and suspending agents; Preservatives such as thimerosal, benzyl alcohol, parabens, methyl- or propylhydroxybenzoate; Antioxidants such as ascorbic acid, dihydroquinone, butylated hydroxytoluene and dithiothreitol; And buffering agents such as monobasic sodium phosphate, dibasic sodium phosphate, sodium benzoate, potassium benzoate, sodium citrate, sodium acetate and sodium tartrate; Chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid; And isotonicity modifiers, such as sodium chloride or dextrose.

상기 약학적 조성물은 마취제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 마취제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아메토카인(테트라카인), 리그노카인(리도카인), 자이실로카인, 부피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 벤조카인, 메피보카인, 코카인 및 이들의 배합물이 포함된다.The pharmaceutical composition may further include an anesthetic. Examples of the anesthetic agent include, but are not limited to, amethokine (tetracaine), lignocaine (lidocaine), xylocaine, bupivacaine, prilocaine, ropivacaine, benzocaine, mepibocaine, ***e, and Combinations of these are included.

상기 약학적 조성물은 항균제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항균제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아만파딘 하이드로클로라이드, 아만파딘 설페이트, 아미카신, 아미카신 설페이트, 아모글리코사이드, 아목시실린, 암피실린, 암사마이신, 바시트라신, 베타-락탐, 칸디시딘, 카프레오마이신, 카베니실린, 세팔렉신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파졸린, 세파피린, 세프라딘, 세팔로글리신, 칠롬페니콜, 클로르헥시딘, 클로스헥시딘 글루코네이트, 클로르헥시딘 하이드로클로라이드, 클로록신, 클로르퀴르알돌, 클로르테트라사이클린, 클로르테트라사이클린 하이드로클로라이드, 시프로플록사신, 시르쿨린, 클린다마이신, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 클로트리마졸, 클록사실린, 데메클로사이클린, 디클로스사실린, 디요오도하이드록시퀸, 독시사이클린, 에탐부톨, 에탐부톨 하이드로클로라이드, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에르흐마이신 스테아레이트, 파르네솔, 플록사실린, 젠타마이신, 젠타마이신 설페이트, 그라미시딘, 지세오풀빈, 할로프로긴, 할로퀴놀, 헥사클로로펜, 이미노사이클린, 요오도클로르하이드록시퀸, 카나마이신, 카나마이신 설페이트, 린코마이신, 리네오마이신, 리네오마이신 하이드로클로라이드, 마크롤리드, 메클로사이클린, 메타사이클린, 메타사이클린 하이드로클로라이드, 메테닌, 메테나민 히푸레이트, 메테나민 만델레이트, 메티실린, 메토니다졸, 미코나졸, 미코나졸 하이드로클로라이드, 미노사이클린, 미노사이클린 하이드로클로라이드, 무피로신, 나프실린, 네오마이신, 네오마이신 설페이트, 네티미신, 네틸미신 설페이트, 니트로푸라존, 노르플록사신, 니스타틴, 옥토피록스, 올레안도마이신, 오르세팔로스포린, 옥사실린, 옥시테아클린, 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드, 파라클로로메타 자일레놀, 파로모마이신, 파로모마이신 설페이트, 페니실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 펜타미딘, 펜타미딘 하이드로클로라이드, 페네티실린, 폴리믹신,퀴놀론, 스트렙토마이신 설페이트, 테트라사이클린, 토브라마이신, 톨나프테이트, 트리클로산, 트리팜핀, 리파마이신, 롤리테트라사이클린, 은 염, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스트룹토마이신, 설폰아미드, 테트라사이클린류, 테트라사이클린, 토브라마이신, 토브라마이신 설페이트, 트리클로카본, 트리클로산, 트리메토프림-설파메톡사졸, 틸로신, 반코마이신 및 이로트리신이 포함된다.The pharmaceutical composition may further include an antimicrobial agent. Examples of the antimicrobial agent include, but are not limited to, amanfadine hydrochloride, amanfadine sulfate, amikacin, amikacin sulfate, amoglycoside, amoxicillin, ampicillin, amsamycin, bacitracin, beta-lactam, candisidine , Capreomycin, carbenicillin, cephalexin, cephaloridin, cephalotin, cefazoline, cepapyrin, cepradin, cephaloglycine, chilomphenicol, chlorhexidine, closhexidine gluconate, chlorhexidine hydrochloride , Chloroxine, Chlorquiraldol, Chlortetracycline, Chlortetracycline hydrochloride, Ciprofloxacin, Cyrculin, Clindamycin, Clindamycin hydrochloride, Clotrimazole, Cloxacillin, Demeclocycline, Diclosacillin, Diiodohyde Roxyquine, doxycycline, ethambutol, ethambutol hydrochloride, erythromycin, erythromycin estolate, ermycin stearate, farnesol, phloxacillin, gentamicin, gentamicin sulfate, gramicidine, geofulvin, halopro Gin, haloquinol, hexachlorophene, iminocycline, iodochlorhydroxyquine, kanamycin, kanamycin sulfate, lincomycin, lineomycin, lineomycin hydrochloride, macrolide, meclocycline, metacycline, metacycline Hydrochloride, Methenin, Metenamine Hypurate, Methenamine Mandelate, Methicillin, Metonidazole, Miconazole, Miconazole Hydrochloride, Minocycline, Minocycline Hydrochloride, Mupirosine, Napsillin, Neomycin, Neomycin Sulfate , Netymycin, netylmycin sulfate, nitrofurazone, norfloxacin, nystatin, octopirox, oleandomycin, orcephalosporin, oxacillin, oxyteaclean, oxytetracycline hydrochloride, parachlorometha xylenol , Paromomycin, paromomycin sulfate, penicillin, penicillin G, penicillin V, pentamidine, pentamidine hydrochloride, peneticillin, polymyxin, quinolone, streptomycin sulfate, tetracycline, tobramycin, tolnaphtate, Triclosan, tripampin, rifamycin, lolita Tracycline, silver salt, spectinomycin, spiramycin, struptomycin, sulfonamide, tetracycline, tetracycline, tobramycin, tobramycin sulfate, triclocarbon, triclosan, trimethoprim-sulfamethoxazole, Tyrosine, vancomycin and irothricin are included.

상기 약제학적 조성물은 소염제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 소염제는 비스테로이드성, 스테로이드성 또는 이들의 배합물일 수 있다. 비스테로이드성 소염제의 비제한적 예는 옥시캄, 예를 들면, 피록시캄, 이속시캄, 테녹시캄, 수독시캄; 살리실레이트, 예를 들면, 아스피린, 디살시드, 베노릴레이트, 트리리세이트, 사파프린, 솔프린, 디플루니살 및 펜도살; 아세트산 유도체, 예를 들면, 디클로페낙, 펜클로페낙, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴, 이소세팍, 푸로페낙, 티오피낙, 지도메타신, 아세마타신, 펜티아작, 조메피락, 클린다낙, 옥세피낙, 펠비낙 및 케토롤락; 페나메이트, 예를 들면, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 니플룸산 및 톨페남산; 프로피온산 유도체, 예를 들면, 이부프로펜, 나프록센, 베녹사프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 페노프로펜, 펜부펜, 인도프롭펜, 피르프로펜, 카르프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 미로프로펜, 티옥사프로펜, 수프로펜, 알미노프로펜 및 티아프로페닉; 피라졸, 예를 들면, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 페프라존, 아자프로파존 및 트리메타존을 포함한다. 이들 비스테로이드성 소염제의 추출물이 또한 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition may further include an anti-inflammatory agent. The anti-inflammatory agent may be non-steroidal, steroidal, or a combination thereof. Non-limiting examples of nonsteroidal anti-inflammatory agents include oxycam, such as piroxicam, isoxicam, tenoxicam, sudoxicam; Salicylates such as aspirin, disalside, benolylate, tririsate, sapaphrine, solphrine, diflunisal and pendosal; Acetic acid derivatives such as diclofenac, penclofenac, indomethacin, sulindac, tolmethine, isosepac, furofenac, thiofinac, zidomethacin, asematacin, penthiazac, jomepirac, clindanac , Oxepinac, felbinac and ketorolac; Phenamates such as mefenamic acid, meclofenamic acid, flufenamic acid, niplumic acid and tolfenamic acid; Propionic acid derivatives such as ibuprofen, naproxen, benoxaprofen, flurbiprofen, ketoprofen, fenoprofen, fenbufen, indopropfen, pyrpropene, carprofen, oxaprozin, Pranoprofen, miroprofen, thioxaprofen, suprofen, aluminoprofen and thiapropenic; Pyrazoles such as phenylbutazone, oxyfenbutazone, peprazone, azapropazone and trimetazone. Extracts of these nonsteroidal anti-inflammatory agents can also be used.

