KR102160725B1 - 신장 세포 모집단 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이오마커로 특징지어진 농축 이질성 포유류 신장 세포 모집단, 및 이를 만들고 이용하는 방법에 관한 것이다.

Description

신장 세포 모집단 및 이의 용도{RENAL CELL POPULATIONS AND USES THEREOF}
관련된 출원의 교차-참조
본 출원은 2012년 10월 24일에 제출된, "Isolated Regenerative Renal Cells and Uses Thereof"라는 제목의 미국 특허 가출원 일련 번호 제61/718,150호, 및 2013년 9월 11일에 제출된, "Renal Cell Populations and Uses Thereof"의 제목의 제61/876,616호에 대한 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 개시는 농축 이질성 포유류 신장-유래 세포 모집단과 일반적으로 관련되고, 세포 모집단을 식별하는 방법, 재생 의학 요법의 제조에서 그들의 용도를 위한 방법, 및 포유류 대상에게 농축 이질성 신장-유래 세포 모집단의 투여로 신장 질환을 치료하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다.
발명의 배경
콜라겐 및 젤라틴-기반 생체물질은 여러 가지 조직 조작 적용을 위해 성공적으로 이용되어 왔다 (Rohanizadeh et al. J Mater Sci Mater Med 2008; 19: 1173-1182; Takemoto et al. Tissue Eng Part A 2008; 14: 1629-1638; Young et al. J Control Release 2005; 109: 256-274). 이들 두 가지 거대분자 모두 뛰어난 생체적합성 및 낮은 항원성으로 특징지어진다 (Cenni et al. J Biomater Sci Polym Ed 2000; 11: 685-699; Lee et al. Int J Pharm 2001; 221: 1-22; Waksman et al. J Immunol 1949; 63: 427-433); 하지만, 콜라겐의 가수분해에 의해 젤라틴이 얻어지기 때문에, 후자에 비해 다음의 특정한 장점을 갖는다: (a) 쉽게 입수가능하고 이용하기 쉽다; (b) 분자량 및 블룸(bloom) (즉 물리적 특성에 대해 제어)에 관하여 선택권을 제공; 및 (c) 화학적 변형에 대하여 더 융통성이 있으며 제조하는 것이 수월하다. 더욱이, 생물학적 관점에서, 젤라틴은 콜라겐과 유사한 세포 부착 특성 및 세포적합성을 유지한다 Engvall et al. Int J Cancer 1977; 20: 1-5; Kim et al. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2009; 108: e94-100).
이들 거대분자의 가교를 위해 (조직 조작 적용에서) 그들의 생체내 체류를 연장시키기 위해 그들의 생분해를 지연시키거나 (약물 담체로서 이용될 때) 그들의 약물 방출 능력을 맞추는 목적을 위한 다양한 방법이 보고되었다. 콜라겐 또는 젤라틴의 화학적 또는 광화학적 가교에 대하여 수많은 방법이 공개되었다 (Adhirajan et al. J Microencapsul 2007; 24: 647-659; Chang et al. Macromol Biosci 2007; 7: 500-507; Gagnieu et al. Biomed Mater Eng 2007; 17: 9-18; Kimura et al. J Biomater Sci Polym Ed 2010; 21: 463-476; Ma et al. J Biomed Mater Res A 2004; 71: 334-342; Vandelli et al. Int J Pharm 2001; 215: 175-184; Vandelli et al. J Control Release 2004; 96: 67-84). 이들 절차의 다수가 효소적 분해에 대한 이들 생체물질의 민감성을 감소시키고 그들의 생체내 체류 시간을 연장시키는 것을 목적으로 한다 (Chang et al. supra 2007; Ma et al. supra 2004). 다른 가교 방법은 전형적으로 서방형 약물, 단백질 또는 핵산 담체로서 적합한 젤라틴 또는 콜라겐-기반 생체물질을 수득하기 위해 이용된다 (Kimura supra 2010; Vandelli supra 2004; Kommareddy et al. Nanomedicine 2007; 3: 32-42; Sehgal et al. Expert Opin Drug Deliv 2009; 6: 687-695; Sutter et al. J Control Release 2007; 119: 301-312). 콜라겐 및 젤라틴 그리고 다른 조직 조작-호환 시스템을 위해 광범위하게 이용되는 가교 작용제 종류는 카르보디이미드이다 (Adhirajan supra 2007; Olde Damink et al. Biomaterials 1996; 17: 765-773; Pieper et al. Biomaterials 2000; 21: 581-593; Cornwell et al. Clin Podiatr Med Surg 2009; 26: 507-523). 이들 분자는 제로-길이 가교제로서 공지되고 가교되어야 할 종에 존재하는 카르복실 및 일차 아민 기능성 사이의 아미드 결합의 형성을 매개함으로써 작용한다. 추가로, 카르보디이미드는 일반적인 다른 가교 작용제 (가령, 글루타르알데하이드)와 비교하여 세포독성이 덜하다 (Lai et al. J Mater Sci Mater Med 2010; 21: 1899-1911). 글루타르알데하이드는 Cultispher™ 비드(bead)에서 가교제로서 이용된다. Burg 미국 특허 번호 제6,991,652호는 대상에게 전달될 수도 있는 세포에 대한 3-차원 지지 구조물을 함유한 조직 조작 합성물(composite)을 설명한다.
재생 의학 기술은 만성 신장 질환 (CKD)에 대한 차세대 치료학적 선택을 제공한다. Presnell et al. WO/2010/056328 및 Ilagan et al. PCT/US2011/036347은 세뇨관 및 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포 모집단을 비롯한, 단리된 생물활성 신장 세포, 및 이를 단리시키고 배양하는 방법, 그리고 세포 모집단으로 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법을 설명한다.
조직 조작 및 재생 의학 적용에서 활성제, 가령 생물활성 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 전달하는 데에 적합한 치료학적 제제가 필요하다.
신장은 혈액을 깨끗하게 유지하고 화학적으로 균형을 맞추기 위한 많은 기능을 수행하는 복합 기관이다. 노폐물을 제거하는 것 외에도, 신장은 다음 세가지 중요한 호르몬을 방출한다:
에리트로포이에틴, 또는 EPO, 이는 적혈구 세포를 만들기 위해 골수를 자극함
레닌, 혈압을 조절함; 그리고
비타민 D의 활성 형태인, 칼시트리올, 이는 신체내 정상적인 화학 균형을 위해 그리고 뼈를 위해 칼슘을 유지하는 것을 도움.
이들 기능을 수행하기 위하여 신장은 수많은 상이한 세포 유형을 포함한다. 하지만, 모든 세포에서 재생 반응이 요구되는 것은 아니며 재생 반응을 유도하는 데에서 유용한 세포의 조합을 식별하는 것이 연구의 주제가 되었다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 치료학적 제제에서의 이용을 밝혀낸 이질성 신장 세포 모집단, 즉 생물활성 세포를 식별하는 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 요약
포유류 신장 조직으로부터의 이질성 포유류 신장 세포 모집단이 본 명세서에서 개시된다. 포유류 신장-유래 세포 모집단의 단리 및 정제를 위한 방법이 제공된다. 포유류 신장-유래 세포의 독특한 모집단은 표현형 특징, 예를 들면, 바이오마커 표현형으로 특징지어진다. 바이오마커 발현 표현형은 배양에서 포유류 신장-유래 세포 모집단의 다수의 계대 후 보유되고 그리고 재생 요법의 제조에서 이용하기에 적합하다.
특이적인 바이오마커로 특징지어진 인간 신장 세포 모집단의 선별 모집단 및 그들의 용도가 본 명세서에서 설명된다.
인간 신장 세포의 선별 모집단은 재생 자극을 제공하는 더 적은 수의 세포를 이용하는 것을 허용한다. 이러한 더 적은 수가 이로운데 그 이유는 부정적인 면역학적 사건의 가능성을 낮추고 그리고 재생 자극을 제공하기 때문이다. 선별된 신장 세포 모집단은 재생 자극으로서 효과적이어야 하는 줄기세포의 큰 비율을 요구하지 않는다. 선별된 신장 세포 모집단은 병에 걸린 신장으로부터 회복될 수 있다.
하나의 측면에서, 이질성 신장 세포 모집단을 식별하고 및/또는 특징짓기 위한 방법이 제공된다. 한 가지 구체예에서, 이질성 신장 세포 모집단은 바이오마커의 표현형 발현으로 특징지어진다. 특정한 구체예에서, 신장 세포는 이질성 신장 세포 모집단 상에서/안에서 바이오마커의 검출을 허용하는 하나 이상의 시약으로 식별된다. 바이오마커의 검출은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 면역형광 현미경검사법, 유동세포 분석법, 광-섬유 스캐닝 세포분석법, 또는 레이저 스캐닝 세포분석법에 기반한 것들에 의해 수행될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 이식 및/또는 재생 반응 유도에 적합한 이질성 신장 세포 모집단을 식별하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
포유류 신장 샘플로부터 세포를 단리시키는 단계;
상기 단리된 세포를 하나 이상의 라벨링된 검출 모이어티에 노출시키는 단계, 여기서 각각의 라벨링된 검출 모이어티는 상이한 바이오마커를 표적으로 하고 상이한 라벨로 라벨링됨;
상기 바이오마커 각각을 발현하는 세포의 백분율을 결정하는 단계.
한 가지 구체예에서, 세포 모집단은 표 12.2 및 12.3에 열거된 2개 이상의 바이오마커를 발현하는 SRC 세포 모집단이다. 한 가지 구체예에서, 바이오마커는 표 12.4에서 제공된 바와 같은 발현 수준을 갖는다. 구체예에서 SRC 세포 모집단은 GGT-1 및 CK18에 대해 각각, 18% 및 80%보다 크게 발현 수준을 갖는다.
하나의 측면에서, 활성제, 가령 생물활성 세포를 함유한 주사가능, 치료하적 제제가 제공된다. 한 가지 구체예에서, 주사가능한 제제는 생물활성 세포 및 온도-민감성 세포-안정화 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 온도-민감성 세포-안정화 생체물질은 (i) 8℃ 이하에서 실질적으로 고체 상태 및/또는 (ii) 주위 온도 이상에서 실질적으로 액체 상태를 유지한다. 한 가지 다른 구체예에서, 생물활성 세포는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 신장 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 생물활성 세포는 세포-안정화 생체물질의 부피의 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분산된다. 다른 구체예에서, 약 8℃ 내지 약 주위 온도에서 생체물질은 고체에서 액체(solid-to-liquid)로의 전이 상태다. 한 가지 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 겔 상태이다. 또 다른 구체예에서, 세포-안정화 생체물질은 하이드로겔을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 하이드로겔은 젤라틴을 포함한다. 다른 구체예에서, 젤라틴은 약 0.5% 내지 약 1% (w/v)의 제제로 존재한다. 한 가지 구체예에서, 젤라틴은 약 0.75% (w/v)의 제제로 존재한다. 또 다른 구체예에서, 제제는 세포 생존제(cell viability agent)를 추가로 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 세포 생존제는 항산화제, 산소 담체, 면역조절 인자, 세포 모집 인자, 세포 부착 인자, 항-염증제, 면역억제제, 혈관신생 인자, 및 상처 치유 인자로 구성된 군에서 선택된 작용제를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 세포 생존제는 항산화제이다. 한 가지 구체예에서, 항산화제는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산이다. 또 다른 구체예에서, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산은 약 50 μM 내지 약 150 μM로 존재한다. 한 가지 다른 구체예에서 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산은 약 100 μM로 존재한다. 몇몇 구체예에서, 세포 생존제는 산소 담체이다. 한 가지 구체예에서, 산소 담체는 퍼플루오로카본이다. 다른 구체예에서, 세포 생존제는 면역조절제이다. 한 가지 구체예에서, 세포 생존제는 면역억제제이다.
또 다른 측면에서, 생물활성 신장 세포를 함유한 주사가능, 치료학적 제제가 제공된다. 한 가지 구체예에서, 제제는 생물활성 신장 세포, 약 0.75% (w/v) 젤라틴, 및 약 100 μM 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산을 포함하며, 여기서 제제는 (i) 약 8℃ 이하에서 실질적으로 고체 상태, 및 (ii) 주위 온도 이상에서 실질적으로 액체 상태이다. 또 다른 구체예에서, 생물활성 신장 세포는 세포-안정화 생체물질의 부피의 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게 분산된다. 한 가지 다른 구체예에서, 약 8℃ 내지 약 주위 온도에서 생체물질은 고체에서 액체로의 전이 상태다. 다른 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 겔 상태이다. 몇몇 구체예에서, 제제는 세포 생존제를 추가로 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포 생존제는 항산화제, 산소 담체, 면역조절 인자, 세포 모집 인자, 세포 부착 인자, 항-염증제, 혈관신생 인자, 및 상처 치유 인자로 구성된 군에서 선택된 작용제를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포 생존제는 산소 담체이다. 또 다른 구체예에서, 산소 담체는 퍼플루오로카본이다. 한 가지 다른 구체예에서, 세포 생존제는 면역조절제이다. 다른 구체예에서, 세포 생존제는 면역억제제이다.
하나의 다른 측면에서, 본 개시는 생체적합 비드를 추가로 포함한 본 명세서에서 설명된 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 생체적합 비드는 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 비드는 가교된다. 한 가지 다른 구체예에서, 가교된 비드는 비-가교된 생체적합 비드와 비교하여 효소적 분해에 대해 감소된 민감성을 갖는다. 다른 구체예에서, 가교된 비드는 카르보디이미드-가교된 비드이다. 한 가지 구체예에서, 카르보디이미드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC), DCC - N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC), 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드　(DIPC)로 구성된 군에서 선택된다. 또 다른 구체예에서, 카르보디이미드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)이다. 한 가지 다른 구체예에서, 가교된 비드는 비-가교된 비드와 비교하여 감소된 수의 유리 일차 아민을 포함한다. 다른 구체예에서, 유리 일차 아민의 수는 약 355 nm에서 분광광도법으로 검출가능하다. 몇몇 구체예에서, 비드는 생물활성 세포로 접종된다. 한 가지 구체예에서, 생물활성 세포는 신장 세포이다. 또 다른 구체예에서, 제제는 (i) 주위 온도에서 실질적으로 고체 상태, 및 (ii) 37℃ 이상에서 실질적으로 액체 상태를 유지하는 온도-민감성 생체물질을 포함하는 추가적인 생체적합 비드를 추가로 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 비드의 생체물질은 주위 온도 및 약 37℃ 사이에서 고체에서 액체로의 전이 상태를 포함한다. 다른 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 겔 상태이다. 한 가지 구체예에서, 비드의 생체물질은 하이드로겔이다. 또 다른 구체예에서, 하이드로겔은 젤라틴을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 비드는 약 5% (w/v) 내지 약 10% (w/v)에서 젤라틴을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 추가적인 생체적합 비드는 스페이서 비드(spacer bead)이다. 다른 구체예에서, 스페이서 비드는 생물활성 세포로 접종되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 개시의 제제는 신장 세포 모집단에 의해 분비된 산물을 함유한다. 한 가지 구체예에서, 제제는 신장 세포 모집단 및/또는 생물활성 세포에 의해 분비된 산물을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 생물활성 세포는 신장 세포이다. 또 다른 구체예에서, 산물은 측분비 인자(paracrine factor), 내분비 인자(endocrine factor), 및 곁분비 인자(juxtacrine factor) 중 하나 이상을 포함한다. 한 가지 다른 구체예에서, 산물은 소포를 포함한다. 다른 구체예에서, 소포는 미세소포를 포함한다. 한 가지 구체예에서, 소포는 엑소좀을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 소포는 측분비 인자, 내분비 인자, 곁분비 인자, 및 RNA로 구성된 군에서 선택된 분비 산물을 포함한다.
도 1은 본 명세서에서 설명된 전반적인 NKA 제조 과정의 흐름 도표이다.
도 2 A-D는 도 1에서 도시되고 본 명세서에서 설명된 과정의 추가적인 세부사항을 제공하는 흐름 도표이다.
도 3은 배양 기간 동안의 변화율 및 6명의 환자로부터의 세포 수득률을 예시화하는 그래프이다.
도 4는 7% OptiPrep® 밀도 구배에서 SRC 밴딩(banding)의 그림이다. 참조는 실시예 5에서 이루어진다.
도 5는 인간 SRC 모집단에서 신장 세포 마커의 발현을 도시하는 막대 그래프이다. 참조는 실시예 12에서 이루어진다.
도 6은 인간 SRC의 효소 활성을 도시하는 막대 그래프이다. 참조는 실시예 12에서 이루어진다.
도 7A-D는 신장에서의 NKA 주사를 도시한다: (a) 신장 피질 내로 삽입된 바늘, (b) NKA 전달, (c) 신장에서 다수의 전달 지점, 및 (d) NKA의 최종 주입물 (예시적).
발명의 상세한 설명
활성제, 가령 생물활성 세포에 대한 치료학적 제제, 그리고 이를 제조하는 방법 및 제제로 이를 필요로 하는 대상을 치료하는 방법이 본 명세서에서 개시된다. 생물활성 세포 제제는 생물활성 신장 세포 (BRC)의 이질 혼합물 또는 분획물에 적합할 수 있다. 생물활성 신장 세포는 세뇨관 및 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포를 비롯한 단리된 신장 세포일 수 있다. BRC 세포 모집단은 농축 세뇨관 및 EPO-생성 세포 모집단을 포함할 수 있다. BRC는 건강한 개체로부터의 신장 세포 분획물로부터 유래되거나 그들 자체일 수 있다. 추가로, 건강한 개체의 상응하는 신장 세포 분획물과 비교하여 특정 세포 성분은 결여될 수 있으나 여전히 치료적 특성을 보유하는 건강하지 않은 개체로부터 수득된 신장 세포 분획물이 제공된다. 또한, 본 개시는 건강한 개체와 비교하여 세포 성분이 결여된 치료학적-활성 세포 모집단을 제공하며, 이때 세포 모집단은 한 가지 구체예에서, 다양한 질환 상태의 자가 공급원으로부터 단리되고 확장될 수 있다.
생물활성 세포 제제가 본 명세서에서 설명되지만, 본 개시는 여러 가지 다른 활성제를 함유한 제제도 고려한다. 다른 적합 활성제는 세포 응집물, 무세포 생체물질, 생물활성 세포로부터 분비된 산물, 거대 및 소분자 치료제, 그리고 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 한 가지 유형의 생물활성 세포는 치료학적 분자와 함께 또는 상기 분자 없이 생체물질-기반 미세담체와 조합될 수 있고 또는 비부착 세포인, 또 다른 유형의 생물활성 세포는 무세포 입자와 조합될 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007은 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대해 전반적인 지침을 해당 분야의 통상의 기술자에게 제공한다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 발명의 실시에서 이용될 수 있는, 본 명세서에서 설명된 것과 유사하거나 동일한 많은 방법 및 물질을 인지할 수 있을 것이다. 실제로, 본 명세서는 설명된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포 모집단"은 적합한 조직 공급원, 주로 포유류로부터 단리에 의해 수득되는 다수의 세포를 나타낸다. 단리된 세포 모집단은 후속적으로 시험관 내에서 배양될 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 발명에서 이용하기 위한 세포 모집단을 단리시키고 배양하기 위한 다양한 방법 및 본 발명에서 이용하기에 적합한 세포 모집단에서 다양한 수의 세포를 인식할 것이다. 세포 모집단은 기관 또는 조직, 가령 신장으로부터 유래된 비분할된 이질성 세포 모집단일 수 있다. 예를 들어, 이질성 세포 모집단은 조직 생검 또는 전체 기관 조직으로부터 단리될 수 있다. 대안으로, 이질성 세포 모집단은 조직 생검 또는 전체 기관 조직으로부터 확립된, 포유류 세포의 시험관내 배양으로부터 유래될 수 있다. 비분할된 이질성 세포 모집단은 또한 비-농축 세포 모집단으로서 불릴 수 있다. 한가지 구체예에서, 세포 모집단은 생물활성 세포를 함유한다.
용어 "고유(native) 기관"은 살아 있는 대상의 기관을 의미한다. 대상은 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 대상은 특정한 기관과 연관된 질환을 가질 수 있다.
용어 "고유 신장"은 살아 있는 대상의 신장을 의미한다. 대상은 건강하거나 건강하지 않을 수 있다. 건강하지 않은 대상은 신장 질환을 가질 수 있다.
용어 "재생 효과"는 고유 기관, 가령 신장에 이점을 제공하는 효과를 의미한다. 효과는 고유 기관에 대한 손상의 정도에서의 감소 또는 고유 기관 기능의 개선, 회복, 또는 안정화를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 신장 손상은 섬유증, 염증, 사구체 비대 등의 형태이고 대상에서 고유 기관과 연관된 질환과 관련될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "혼합물"은 비분할된 이질성 세포 모집단으로부터 유래된 2개 이상의 단리되고 농축된 세포 모집단의 조합을 나타낸다. 특정한 구체예에 따르면, 세포 모집단은 신장 세포 모집단이다.
"농축" 세포 모집단 또는 제조물은 특이적인 세포 유형을 초기 모집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 큰 백분율로 포함하는, 초기 기관 세포 모집단 (가령, 비분할된 이질성 세포 모집단)으로부터 유래된 세포 모집단을 나타낸다. 예를 들어, 초기 신장 세포 모집단은 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 등의 관심 세포 모집단에 대해 농축될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포 모집단", "세포 제조물" 및 "세포 원형 (prototype)"은 호환적으로 사용된다.
하나의 측면에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "농축" 세포 모집단은 초기 모집단에서 EPO를 생성할 수 있는 세포 백분율보다 더 큰, EPO를 생성할 수 있는 세포의 백분율을 함유한 초기 기관 세포 모집단 (가령, 신장 생검 또는 배양된 포유류 신장 세포로부터의 세포 현탁액)을 나타낸다. 예를 들어, 용어 "B4"는 초기 세포 모집단과 비교하여 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포를 더 큰 백분율로 포함하는 초기 신장 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단이다. 세포 모집단은 하나 이상의 세포 유형에 대해 농축되고 하나 이상의 다른 세포 유형은 고갈될 수 있다. 예를 들어, 농축 EPO 생성-세포 모집단은 비-농축 세포 모집단, 즉 농축 세포 모집단이 유래된 초기 세포 모집단에 있는 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포에 비해, 간질 섬유모세포는 농축되고 세뇨관 세포 및 집합관 상피 세포는 고갈될 수 있다. EPO 농축 또는 "B4" 모집단을 언급하는 모든 구체예에서, 농축 세포 모집단은 내생성의 고유 EPO 유전자로부터 산소-조정가능한 EPO 발현으로 입증되는 바와 같이, 산소-조절된 방식으로 EPO를 생성할 수 있는 세포를 함유하는 이질성 세포 모집단이다.
또 다른 측면에서, 특정 세포 유형, 가령 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 초기 세포 모집단에서의 세포 유형의 백분율보다 더 큰 백분율로 포함한 농축 신장 세포 모집단은 또한, 건강한 개체 또는 대상으로부터 유래된 초기 신장 세포 모집단과 비교하여, 하나 이상의 특이적인 세포 유형, 가령 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 결여되거나 결핍될 수 있다. 예를 들어, 용어 "B4'" 또는 "B4 프라임"은, 하나의 측면에서, 건강한 개체와 비교하여, 출발 표본의 질환 상태에 따라, 하나 이상의 세포 유형, 가령 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 결여되거나 결핍된 초기 신장 세포 모집단으로부터 유래된 세포이다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 만성 신장 질환을 갖는 대상으로부터 유래된다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 초점 분절 사구체경화증 (focal segmental glomerulosclerosis (FSGS))을 갖는 대상으로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단은 자가면역 사구체신염을 가진 대상으로부터 유래된다. 또 다른 측면에서, B4'는 후에 하나 이상의 세포 유형, 가령 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 고갈되거나 결핍되는, 모든 세포 유형, 가령 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 포함하는 초기 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단이다. 또 다른 측면에서, B4'는 후에 하나 이상의 특이적인 세포 유형, 가령 혈관, 사구체 또는 내분비 세포가 농축되는, 모든 세포 유형, 예를 들어 혈관, 사구체 또는 내분비 세포를 포함하는 초기 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단이다. 예를 들어, 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 혈관 세포가 농축되지만 사구체 및/또는 내분비 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단은 사구체 세포가 농축되지만 혈관 및/또는 내분비 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단은 내분비 세포가 농축되지만 혈관 및/또는 사구체 세포는 고갈될 수 있다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단은 혈관 및 내분비 세포가 농축되지만 사구체 세포는 고갈될 수 있다. 바람직한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 단독으로 또는 또 다른 농축 세포 모집단, 가령 B2 및/또는 B3과의 혼합 상태로 치료학적 특성을 보유한다. 예를 들어, B4' 세포 모집단은 본 명세서에서 실시예, 가령 실시예 11-13에서 설명된다.
또 다른 측면에서, 농축 세포 모집단은 초기 모집단에서 몇몇 EPO-생성 세포로 하나 이상의 혈관, 사구체 및 근위 세뇨관 마커를 발현하는 세포의 백분율보다 더 큰, 몇몇 EPO-생성 세포로 하나 이상의 혈관, 사구체 및 근위 세뇨관 마커를 발현하는 세포의 백분율을 포함하는 상기 논의된 바와 같은 초기 신장 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 용어 "B3"은 초기 모집단과 비교하여 근위 세뇨관 세포 그리고 혈관 및 사구체 세포를 더 큰 백분율로 포함하는 초기 신장 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단을 나타낸다. 한 가지 구체예에서, B3 세포 모집단은 초기 모집단과 비교하여 근위 세뇨관 세포를 더 큰 백분율로 포함하지만 B2 세포 모집단과 비교하여 근위 세뇨관 세포를 더 적은 백분율로 포함한다. 또 다른 구체예에서, B3 세포 모집단은 초기 모집단과 비교하여 몇몇 EPO-생성 세포로 혈관 및 사구체 세포 마커를 더 큰 백분율로 포함하지만 B4 세포 모집단과 비교하여 몇몇 EPO-생성 세포로 혈관 및 사구체 세포 마커를 더 적은 백분율로 포함한다.
