KR102169782B1 - Cell spheroid formed by co-culture of human gingiva-derived stem cell and osteoprecursor cell and increasing method of VEGF production thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포의 혈관내피성장인자 생산을 증가시키는 방법, 상기 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 또는 골융합 촉진용 조성물, 및 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 세포 스페로이드를 형성하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포 유래의 VEGF 생산량을 증가시킬 수 있고, 상기 공동배양에 의해 세포 스페로이드를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 세포 스페로이드로부터 VEGF 함량이 향상된 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 치아 내 골융합을 촉진시켜서 골질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 허혈성 질환을 혈관신생 촉진에 의해 효과적으로 치료할 수 있다.The present invention is a method for increasing the production of vascular endothelial growth factor of stem cells by co-culturing gum-derived stem cells and bone cell precursors, a composition for treating ischemic diseases comprising the vascular endothelial growth factor as an active ingredient, or a composition for promoting bone fusion , And gum-derived stem cells and bone cell precursors are co-cultured to form cellular spheroids.
According to the present invention, it is possible to increase the production of VEGF derived from stem cells by co-culturing gum-derived mesenchymal stem cells and bone cell precursors, and cell spheroids can be prepared by the co-culture. In addition, by using a composition containing as an active ingredient a culture medium having an improved VEGF content from cell spheroids prepared according to the present invention, bone fusion can be promoted to effectively treat bone diseases, and ischemic diseases can be effectively treated by promoting angiogenesis. It can be cured.

Description

인간 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드 및 이로부터 혈관내피 성장인자의 생산량을 증가시키는 방법{Cell spheroid formed by co-culture of human gingiva-derived stem cell and osteoprecursor cell and increasing method of VEGF production thereof}Cell spheroid formed by co-culture of human gingiva-derived stem cell and osteoprecursor cell and cell spheroid formed by co-culture of human gingiva-derived stem cells and osteoprecursor cells and increasing method of VEGF production thereof}

본 발명은 인간 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드 및 이로부터 혈관내피 성장인자(VEGF)의 생산량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포의 혈관내피성장인자 생산을 증가시키는 방법, 상기 혈관내피성장인자를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 치료용 조성물 또는 골융합 촉진용 조성물, 및 잇몸-유래 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 세포 스페로이드를 형성하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cell spheroid formed by co-culturing human gum-derived stem cells and bone progenitor cells, and a method of increasing the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) therefrom. More specifically, the present invention is a method for increasing the production of vascular endothelial growth factor of stem cells by co-culturing gum-derived stem cells and bone cell precursors, a composition for the treatment of ischemic diseases comprising the vascular endothelial growth factor as an active ingredient Or it relates to a composition for promoting bone fusion, and a method for forming a cell spheroid by co-culturing the gum-derived stem cells and bone cell precursors.

세포의 공동-배양은 줄기세포를 포함하는 세포 치료제의 개발에 오랫동안 사용되어 왔고 기능성을 향상시키는 것으로 알려져있다. 1차 간세포(primary hepatocyte)와 간 간성상세포(hepatic stellate cell)를 사용하여 형성된 스페로이드는 한 종류의 세포를 단일배양하여 형성시킨 세포 스페로이드에 비해 더 많은 알부민을 생산한다(비특허문헌 1). 부가적으로, 공동-배양된 이질적인 세포 스페로이드의 효소 활성이 단일 배양된 세포 스페로이드에 비해 높다. 췌장섬 유래 1차 세포 및 간세포는 3차원 공동-배양 모델 연구에 사용되어 왔으며, 다른 형태인 2 종류의 세포는 스페로이드 형태로서 서로의 기능성을 보완해 준다는 연구 결과가 보고되고 있으며 이러한 효과는 더 많은 수의 단일 세포 배양에 비해 높은 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).Cell co-culture has long been used in the development of cell therapy products including stem cells and is known to improve functionality. Spheroids formed using primary hepatocytes and hepatic stellate cells produce more albumin than cell spheroids formed by single culture of one type of cell (Non-Patent Document 1 ). Additionally, the enzymatic activity of co-cultured heterogeneous cellular spheroids is high compared to single cultured cellular spheroids. Pancreatic islet-derived primary cells and hepatocytes have been used in three-dimensional co-culture model studies, and studies have reported that two types of cells, which are different types, complement each other's functions as spheroids. It is known to be higher than that of a large number of single cell cultures (Non-Patent Document 2).

최근에는, 줄기세포 자체보다는 줄기세포를 배양하여 생산되는 배양액 내 다양한 생리활성 인자가 포함되어 있음을 확인하여 이를 이용한 다양한 치료제가 개발 중이고(비특허문헌 3), 줄기세포에 대한 다양한 배양 조건(저산소 환경 배양, 세포 자극 인자의 처리 등)을 적용하여 배양액을 제조한 후 이의 질환 치료 효과에 대한 실험이 활발히 진행되고 있다. 또한, 줄기세포의 용도에 있어서 세포 재생뿐만 아니라 일시적인 파라크린(paracrine) 활성까지 확대되고 있다(비특허문헌 4). 중간엽 줄기세포는 성장인자, 사이토카인, 및 세포외 기질 금속단백분해효소를 포함하는 다양한 단백질을 분비하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 5). 혈관내피, 섬유아세포, 및 간세포 성장인자를 포함하는 다양한 성장인자들이 중간엽 줄기세포로부터 분비된다는 것이 알려져 있고(비특허문헌 6, 비특허문헌 7), 중간엽 줄기세포의 조정 배지(Conditioned medium)가 내피세포의 성장에 영향을 준다는 보고가 알려져 있다(비특허문헌 8). 특히, 혈관내피성장인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor)의 분비는 중간엽 줄기세포-조정 배지의 분석에 의해 입증되었다(비특허문헌 9).Recently, it was confirmed that various physiologically active factors are contained in the culture medium produced by culturing stem cells rather than the stem cells themselves, and various therapeutic agents using them are being developed (Non-Patent Document 3), and various culture conditions for stem cells (hypoxic After preparing a culture solution by applying environmental culture, treatment of cell stimulating factors, etc.), experiments on its disease treatment effect are being actively conducted. In addition, in the use of stem cells, not only cell regeneration but also temporary paracrine activity is being expanded (Non-Patent Document 4). Mesenchymal stem cells are known to secrete various proteins including growth factors, cytokines, and extracellular matrix metalloproteinases (Non-Patent Document 5). It is known that various growth factors including vascular endothelial, fibroblast, and hepatocyte growth factors are secreted from mesenchymal stem cells (Non-Patent Document 6, Non-Patent Document 7), and conditioned medium for mesenchymal stem cells. Is known to affect the growth of endothelial cells (Non-Patent Document 8). In particular, the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor) was demonstrated by analysis of mesenchymal stem cells-regulated medium (Non-Patent Document 9).