상기 스테로이드성 소염제의 비제한적 예에는 코르티코스테로이드, 예를 들면, 하이드로코르티손, 하이드록시-트리암시놀론, 알파-메틸 덱사메타손, 덱사메타손-포스페이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 클로베타솔 발레레이트, 데소니드, 데스옥시메타손, 데스옥시코르티코스테론 아세테이트, 덱사메타손, 디클로리손, 디플로라손 디아세테이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루아드레놀론, 플루클로롤론 아세토니드, 플루드로코르티손, 플루메타손 피발레이트, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루코르틴 부틸에스테르, 플루오코르톨론, 플루프레드니덴(플루프레드닐리덴) 아세테이트, 플루란드레놀론, 할시노니드, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 부티레이트, 메틸프로드니솔론, 트리암시놀론 아세토니드, 코르티손, 코르토독손,플루세토니드, 플루드로코리손, 디플루오로손 디아세테이트, 플루라드레놀론, 플루드로코르티손, 디플루로손 디아세테이트, 플루라드레놀론 아세토니드, 메드리손, 암시나펠, 암시나피드, 베타메타손 및 이의 에스테르의 밸런스(balance), 클로로프레드니손, 클로르프레드니손 아세테이트, 클로코르텔론, 클레시놀론, 디클로리손, 디플루르프레드네이트, 플루클로로니드, 플루니솔리드, 플루오로메탈론, 플루페롤론, 플루프레드니솔론, 하이드로코르티손 발레레이트, 하이드로코르티손 사이클로펜틸프로피오네이트, 하이드로코르타메이트, 메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 및 이의 추출물이 포함된다.Non-limiting examples of such steroidal anti-inflammatory agents include corticosteroids such as hydrocortisone, hydroxy-triamcinolone, alpha-methyl dexamethasone, dexamethasone-phosphate, beclomethasone dipropionate, clobetasol valerate, desoni De, desoxymethasone, desoxycorticosterone acetate, dexamethasone, dichlorisone, diflorasone diacetate, diflucortolone valerate, fluadrenolone, fluchlorolone acetonide, fludrocortisone, flumeta Sohn pivalate, fluocinolone acetonide, fluocinonide, flucortin butyl ester, fluocortolone, fluprednidene (fluprednylidene) acetate, flurandrenolone, halcinonide, hydrocortisone acetate, hydrocortisone Butyrate, methylprodnisolone, triamcinolone acetonide, cortisone, cortodoxone, flucetonide, fludrocorisone, difluorosone diacetate, fluradrenolone, fludrocortisone, diflurosone diacetate, fluradrenolone Balance of acetonide, medisone, gammanafel, gammanapid, betamethasone and esters thereof, chloroprednisone, chlorprednisone acetate, chlorocortelone, clecinolone, dichlorisone, diflurprednate, fluchloro Need, flunisolide, fluorometalone, fluperolone, fluprednisolone, hydrocortisone valerate, hydrocortisone cyclopentylpropionate, hydrocortamate, meprednisone, paramethasone, prednisolone, prednisone, beclomethasone Dipropionate, triamcinolone and extracts thereof.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 덱스트란, 폴록사머, 또는 이의 혼합물의 용량은 넓은 범위로 변하며 각각의 특별한 경우의 개별적인 요구 조건에 따라 결정된다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount. The term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease, and the effective dose level is the severity of the disease, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration, the route of administration. And factors including the rate of excretion, duration of treatment, drugs used in combination or co-used with the composition of the present invention used, and other factors well known in the medical field. The dosage of dextran, poloxamer, or mixtures thereof varies over a wide range and is determined by the individual requirements of each particular case.

본 발명의 약학적 조성물은 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료를 위한 공지의 약제와 병용하여 투여할 수 있으며, 상기 치료제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with known drugs for the treatment of joint disease or connective tissue disease, and may be administered simultaneously or sequentially with the therapeutic agent.

본 발명의 약학적 조성물은 1회 또는 수회로 나누어 바람직한 투여 간격, 예컨대 1주일 간격으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be divided once or several times and administered at a preferred administration interval, such as one week.

또한 필요에 따라 본 발명의 조성물은 활성성분을 포함하는 하나 이상의 단위약형을 포함하는 포장 또는 투여장치에 제공될 수 있다. 제약학적 수용가능한 담체내에 조성된 본 발명의 화합물로 구성된 조성물은 적절히 제조되어 적정 용기내에 위치시키고, 지시된 조건의 치료용임을 알린다. 레벨에 표시된 적절한 지시에는 관절 질환의 치료 및 결체조직 질환의 치료를 포함한다.In addition, if necessary, the composition of the present invention may be provided in a package or an administration device containing one or more unit dosage forms containing the active ingredient. A composition consisting of a compound of the present invention formulated in a pharmaceutically acceptable carrier is suitably prepared, placed in an appropriate container, and indicated for use in the treatment of the indicated conditions. Appropriate indications indicated on the level include treatment of joint disease and treatment of connective tissue disease.

본 발명에 따르면, 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물은 관절 질환 또는 결체조직 질환을 겪는 개체에서 장기간 지속되는 통증의 경감을 유도한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물을 사용하는 경우 주요 약물 부작용을 피하고, 너무 침습적인 기술을 사용하지 않으면서도 급성뿐 아니라 만성 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다.According to the present invention, a pharmaceutical composition comprising dextran, poloxamer or a mixture thereof induces relief of long-lasting pain in an individual suffering from joint disease or connective tissue disease. In the case of using the pharmaceutical composition according to the present invention, major drug side effects are avoided, and acute as well as chronic joint disease or connective tissue disease can be treated and/or prevented without using too invasive techniques.

본 발명에서 “결체조직(connective tissue)"은 결조직 또는 결합조직이라고도 알려져 있고, 동물 조직에 널리 분포하고 세포, 장기, 기관 등을 결합, 보호, 충전하는 역할을 하는 조직을 지칭하며, 섬유성 결합조직, 아교질조직, 세망(細網)조직으로 분류되지만 섬유성 결합조직이 그 대부분을 차지한다.In the present invention, "connective tissue" is also known as connective tissue or connective tissue, and refers to a tissue that is widely distributed in animal tissues and serves to bind, protect, and fill cells, organs, organs, etc., and fibrous It is classified into connective tissue, gelatinous tissue, and reticular tissue, but fibrous connective tissue occupies most of them.

본 발명에서, “관절 질환” 또는 “결체조직 질환”이 발생하는 원인은 외상성, 감염성, 염증성, 퇴행성으로 크게 분류될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 또는 치료제는 관절에 손상을 가져오는 모든 원인에 의한 관절 질환 및 결체조직 질환에 사용될 수 있지만, 본 발명의 조성물이 효과적으로 사용될 것으로 예상되는 관절 질환은 골관절염, 바람직하게는 반복적인 마찰력과 그로 인해 발생하는 퇴행성 골관절염, 외상성 관절염, 류마티스 관절염, 슬개대퇴 증후군, 만성 염증 또는 관절증을 포함한다. 또한 본 발명의 조성물이 효과적으로 사용될 것으로 예상되는 결체조직 질환은 추간판, 인대, 힘줄, 피부, 건 등이 물리적인 손상이나 반복적인 마찰에 따른 퇴행성 변화로 인하여 콜라겐 또는 수분의 손실이 생긴 경우의 결체조직 질환을 포함한다.In the present invention, the causes of “joint disease” or “connective tissue disease” can be broadly classified into traumatic, infectious, inflammatory and degenerative. The composition or therapeutic agent according to the present invention can be used for joint disease and connective tissue disease due to any cause of damage to the joint, but the joint disease for which the composition of the present invention is expected to be effectively used is osteoarthritis, preferably repetitive frictional force. And the resulting degenerative osteoarthritis, traumatic arthritis, rheumatoid arthritis, patellofemoral syndrome, chronic inflammation or arthrosis. In addition, the connective tissue disease that the composition of the present invention is expected to be used effectively is the connective tissue when loss of collagen or moisture occurs due to physical damage to the intervertebral discs, ligaments, tendons, skin, tendons, etc. due to degenerative changes caused by repetitive friction. Includes disease.

본 발명에서는, 세포 독성을 나타내지 않으면서 항염 효과를 효과적으로 나타내고, 연골기질을 파괴하는 단백질인 MMP-3, MMP-13 유전자 발현을 억제하고, 연골 보호작용으로 2형 콜라겐의 합성을 촉진하고, 아그리칸의 생성량을 증가시키는 효과를 달성할 수 있는 바람직한 예시를 다음과 같이 제공할 수 있다. In the present invention, the present invention effectively exhibits anti-inflammatory effects without exhibiting cytotoxicity, inhibits expression of MMP-3 and MMP-13 genes, proteins that destroy cartilage matrix, promotes the synthesis of type 2 collagen by protecting cartilage, and Preferred examples capable of achieving the effect of increasing the amount of glycan produced can be provided as follows.

본 발명의 일 예는 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. An example of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating joint disease or connective tissue disease, comprising a mixture of two selected from the group consisting of dextran 1, dextran 5, and poloxamer 188. .

상기 덱스트란은 덱스트란 1 로 조성물에 단일 유효성분으로 포함되며, 덱스트란 1의 농도는 2 내지 40 (w/v)% 일 수 있다. The dextran is included as a single active ingredient in the composition as dextran 1, and the concentration of dextran 1 may be 2 to 40 (w/v)%.

상기 덱스트란은 덱스트란 5 로 조성물에 단일 유효성분으로 포함되며, 덱스트란 5의 농도는 2 내지 30 (w/v)% 일 수 있다. The dextran is included as a single active ingredient in the composition as dextran 5, and the concentration of dextran 5 may be 2 to 30 (w/v)%.

또한 상기 폴록사머는 조성물에 단일 유효성분으로 포함되며, 폴록사머의 농도는 1 내지 15 (w/v)% 일 수 있다. In addition, the poloxamer is included as a single active ingredient in the composition, and the concentration of the poloxamer may be 1 to 15 (w/v)%.

본 발명에 있어서, 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종은 1:1 의 부피비로 혼합되는 것일 수 있다. In the present invention, two types selected from the group consisting of dextran 1, dextran 5, and poloxamer 188 may be mixed in a volume ratio of 1:1.

본 발명의 일 예에서, 상기 혼합물은 덱스트란 5 및 폴록사머의 혼합물이며, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v)%, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 20 (w/v)% 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the mixture is a mixture of dextran 5 and poloxamer, the concentration of dextran 5 is 2 to 40 (w/v)%, and the concentration of poloxamer is 1 to 20 (w/v )%.

또한 상기 혼합물은 덱스트란 5 및 덱스트란 1의 혼합물이며, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v) %, 상기 덱스트란 1의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) % 일 수 있다. In addition, the mixture is a mixture of dextran 5 and dextran 1, the concentration of dextran 5 is 2 to 40 (w/v)%, and the concentration of dextran 1 may be 2.5 to 40 (w/v)% have.

또한 상기 혼합물은 덱스트란 1 및 폴록사머의 혼합물이며, 상기 덱스트란 1 의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) %, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 5 (w/v)% 일 수 있다. In addition, the mixture may be a mixture of dextran 1 and poloxamer, and the concentration of dextran 1 may be 2.5 to 40 (w/v)%, and the concentration of poloxamer may be 1 to 5 (w/v)%.