또 다른 측면에서, 농축 세포 모집단은 또한 초기 모집단에서 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포의 백분율보다 더 큰, 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포의 백분율을 포함하는 상기 논의된 바와 같은 초기 신장 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 용어 "B2"는 초기 모집단과 비교하여 세뇨관 세포를 더 큰 백분율로 포함하는 초기 신장 세포 모집단으로부터 유래된 세포 모집단을 나타낸다. 추가로, 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포 (또는 "B2")가 농축된 세포 모집단은 집합관 시스템으로부터의 일부 상피 세포를 함유할 수 있다. 비록 하나 이상의 세뇨관 세포 마커를 발현하는 세포 (또는 "B2")가 농축된 세포 모집단은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포가 상대적으로 고갈되어 있지만, 농축 모집단은 초기 세포 모집단과 비교하였을 때, 이들 세포 (EPO-생성, 사구체 및 혈관)를 더 적은 백분율로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이질성 세포 모집단은 고갈된 세포 모집단이 고갈되기 전 이질성 세포 모집단에 함유된 세포 유형(들)의 비율과 비교하여 더 적은 비율의 세포 유형(들)을 함유하도록 하나 이상의 세포 유형이 고갈된다. 고갈될 수 있는 세포 유형은 임의의 유형의 신장 세포이다. 예를 들어, 특정한 구체예에서, 고갈될 수 있는 세포 유형은 < 약 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 큰 입도의 집합관 및 세뇨관 시스템을 가진 세포를 포함하며, 이는 "B1"로서 언급된다. 특정한 다른 구체예에서, 고갈될 수 있는 세포 유형은 > 약 1.095 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함하며, 이는 "B5"로서 언급된다. 몇몇 구체예에서, 세뇨관 세포가 농축된 세포 모집단은 다음 중 모두가 상대적으로 고갈된다: "B1", "B5", 산소-조정가능한 EPO-발현 세포, 사구체 세포, 및 혈관 세포.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "저산소 (hypoxic)" 배양 조건은 대기 산소 수준 (약 21%)에서 세포를 배양하는 표준 배양 조건과 비교하여 배양 시스템에서 세포가 이용가능한 산소 수준을 감소시킨 배양 조건을 나타낸다. 비-저산소 조건은 본 명세서에서 정상 또는 표준 배양 조건을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "산소-조정가능한"은 세포가 이용가능한 산소량에 기반하여 유전자 발현 조절 (상향 또는 하향)하는 세포의 능력을 나타낸다. "저산소-유도성"은 산소 부압의 감소에 반응하여 (사전-유도 또는 초기 산소 분압과 무관하게) 유전자 발현을 상향조절하는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "생체물질"은 살아 있는 조직으로 주입하기에 적합한 천연 또는 합성 생체적합 물질을 나타낸다. 천연 생체물질은 생물계에 의해 만들어지거나 생물계로부터 기원하는 물질이다. 합성 생체물질은 생물계에 의해 만들어지지 않거나 생물계로부터 기원하지 않는 물질이다. 본 명세서에서 개시된 생체물질은 천연 및 합성 생체적합 물질의 조합일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 생체물질은 예를 들어, 폴리머 매트릭스(polymeric matrice) 및 스캐폴드(scaffold)를 포함한다. 해당 분야의 통상의 기술자는 생체물질(들)이 다양한 형태, 예를 들어, 다공성 포움(foam), 겔, 액체, 비드, 고체로서 형성될 수 있고 그리고 하나 이상의 천연 또는 합성 생체적합 물질을 포함할 수 있다는 점을 인식할 것이다. 한 가지 구체예에서, 생체물질은 하이드로겔이 될 수 있는 액체 형태의 용액이다.
용어 "변형 방출" 또는 동일한 용어 "제어 방출", "지연 방출", 또는 "서방"은 개체에게 투여 후 시간에 걸쳐 또는 하나보다 더 많은 시점에 활성제, 가령 생물활성 세포를 방출하는 제제를 나타낸다. 제제에 따라, 바람직한 시간, 가령 몇 분, 몇 시간, 며칠, 몇 주, 또는 그 이상의 범위에 걸쳐 일어날 수 있는 활성제의 변형 방출은 실질적으로 전체 투약 단위가 투여 후 바로 이용가능한 표준 제제와 대조된다. 조직 조작 및 재생 의학 적용을 위하여, 바람직한 변형 방출 제제는 국소 투여 (가령, 고형 기관에 바로 활성제를 투여) 후 다수의 시점에 활성제의 방출을 제공한다. 예를 들어, 생물활성 세포의 변형 방출 제제는 투여 시간에 바로, 그 후에 세포의 초기 방출, 그 후에 이차 방출을 제공할 것이다. 활성제의 이차 방출에 대한 시간 지연은 초기 투여 후, 몇 분, 몇 시간, 또는 며칠일 수 있다. 일반적으로, 방출 지연에 대한 시간 기간은 활성제의 생체물질 담체가 이의 구조적 완전성을 잃기까지 걸리는 시간의 기간에 상응한다. 활성제의 지연 방출이 시작되고 따라서 완전성이 분해되기 시작하고 완전성이 완전히 무너지는 시간에 완료된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 방출의 적합한 메커니즘을 인식할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "빈혈증"은 대상의 EPO-생성 세포에 의한 기능성 EPO 단백질의 부적절한 생성 및/또는 EPO 단백질의 전신 순환계 내로 부적절한 방출 및/또는 골수내 적아세포의 EPO 단백질에 대한 무능력한 반응으로 인한, 적혈구 세포의 수 및/또는 헤모글로빈 수준의 결핍을 나타낸다. 빈혈증이 있는 대상은 적혈구 항상성을 유지할 수 없다. 일반적으로, 빈혈증은 신장 기능의 감퇴 또는 상실 (가령, 만성 신부전), 상대적인 EPO 결핍과 연관된 빈혈증, 충혈성 심부전과 연관된 빈혈증, 화학요법 또는 항-바이러스 요법 (가령, AZT)과 같은 골수-억제성 요법과 연관된 빈혈증, 비-골수성 암과 연관된 빈혈증, HIV와 같은 바이러스 감염과 연관된 빈혈증, 및 자가면역 질환 (가령, 류마티스 관절염), 간질환, 및 다발성-기관계 부전과 같은 만성 질환의 빈혈증으로 발생할 수 있다.
용어 "EPO-결핍"은 빈혈증을 비롯하여, 에리트로포에틴 수용체 아고니스트(agonist) (가령, 재조합 EPO 또는 EPO 유사체)로 치료가능한 임의의 상태 또는 장애를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "기관-관련 질환"은 기관의 기능을 수행하는 기관의 능력의 상실을 야기하는 급성 또는 만성 기관 부전의 임의의 단계 또는 정도와 연관된 장애를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "신장 질환"은 혈액을 여과하고 과량의 유체, 전해질, 폐기물을 혈액으로부터 제거하는 신장의 능력의 상실을 야기하는 급성 또는 만성 신부전의 임의의 단계 또는 정도와 연관된 장애를 나타낸다. 신장 질환은 또한 빈혈증과 같은 내분비 기능이상 (에리트로포에틴-결핍), 및 무기물 불균형 (비타민 D 결핍)을 포함한다. 신장 질환은 신장에서 기원하거나 심부전, 고혈압, 당뇨병, 자가면역 질환 또는 간질환을 포함하는 (하지만 이에 제한되지 않는) 여러 가지 상태에 대해 부차적일 수 있다. 신장 질환은 신장의 급성 손상 후 발병하는 만성 신부전 상태일 수 있다. 예를 들어, 허혈 및/또는 유독물 노출에 의한 신장 손상은 급성 신부전을 일으킬 수 있으며; 급성 신장 손상 후 불완전한 회복은 만성 신부전의 발병을 초래할 수 있다.
용어 "치료"는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍의 치료, 예방 또는 방지 수단 모두를 말하며, 여기서 이들의 목적은 표적 질환을 역전, 방지 또는 지연 (경감)시키는 것이다. 이와 같은 치료를 필요로 하는 사람은 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 이미 가지고 있는 사람, 그리고 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 가질 경향이 있는 사람 또는 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 전달 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 예방해야 할 사람들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료"는 신장 기능의 안정화 및/또는 개선을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "생체내 접촉"은 세포의 농축 모집단에 의해 분비되는 산물 및 고유 기관 사이에서의 생체내 직접적인 접촉을 나타낸다. 예를 들어, 신장 세포의 농축 모집단 (또는 혼합물 또는 신장 세포/신장 세포 분획물을 함유하는 구조물)에 의해 분비되는 산물은 고유 신장과 생체내 접촉을 할 수 있다. 직접적인 생체내 접촉은 실제로 측분비, 내분비 또는 곁분비일 수 있다. 분비되는 산물은 본 명세서에서 설명된 상이한 산물의 이질성 모집단일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "리보핵산" 또는 "RNA"는 각각의 단위가 질소 염기, 리보스 슈가(sugar) 및 포스페이트로 이루어진 뉴클레오타이드 단위의 쇄를 나타낸다. RNA는 단일 또는 이중 가닥 형태일 수 있다. RNA는 소포의 일부이거나, 이에 포함되거나 이와 결합될 수 있다. 소포는 엑소좀일 수 있다. RNA는 mRNA, rRNA, 작은 RNA, snRNA, snoRNA, 마이크로RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 비코딩 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 RNA는 인간 RNA이다.
용어 "구조물"은 하나 이상의 합성 또는 천연적으로 생성되는 생체적합 물질로 제조된 스캐폴드 또는 매트릭스의 표면 상에 또는 내에 침착된 하나 이상의 세포 모집단을 나타낸다. 하나 이상의 세포 모집단은 하나 이상의 합성 또는 천연적으로 생성되는 생체적합 물질, 폴리머, 단백질 또는 펩티드로 제조된 생체물질로 코팅되고 생체물질 상에 침착되고, 생체물질 내에 포매되고, 생체물질에 부착되고, 생체물질 내에 도말되고, 또는 생체물질 내에 포착될 수 있다. 하나 이상의 세포 모집단은 시험관내 또는 생체내에서 생체물질 또는 스캐폴드 또는 매트릭스와 조합될 수 있다. 일반적으로, 스캐폴드/생체물질을 형성하는데 사용되는 하나 이상의 생체적합 물질은 그 위에 침착되는 최소한 하나의 세포 모집단의 다세포적 3-차원 구조 형성을 지시하거나 촉진하거나 허용하도록 선택된다. 구조물을 생성하는 데에 이용되는 하나 이상의 생체물질은 또한 구조물 또는 구조물의 세포 성분의 내생성 숙주 조직과의 분산 및/또는 통합을 지시, 촉진 또는 허용하거나, 구조물 또는 구조물의 세포 성분의 생존, 접목, 내성 또는 기능 수행을 지시, 촉진 또는 허용하도록 선택될 수 있다.
용어 "마커" 또는 "바이오마커"는 일반적으로 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 또는 당지질-기반 분자 마커를 나타내며, 배양된 세포 모집단에서 이의 발현 또는 존재는 표준 방법 (또는 본 명세서에서 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 특정 세포 유형인 배양된 세포 모집단 중의 하나 이상의 세포와 일치한다. 이러한 바이오마커는 표 X 및 Y에서 제시된 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 마커는 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드 또는 염색체 상의 식별가능한 물리적 위치, 가령 유전자, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 또는 고유 세포에 의해 발현되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 (예를 들어, mRNA)일 수 있다. 마커는 "유전자 발현 마커"로 언급되는 유전자의 발현 영역 또는 미지의 코딩 기능을 갖는 DNA의 일부 절편일 수 있다. 바이오마커는 세포-유래되는, 가령 분비되는 산물일 수 있다.
용어 "바이오마커 시그니쳐(signature)", "시그니쳐", "바이오마커 발현 시그니쳐", 또는 "발현 시그니쳐"는 본 명세서에서 호환적으로 사용되고 하나의 바이오마커 또는 이의 조합을 나타내며, 여기서 바이오마커의 발현은 세포 유형(들), 가령, 세포 모집단, 가령 생물활성 신장 세포를 포함한, 상피 세포, 세뇨관 세포 등의 지표다. 바이오마커 시그니쳐는 본 명세서에 제공되는 방법 및 제조에서 이용하기 위한 세포 모집단의 적합성의 지표로서 역할을 할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 바이오마커 시그니쳐는 "유전자 시그니쳐"이다. 용어 "유전자 시그니쳐"는 "유전자 발현 시그니쳐"와 호환적으로 사용되고 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 조합을 나타내며, 여기서 폴리뉴클레오티드의 발현은 세포 유형, 가령 상피 세포, 세뇨관 세포 등의 지표다. 몇몇 구체예에서, 바이오마커 시그니쳐는 "단백질 시그니쳐"이다. 용어 "단백질 시그니쳐"는 "단백질 발현 시그니쳐"와 호환적으로 사용되고 하나의 폴리펩티드 또는 이의 조합을 나타내며, 여기서 폴리펩티드의 발현은 세포 유형, 가령 상피 세포, 세뇨관 세포 등의 지표다.
용어 "발현의 수준", "발현 수준"은 호환적으로 사용되고 그리고 일반적으로 생물학적 샘플내 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 산물의 양 또는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 산물 또는 단백질을 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. "발현하는" 또는 "발현" 및 이의 문법적 변형은 생물학적 샘플에서 검출가능한 양의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 산물 또는 단백질의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 검출가능한 (상기 백그라운드 또는 대조 값) 단백질을 발현하는 것으로 언급될 수 있다. 유사하게, 샘플내 세포의 일부가 단백질을 발현한다면, 샘플은 단백질을 발현하는 것으로 언급될 수 있다. 대안으로, 샘플은 단백질을 발현하는 세포의 백분율과 관련 있는 발현의 수준을 갖는 것으로 언급될 수 있는데, 예를 들어, 샘플내 60%의 세포가 단백질을 발현한다면, 발현의 수준은 60%이다.
호환적으로 사용되는, 용어 "차등적으로 발현되는 유전자", "차등적 유전자 발현" 및 이들의 동의어는 제2 세포 또는 세포 모집단에서의 발현에 비해, 제1 세포 또는 세포 모집단에서 더 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 나타낸다. 이 용어는 또한, 배양 중 제1 또는 제2 세포의 계대 동안 시간이 지남에 따라 상이한 단계에서 더 높거나 낮은 수준으로 발현이 활성화되는 유전자를 포함한다. 또한, 차등 발현 유전자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 억제될 수 있고, 또는 폴리펩티드 산물이 상이하도록 택일적으로 스플라이싱(splicing)될 수 있다는 점이 이해된다. 이러한 차이는, 예를 들어 mRNA 수준, 표면 발현, 분비 또는 폴리펩티드의 다른 구분의 변화에 의해 입증될 수 있다. 차등 유전자 발현은 2개 이상의 유전자 또는 이들 유전자 산물 간의 발현 비교 또는 2개 이상의 유전자 또는 이들 유전자 산물 간의 발현 비율의 비교 또는 심지어, 제1 세포와 제2 세포 간에 상이한, 동일 유전자의 2개의 상이하게 가공처리된 산물의 비교를 포함할 수 있다. 차등 발현을 예를 들어 제1 세포 및 제2 세포 사이에서, 유전자 또는 이의 발현 산물의 시간적(temporal) 또는 세포적 발현 패턴의 정량적, 그리고 정성적 차이 둘 모두를 포함한다. 본 개시의 목적을 위하여, 제1 세포와 제2 세포에서 주어진 유전자의 발현 사이에 차이가 있는 경우, "차등 유전자 발현"이 존재하는 것으로 간주된다. 마커의 차등 발현은 (제2 세포) 투여 후 환자로부터의 세포에서의 발현과 비교하여, (제1 세포) 세포 모집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 전 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "저해하다", "하향-조절하다","하향-발현하다" 및 "감소하다"는 호환적으로 사용되며 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 인코딩하는 RNA 분자 또는 등가 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성이 하나 이상의 대조, 예를 들어 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조와 비교하여 감소되는 것을 의미한다. 하향-발현은, 투여 후 환자로부터의 세포와 비교하여, 세포 모집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 전 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "상향-조절하다" 또는 "과다-발현하다"는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위를 인코딩하는 RNA 분자 또는 등가 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 아단위의 활성이 하나 이상의 대조, 예를 들어 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조와 비교하여 증가되는 것을 의미한다. 과다-발현은, 투여 전 환자로부터의 세포와 비교하여, 세포 모집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 후 환자로부터의 세포에 존재할 수 있다.
용어 "대상"은 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍과 같은 기관-관련 질환의 하나 이상의 신호, 증상 또는 다른 지표를 겪거나 겪은 경험이 있는 치료받을 수 있는 환자를 포함한 임의의 단일 인간 대상을 의미한다. 이러한 대상은, 원인에 관계 없이, 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍으로 새로 진단받은 또는 이전에 진단받은, 및 재발 또는 악화를 경험한 또는 이들 질환에 걸릴 위험에 처한 대상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 대상은 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍에 대해 이전에 치료를 받았거나, 치료를 받지 않았을 수도 있다.
용어 "환자"는 치료를 바라는 임의의 단일 동물, 더욱 바람직하게는 포유류 (예를 들어, 개, 고양이, 말, 토끼, 동물원 동물, 소, 돼지, 양 및 비-인간 영장류와 같은 비-인간 동물을 포함)을 나타낸다. 가장 바람직하게는, 환자는 인간이다.
용어 "샘플" 또는 "환자 샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 일반적으로, 대상 또는 환자, 체액, 체조직, 세포주, 조직 배양물 또는 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 이 용어는 예를 들어 신장 생검과 같은 조직 생검을 포함한다. 이 용어는, 예를 들어 배양된 포유류 신장 세포와 같은 배양된 세포를 포함한다. 포유류로부터의 조직 생검 및 배양된 세포를 수득하는 방법들은 해당 분야에 잘 알려져 있다. 용어 "샘플"이 단독으로 사용된다면, "샘플"은 여전히 "생물학적 샘플" 또는 "환자 샘플"을 의미한다, 즉, 이들 용어는 호환적으로 사용된다.
용어 "시험 샘플"은 본 발명에서 개시된 방법에 의해 처리된 대상으로부터의 샘플을 나타낸다. 시험 샘플은 혈액, 정액, 혈청, 소변, 골수, 점막, 조직 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포유류 대상의 다양한 공급원으로부터 기원할 수 있다.
용어 "대조" 또는 "대조 샘플"은 시험 샘플의 결과의 연관성을 보이는데 도움이 되는 음성 또는 양성 결과가 예상되는 음성 또는 양성 대조를 나타낸다. 본 발명에 적합한 대조는 정상적인 적혈구 항상성의 특징적 지표를 나타내는 것으로 알려진 샘플, 빈혈증의 특징적 지표를 나타내는 것으로 알려진 샘플, 빈혈증이 아닌 것으로 알려진 대상으로부터 수득된 샘플, 및 빈혈증인 것으로 알려진 대상으로부터 수득된 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 제공된 방법에서 사용하기에 적합한 추가 대조는 적혈구 생성을 조절하는 것으로 알려진 약리학적 물질 (예를 들어, 재조합 EPO 또는 EPO 유사체)로 처리된 대상으로부터 유래되는 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 대조는 본 명세서에서 개시된 방법으로 처리되기 전 대상으로부터 수득되는 샘플일 수 있다. 추가의 적합한 대조는 임의 유형 또는 단계의 신장 질환을 갖는 것으로 알려진 대상으로부터 수득되는 시험 샘플, 및 임의의 유형 또는 단계의 신장 질환을 가지지 않는 것으로 알려진 대상으로부터의 샘플일 수 있다. 대조는 정상적인 건강한 매칭 대조(matched control)일 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 사용하기에 적합한 다른 대조를 인식할 것이다.
"재생 예후", "재생적 예후" 또는 "재생에 대한 예후"는 일반적으로 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물 또는 구조물의 투여 또는 이식으로부터의 유망한 재생 과정 또는 결과에 대한 예측 또는 예견을 나타낸다. 재생 예후에 있어, 예측 또는 예견은 하기 중 하나 이상에 의해 알려질 수 있다: 이식 또는 투여 후 기능성 기관 (가령, 신장)의 개선, 이식 또는 투여 후 기능성 신장의 발달, 이식 또는 투여 후 개선된 신장 기능 또는 수용력의 발달 및 이식 또는 투여 후 고유 신장에 의한 특정 마커의 발현.
"재생된 기관"은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물의 이식 또는 투여 후의 고유 기관을 나타낸다. 재생된 기관은 고유 기관에서의 기능 도는 수용력의 발달, 고유 기관에서의 기능 또는 수용력의 개선, 및 고유 기관에서 특정 마커의 발현을 포함하지만, 이에 제한되지 않은 다양한 지표로 특징지어진다. 해당 분야의 통상의 기술자는 다른 지표가 재생된 기관을 특징짓는 데에 적합하다는 점을 인식할 것이다.
"재생된 신장"은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 세포 모집단, 혼합물 또는 구조물의 이식 또는 투여 후의 고유 신장을 나타낸다. 재생된 신장은 고유 신장에서 기능 또는 수용력의 발달, 고유 신장에서 기능 또는 수용력의 개선 및 고유 신장에서 특정 마커의 발현을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 지표로 특징지어진다. 해당 분야의 통상의 기술자는 다른 지표도 재생된 신장을 특징짓는 데에 적합할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
용어 "세포 응집물" 또는 "스페로이드(spheroid)"는 단층으로서의 성장과는 반대로 3D 성장을 허용하도록 배양된 세포의 응집물 또는 조립체를 나타낸다. 용어 "스페로이드"는 응집물이 기하학적 구체가 아니라는 점을 암시한다는 것에 주목한다. 응집물은 잘 정의된 형태학으로 매우 잘 조직화될 수 있고 또는 조직화되지 않은 덩어리일 수도 있다; 응집물은 단일 세포 유형 또는 하나 보다 많은 세포 유형을 포함할 수 있다. 세포는 일차 단리물, 또는 영구적인 세포주, 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 오르가노이드(organoid) 및 기관형 배양(organotypic culture)이 이 정의에 포함된다.
용어 "주위 온도"는 본 개시의 제제가 대상에게 투여될 때의 온도를 나타낸다. 일반적으로, 주위 온도는 온도-제어된 환경의 온도이다. 주위 온도는 범위가 약 18℃ 내지 약 30℃이다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 또는 약 30℃이다.
본 명세서에서 사용될 때 용어 "라벨"은 핵산 프로브(probe) 또는 항체와 같은 시약과 직접적으로 또는 간접적으로 접합되거나 융합되고 그리고 접합되거나 융합된 시약의 검출을 촉진하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 라벨은 그 자체로 검출가능하고 (가령, 방사선 동위원소 라벨 또는 형광 라벨) 또는, 효소 라벨의 경우에는, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 이 용어는 프로브 또는 항체와 검출가능한 물질이 커플링함으로써 (즉, 물리적으로 연결됨으로써) 프로브 또는 항체의 직접적인 라벨링, 그리고 직접적으로 라벨링된 또 다른 시약으로의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접적인 라벨링을 아우르는 것으로 의도된다. 간접적인 라벨링의 예시는 형광으로 라벨링된 이차 항체를 이용하여 일차 항체의 검출 및 형광으로 라벨링된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있도록 비오틴으로 DNA 프로브의 말단-라벨링을 포함한다.
용어 "검출"은 직접적인 및 간접적인 검출을 비롯한 검출의 임의의 수단을 포함한다.
"키트"는 적어도 하나의 시약, 가령 신장 질환의 치료를 위한 약물, 또는 본 명세서에서 개시된 바와 같은 바이오마커 유전자 또는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함한 임의의 제조품 (가령, 패키지 또는 용기)이다. 제조품은 바람직하게, 본 명세서에서 개시된 방법을 수행하기 위한 단위로서 홍보되고, 배분되고, 또는 판매된다.
2. 세포 모집단
본 개시의 제제는 신장 질환의 치료에서 이용하기 위한, 즉, 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공하기 위한 특이적 생물활성 성분 또는 세포 유형이 농축되고 및/또는 특이적 비활성 또는 바람직하지 않은 성분 또는 세포 유형이 고갈된, 신장 세포의 단리된, 이질성 모집단, 및 이의 혼합물을 함유할 수 있고, Presnell et al. U.S. 2011-0117162 및 Ilagan et al. PCT/US2011/036347에서 이전에 설명되었고, 이의 전체 내용은 참조로서 본 명세서에 편입된다. 제제는 건강한 개체와 비교하여 세포 성분은 결여되나 치료학적 특성을 보유한, 즉 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공하는 단리된 신장 세포 분획물을 함유할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 세포 분획물, 및/또는 세포의 혼합물은 건강한 개체, 신장 질환을 가진 개체, 또는 본 명세서에서 설명된 대상으로부터 유래될 수 있다.
본 개시는 단리된 세포 모집단(들), 세포 분획물(들), 혼합물(들), 농축된 세포 모집단(들), 세포 응집물(들), 및 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 생물활성 세포 모집단과 함께 이용하는 데에 적합한 제제를 제공한다. 구체예에서, 생물활성 세포 모집단은 생물활성 신장 세포이다.
생물활성 세포 모집단
본 개시는 생물활성 세포 모집단을 필요로 하는 대상내 표적 기관 또는 조직에 투여되어야 하는 생물활성 세포 모집단에 적합한 치료학적 제제를 고려한다. 생물활성 세포 모집단은 일반적으로, 대상에게 투여 시 치료학적 특성을 잠재적으로 갖는 세포 모집단을 나타낸다. 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상에게 투여시, 물활성 신장 세포 모집단은 대상에서 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 제공할 수 있다. 치료학적 특성은 재생 효과를 포함할 수 있다.
생물활성 세포 모집단은 줄기 세포 (가령, 만능, 다능, 소능, 또는 단능) 가령, 배아 줄기 세포, 양수 줄기 세포, 성체 줄기 세포 (가령, 조혈, 유방, 장, 간엽, 태반, 폐, 골수, 혈액, 제대, 내피, 치수, 지방, 신경, 후각, 신경관, 고환), 유도 만능 줄기 세포; 유전적으로 변형된 세포; 그리고 신체의 임의의 공급원으로부터 유래된 세포 모집단 또는 조직 외식편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 개시의 제제는 또한, 2011년 6월 9일에 제출된 Basu et al. PCT/US11/39859에서 설명된 바와 같은 신장 지방-유래 세포 모집단과 함께; 및 2011년 5월 3일에 제출된 Ludlow et al. U.S. 2010-0131075 및 Ludlow et al. PCT/US11/35058에서 설명된 지방-유래 또는 말초 혈액-유래 평활근과 함께; 또는 Atala U.S. 6,576,019에서 설명된 바와 같은 방광-유래 요로상피 또는 평활근과 함께 이용될 수 있으며, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다. 생물활성 세포 모집단은 자연에서 단리된, 농축된, 정제된, 동질성, 또는 이질성일 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 개시의 제제에서 이용하는 데에 적합한 다른 생물활성 세포 모집단을 인식할 것이다.
한 가지 구체예에서, 세포의 공급원은 의도된 표적 기관 또는 조직과 동일하다. 예를 들어, 신장 세포는 신장에 투여되어야 하는 제제에서 이용되기 위해 신장으로부터 공급될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포의 공급원은 의도된 표적 기관 또는 조직과 동일하지 않다. 예를 들어, 에리트로포이에틴-발현 세포는 신장에 투여되어야 하는 제제에서 이용되기 위해 신장 지방으로부터 공급될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시는 생물활성 성분은 농축되고 비활성 또는 바람직하지 않은 성분들은 고갈된, 신장 세포의 이질성 모집단의 특정한 아분획물을 함유한 제제는 초기 세포 모집단보다 우월한 치료학적 및 재생적 결과를 제공한다는 점을 제공한다. 예를 들어, 비활성 또는 바람직하지 않은 성분, 가령, B1 및 B5가 고갈된, 본 명세서에서 설명된 생물활성 신장 세포, 가령 B2, B4, 및 B3은 단독으로 또는 혼합되어, 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 위해 이용되어야 하는 제제의 일부일 수 있다.