하지만, 중간엽 줄기세포로부터 혈관내피성장인자의 분비를 증가시키는 세포의 공동배양 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.However, little is known about a method of co-culture of cells that increases the secretion of vascular endothelial growth factor from mesenchymal stem cells.

대한민국 등록특허 제 10-851783호.Korean Patent Registration No. 10-851783. 대한민국 등록특허 제 10-1274930호.Korean Patent Registration No. 10-1274930.

Wong SF et al., 2011, Biomaterials, 32: 8087.Wong SF et al., 2011, Biomaterials, 32: 8087. Jun Y et al., 2013, Biomaterials, 34: 3784.Jun Y et al., 2013, Biomaterials, 34: 3784. Fox et al., 2007, Br. J. Haematol., 137: 491.Fox et al., 2007, Br. J. Haematol., 137: 491. Baraniak PR et al., 2010, Regen Med, 5:121.Baraniak PR et al., 2010, Regen Med, 5:121. Chan JK et al., 2016, Methods Mol Biol, 1416:467.Chan JK et al., 2016, Methods Mol Biol, 1416:467. Liang X et al., 2014, Cell Transplant, 23: 1045. Liang X et al., 2014, Cell Transplant, 23: 1045. Tang Y et al., 2016, Int J Hepatol, 545: 2487.Tang Y et al., 2016, Int J Hepatol, 545: 2487. Liang X et al., 2014, Cell Transplant, 23: 1045.Liang X et al., 2014, Cell Transplant, 23: 1045. Kinnaird T et al., 2004, Circulation, 109: 1543Kinnaird T et al., 2004, Circulation, 109: 1543 안재훈 et al.,1999, 대한정형외과학회지, 34: 631.Jaehoon Ahn et al., 1999, Journal of the Korean Orthopedic Society, 34: 631. Midy V and Plouet J, 1994, Biochem Biophys Res Commun 199(1): 380.Midy V and Plouet J, 1994, Biochem Biophys Res Commun 199(1): 380. Jin SH et al., 2015, J Periodontal Res, 50:461.Jin SH et al., 2015, J Periodontal Res, 50:461.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술 상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 3차원 세포 배양방법에 근거하여 줄기세포와 골전구체 세포를 마이크로웰에서 공동배양하여 세포 스페로이드를 구축하고, 줄기세포의 파라크린 효과를 향상시켜서 줄기세포 유래의 VEGF 분비량을 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.The present invention was conceived to solve the problems of the prior art as described above, and an object of the present invention is to construct a cell spheroid by co-culturing stem cells and bone progenitor cells in microwells based on a three-dimensional cell culture method. And, it is to provide a method of increasing the secretion amount of VEGF derived from stem cells by improving the paracrine effect of stem cells.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems that are not mentioned may be clearly understood by those of ordinary skill in the art from the following description.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 잇몸-유래 줄기세포와 골전구체 세포를 다양한 비율로 공동-배양하여 세포 스페로이드를 형성하였고, 상기 세포 스페로이드로부터의 VEGF 생산량을 측정하여 줄기세포 비율 증가에 따른 VEGF 생산량 증가를 검증하였다.In order to solve the above problem, the present inventors co-cultured gum-derived stem cells and bone progenitor cells at various ratios to form cell spheroids, and by measuring the amount of VEGF production from the cell spheroids, Accordingly, the increase in VEGF production was verified.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.Hereinafter, various embodiments described herein are described with reference to the drawings. In the following description, for a thorough understanding of the invention, various specific details, such as specific forms, compositions and processes, etc. are set forth. However, certain embodiments may be practiced without one or more of these specific details, or with other known methods and forms. In other instances, well-known processes and manufacturing techniques have not been described in specific details in order not to unnecessarily obscure the present invention. Reference throughout this specification to “one embodiment” or “an embodiment” means that a particular feature, form, composition, or characteristic described in connection with the embodiment is included in one or more embodiments of the invention. Thus, the context of “in one embodiment” or “an embodiment” expressed in various places throughout this specification does not necessarily represent the same embodiment of the invention. Additionally, particular features, shapes, compositions, or properties may be combined in one or more embodiments in any suitable manner.

본 발명의 목적은 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 3차원 형태로 형성된 세포 스페로이드를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a cell spheroid formed in a three-dimensional shape by co-culturing gum-derived mesenchymal stem cells and bone progenitor cells.

본 발명의 다른 목적은 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포의 혼합 비율을 조절하여 공동배양함으로써 VEGF 분비량이 향상된 세포 스페로이드를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cell spheroid with improved VEGF secretion by co-culture by adjusting the mixing ratio of gum-derived mesenchymal stem cells and bone progenitor cells.

본 발명의 또 다른 목적은 VEGF 함량이 증가된 세포 스페로이드 배양액을 유효 성분으로 포함하는 골 융합 촉진용 조성물 또는 허혈성 질환 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for promoting bone fusion or a composition for treating ischemic diseases comprising a cell spheroid culture medium having an increased VEGF content as an active ingredient.