또한 상기 혼합물은 덱스트란 1 및 폴록사머의 혼합물이며, 상기 덱스트란 1의 농도는 45 내지 55 (w/v) %, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 2 (w/v)% 일 수 있다. In addition, the mixture may be a mixture of dextran 1 and poloxamer, and the concentration of dextran 1 may be 45 to 55 (w/v)%, and the concentration of poloxamer may be 1 to 2 (w/v)%.

또한 본 발명의 일 예는 줄기세포; 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. In addition, an example of the present invention stem cells; It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating joint disease or connective tissue disease, comprising a mixture of two selected from the group consisting of dextran 1, dextran 5 and poloxamer 188.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다. Terms not otherwise defined in the specification have the meanings commonly used in the art to which the present invention belongs.

재료 및 방법Materials and methods

본원 발명에서는 덱스트란 1 (Dextran 1 (EP grade, Pharmacosmos), 덱스트란 5 (Dextran 5, pharmaceutical quality, Pharmacosmos), 폴록사머 188 (Poloxamer 188, cell culture grade, 시그마-알드리치) 을 이용하여 실험을 수행하였다. 또한 관절염 유도를 위하여 rhIL-1α (recombinant human IL-1α, Lot No. 200-01A) 을 PEPROTECH에서 구입하여 사용하였으며, 양성대조물질로 인도메타신(Indomethacin, 시그마-알드리치, Lot No. 53-86-1), 히알루론산나트륨(sodium hyaluronate 25 mg/2.5 mL, 아라간주, 동광제약, 전문의약품)을 이용하였다. In the present invention, experiments were performed using Dextran 1 (EP grade, Pharmacosmos), Dextran 5 (Dextran 5, pharmaceutical quality, Pharmacosmos), and Poloxamer 188 (Poloxamer 188, cell culture grade, Sigma-Aldrich). In addition, rhIL-1α (recombinant human IL-1α, Lot No. 200-01A) was purchased and used from PEPROTECH to induce arthritis, and indomethacin (Sigma-Aldrich, Lot No. 53) was used as a positive control material. -86-1), sodium hyaluronate (sodium hyaluronate 25 mg/2.5 mL, Araganju, Dongkwang Pharmaceutical, specialty medicine) was used.

실시예Example 1. 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물의 제조 및 실험 준비 1. Preparation of dextran, poloxamer or mixtures thereof and preparation for experiments

1.1 세포의 분리 배양1.1 Separation culture of cells

3 주령 수컷 SD 랫트의 뒷다리 관절을 멸균 상태에서 분리한 후, 관절을 구성하는 연골조직만을 모아 단일 세포화하여 일차 랫트 연골세포(Chondrocytes)를 분리하여 사용하였다. 초대 배양한 세포가 안정되면 시험에 사용하였으며, 한 번 초대 배양할 때 최소 6 마리 이상에서 분리하였다. 안정화된 연골세포를 특정하기 위하여 RNA 분리 후 연골세포 표지 인자인 2형 콜라겐이나 SOX9 유전자의 발현 정도를 실시간 RT-PCR을 이용해 확인한 후에 시험에 사용하였다. After separating the hind limb joint of a 3-week-old male SD rat in a sterile state, only cartilage tissue constituting the joint was collected to form a single cell, and primary rat chondrocytes were separated and used. When the primary cultured cells were stable, they were used for the test, and at least 6 animals were isolated from the primary culture once. In order to identify stabilized chondrocytes, after RNA isolation, the expression level of type 2 collagen or SOX9 gene, which is a chondrocyte marker, was confirmed by real-time RT-PCR, and then used for the test.

1.2 세포 배양 방법 1.2 Cell culture method

1.1에서 분리된 세포는 온도 37 ℃, 습도 95 %, CO₂ 5 %로 설정된 배양기에서 배양하였으며, 배양실 온도 및 습도는 8 시간 단위로 확인하였다. 배지로는 10% 우태아혈청, 2 mL L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지를 이용하였다. 배양 기간 동안 세포 수를 관찰 후 90 % 이상 증식되었을 때 Detached solution (0.25 (w/v)% Trypsin, 0.53 mM EDTA solution (3 mL))으로 세포를 분리하고 125 X g, 10분간 원심분리하여 세포를 분리하였으며, 이하 실험에 사용하였다. The cells isolated at 1.1 were cultured in an incubator set at 37° C., 95% humidity, and 5% CO ₂ , and the temperature and humidity in the culture chamber were confirmed every 8 hours. As a medium, a Minimum Essential Medium (MEM) medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mL L-glutamine, 50 U/mL penicillin, and 50 μg/mL streptomycin was used. After observing the number of cells during the incubation period, when the number of cells has grown more than 90%, separate the cells with Detached solution (0.25 (w/v)% Trypsin, 0.53 mM EDTA solution (3 mL)) and centrifuge the cells at 125 X g for 10 minutes. Was separated and used in the following experiments.

1.3 1.3 시험군의Test group 구성 및 제조 Composition and manufacturing

시험군은 rhIL-1α 5 ng/mL로 골관절염을 유발시킨 모델에 정상대조군(NC), 염증유발대조군(PC), 시험물질(단일물 또는 혼합물) 농도별로 처리하는 것으로 구성하였으며, 양성대조군인 인도메타신(IM) 또는 히알루론산나트륨(HN) 처리군은 단일 농도로 구성하였다. 시험군은 하기 표 1에 나타내었다. The test group consisted of treatment with rhIL-1α 5 ng/mL in a model that induced osteoarthritis by concentration of the normal control group (NC), the inflammation-inducing control group (PC), and the test substance (single or mixture). New (IM) or sodium hyaluronate (HN) treatment groups consisted of a single concentration. Test groups are shown in Table 1 below.

[표 1][Table 1]

D=덱스트란1, T=덱스트란5, P=폴록사머188, NC=정상군, PC=염증유발물질(rhIL-1α)투여군, HN=히알루론산나트륨, IM=인도메타신, D+P=덱스트란1과 폴록사머188 혼합물, D+T=덱스트란1과 덱스트란5 혼합물, P+T=폴록사머188과 덱스트란5 혼합물. D = dextran 1, T = dextran 5, P = poloxamer 188, NC = normal group, PC = inflammatory substance (rhIL-1α) administration group, HN = sodium hyaluronate, IM = indomethacin, D+P =Dextran 1 and poloxamer 188 mixture, D+T = dextran 1 and dextran 5 mixture, P+T = poloxamer 188 and dextran 5 mixture.

본 발명에서 사용된 성분의 농도는 다음과 같은 표기방법에 따라 표기하였다: D10= 덱스트란1의 10(w/v)% 용액, P10= 폴록사머 188의 10(w/v)% 용액, T10= 덱스트란5의 10(w/v)% 용액The concentration of the ingredients used in the present invention was expressed according to the following notation method: D10 = 10(w/v)% solution of dextran 1, P10 = 10(w/v)% solution of poloxamer 188, T10 = 10(w/v)% solution of dextran 5

본 발명에 사용된 시험물질은 다음과 같은 방법을 이용하여 조제하였다: 세포 배양액에 녹는 최대 농도를 반영하여 덱스트란 1 (D)은 1~50(w/v)%, 덱스트란 5 (T)는 1~40(w/v)%, 폴록사머 188 (P)는 1~35(w/v)%의 범위 안에서 단일물을 조제하였다. 혼합물을 조제하는 경우에는 두 종류의 단일물을 각각 1 : 1 (v : v) 부피비로 혼합하여 조제하였다. The test substance used in the present invention was prepared using the following method: Dextran 1 (D) is 1-50 (w/v)%, dextran 5 (T) reflecting the maximum concentration dissolved in the cell culture solution. A single product was prepared within the range of 1 to 40 (w/v)% and 1 to 35 (w/v)% of poloxamer 188 (P). In the case of preparing a mixture, two types of single substances were each mixed in a volume ratio of 1:1 (v:v) to prepare.

세포배양을 위해 조제한 배지인 complete media (10 % fetal bovine serum, 2 mL L-glutamine, 50 U/mL penicilin, 50 ug/mL streptomycin 등이 모두 함유된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지))에 덱스트란 1, 5 및 폴록사머 188을 각각 투여 농도(w/v)에 맞게 완전히 용해시켰다. 시험물질을 complete media에 완전히 용해시켜 균질화하기 위하여 서늘한 온도에서, 특히 폴록사머 188의 경우에는 찬 온도에서, 멸균 스패출러, 막대기, magnetic bar 등으로 천천히 교반하거나 거품이 생기지 않을 정도로 짧게 수 차례 진탕하여 부유물 없이 완전히 투명하게 될 때까지 용해시켰다. 시험물질이 완전히 용해된 후에는 0.22 μm pore size syringe filter로 여과한 후 밀봉하여 냉장 보관하였다. Dextran in complete media (Minimum Essential Medium (MEM) medium containing all of 10% fetal bovine serum, 2 mL L-glutamine, 50 U/mL penicilin, 50 ug/mL streptomycin, etc.), a medium prepared for cell culture. 1, 5 and poloxamer 188 were completely dissolved in accordance with the dose concentration (w/v), respectively. In order to completely dissolve and homogenize the test substance in the complete media, at a cool temperature, especially in the case of poloxamer 188, slowly agitate with a sterile spatula, stick, magnetic bar, etc., or shake several times briefly to avoid foaming. It was dissolved until completely transparent without any suspension. After the test material was completely dissolved, it was filtered through a 0.22 μm pore size syringe filter, sealed, and stored in a refrigerator.

보다 구체적으로 단일물 조제는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. More specifically, the preparation of a single product was performed in the following manner.