또 다른 측면에서, 제제는 하나 이상의 세포 유형, 가령 혈관, 내분비, 또는 내피, 즉 B4'가 고갈되거나 결핍된 특이적인 아분획물, B4를 함유하며, 이는 단독으로 또는 다른 생물활성 아분획물, 가령 B2 및/또는 B3과 혼합되었을 때, 치료학적 특성, 가령 신장 기능의 안정화 및/또는 개선 및/또는 재생을 보유한다. 바람직한 구체예에서, 생물활성 세포 모집단은 B2이다. 특정한 구체예에서, B2 세포 모집단은 B4 또는 B4'와 혼합된다. 다른 구체예에서, B2 세포 모집단은 B3과 혼합된다. 다른 구체예에서, B2 세포 모집단은 B3 및 B4 둘 모두와 혼합되고, 또는 B3 및/또는 B4의 특이적 세포 성분과 혼합된다.
B2 세포 모집단은 다음 중 하나 이상으로 구성된 군에서 선택된 세뇨관 세포 마커의 발현으로 특징지어진다: 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타아제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라아제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 담체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나아제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나아제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8), 및 집합관 마커 아쿠아포린-4 (Aqp4). B2는 B3 및/또는 B4보다 크고 더욱 과립화되어, 약 1.045 g/ml 내지 약 1.063 g/ml (설치류), 약 1.045 g/ml 내지 1.052 g/ml (인간), 및 약 1.045 g/ml 내지 약 1.058 g/ml (개)의 부력 밀도를 갖는다.
B3 세포 모집단은 일부 EPO-생성 세포와 함께 혈관, 사구체, 및 근위 세뇨관 마커의 발현으로 특징지어지며, B2 및 B4와 비교하여 중간 정도의 크기 및 입도를 가져 약 1.063 g/ml 내 약 1.073 g/ml (설치류), 약 1.052 g/ml 내지 약 1.063 g/ml (인간), 및 약 1.058 g/ml 내지 약 1.063 g/ml (개)의 부력 밀도를 갖는다. B3은 다음 중 하나 이상으로 구성된 군에서 선택되는 마커의 발현으로 특징지어진다: 아쿠아포린 7 (Aqp7), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절자 2 (Fxyd2), 용질 담체 패밀리 17 (나트륨 포스페이트), 멤버 3 (Slc17a3), 용질 담체 패밀리 3, 멤버 1 (Slc3a1), 클라우딘 2 (Cldn2), 냅신 A 아스파틱 펩티다아제 (Napsa), 용질 담체 패밀리 2 (촉진된 글루코오즈 수송체), 멤버 2 (Slc2a2), 알라닐 (막) 아미노펩티다아제 (Anpep), 막통과 단백질 27 (Tmem27), 아실-CoA 신쎄타아제 중간-쇄 패밀리 멤버 2 (Acsm2), 글루타티온 퍼옥시다아제 3 (Gpx3), 프룩토오즈-1,6- 비포스파타아제 1 (Fbp1), 및 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소 2 (Agxt2). B3은 또한, 혈관 발현 마커 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam) 및 사구체 발현 마커 포도신 (Podn)으로 특징지어진다.
B4 세포 모집단은 다음 중 하나 이상을 함유한 혈관 마커 세트: PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146; 다음 중 하나 이상을 함유한 사구체 마커 세트: 포도신 (Podn), 및 네프린 (Neph); 및 비분할된 (UNFX), B2 및 B3과 비교하여 산소-조정가능한 EPO 농축 모집단의 발현으로 특징지어진다.　 B4는 또한 다음 마커 중 하나 이상의 발현으로 특징지어진다: 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4 (Cxcr4), 엔도텔린 수용체 유형 B (Ednrb), 콜라겐, 유형 V, 알파 2 (Col5a2), 카드헤린 5 (Cdh5), 플라스미노겐 활성자, 조직 (Plat), 안지오포이에틴 2 (Angpt2), 키나아제 삽입 도메인 단백질 수용체 (Kdr), 분비 단백질, 산성의 시스테인-풍부 (오스테오넥틴) (Sparc), 세르글리신 (Srgn), TIMP 메탈로펩티다아제 저해제 3 (Timp3), 윌름즈(Wilms) 종양 1 (Wt1), 날개없는-유형 MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 4 (Wnt4), G-단백질 신호전달 4 (Rgs4)의 조절자, 혈소판 내피 세포 흡착 분자 (Pecam), 및 에리트로포이에틴 (Epo). B4는 또한 B2 또는 B3과 비교하여 더 작고, 덜 과립화된 세포로 특징지어지며, 여기서 부력 밀도는 약 1.073 g/ml 내지 약 1.091g/ml (설치류), 약 1.063 g/ml 내지 약 1.091 g/mL (인간 및 개)이다.
B4' 세포 모집단은 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 부력 밀도를 갖고 그리고 다음 마커 중 하나 이상을 발현하는 것으로서 정의된다: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, 포도신, 네프린, EPO, CK7, CK8/18/19. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 다음 중 하나 이상을 함유한 혈관 마커 세트의 발현으로 특징지어진다: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단은 내분비 마커 EPO의 발현으로 특징지어진다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 다음 중 하나 이상을 함유한 사구체 마커 세트의 발현으로 특징지어진다: 포도신 (Podn), 및 네프린 (Neph). 특정한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 PECAM, vEGF, KDR, HIF1a 중 하나 이상을 함유한 혈관 마커 세트의 발현에 의해 그리고 내분비 마커 EPO의 발현으로 특징지어진다. 또 다른 구체예에서, B4'는 또한 B2 또는 B3과 비교하여 더 작고, 덜 과립화된 세포로 특징지어지며, 여기서 부력 밀도는 약 1.073 g/ml 내지 약 1.091g/ml (설치류), 약 1.063 g/ml 내지 약 1.091 g/mL (인간 및 개)이다.
하나의 측면에서, 본 개시는 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 혈관 세포, 및 사구체 세포 중 적어도 하나를 포함한 인간 신장 세포의 단리된, 농축 B4' 세포 모집단을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 몇몇 구체예에서, B4' 세포 모집단은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다.
한 가지 구체예에서, 제제는 B4' 세포 모집단을 함유하지만 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포를 포함한 B2 세포 모집단은 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단 제제는 < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단 제제는 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다.
한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단-함유 제제는 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포를 포함한 B2 세포 모집단; < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단; 및 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다. 몇몇 구체예에서, B4' 세포 모집단은 신장 질환을 갖는 대상으로부터 유래될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시는 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포의 단리된, 농축 모집단을 포함한, 제1 세포 모집단, B2 및 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포를 포함하지만, 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 모집단, B4'를 포함한 인간 신장 세포의 혼합물을 함유한 제제를 제공하며, 여기서 혼합물은 < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단, 또는 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소분자를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다. 특정한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정한 구체예에서, B2는 집합관 상피 세포를 추가로 포함한다. 한 가지 구체예에서, 제제는 수용체-매개된 알부민 흡수를 할 수 있는 세포의 혼합물을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 혼합물은 시험관내 및 생체내 모두에서 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생성하고 및/또는 생성을 자극할 수 있는 HAS-2-발현 세포를 함유한다. 모든 구체예에서, 제1 및 제2 세포 모집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다 (Basu et al. Lipids in Health and Disease, 2011, 10:171).
한 가지 구체예에서, 제제는 생체내 전달 시 재생 자극을 제공할 수 있는 혼합물을 함유한다. 다른 구체예에서, 혼합물은 생체내 전달 시 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생성 및/또는 내분비 기능의 감퇴를 감소시키고, 안정화시키고 또는 개선할 수 있다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 신장 질환을 갖는 대상으로부터 유래된다.
하나의 측면에서, 본 개시는 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포, 혈관 세포, 및 사구체 세포 중 적어도 하나를 포함한 인간 신장 세포의 단리된, 농축 B4' 모집단을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 발현되지 않는 사구체 마커는 포도신일 수 있다. 몇몇 구체예에서, B4' 세포 모집단은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다.
한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단-함유 제제는 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포를 포함한 B2 세포 모집단을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, B4' 세포 모집단 제제는 < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 사구체 세포를 포함한 B1 세포 모집단을 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, B1 세포 모집단 제제는 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다.
한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단-함유 제제는 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포를 포함한 B2 세포 모집단; < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단; 및 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다. 몇몇 구체예에서, B4' 세포 모집단은 신장 질환을 갖는 대상으로부터 유래될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시는 밀도가 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포의 단리된, 농축 모집단을 포함한, 제1 세포 모집단, B2, 및 약 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하지만 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 모집단, B4'를 포함한 인간 신장 세포의 혼합물을 함유한 제제를 제공하며, 여기서 혼합물은 < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단, 또는 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력을 갖는 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다. 특정한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 한 가지 구체예에서, B4' 세포 모집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정한 구체예에서, B2는 집합관 상피 세포를 추가로 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포의 혼합물은 수용체-매개된 알부민 흡수를 할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 혼합물은 시험관내 및 생체내 모두에서 고분자량의 히알루론산 (HA) 종을 생성하고 및/또는 생성을 자극할 수 있는 HAS-2-발현 세포를 함유한다. 모든 구체예에서, 제1 및 제2 세포 모집단은 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 세포 분획물 또는 농축 세포 모집단 (가령, B1, B2, B3, B4 (또는 B4'), 및 B5)의 조합을 포함한 이질성 신장 세포 모집단을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 조합은 약 1.045 g/ml 내지 약 1.091 g/ml의 부력 밀도를 갖는다. 한 가지 다른 구체예에서, 조합은 1.045 g/ml 내지 약 1.099 g/ml 미만 또는 약 1.100 g/ml의 부력 밀도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 조합은 밀도 구배 상에서의 분리에 의해, 가령, 원심분리에 의해 결정되는 바와 같은 부력 밀도를 갖는다. 또 다른 구체에에서, 세포 분획물의 조합은 B1 및/또는 B5가 고갈된 B2, B3, 및 B4 (또는 B4')를 함유한다. 몇몇 구체예에서, 세포 분획물의 조합은 B2, B3, B4 (또는 B4') 및 B5를 함유하지만 B1은 고갈된다. 일단 B1 및/또는 B5가 고갈되고 나면, 조합은 B2, B3, 및 B4 (또는 B4') 세포 분획물의 조합을 포함한 제제의 제조에 앞서 시험관 내에서 후속적으로 배양될 수 있다.
본 개시의 발명자들은 놀랍게도, B2, B3, B4, 및 B5의 B1-고갈 조합의 시험관내 배양이 B5의 고갈을 야기한다는 점을 밝혀내었다. 한 가지 구체예에서, B5는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5회 계대 후 고갈된다. 한 가지 다른 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 조건 하에 계대되는 B2, B3, B4, 및 B5 세포 분획물 조합은 계대된 세포 모집단이 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 또는 약 0.5% 미만인 백분율에서 B5를 갖는 계대된 세포 모집단을 제공한다.
또 다른 구체예에서, B4'는 세포 분획물의 조합의 일부이다. 한 가지 다른 구체예에서, B5의 시험관내 배양 고갈은 저산소 조건 하에 일어난다.
한 가지 구체예에서, 제제는 생체내 전달 시 재생 자극을 제공할 수 있는 혼합물을 함유한다. 다른 구체예에서, 혼합물은 생체내 전달 시 사구체 여과, 세뇨관 재흡수, 소변 생성, 및/또는 내분비 기능의 감퇴를 감소시키고, 안정화시키고, 또는 개선할 수 있다. 한 구체예에서, B4' 세포 모집단은 신장 질환을 갖는 대상으로부터 유래된다.
바람직한 구체예에서, 제제는 B3 및/또는 B4와 조합하여 B2를 포함하는 혼합물을 함유한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 혼합물은 B3 및/또는 B4'와 조합하여 B2를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 혼합물은 (i) B3 및/또는 B4와 조합하여 B2; 또는 (ii) B3 및/또는 B4'와 조합하여 B2로 구성되거나 본질적으로 구성된다.
B4' 세포 모집단을 함유한 혼합물은 비-건강 대상으로부터 또한 수득된 B2 및/또는 B3 세포 모집단을 함유할 수 있다. 비-건강 대상은 B4' 분획물이 수득되었던 동일 대상일 수 있다. B4' 세포 모집단과 대조적으로, 비-건강 대상으로부터 수득된 B2 및 B3 세포 모집단은 건강한 개체로부터 유래된 초기 신장 세포 모집단과 비교하여 전형적으로 하나 이상의 특이적 세포 유형이 결핍되지 않는다.
Presnell et al. WO/2010/056328에서 설명된 바와 같이, B2 및 B4 세포 제조물은 히알루론산 신타아제-2 (HAS-2) - 더욱 특이적으로 B2 세포 모집단에 농축되는 마커의 작용을 통하여, 더 큰 분자량의 히알루론산 (HA) 종을 시험관내 및 생체내 모두에서 발현할 수 있다는 점이 밝혀졌다. 5/6 Nx 모델에서 B2로의 처리는 섬유증의 감소를 보여주었고, 동시에 생체 내에서 HAS-2 발현이 강하게 발현되고 처리된 조직 내에서 고분자량의 HA의 생성이 예상되었다. 특히, 처리되지 않은 5/6 Nx 모델은 HAS-2의 제한된 검출과 함께 섬유증을 초래하였고 고분자량 HA는 거의 생성되지 않았다. 이론에 제한됨이 없이, B2 (및 어느 정도는 B4)에 의해 주로 생성되는 항-염증성 고분자량 HA 종이 신장 섬유증의 감소 및 신장 재생에 있어 세포 제조물과 함께 상승적으로 작용한다는 점이 가정된다. 이에 따라, 본 개시는 히알루론산을 포함한 생체물질과 함께 본 명세서에서 설명된 생물활성 신장 세포를 함유한 제제를 포함한다. 이식된 세포에 의한 직접적인 생성 또는 생성의 자극을 통한 재생적 자극의 생체물질 성분의 제공이 또한 본 개시에서 고려된다.
하나의 측면에서, 본 개시는 신장 질환, 빈혈증 및/또는 EPO 결핍의 치료를 이를 필요로 하는 대상에서 치료하는 데에 이용하기 위한 EPO-생성 신장의 단리된 이질성 모집단을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 세포 모집단은 신장 생검으로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 세포 모집단은 전체 신장 조직으로부터 유래된다. 한 가지 다른 구체예에서, 세포 모집단은 신장 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된 포유류 신장 세포의 시험관내 배양으로부터 유래된다. 모든 구체예에서, 이들 모집단은 비분할된 세포 모집단이며, 본 명세서에서는 비-농축 세포 모집단으로도 또한 언급된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 농축 아집단에서 EPO-생성 세포의 비율이 초기 또는 최초 세포 모집단에서의 EPO-생성 세포의 비율보다 더 크도록 추가 농축된, 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 신장 세포의 단리된 모집단을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 농축 EPO-생성 세포 분획물은 비농축 초기 모집단에 함유된 간질 섬유모세포 및 세뇨관 세포와 비교하여 더 큰 비율의 간질 섬유모세포 및 더 적은 비율의 세뇨관 세포을 함유한다. 특정한 구체예에서, 농축 EPO-새성 세포 분획물은 비농축 초기 모집단에 함유된 사구체 세포, 혈관 세포 및 집합관 세포와 비교하여 더 큰 비율의 사구체 세포 및 혈관 세포 그리고 더 적은 비율의 집합관 세포을 함유한다. 이러한 구체예에서, 이들 모집단은 본 명세서에서 "B4" 세포 모집단으로도 언급된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 하나 이상의 추가 신장 세포 모집단과 혼합된 EPO-생성 신장 세포 모집단을 함유하는 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, EPO-생성 세포 모집단은 EPO-생성 세포가 농축된 제1 세포 모집단, 가령, B4이다. 또 다른 구체예에서, EPO-생성 세포 모집단은 EPO-생성 세포가 농축되지 않은 제1 세포 모집단, 가령 B2이다. 또 다른 구체예에서, 제1 세포 모집단은 제2 신장 세포 모집단과 혼합된다. 몇몇 구체예에서, 제2 세포 모집단은 세뇨관 세포가 농축되며, 이는 세뇨관 세포 표현형의 존재로 입증될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나의 세뇨관 세포 마커의 존재로 명시될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세뇨관 세포 표현형은 하나 이상의 세뇨관 세포 마커의 존재로 명시될 수 있다. 세뇨관 세포 마커는 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타아제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라아제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 담체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나아제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나아제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 제1 세포 모집단은 간질-유래 세포, 세뇨관 세포, 집합관-유래 세포, 사구체-유래 세포, 및/또는 혈액 또는 혈관구조로부터 유래된 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 개의 신장 세포 유형 중 적어도 하나와 혼합된다.
본 개시의 제제는 B2 및/또는 B3과의 혼합물의 형태로, 또는 농축 세포 모집단, 가령 B2+B3+B4/B4'의 형태로 B4 또는 B4'를 함유한 EPO-생성 신장 세포 모집단을 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 제제는 배양 시스템의 산소 분압의 감소가 EPO의 발현의 유도를 야기하도록, EPO 발현 및 산소에 대한 생물반응성으로 특징지어지는 EPO-생성 신장 세포 모집단을 함유한다. 한 가지 구체예에서, EPO-생성 세포 모집단은 EPO-생성 세포가 농축된다. 한 가지 구체예에서, EPO 발현은 세포가 이용가능한 산소의 정상적인 대기 수준 (~21%)에서 배양된 세포 모집단과 비교하여 배양 시스템에서 이용가능한 산소 수준이 감소되는 조건 하에 세포 모집단이 배양될 때 유도된다. 한 가지 구체예에서, 더 낮은 산소 조건에서 배양된 EPO-생성 세포는 정상적인 산소 조건에서 배양된 EPO-생성 세포에 비해 더 큰 수준의 EPO를 발현한다. 일반적으로, 이용가능한 산소의 감소된 수준 (저산소 배양 조건이라고도 함)에서 세포의 배양은 이용가능한 산소의 정상적인 대기 수준 (정상 또는 표준 산소 배양 조건이라고도 함)에서 세포의 배양에 비해 감소된 산소의 수준이 감소된다는 것을 의미한다. 한 가지 구체예에서, 저산소 세포 배양 조건은 약 1% 미만의 산소, 약 2% 미만의 산소, 약 3% 미만의 산소, 약 4% 미만의 산소 또는 약 5% 미만의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 정상 또는 표준 산소 배양 조건은 약 10% 산소, 약 12% 산소, 약 13% 산소, 약 14% 산소, 약 15% 산소, 약 16% 산소, 약 17% 산소, 약 18% 산소, 약 19% 산소, 약 20% 산소, 또는 약 21% 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
한 가지 다른 구체예에서, EPO의 유도 또는 증가된 발현은 약 5% 미만의 이용가능한 산소에서 세포를 배양하고 대기 (약 21%) 산소에서 배양된 세포와 EPO 수준을 비교함으로써 수득되고 관측될 수 있다. 또 다른 구체예에서, EPO의 유도는 세포의 배양이 대기 산소 (약 21%)에서 얼마간의 시간 동안 배양되는 제1 배양 단계 및 이용가능한 산소 수준이 감소되고 약 5% 미만의 이용가능한 산소에서 동일한 세포가 배양되는 제2 배양 단계를 포함하는 방법에 의해 EPO를 발현할 수 있는 세포의 배양으로 수득된다. 또 다른 구체예에서, 저산소 조건에 반응하는 EPO 발현은 HIF1α에 의해 조절된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 해당 분야에 공지된 다른 산소 조절 배양 조건이 본 명세서에서 설명된 세포에 대해 이용될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
하나의 측면에서, 제제는 관류 조건에 대한 생물-반응성 (가령, EPO 발현)으로 특징지어진 EPO-생성 포유류 세포의 농축 모집단을 함유한다. 한 가지 구체예에서, 관류 조건은 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 유동 (관류)을 포함한다. 한 가지 구체예에서, EPO 발현은 동력이 유동을 통해 세포에 전달되는 이러한 방식으로 세포가 배양되는 배지는 간헐적으로 또는 연속적으로 순환되거나 교반될 때 기계적으로-유도된다. 한 가지 구체예에서, 일시적, 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 겪는 세포는 그들이 3-차원 구조로서 존재하거나 이러한 3-차원 구조를 형성하기 위한 골격 및/또는 공간을 제공하는 물질 내에서 또는 물질 상에 존재하는 이러한 방식으로 배양된다. 한 가지 구체예에서, 세포는 다공성 비드 상에서 배양되고 흔들리는 플랫폼(platform), 궤도를 선회하는 플랫폼 또는 스피너 플라스크(spinner flask)를 통해 간헐적 또는 연속적 유체 흐름을 받게 된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 3-차원 스캐폴딩에서 배양되며, 스캐폴드는 고정되고 유체는 스캐폴딩를 통하여 또는 가로질러 방향성 있게 흐르도록 한 장치에 놓인다. 해당 분야의 통상의 기술자는 해당 분야에 공지된 다른 관류 배양 조건이 본 명세서에서 설명된 세포에 대해 이용될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
세포 응집물
하나의 다른 측면에서, 본 개시의 제제는 세포 응집물 또는 스페로이드를 함유한다. 한 가지 구체예에서, 세포 응집물은 본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 모집단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포 응집물은 생물활성 신장 세포, 가령 신장 세포 혼합물, 농축 신장 세포 모집단, 및 신장 세포 분획물의 조합을 포함한다.
특정한 구체예에서, 본 개시의 생물활성 신장 세포는 본 명세서에서 추가로 설명된 바와 같은 3D 형식으로 배양될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 용어 "오르가노이드"는 세포의 축적을 나타내며, 여기서 표현형 및/또는 기능은 고유 신장과 일치한다. 몇몇 구체예에서, 오르가노이드는 주어진 조직의 생체 내에서 전형적으로 발견되는 여러 가지 계통의 세포의 혼합된 모집단을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 개시의 오르가노이드는 임의의 수단을 통해, 시험관 내에서 형성되며, 여기서 본 개시의 세포는 응집물을 형성하며, 상기 응집물은 결과적으로 스페로이드, 오르가노이드, 또는 이의 조합을 형성할 수 있다. 이러한 응집물, 스페로이드 또는 오르가노이드는 몇몇 구체예에서, 특정한 기관과 일치하는 구조를 추정한다. 몇몇 구체예에서, 이러한 응집물, 스페로이드 또는 오르가노이드는 표면 마커를 발현하며, 상기 마커는 특정한 기관의 세포에 의해 전형적으로 발현된다. 몇몇 구체예에서, 이러한 응집물, 스페로이드 또는 오르가노이드는 특정한 기관의 세포에 의해 전형적으로 발현되는, 화합물 또는 물질을 생성한다. 특정한 구체예에서, 본 개시의 세포는 천연 기질, 가령 젤라틴 상에서 배양될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 개시의 세포는 합성 기질, 가령 PGLA 상에서 배양될 수 있다.
비활성 세포 모집단
본 명세서에서 개시된 바와 같이, 생물활성 성분은 농축되고 비활성 또는 바람직하지 않은 성분은 고갈된, 신장 세포의 이질성 모집단의 특정한 아분획물은 초기 모집단보다 우월한 치료학적 및 재생 결과를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 개시에 제공된 제제는 B1 및/또는 B5 세포 모집단이 고갈된 세포 모집단을 함유한다. 예를 들면, 다음은 B1 및/또는 B5가 고갈될 수 있다: B2, B3, 및 B4 (또는 B4') 중 2개 이상의 혼합물; B2, B3, 및 B4 (또는 B4')의 농축 세포 모집단.
B1 세포 모집단은 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함하며, 여기서 세포 모집단은 약 1.045 g/m 미만의 부력 밀도를 갖는다. B5 세포 모집단은 약 1.091 g/ml 초과인 부력 밀도를 갖고 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포로 구성된다.
세포 모집단을 단리시키고 배양하는 방법
하나의 측면에서, 본 개시의 제제는 신장 조직으로부터 단리되고 및/또는 배양된 세포 모집단을 함유한다. 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍, 및 사구체 여과 결핍의 치료을 포함한, 치료학적 용도를 위한 제제에서 이용될 신장 세포 성분, 가령 농축 세포 모집단을 분리하고 단리시키기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 한 가지 구체예에서, 세포 모집단은 새롭게 분해된, 즉 기계적으로 또는 효소로 분해된 신장 조직으로부터 또는 포유류 신장 세포의 이질성 시험관내 배양물로부터 단리된다.
분리하기 전 저산소 배양 조건에서 배양되어 B4'를 비롯한 B4, 및 B2 및/또는 B3 분획물에서 개선된 세포 분포 및 조성을 제공하는 신장 세포의 이질성 혼합물을 함유할 수 있다. 질환이 있는 및 질환이 없는 신장으로 단리된 신장 세포에 대해 B2로부터 B4에서 산소-의존 세포의 농축이 관찰되었다. 이론에 제한됨 없이, 이것은 다음 현상 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있다: 1) 저산소 배양 기간 동안 특이적인 세포 성분들의 선택적 생존, 사멸 또는 증식; 2) 저산소 배양에 반응하여 세포 입도 및/또는 크기의 변화, 이에 의해 부력 밀도 변화 및 밀도 구배 분리 동안 후속적인 국소화에 영향을 줌; 및 3) 저산소 배양 기간에 반응하여 세포 유전자/단백질 발현의 변화, 이에 의해 구배의 임의의 주어진 분획물 내에서 세포의 차등적 특징을 초래함. 따라서, 한 가지 구체예에서, 세뇨관 세포가 농축된 세포 모집단, 가령 B2를 함유한 제제는 저산소-저항성이다.
세포 모집단을 분리하고 단리시키기 위한 예시적인 기술은 관심 모집단 내에 함유된 상이한 세포 유형의 상이한 비중에 기반하여 밀도 구배 상에서 분리하는 것을 포함한다. 임의의 주어진 세포 유형의 비중은 세포내 입도, 세포내 물의 용적 및 다른 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 하나의 측면에서, 본 개시는 인간, 개 및 설치류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수 종에 걸쳐 세포 제조물, 가령 B4'를 비롯한, B2 및 B4의 단리를 위한 최적의 구배 조건을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 밀도 구배는 신장 세포의 이절성 모집단으로부터 유래된, 세뇨관 세포 분획물의 신규 농축 모집단, 즉 B2 세포 모집단을 수득하는 데에 이용된다. 한 가지 구체예에서, 밀도 구배는 신장 세포의 이절성 모집단으로부터 유래된, EPO-생성 세포 분획물의 신규 농축 모집단, 즉 B4 세포 모집단을 수득하는 데에 이용된다. 다른 구체예에서, 밀도 구배는 신장의 세뇨관 세포, 사구체 세포, 및 내피 세포의 농축 아집단을 수득하는 데에 이용된다. 한 가지 구체예에서, EPO-생성 및 세뇨관 세포는 모두 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리된다. 한 가지 구체예에서, EPO-생성, 사구체 및 혈관 세포는 다른 세포 유형으로부터 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리되며 동시에, 세뇨관 세포 및 집합관 세포의 아집단은 다른 세포 유형으로부터 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 부수적으로 분리된다. 한 가지 다른 구체예에서, 내분비, 사구체 및/또는 혈관 세포는 다른 세포 유형으로부터 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 분리되며, 동시에 세뇨관 세포 및 집합관 세포의 아집단은 다른 세포 유형으로부터 및 적혈구 및 세포 파편으로부터 부수적으로 분리된다.