본 발명의 일 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 잇몸 유래의 줄기세포이고, 상기 공동배양에 의한 성장인자 단백질의 생산량은 중간엽 줄기세포 단독배양에 의한 생산량에 비해 증가되었으며, 상기 성장인자 단백질의 생산량은 골전구체 세포에 대한 중간엽 줄기세포의 비율(중간엽 줄기세포: 골전구체 세포)에 따라 증가하며, 상기 비율은 1:3 내지 3:1이며, 상기 성장인자 단백질은 혈관내피성장인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor), 섬유아세포 성장인자(FGF, Fibroblast Growth Factor), 및 간세포 성장인자(HGF, Hepatocyte Growth Factor)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법을 제공하였다.In one embodiment of the present invention, a method of increasing growth factor protein production of mesenchymal stem cells by co-culturing mesenchymal stem cells and bone progenitor cells is provided. In the above embodiment, the mesenchymal stem cells are stem cells derived from human gums, and the amount of growth factor protein produced by the co-culture was increased compared to the production amount obtained by culturing the mesenchymal stem cells alone, and the production amount of the growth factor protein Increases according to the ratio of mesenchymal stem cells to bone progenitor cells (mesenchymal stem cells: bone progenitor cells), the ratio is 1:3 to 3:1, and the growth factor protein is vascular endothelial growth factor (VEGF , Vascular Endothelial Growth Factor), Fibroblast Growth Factor (FGF), and Hepatocyte Growth Factor (HGF), which is one or more selected from the group consisting of, increasing growth factor protein production of mesenchymal stem cells Provided a way to do.

본 발명의 다른 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 줄기세포 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하고, 상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌질환, 허혈성 신질환, 허혈성 폐질환, 사지의 허혈성 질환, 버거스병, 하지동맥 폐색증, 뇌졸중, 뇌경색, 허혈성 심근증, 심근경색증, 허혈성 심부전 및 폐색성 동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 허혈성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하였다.In another embodiment of the present invention, a pharmaceutical composition for preventing or treating ischemic diseases comprising a stem cell culture medium obtained by co-culturing mesenchymal stem cells and bone progenitor cells as an active ingredient is provided. In the above embodiment, the stem cell culture medium contains any one or more growth factor proteins selected from the group consisting of vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), and hepatocyte growth factor (HGF), and the ischemic The disease is any one selected from the group consisting of ischemic brain disease, ischemic kidney disease, ischemic lung disease, limb ischemic disease, Burgers disease, lower limb artery occlusion, stroke, cerebral infarction, ischemic cardiomyopathy, myocardial infarction, ischemic heart failure, and obstructive arteriosclerosis. , To provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of ischemic diseases.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 치아 내 골융합 촉진용 조성물을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 줄기세포 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 성장인자 단백질을 포함하는 것인, 치아 내 골융합 촉진용 조성물을 제공하였다.In another embodiment of the present invention, there is provided a composition for promoting bone fusion in teeth comprising a stem cell culture solution obtained by co-culturing mesenchymal stem cells and bone progenitor cells as an active ingredient. In the above embodiment, the stem cell culture medium contains any one or more growth factor proteins selected from the group consisting of vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), and hepatocyte growth factor (HGF), A composition for promoting bone fusion in teeth was provided.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 중간엽 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 혼합하여 공동배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포가 결합된 세포 스페로이드(cell spheroid)의 제조 방법을 제공하였다. 상기 구체예에서, 상기 중간엽 줄기세포는 잇몸 유래이고, 상기 중간엽 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1이며, 상기 세포 스페로이드는 줄기세포능(stemness)을 유지하고 있으며, 상기 공동배양은 오목한 표면에서 실시하는 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포가 결합된 세포 스페로이드(cell spheroid)의 제조 방법을 제공하였다.In another embodiment of the present invention, preparation of a cell spheroid in which mesenchymal stem cells and bone progenitor cells are combined, comprising the step of mixing and co-culturing mesenchymal stem cells and osteoprecursor cells The method was provided. In the above embodiment, the mesenchymal stem cells are derived from gums, the mixing ratio of the mesenchymal stem cells and osteoprecursor cells is 1:3 to 3:1, and the cell spheroid is stem cell ability (stemness ), and the co-cultivation is performed on a concave surface, and a method for producing a cell spheroid in which mesenchymal stem cells and bone progenitor cells are bound is provided.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be made by incorporating it into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.

본 발명의 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부 외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부 외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제에 사용되는 성분, 예를 들어 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 중점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산 인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.The composition of the present invention may be formulated in a parenteral dosage form. The parenteral dosage form may be an injection or an external preparation for skin. The external preparation for skin may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal delivery patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof. The external preparations for skin are ingredients commonly used in external preparations for skin such as cosmetics or pharmaceuticals, such as aqueous ingredients, oily ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, heavyweights, UV absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, Fragrances, colorants, various skin nutrients, or combinations thereof, and may be appropriately formulated as needed. The external preparations for skin include metal sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, bellapamil, licorice extract, glavidine, and caline. Hot water extract of fruit, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glytilithic acid, tranexamic acid and derivatives or salts thereof, vitamin C, ascorbic acid magnesium phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars such as trehalose can also be appropriately blended.

세포 배양은 바이오 연구 분야에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환의 연구에까지 광범위하게 이용되고 있다. 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 세포 배양 방법은 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다. 하지만, 단층 세포 배양 방법은 2차원적 세포배양법에 의해 성장하는 세포는 세포외기질(extracellular matrix)에 부착되어 3차원적 생체조직 환경에서 성장하는 세포와 많은 차이점을 나타낸다. 따라서, 2차원적 및 3차원적 세포배양은 전반적인 형태학적 차이를 나타내며, 또한 통상적인 2차원적 세포배양을 통하여 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상이 실제 생체 조직 환경에서 일어나는 현상과 크게 다르므로, 2차원적 세포배양 방법은 3차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 문제점을 나타내고 있다. 특히, 세포가 생체 내와 동등한 3차원 조직을 구축할 수 없고, 세포가 체내에서 갖고 있는 특이적인 기능을 장시간 유지할 수 없다. 이와 같은 2차원적 세포배양에서 나타나는 문제점을 해결하기 위하여 생체 내와 동등한 기능을 갖는 세포의 3차원 조직인 스페로이드의 배양이 주목을 받고 있다. 특히, 줄기세포 기술이 발전함에 따라 배아줄기세포를 3차원으로 스페로이드 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러가지 방법이 시도되고 있다. Cell culture is the most basic research method in the field of bio research, and is widely used not only for the function of living organisms, but also for the study of human diseases. The cell culture method most commonly used to date is to culture cells on a two-dimensional surface. However, the single-layer cell culture method shows a number of differences from cells grown in a three-dimensional living tissue environment by attaching cells to an extracellular matrix to the cells grown by the two-dimensional cell culture method. Therefore, two-dimensional and three-dimensional cell culture shows overall morphological differences, and there are many types of receptor expression, gene transcriptional regulation, cell migration and apoptosis, etc., which occur through conventional two-dimensional cell culture. Since complex life phenomena are significantly different from those occurring in an actual living tissue environment, the two-dimensional cell culture method presents a problem in that it cannot accurately reflect the physiological environment of a living body in which cells grow in three dimensions. In particular, cells cannot construct a three-dimensional tissue equivalent to that in a living body and cannot maintain a specific function of cells in the body for a long time. In order to solve the problems occurring in such two-dimensional cell culture, the culture of spheroids, which is a three-dimensional tissue of cells having the same function as in vivo, is attracting attention. In particular, with the development of stem cell technology, various methods have been attempted to cultivate embryonic stem cells in three dimensions and apply them to the study of various differentiation mechanisms.