덱스트란 Dextran 1 의1 of 5% 단일물('D5') 제조 5% single product ('D5') preparation

덱스트란 1의 5% 시험용액을 조제하는 경우, 덱스트란 1을 5g으로 분취하고 complete media에 완전히 용해시켜 100 mL로 총량을 맞추어 D5 (w/v)% 시험용액을 조제하였다. 이와 같이 0.05 g/mL의 농도로 용해된 시험물질을 0.22 μm pore size syringe filter 를 이용해 여과하여 냉장보관 후 사용하였다. When preparing a 5% test solution of dextran 1, 5 g of dextran 1 was aliquoted and completely dissolved in complete media, and the total amount was adjusted to 100 mL to prepare a D5 (w/v)% test solution. As such, the test material dissolved in a concentration of 0.05 g/mL was filtered using a 0.22 μm pore size syringe filter and stored in a refrigerator before use.

덱스트란 1의 5%와 폴록사머 188의 10%의 혼합물('D5+P10') 제조 Preparation of a mixture of 5% of dextran 1 and 10% of poloxamer 188 ('D5+P10')

D5와 P10을 각각 조제하고 0.22 μm pore size syringe filter로 여과하여 냉장 보관한 후, 각각 용량을 1 : 1 (v : v) 비율로 혼합하여 저속으로 거품이 나지 않도록 진탕한 후 사용하였다. D5 and P10 were prepared, respectively, filtered through a 0.22 μm pore size syringe filter, stored in the refrigerator, and then each volume was mixed at a ratio of 1:1 (v:v) and shaken at low speed to prevent foaming.

비교예Comparative example : : 인도메타신Indomethacin 처리군 ( Treatment group ( IMIM ) 제조 ) Produce

인도메타신은 5 mM의 농도로 DMSO에 완전히 용해 시킨 후 complete media로 희석하여 0.22 μm pore size syringe filter로 여과한 후 세포에 처리될 때 최종 농도가 5 μM 이 되도록 조정하였다. Indomethacin was completely dissolved in DMSO at a concentration of 5 mM, diluted with complete media, filtered through a 0.22 μm pore size syringe filter, and adjusted to a final concentration of 5 μM when treated with cells.

비교예Comparative example : 히알루론산 나트륨 처리군 (: Sodium hyaluronate treatment group ( HNHN ) 제조 ) Produce

히알루론산나트륨은 아라간주 (히알루론산나트륨 25 mg/2.5 mL, 1회용 멸균 주사기에 담겨있는 약제형태)에 complete media를 흡입하여 히알루론산나트륨 25 mg/3 mL (=히알루론산나트륨 8.33 mg/mL)으로 희석한 후 즉시 사용하였다. Sodium hyaluronate is sodium hyaluronate 25 mg/3 mL (= sodium hyaluronate 8.33 mg/mL) by inhaling complete media into Araganju (sodium hyaluronate 25 mg/2.5 mL, in the form of a drug contained in a disposable sterile syringe). It was diluted with and used immediately.

1.4 투여 방법 설정1.4 Setting the method of administration

랫트에서 분리한 초대배양 연골세포의 경우 doubling time이 약 24 시간이므로 증식 및 안정화가 적정할 때 시험물질을 처리하였다. 48 well 또는 24 well plate에 연골세포를 배양한 후 각 시험물질을 1회 투여하되, 관절염 유도를 위한 rhIL-1α 처리 1 시간 전에 각 시험물질의 농도 별로 총 배양액 용량의 20%(v/v)가 되도록 시험용액을 투여하였다. rhIL-1α 처리 24 시간 후 배양액을 채취하여 분석 실험을 진행하였다. 단, 연골세포에 대한 시험물질의 독성 또는 증식능을 확인할 때에는 rhIL-1α를 처리하지 않고 시험물질만을 처리하였다. In the case of primary cultured chondrocytes isolated from rats, the doubling time was about 24 hours, so the test substance was treated when proliferation and stabilization were appropriate. After culturing chondrocytes in a 48 well or 24 well plate, each test substance is administered once, but 20% (v/v) of the total culture medium volume for each concentration of each test substance 1 hour before rhIL-1α treatment for arthritis induction The test solution was administered so as to be. After 24 hours of rhIL-1α treatment, the culture solution was collected and analyzed. However, when checking the toxicity or proliferative ability of the test substance on chondrocytes, only the test substance was treated without treatment with rhIL-1α.

1.5 통계학적 분석1.5 Statistical Analysis

모든 실험결과는 정상대조군(NC) 또는 염증유발 양성 대조군(PC)과 student T-test로 p<0.05 수준에서 비교 분석하여 유의성을 표시하였다. All experimental results were compared with the normal control group (NC) or the positive control group for inducing inflammation (PC) and the student T-test at a level of p<0.05 to indicate significance.

실시예Example 2. 세포 독성 분석 2. Cytotoxicity analysis

시험물질 처리에 따라 연골세포의 증식능이 변화하는지 여부를 확인하여 세포 독성 분석을 수행하였다. 세포증식능 평가는 rhIL-1α를 처리하지 않은 미처리 연골세포와 rhIL-1α를 처리하여 염증을 유발한 연골세포에서 모두 수행하였으며, 각각의 시험물질을 랫트 연골세포에 처리한 뒤 24시간 및 48 시간 배양한 후에 MTT 분석 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; Sigma, M5655)을 진행하였다. 염증유발물질인 rhIL-1α로 유도한 관절염 in-vitro 모델에서의 시험물질의 세포증식능 평가에서는 rhIL-1α 처리 1 시간 전에 각각의 시험물질을 랫트 연골세포에 처리하고 24시간 및 48 시간 배양한 후 MTT 분석 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; Sigma, M5655)을 진행하였으며, 그 결과를 도 1 내지 도 4 에 나타내었다. Cytotoxicity analysis was performed by checking whether the proliferative ability of chondrocytes changed according to the treatment of the test substance. Cell proliferative capacity evaluation was performed on both untreated chondrocytes not treated with rhIL-1α and chondrocytes that induced inflammation by treatment with rhIL-1α, and cultured for 24 hours and 48 hours after each test substance was treated on rat chondrocytes. After the MTT analysis (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; Sigma, M5655) was performed. In the evaluation of the cell proliferation ability of the test substance in the in-vitro model of arthritis induced by the inflammation-inducing substance rhIL-1α, each test substance was treated on rat chondrocytes 1 hour before rhIL-1α treatment and cultured for 24 hours and 48 hours. MTT analysis (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; Sigma, M5655) was performed, and the results are shown in FIGS. 1 to 4.

도 1에 나타낸 바와 같이, 염증을 유발하지 않은 랫트 무릎관절 연골세포에서 덱스트란1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 또는 이의 혼합물의 세포 증식율을 24시간 동안 관찰한 결과, 대부분의 덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 및 이의 혼합물이 세포에 독성을 나타내지 않으면서 세포 증식을 돕는다는 것을 확인하였다. 다만 단일 처리군 중 폴록사머 188 처리군의 경우, 폴록사머 188 25(w/v)%(P25), 35(w/v)% (P35) 농도로 24시간 배양 시 일부 세포증식능의 감소가 대조약물(시판약물)인 히알루론산나트륨(HN) 투여군보다도 낮게 나타나 단일 투여에 적합하지 않은 것으로 나타났다. 또한 이들의 혼합물에서도 24 시간 배양 시 일부 세포증식능의 감소가 나타나 이를 통해 폴록사머 188의 경우, 이를 고농도로 처리하는 경우에 세포 독성을 유발할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 또한 혼합물 중에서는 D50+P35, P5+T40, P25+T40, P35+T40 실험군에서 세포증식능의 감소가 대조약물(시판약물)인 히알루론산나트륨(HN) 투여군보다도 낮게 나타났다. As shown in FIG. 1, the cell proliferation rate of dextran 1, dextran 5, poloxamer 188 or a mixture thereof was observed for 24 hours in rat knee joint chondrocytes that did not induce inflammation, and most of dextran 1, dex It was confirmed that tran 5, poloxamer 188 and mixtures thereof assisted cell proliferation without showing toxicity to cells. However, in the case of the poloxamer 188 treatment group among the single treatment groups, the decrease in some cell proliferative capacity when cultured at the concentration of poloxamer 188 25(w/v)%(P25) and 35(w/v)% (P35) for 24 hours was compared. It was found to be lower than the drug (commercially available drug) sodium hyaluronate (HN) administration group, which was not suitable for single administration. In addition, even in these mixtures, when cultured for 24 hours, some cell proliferative capacity was decreased, which confirmed the possibility that poloxamer 188 may cause cytotoxicity when treated at a high concentration. In addition, among the mixtures, the decrease in cell proliferation ability in the D50+P35, P5+T40, P25+T40, and P35+T40 experimental groups was lower than that of the control drug (commercial drug), sodium hyaluronate (HN) administration group.

도 2에 나타낸 바와 같이, 염증을 유발하지 않은 랫트 무릎관절 연골세포에서 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물의 세포 증식율을 48 시간 동안 관찰한 결과에서도 24시간 배양과 유사한 결과를 확인하였다. As shown in FIG. 2, the cell proliferation rate of dextran, poloxamer, or a mixture thereof was observed for 48 hours in rat knee joint chondrocytes that did not induce inflammation, and a result similar to that of the 24-hour culture was confirmed.

이러한 결과를 통해, 정상 무릎 관절 연골세포에 대한 처리 시, 덱스트란 1(D) 를 50%까지 농도를 증가시키거나, 덱스트란 5 (T) 를 40%까지 농도를 증가시켜도 연골세포의 증식이 시판약물 대비 억제되지 않는 반면, 폴록사머 188의 경우 25% 이상의 농도에서는 연골 세포에 독성을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한 혼합물로 구성하는 경우 폴록사머 188단독과 비교하여 세포 증식능이 일부 개선되기는 하나, 독성을 유발하지 않기 위해서는 폴록사머 188은 10(w/v)% 농도 이하로 혼합되는 것이 바람직함을 확인하였다. Through these results, when treating normal knee joint chondrocytes, even if the concentration of dextran 1 (D) is increased to 50% or the concentration of dextran 5 (T) is increased to 40%, the proliferation of chondrocytes is reduced. While not inhibited compared to commercial drugs, it was confirmed that poloxamer 188 can exhibit toxicity to chondrocytes at a concentration of 25% or more. In addition, it was confirmed that the cell proliferation ability is partially improved compared to poloxamer 188 alone, but poloxamer 188 is preferably mixed at a concentration of 10 (w/v)% or less in order not to cause toxicity.