하나의 측면에서, 본 개시의 제제는 하기 설명된 특정한 주요 특징에 기반하여, 물에서 60% 비이온성 요오드 처리된 화합물 요오딕사놀을 포함하는, OPTIPREP® (Axis-Shield) 밀도 구배 매질을 부분적으로 이용함으로써 발생되는 세포 모집단을 함유한다. 하지만, 해당 분야의 통상의 기술자는 본 개시의 세포 모집단을 분리하기 위한 필수적인 특징을 포함하는, 해당 분에 공지된 세포 표면 마커를 이용하는 임의의 밀도 구배 또는 다른 수단, 가령 면역학적 분리가 이용될 수 있다는 점을 인식할 것이다. 또한, 밀도 구배를 통하여 세포 아집단의 분리에 기여하는 동일한 세포 특징 (크기 및 입도)은 유동세포 분석법을 통하여 세포 아집단을 분리하는 데에 이용될 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 인식되어야 한다 (전방 산란 = 유동세포 분석법을 통한 크기 반영, 및 측면 산란 = 입도 반영). 중요하게도, 밀도 구배 매질은 특정 관심 세포에 대해 낮은 독성을 가져야 한다. 밀도 구배 매질이 특정 관심 세포에 대해 낮은 독성을 가져야 하는 동시에, 본 개시는 관심 세포의 선별 과정에서 역할을 하는 구배 매질의 용도를 고려한다. 이론에 제한됨 없이, 로딩 및 회수 단계 사이에서 상당한 세포 손상이 있기 때문에, 요오딕사놀을 포함한 구배에 의해 회수되는, 본 명세서에 개시된 세포 모집단은 요오딕사놀-저항성인 것으로 보이며, 이는 구배 조건 하에 요오딕사놀에 노출로 특정한 세포의 제거가 초래된다는 점을 제시한다. 요오딕사놀 구배 후에 특정 밴드에 나타나는 세포는 요오딕사놀 및/또는 밀도 구배 노출의 임의의 부작용에 대한 저항성이다. 이에 따라, 본 명세서에서 설명된 제제를 위한 세포 모집단의 단리 및/또는 선별에서 약한 정도 내지 중간 정도의 신장독소인, 추가적인 대조 매질의 이용이 또한 고려된다. 추가로, 밀도 구배 매질은 인간 혈장에서 단백질과 결합하지 않아야 하고 또는 관심 세포의 주요 기능에 역효과를 주지 않아야 한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 신장 세포 유형이 농축 및/또는 고갈된 세포 모집단을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 신장 세포 유형은 BD FACSAria™ 또는 등가물을 이용하여 농축 및/또는 고갈될 수 있다.
또 다른 측면에서, 제제는 자기 세포 분류를 이용하여 신장 세포 유형이 농축 및/또는 고갈된 세포 모집단을 함유한다. 한 가지 구체예에서, 신장 세포 유형은 Miltenyi autoMACS® 시스템 또는 등가물을 이용하여 농축 및/또는 고갈될 수 있다.
또 다른 측면에서, 제제는 3-차원 배양된 신장 세포 모집단을 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 세포 모집단을 배양하는 방법은 연속적 관류를 통하여 이루어진다. 한 가지 구체예에서, 3-차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양된 세포 모집단은 정적으로 배양된 세포 모집단과 비교할 때, 더 큰 세포성(cellularity) 및 상호연결성을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 3차원 배양 및 연속 관류를 통하여 배양된 세포 모집단은 이러한 세포 모집단의 정적인 배양과 비교할 때, 더 큰 EPO 발현, 그리고 e-카드헤린과 같은 신장 세뇨관-연관 유전자의 증진된 발현을 나타낸다. 또 다른 구체예에서, 연속적 관류를 통하여 배양된 세포 모집단은 정적으로 배양된 세포 모집단과 비교할 때, 더 높은 수준의 글루코오스 및 글루타민 소비를 나타낸다.
본 명세서에서 설명된 바와 같이, 낮은 또는 저산소 조건은 본 명세서에 제공된 제제를 위한 세포 모집단을 제조하기 위한 방법에서 이용될 수 있다. 하지만, 세포 모집단을 제조하는 방법은 낮은 산소 조건화의 단계 없이도 이용될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 표준 산소 조건이 이용될 수 있다.
해당 분야의 통상의 기술자는 해당 분야에 공지된 단리 및 배양의 다른 방법이 본 명세서에서 설명된 세포에 대해 이용될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
3. 생체물질
여러 가지 생체물질은 본 개시의 치료학적 제제를 제공하기 위해 활성제와 조합될 수 있다. 생체물질은 임의의 적절한 모양 (가령, 비드) 또는 형태 (가령, 액체, 겔 등)로 되어 있을 수 있다. Bertram et al. 미국 공개 출원 20070276507 (이의 전체로 본 명세서에 참조로서 편입됨)에서 설명된 바와 같이, 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드는 다수의 전체 시스템, 기하학 또는 공간 제약을 만족시키는 다수의 바람직한 배치로 성형될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 본 개시의 매트릭스 또는 스캐폴드는 3-차원이며 기관 또는 조직 구조의 크기 및 모양에 맞도록 성형될 수 있다. 예를 들어, 신장 질환, 빈혈증, EPO 결핍, 세뇨관 수송 결핍 또는 사구체 여과 결핍을 치료하기 위한 폴리머 스캐폴드의 이용에서, 3-차원 (3-D) 매트릭스가 이용될 수 있다. 여러 가지 상이하게 성형된 3-D 스캐폴드가 이용될 수 있다. 당연히, 폴리머 매트릭스는 상이한 체격의 환자에 맞도록 상이한 크기 및 모양으로 성형될 수 있다. 또한, 폴리머 매트릭스는 환자의 특별 요구를 수용하도록 다른 방법으로 성형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리머 매트릭스 또는 스캐폴드는 생체적합성의 다공성 폴리머 스캐폴드일 수 있다. 스캐폴드는 개방-셀 폴리락트산 (OPLA®), 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 불소 처리된 폴리에틸렌, 페놀, 폴리-4-메틸펜텐, 폴리아크릴니트릴, 폴리아미드, 폴리아미드이미드, 폴리아크릴레이트, 폴리벤조옥사졸, 폴리카보네이트, 폴리시아노아릴에테르, 폴리에스테르, 폴리에스테르카보네이트, 폴리에테르, 폴리에테르, 폴리에테르에테르케톤, 폴리에테르이미드, 폴리에테르케톤, 폴리에테르술폰, 폴리에틸렌, 폴리플루오르올레핀, 폴리이미드, 폴리올레핀, 폴리옥사디아졸, 폴리페닐렌 옥사이드, 폴리페닐렌 설파이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리설파이드, 폴리술폰, 폴리테트라플루오르에틸렌, 폴리티오에테르, 폴리트리아졸, 폴리우레탄, 폴리비닐, 폴리비닐리덴 불화물, 재생 셀룰로오스, 실리콘, 우레아-포름알데하이드 콜라겐, 젤라틴, 알기네이트, 라미닌, 피브로넥틴, 실크, 엘라스틴, 알기네이트, 히알루론산, 아가로오스, 또는 코폴리머 또는 이의 물리적 블렌드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 여러 가지 합성 또는 천연-발생 물질로부터 형성될 수 있다. 스캐폴딩 배치는 액상 현탁액에서부터 부드러운 다공성 스캐폴드, 딱딱한 모양을 가진 다공성 스캐폴드까지 다양할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 배치는 하이드로겔이 될 수 있는 액체 형태의 용액이다.
하이드로겔은 여러 가지 폴리머 물질로부터 형성될 수 있고, 여러 가지 생의학적 적용에서 유용하다. 하이드로겔은 친수성 폴리머의 3-차원 네트워크로서 물리적으로 설명될 수 있다. 하이드로겔 유형에 따라, 그들은 비록 물에 용해되지는 않지만, 다양한 백분율의 물을 함유한다. 하이드로겔은 높은 수분 함량에도 불구하고, 친수성 잔기의 존재로 인하여 추가적으로 큰 용적의 액체를 결합할 수 있다. 하이드로겔은 그들의 젤라틴성 구조의 변화 없이 상당히 팽창된다. 하이드로겔의 기본적인 물리적 특징은 이용되는 폴리머의 성질 및 산물에 대한 추가적인 특정 장치에 따라 특이적으로 변형될 수 있다.
바람직하게, 하이드로겔은 생물학적으로 비활성이고 포유류 조직과 생리학적으로 양립가능한, 폴리머, 생물학적으로 유도된 물질, 합성에 의해 유도된 물질 또는 이의 조합으로 구성된다. 하이드로겔 물질은 바람직하게는 염증 반응을 유도하지 않는다. 하이드로겔을 형성하는데 사용될 수 있는 다른 물질의 예시는 (a) 변형된 알기네이트, (b) 일가 양이온에 노출로 겔화되는 폴리사카라이드 (즉, 겔란 검 및 카라지난), (c) 매우 점성이 큰 액체이거나 틱소트로픽 (thixotropic)이며 구조의 느린 발달에 의해 시간을 두고 겔을 형성하는 폴리사카라이드 (가령, 히알루론산) 및 (d) 젤라틴 또는 콜라겐, 및 (e) 폴리머 하이드로겔 전구물질 (가령, 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 코폴리머 및 단백질)을 포함한다. 미국 특허 번호 제6,224,893 B1호는 하이드로겔을 만드는 데에 적합한, 다양한 폴리머 및 이러한 폴리머의 화학적 특성의 상세한 설명을 제공한다.
스캐폴딩 또는 생체물질 특징은 세포가 스캐폴딩 또는 생체물질 재료에 부착되어 이와 상호작용할 수 있고, 및/또는 세포가 포착될 수 있는 다공성 공간을 제공할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 다공성 스캐폴드 또는 생체물질은 다공성 스캐폴드로 설계된 생체물질 상에서 (가령, 세포의 부착에 의해) 및/또는 스캐폴드의 세공 내에 (가령, 세포의 포착에 의해) 세포의 하나 이상의 모집단 또는 혼합물의 첨가 또는 침착을 허용한다. 또 다른 구체예에서, 스캐폴드 또는 생체물질은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 구조물을 형성하게 위해 스캐폴드 내에서 세포:세포 및/또는 세포:생체물질 상호작용을 허용하거나 촉진시킨다.
한 가지 구체예에서, 생체물질은 5.1 kDA 내지 >2 x 106 kDa의 크기 범위를 갖는 HA 분자를 함유한, 하이드로겔 형태의 히알루론산 (HA)으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 생체물질은 5.1 kDA 내지 >2 x 106 kDa의 크기 범위를 갖는 HA 분자를 또한 함유한, 다공성 포움 형태의 히알루론산으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 생체물질은 약 50 마이크론 내지 약 300 마이크론의 세공 크기 및 개방-셀 구조를 갖는, 폴리-락트산 (PLA)-기반 포움으로 구성된다. 또 다른 구체예에서, 특이적인 세포 모집단, 바람직하게는 B2 또한 B4는 특히 신장내 이식 후, 히알루론산 신타아제-2 (HAS-2)를 통하여 고분자량 히알루론산의 합성을 직접적으로 제공하고 및/또는 자극한다.
본 명세서에서 설명된 바와 같은 생체물질은 또한, 특정한 외부 조건, 가령, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 반응하도록 설계되거나 개작될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 생체물질은 (가령, 시험관 내에서 또는 생체 내에서) 온도-민감성이다. 또 다른 구체예에서, 생체물질은 효소적 분해에 대한 노출에 반응하도록 (가령, 시험관 내에서 또는 생체 내에서) 개작된다. 외부 조건에 대한 생체물질의 반응은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 미세 조정될 수 있다. 설명된 제제의 온도 민감성은 제제내 생체물질의 백분율을 조정함으로써 바뀔 수 있다. 예를 들어, 용액내 젤라틴의 백분율은 최종 제제 (가령, 액체, 겔, 비드 등)내 젤라틴의 온도 민감성을 조절하도록 조정될 수 있다. 대안으로, 생체물질은 효소적 분해에 대해 더 큰 저항성을 제공하기 위해 화학적으로 가교될 수 있다. 예를 들면, 카르보디이미드 가교제는 젤라틴 비드를 화학적으로 가교하는 데에 이용될 수 있고 그렇게 함으로써 내생 효소에 대한 감소된 감수성을 제공한다.
하나의 측면에서, 외부 조건에 대한 생체물질의 반응은 생체물질의 구조적 완전성의 상실에 관한 것이다. 비록 온도-민감성 및 효소적 분해에 대한 저항성이 위에서 제공되기는 하지만, 물질 완전성의 상실이 상이한 생체물질에서 일어날 수도 있는 다른 메커니즘이 존재한다. 이들 메커니즘은 열역학적 (가령, 용해, 확산과 같은 상 전이 (가령, 생체물질로부터 주변 조직내로 이온성 가교제의 확산)), 화학적, 효소적, pH (가령, pH-민감 리포좀), 초음파, 및 광분해성 (빛 투과)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 생체물질이 구조적 완전성을 상실하게 되는 정확한 메커니즘은 달라질 것이지만, 전형적으로 상기 메커니즘은 이식 시점에 또는 이식-후 촉발된다.
해당 분야의 통상의 기술자는 해당 분야에 공지된 다른 유형의 합성 또는 천연-발생 물질이 본 명세서에서 설명된 바와 같은 스캐폴드를 형성하는 데에 이용될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
하나의 측면에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 구조물은 상기-언급된 스캐폴드 또는 생체물질로부터 만들어진다.
4. 구조물
하나의 측면에서, 본 개시는 신장 질환, 빈혈증, 또는 EPO 결핍의 치료를 필요로 하는 대상에서 치료를 위한, 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 세포 모집단을 갖는 이식가능한 구조물을 함유한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 구조물은 하나 이상의 합성 또는 천연-발생 생체적합 물질로 구성된 생체적합 물질 또는 생체물질, 스캐폴드 또는 매트릭스 및 부착 및/또는 포착에 의해 스캐폴드 표면 상에 침착되거나 표면 내에 포매되는 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 세포 모집단 또는 세포의 혼합물로 이루어진다. 특정한 구체예에서, 구조물은 생체물질 그리고 생체물질 성분(들)로 코팅된, 생체물질 성분 상에 침착된, 생체물질 성분 내에 침착된, 생체물질 성분에 부착된, 생체물질 성분 내에 포착된, 생체물질 성분 내에 포매된, 생체물질 성분으로 접종된, 또는 생체물질 성분과 조합된, 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 세포 모집단 또는 세포의 혼합물로 이루어진다. 농축 세포 모집단 또는 이의 혼합물을 비롯한, 본 명세서에서 설명된 임의의 세포 모집단은 구조물을 형성하기 위해 매트리스와 조합하여 이용될 수 있다.
하나의 측면에서, 제제는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 외부 조건에 반응하도록 설계되거나 개작된 생체물질로 이루어진 구조물을 함유한다. 결과로서, 구조물에서 생체물질과 세포 모집단의 회합의 본질은 외부 조건에 따라서 변화할 것이다. 예를 들어, 온도-민감성 생체물질과 세포 모집단의 회합은 온도에 의해 변화한다. 한 가지 구체예에서, 구조물은 약 8℃ 미만에서 실질적으로 고체 상태 및 약 주위 온도 이상에서 실질적으로 액체 상태인 세포 모집단 및 생체물질을 함유하며, 여기서 세포 모집단은 약 8℃ 미만에서 생체물질에서 현탁된다.
하지만, 세포 모집단은 약 주위 온도 이상에서 생체물질의 용적 전체에 걸쳐 이동하는 것이 실질적으로 자유롭다. 더 낮은 온도의 실질적으로 고체 상에서 세포 모집단을 현탁하는 것은 유체내 세포와 비교하여, 세포, 가령 앵커리지(anchorage)-의존 세포에 대한 안정성 이점을 제공한다. 더욱이, 실질적으로 고체 상태에서 세포를 현탁하는 것은 다음 장점 중 하나 이상을 제공한다: i) 세포의 침전을 방지함, ii) 세포가 현탁된 상태에서 생체물질에 앵커링된 채로 남아 있도록 함; iii) 세포가 생체물질의 용적의 전체에 걸쳐 더욱 균일하게 분산된 채로 남아 있도록 함; iv) 세포 응집물의 형성을 방지함; 및 v) 제제의 저장 및 수송 동안 세포에 대한 더 나은 보호를 제공함. 대상에게 투여를 유도하는 이러한 특징을 보유할 수 있는 제제가 유리한데, 적어도 그 이유는 제제에서 세포의 전반적인 건강이 더 낫고 더 균일할 것이고 일정한 투여량의 세포가 투여될 것이기 때문이다.
또 다른 구체예에서, 구조물이 침착된 세포 모집단 또는 세포 성분은 산소-조정가능 EPO-생성 세포가 농축된 제1 신장 세포 모집단이다. 또 다른 구체예에서, 제1 신장 세포 모집단은 산소-조정가능 EPO-생성 세포에 추가하여 사구체 및 혈관 세포를 함유한다. 한 가지 구체예에서, 제1 신장 세포 모집단은 B4' 세포 모집단이다. 한 가지 다른 구체예에서, 구조물의 침착된 세포 모집단 또는 세포 성분(들)은 제1 농축 신장 세포 모집단 및 제2 신장 세포 모집단 모두를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 제2 세포 모집단은 산소-조정가능 EPO 생성 세포가 농축되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 제2 세포 모집단은 신장 세뇨관 세포가 농축된다. 또 다른 구체예에서, 제2 세포 모집단은 신장 세뇨관 세포가 농축되고 집합관 상피 세포를 함유한다. 다른 구체예에서, 신장 세뇨관 세포는 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타아제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라아제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 담체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나아제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나아제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 세뇨관 세포 마커의 발현으로 특징지어진다.
한 가지 구체예에서, 구조물을 형성하기 위해 생체물질 또는 스캐폴드 상에 침착되거나 이와 조합된 세포 모집단은 여러 가지 공급원, 가령 자가 공급원으로부터 유래된다. 또한, 동종이계 또는 동계 (자가유전자형 또는 동종유전자형) 공급원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 비-자가 공급원도 이용에 적합하다.
해당 분야의 통상의 기술자는 구조물을 형성하기 위해 세포 모집단을 생체물질에 침착시키거나 그렇지 않으면 생체물질과 세포 모집단을 조합하기 위한 여러 가지 적합한 방법이 있다는 점을 이해할 것이다.
하나의 측면에서, 구조물은 본 명세서에서 설명된 이용 방법에서 이용하는 데에 적합하다. 한 가지 구체예에서, 구조물은 임의의 병인의 신장 질환, 빈혈증 또는 임의 병인의 EPO 결핍의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 데에 적합하다. 다른 구체예에서, 구조물은 적혈구 항상성의 개선 및 회복을 필요로 하는 대상에게 투여하는 데에 적합하다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 개선된 신장 기능을 필요로 하는 대상에게 투여하는 데에 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 개선된 신장 기능을 필요로 하는 대상 내로 이식을 위한 구조물을 제공하며, 상기 구조물은 다음을 포함한다: a) 하나 이상의 생체적합 합성 폴리머 또는 천연-발생 단백질 또는 펩티드를 포함하는 생체물질; 및 b) 생체물질로 코팅되고, 생체물질 상에 침착되고, 또는 생체물질 내에 포착되고, 생체물질에서 현탁되고, 생체물질 내에 포매되고, 및/또는 그렇지 않으면 생체물질과 조합되는, 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포의 단리된, 농축 모집단을 포함한, 제1 세포 모집단, B2 그리고 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포를 포함하지만 사구체 세포는 고갈된 제2 세포 모집단, B4'를 포함하는 신장 질환을 갖는 대상으로부터 유래된 포유류 신장 세포의 혼합물. 특정한 구체예에서, 혼합물은 < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단, 또는 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력의 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다.
한 가지 구체예에서, 구조물은 혈관 마커의 발현으로 특징지어지는 B4' 세포 모집단을 포함한다. 몇몇 구체예에서, B4' 세포 모집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 특정한 구체예에서, 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 모든 구체예에서, 혼합물은 포유류 신장 조직 또는 배양된 신장 세포로부터 유래될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 구조물은 혼합물의 포착 및/또는 부착에 적합한 3-차원 (3-D) 다공성 생체물질로서 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 포유류 세포를 포매, 부착, 현탁 또는 코팅하는 데에 적합한 액체 또는 반-액체 겔로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 하이드로겔 형태의 고분자량 히알루론산 (HA) 종으로 주로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 다공성 포움 형태의 고분자량 히알루론산 종으로 주로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 약 50 마이크론 내지 약 300 마이크론의 세공을 갖는 폴리-락트산-기반 포움으로 구성된 생체물질을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 구조물은 개선된 신장 기능을 필요로 하는 대상에 대해 자가인 신장 샘플로부터 유래될 수 있는 하나 이상의 세포 모집단을 포함한다. 특정한 구체예에서, 샘플은 신장 생검이다. 몇몇 구체예에서, 대상은 신장 질환을 갖는다. 다른 구체예에서, 세포 모집단은 비-자가 신장 샘플로부터 유래된다. 한 가지 구체예에서, 구조물은 적혈구 항상성을 제공한다.
5. 신장 세포의 표현형 특성화
임의의 단계의 과정에서 단리된 세포는 그들의 표현형으로 특징지어질 수 있다. 한 가지 구체예에서, 세포는 농축되었던 이질성 신장 세포 모집단이다. 추가적인 구체예에서, 농축 이질성 신장 세포 모집단은 적어도 24시간 동안 저산소 조건 하에 배양되었다. 추가적인 구체예에서, 농축 이질성 신장 세포 모집단은 밀도 구배가 형성되었다.
샘플에서 다양한 바이오마커의 존재 (가령, 발현) 및/또는 수준/양은 다수의 방법론에 의해 분석될 수 있으며, 여기서 면역조직화학 ("IHC"), 웨스턴 블롯 분석, 면역침전, 분자 결합 어세이, ELISA, ELIFA, 형광 활성 세포 분류 ("FACS"), MassARRAY, 단백질체학, 생화학 효소 활성 어세이, 원위치(in situ) 혼성화, 서던 분석, 노던 분석, 전체 게놈 서열화, 정량적 실시간 PCR ("qRT-PCR") 및 가령 분지된 DNA, SISBA, TMA 등)과 같은 다른 증폭 유형 검출법을 비롯한 중합효소 연쇄 반응("PCR"), RNA-Seq, FISH, 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 프로파일링, 및/또는 유전자 발현의 일련 분석 ("SAGE"), 그리고 단백질, 유전자, 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 어세이 중 어느 하나를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 방법론이 해당 분야에 공지되고 해당 분야의 통상의 기술자에게 이해된다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) 및 18 (PCR Analysis)에서 밝혀진다. 복합 면역어세이, 가령 Rules Based Medicine 또는 Meso Scale Discovery로부터 입수가능한 것들이 또한 이용될 수 있다.
하나의 측면에서, 이질성 신장 세포 샘플에서 2개 이상의 바이오마커의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항체와 이의 동족 리간드 (즉, 바이오마커)의 결합을 허용하는 조건 하에 바이오마커를 표적으로 하는 항체와 샘플을 접촉시키는 단계, 및 결합된 항체의 존재를, 가령, 복합체가 항체와 바이오마커 사이에서 형성되는지 검출함으로써 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 하나 이상의 바이오마커의 존재 검출은 면역조직화학에 의한 것이다.
특정한 구체예에서, 본 명세서에서 제공된 임의의 항체는 이질성 신장 세포 샘플내 바이오마커의 존재를 검출하는 데에 유용하다. 본 명세서에서 이용된 바와 같은 용어 "검출"은 정량적 또는 정성적 검출을 아우른다. 특정한 구체예에서, 생물학적 샘플은 SRC 샘플을 포함한다.
특정한 구체예에서, 이질성 신장 세포는 AQP1, AQP2, AQP4, 칼비딘, 칼포닌, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK40 내지 67, CK7, CK8, CK8/18, CK8/18/19, 코넥신 43, 쿠빌린, CXCR4 (푸신), DBA, E-카드헤린 (CD324), EPO (에리트로포이에틴) , GGT1, GLEPP1 (사구체 상피 단백질 1) , 합토글로불린, Itgb1 (인테그린 β1), KIM-1/TIM-1 (신장 손상 분자-1 / T-세포 면역글로불린 및 뮤신-함유 분자), MAP-2 (미세소관-연관 단백질 2), 메갈린, N-카드헤린, 네프린, NKCC (Na-K-Cl- 공수송체), OAT-1 (유기성 음이온 수송체 1), 오스테오폰틴, 판-카드헤린, PCLP1 (포도칼신-유사 1 분자), 포도신, SMA (평활근 알파-액틴), 시냅토포딘, THP (탐-호스펄 단백질), 비멘틴 , 및 αGST-1 (알파 글루타티온 S-전이효소)에서 선택된 바이오마커의 검출을 허용하는 하나 이상의 시약으로 식별된다. 특정한 구체예에서, 바이오마커는 단클론 또는 다클론 항체에 의해 검출된다.
한 가지 구체예에서, 검출가능 라벨은 방사능접합체를 형성하기 위한 방사성 원자를 포함한다. 여러 가지 방사성 동위원소는 방사능접합체의 생성에 이용가능하다. 예시로는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사능접합체가 검출을 위해 이용될 때, 이는 신티그래프 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 99Tc-m (준안정 핵 이성체) 또는 123I, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 이미징을 위한 스핀 라벨 (또한 자기 공명 이미징, mri로도 공지됨), 가령 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
하나보다 많은 검출가능 라벨 (염료를 포함)이 하나의 검사에서 이용되는 경우에, 검출가능 라벨은 각각의 라벨이 샘플에 존재하는 임의의 다른 검출가능 신호에 대한 실질적인 간섭 없이 독립적으로 검출될 수 있도록 선별된다는 점이 바람직하다. 예를 들어, 검출가능 라벨 (염료를 포함)은 검출 조건 하에 상이한 색을 보여주는 상이한 형광 분자일 수 있다.
검출은 임의의 적합한 방법 예를 들어, 면역형광 현미경검사법, 유동세포 분석법, 광-섬유 스캐닝 세포분석법, 또는 레이저 스캐닝 세포분석법에 기반한 것들로 수행될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 세포내 바이오마커의 발현은 세포에서 mRNA를 평가함으로써 결정된다. 세포에서 mRNA의 평가를 위한 방법이 잘 알려져 있고 그리고 예를 들어, 상보적 DNA 프로브를 이용한 혼성화 어세이 (가령 하나 이상의 유전자에 대해 특이적인 라벨링된 리보프로브를 이용한 원위치 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 어세이 (가령, 하나 이상의 유전자에 대해 특이적인 상보적 프라이머를 이용한 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형 검출 방법, 가령, 분지된 DNA, SISBA, TMA 등)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 검사 샘플내 바이오마커의 발현은 참조 샘플과 비교된다. 예를 들어, 검사 샘플은 병에 걸린 조직 샘플일 수 있고 그리고 참조 샘플은 정상 조직으로부터 나온 것일 수 있다.