출원서 내 특별한 정의가 없으면 본 출원서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.Unless there is a specific definition in the application, all scientific and technical terms used in this application have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the present invention belongs.

본 발명에서 "2차 배양"은 줄기세포 배양에 통상적으로 사용하던 방식으로서 배양 접시(페트리 디쉬) 상에서 줄기세포를 배양하는 것으로서 단일층 배양(monolayer culture)으로도 불리고, "3차 배양"은 배양 접시가 아닌 배양 배지가 담긴 플라스크에서 적절한 교반 하에 배양하는 것으로서, 스피너 배양(spinner culture)으로도 불린다. In the present invention, "secondary culture" is a method commonly used for culturing stem cells, which is a method of culturing stem cells on a petri dish (petri dish), which is also called monolayer culture, and "tertiary culture" is a culture It is cultured under appropriate agitation in a flask containing a culture medium other than a dish, and is also called spinner culture.

본 발명에서 "세포 스페로이드"는 세포 배양시 세포들이 3차원 형태로 뭉쳐서 형성된 세포의 집합체이다. 최근에는 생체 내와 동등한 기능을 갖는 3차원 세포 조직인 스페로이드(spheroid)의 배양이 주목을 받고 있다. 암을 모사하기 위한 세포 응집(cell aggregation)을 유도하기도 하고, 당뇨 치료를 위한 인슐린의 정상분비를 유도하기 위해서 췌도 세포를 이식함에 있어 응집된 세포를 이식하는 방법 등이 쓰이고 있어 스페로이드의 대량 생산이 요구되고 있다. 또한, 줄기세포 연구가 성숙됨에 따라 배아 줄기세포를 3차원 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러 가지 방법이 시도되고 있다.In the present invention, a "cell spheroid" is an aggregate of cells formed by lumping cells together in a three-dimensional form during cell culture. Recently, the cultivation of spheroids, which are three-dimensional cellular tissues having the same function as in vivo, has attracted attention. In order to induce cell aggregation to mimic cancer and to induce normal secretion of insulin for diabetes treatment, a method of transplanting aggregated cells is used in transplanting islet cells. Is being demanded. In addition, as stem cell research matures, various methods have been attempted to apply three-dimensional culture of embryonic stem cells to the study of various differentiation mechanisms.

한편, 줄기세포를 배양하게 되면 줄기세포는 배양액 내로 다양한 물질들을 분비한다. 이러한 줄기세포 배양액은 줄기세포가 분비하는 물질의 총칭으로 다양한 성장인자 단백질을 포함하는 다양한 물질을 포함하고 있으며, autocrine, paracrone, 및 endocrine 등의 기능을 통해 세포 치료에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 이 배양액은 여러 연구에서 상당한 생화학적 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 최근에는 이와 같이 줄기세포를 배양하여 유효물질을 극대화시킨 줄기세포 배양액을 이용한 다양한 용도의 개발이 시도되고 있다. 현재까지 의약품 및 화장료 조성물에 많이 사용되고 있는 인간 유래 지방줄기세포 배양액 추출물(Human adipocyte conditioned media extracts)은 지방조직에서 지방을 제거한 세포를 여러 세대 배양해 줄기세포를 분리해 낸 후, 줄기세포 배양액으로부터 줄기세포가 만들어낸 단백질을 얻을 수 있다. 이 단백질 혼합물에는 VEGF(혈관내피성장인자), TGF(형질전환성장인자), HGF(간세포증식인자), FGF(섬유아세포성장인자), IGF(인슐린유사성장인자) 등 150여 가지의 성장인자(growth factor) 단백질 성분을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 지방유래 줄기세포로부터 필요한 활성 단백질 성분의 함량을 증가시키는 다양한 종류의 배양 방법에 대한 개발이 활발히 진행되고 있다.Meanwhile, when stem cells are cultured, stem cells secrete various substances into the culture medium. This stem cell culture medium is a generic term for substances secreted by stem cells, and contains various substances including various growth factor proteins, and is known to affect cell therapy through functions such as autocrine, paracrone, and endocrine. This culture has been shown to have significant biochemical activity in several studies. In recent years, development of a variety of uses using a stem cell culture medium in which an effective substance is maximized by culturing stem cells as described above has been attempted. Human adipocyte conditioned media extracts, which have been widely used in pharmaceutical and cosmetic compositions to date, are cultivated for several generations of fat-removed cells from adipose tissue to isolate stem cells, and then stem from stem cell culture. You can get protein produced by cells. This protein mixture contains more than 150 growth factors including VEGF (vascular endothelial growth factor), TGF (transgenic growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), FGF (fibroblast growth factor), and IGF (insulin-like growth factor). growth factor) is reported to contain protein components. Therefore, development of various types of culture methods for increasing the content of active protein components required from adipose-derived stem cells is actively progressing.