도 3 및 도 4에서는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델에서의 실험군 처리에 따른 세포 증식율을 각각 24시간, 48시간 동안 관찰한 결과를 나타내었다. 3 and 4 show the results of observing the cell proliferation rate according to the experimental group treatment for 24 hours and 48 hours, respectively, in an in vitro model of osteoarthritis according to rhIL-1α treatment.

도 3에 나타낸 바와 같이, 골관절염 모델에서도 폴록사머 188 은 농도가 높아지는 경우 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났으며, 덱스트란 1 및 덱스트란 5는 농도가 높아지더라도 세포증식을 억제하지 않는 것으로 나타났다. 폴록사머 188의 경우, P10 단독 처리군에서는 세포 증식 억제가 확인되었으나, 이를 D5, D50, T4, T40 등과 혼합하여 사용하는 경우에는 세포 증식효과가 나타나는 바, 덱스트란과 혼합 처리시에는 폴록사머 188 의 1% 내지 10(w/v)% 를 사용할 수 있음을 확인하였다. As shown in FIG. 3, even in the osteoarthritis model, poloxamer 188 was found to inhibit cell proliferation when the concentration was increased, and dextran 1 and dextran 5 did not inhibit cell proliferation even when the concentration was increased. In the case of poloxamer 188, inhibition of cell proliferation was confirmed in the group treated with P10 alone, but when used in combination with D5, D50, T4, T40, etc., the cell proliferation effect appeared.When mixed with dextran, poloxamer 188 It was confirmed that 1% to 10 (w/v)% of can be used.

도 4에서도 24시간 배양과 동일한 결과를 확인할 수 있었으며, P10 처리군의 세포증식능은 덱스트란 1 또는 덱스트란 5와의 혼합을 통해 증가한다는 사실을 확인하였다. In FIG. 4, the same results as those of the 24-hour culture were confirmed, and it was confirmed that the cell proliferation capacity of the P10-treated group was increased through mixing with dextran 1 or dextran 5.

상기와 같은 결과를 종합하여, 덱스트란 1 및 덱스트란 5는 정상 및 염증 유발세포에서 대부분 세포 독성을 유발하지 않음을 확인하였다. 반면 폴록사머 188은 농도가 높아짐에 따라 단일 물질로 처리하는 경우 정상세포 및 염증 유발 세포에서 모두 세포 증식능 억제를 유발할 수 있는 것으로 나타났으나, 폴록사머 188을 1 내지 10(w/v)% 로 덱스트란 1 또는 덱스트란 5 와 혼합 투여하는 경우, 세포독성 없이 이용 가능함을 확인하였다. By combining the above results, it was confirmed that dextran 1 and dextran 5 do not induce cytotoxicity in most of the normal and inflammatory cells. On the other hand, as the concentration of poloxamer 188 increased, it was found that treatment with a single substance could induce cell proliferation inhibition in both normal cells and inflammatory cells, but poloxamer 188 was 1 to 10 (w/v)%. When administered in combination with dextran 1 or dextran 5, it was confirmed that it can be used without cytotoxicity.

실시예Example 3. 실시간 RT- 3. Real-time RT- PCRPCR 을 통한 through MMPMMP -3, -3, MMPMMP -13 유전자 발현 변화 확인-13 Confirmation of gene expression change

골관절염 평가를 위한 지표 물질들의 유전자 발현을 통해 골관절염 치료 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. MMP-3, MMP-13은 연골기질을 파괴하는 단백질이므로, 염증 자극을 통해 유도될 수 있는 상기 유전자 발현량의 증가를 효과적으로 억제할 수 있다면, 연골 보호 효과가 우수한 것으로 평가할 수 있다. An experiment was conducted to confirm the effect of osteoarthritis treatment through gene expression of indicator substances for osteoarthritis evaluation. Since MMP-3 and MMP-13 are proteins that destroy cartilage matrix, if they can effectively suppress the increase in the expression level of the gene that can be induced through inflammatory stimulation, it can be evaluated as having excellent cartilage protection effect.

덱스트란 1은 2.5 내지 50 (w/v)%, 덱스트란 5는 2 내지 40(w/v)%으로, 폴록사머 188은 1 내지 20(w/v)% 로 변화시키며 단일 투여 또는 혼합투여를 수행하고 이에 따른 MMP-3, MMP-13 의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로 각각의 시험물질을 rhIL-1α 처리 1시간 전에 랫트 연골세포에 처리한 뒤 24 시간 배양하였다. 배양 세포의 상층액을 제거한 뒤, 인산완충용액 (PBS)을 이용하여 세포를 세척하였다. 세척된 세포로부터 RNA를 분리하고 (GeneAll hybrid-R RNA purification kit; GeneAll, 3033522), 분리한 RNA를 nanodrop (Take3 Multi-Volume plate, BioTeK, Instruments, VT, USA)을 이용하여 정량한 뒤, 각 실험군별로 동일한 농도로 희석하였다. 동량으로 희석된 RNA를 PCR을 이용하여 cDNA로 합성하였으며 (ReverTra AceR qPCR RT Master Mix with gDNA Remover, Toyobo, FSQ-301). 합성된 cDNA를 이용, Real time RT-PCR을 통해 96 well plate에서 MMP-3, MMP-13의 유전자 발현을 확인하였다 (n=3). Dextran 1 is 2.5 to 50 (w / v)%, dextran 5 is 2 to 40 (w / v)%, poloxamer 188 is changed to 1 to 20 (w / v)%, single administration or mixed administration And confirmed the change in expression of MMP-3 and MMP-13 accordingly. Specifically, each test substance was treated with rat chondrocytes 1 hour before rhIL-1α treatment and then cultured for 24 hours. After removing the supernatant of the cultured cells, the cells were washed with a phosphate buffer solution (PBS). RNA was isolated from the washed cells (GeneAll hybrid-R RNA purification kit; GeneAll, 3033522), and the isolated RNA was quantified using nanodrop (Take3 Multi-Volume plate, BioTeK, Instruments, VT, USA), and then each It was diluted to the same concentration for each experimental group. RNA diluted in the same amount was synthesized as cDNA using PCR (ReverTra AceR qPCR RT Master Mix with gDNA Remover, Toyobo, FSQ-301). Using the synthesized cDNA, gene expression of MMP-3 and MMP-13 was confirmed in 96 well plates through Real time RT-PCR (n=3).

실험에 사용된 프라이머의 구성은 하기 표 2에 나타내었고, 대조군으로는 하우스키핑 유전자인 GAPDH를 사용하였다. The configuration of the primers used in the experiment is shown in Table 2 below, and GAPDH, a housekeeping gene, was used as a control.

[표 2][Table 2]

해당 프라이머, SyBr green (SYBR Premix Ex Taq, Takara, RR420A) 그리고 주형을 혼합한 뒤, 실시간 RT-PCR (CFX 96 touch, Bio rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 intercalating 법에 의한 실시간 RT-PCR을 수행하였다. Ct값을 검량선에 적용하여 얻어지는 정량결과(유전자 발현량)는 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 정량결과로 나눈 값으로 표시하였다. After mixing the primer, SyBr green (SYBR Premix Ex Taq, Takara, RR420A) and the template, real-time RT- by intercalating method using real-time RT-PCR (CFX 96 touch, Bio rad, Hercules, CA, USA) PCR was performed. The quantification result (gene expression level) obtained by applying the Ct value to the calibration curve was expressed as a value divided by the quantification result of GAPDH, the housekeeping gene.

3.1 3.1 MMPMMP -3 발현 변화 확인-3 Confirmation of expression change

덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 MMP-3의 발현 결과를 표 3a 내지 표 3b 및 도 5에 나타내었다. The expression results of MMP-3 according to the treatment of dextran 1, dextran 5, poloxamer 188 alone or a mixture thereof are shown in Tables 3a to 3b and FIG. 5.

[표 3a][Table 3a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 MMP-3 유전자 발현량Expression level of MMP-3 gene of dextran 1 (D), dextran 5 (T), poloxamer 188 (P) single substance in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24h

[표 3b][Table 3b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 MMP-3 유전자 발현량Expression level of MMP-3 gene of a mixture of dextran 1 (D), dextran 5 (T) or poloxamer 188 (P) in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24 h

상기 표 3a 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 덱스트란 1 (D) 는 2.5 내지 40(w/v)% 에서 염증 유발 양성 대조군 대비 유의적인 MMP-3 감소 효과를 나타내었으며, 덱스트란 5 (T) 는 2 내지 20 (w/v)% 에서 유의적인 MMP-3 감소 효과를 나타내었다. 한편 폴로사머 188(P) 는 실험한 모든 군인 1 내지 20(w/v)%에서 감소 효과를 나타내었다.As shown in Table 3a and 5, dextran 1 (D) showed a significant MMP-3 reduction effect compared to the positive control inducing inflammation at 2.5 to 40 (w/v)%, and dextran 5 (T) Showed a significant MMP-3 reduction effect at 2 to 20 (w/v)%. On the other hand, polosamer 188 (P) showed a reduction effect in 1 to 20 (w/v)% of all soldiers tested.