포유류로부터의 샘플은 노던, 점 블롯 또는 PCR 분석을 이용하여 mRNA에 대해 편리하게 어세이될 수 있다. 추가로, 이러한 방법은 (가령, 동시에 "항존(housekeeping)" 유전자, 가령 액틴 패밀리 멤버의 비교 대조 mRNA 서열 수준을 검사함으로써) 생물학적 샘플에서 표적 mRNA의 수준을 결정할 수 있게 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 증폭된 표적 cDNA의 서열이 결정될 수 있다.
선택적인 방법은 마이크로어레이 기술로 조직 또는 샘플내 mRNA, 가령 표적 mRNA를 시험하거나 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 이용하여, 검사 및 대조 샘플로부터의 검사 및 대조 mRNA 샘플은 역 전사되고 라벨링되어 cDNA 프로브를 발생시킨다. 이후 프로브는 고형 지지체 상에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화된다. 어레이는 어레이 각각의 멤버의 서열 및 위치가 공지되도록 구성된다. 예를 들어, 발현이 재생 반응을 유도할 수 있는 세포 모집단과 연관되는 유전자의 선별은 고형 지지체 상에 어레이될 수 있다. 특정한 어레이 멤버와의 라벨링된 프로브의 혼성화는 프로브가 유래된 샘플이 그 유전자를 발현한다는 점을 명시한다.
몇몇 구체예에 따르면, 존재 및/또는 수준/양은 전술된 유전자의 단백질 발현 수준을 관찰함으로써 측정된다. 특정한 구체예에서, 방법은 바이오마커의 결합을 허용하는 조건 하에 본 명세서에서 설명된 바이오마커에 대한 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 복합체가 항체와 바이오마커 사이에서 형성되는 지 검출하는 단계를 포함한다.
특정한 구체예에서, 샘플내 바이오마커 단백질의 존재 및/또는 수준/양은 IHC 및 착색 프로토콜을 이용하여 시험된다. 세포의 IHC 착색은 샘플내 단백질의 존재를 결정하거나 검출하는 방법이 신뢰할 수 있는 방법이라는 점을 보여주었다. 하나의 측면에서, 바이오마커의 수준은 다음을 포함하는 방법을 이용하여 결정된다: (a) 항체로 샘플 (가령 신장 세포)의 IHC 분석을 수행하는 단계; 및 b) 샘플내 바이오마커의 수준을 결정하는 단계. 몇몇 구체예에서, IHC 착색 강도는 참조 값과 비교하여 결정된다.
IHC는 추가적인 기술, 가령 형태학적 착색 및/또는 형광 원위치 혼성화와 조합하여 수행될 수 있다. 두 가지 일반적인 IHC 방법이 이용가능하다; 직접 및 간접 어세이. 제1 어세이에 따라, 표적 항원과 항체의 결합은 직접적으로 결정된다. 이 직접 어세이는 라벨링된 시약, 가령 형광 태그 또는 효소-라벨링된 일차 항체를 이용하며, 이는 추가적인 항체 상호작용 없이 가시화될 수 있다. 전형적인 간접 어세이에서, 비접합된 일차 항체는 항원과 결합하고 그 다음 라벨링된 이차 항체는 일차 항체와 결합한다. 이차 항체가 효소 라벨에 적합되는 경우, 발색성 또는 형광성 기질이 항원의 가시화를 제공하기 위해 첨가된다. 신호 증폭이 일어나는데 그 이유는 여러 가지 이차 항체가 일차 항체 상에서의 상이한 항원결정부와 작용할 수 있기 때문이다.
전형적으로 IHC를 위해 이용된 일차 및/또는 이차 항체는 검출가능한 모이어티로 라벨링될 것이다. 다음 카테고리 내로 일반적으로 그룹화될 수 있는 수많은 라벨이 이용가능하다: (a) 방사성 동위원소, 가령 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I; (b) 콜로이드 금 입자; (c) 희토 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드, 로다민, 플루오레세인, 단실, 리사민, 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌, 또는 상업적으로 이용가능한 형관단 가령 SPECTRUM ORANGE7 및 SPECTRUM GREEN7 및/또는 상기 것들 중 임의의 하나 이상의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 형광 라벨; (d) 다양한 효소-기질 라벨이 이용가능하며 미국 특허 번호 제4,275,149호는 이들 중 몇 가지의 검토를 제공한다. 효소 라벨의 예시로는 루시퍼라아제 (가령, 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제; 미국 특허 번호 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 디하이드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 가령 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 리소자임, 사카라이드 옥시다아제 (가령, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제), 헤테로사이클릭 옥시다아제 (가령 우리카아제 및 잔틴 옥시다아제), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함한다.
효소-기질 조합의 예시는 예를 들어, 기질로서 하이드로겐 퍼옥시다아제와 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (HRP); 발색성 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트와 알칼리 포스파타아제 (AP); 및 발색성 기질 (가령, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다아제) 또는 형광성 기질 (가령, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다아제)와 β-D-갈락토시다아제 (β-D-Gal)를 포함한다. 이들의 일반적인 검토를 위하여, 미국 특허 번호 제4,275,149호 및 제4,318,980호를 참고한다.
예시적인 방법에서, 샘플은 항체-바이오마커 복합체를 형성하는 데에 충분한 조건 하에 바이오마커에 특이적인 항체과 접촉될 수 있고, 그 다음 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 혈장 또는 혈청을 비롯한, 매우 다양한 조직과 샘플을 어세이하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차와 같은, 다수의 방식으로 검출될 수 있다. 이러한 어세이 포맷을 이용한 매우 다양한 면역어세이 기술이 이용가능하며, 가령 미국 특허 번호 제4,016,043호, 제4,424,279호 및 제4,018,653호를 참고한다. 이들은 비-경쟁적 유형의 단측 및 양측 또는 "샌드위치" 어세이, 그리고 그리고 전통적인 경쟁적 결합 어세이를 포함한다. 이들 어세이는 또한 표적 바이오마커와 라벨링된 항체의 직접적인 결합을 포함한다.
조직 또는 세포 샘플에서 선별된 바이오마커의 존재 및/또는 수준/양은 또한 기능적 또는 활성-기반 어세이의 방식으로 시험될 수 있다. 예를 들면, 바이오마커가 효소라면, 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정하거나 검출하기 위해 해당 분야에 공지된 어세이를 수행할 수 있다.
특정한 구체예에서, 샘플은 어세이 작동 사이의 가변성 그리고, 어세이된 바이오마커의 양에서의 차이 및 이용된 샘플의 질에서의 가변성에 대해 표준화된다. 이러한 표준화는 잘 알려진 항존 유전자, 가령 ACTB를 비롯한, 특정 표준화 바이오마커의 수준을 검출하고 편입시킴으로써 성취될 수 있다. 대안으로, 표준화는 어세이된 모든 유전자 또는 이의 거대한 서브세트(subset)의 평균 또는 중간값 신호에 기반될 수 있다 (전체적 표준화 기법). 유전자-대-유전자 기초로, 대상 종양 mRNA 또는 단백질의 측정된 표준화 양은 참조 세트에서 발견된 양과 비교된다. 대상마다 검사된 종양당 각각의 mRNA 또는 단백질에 대한 표준화 발현 수준은 참조 세트에서 측정된 발현 수준의 백분율로서 발현될 수 있다. 검사되어야할 특정한 대상 샘플에서 측정된 존재 및/또는 발현 수준/양은 해당 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 결정될 수 있는, 이 범위 내의 몇몇 백분위수에 속할 것이다.
구체예에서, 사이토케라틴은 CK8, CK18, CK19 및 이의 조합에서 선택된다. 특정한 구체예에서, 사이토케라틴은 CK8, CK18, CK19, CK8/CK18, CK8/CK19, CK18/CK19 또는 CK8/CK18/CK19이며, 여기서 "/"는 이에 인접한 사이토케라틴의 조합을 나타낸다. 모든 구체예에서, 사이토케라틴은 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 초과의 발현 수준을 갖는다.
구체예에서, GGT는 GGT-1이다. 모든 구체예에서, GGT는 약 10%, 약 15%, 약 18%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 또는 약 60% 초과의 발현 수준을 갖는다.
6. 이용 방법
또 다른 측면에서, 본 개시의 제제는 질환의 치료를 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 생물활성 세포는 본 명세서에 설명된 제제의 부분으로서 고유 기관에 투여될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 생물활성 세포는 투여의 대상인 고유 기관으로부터 또는 표적 고유 기관이 아닌 공급원으로부터 공급될 수 있다.
하나의 측면에서 본 개시는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 신장 세포 모집단 및 신장 세포의 혼합물을 함유한 제제로 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 필요로 하는 대상에서 치료를 위한 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 방법은 EPO-생성 세포가 농축된 제1 신장 세포 모집단을 포함하는 조성물을 함유한 제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제1 세포 모집단은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 및 혈관 세포가 농축된다. 한 가지 구체예에서, 제1 신장 세포 모집단은 B4' 세포 모집단이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 하나 이상의 신장 세포 모집단을 추가로 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 추가적인 세포 모집단은 EPO-생성 세포가 농축되지 않은 제2 세포 모집단이다. 또 다른 구체예에서, 추가적인 세포 모집단은 EPO-생성 세포, 사구체 세포 또는 혈관 세포가 농축되지 않은 제2 세포 모집단이다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 본 명세서에서 설명된 질환 또는 장애의 치료를 위하여, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 이식가능한 구조물을 형성하기 위해 생체물질 내에 침착되고, 생체물질 상에 침착되고, 생체물질 내에 포매되고, 생체물질로 코팅되고, 생체물질에서 현탁되고, 또는 생체물질 내에 포착된 신장 세포 모집단 또는 신장 세포의 혼합물을 또한 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포 모집단은 단독으로 이용되거나 또는 급성 또는 만성 질환 상태에서 재생을 자극하기 위한 다른 세포 또는 생체물질, 가령 하이드로겔, 다공성 스캐폴드, 또는 고유 또는 합성 펩티드 또는 단백질과 조합하여 이용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의한 대상에서의 신장 질환의 효과적인 치료는 적혈구생성 및/또는 신장 기능의 다양한 지표를 통하여 관찰될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 적혈구 항상성의 지표는 헤마토크릿 (HCT), 헤모글로빈 (HB), 평균 미립자 헤모글로빈 (MCH), 적혈구 수 (RBC), 망상적혈구 수, 망상적혈구 %, 평균 미립자 용적 (MCV), 및 적혈구 분포 폭 (RDW)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 한 가지 다른 구체예에서, 신장 기능의 지표는 혈청 알부민, 알부민 대 글로불린 비 (A/G 비), 혈청 인, 혈청 나트륨, 신장 크기 (초음파에 의해 측정가능), 혈청 칼슘, 인:칼륨 비, 혈청 칼륨, 단백뇨, 소변 크레아티닌, 혈청 크레아티닌, 혈액 질소 우레아 (BUN), 콜레스테롤 수준, 트리글리세라이드 수준 및 사구체 여과율 (GFR)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가로, 일반적인 건강 및 웰빙(well-being)의 여러 가지 지표는 체중 증가 또는 감소, 생존, 혈압 (평균 전신 혈압, 확장기 혈압 또는 수축기 혈압) 및 신체 지구 능력을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 구체예에서, 생물활성 신장 세포 제제로 효과적인 치료은 하나 이상의 신장 기능의 안정화로 입증된다. 신장 기능의 안정화는 본 명세서에서의 방법으로 치료되지 않은 대상에서의 동일한 지표와 비교하여 본 명세서에 제공된 방법에 의해 치료된 대상에서 지표의 변화의 관찰로 입증된다. 대안으로, 신장 기능의 안정화는 치료에 앞서 동일한 대상에서의 동일한 지표와 비교하여 본 명세서의 방법으로 치료된 대상에서 지표의 변화의 관찰로 입증될 수 있다. 제1 지표의 변화는 값의 증가 또는 감소일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 본 개시에 의해 제공된 치료는 대상에서 혈액 우레아 질소 (BUN) 수준의 안정화를 포함할 수 있고, 여기서 대상에서 관찰된 BUN 수준은 본 개시의 방법으로 치료되지 않은, 유사한 질환 상태를 가진 대상에 비해 더 낮다. 한 가지 다른 구체에에서, 치료는 대상에서 혈청 크레아티닌 수준의 안정화를 포함할 수 있고, 여기서 대상에서 관찰된 혈청 크레아티닌 수준은 본 개시의 방법으로 치료되지 않은, 유사한 질환 상태를 가진 대상에 비해 더 낮다. 또 다른 구체예에서, 치료는 대상에서 헤마토크릿 (HCT) 수준의 안정화를 포함할 수 있고, 여기서 대상에서 관찰된 HCT 수준은 본 개시의 방법으로 치료되지 않은, 유사한 질환 상태를 가진 대상에 비해 더 높다. 또 다른 구체예에서, 치료는 대상에서 적혈구 (RBC) 수준의 안정화를 포함할 수 있고, 여기서 대상에서 관찰된 RBC 수준은 본 개시의 방법으로 치료되지 않은, 유사한 질환 상태를 가진 대상에 비해 더 높다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 설명된 또는 해당 분야에서 공지된 하나 이상의 추가적인 지표가 대상에서 신장 질환의 효과적인 치료를 결정하기 위해 측정될 수 있다는 점을 인식할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 대상에게 적혈구 항성성을 제공하는 방법에서의 이용을 위한 제제에 관한 것이다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 (a) 본 명세서에서 설명된 바와 같은, 신장 세포 모집단, 가령 B2 또는 B4', 또는 신장 세포의 혼합물, 예를 들어, B2/B4' 및/또는 B2/B3, 또는 농축 신장 세포 모집단을 함유한 제제를 대상에게 투여하는 단계; 및 (b) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서 적혈구생성 지표의 수준이 대조의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 대상이 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내고 또는 (ii) 대상에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다. 또 다른 구체예에서, 방법은 (a) 본 명세서에서 설명된 바와 같은 신장 세포 모집단 또는 신장 세포의 혼합물을 포함하는 제제를 대상에게 투여하는 단계; 및 (b) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 대상이 투여 단계 (들)에 반응성이 있음을 나타내고 또는 (ii) 대상에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다. 또 다른 구체예에서, 방법은 (a) 생체물질 또는 생체적합성 폴리머 스캐폴드를 제공하는 단계; (b) 본 개시의 신장 세포 모집단 또는 신장 세포 혼합물을 본 명세서에서 설명된 방식으로 생체물질 또는 스캐폴드 위에 또는 내에 침착시켜 이식가능한 구조물을 형성하는 단계; (c) 구조물을 함유한 제제를 제조하는 단계; (d) 대상 내로 구조물을 이식하는 단계; 및 (e) 대상으로부터의 생물학적 샘플에서, 적혈구생성 지표의 수준이 대조의 지표 수준과 비교하여 상이한 지를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준의 차이는 (i) 대상이 투여 단계 (a)에 반응성이 있음을 나타내고, 또는 (ii) 대상에서 적혈구 항상성을 나타내는 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 신장 기능의 안정화 및 적혈구 항상성의 회복을 필요로 하는 대상에게 이를 제공하는 방법에서 이용하기 위한 제제에 관한 것이며, 여기서 상기 대상은 신장 기능의 결핍 및 빈혈증 및/또는 EPO-결핍을 모두 가지고 있다. 한 가지 구체예에서, 방법은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 신장 세포 모집단 또는 신장 세포의 혼합물을 함유한 제제를 포함하는 단계를 포함하고, 여기서 신장 세포는 다음 세포 유형 중 적어도 하나를 함유한다: 세뇨관-유래 세포, 사구체-유래 세포, 간질-유래 세포, 집합관-유래 세포, 기질 조직-유래 세포, 또는 혈관구조로부터 유래된 세포. 또 다른 구체예에서, 모집단 또는 혼합물은 EPO-생성 세포 및 세뇨관 상피 세포를 모두 포함하며, 여기서 세뇨관 세포는 다음 마커 중 적어도 하나로 식별된다: 메갈린, 쿠빌린, 히알루론산 신타아제 2 (HAS2), 비타민 D3 25-하이드록실라아제 (CYP2D25), N-카드헤린 (Ncad), E-카드헤린 (Ecad), 아쿠아포린-1 (Aqp1), 아쿠아포린-2 (Aqp2), RAB17, 멤버 RAS 종양유전자 패밀리 (Rab17), GATA 결합 단백질 3 (Gata3), FXYD 도메인-함유 이온 수송 조절자 4 (Fxyd4), 용질 담체 패밀리 9 (나트륨/수소 교환기), 멤버 4 (Slc9a4), 알데하이드 디하이드로게나아제 3 패밀리, 멤버 B1 (Aldh3b1), 알데하이드 디하이드로게나아제 1 패밀리, 멤버 A3 (Aldh1a3), 및 칼파인-8 (Capn8). 이 구체예에서, 대상의 치료는 치료를 받지 않은 대상의 지표 또는 대상의 치료-전 지표와 비교하여, 적혈구생성의 적어도 하나의 지표의 개선과 함께 신장 기능의 적어도 하나의 지표의 개선으로 입증될 것이다.
하나의 측면에서, 본 개시는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 EPO-생성 세포가 농축된 신장 세포 모집단 또는 EPO-생성 세포가 농축된 세포 모집단을 함유한 신장 세포의 혼합물을 투여함으로써 (i) 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 회복, 또는 (iv) 이의 임의의 조합 방법에서 이용하기 위한 제제를 제공하며, 여기서 투여의 유익한 효과는 EPO-생성 세포가 농축되지 않은 세포 모집단을 투여하는 효과보다 크다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 개선된 수준의 혈청 혈액 우레아 질소 (BUN)를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 혈청에서 개선된 단백질 정체(retention)를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 개선된 수준의 혈청 콜레스테롤 및/또는 트리글리세라이드를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 개선된 수준의 비타민 D를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 인:칼슘 비를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 추가적인 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 수준의 혈청 크레아티닌을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 수준의 헤마토크릿을 제공한다. 추가적인 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 수준의 적혈구 수 (RBC#)를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 헤마토크릿의 개선된 수준은 정상적인 건강한 수준의 95%로 회복된다. 추가적인 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 망상적혈구 수를 제공한다. 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 망상적혈구 백분율을 제공한다. 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 수준의 적혈구 용적 분포 폭 (RDW)을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 비-농축 세포 모집단과 비교하여 개선된 수준의 헤모글로빈을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 농축 세포 모집단은 골수에서 조혈 반응을 제공하며, 따라서 골수 세포질은 거의-정상이며, 골수:적혈구 비도 거의 정상이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 농축 세포 모집단을 투여함으로써 (i) 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO-결핍의 치료; (ii) 신장 기능의 안정화, (iii) 적혈구 항상성의 회복 또는 (iv) 이의 임의의 조합 방법에서 이용하기 위한 제제를 제공하며, 여기서, 본 명세서에서 설명된 신장 세포 모집단 또는 신장 세포 모집단 혼합물의 투여의 유익한 효과는 재조합 EPO (rEPO)를 투여함으로써 제공되는 유익한 효과와 비교하여 개선된 적혈구 항상성으로 특징지어진다. 한 가지 구체예에서, 모집단 또는 혼합물은 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 때, 재조합 EPO 단백질의 투여와 비교하여 개선된 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#에 의해 결정됨)을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 모집단 또는 혼합물은 투여될 때, 재조합 EPO와 비교하여 개선된 수준의 헤마토크릿, RBC 또는 헤모글로빈을 제공하며, 대조에서의 헤마토크릿보다 약 10% 이하로 낮거나 높다. 추가적인 구체예에서, 모집단 또는 혼합물의 단일 용량 또는 전달은 투여될 때, 재조합 EPO 단백질의 단일 용량 또는 전달이 적혈구 항상성의 개선을 제공하는 기간을 상당히 초과한 기간 동안 치료된 대상에서 적혈구 항성성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#의 증가에 의해 결정)의 개선을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 모집단 또는 혼합물은 본 명세서에서 설명된 용량으로 투여될 때, 헤마토크릿, 헤모글로빈, 또는 RBC#는 매칭 건강 대조에서의 정상 수준의 약 110%를 초과하지 않는다. 추가적인 구체예에서, 모집단 또는 혼합물은 본 명세서에서 설명된 용량으로 투여될 때, 본 명세서에서 설명된 용량으로 전달된 재조합 EPO 단백질과 비교하여 더 우수한 적혈구 항상성 (헤마토크릿, 헤모글로빈 또는 RBC#에 의해 결정됨)을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 재조합 EPO은 약 100 IU/kg, 약 200 IU/kg, 약 300 IU/kg, 약 400 IU/kg, 또는 약 500 IU/kg의 용량으로 전달된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 해당 분야에 공지된 재조합 EPO의 다른 투여량이 적합할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
본 개시의 또 다른 구체예는 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료를 필요로 하는 대상에서 치료를 위한 약물의 제조를 위하여, 적혈구 항상성을 필요로 하는 대상에서 이를 제공하기 위하여, 신장 기능의 개선을 필요로 하는 대상에서 이의 개선을 위하여, 또는 고유 신장에 재생 효과를 제공하기 위하여, 본 명세서에서 설명된 농축 세포 모집단 및 이의 혼합물을 포함한 적어도 하나의 세포 모집단, 또는 본 명세서에서 설명된 이식가능 구조물, 또는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 분비된 산물을 함유한 제제의 용도에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 구체예는 특정한 입증된 치료학적 특성에 기반한 특이적인 세포 아집단(들)의 선별에 기반하여, 특이적인 병인의 신장 질환을 치료하기 위한 (본 명세서에서 설명된) 특이적인 농축 세포 모집단(들)을 함유한 제제에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 개시는 신장 질환의 치료를 필요로 하는 대상에서 치료하는 방법에서 이용하기 위한 제제를 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상에게 1.045 g/mL 내지 1.052 g/mL의 밀도를 갖는 세뇨관 세포의 단리된, 농축 모집단을 포함한, 제1 세포 모집단, B2, 그리고 1.063 g/mL 내지 1.091 g/mL의 밀도를 갖는 에리트로포이에틴 (EPO)-생성 세포 및 혈관 세포는 포함하지만, 사구체 세포는 고갈된, 제2 세포 모집단, B4'를 포함한 포유류 신장 세포의 혼합물을 포함한 제제를 투여하는 단계, 여기서 혼합물은 < 1.045 g/ml의 밀도를 갖는 집합관 및 세뇨관 시스템의 큰 과립 세포를 포함한 B1 세포 모집단, 또는 > 1.091 g/ml의 밀도를 갖는 낮은 입도 및 생존력을 갖는 파편 및 소세포를 포함한 B5 세포 모집단을 포함하지 않는다. 특정한 구체예에서, 상기 방법은 신장 기능 지표의 수준이 대조에서의 지표 수준에 비해 상이하다는 점을 대상으로부터의 검사 샘플에서 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 지표 수준에서의 차이는 대상에서 하나 이상의 신장 기능의 감퇴의 감소, 안정화, 또는 개선을 나타낸다. 한 가지 구체예에서, 본 방법에서 이용된 B4' 세포 모집단은 혈관 마커의 발현으로 특징지어진다. 특정한 구체예에서, 방법에서 이용된 B4' 세포 포집단은 사구체 마커의 발현으로 특징지어지지 않는다. 한 가지 구체예에서, 방법에서 이용된 세포의 혼합물은 산소-조정가능한 에리트로포이에틴 (EPO) 발현을 할 수 있다. 특정한 구체예에서, 본 개시의 방법에 의해 치료되어야 할 신장 질환은 에리트로포이에틴 (EPO) 결핍을 수반한다. 특정한 구체예에서, EPO 결핍은 빈혈증이다. 몇몇 구체예에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 대상에서 신부전에 대해 부차적으로 발생한다. 몇몇 구체예에서, EPO 결핍 또는 빈혈증은 EPO 결핍 또는 빈혈증은 만성 신부전, 원발성 EPO 결핍, 화학요법 또는 항-바이러스 요법, 비-골수성 암, HIV 감염, 간질환, 심부전, 류마티스 관절염 또는 다발성 기관계 부전으로 구성된 군에서 선택되는 질환에 대해 부차적으로 발생한다. 특정한 구체예에서, 본 발명에서 이용된 조성물은 추가로, 하나 이상의 하나 이상의 생체적합 합성 폴리머 및/또는 천연-발생 단백질 또는 펩티드를 포함하는 생체 물질을 포함하며, 여기서 혼합물은 생체물질로 코팅, 생체물질 상에 침착, 생체물질 내에 침착, 생체물질 내에 포착, 생체물질에서 현탁, 생체물질 내에 포매 및/또는 그렇지 않으면 생체물질과 조합된다. 특정한 구체예에서, 본 개시의 제제에서 이용된 혼합물은 포유류 신장 조직 또는 배양된 포유류 신장 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 혼합물은 치료가 필요한 대상에 대해 자가인 신장 샘플로부터 유래된다. 한 가지 구체예에서, 샘플은 신장 생검이다. 다른 구체예에서, 제제는 비-자가 신장 샘플로부터 유래된 혼합물을 함유한다.
또 다른 측면에서 본 개시는 신장 질환, 빈혈증 또는 EPO 결핍의 치료가 필요한 대상에서 이를 치료하는 데에 유용한 약물의 제조를 위하여 본 명세서에서 설명된 세포 제조물 및 혼합물 또는 본 개시의 이식가능한 구조물을 함유한 제제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 고유 신장의 재생을 필요로 하는 대상에서 이를 위한 방법에서 이용하기 위한 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 대상에게 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물을 투여하거나 이식하는 단계를 포함한다. 재생된 고유 신장은 고유 신장에서 기능 또는 수용력의 발달, 고유 신장에서 기능 또는 수용력의 개선, 및 고유 신장에서 특정한 마커의 발현을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다수의 지표로 특징지어질 수 있다. 한 가지 구체예에서, 발달되거나 개선된 기능 또는 수용력은 상기 설명된 적혈구 항상성 및 신장 기능의 다양한 지표에 기반하여 관찰될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 재생된 신장은 하나 이상의 줄기 세포 마커의 차등 발현으로 특징지어진다. 줄기 세포 마커는 다음 중 하나 이상일 수 있다: SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 (Sox2); 미분화된 배아 세포 전사 인자 (UTF1); 생쥐로부터의 결절 동족체 (NODAL); 프로미닌 1 (PROM1) 또는 CD133 (CD133); CD24; 이의 임의의 조합 (이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입되는 Ilagan et al. PCT/US2011/036347을 참고). 또 다른 구체예에서, 줄기 세포 마커(들)의 발현은 대조와 비교하여 상향-조절된다.