본 발명에서 "골전구체 세포(osteoprecursor)"는 골(bone)을 형성하는데 도움을 주는 모든 세포로 분화될 수 있는 세포를 의미하며, 바람직하게는 골재생에 사용될 수 있는 세포를 의미하며, 더욱 바람직하게는 치아 내 골재생에 영향을 주는 세포를 의미한다. In the present invention, "osteoprecursor" refers to a cell that can be differentiated into all cells that help to form bone, and preferably refers to a cell that can be used for bone regeneration, and more preferably Hagi refers to cells that affect bone regeneration in teeth.

본 발명에서 "혈관내피 성장인자(VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor)"는 중간엽 줄기세포가 분비하는 주요한 혈관신생 인자로서, 내피 세포의 생존, 분화 및 혈관 형성을 조절하는 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. VEGF는 저산소상태 및 TGF, 인터루킨, PDGF와 같은 세포성장인자들의 자극에 의해 혈관내피세포, 조혈세포, 기질세포에서 주로 생성된다. 조직 내에서 VEGF의 발현이 증가되면 혈관 신생 촉진을 유도함으로써 세포 및 조직의 재생이 활발해지는 것이다. In the present invention, "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)" is a major angiogenesis factor secreted by mesenchymal stem cells, and is known to have a function of regulating the survival, differentiation, and blood vessel formation of endothelial cells. . VEGF is mainly produced in vascular endothelial cells, hematopoietic cells, and stromal cells by hypoxia and stimulation of cell growth factors such as TGF, interleukin, and PDGF. When the expression of VEGF in the tissue is increased, the regeneration of cells and tissues becomes active by inducing the promotion of angiogenesis.

혈류공급의 영향을 비교적 많이 받는 근골격계에서도 혈관생성의 중요성이 부각되면서 치료성 혈관신생이 각광을 받기 시작하였고, 골유합, 골형성, 골이식, 국소 허혈성 골괴사 등에서 이미 혈관형성의 촉진이 치료에 도움을 주는 것으로 알려져 활용되고 있는 실정이다(비특허문헌 10). 모세혈관에서 혈장단백질의 투과를 증가시키는 사이토카인(cytokine)으로서, 세포의 분열과 이동을 촉진하고 세포소멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며, 혈관세포의 이동을 촉진시켜 새로운 세포의 발생 및 분화를 촉진시키는 VEGF는 최근 연구에서 뼈 성장의 조절에 대한 역할에 많은 관심이 집중되고 있고, BMP-2보다 조골세포의 증식에 더 강력한 유도활성을 갖는다고 보고되었다(비특허문헌 11). 특히, 치아 내 골재생에 사용하는 치조골 재생용 조성물에 VEGF를 추가하면 종래 뼈를 주성분으로 하는 치조골 재생용 조성물에 비해 현저히 치조골의 재생 속도 및 치아 내 골융합 속도를 향상시킬 수 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2).In the musculoskeletal system, which is relatively affected by blood flow, the importance of angiogenesis has emerged, and therapeutic angiogenesis has begun to gain attention.In bone union, bone formation, bone graft, and local ischemic bone necrosis, promotion of angiogenesis has already helped in treatment. It is known as giving and is being utilized (Non-Patent Document 10). As a cytokine that increases the permeation of plasma proteins in capillaries, it promotes the division and migration of cells and maintains the survival of newly formed blood vessels through inhibition of apoptosis. VEGF, which promotes development and differentiation, has focused on its role in the regulation of bone growth in recent studies, and it has been reported that it has a more potent induction activity in the proliferation of osteoblasts than BMP-2 (Non-Patent Document 11). . In particular, when VEGF is added to the composition for regeneration of alveolar bone used for bone regeneration in teeth, it is possible to significantly improve the speed of regeneration of the alveolar bone and the speed of bone fusion within the tooth compared to the conventional composition for regeneration of alveolar bone, which is based on bone (Patent Document 1, Patent Document 2).

본 발명에서 "허혈성 질환(Ischemic disease)"은 몸의 각 기관에 혈류를 공급하는 혈관에 다양한 형태의 병리학적 이상이 발생되어, 국소적으로 정상적 혈류의 장애를 초래하게 되는 질환을 의미한다. 혈관을 통한 혈액의 공급은 상처 치유나 조직 재생에 필수적인 현상이라 할 수 있는데, 동맥 경화증, 심근경색 및 협심증과 같은 질병은 원활하지 못한 혈액 공급이 원인이 되고 있다. In the present invention, "Ischemic disease" refers to a disease in which various types of pathological abnormalities occur in blood vessels that supply blood flow to each organ of the body, resulting in a local disorder of normal blood flow. Blood supply through blood vessels can be said to be an essential phenomenon for wound healing or tissue regeneration. Diseases such as arteriosclerosis, myocardial infarction, and angina are caused by poor blood supply.

한편, 혈관신생을 이용한 생체 질환의 치료를 혈관신생요법이라 하는데, 이미 VEGF와 같은 혈관신생인자는 중증의 국소 빈혈을 위한 치료제로 사용되고 있다. 또한, FGF, 표피성장인자(EGF, Epithermal Growth Factor) 및 혈소판-유도 내피 성장인자(PDEGF, Platelet-Derived Endothelial Growth Factor) 등의 혈관신생인자들도 임상 치료를 위하여 연구되고 있다. 하지만, 상기 인자들은 단백질로서 분리 및 정제가 어렵고, 고가이므로 임상 적용에 어려움이 있다. On the other hand, treatment of biological diseases using angiogenesis is called angiogenesis, and angiogenesis factors such as VEGF are already used as therapeutic agents for severe ischemia. In addition, angiogenesis factors such as FGF, Epithermal Growth Factor (EGF) and Platelet-Derived Endothelial Growth Factor (PDEGF) are also being studied for clinical treatment. However, since these factors are proteins, it is difficult to separate and purify them, and they are expensive, so there is difficulty in clinical application.

본 발명에 따라 잇몸-유래 중간엽 줄기세포 및 골세포 전구체를 공동배양하여 줄기세포 유래의 VEGF 생산량을 증가시킬 수 있고, 상기 공동배양에 의해 세포 스페로이드를 제조할 수 있다.According to the present invention, it is possible to increase the production of VEGF derived from stem cells by co-culturing gum-derived mesenchymal stem cells and bone cell precursors, and cell spheroids can be prepared by the co-culture.