표 3b 및 도 5에 나타낸 바와 같이 혼합물 실험군에서는 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)%, 덱스트란 (T) 4% 및 40(w/v)% 모든 실험군에서 유의적인 효과를 확인하였으나, 덱스트란 1 (D)을 50(w/v)%까지 고농도로 처리한 군에서는 P2 와의 혼합에서만 유의적인 감소 효과를 확인하였다. 따라서 덱스트란 1을 덱스트란 5 또는 폴록사머 188과 혼합하는 경우, 농도를 50(w/v)%미만으로 혼합하는 것이 바람직함을 확인하였다. 폴록사머 188은 단독 처리 및 혼합 처리군에서 MMP-3 감소 효과를 대부분 유의적으로 나타내었으나, 실시예 2에서 확인한 바에 따라 폴록사머의 농도는 10(w/v)% 이하 인 것이 바람직하며, 이에 해당되는 P2, P5, P10은 덱스트란 1 및 덱스트란 5와의 조합에서도 유의적인 MMP-3 억제 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다. As shown in Table 3b and Figure 5, in the mixture experimental group, dextran 1 (D) 5 (w/v)% and poloxamer 188 (P) 2 to 10 (w/v)%, dextran (T) 4% and A significant effect was confirmed in all the experimental groups of 40(w/v)%, but in the group treated with high concentration of dextran 1 (D) up to 50(w/v)%, a significant reduction effect was found only in the mixture with P2. Therefore, it was confirmed that when dextran 1 is mixed with dextran 5 or poloxamer 188, it is preferable to mix the concentration to less than 50 (w/v)%. Poloxamer 188 showed a significant effect of reducing MMP-3 in the single treatment and mixed treatment groups, but as confirmed in Example 2, the concentration of poloxamer is preferably 10 (w/v)% or less. It was confirmed that the corresponding P2, P5, and P10 can induce a significant MMP-3 inhibitory effect even in combination with dextran 1 and dextran 5.

3.2 3.2 MMPMMP -13 발현 변화 확인-13 Confirmation of expression change

덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 MMP-13의 발현 결과를 표 4a 내지 표 4b 및 도 6에 나타내었다. The expression results of MMP-13 according to the treatment of dextran 1, dextran 5, poloxamer 188 single or a mixture thereof are shown in Tables 4a to 4b and Fig. 6.

[표 4a][Table 4a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 MMP-13 유전자 발현량Expression level of MMP-13 gene of dextran 1 (D), dextran 5 (T), poloxamer 188 (P) single substance in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24h

[표 4b] [Table 4b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 MMP-13 유전자 발현량Expression level of MMP-13 gene in a mixture of dextran 1 (D), dextran 5 (T) or poloxamer 188 (P) in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24h

상기 표 4a 내지 표 4b, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 단일물 실험군에서 덱스트란 1 (D) 은 2.5 내지 25(w/v)% 에서 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었으며, D40인 40(w/v)%에서는 유의하지는 않았으나 MMP-13 유전자 증가가 억제되었고, D50인 50(w/v)%에서는 오히려 MMP-13 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 특성은 덱스트란 1 (D) 의 혼합물에서도 유사하게 나타났다. 따라서, 덱스트란 1(D)는 2.5 내지 40(w/v)%가 가장 바람직한 농도 범위인 것을 확인하였으며, 이는 MMP-3 유전자 발현량 결과와도 일치하는 결과이다. 덱스트란 5 (T) 는 단독 투여시 2 내지 40(w/v)%에서 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었으며, 덱스트란 5 (T) 4 및 40(w/v)%은 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 및 폴록사머 188 (P) 2 및 10(w/v)% 와의 혼합에서도 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었다.As can be seen in Tables 4a to 4b and Fig. 6, dextran 1 (D) in the single test group showed a significant MMP-13 gene increase inhibitory effect at 2.5 to 25 (w/v)%, D40 Although it was not significant in 40(w/v)% of phosphorus, the increase in MMP-13 gene was suppressed, and in 50(w/v)% of D50, the level of MMP-13 was rather increased. These properties were similarly found in the mixture of dextran 1 (D). Therefore, it was confirmed that dextran 1 (D) was in the most preferable concentration range of 2.5 to 40 (w/v)%, which is also consistent with the MMP-3 gene expression level result. Dextran 5 (T) showed a significant MMP-13 gene increase inhibitory effect at 2 to 40 (w/v)% when administered alone, and dextran 5 (T) 4 and 40 (w/v)% were dex Tran 1 (D) 5(w/v)% and poloxamer 188 (P) 2 and 10(w/v)% also showed a significant inhibitory effect of increasing the MMP-13 gene.

폴록사머 188의 경우, 단독 실험군에서 5 내지 20(w/v)%에서 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었으나, 덱스트란과 혼합물로 투여하는 경우 2(w/v)% 역시 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다. 실시예 2에서의 세포 독성 실험 결과를 고려하면, 폴록사머 188(P)의 농도는 혼합 투여 시 2 내지 10(w/v)% 인 것이 바람직한 것으로 확인하였다. 이에 해당되는 P2, P10은 덱스트란 1 및 덱스트란 5와의 조합에서도 덱스트란 1 (D) 50(w/v)%의 조합을 제외하고는 모두 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 유도하였다. In the case of poloxamer 188, 5 to 20 (w/v)% of the MMP-13 gene was inhibited in the single experimental group, but 2 (w/v)% may also exhibit an effect when administered as a mixture with dextran. It was confirmed that there is. Considering the results of the cytotoxicity test in Example 2, it was confirmed that the concentration of poloxamer 188 (P) is preferably 2 to 10 (w/v)% when administered in combination. Corresponding to P2 and P10, even in combination with dextran 1 and dextran 5, except for the combination of dextran 1 (D) 50(w/v)%, all induced significant MMP-13 gene increase inhibitory effects.

실시예Example 4. IL-10/IL-6 4. IL-10/IL-6 발현 비를Expression ratio 통한 항염 효과 확인 Anti-inflammatory effect

실시예 3과 유사한 방법으로 24h 동안 염증유발물질인 rhIL-1α 와 시험물질(단일물, 이들의 혼합물)을 함께 처리시 IL-10/IL-6 발현 비를 확인하여 실험군의 항염 효과를 확인하였다. IL-10/IL-6 발현 비가 증가할수록 항염 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다. In a similar method to Example 3, when the inflammation-inducing substance rhIL-1α and the test substance (a single product, a mixture thereof) were treated together for 24 h, the expression ratio of IL-10/IL-6 was confirmed to confirm the anti-inflammatory effect of the experimental group. As the IL-10/IL-6 expression ratio increases, it can be determined that the anti-inflammatory effect is superior.

실험에 사용된 프라이머의 구성은 하기 표 5 에 나타내었으며, 대조군으로는 하우스키핑 유전자인 GAPDH를 사용하였다. 결과를 표 6a 내지 표 6b, 및 도 7 에 나타내었다.The configuration of the primers used in the experiment is shown in Table 5 below, and GAPDH, a housekeeping gene, was used as a control. The results are shown in Tables 6a to 6b and Fig. 7.

[표 5][Table 5]

해당 프라이머, SyBr green (SYBR Premix Ex Taq, Takara, RR420A) 그리고 주형을 혼합한 뒤, Real time RT-PCR (CFX 96 touch, Bio rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 intercalating 법에 의한 Real Time RT-PCR을 수행하였다. Ct값을 검량선에 적용하여 얻어지는 정량결과(유전자 발현량)는 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 정량결과로 나눈 값으로 표시하였다. After mixing the primer, SyBr green (SYBR Premix Ex Taq, Takara, RR420A) and the template, Real Time by intercalating method using Real time RT-PCR (CFX 96 touch, Bio rad, Hercules, CA, USA) RT-PCR was performed. The quantification result (gene expression level) obtained by applying the Ct value to the calibration curve was expressed as a value divided by the quantification result of GAPDH, the housekeeping gene.

[표 6a][Table 6a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 IL-10 / IL-6 유전자 발현 비 Expression ratio of IL-10 / IL-6 gene of dextran 1 (D), dextran 5 (T), poloxamer 188 (P) single substance in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24 h

[표 6b][Table 6b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 IL-10 / IL-6 유전자 발현 비Expression ratio of IL-10 / IL-6 gene of dextran 1 (D), dextran 5 (T) or poloxamer 188 (P) mixture in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24 h

표 6a 및 도 7 에 나타낸 바와 같이, 단일군 처리 실험인 덱스트란 1 (D)을 단독으로 처리한 군에서는 50(w/v)% 처리군을 제외하고는 IL-10/IL-6 발현비의 증가가 뚜렷하게 확인되지 않았으나, 폴록사머 188 (P) 1 내지 20 (w/v)% 처리군, 덱스트란 5 (T) 2 내지 20 (w/v)% 군에서는 유의적인 증가효과가 확인되었다. As shown in Table 6a and 7, in the group treated with dextran 1 (D) alone, which is a single group treatment experiment, IL-10/IL-6 expression ratio except for the 50(w/v)% treatment group The increase of was not clearly confirmed, but a significant increase effect was observed in the poloxamer 188 (P) 1 to 20 (w/v)% treatment group and the dextran 5 (T) 2 to 20 (w/v)% group. .

표 6b 및 도 7 에 나타낸 바와 같이, 혼합물 처리 실험인 덱스트란 1(D)의 혼합물 투여군 모두에서 유의적인 IL-10/IL-6 발현비의 증가 효과가 나타났으며, 폴록사머 188 (P) 및 덱스트란 5 (T) 와의 혼합 투여군에서도 모두 유의적인 증가가 나타나 혼합물에서의 항염효능이 탁월함을 확인하였다. As shown in Table 6b and Fig. 7, a significant effect of increasing the IL-10/IL-6 expression ratio was observed in all of the mixture administration groups of dextran 1 (D), which is a mixture treatment experiment, and poloxamer 188 (P) And dextran 5 (T) were also significantly increased in the mixed administration group, confirming the excellent anti-inflammatory effect in the mixture.