농축 세포 모집단 및 이의 혼합물을 포함한 본 명세서에서 설명된 세포 모집단 그리고 이를 함유한 구조물이 고유 신장에 대한 재생 효과를 제공하는 데에 이용될 수 있다. 상기 효과는 세포 자체에 의해 및/또는 세포로부터 분비된 산물에 의해 제공될 수 있다. 재생 효과는 다음 중 하나 이상으로 특징지어질 수 있다: 상피-중간엽 이행의 감소 (TGF-β 신호전달의 약화를 통해 이루어질 수 있음); 신장 섬유증의 감소; 신장 염증의 감소; 고유 신장에서 줄기 세포 마커의 차등 발현; 신장 손상, 가령 세뇨관 손상 부위로 이식 세포 및/또는 고유 세포의 이동, 신장 손상, 가령, 세뇨관 손상 부위에서 이식 세포의 접목; (본 명세서에서 설명된 바와 같은) 신장 기능의 하나 이상의 지표의 안정화; (본 명세서에서 설명된 바와 같은) 적혈구 항상성의 회복; 및 이의 임의의 조합.
7. 재생을 모니터링하는 방법
또 다른 측면에서, 본 개시는 대상에게 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물을 함유한 제제의 투여 또는 이식 후 고유 신장의 재생을 모니터링하기 위한 예후 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 대상으로부터 얻은 검사 샘플 및 대조 샘플에서 마커의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 샘플과 비교하여 검사 샘플에서 마커의 더 높은 수준의 발현이 대상에서의 고유 신장의 재생에 대해 예후한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 샘플에서 하나 이상의 줄기 세포 마커의 발현의 검출을 포함한다. 줄기 세포 마커는 Sox2; UTF1; NODAL; CD133; CD24; 및 이의 조합에서 선택될 수 있다 (Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 실시예 11을 참고). 검출 단계는 줄기 세포 마커(들)의 발현이 대조 샘플에 비해 검사 샘플에서 상향-조절되거나 더 높은지를 결정하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 높은 수준의 발현은 대상의 고유 신장의 재생을 예후한다. 한 가지 다른 구체예에서, 줄기 세포 마커(들)이 mRNA 발현이 검출된다. 다른 구체예에서, mRNA 발현의 검출은 PCR-기반 방법, 가령, qRT-PCR을 통해 일어날 수 있다. 또한, 원위치 혼성화도 mRNA 발현의 검출을 위해 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 줄기 세포 마커의 폴리펩티드 발현도 또한 항-줄기 세포 마커 작용제를 이용하여 검출될 수 있다. 한 가지 다른 구체예에서, 상기 작용제는 마커를 표적으로 하는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 줄기 세포 마커 폴리펩티드 발현은 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 검출된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 마커의 mRNA 및/또는 폴리펩티드 발현을 검출하기 위한 다른 방법을 인식할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물을 함유한 제제의 이식 또는 투여 후 환자의 예후 평가를 위한 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 상기 대상으로부터 수득된 검사 샘플에서 마커 발현의 수준을 검출하는 단계; (b) 대조 샘플 (또는 대조 참조 값)에 대한 마커 발현의 수준에 비해 검사 샘플에서 발현 수준을 결정하는 단계; 및 (c) 마커 발현 수준의 결정에 기반하여 환자의 재생 예후를 예측하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 샘플 (대조 참조 값)과 비교하여 검사 샘플에서 더 높은 수준의 마커 발현은 대상에서 재생을 예후한다.
하나의 다른 측면에서, 본 개시는 대상에게 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물을 함유한 제제의 투여 또는 이식 후 고유 신장의 재생을 모니터링하기 위한 예후 방법을 제공하며, 여기서 비-침습성 방법이 이용된다. 조직 생검에 대한 대안으로서, 치료를 받은 대상에서 재생 결과는 체액, 가령 소변 검사로부터 평가될 수 있다. 대상-유래 소변 공급원으로부터 수득된 미세소포는 궁극적으로 본 개시의 세포 모집단으로의 처리에 의해 영향을 받은 신장 세포 모집단으로부터 유래되는 특이적 단백질 및 miRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 특정한 성분을 함유한다는 점이 밝혀졌다. 이들 성분은 줄기 세포 복제 및 분화, 아폽토시스, 염증, 및 면역-조절에 수반되는 인자를 포함할 수 있다. 미세소포-연관 miRNA/단백질 발현 패턴의 시간적 분석은 본 개시의 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물을 받은 대상의 신장 내에서 재상 결과의 연속적인 모니터링을 허용한다.
이들 신장-유래 소포 및/또는 대상의 소변으로 나오는 신장 유래 소포의 내강 함유물이 재생 결과를 나타내는 바이오마커에 대해 분석될 수 있다.
한 가지 구체예에서, 본 개시는 신장 질환 (KD) 환자가 치료학적 제제로의 처리에 반응하는지에 대해 평가하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득된 검사 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양을 대조 샘플내 소포량과 비교하여 또는 이에 비해, 결정하거나 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 대조 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양과 비교하여 검사 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 더 높거나 더 낮은 양은 치료제로의 처리에 대한 처리된 환자의 반응성을 나타낸다.
또한 본 개시는 KD 환자에서 치료제로의 처리 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 치료제로 처리된 KD 환자로부터 수득된 검사 샘플내 소포량을 대조 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양과 비교하여 또는 이에 비해 결정하거나 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양과 비교하여 검사 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 더 높거나 더 낮은 양은 KD 환자에서 치료제로의 치료 효능을 나타낸다.
본 개시는 작용제가 실장 질환 (KD)을 치료하는 데에 효과적인 환자 아집단을 식별하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 대조 샘플로부터 수득된 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양과 비교하여 환자 아집단으로부터의 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양의 존재와 작용제의 효능 사이의 상관관계를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 샘플내 소포 또는 이의 내강 함유물의 양과 비교하여 환자 아집단으로부터의 샘플내 소포의 더 높거나 더 낮은 양은 작용제가 환자 아집단에서 KD를 치료하는 데에 효과적이라는 점을 나타낸다.
결정하거나 검출하는 단계는 검사 샘플, 가령 소변에 존재할 수 있는 miRNA 또는 다른 분비 산물의 양을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
비-침습적 예후적 방법은 본 명세서에서 기술된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물의 투여 또는 이식 전 및/또는 후에 대상으로부터 소변 샘플을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 소포 및 다른 분비 산물은 원치 않는 파편을 제거하기 위한 원심분리를 포함하지만, 이에 제한되지 않은 표준 기술을 이용하여 소변 샘플로부터 단리될 수 있다 (Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al. 미국 공개 특허 출원 번호 제20110053157호, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨).
본 개시는 치료 후 대상에서 재생 결과를 검출하기 위한 비-침습적 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료된 대상으로부터 소변내 소포 또는 이의 내강 함유물의 검출을 포함한다. 내강 함유물은 하나 이상의 miRNA일 수 있다. 개별적인 miRNA의 조합 또는 패널의 검출은 이러한 예후적 방법에 적합할 수 있다. 예시적인 조합은 다음 중 2개 이상을 포함한다: miR-24; miR-195; miR-871; miR-30b-5p; miR-19b; miR-99a; miR-429; let-7f; miR-200a; miR-324-5p; miR-10a-5p; 및 이의 임의의 조합. 한 가지 구체예에서, miRNA의 조합은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개 이상의 개별적인 miRNA를 포함할 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 다른 miRNA 및 miRNA의 조합이 이러한 예후적 방법에서 이용하기에 적합할 수 있다는 점을 인식할 것이다. 추가적인 miRNA의 공급원은 맨체스터 대학의 생명 과학부에서관리하고 유지하는, http://mirbase.org에서의 miRBase를 포함한다.
해당 분야의 통상의 기술자는 재생을 검출하는 예후적 방법이 본 명세서에서 설명된 세포 모집단 및 구조물과는 별개로, 해당 분야에 공지된 다른 치료제로 처리된 대상에 적합할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
몇몇 구체예에서, 결정 단계는 (i) 검사 샘플 및 대조에서 마커 발현 (또는 소포/소포 함유물)의 차등 수준을 측정하는 단계; 및/또는 (ii) 검사 샘플 및 대조에서 마커 발현의 차등 수준을 측정하는 단계로부터 수득된 데이터를 분석하는 단계의 목적을 위해 적합한 프로세서에 의해 실행되는 소프트웨어 프로그램의 이용을 포함한다. 적합한 소프트웨어 및 프로세서는 해당 분야에 잘 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다. 프로그램은 CD-ROM, 플로피 디스크, 하드 디스크, DVD 또는 프로세서와 연관된 메모리와 같은 실재하는 매질에 저장된 소프트웨어에 수록되지만, 해당 분야의 통상의 기술자는 전체 프로그램 또는 이의 일부가 프로세서 외의 장치에 의해 대안으로 실행되고 및/또는 잘 알려진 방식으로 펌웨어(firmware) 및/또는 전용 하드웨어에 수록될 수 있다는 점을 쉽게 인식할 것이다.
결정 단계 후에, 측정 결과, 발견, 진단, 예측 및/또는 치료 권장사항이 통상적으로 기록되고 예를 들어, 기술자, 의사 및/또는 환자에게 전달된다. 특정한 구체예에서, 이러한 정보를 관심자, 가령 환자 및/또는 담당 의사에게 전하기 위해 컴퓨터가 이용될 것이다. 몇몇 구체예에서, 결과 또는 진단이 전달되는 나라 또는 관할구와는 다른 나라 또는 관할구에서 어세이가 수행되거나 어세이 결과가 분석될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 마커 발현의 차등 수준을 갖는 검사 대상에서 측정된 마커 발현의 수준에 기반하여 예후, 예측 및/또는 치료 권장사항은 어세이가 완료되고 예후 및/또는 예측이 나온 후 가능한 빨리 대상에게 전달된다. 결과 및/또는 관련된 정보는 대상의 주치의에 의해 대상에게 전달될 수 있다. 대안으로, 결과는 편지, 전자 형태의 통신, 가령 이메일 또는 전화를 비롯한 임의의 통신 수단으로 검사 대상에게 직접 전달될 수 있다. 이메일 전달의 경우에서와 같이, 컴퓨터의 이용으로 전달이 용이해질 수 있다. 특정한 구체예에서, 예후적 검사의 결과 및/또는 이로부터의 결론 및/또는 검사에 기반한 치료 권장사항을 포함한 정보는 원격통신 기술자에게 익숙할 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 이용하여 발생되고 대상에게 자동적으로 전달될 수 있다. 건강관리-지향 통신 시스템의 하나의 예시는 미국 특허 번호 제6,283,761호에서 설명된다; 하지만, 본 개시는 이 특정한 통신 시스템을 활용하는 방법에 제한되지 않는다. 본 개시의 방법의 특정한 구체예에서, 샘플의 어세이, 재생의 예후 및/또는 예측 및 어세이 결과 또는 예후의 전달을 비롯한, 방법의 단계 모두 또는 몇 가지는 다양한 (가령, 해외) 관할구에서 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 명세서에서 설명된 예후적 방법은 이식 또는 투여의 재생 성공에 관하여 관심자에게 정보를 제공한다.
모든 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 이러한 치료를 필요로 하는 대상에게 재생된 신장을 제공하는 방법은 상기 설명된 바와 같은 재생의 예후적 평가의 이식-후 단계를 포함할 수 있다.
8. 생물활성 세포 제제
본 명세서에서 설명된 제제는 대상에게 투여되어야할 활성제, 가령 생물활성 신장 세포에 대해 바람직한 환경을 형성하는 특성을 갖는 생체물질을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 제제는 활성제가 생체물질로 조제되는 시간에서부터 대상에게 투여되는 시점까지 바람직한 환경을 제공하는 제1 생체물질을 함유한다. 한 가지 다른 구체예에서, 바람직한 환경은 대상에게 투여하기에 앞서 (본 명세서에서 설명된 바와 같은) 유체에서의 세포에 비하여 실질적으로 고체 상태에서 현탁된 생물활성 세포를 갖는 이점에 관계한다. 또 다른 구체예에서, 제1 생체물질은 온도-민감성 생체물질일 수 있다. 온도-민감성 생체물질은 (i) 약 8℃ 이하에서 실질적으로 고체 상태, 및 (ii) 주위 온도 이상에서 실질적으로 액체 상태를 가질 수 있다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 실온이다.
또 다른 측면에서, 제제는 제조 시간에서부터 대상에게 투여된 후의 시점까지 조합 세포에 대한 바람직한 환경을 제공하는, 제2 생체물질과 조합된 생물활성 세포를 함유한다. 한 가지 구체예에서, 제2 생체물질에 의해 제공된 바람직한 환경은 대상에게 투여한 시점까지 및 투여 후 시간 동안 구조적 완전성을 보유하는 생체물질에 세포를 투여하는 이점에 관계한다. 한 가지 구체예에서, 이식 후 제2 생체물질의 구조적 완전성은 몇 분, 몇 시간, 며칠, 또는 몇 주가 걸린다. 한 가지 구체예에서, 구조적 완전성은 1개월 미만, 1주 미만, 1일 미만, 또는 1시간 미만이 걸린다. 상대적으로 단기의 구조적 완전성은 배치된 조직 또는 기관과 편입된 요소의 상호작용에 대한 방해 또는 저해 없이, 제어된 조작, 배치 또는 분산으로 조직 또는 기관내 표적 위치에 활성제 및 생체물질을 전달할 수 있는 제제를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 제2 생체물질은 제1 생체물질보다 차이가 나는 민감성을 가진 온도-민감성 생체물질이다. 제2 생체물질은 (i) 약 주위 온도 이하에서 실질적으로 고체 상태, 및 (ii) 약 37℃ 이상에서 실질적으로 액체 상태를 가질 수 있다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 실온이다.
한 가지 구체예에서, 제2 생체물질은 가교된 비드이다. 가교된 비드는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 가교의 정도에 따라 미세하게 조정가능한 시험관내 체류 시간을 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가교된 비드는 생물활성 세포를 포함하고 본 명세서에서 설명된 바와 같은 효소적 분해에 대한 저항성이 있다.
본 개시의 제제는 활성제, 가령 생물활성 세포와 조합된 제1 생체물질을, 활성제, 가령 생물활성 세포와 조합된 제2 생체물질과 함께 또는 없이, 포함할 수 있다. 제제가 제2 생체물질을 포함하는 경우, 이는 온도 민감성 비드 및/또는 가교된 비드일 수 있다. 다양한 대표 제제는 하기 실시예에서 제공된다 (또한 도 3-7을 참고).
본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제조물, 혼합물, 및/또는 구조물은 생물활성 세포 제제로서 투여될 수 있다. 하나의 측면에서, 제제는 본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제조물, 혼합물, 및/또는 구조물에 대한 안정성을 제공하는 세포 및 하나 이상의 생체물질을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 생체물질은 온도에 따라 적어도 2개의 상이한 상 또는 상태에서 유지할 수 있는 온도-민감성 생체물질이다. 생체물질은 제1 온도에서 제1 상태, 제2 온도에서 제2 상태, 및/또는 제3 온도에서 제3 상태를 유지할 수 있다. 제1, 제2 또는 제3 상태는 실질적으로 고체, 실질적으로 액체, 또는 실질적으로 반-고체 또는 반-액체 상태일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 생체물질은 제1 온도에서 제1 상태 및 제2 온도에서 제2 상태를 가지며, 여기서 제1 온도는 제2 온도보다 더 낮다.
한 가지 다른 구체예에서, 온도-민감성 생체물질은 약 8℃ 이하의 온도에서 실질적으로 고체 상태이다. 다른 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 또는 약 8℃에서 유지된다. 한 가지 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 겔의 형태를 갖는다. 다른 구체예에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 주이 온도 이상에서 실질적으로 액체 상태이다. 한 가지 구체예에서, 실질적으로 액체 상태는 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 또는 약 37℃에서 유지된다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 실온이다.
또 다른 구체예에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 약 주위 온도 이하의 온도에서 실질적으로 고체 상태이다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 실온이다. 또 다른 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 약 17℃, 약 16℃, 약 15℃, 약 14℃, 약 13℃, 약 12℃, 약 11℃, 약 10℃, 약 9℃, 약 8℃, 약 7℃, 약 6℃, 약 5℃, 약 4℃, 약 3℃, 약 2℃, 또는 약 1℃에서 유지된다. 한 가지 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 비드의 형태를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 온도-민감성 생체물질의 상태는 약 37℃ 이상의 온도에서 실질적으로 액체 상태이다. 한 가지 다른 구체예에서, 실질적으로 고체 상태는 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 유지된다.
온도-민감성 생체물질은 용액의 형태로, 비드의 형태로, 또는 본 명세서에서 설명된 및/또는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 적합한 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 세포 모집단과 제조물은 온도-민감성 생체물질로 코팅되고, 상기 생체물질 상에 침착되고, 상기 생체물질 내에 포매되고, 상기 생체물질에 부착되고, 상기 생체물질에 도말되고, 현탁되고, 또는 상기 생체물질에 포착될 수 있다. 대안으로, 온도-민감성 생체물질은 임의의 세포 없이, 가령 스페이서 비드의 형태로 제공될 수 있다.
다른 구체예에서, 온도-민감성 생체물질은 제1 상태 및 제2 상태에서 전이 상태를 갖는다. 한 가지 구체예에서, 전이 상태는 약 8℃ 내지 약 주위 온도의 온도에서 고체-대-액체 전이 상태이다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 실온이다. 한 가지 다른 구체예에서, 고체-대-액체 전이 상태는 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 내지 약 18℃ 중 하나 이상의 온도에서 일어난다.
온도-민감성 생체물질은 센티푸아즈 (cP)에서 측정된 주어진 온도에서 특정한 점도를 갖는다. 한 가지 구체예에서, 생체물질은 25℃에서 약 1 cP 내지 약 5 cP, 약 1.1 cP 내지 약 4.5 cP, 약 1.2 cP 내지 약 4 cP, 약 1.3 cP 내지 약 3.5 cP, 약 1.4 cP 내지 약 3.5 cP, 약 1.5 cP 내지 약 3 cP, 약 1.55 cP 내지 약 2.5 cP, 또는 약 1.6 cP 내지 약 2 cP의 점도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 0.75% (w/v) 용액은 37℃에서 약 1.0 cP 내지 약 1.15 cP의 점도를 갖는다. 37℃에서 점도는 약 1.0 cP, 약 1.01 cP, 약 1.02 cP, 약 1.03 cP, 약 1.04 cP, 약 1.05 cP, 약 1.06 cP, 약 1.07 cP, 약 1.08 cP, 약 1.09 cP, 약 1.10 cP, 약 1.11 cP, 약 1.12 cP, 약 1.13 cP, 약 1.14 cP, 또는 약 1.15 cP일 수 있다. 한 가지 다른 구체예에서, 생체물질은 젤라틴 용액이다. 젤라틴은 용액에서 약 0.5%, 약 0.55%, 약 0.6%, 약 0.65%, 약 0.7%, 약 0.75%, 약 0.8%, 약 0.85%, 약 0.9%, 약 0.95% 또는 약 1%, (w/v)에서 존재한다. 한 가지 구체예에서, 생체물질은 PBS에서 0.75% (w/v) 젤라틴 용액이다. 한 가지 구체예에서, 0.75% (w/v) 용액은 25℃에서 약 1.6 cP 내지 약 2 cP에서 점도를 갖는다. 한 가지 구체예에서, 0.75% (w/v) 용액은 37℃에서 약 1.07 cP 내지 약 1.08 cP의 점도를 갖는다. 젤라틴 용액은 PBS, DMEM, 또는 또 다른 적합한 용매에서 제공될 수 있다.
하나의 측면에서, 생물활성 세포 제제는 세포 생존제를 또한 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포 생존제는 항산화제, 산소 담체, 면역조절 인자, 세포 모집 인자, 세포 부착 인자, 항-염증제, 혈관신생 인자, 상처 치유 인자, 생물활성 세포로부터 분비된 산물로 구성된 군에서 선택된다.
항상화제는 다른 분자의 산화를 저해하는 능력으로 특징지어진다. 항산화제는 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카르복실산 (Trolox®), 카로테노이드, 플라보노이드, 이소플라본, 유비퀴논, 글루타티온, 리포산, 수퍼옥사이드 디스무타아제, 아스코르빈산, 비타민 E, 비타민 A, 혼합된 카로테노이드 (가령, 베타 카로텐, 알파 카로텐, 감마 카로텐, 루테인, 리코펜, 피토펜, 피토플루엔, 및 아스타잔틴), 셀레늄, 코엔자임 Q10, 인돌-3-카르비놀, 프로안토시아니딘, 레스베라트롤, 퀘르세틴, 카테킨, 살리실산, 쿠르쿠민, 빌리루빈, 옥살산, 피틴산, 리포산, 바닐릭산, 폴리페놀, 페룰산, 테아플라빈, 및 이의 유도체 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 개시에서 이용하기 위한 다른 적합한 항산화제를 인식할 것이다.
산소 담체는 산소를 운반하고 방출하는 능력으로 특징지어진다. 그들은 퍼플루오로카본 및 퍼플루오로카본을 함유한 의약을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 퍼플루오로카본-기반 산소 담체는 퍼플루오로옥틸 브로마이드 (C8F17Br); 퍼플루오로디코로탄 (C8F16C12); 퍼플루오로데실 브로마이드; 퍼플루오브론; 퍼플루오로데칼린; 퍼플루오로트리포필아민; 퍼플루오로메틸사이클로피페리딘; Fluosol® (퍼플루오로데칼린 & 퍼플루오로트리포필아민); Perftoran® (퍼플루오로데칼린 & 퍼플루오로메틸사이클로피페리딘); Oxygent® (퍼플루오로데실 브로마이드 & 퍼플루오브론); Ocycyte™ (퍼플루오로 (삼차-부틸사이클로헥산))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 개시에서 이용하기 위한 다른 적합한 퍼플루오로카본-기반 산소 담체를 인식할 것이다.
면역조절 인자는 오스테오폰틴, FAS 리간드 인자, 인터류킨, 형질변환 성장 인자 베타, 혈청 유래 성장 인자, 클러스테린, 트랜스페린, 작용 시 조절되는, 정상 T-세포 발현되는, 분비되는 단백질 (RANTES), 플라스미노겐 활성자 저해제 - 1 (Pai-1), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파), 인터류킨 6 (IL-6), 알파-1 마이크로글로불린, 및 베타-2-마이크로글로불린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 개시에서 이용하기 위한 다른 적합한 면역조절 인자를 이해할 것이다.
항-염증제 또는 면역 억제제 (하기 설명됨)는 또한 제제의 일부일 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 제제 및/또는 치료에서 이용하기 위한 다른 적합한 항산화제를 이해할 것이다.
세포 모집 인자는 단핵구 화학주성 단백질 1 (MCP-1), 및 CXCL-1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 제제 및/또는 치료에서 이용하기 위한 다른 적합한 세포 모집 인자를 인식할 것이다.
세포 부착 인자는 피브로넥틴, 프로콜라겐, 콜라겐, ICAM-1, 결합 조직 성장 인자, 라미닌, 프로테오글리칸, 특이적 세포 부착 펩티드 가령 RGD 및 YSIGR을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 제제 및/또는 치료에서 이용하기 위한 다른 적합한 세포 부착 인자를 인식할 것이다.
혈관신생 인자는 매트릭스 메탈로프로테아제 1 (MMP1), 매트릭스 메탈로프로테아제 2 (MMP2), 혈관 내피 성장 인자 F (VEGF), 매트릭스 메탈로프로테아제 9 (MMP-9), 조직 저해제 또는 메탈로프로테아제 - 1 (TIMP-1) 혈관 내피 성장 인자 F (VEGF), 안지오포이에틴-2 (ANG-2)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 제제 및/또는 치료에서 이용하기 위한 다른 적합한 혈관신생 인자를 인식할 것이다.
상처 치유 인자는 케라티노사이트 성장 인자 1 (KGF-1), 조직 플라스미노겐 활성자 (tPA), 칼비딘, 클러스테린, 시스테인 C, 트레포일 인자 3을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 제제 및/또는 치료에서 이용하기 위한 다른 적합한 상처 치유 인자를 인식할 것이다.
본 명세서에서 설명된 생물활성 세포로부터 분비된 산물이 또한 세포 생존제로서 생물활성 세포 제제에 첨가될 수 있다.
하나의 다른 측면에서, 제제는 본 명세서에서 설명된 온도-민감성 생체물질 및 생체물질을 함유한 생체적합 비드의 모집단을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 비드는 가교된다. 가교는 해당 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 가교 작용제, 가령 카르보디이미드; 알데하이드 (가령 푸르푸랄, 아크롤레인, 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 글리세릴 알데하이드), 석신이미드-기반 가교제 {비스(설포석신이미딜) 수베레이트 (BS3), 디석신이미딜 글루타레이트 (DSG), 디석신이미딜 수베레이트 (DSS), 디티오비스(석신이미딜 프로피오네이트), 에틸렌 글리콜비스(설포석신이미딜석시네이트), 에틸렌 글리콜비스(석신이미딜석시네이트) (EGS), 비스(설포석신이미딜) 글루타레이트 (BS2G), 디석신이미딜 타르트레이트 (DST)}; 에폭시드 (에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 , 1,4 부탄디올 디글리시딜 에테르); 사카라이드 (글루코오스 및 알도오스 슈가); 설폰산 및 p-톨루엔 설폰산; 카보닐디이미다졸; 제니핀; 이민; 케톤; 디페닐포스포릴아지드 (DDPA); 테레프탈로일 클로라이드; 세륨 (III) 니트레이트 헥사하이드레이트; 미생물 트랜스글루타미나아제; 및 하이드로겐 퍼옥사이드를 이용하여 성취될 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 본 방법, 제제 및/또는 치료에서 이용하기 위한 다른 적합한 가교 작용제 및 가교 방법을 인식할 것이다.
한 가지 구체예에서, 비드는 카르보디이미드-가교된 비드이다. 카르보디이미드-가교된 비드는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC), DCC - N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (DCC), 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIPC)로 구성된 군에서 선택된 카르보디이미드와 가교될 수 있다. 더 낮은 농도의 EDC로 처리된 비드는 더 많은 수의 유리 일차 아민을 가질 것으로 예측되었지만, 고농도의 가교제로 처리된 샘플은 아미드 결합과 관여된 대부분의 일차 아민을 가질 것이다. 335 nm에서 분광광도법으로 검출가능한, 일차 아민과 피크릴설폰산 사이의 공유 결합에 의해 발달된 주황색의 강도는 샘플에 존재하는 일차 아민의 수에 비례한다. 샘플에 존재하는 밀리그램의 단백질 당 정상화되었을 때, 가교를 위해 이용된 초기 농도의 EDC 및 존재하는 유리 아민의 수 사이의 역 상관관계가 관찰될 수 있다. 이 결과는 반응에서 이용된 카르보디이미드의 양에 의해 좌우되는, 차등적 비드 가교를 나타낸다. 일반적으로, 가교된 비드는 비-기교 비드와 비교하여 감소된 수의 유리 일차 아민을 나타낸다. 유리 일차 아민의 수는 약 335 nm에서 분광광도법으로 검출될 수 있다.