또한, 본 발명에 따라 제조된 세포 스페로이드로부터 VEGF 함량이 향상된 배양액을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 치아 내 골융합을 촉진시켜서 골질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 허혈성 질환을 혈관신생 촉진에 의해 효과적으로 치료할 수 있다.In addition, by using a composition containing as an active ingredient a culture medium having an improved VEGF content from cell spheroids prepared according to the present invention, bone fusion can be promoted to effectively treat bone diseases, and ischemic diseases can be effectively treated by promoting angiogenesis. It can be cured.

도 1은 본 발명에 따른 세포 공동배양 및 분석 방법의 개요에 관한 것이다.
도 2는 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 2차원 배양하여 3일째 관찰한 결과에 관한 것이다.
도 3은 줄기세포 및 골전구체(osteoprecursor) 세포를 3차원 배양하여 3일째 관찰한 결과에 관한 것이다.
도 4는 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드의 생존율에 관한 것이다.
도 5는 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 형성된 세포 스페로이드의 줄기세포능(stemness)에 관한 것이다.
도 6은 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 2차원 배양하여 혈관내피성장인자(VEGF) 분비를 비교한 결과에 관한 것이다.
도 7은 본 발명에 따라 줄기세포 및 골전구체 세포를 3차원 배양하여 형성된 세포 스페로이드 유래의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비를 비교한 결과에 관한 것이다.1 relates to an overview of the cell co-culture and analysis method according to the present invention.
Figure 2 relates to the results observed on the third day by two-dimensional culture of stem cells and osteoprecursor cells.
3 is a three-dimensional culture of stem cells and osteoprecursor cells and relates to the results observed on the third day.
Figure 4 relates to the survival rate of the cell spheroid formed by co-culturing stem cells and bone progenitor cells according to the present invention.
Figure 5 relates to the stem cell ability (stemness) of the cell spheroid formed by co-culturing stem cells and bone progenitor cells according to the present invention.
6 relates to a result of comparing the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) by two-dimensional culturing stem cells and bone progenitor cells according to the present invention.
7 relates to a result of comparing the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) derived from cellular spheroids formed by three-dimensional culturing stem cells and bone progenitor cells according to the present invention.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples. However, the following examples are only illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

잇몸-유래 줄기세포의 분리 및 배양Isolation and culture of gum-derived stem cells

잇몸(Gingiva)-유래 줄기세포는 선행문헌(비특허문헌 12)에 기재된 방법에 따라 수득하였다. 잇몸 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)시키고, 갈아서(mince) 1~2 mm2의 단편으로 만든 후, 1 ㎎/㎖의 디스파제(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 및 2 ㎎/㎖의 콜라게네이즈 IV(Sigma-Aldrich Co.)를 포함하는 알파-변형된 최소 배지(α-MEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 분해시켰다. 세포는 5% CO2 및 95% O2로 가습된 인큐베이터 내에서 배양하였다. 비부착 세포는 인산-완충-식염수(PBS; Welgene, 대구)를 사용하여 세척하였고 신선한 배지로 교환하였다. 배지는 2-3일마다 교환하였다. Gingiva-derived stem cells were obtained according to the method described in Prior Document (Non-Patent Document 12). The gingival tissue is de-epithelialized, mince and made into fragments of 1-2 mm 2 , and then 1 mg/ml of dispase (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA). And 2 mg/ml of collagenase IV (Sigma-Aldrich Co.) containing alpha-modified minimal medium (α-MEM, Gibco, Grand Island, NY, USA). Cells were cultured in an incubator humidified with 5% CO 2 and 95% O 2 . Non-adherent cells were washed with phosphate-buffered-saline (PBS; Welgene, Daegu) and replaced with fresh medium. The medium was changed every 2-3 days.

줄기세포 및 Stem cells and 골전구체Bone precursor (( osteoprecursorosteoprecursor ) 세포의 공동-배양(2차원 배양)) Co-culture of cells (two-dimensional culture)

잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포(MC3T3-E1 세포, ATCC CRL-2593)는 6×105의 양으로 24웰 플레이트에 시딩하였고 성장 배지(α-MEM)를 사용하여 배양하였다. 줄기세포와 골전구체 세포의 비율은 0:4(그룹 1), 1:3(그룹 2), 2:2(그룹 3), 및 3:1(그룹 4)로 조합하여 배양하였다. Gum-derived stem cells and bone progenitor cells (MC3T3-E1 cells, ATCC CRL-2593) were seeded in a 24-well plate in an amount of 6×10 5 and cultured using a growth medium (α-MEM). The ratio of stem cells and bone progenitor cells was cultured in combination with 0:4 (group 1), 1:3 (group 2), 2:2 (group 3), and 3:1 (group 4).

골전구체 세포의 형태는 3일째에 섬유아세포와 유사한 형태를 나타내었다(도 2A). 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포의 다른 비율(group 2, 1:3; group 3, 2:2; 및 group4, 3:1)로 배양시 형태학적으로 유의한 차이점이 관찰되지 않았다(각각 도 2B, 도 2C, 및 도 2D).The morphology of the bone progenitor cells showed a morphology similar to that of fibroblasts on the third day (Fig. 2A). When cultured at different ratios of gum-derived stem cells and bone progenitor cells (group 2, 1:3; group 3, 2:2; and group 4, 3:1), no morphologically significant differences were observed (respectively 2B, 2C, and 2D).