덱스트란 1 의 50(w/v)% 투여군에서 비록 IL-10/IL-6 발현비의 증가가 유의적이긴 하였으나 그 증가량이 두각을 나타내지 않았음을 고려하면, 골관절염 모델에서의 IL-10/IL-6 발현비 증가, 즉 항염 효과는 덱스트란 1 (D)의 농도를 증가시키는 것보다는 폴록사머 188 (P) 또는 덱스트란 5 (T)와의 혼합으로 투여하는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다. 특히 항염 효과는 덱스트란 1 (D) 5 및 50 (w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4 및 40(w/v)%, 폴록사머 188 (P) 2 및 10(w/v)%의 단독 투여군과 비교하여 이들의 혼합물 투여군이 대부분 현저하게 우수한 것으로 나타났으므로, 이를 통해 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5 (T), 폴록사머 188 (P) 혼합 투여의 우수성을 확인할 수 있다. Although the increase in the IL-10/IL-6 expression ratio was significant in the 50(w/v)% administration group of dextran 1, considering that the increase was not prominent, IL-10/ in the osteoarthritis model Increasing the IL-6 expression ratio, ie, anti-inflammatory effect, indicates that it is preferable to administer it in combination with poloxamer 188 (P) or dextran 5 (T) rather than increasing the concentration of dextran 1 (D). In particular, the anti-inflammatory effect is dextran 1 (D) 5 and 50 (w/v)%, dextran 5 (T) 4 and 40 (w/v)%, poloxamer 188 (P) 2 and 10 (w/v) Compared to the single administration group of %, these mixture administration groups were found to be mostly remarkably superior.Through this, the superiority of the mixed administration of dextran 1 (D), dextran 5 (T), and poloxamer 188 (P) can be confirmed. have.

실시예Example 5. 골관절염 모델에서의 2형 콜라겐(Type II Collagen) 및 5. Type II Collagen in osteoarthritis model and 아그리칸Agrican (Aggrecan) 의 생성량 증가 확인Confirm the increase in the amount of (Aggrecan) produced

골관절염 평가를 위한 지표 물질 중 2형 콜라겐과 아그리칸 단백질 생성량을 확인하기 위하여 rhIL-1α를 처리하기 1시간 전에 각각의 시험물질을 연골세포에 처리한 뒤 24 시간 동안 배양하였다. 2형 콜라겐과 아그리칸은 연골기질 조성물이므로, 이의 생성량이 증가되면 연골 기질 보호 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다. In order to confirm the production of type 2 collagen and agrican protein among indicator substances for osteoarthritis evaluation, each test substance was treated with chondrocytes 1 hour before treatment with rhIL-1α and cultured for 24 hours. Since type 2 collagen and agrican are cartilage substrate compositions, it can be determined that the cartilage matrix protective effect is excellent when the amount of the collagen is increased.

여기서 세포 상층액(배양액)을 회수하여 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액 만을 분석에 사용하였다. 원심분리된 세포 상층액을 이용하여 Aggrecan ELISA Kit (Rat Aggrecan ELISA Kit, Mybiosource, MBS261073)와 type II Collagen (Type II Collagen detection Kit, Multi-Species, Chondrex, 6018) 제품의 manual을 참조한 분석을 진행하였다. 정확한 분석을 위하여 전파장대의 ELISA reader (EPOCH 2 microplate reader, BioTek, Instruments, VT, USA)를 이용하여 각각 450nm와 490nm에서 흡광도를 측정한 후 검량선에 따라 2형 콜라겐과 아그리칸의 함량(ng/mL)을 정량하였다. Here, the cell supernatant (culture solution) was recovered, centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes, and only the supernatant was used for analysis. Analysis was performed by referring to the manual of Aggrecan ELISA Kit (Rat Aggrecan ELISA Kit, Mybiosource, MBS261073) and type II Collagen (Type II Collagen detection Kit, Multi-Species, Chondrex, 6018) products using the centrifuged cell supernatant. . For accurate analysis, the absorbance was measured at 450 nm and 490 nm using a radio field ELISA reader (EPOCH 2 microplate reader, BioTek, Instruments, VT, USA), respectively, and the contents of type 2 collagen and agrican according to the calibration curve (ng /mL) was quantified.

5.1 2형 콜라겐의 생성량 확인5.1 Confirmation of the production amount of type 2 collagen

덱스트란 1 (D), 덱스트란 5 (T), 폴록사머 188 (P) 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 2형 콜라겐의 생성량 결과를 표 7a 내지 표 7b 및 도 8에 나타내었다. Dextran 1 (D), dextran 5 (T), poloxamer 188 (P) alone or a mixture thereof treatment of type 2 collagen production results are shown in Tables 7a to 7b and Figure 8.

[표 7a] [Table 7a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 Type II Collagen 생성량Type II Collagen Production Amount of Dextran 1 (D), Dextran 5 (T), Poloxamer 188 (P) Single Product in Chondrocytes Treated with RhIL-1α for 24h

[표 7b][Table 7b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 Type II Collagen 생성량Type II Collagen Production Amount of Dextran 1 (D), Dextran 5 (T) or Poloxamer 188 (P) Mixture in Chondrocytes Treated with RhIL-1α for 24h

상기 표 7a 내지 표 7b, 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 덱스트란 1 (D) 5 내지 25(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 단독 투여군에서 염증유발 양성 대조군(PC) 대비 2형 콜라겐 합성 증가가 관찰되었다. 한편 덱스트란 1 (D) 50(w/v)% 은 단독 및 덱스트란 5 (T), 폴록사머 188 (P)과의 혼합 투여군 모두에서 염증유발 양성 대조군(PC) 대비 2형 콜라겐 합성 증가를 유도하지는 못한 것으로 나타났다. 이는, 실시예 3 에서 확인한 바와 같이 덱스트란 1 (D) 50(w/v)% 단독으로는 MMP-3, MMP-13 의 발현 증가를 억제하는 효과를 나타내지 않고 오직 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)% 과의 혼합에서만 MMP-3, MMP-13 의 발현 증가를 억제할 수 있음을 고려하면, 덱스트란 1 (D)은 40(w/v)% 이하로 단독 또는 혼합 사용하는 것이 바람직하다는 것을 보여주는 결과이다. 특히, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)%와 혼합 투여 시에 염증유발 양성 대조군(PC) 대비 2형 콜라겐 합성이 유의하게 증가하였다.As shown in Tables 7a to 7b, and Fig. 8, inflammation in the group administered dextran 1 (D) 5 to 25 (w/v)%, dextran 5 (T) 4 to 40 (w/v)% alone An increase in type 2 collagen synthesis was observed compared to the induced positive control (PC). On the other hand, dextran 1 (D) 50(w/v)% showed an increase in type 2 collagen synthesis compared to the positive control group (PC) in both groups administered with dextran 5 (T) and poloxamer 188 (P) alone. It was found that it did not induce. This, as confirmed in Example 3, dextran 1 (D) 50 (w / v)% alone did not show the effect of inhibiting the increase in the expression of MMP-3, MMP-13, only poloxamer 188 (P) 2 Considering that the increase in the expression of MMP-3 and MMP-13 can be suppressed only when mixed with 10 (w/v)%, dextran 1 (D) is 40 (w/v)% or less alone or mixed. Results show that it is desirable to use. In particular, when administered in combination with dextran 1 (D) 5 (w/v)% and dextran 5 (T) 4 to 40 (w/v)%, the synthesis of type 2 collagen was significant compared to the positive control for inflammation (PC). Increased.

폴록사머 188(P)의 경우 2(w/v)% 처리군을 제외한 10(w/v)%, 20(w/v)% 단독 처리군에서 모두 2형 콜라겐 합성 증가 효과가 관찰되지 않았으며, 농도를 증가시킬수록 2형 콜라겐 합성은 더욱 감소함을 확인하였다. 그러나 폴록사머 188 (P) 2 또는10(w/v)% 를 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 또는 덱스트란 5 (T) 40(w/v)% 와 혼합하여 투여하는 경우에는 2형 콜라겐 합성 증가 효과가 유의하게 나타났다. 이러한 결과는 골관절염의 2형 콜라겐 합성에 있어서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T)를 단독으로 처리 가능하나, 폴록사머 188 (P)은 2(w/v)%를 제외하고는 단독처리는 적합하지 않고, 폴록사머 188(P)과 덱스트란 1 (D) 또는 덱스트란 5 (T)의 혼합 투여가 2형 콜라겐 합성을 효과적으로 유도할 수 있음을 나타낸다. In the case of poloxamer 188(P), no effect of increasing type 2 collagen synthesis was observed in both 10(w/v)% and 20(w/v)% treatment groups except for the 2(w/v)% treatment group. It was confirmed that, as the concentration increased, the synthesis of type 2 collagen further decreased. However, when poloxamer 188 (P) 2 or 10 (w/v)% is administered in combination with dextran 1 (D) 5 (w/v)% or dextran 5 (T) 40 (w/v)% Was found to have a significant effect of increasing type 2 collagen synthesis. These results indicate that dextran 1 (D) and dextran 5 (T) can be treated alone in the synthesis of type 2 collagen in osteoarthritis, but poloxamer 188 (P) is alone except for 2 (w/v)%. Treatment is not suitable, indicating that the mixed administration of poloxamer 188(P) and dextran 1 (D) or dextran 5 (T) can effectively induce type 2 collagen synthesis.

앞서 실시예 4에서는 단독 투여와 비교하여 폴록사머 188과 덱스트란 1 또는 덱스트란 5의 혼합 투여가 IL-10/IL-6 의 유전자 발현 비율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였으므로, 이와 같은 결과를 종합하면, 골관절염에서의 염증 반응을 완화시키는 것과 동시에 콜라겐 합성을 촉진하기 위해서는 덱스트란 1, 덱스트란 5 또는 폴록사머 188 의 혼합물을 투여하는 것이 바람직한 것을 확인하였다.In Example 4 above, it was confirmed that the mixed administration of poloxamer 188 and dextran 1 or dextran 5 can significantly increase the gene expression ratio of IL-10/IL-6 compared to the single administration, so the same result Taken together, it was confirmed that it is preferable to administer a mixture of dextran 1, dextran 5, or poloxamer 188 in order to alleviate the inflammatory response in osteoarthritis and at the same time promote collagen synthesis.

5.2 5.2 아그리칸Agrican 함량 정량 결과 확인 Confirmation of content quantification result

덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 아그리칸 생성량 결과를 표 8a 내지 표 8b, 및 도 9에 나타내었다. Dextran 1, dextran 5, poloxamer 188 single or aggrecan production results according to the treatment of a mixture thereof are shown in Tables 8a to 8b, and Fig. 9.