가교 비드는 비-가교 생체적합 비드와 비교하여 효소적 분해에 대해 감소된 감수성을 가지며, 따라서 미세하게 조정된 생체내 체류 시간을 가진 비드를 제공한다. 예를 들어, 가교 비드는 내생 효소, 가령 콜라게나아제에 대한 저항성이 있다. 가교 비드의 공급은 다음 중 하나 이상을 촉진하는 생체물질의 발달과 생성에 중점을 둔 전달 시스템의 일부이다: (a) 바람직한 부위에 부착된 세포의 전달 및 원형 조직 및 혈관 공급의 재생과 내성장을 위한 공간의 형성; (b) 세포가 그들의 미세환경을 확립하고, 기능하고, 리모델링하고 그리도 그들 자체의 세포외 매트릭스 (ECM)를 분비하게 하는 데에 충분히 긴 부위에서 지속하는 능력; (c) 주변 조직과 이식된 세포의 통합의 증진; (d) 실질적으로 고체 형태의 세포를 이식하는 능력; (e) 숙주 조직과 전달된 세포/물질의 통합 또는 조직 내성장에 대한 유의적인 장벽을 제공하지 않은 단기 구조적 완전성; (f) 실질적으로 고체 형태로 생체내 전달을 국부화하여 이식 동안에 조직 내로 세포의 분산을 방지함; (g) 유체에서 현탁되는 세포와 비교하여 앵커리지 의존 세포의 개선된 안정성 및 생존력; 및 (h) 세포가 i) 실질적으로 고체 형태 (가령, 비드에 부착됨)로, 그리고 ii) 실질적으로 액체 형태 (가령, 유체에서 현탁됨)로 전달될 때 2상(biphasic) 방출 프로파일.
한 가지 구체예에서, 본 개시는 젤라틴을 함유한 가교 비드를 제공한다. 비-가교 젤라틴 비드는 생물활성 세포 제제에 적합하지 않는데, 그 이유는 그들이 완전성을 빠르게 상실하고 세포가 주사 부위로부터 소멸되기 때문이다. 대조적으로, 매우 가교된 젤라틴 비드는 주사 부위에서 매우 오래 지속될 수 있고 신생(de-novo) ECM 분비, 세포 통합 및 조직 재생을 방해할 수 있다. 본 개시는 미세하게 조정될 가교 비드의 생체내 체류 시간을 허용한다. 생체물질의 생분해성을 맞추기 위하여, 카르보디이미드의 상이한 가교제 농도가 이용되는 반면, 전반적인 반응 조건은 모든 샘플에 대하여 유지되었다. 예를 들어, 카르보디이미드-가교 비드의 효소적 감수성은 약 0 내지 약 1M에서 가교 작용제의 농도가 변화함으로써 미세하게 조정될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 농도는 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 11 mM, 약 12 mM, 약 13 mM, 약 14 mM, 약 15 mM, 약 16 mM, 약 17 mM, 약 18 mM, 약 19 mM, 약 20 mM, 약 21 mM, 약 22 mM, 약 23 mM, 약 24 mM, 약 25 mM, 약 26 mM, 약 27 mM, 약 28 mM, 약 29 mM, 약 30 mM, 약 31 mM, 약 32 mM, 약 33 mM, 약 34 mM, 약 35 mM, 약 36 mM, 약 37 mM, 약 38 mM, 약 39 mM, 약 40 mM, 약 41 mM, 약 42 mM, 약 43 mM, 약 44 mM, 약 45 mM, 약 46 mM, 약 47 mM, 약 48 mM, 약 49 mM, 약 50 mM, 약 55 mM, 약 60 mM, 약 65 mM, 약 70 mM, 약 75 mM, 약 80 mM, 약 85 mM, 약 90 mM, 약 95 mM, 또는 약 100 mM이다. 가교제 농도는 또한 약 0.15 M, 약 0.2 M, 약 0.25 M, 약 0.3 M, 약 0.35 M, 약 0.4 M, 약 0.45 M, 약 0.5 M, 약 0.55 M, 약 0.6 M, 약 0.65 M, 약 0.7 M, 약 0.75 M, 약 0.8 M, 약 0.85 M, 약 0.9 M, 약 0.95 M, 또는 약 1 M일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가교 작용제는 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)이다. 한 가지 구체예에서, EDC-가교 비드는 젤라틴 비드이다.
가교 비드는 도말, 부착, 또는 캡슐화에 유리한 특정한 특징을 가질 수 있다. 예를 들어, 비드는 다공성 표면을 가질 수 있고 및/또는 실질적으로 비어있을 수 있다. 구멍의 존재는 비-다공성 표면 또는 활면과 비교하여 더 많은 수의 세포가 부착되도록 하는 증가된 세포 부착 표면을 제공한다. 추가로, 구멍 구조는 신생 조직의 형성을 지원하는 다공성 비드와의 숙주 조직 통합을 지원할 수 있다. 비드는 일반적인 입자 분포 패턴에 상응하는 와이불 플롯(Weibull plot)에 맞춰질 수 있는 입도 분포를 갖는다. 한 가지 구체예에서, 가교 비드는 약 120 μm, 약 115 μm, 약 110 μm, 약 109 μm, 약 108 μm, 약 107 μm, 약 106 μm, 약 105 μm, 약 104 μm, 약 103 μm, 약 102 μm, 약 101 μm, 약 100 μm, 약 99 μm, 약 98 μm, 약 97 μm, 약 96 μm, 약 95 μm, 약 94 μm, 약 93 μm, 약 92 μm, 약 91 μm, 또는 약 90 μm 미만의 평균 지름을 갖는다. 가교 비드의 특징은 주조 과정에 따라 변화한다. 예를 들면, 액체 젤라틴 용액을 에어로졸화하고 이를 박층 크로마토그래피 시약 분무기 (ACE Glassware)로 액체 질소 내로 뿌리는 데에 공기의 흐름이 이용되는 과정은 전술한 특징을 갖는 비드를 제공하는 데에 이용된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 주조 과정의 파라미터를 조절하는 것이 비드의 상이한 특징, 가령 상이한 입도 분포를 맞추기 위한 기회를 제공한다는 점을 인식할 것이다.
가교 비드의 세포적합성은 최종 생물활성 세포 제제에 상응하는 세포로 비드가 배양되는 세포 배양 기술을 이용한 조제에 앞서 시험관 내에서 평가된다. 예를 들면, 비드는 생물활성 신장 세포 제제의 제조에 앞서 일차 신장 세포와 배양되고 그리고 세포적합성을 확인하는 데에 살아 있는/죽은 세포 어세이가 이용된다. 특정한 제제에서, 생체적합 가교 비드는 약 5% (w/w) 내지 약 15% (w/w)의 용액 용적으로 용액내 온도-민감성 생체물질과 조합된다. 가교 비드는 약 5% (w/w), 약 5.5% (w/w), 약 6% (w/w), 약 6.5% (w/w), 약 7% (w/w), 약 7.5% (w/w), 약 8% (w/w), 약 8.5% (w/w), 약 9% (w/w), 약 9.5% (w/w), 약 10% (w/w), 약 10.5% (w/w), 약 11% (w/w), 약 11.5% (w/w), 약 12% (w/w), 약 12.5% (w/w), 약 13% (w/w), 약 13.5% (w/w), 약 14% (w/w), 약 14.5% (w/w), 또는 약 15% (w/w)의 용액 용적으로 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 대략 몇 분, 몇 시간, 또는 며칠의 기간에 걸쳐 분해되는 생체물질을 함유한 제제를 제공한다. 이것은 이후 몇 주, 또는 몇 개월에 걸쳐 천천히 분해되는 고형 물질의 이식에 중점을 두는 작업의 많은 부분과는 대조적이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 전달 매트릭스와 함께 생물활성 세포로 도말된 생체적합 가교 비드를 갖는 제제를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 전달 매트릭스는 다음 특징 중 하나 이상을 갖는다: 대상 내로 이식에 앞서 또는 이식 동안, 생체적합성, 생분해성/생체흡수인, 실질적으로 고체 상태, 이식 후 구조적 완전성 (실질적으로 고체 상태)의 상실, 및 세포 생존력을 지지하기 위한 세포적합 환경. 이식 동안 간격을 둔 이식된 입자 (가령, 가교 비드)를 유지하는 전달 매트릭스의 능력은 고유 조직 내성장을 증진시킨다. 전달 매트릭스가 부재한다면, 이식 동안 소구획으로 갈라진 비드의 압축은 충분한 조직 내성장에 대한 부적합한 공간을 초래할 수 있다. 전달 매트릭스는 고형 제제의 이식을 촉진한다. 추가로, 구조적 완전성의 단 기간은 이식 직후, 매트릭스가 숙주 조직과의 전달된 세포/물질의 조직 내성장 또는 통합에 대한 유의적인 장벽을 제공하지 않는다는 점을 의미한다. 전달 매트릭스는 본 명세서에서 설명된 제제의 국부화를 제공하는데, 그 이유는 삽입된 고체 단위가 전달된 물질이 이식 동안 조직 내로 분산되는 것을 방지하는 것을 돕기 때문이다. 세포-기반 제제에 대하여, 고체 전달 매트릭스는 유체에서 현탁된 세포와 비교하여 앵커리지 의존 세포의 안정성 및 생존력을 개선한다.
한 가지 구체예에서, 전달 매트릭스는 세포로 도말되지 않은 생체적합 비드의 모집단이다. 또 다른 구체예에서, 도말되지 않은 비드는 개별적인 세포-도말된 비드 사이에서 그리고 상기 비드의 전체에 걸쳐 분산된다. 도말되지 않은 비드는 이식에 앞서 그리고 이식 직후, 세포-도말된 비드 사이에서 "스페이서 비드(spacer bead)"로서 작용한다. 스페이서 비드는 제1 온도에서 실질적으로 고체 상태인 그리고 제2 온도에서 실질적으로 액체 상태인 온도-민감성 생체물질을 함유하며, 여기서 제1 온도는 제2 온도보다 낮다. 예를 들어, 스페이서 비드는 본 명세서에서 설명된 것과 같이, 약 주위 온도 이하에서 실질적으로 고체 상태인 그리고 약 37℃에서 실질적으로 액체 상태인 생체물질을 함유한다. 한 가지 구체예에서, 주위 온도는 약 실온이다. 또 다른 구체예에서, 생체물질은 젤라틴 용액이다. 젤라틴 용액은 약 4%, 약 4.5%, 약 5%, 약 5.5%, 약 6%, 약 6.5%, 약 7%, 약 7.5%, 약 8%, 약 8.5%, 약 9%, 약 9.5%, 약 10%, 약 10.5%, 또는 약 11%, (w/v)로 존재한다. 젤라틴 용액은 PBS, 세포 배양 배지 (가령, DMEM), 또는 또 다른 적합한 용매에서 제공될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 개시는 실질적으로 고체 형태 (가령, 스페이서 비드)로 이식되고 그 다음 신체 내로 이식 후 액화되거나/녹거나 그렇지 않으면 구조적 완전성을 상실하는 생체물질을 함유한 제제를 제공한다. 이것은 액체로서 주사될 수 있는 물질의 이용에 중점을 둔 작업의 상당한 부분과 대조적이며, 여기서 상기 물질은 주사 후 신체 내에서 응고된다.
스페이서 비드의 온도-민감성은 조제에 앞서 시험관 내에서 평가될 수 있다. 스페이서 비드는 라벨링될 수 있고 라벨링되지 않은 비-온도-민감성 비드와 혼합될 수 있다. 이후 물리적 전이의 변화를 관찰하기 위해 혼합물은 37℃에서 인큐베이션된다. 더 높은 온도에서의 라벨링된 온도-민감성 비드 모양의 상실이 시간이 지남에 따라 관찰된다. 예를 들어, 온도-민감성 젤라틴 비드는 알시안 블루(Alcian blue) 염료로 만들어져 물리적 전이의 마커로서 역할을 할 수 있다. 청색 젤라틴 비드는 Cultispher S 비드 (백색)와 혼합되고 카테더 내로 로딩되고, 그 다음 37 ℃에서, 1X PBS, pH 7.4에서 압출성형되고 그리고 인큐베이션된다. 청색 젤라틴 비드 모양의 상실은 상이한 시점에 미시적으로 일어난다. 청색 젤라틴 비드의 물리적 상태의 변화는 30분 후에 볼 수 있고 이는 연장된 인큐베이션 시간으로 더욱 두드러진다. 비드는 물질의 점도로 인해 완전히 소멸되지는 않는다.
본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제제는 신장 내로 주사를 위한 신장 세포-기반 제제를 제조하는 데에 이용될 수 있다. 하지만, 해당 분야의 통상의 기술자는 제제가, 많은 다른 유형의 생물활성 세포 모집단에 적합할 것이라는 점을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 개시는 임의의 고형 기관 또는 조직 내로 주사를 위한 생물활성 세포에 대한 제제를 고려한다.
하나의 측면에서, 본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제제는 정해진 수의 세포를 함유할 것이다. 한 가지 구체예에서, 제제에 대한 세포의 총 수는 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 또는 약 109개이다. 한 가지 구체예에서, 본 명세서에서 설명된 제제에 대한 세포의 투여량은 표적 기관 또는 조직의 추정되는 매쓰(mass) 또는 기능성 매쓰에 기반하여 계산될 수 있다. 특정한 구체예에서, 생물활성 세포 제제는 제제로의 치료 대상이 될 숙주 기관의 무게에 기반한 세포의 수에 상응한 투여량을 함유한다. 예를 들어, 생물활성 신장 세포 제제는 인간 신장에 대해 약 150 그램의 평균 무게에 기반한다. 한 가지 구체예에서, 신장의 그램 (g)당 세포 수는 약 600개 세포/g 내지 약 7.0 x 107개 세포/g이다. 몇몇 구체예에서, 신장의 그램당 세포 수는 약 600개 세포/g, 약 1000개 세포/g, 약 1500개 세포/g, 약 2000개 세포/g, 약 2500개 세포/g, 약 3000개 세포/g, 약 3500개 세포/g, 약 4000개 세포/g, 약 4500개 세포/g, 약 5000개 세포/g, 약 5500개 세포/g, 약 6000개 세포/g, 약 6500개 세포/g, 약 7000개 세포/g, 약 7500개 세포/g, 약 8000개 세포/g, 약 8500개 세포/g, 약 9000개 세포/g, 약 9500개 세포/g, 또는 약 10,000개 세포/g이다.
다른 구체예에서, 신장의 그램당 세포 수는 약 1.5 x 104개 세포/g, 약 2.0 x 104개 세포/g, 약 2.5 x 104개 세포/g, 약 3.0 x 104개 세포/g, 약 3.5 x 104개 세포/g, 약 4.0 x 104개 세포/g, 약 4.5 x 104개 세포/g, 약 5.0 x 104개 세포/g, 약 5.5 x 104개 세포/g, 약 6.0 x 104개 세포/g, 약 6.5 x 104개 세포/g, 약 7.0 x 104개 세포/g, 약 7.5 x 104개 세포/g, 약 8.0 x 104개 세포/g, 약 9.5 x 104개 세포/g이다.
다른 구체예에서, 신장의 그램당 세포 수는 약 1.0 x 105 개 세포/g, 약 1.5 x 105 개 세포/g, 약 2.0 x 105 개 세포/g, 약 2.5 x 105 개 세포/g, 약 3.0 x 105 개 세포/g, 약 3.5 x 105 개 세포/g, 약 4.0 x 105 개 세포/g, 약 4.5 x 105 개 세포/g, 약 5.0 x 105 개 세포/g, 약 5.5 x 105 개 세포/g, 약 6.0 x 105 개 세포/g, 약 6.5 x 105 개 세포/g, 약 7.0 x 105 개 세포/g, 약 7.5 x 105 개 세포/g, 약 8.0 x 105 개 세포/g, 약 8.5 x 105 개 세포/g, 약 9.0 x 105 개 세포/g, 또는 약 9.5 x 105 개 세포/g이다.
다른 구체예에서, 신장의 그램당 세포 수는 약 1.0 x 106개 세포/g, 약 1.5 x 106개 세포/g, 약 2.0 x 106개 세포/g, 약 2.5 x 106개 세포/g, 약 3.0 x 106개 세포/g, 약 3.5 x 106개 세포/g, 약 4.0 x 106개 세포/g, 약 4.5 x 106개 세포/g, 약 5.0 x 106개 세포/g, 약 5.5 x 106개 세포/g, 약 6.0 x 106개 세포/g, 약 6.5 x 106개 세포/g, 약 7.0 x 106개 세포/g, 약 7.5 x 106개 세포/g, 약 8.0 x 106개 세포/g, 약 8.5 x 106개 세포/g, 약 9.0 x 106개 세포/g, 약 9.5 x 106개 세포/g, 1.0 x 107개 세포/g, 또는 약 1.5 x 107개 세포/g이다.
총 세포 수는 제제에 대해 선별될 수 있고 제제의 용적은 조정되어 적절한 투여량에 도달할 수 있다.
몇몇 구체예에서, 제제는 대상에 대한 세포의 투여량을 함유할 수 있으며, 이는 단일 투여량 또는 단일 투여량 플러스 추가 투여량이다. 다른 구체예에서, 투여량은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 구조물에 의해 제공될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 바와 같은 신장 세포 모집단 또는 신장세포 모집단의 혼합물의 치료학적 유효량은 범위가 대상에 의해 안전하게 수용되는 세포의 최대 수부터 신장 질환의 치료, 가령 하나 이상의 신장 기능의 안정화, 감소된 감퇴율(rate-of-decline), 또는 개선을 위해 필수적인 세포의 최소 수일 수 있다.
본 명세서에서 설명된 신장 세포 모집단 또는 이의 혼합물의 치료학적 유효량은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제에서 현탁될 수 있다. 이러한 담체는 기저 배양 배지 플러스 1% 혈청 알부민, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 콜라겐, 알기네이트, 히알루론산, 피브린 글루, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 제제는 투여의 방식에 적합해야 한다.
이에 따라, 본 개시는 대상에서 신장 질환을 치료하기 위한 약물의 제조를 위하여, 신장 세포 모집단 또는 이의 혼합물, 예를 들어, B2 세포 모집단 단독 또는 B3 및/또는 B4 또는 B4' 세포 모집단과의 혼합물을 함유한 제제의 용도를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 약물은 재조합 폴리펩티드, 가령 성장 인자, 케모카인 또는 사이토카인을 추가로 포함한다. 추가적인 구체예에서, 약물은 인간 신장-유래 세포 모집단을 포함한다. 약물을 제조하는 데에 이용되는 세포는 본 명세서에서 제공된 방법을 위해 제공된 임의의 변화율을 이용하여 단리되고, 유래되고, 또는 농축될 수 있다.
신장 세포 제조물(들), 또는 이의 혼합물, 또는 조성물은 인간에게 투여를 위해 개작된 제약학적 조성물로서 일과적인 절차에 따라 조제된다. 전형적으로 정맥내 투여, 동맥-내 투여 또는 신장 캡슐 내로의 투여를 위한 조성물은 예를 들어, 멸균된 등장성 수성 완충액 내의 용액이다. 필요하다면, 조성물은 주사 부위에서 임의의 통증을 개선시키기 위해 국소 마취제를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 제형으로, 예를 들어 용봉한 용기, 가령 활성제의 양을 나타내는 앰플에서 동결보존된 농축물로서 함께 혼합하여 또는 별도로 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 할 때, 멸균된 제약학적 등급수 또는 식염수를 함유한 주입 병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우, 주사를 위한 멸균수 또는 식염수의 앰플은 성분이 투여에 앞서 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
제약학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정한 조성물에 의해, 그리고 조성물을 투여하는 데에 이용되는 특정한 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 이에 따라, 제약학적 조성물에 적합한 매우 다양한 제제가 있다 (가령, Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, formerly Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003을 참고, 이는 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨). 제약학적 조성물은 일반적으로, 멸균된, 실질적으로 등장성으로서 조제되며, 미국 식품 의약국의 모든 의약품 제조 품질 관리 기준 (GMP) 규정을 완전히 준수한다.
하나의 측면은 신장 세포 제조물, 예를 들어, B2 세포 제조물 단독으로 또는 B3 및/또는 B4 또는 B4' 세포 제조물과 조합하여, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한, 제약학적 제제를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 제제는 104 내지 109개의 포유류 신장-유래 세포를 포함한다.
변형된 방출 제제
하나의 측면에서, 본 개시의 제제는 변형된 방출 제제로서 제공된다. 일반적으로, 변형된 방출은 투여 시, 제1 활성제의 초기 방출로, 그 다음 제2 활성제의 적어도 하나의 추가적인, 차후 방출로 특징지어진다. 제1 및 제2 활성제는 동일할 수 있고 또는 그들은 상이할 수도 있다. 한 가지 구체예에서, 제제는 동일한 제제에서 다수의 성분을 통해 변형된 방출을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 방출 제제는 활성제가 제제의 용적 전체에 걸쳐 자유롭게 이동할 수 있게 하여, 투여 시 표적 부위로 즉각 방출하도록 허용하는 제1 성분의 부분으로서 활성제를 함유한다. 제1 성분은 실질적으로 액체 상 및 실질적으로 고체 상을 갖는 온도-민감성 생체물질일 수 있으며, 고체 상일때 제1 성분은 투여 시간에 실질적으로 액체 상으로 있는다. 한 가지 구체예에서, 활성제는 제제의 용적 전체에 걸쳐 실질적으로 자유롭게 이동하도록 실질적으로 액체 상이고, 따라서 투여 시 표적 부위로 즉각적으로 방출된다.
또 다른 구체예에서, 변형된 방출 제제는 활성제가 표적 부위에 투여 전 및 후에 지속되는 제2 성분에 부착되고, 상기 성분 상에 침착되고, 상기 성분으로 코팅되고, 상기 성분 내에 포매되고, 상기 성분 상에서 도말되고, 또는 상기 성분 내에 포착되는 제2 성분의 부분으로서 활성제를 갖는다. 제2 성분은 활성제와 회합할 수 있는 구조적 요소를 함유하며, 따라서, 투여 시간에 제2 성분으로부터 활성제의 즉각적인 방출을 방지한다. 예를 들어, 제2 성분은 생체내 효소적 분해를 방지하거나 지연시키기 위해 가교될 수 있는, 실질적으로 고체 형태, 가령 생체적합 비드로 제공된다. 한 가지 구체예에서, 실질적으로 고체 상으로의 활성제는 투여 전 및 후에 제제 내에서 이의 구조적 완전성을 보유하고 따라서 투여 시 표적 부위로 활성제를 즉각적으로 방출하지 않는다. 변형된 방출 제제에 적합한 담체가 본 명세서에서 설명되었지만 해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 이용하기에 적절한 다른 담체를 인식할 것이다.
한 가지 구체예에서, 제제는 세포, 나노입자, 치료학적 분자 등을 비롯하여 전달된 요소의 빠른 초기 전달/방출을 제공하고, 그 다음 요소의 추후 지연된 방출을 제공한다. 본 개시의 제제는 전달되어야 할 작용제가 비부착 형태(가령 용액내 세포) 및 부착 형태 (가령, 비드 또는 또 다른 적합한 담체와 붙은 세포) 둘 모두로 제공되는 이러한 2상 방출 프로파일에 대해 설계될 수 있다. 초기 투여 시, 비방해 작용제가 전달 부위로 즉각적으로 제공되는 반면, 방해 작용제의 방출은 담체 (가령, 비드)의 구조적 완전성이 이전에 부착된 작용제가 방출되는 시점에 실패할 때까지 지연된다. 하기 논의되는 바와 같이, 방출의 다른 적합 메커니즘은 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 것이다.
방출에 대한 시간 지연은 활성제의 성질에 기반하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 생물활성 세포 제제에서 방출에 대한 시간 지연은 대략 몇 초, 몇 분, 몇 시간, 또는 며칠일 수 있다. 몇 가지 환경에서는, 대략 몇 주의 지연이 적절할 수 있다. 다른 활성제, 가령 소분자 또는 거대분자에 대하여, 제제에서 방출에 대한 시간 지연은 대략 몇 초, 몇 분, 몇 시간, 며칠, 몇 주, 또는 몇 개월일 수 있다. 상이한 시간 지연 방출 프로파일을 제공하는 상이한 생체물질을 함유하는 것이 제제를 위해 또한 가능하다. 예를 들어, 제1 활성제와 제1 생체물질은 제1 방출 시간을 가질 수 있고 제2 활성제와 제2 생체물질은 제2 방출 시간을 가질 수 있다. 제1 및 제2 활성제는 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 지연된 방출의 기간은 일반적으로, 생체물질의 구조적 완전성의 상실에 대한 기간에 상응할 수 있다. 하지만, 해당 분야의 통상의 기술자는 지연된 방출의 다른 메커니즘을 인식할 것이다. 예를 들어, 활성제는 임의의 특정한 생체물질의 분해, 가령 폴리머 매트릭스로부터 약물의 확산과는 관계 없이 시간이 지남에 따라 계속 방출될 수 있다. 추가로, 생물활성 세포는 생체물질 및 생물활성 세포를 함유하는 제제로부터 떠나 고유 조직으로 이동할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 생물활성 세포는 생체물질, 가령 비드에서 고유 조직으로 이동한다.
에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체적합성 폴리머가 이용될 수 있다. 제제에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 제제의 연장 흡수가 야기될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받거나 해당 분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 공지된다. 가령, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참고한다. 폴리펩티드 작용제의 제어된 또는 연장된 방출에 적용가능한 추가적인 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,306,406호 및 제6,346,274호에서, 그리고 예를 들어 미국 특허 출원 번호 제US20020182254호 및 제US20020051808호에서 설명되며, 이들 모두 참조로서 본 명세서에 편입된다.
9. 투여 방법 및 경로
본 개시의 생물활성 세포 제제는 단독으로 투여되거나 다른 생물활성 성분과 조합하여 투여될 수 있다. 본 제제는 조직을 재생시키기 위해 고형 기관의 내부에 편입된 조직 조작 요소의 주사 또는 이식에 적합하다. 추가로, 제제는 조직을 재생시키기 위해 중공 기관의 벽에 조직 조작 요소의 주사 또는 이식을 위해 이용된다.
하나의 측면에서, 본 개시는 본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제제를 필요로 하는 대상에게 이를 제공하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 생물활성 세포의 공급원은 자가, 또는 동종이계, 동계 (자가유전자형 또는 동종유전자형), 및 이의 임의의 조합이 될 수 있다. 자가 공급원이 아닌 경우, 상기 방법은 면역억제 작용제의 투여를 포함할 수 있다. 적합한 면역억제 약물은 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 미조르빈, 사이클로스포린, 타크롤리무스 하이드레이트, 클로람부실, 로벤자리트 이나트륨, 아우라노핀, 알프로스타딜, 구스페리무스 하이드로클로라이드, 바이오신소르브, 무로모나브, 알레파셉트, 펜토스타틴, 다클리주마브, 시롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 레플로노미드, 바실릭시마브, 도르나아제 α, 빈다리드, 클라드리빈, 피메크롤리무스, 일로데카킨, 세델리주마브, 에팔리주마브, 에베롤리무스, 아니스페리무스, 가빌리모마브, 파랄리모마브, 클로파라빈, 라파마이신, 시플리주마브, 사이레이토, LDP-03, CD4, SR-43551, SK&F-106615, IDEC-114, IDEC-131, FTY-720, TSK-204, LF-080299, A-86281, A-802715, GVH-313, HMR-1279, ZD-7349, IPL-423323, CBP-1011, MT-1345, CNI-1493, CBP-2011, J-695, LJP-920, L-732531, ABX-RB2, AP-1903, IDPS, BMS-205820, BMS-224818, CTLA4-1g, ER-49890, ER-38925, ISAtx-247, RDP-58, PNU-156804, LJP-1082, TMC-95A, TV-4710, PTR-262-MG, 및 AGI-1096 (미국 특허 번호 제7,563,822호를 참고)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 다른 적합한 면역억제 약물을 인식할 것이다.