세포 cell 스페로이드Spheroid (spheroid) 형성(3차원 배양)(spheroid) formation (three-dimensional culture)

줄기세포 스페로이드를 형성하기 위해, 마이크로웰에 배지(α-MEM)를 넣고 기포를 제거하기 위해 피펫팅(pipetting)을 신중하게 실시하였다. 기포가 다 제거되면 세포를 잘 섞어 디쉬(dish) 위에 로딩(loading)하였다. 줄기세포 스페로이드는 폴리디메틸실록산에 기반한 오목한 마이크로몰드(Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc., 서울) 내에서 직경 600 ㎛ 크기로 형성되었다. 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포는 4가지 비율(그룹 1 내지 그룹 4)로 조합하여 공동배양을 실시하였다(도 1 참조). 세포 응집 및 세포-스페로이드 형성은 역상 현미경(Leica DM IRM, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)를 사용하여 관찰하였고, 촬영된 이미지를 저장하였다.In order to form a stem cell spheroid, a medium (α-MEM) was placed in the microwell and pipetting was carefully performed to remove air bubbles. When all air bubbles were removed, the cells were mixed well and loaded onto a dish. Stem cell spheroids were formed in a diameter of 600 μm in a concave micro-mold (Prosys® StemFit 3D, Prodizen Inc., Seoul) based on polydimethylsiloxane. Gum-derived stem cells and bone progenitor cells were combined in four ratios (groups 1 to 4) and co-cultured (see Fig. 1). Cell aggregation and cell-spheroid formation were observed using an inverted microscope (Leica DM IRM, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), and photographed images were saved.

공동-배양 3일째의 스페로이드 형태는 도 3에 나타내었다. 골전구체 세포는 오목한 마이크로웰 내에서 스페로이드를 형성하였다(도 3A). 잇몸-유래 줄기세포 및 골전구체 세포를 조합한 그룹도 스페로이드를 형성하였다(도 3B-3D). 골전구체 세포에 대한 줄기세포 비율의 증가(Group 2, 1:3; Group 3, 2:2; Group4, 3:1)에 따라 형성된 스페로이드에 대한 형태학적 관찰에서 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다(각각 도 3B, 3C, 및 3D).The spheroid morphology on day 3 of co-culture is shown in FIG. 3. Bone progenitor cells formed spheroids in concave microwells (Fig. 3A). A group combining gum-derived stem cells and bone progenitor cells also formed spheroids (Figs. 3B-3D). No significant changes were observed in the morphological observations of spheroids formed according to the increase in the ratio of stem cells to bone progenitor cells (Group 2, 1:3; Group 3, 2:2; Group4, 3:1). (Figures 3B, 3C, and 3D, respectively).

세포 생존율 측정Cell viability measurement

세포 스페로이드의 생존율은 공동-배양 3일째에 Live/Dead Kit(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 정성적으로 분석하였다. 세포 스페로이드는 PBS를 사용하여 2회 세척하였고, 이후에 2㎕의 50mM 칼세인 아세톡시메틸 에스테르(calcein acetoxymethyl ester) 워킹 용액 및 4㎕의 2mM 에디티움 동형이량체-1(Ethidium homodimer-1)을 포함하는 1㎖의 α-MEM으로 상온에서 15분간 부유시켰다. 칼세인 아세톡시메틸 에스테르 및 에티디움 동형이량제-1으로 염색된 스페로이드는 형광 현미경(Axiovert 200; Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰하였다. 생존한 세포는 강하고 동일한 녹색 형광을 나타내었고, 죽은 세포는 적색 형광을 나타내었다(도 4). The viability of cell spheroids was qualitatively analyzed using Live/Dead Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) on the third day of co-culture. Cell spheroids were washed twice with PBS, after which 2 μl of 50 mM calcein acetoxymethyl ester working solution and 4 μl of 2 mM Ethidium homodimer-1 It was suspended for 15 minutes at room temperature with 1 ml of α-MEM containing. Spheroids stained with calcein acetoxymethyl ester and ethidium homodimer-1 were observed using a fluorescence microscope (Axiovert 200; Zeiss, Germany). Surviving cells showed strong and identical green fluorescence, and dead cells showed red fluorescence (FIG. 4).

줄기세포능Stem cell ability (( stemnessstemness ) 측정) Measure

세포 스페로이드는 공동-배양 3일째에 회수하여 줄기세포능을 측정하였다. 세포 스페로이드는 1x 농도로 희석시킨 NHL493(녹색)에 접합된 인간 SSEA-4 항체(Clone MC-813-70; R&D Systems, McKinley Place, NE, USA) 및 NL557(적색)에 접합된 인간 TRA-1-60(R) 항체(Clone TRA-1-60; R&D Systems)을 사용하여 배양하였다. 스페로이드 내 항원들(SSEA-4, TRA-1-60(R))은 형광 현미경(Axiovert 200; Zeiss, Germany) 상에서 시각화하였다. 상기 항원들은 인간 줄기세포의 양성 표지자로서 사용하였다.Cell spheroids were recovered on the third day of co-culture and stem cell ability was measured. Cell spheroids were human SSEA-4 antibody conjugated to NHL493 (green) diluted at 1x concentration (Clone MC-813-70; R&D Systems, McKinley Place, NE, USA) and human TRA- conjugated to NL557 (red). It was cultured using 1-60(R) antibody (Clone TRA-1-60; R&D Systems). Antigens in spheroids (SSEA-4, TRA-1-60(R)) were visualized on a fluorescence microscope (Axiovert 200; Zeiss, Germany). These antigens were used as positive markers for human stem cells.

스페로이드 내 대부분의 세포는 녹색 형광을 발산하였고, 적은 비율의 적색 형광이 관찰되었다(도 5). 줄기세포 없이 형성된 스페로이드는 줄기세포 마커인 SSEA-1 및 TRA-1-60(R)에 대하여 음성 결과를 나타내었다(도 5A-5C). 줄기세포를 포함하는 스페로이드는 줄기세포 마커인 SSEA-1 및 TRA-1-60(R)에 대하여 양성 결과를 나타내었다(도 5D-5L).Most of the cells in the spheroid emitted green fluorescence, and a small percentage of red fluorescence was observed (FIG. 5). The spheroids formed without stem cells showed negative results for the stem cell markers SSEA-1 and TRA-1-60(R) (FIGS. 5A-5C). The spheroids including stem cells showed positive results for the stem cell markers SSEA-1 and TRA-1-60(R) (Fig. 5D-5L).

혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor ( VEGFVEGF , Vascular Endothelial Growth Factor)의 분비, Vascular Endothelial Growth Factor)

상기 실시예 2 및 실시예 3(2차원 및 3차원 배양)에 따른 공동배양 시스템으로부터의 인간 혈관내피성장인자의 분석은 통상적으로 사용 가능한 키트(Quantikine® ELISA, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 실시하였다. 모든 시약 및 시료는 매뉴얼에서 추천한 바에 따라 준비하였다.Analysis of human vascular endothelial growth factor from the co-culture system according to Examples 2 and 3 (2D and 3D culture) was performed using a kit (Quantikine® ELISA, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN. , USA). All reagents and samples were prepared according to the recommendations in the manual.