[표 8a] [Table 8a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 아그리칸 생성량Dextran 1 (D), dextran 5 (T), poloxamer 188 (P) single substance agrican production in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24h

[표 8b] [Table 8b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 아그리칸 생성량Agrican production amount of a mixture of dextran 1 (D), dextran 5 (T) or poloxamer 188 (P) in chondrocytes treated with RhIL-1α for 24 h

상기 표 8a 및 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 덱스트란 1 (D) 5 내지 25(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4(w/v)%, 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)% 단독 처리군에서 아그리칸 생성량이 염증유발 양성 대조군(PC)과 비교하여 유의하게 증가함을 확인하였다. 한편 덱스트란 1 (D) 50(w/v)%, 폴록사머 188 (P) 20(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 20 내지 40(w/v)% 단독 투여군은 아그리칸 생성 증가를 유도하지 못한 것으로 확인하였다. As can be seen in Table 8a and 9, dextran 1 (D) 5 to 25 (w/v)%, dextran 5 (T) 4 (w/v)%, poloxamer 188 (P) 2 It was confirmed that the amount of agrican production was significantly increased in the to 10 (w/v)% alone treatment group compared to the positive control for inflammation induction (PC). On the other hand, dextran 1 (D) 50 (w / v)%, poloxamer 188 (P) 20 (w / v)%, dextran 5 (T) 20 to 40 (w / v)% alone administered group is agrican It was confirmed that it did not induce an increase in production.

표 8b 및 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혼합 투여군 중에서는 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%, 또는 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 의 혼합 투여군에서 아그리칸 생성량이 염증유발 양성 대조군(PC)과 비교하여 유의하게 증가하였고, 덱스트란 1 (D) 50(w/v)% 와는 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%와의 혼합투여군에서만 아그리칸 생성량이 유의하게 증가하였다. 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 와 폴록사머 188(P) 2 내지 10(w/v)% 간의 혼합 투여군에서도 염증유발 양성 대조군(PC)과 비교하여 아그리칸 생성량이 유의하게 증가함을 확인하였다. 특히, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%는 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)%와의 혼합 투여시 단일투여에 비해 유의하게 아그리칸 생성량이 증가함을 확인하였다.As can be seen in Table 8b and Figure 9, in the mixed administration group, dextran 1 (D) 5 (w / v)% and poloxamer 188 (P) 2 (w / v)%, or dextran 5 (T ) In the mixed administration group of 4 to 40 (w/v)%, the amount of agrican was significantly increased compared to the positive control (PC) for inflammation, and poloxamer was different from that of dextran 1 (D) 50 (w/v)%. Only in the mixed administration group with 188 (P) 2(w/v)%, the amount of agrican significantly increased. In the mixed administration group between dextran 5 (T) 4 to 40 (w/v)% and poloxamer 188 (P) 2 to 10 (w/v)%, the amount of agrican production compared to the positive control (PC) It was confirmed that it increased significantly. In particular, dextran 1 (D) 5 (w / v)% and poloxamer 188 (P) 2 (w / v)% is single when administered in combination with dextran 5 (T) 4 to 40 (w / v)% It was confirmed that the amount of agrican production significantly increased compared to the administration.

앞서 실시예 5.1에서 확인한 2형 콜라겐 합성의 결과를 함께 고려하는 경우, 골관절염 모델에서 2형 콜라겐 합성을 증가시키고 아그리칸의 생성을 증가시키기 위해서는 덱스트란 1 (D) 5 내지 25(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4(w/v)%, 또는 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%를 단독 투여하거나, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 를 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)%와 혼합 투여하거나, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%을 폴록사머 188 (P) 2 (w/v)%와 혼합 투여하는 경우가 바람직한 것으로 확인되었다. 또한 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 은 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 와의 조합에서, 특히 덱스트란 5 40(w/v)% 의 경우 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)% 과의 조합에서 2형 콜라겐 합성과 아그리칸의 생성을 유의하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다. When the results of the synthesis of type 2 collagen identified in Example 5.1 are considered together, dextran 1 (D) 5 to 25 (w/v) in order to increase the synthesis of type 2 collagen and increase the production of agrican in the osteoarthritis model )%, dextran 5 (T) 4 (w/v)%, or poloxamer 188 (P) 2 (w/v)% administered alone, or dextran 1 (D) 5 (w/v)% Dextran 5 (T) 4-40 (w/v)% and mixed administration, or dextran 1 (D) 5(w/v)% mixed with poloxamer 188 (P) 2 (w/v)% It has been found to be preferable. In addition, dextran 5 (T) 4 to 40 (w / v)% in combination with dextran 1 (D) 5 (w / v)%, in particular in the case of dextran 5 40 (w / v)% Poloxamer 188 (P) It was confirmed that in combination with 2 to 10 (w/v)%, the synthesis of type 2 collagen and the production of agrican can be significantly increased.

상기와 같은 결과를 종합하면 골관절염 치료에 있어서, 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머 188를 사용할 수 있으나, 이들의 단독 또는 모든 조합이 골관절염에 치료 효과를 나타내는 것은 아니며, 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머 188의 농도 조합에 따라 독성 및 효과가 상이하게 나타날 수 있으므로 이의 적절한 조합을 도출하는 것이 중요하다는 것을 확인할 수 있다. Taking the above results together, in the treatment of osteoarthritis, dextran 1, dextran 5, and poloxamer 188 can be used, but these alone or in all combinations do not show a therapeutic effect on osteoarthritis, dextran 1, dextran It can be seen that it is important to derive an appropriate combination thereof because toxicity and effect may appear differently depending on the combination of concentrations of 5 and poloxamer 188.

Claims (14)

4000 Da 내지 6000Da 의 분자량을 갖는 덱스트란을 2 내지 30 (w/v)% 농도로 포함하는, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
Pharmaceuticals for the prevention or treatment of degenerative joint diseases or degenerative connective tissue diseases caused by degenerative changes in the intervertebral discs, ligaments, skin, tendons, including dextran having a molecular weight of 4000 Da to 6000 Da at a concentration of 2 to 30 (w/v)% Ever composition.
제1항에 있어서, 상기 덱스트란은 4,500 내지 5,500 Da 의 분자량을 갖는 것인, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the dextran has a molecular weight of 4,500 to 5,500 Da, for the prevention or treatment of degenerative joint disease or degenerative connective tissue disease caused by degenerative changes in the intervertebral discs, ligaments, skin, and tendons.
4000 Da 내지 6000Da 의 분자량을 갖는 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 덱스트란의 농도는 2 내지 40 (w/v)%, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 20 (w/v)%인, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A mixture of dextran and poloxamer having a molecular weight of 4000 Da to 6000 Da is included as an active ingredient, and the concentration of the dextran is 2 to 40 (w/v)%, and the concentration of the poloxamer is 1 to 20 (w/ v)%, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative joint disease or degenerative connective tissue disease caused by degenerative changes in the intervertebral discs, ligaments, skin, and tendons.
제3항에 있어서, 상기 폴록사머는 폴록사머 101， 폴록사머 105, 폴록사머 105 벤조에이트， 폴록사머 108, 폴록사머 122, 폴록사머 123, 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 182, 폴록사머 182 디벤조에이트, 폴록사머 183, 폴록사머 184, 폴록사머 185, 폴록사머 188, 폴록사머 212, 폴록사머 215, 폴록사머 217, 폴록사머 231, 폴록사머 234, 폴록사머 235, 폴록사머 237, 폴록사머 238, 폴록사머 282, 폴록사머 284, 폴록사머 288, 폴록사머 331, 폴록사머 333, 폴록사머 334, 폴록사머 335, 폴록사머 338, 폴록사머 401, 폴록사머 402, 폴록사머 403 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
The method of claim 3, wherein the poloxamer is poloxamer 101, poloxamer 105, poloxamer 105 benzoate, poloxamer 108, poloxamer 122, poloxamer 123, poloxamer 124, poloxamer 181, poloxamer 182, poloxamer 182 Dibenzoate, Poloxamer 183, Poloxamer 184, Poloxamer 185, Poloxamer 188, Poloxamer 212, Poloxamer 215, Poloxamer 217, Poloxamer 231, Poloxamer 234, Poloxamer 235, Poloxamer 237, Polox Samer 238, Poloxamer 282, Poloxamer 284, Poloxamer 288, Poloxamer 331, Poloxamer 333, Poloxamer 334, Poloxamer 335, Poloxamer 338, Poloxamer 401, Poloxamer 402, Poloxamer 403 and Poloxamer 407 That is selected from the group consisting of, the pharmaceutical composition.
i) 4000 Da 내지 6000Da 의 분자량을 갖는 덱스트란 및
ii) 800 내지 1200 Da 의 분자량을 갖는 덱스트란;의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 i) 덱스트란의 농도는 2 내지 40(w/v)%, 상기 ii) 덱스트란의 농도는 2.5 내지 40(w/v)% 인, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
i) Dextran having a molecular weight of 4000 Da to 6000 Da and
ii) a mixture of dextran having a molecular weight of 800 to 1200 Da; as an active ingredient, the concentration of i) dextran is 2 to 40 (w/v)%, and ii) the concentration of dextran is 2.5 to 40(w/v)% phosphorus, a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative joint disease or degenerative connective tissue disease caused by degenerative changes in the intervertebral discs, ligaments, skin, and tendons.
제5항에 있어서, 상기 i) 덱스트란은 4,500 내지 5,500 Da 의 분자량을 갖는 것인, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition of claim 5, wherein i) dextran has a molecular weight of 4,500 to 5,500 Da, for the prevention or treatment of degenerative joint disease or degenerative connective tissue disease caused by degenerative changes in intervertebral discs, ligaments, skin, and tendons .
삭제delete 줄기세포;
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물;을 포함하는 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.Stem Cells;
The pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative joint disease or degenerative connective tissue disease caused by degenerative changes in the intervertebral discs, ligaments, skin, and tendons, including the composition of any one of claims 1 to 6. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete

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