6.1. 2차원 공동배양에서의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비6.1. Vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion in two-dimensional co-culture

2차원 공동-배양에서 혈관내피성장인자의 분비는 그룹 2, 3, 및 4에서 유의하게 차이점이 관찰되었다. 혈관내피성장인자의 분비는 줄기세포 비율의 증가에 비례하여 증가하였다(도 6). 대조군(배지 단독 그룹)과 비교했을 시 혈관내피성장인자 분비에 대한 통계적으로 유의한 증가는 그룹 3 및 그룹 4에서 관찰되었다(P<0.05).In the two-dimensional co-culture, the secretion of vascular endothelial growth factor was significantly different in groups 2, 3, and 4. The secretion of vascular endothelial growth factor increased in proportion to the increase of the stem cell ratio (Fig. 6). A statistically significant increase in vascular endothelial growth factor secretion was observed in groups 3 and 4 when compared to the control group (medium alone group) (P<0.05).

6.2. 3차원 공동배양된 세포 스페로이드에서의 혈관내피성장인자(VEGF) 분비6.2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion from three-dimensional co-cultured cell spheroids

세포 스페로이드로부터의 혈관내피성장인자 분비는 그룹 2, 3, 및 4에서 유의하게 차이점이 관찰되었다. 혈관내피성장인자의 분비는 줄기세포 비율의 증가에 비례하여 증가하였다(도 7). 대조군(배지-단독 그룹)과 비교하여 그룹 2, 3, 및 4에서 통계적으로 유의한 차이점(*, 대조군과 비교한 통계적 차이점; **, 그룹 2와 비교한 통계적 차이점)이 관찰되었다.Vascular endothelial growth factor secretion from cellular spheroids was significantly different in groups 2, 3, and 4. The secretion of vascular endothelial growth factor increased in proportion to the increase of the stem cell ratio (FIG. 7). Statistically significant differences (*, statistical differences compared to control; **, statistical differences compared to group 2) were observed in groups 2, 3, and 4 compared to the control group (medium-only group).

줄기세포 및 골전구체 세포의 공동배양시 줄기세포 단독 배양에 비해 VEGF 생산이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. When co-cultured with stem cells and bone progenitor cells, it was confirmed that VEGF production was increased compared to that of stem cells alone.

통계 분석Statistical analysis

실험 결과는 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 사후검증(post hoc test)을 포함하는 스튜던트 테스트(student’s t test) 또는 2원 변량 분석(ANOVA)을 실시하여 4 그룹 간의 차이점을 상업적으로 허용되는 프로그램(SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)에 의해 분석하였다. 유의수준은 0.05이다. Experimental results are expressed as mean ± standard deviation. A commercially-acceptable program (SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., Chicago,) conducted a student's t test, including a post hoc test, or a binary variance analysis (ANOVA) to determine the differences between the four groups (SPSS 12 for Windows, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The significance level is 0.05.

상기 결과들을 통하여, 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 세포 스페로이드를 제조하면, 중간엽 줄기세포 단독 배양에 의해 형성된 세포 스페로이드에 비해 VEGF 생산량이 향상됨을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 증가된 VEGF 및 골전구체 세포로부터 생성된 다양한 골 재생 인자들을 포함하는 조성물을 이용하여 골 융합 촉진 용도 및 허혈성 질환의 치료 용도로 사용할 수 있다.Through the above results, it was confirmed that when a cell spheroid was prepared by co-culturing mesenchymal stem cells and bone progenitor cells, VEGF production was improved compared to the cell spheroid formed by culturing mesenchymal stem cells alone. In addition, a composition comprising various bone regeneration factors generated from the increased VEGF and bone progenitor cells can be used for promoting bone fusion and for treating ischemic diseases.

본 명세서에서 인용한 모든 참조문헌, 기사, 공보 및 특허 및 특허 출원이 온전히 본 명세서에 참조로 병합되어 있다. 따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안 된다.All references, articles, publications, and patents and patent applications cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety. Accordingly, the spirit and scope of the following claims should not be limited to the description of the preferred embodiments described above.

Claims (13)

중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
A method of increasing growth factor protein production of mesenchymal stem cells by co-culturing mesenchymal stem cells and bone progenitor cells.
 제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 잇몸 유래의 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
The method of claim 1,
The method for increasing the growth factor protein production of mesenchymal stem cells, characterized in that the mesenchymal stem cells are stem cells derived from human gums.
 제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
The method of claim 1,
The method for increasing the growth factor protein production of mesenchymal stem cells, characterized in that the mixing ratio of the mesenchymal stem cells and bone progenitor cells is 1:3 to 3:1.
 제 1항에 있어서,
상기 성장인자 단백질은 혈관내피성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 간세포 성장인자(HGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 중간엽 줄기세포의 성장인자 단백질 생산을 증가시키는 방법.
The method of claim 1,
The growth factor protein is a growth factor protein of mesenchymal stem cells, characterized in that at least one selected from the group consisting of vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), and hepatocyte growth factor (HGF). How to increase production.
 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포를 공동배양하여 획득한 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하며 상기 배양액은 혈관내피성장인자(VEGF)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진 조성물.
Mesenchymal stem cells and stem cell culture medium obtained by co-culturing bone progenitor cells as an active ingredient, wherein the culture medium contains vascular endothelial growth factor (VEGF), characterized in that, angiogenesis promoting composition.
 제 5항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 인간 잇몸 유래의 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진 조성물.
The method of claim 5,
The mesenchymal stem cells are stem cells derived from human gums, characterized in that, angiogenesis promoting composition.
 제 5항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포 및 골전구체 세포의 혼합 비율은 1:3 내지 3:1인 것을 특징으로 하는, 혈관신생 촉진 조성물.The method of claim 5,
The mixing ratio of the mesenchymal stem cells and bone progenitor cells is 1:3 to 3:1, characterized in that the angiogenesis promoting composition. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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