본 개시의 치료 방법은 본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제제의 전달을 포함한다. 한 가지 구체예에서, 의도되는 장점의 부위로 세포의 직접적인 투여가 바람직하다. 이를 필요로 하는 대상은 고유 신장을 하나 이상의 농축 신장 세포 모집단, 및/또는 이를 포함하는 혼합물 또는 구조물로부터 분비되는 산물과 함께 본 명세서에서 설명된 생물활성 세포 제제와 생체내 접촉시킴으로써 치료될 수 있다.
고유 신장을 분비된 산물과 생체내 접촉시키는 단계는 세포 배양 배지, 가령 조건화 배지로부터 분비된 산물의 모집단을 함유한 제제의 이용/투여를 통해 또는 생체 내에서 산물을 분비할 수 있는 농축 세포 모집단, 및 혼합물, 또는 구조물의 이식에 의해 성취될 수 있다. 생체내 접촉 단계는 고유 신장에 대해 재생 효과를 제공한다.
대상에게 세포 및/또는 분비된 산물을 투여하기 위한 여러 가지 수단은 이러한 설명을 고려하여, 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확할 것이다. 이러한 방법은 대상의 표적 내에 세포의 주사를 포함한다.
세포 및/또는 분비된 산물은 대상에게 주사 또는 이식에 의한 도입을 촉진하는 전달 장치 또는 비히클 내로 삽입될 수 있다. 특정한 구체예에서, 전달 비히클은 천연 물질을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 전달 비히클은 합성 물질을 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 전달 장치는 기관의 구조와 유사한 또는 적절하게 맞는 구조를 제공한다. 다른 구체예에서, 전달 비히클은 사실상 유체와 유사하다. 이러한 전달 장치는 수용 대상의 체내로 세포 및 유체를 주사하기 위한 튜브, 가령 카테터를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 튜브는 추가로, 바늘, 가령 주사기를 가지지만, 주사기를 통해 대상의 원하는 위치에 세포가 도입될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 포유류 신장-유래 세포 모집단은 카테터를 통하여 혈관으로 투여하기 위해 조제된다 (용어 "카테터"는 혈관으로 물질을 전달하기 위한 임의의 여러 가지 튜브형 시스템을 포함하는 것으로 의도됨). 대안으로, 세포는 직물, 가령 위브(weave), 니트(knit), 브레이드(braid), 메쉬(mesh), 및 부직포(non-woven), 천공된 필름(perforated film), 스폰지(sponge), 포움, 및 비드, 가령 고형 또는 다공성 비드, 미세입자, 나노입자 등 (가령, Cultispher-S 젤라틴 비드 - Sigma)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 생체 물질 또는 스캐폴드 내에 또는 상에 삽입될 수 있다. 세포는 여러 가지 상이한 형태로 전달하기 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포는 용액 또는 겔에서 현탁될 수 있다. 세포는 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있고, 이때 세포는 여전히 살아 있다. 제약학적으로 허용되는 담체 및 희석제는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체 및 희석제의 용도는 해당 분야에 잘 알려져 있다. 용액은 바람직하게는 멸균되고 유체이며, 그리고 종종 등장성일 것이다. 바람직하게, 용액은 제조 및 저장의 조건 하에 안정하고 예를 들어, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티메로잘 등의 이용을 통하여 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염으로부터 보존된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 세포 모집단 및 이의 혼합물의 전달에서 이용되는 전달 비히클은 상기-언급된 특징의 조합을 포함할 수 있다는 점을 인식할 것이다.
단리된 신장 세포 모집단(들), 예를 들어 B2 세포 모집단 단독 또는 B4' 및/또는 B3과 혼합된 세포 모집단을 함유한 제제의 투여 방식은 전신, 신장내 (예를 들어, 실질), 정맥 또는 동맥내 주사, 및 의도된 활성 부위에서의 조직으로의 직접 주사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이용될 추가적인 투여 방식은 직접적인 개복을 통하여, 직접적인 복강경을 통하여, 복막을 통하여 또는 경피를 통하여 단일 또는 다중 주사(들)을 포함한다. 이용될 또 다른 추가적인 투여 방식은 예를 들어, 역행(retrograde) 및 요관신우 주입(ureteropelvic infusion)을 포함한다. 외과적 투여 수단은 부분적인 신적출 및 구조물 이식, 부분적인 신적출, 부분적인 신우절개(pyelectomy), 장막 ± 복막과의 혈관화, 다초점 생검 니들 트랙(multifocal biopsy needle track), 콘 또는 피라미드형 내지 실린더 및 신장 막대형 교체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 1-단계 시술뿐만 아니라, 예를 들어 재이식을 위한 기관양-내부 생물반응기를 포함한 2-단계 시술도 포함한다. 한 가지 구체예에서, 세포 혼합물을 함유한 제제는 동일한 시간에 동일한 경로를 통하여 전달된다. 또 다른 구체예에서, 조절된 혼합물을 포함하는 각 세포 조성물은 특정한 위치로 별도로 전달되거나 특정한 방법을 통하여 동시에 또는 시간-조절 방식으로, 본 명세서에서 설명된 하나 이상의 방법에 의해 전달된다.
인간에서 적합한 세포 이식 투여량은 세포의 활성, 예를 들어 EPO 생성과 관련된 기존 정보로부터 결정되거나 전임상 연구에서 수행된 용량 연구로부터 외삽될 수 있다. 시험관내 배양 및 생체내 동물 실험으로부터, 세포의 양이 정량되고 이식 물질의 적합한 투여량을 계산하는 데에 이용될 수 있다. 추가적으로, 환자는 추가의 이식이 수행될 수 있는지 또는 이에 맞게 이식 물질이 감소되는지를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다.
해당 분야에 공지된 하나 이상의 유형의 콜라겐 또는 히알루론산과 같은 선별된 세포외 매트릭스 성분, 및/또는 성장 인자, 혈소판-농축 혈장 및 약물을 비롯한, 하나 이상의 다른 성분이 본 발명의 세포 모집단 및 이의 혼합물에 첨가될 수 있다.
해당 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 설명된 분비된 산물에 적합한 여러 가지 제제 및 투여 방법을 인식할 것이다.
10. 키트 및 제조품
본 개시는 추가로, 본 명세서에서 개시된 바와 같은 매트릭스 및 스캐폴드 및 관련 물질, 및/또는 세포 배양 배지 및 사용 설명서를 포함한 키트를 포함한다. 사용 설명서는 예를 들어, 세포 배양을 위한 설명 또는 세포 및/또는 세포 산물의 투여를 위한 설명을 포함할 수 있다. 한 가지 구체예에서, 본 개시는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 스캐폴드 및 설명서를 포함한 키트를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 마커 발현의 검출을 위한 작용제, 작용제의 이용을 위한 시약, 및 사용 설명서를 포함한다. 이 키트는 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물의 이식 또는 투여 후 대상에서 고유 신장의 재생 예후를 결정하는 목적을 위해 이용될 수 있다. 키트는 또한, 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물의 생체치료 효능을 결정하는 데에 이용될 수 있다.
또 다른 구체예는 치료를 필요로 하는 대상의 치료을 위해 유용한 생물활성 세포를 함유한 제조품이다. 제조품은 용기 및 용기 상에 있는 또는 용기와 연관된 라벨 또는 의약품 설명서(package insert)를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 유리병, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 여러 가지 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 질병을 치료하는 데에 효과적인 조성물을 담고 있고 멸균된 접근 포트(access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 주사 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개를 가진 수액 주머니 또는 유리병일 수 있음). 제제에서 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에 제공된 바와 같은 생물활성 세포 모집단이다. 라벨 또는 의약품 설명서는 제제가 특정한 질병을 치료하기 위해 이용된다는 점을 명시한다. 라벨 또는 의약품 설명서는 환자에게 제제를 투여하기 위한 설명을 추가로 포함할 것이다. 본 명세서에서 설명된 병용 요법을 포함한 제조품 및 키트도 또한 고려된다. 의약품 설명서는 이러한 치료학적 산물의 이용에 관한 징후, 사용량, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 담고 있는 치료학적 산물의 상용 패키지에 포함된 관례상의 설명서를 나타낸다. 한 가지 구체예에서, 의약품 설명서는 제제가 예를 들어 신장 질환 또는 장애와 같은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 이용된다는 점을 명시한다. 이는 추가로, 다른 완충액, 희석제, 여과기, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자의 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다. 다양한 목적을 위해, 가령 재생 결과의 평가를 위해 유용한 키트가 또한 제공된다. 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 소변-유래 소포 및/또는 그들의 함유물, 가령 핵산 (가령 miRNA), 소포, 엑소좀 등에 대한 검출 작용제를 함유한 키트가 제공될 수 있다. 검출 작용제는 핵산 프라이머 및 프로브, 그리고 바람직한 표적의 시험관내 검출을 위한 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 제조품과 마찬가지로, 키트는 용기 및 용기 상에 있는 또는 용기와 연관된 라벨 또는 의약품 설명서를 포함한다. 용기는 적어도 하나의 검출 작용제를 포함한 조성물을 담고 있다. 가령, 희석제 및 완충액 또는 대조 검출 작용제를 함유한 추가적인 용기가 포함될 수 있다. 라벨 또는 의약품 설명서는 조성물의 설명 그리고 의도된 시험관내 예후, 또는 진단용 사용을 위한 설명서를 제공할 것이다.
11. 리포트
본 개시의 방법은, 상업 목적으로 실시될 때, 일반적으로 재생 예후에 대한 리포트 또는 요약을 제공한다. 본 개시의 방법은 본 명세서에서 설명된 세포 모집단, 혼합물, 또는 구조물을 함유한 제제의 임의의 투여 또는 이식 전과 후에 재생에 대한 전개 또는 결과의 예측을 포함하는 리포트를 제공할 것이다. 리포트는 예후에 관계있는 임의의 지표에 대한 정보를 포함할 수 있다. 본 개시의 방법 및 리포트는 추가로 데이터베이스에 리포트를 저장하는 것을 포함할 수 있다. 대안으로, 방법은 추가로, 대상에 대한 데이터베이스에 기록을 만들고 데이터와 함께 기록을 덧붙일 수 있다. 한 가지 구체예에서, 리포트는 페이퍼 리포트이고, 또 다른 구체예에서 리포트는 청각 리포트이며, 또 다른 구체예에서 리포트는 전자 기록이다. 리포트는 의사 및/또는 환자에게 제공되는 것으로 간주된다. 리포트의 수신은 데이터 및 리포트를 포함하는 서버 컴퓨터에 네트워크 연결을 설정하고 그리고 서버 컴퓨터로부터 데이터 및 리포트를 요청하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 제공된 방법은 전체로 또는 부분적으로 자동화될 수 있다.
본 명세서에서 예시적으로 설명된 본 발명은 본 명세서에서 특이적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재에서 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 각각의 예시에서, 용어 "포함하는", "본질적으로 구성된" 및 "구성된" 중 어느 하나는 다른 두 가지 용어 중 어느 것으로도 교체될 수 있다. 따라서, 용어들 중 하나를 이용한 본 발명의 구체예에 대하여, 본 발명은 또한 또 다른 구체예를 포함하고 여기서 이들 용어 중 하나는 이들 용어 중 또 다른 것으로 교체될 수 있다. 각각의 구체예에서, 용어는 그들의 확립된 의미를 갖는다. 따라서, 예를 들어, 한 가지 구체예는 다수의 성분을 "포함하는" 제제를 포함할 수 있고, 또 다른 구체예는 동일한 성분으로 "본질적으로 구성된" 제제를 포함할 수 있으며, 그리고 세 번째 구체예는 동일한 성분으로 "구성된" 제제를 포함할 것이다. 사용되었던 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되고, 그리고 이러한 용어 및 표현의 사용에서 나타나고 설명된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 부분을 제외하는 것으로 의도되는 것은 아니지만, 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 점이 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구체예 및 선택적인 특징에 의해 특이적으로 개시되었음에도 불구하고, 본 명세서에서 개시된 개념의 변형 및 변화가 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 의존될 수 있고, 그리고 이러한 변형 및 변화가 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 내에서 고려된다는 점이 이해되어야 한다.
전술한 설명은 본 발명을 실시하도록 해당 분야의 통상의 기술자에게 충분한 것으로 간주된다. 다음 실시예는 오로지 설명 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 실제로, 본 명세서에서 보여지고 설명된 것들 외에도, 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확해질 것이고 그리고 첨부된 청구항의 범위 내에 포함될 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 참고문헌은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.
실시예
실시예 1
용액의 제조
본 실시예는 이질성 신장 세포 모집단의 단리 및 특성화, 그리고 재생 요법 산물의 제조를 위해 다음 실시예에서 이용되는 여러 가지 배지 제제 및 용액의 조성을 제공한다.
<표 1.1>
Figure 112015049441899-pct00001
모든 세포 세척을 위해 둘베코 인산 완충 식염수 (DPBS)를 이용하였다.
실시예 2
이질성 비분할 신장 세포 모집단의 단리
본 실시예는 인간으로부터의 비분할된 (UNFX) 이질성 신장 세포 모집단의 단리를 설명한다. 초기 조직 해리를 수행하여 인간 신장 조직으로부터 이질성 세포 현탁액을 만들었다.
신장 생검을 통한 신장 조직은 이질성 신장 세포 모집단에 대한 공급원 물질을 제공하였다. 하나 이상의 피질, 피질수질 접합부 또는 수질 조직 중 하나 이상을 포함하는 신장 조직을 이용할 수 있다. 피질수질 접합부 조직을 이용하는 것이 바람직하다. 반흔 조직을 회피하는, 다수의 생검 코어 (최소 2)는 CKD 신장으로부터 요구되었다. 임상 연구자는 최종 NKA의 계획된 이식에 앞서 대략 4주에 병원에서 환자로부터 신장 조직을 얻었다. 조직을 실시예 1의 조직 수송 배지에 옮겼다.
이후, 세포 추출을 위한 조직을 가공처리하기 전에, 생긴 생체부담을 감소시키기 위하여, 실시예 1의 조직 세척 용액으로 조직을 세척하였다.
신장 조직을 잘게 썰고, 무게를 재고, 그리고 실시예 1의 분해 용액에서 해리시켰다. 결과적 세포 현탁액을 둘베코 변형 이글 배지(D-MEM) + 10% 소 태아 혈청 (FBS) (Invitrogen, Carlsbad CA)에서 중화시키고, 세척하고, 무-혈청, 무-보충 케라티노사이트 배지 (KSFM) (Invitrogen)에서 재현탁시켰다. 이후 세포 현탁액에 15% (w/v) 아이오디산올 (OptiPrep™, Sigma) 구배를 만들어, 실시예 1의 신장 세포 성장 배지에서 cm2 당 25,000개 세포의 밀도로 조직 배양 처리된 폴리스티렌 플라스크 또는 접시 상에서 배양의 시작에 앞서 적혈구 및 파편을 제거하였다. 예를 들어, 세포를 150 ml의 50:50 배지에서 25x106개 세포/플라스크로 T500 Nunc 플라스크 상에 도말할 수 있다.
실시예 3
단리된 신장 세포 모집단의 세포
신장 세포 확장은 수용된 조직의 양에 기반하고 생긴 조직으로부터 신장 세포를 단리시키는 것의 성공에 기반한다. 필요하다면, 단리된 세포를 동결보존할 수 있다 (하기 참고). 신장 세포 성장 동역학은 개별적인 환자로부터 단리된 세포의 고유 변수로 인해 샘플마다 달라질 수 있다.
정의된 세포 확장 과정은 표 3.1의 생긴 조직의 가변성에 기인한 세포 회수의 범위를 맞추는 것으로 개발되었다. 신장 세포의 확장은 정의된 세포 배양 절차를 이용하여 표 1.1의 신장 세포 성장 배지에서 폐쇄 배양 용기 (가령, T-플라스크, Cell Factories, HyperStacks®)에서의 연속 계대를 포함한다.
인간 임상 시험을 위해 BPE-무 배지를 발달시켜 BPE의 이용과 연관된 내재된 위험을 제거하였다. 세포 성장, 표현형 (CK18) 및 세포 기능 (GGT 및 LAP 효소 활성)을 BPE-무 배지에서 평가하고 동물 연구에서 이용된 BPE 함유 배지와 비교하였다. 신장 세포 성장, 표현형 및 기능은 2개의 배지에서 동일하였다. (데이터는 나타나지 않음).
<표 3.1>
Figure 112015049441899-pct00002
일단 초기 T-플라스크 (계대 0)에서 세포 성장이 관찰되고 시각적인 오염 흔적이 없어지고 나면, 배양 배지를 교체하고 그 후에는 2-4일마다 바꾸어 주었다, 도 2B. 현미경 하에 가시적인 배양물 관찰로 세포를 평가하여 신장 세포 형태학을 확인하였다. 배양물은 세포가 함께 뭉치는 것으로 인해, 빽빽한 포장도로 또는 자갈 모양을 특징적으로 입증하였다. 이들 형태학적 특징은 확장하는 동안 변화하고 매 계대에서 존재하지 않을 수 있다. 세포 확장 전체에 걸쳐 이용된 배양 욕기에서 다양한 수준의 합류에서의 세포의 Image Library를 이용하여 세포 배양 합류를 평가하였다.
배양 용기가 적어도 50% 합류일때, 트립신화로 신장 세포를 계대하였다, 도 2B. 떨어져 나간 세포를 신장 세포 성장 배지를 함유한 관 내로 수집하고, 수를 세고 그리고 세포 생존율을 계산하였다. 각각의 세포 계대에서, 세포 수를 NKA의 제제를 위해 요구되는 수까지 확장시키기 위하여 충분한 수의 배양 용기에서 500-4000개 세포/cm2로 세포를 도말하였다, 도 2B. 배양 용기를 5% CO2 환경의 37℃ 인큐베이터에 두었다. 상기 설명된 바와 같이, 세포 형태학 및 합류를 모니터링하였고 그리고 조직 배양 배지를 2-4일마다 교체하였다. 표 3.2는 인간 공여자로부터 6회의 신장 생검의 세포 단리 및 확장동안 관찰된 인간 신장 세포의 생존력을 열거한다.
<표 3.2>
Figure 112015049441899-pct00003
상이한 환자로부터의 조직의 고유 변수는 배양에서 상이한 세포 수득률을 야기하였다. 따라서, 세포 계대의 시기 또는 표적 세포수를 얻기 위해 각각의 계대에서 요구되는 배양 용기의 수와 유형을 엄격하게 정의하는 것은 실용적이지 않다. 전형적으로 신장 세포는 2 또는 3회 계대를 겪는다; 하지만, 배양 기간 및 세포 수득률은 세포 성장률에 따라 달라질 수 있다. 이것은 배양 기간 및 6명의 환자로부터의 세포 수득률 (계산)이 나타난 도 3에서 예시화된다.
수확 또는 계대를 위해 EDTA와 0.25% 트립신 (Invitrogen)으로 세포를 떼어내었다. 트립판 블루 배제를 통하여 생존력을 평가하였고 그리고 헤마사이토미터(hemacytometer)를 이용하거나 자동화된 Cellometer® 카운팅 시스템 (Nexcelom Bioscience, Lawrence MA)을 이용하여 수동으로 셈(enumeration)을 수행하였다.
실시예 4
배양된 세포의 동결보존
확장된 신장 세포를 일과적으로 동결보존하여 개별적인 환자로부터 세포 성장의 고유 변수에 대해 맞추고 예정된 임상 스케줄에 산물을 전달하였다 (도 2B). 동결보존된 세포는 또한 또 다른 NKA가 필요되는 경우 (가령, 환자 질병, 뜻밖의 진행 사건으로 인한 지연)에 세포의 대체 공급원을 제공한다. 세포를 동결보존하고 해동 시 생존가능한, 기능 세포를 회수하는 데에 이용되는 조건을 확립하였다.
동결보존을 위하여, 세포를 동결보존 용액에서 약 50x106개 세포/mL의 최종 농도까지 현탁시키고 (실시예 1 참고) 그리고 유리병 내로 분배하였다. 약 50x106개 세포/mL를 함유한 1 mL 유리병을 조절률 냉동고의 동결실에 두고 미리-프로그랭된 속도로 얼렸다. 얼린 후, 공정중(in-process) 저장을 위해 세포를 액체 질소 냉동고에 옮겼다
실시예 5
SRC 세포 모집단의 제조
도 2B의 일정관리에 따라 동결보존된 세포로부터 성장되는 최종 배양 용기로부터 또는 직접적으로 확장 배양으로부터 선별된 신장 세포 (SRC)를 제조할 수 있다.
동결보존 세포를 이용한다면, 하나의 최종 확장 단계를 위해 세포를 해동시키기고 조직 배양 용기 상에 도말하였다. 최종 배양 용기가 대략 50-100% 합류가 되었을 때, 세포는 SRC 분리를 위해 가공처리될 준비가 되었다. NKA의 배지 교환 및 최종 세척은 최종 산물내 임의의 잔여 동결보존 용액을 희석시킨다.
일단 최종 세포 배양 용기가 적어도 50% 합류에 도달하면, 배양 용기를 37℃의 5% CO2 환경에서 2% 산소로 설정된 저산소 인큐베이터에 옮기고 하룻밤 동안 배양하였다. 도 2C를 참고한다. 세포를 48시간만큼 긴 시간 동안 2% 산소로 설정된 산소-조절 인큐베이터에서 유지시켰다. 더욱 생리학적으로 관련있는 저-산소 (2%) 환경으로의 노출은 세포 분리 효능을 개선시켰고 그리고 저산소-유도된 마커, 가령 VEGF의 더 많은 검출을 가능하게 하였다.
충분한 시간 (가령, 하룻밤 내지 48시간) 동안 저산소 조건에 산소를 노출시킨 후, 세포를 EDTA와 0.25% 트립신 (Invitrogen)으로 떼어내었다. 트립판 블루 배제를 통하여 생존력을 평가하였고 그리고 헤마사이토미터를 이용하거나 자동화된 Cellometer® 카운팅 시스템 (Nexcelom Bioscience, Lawrence MA)을 이용하여 수동으로 셈을 수행하였다. 세포를 DPBS로 1회 세척하고 DPBS에서 약 850x106개 세포/mL까지 재현탁시켰다.
세포 부력 밀도에 기반하여 수확된 신장 세포 모집단을 분리하는 데에 밀도 구배 원심분리를 이용하였다. 신장 세포 현탁액을 단일-단계 7% 아이오디산올 밀도 구배 용액 (OptiMEM에서 OptiPrep; 60% (w/v); 실시예 1을 참고) 상에서 분리하였다.
7% OptiPrep 구배 용액을 제조하였고 그리고 이용하기에 앞서 바람직한 밀도를 나타내는 굴절률을 측정하였다 (R.I. 1.3456 +/- 0.0004). 수확된 신장 세포를 구배 용액 상부에 층층히 놓았다. 원심분리 튜브 또는 세포 처리기 (가령, COBE 2991) 중 하나에서 밀도 구배를 실온에서 20분 동안 800 g로 원심분리하였다. 대략 1.045 g/mL보다 더 큰 부력 밀도는 나타내는 세포 분획물을 뚜렷한 펠렛으로서 원심분리 후 수집하였다, 도 4. 1.045 g/mL 미만의 부력 밀도를 유지하는 세포는 제외시키고 폐기시켰다.
SRC 펠렛을 DPBS에서 재현탁시켰다 (도 2C). 최종 산물에서 잔여 OptiPrep, FBS, 배양 배지 및 부수적인 물질의 잔재를 4회 DPBS 세척과 1회 젤라틴 용액 단계로 최소화시킨다.
실시예 6
치료학적 잠재력을 가진 세포는 정상 및 만성적으로-병든 신장 조직으로부터 단리 및 증식될 수 있다
본 연구의 목적은 고함량 분석 (HCA)을 통하여 인간 NKA 세포의 기능적인 특성화를 결정하기 위함이었다. 고-함량 이미징 (HCI)은 다수의 샘플에 걸쳐 2개 이상의 형광 프로브 (다중처리)를 이용하여 다수의 아-세포 사건의 동시적인 이미징을 제공한다. 고-함량 분석 (HCA)은 고-함량 이미지에서 캡쳐된 다수의 세포 파라미터의 동시적인 정량적 측정을 제공한다. 간단히 말해서, 표준 생검 절차를 이용하여 후기 만성 신장 질환 (CKD)이 있는 5개의 인간 신장 및 3개의 비-CKD 인간 신장으로부터 취한 코어 생검으로부터 비분할된 (UNFX) 배양물을 만들었고 (Aboushwareb et al., World J Urol 26, 295, 2008) 그리고 이를 독립적으로 유지시켰다. 생체 외에서 UNFX의 (2) 계대 후, 세포를 수확하고 (Basu et al., WO 2012/064369의 실시예 2에서 설명된 바와 같은) 밀도 구배 방법을 수행하여 아분획물 B2, B3, 및/또는 B4를 비롯한, 아분획물들을 발생시켰다.
Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 10.1에서 요약된 바와 같이 비-CKD 및 CKD 인간 공여자로부터 인간 신장 조직을 얻었다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 4는 HK17 및 HK19 샘플의 조직병리학적 특징을 보여준다. 모든 비-CKD (3/3) 및 CKD (5/5) 신장으로부터 생체외 배양을 확립하였다. 관심 영역 (ROI)을 정의하는 인간 NKA 세포에서 알부민 수송의 고함량 분석 (HCA)이 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 5 (인간 NKA 세포에서 알부민 수송의 HCA)에서 나타난다. 비-CKD 및 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 세포에서 알부민 수송의 정량 비교는 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 6에서 나타난다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 6에서 나타난 바와 같이, 알부민 수송은 CKD-유래 NKA 배양에서 약화되지 않는다. 세뇨관-농축 B2 및 세뇨관 세포-고갈 B4 아분획물 사이에서 마커 발현의 비교 분석은 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 7 (CK8/18/19)에서 나타난다.
세뇨관-농축 B2 및 세뇨관 세포-고갈 B4 아분획물 사이에서 알부민 수송의 비교 기능 분석은 Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 도 8에서 나타난다. 아분획물 B2는 근위 세뇨관 세포에서 농축되고 따라서 증가된 알부민-수송 기능을 나타낸다.
알부민 흡수: 24-웰 콜라겐 IV 플레이트 (BD Biocoat™)에서 합류로 성장된 세포의 배양 배지를 18-24시간 동안 1X 항진균제/항생제 및 2 mM 글루타민을 함유한 페놀 무-적색, 무-혈청, 저-글루코오스 DMEM (pr-/s-/lg DMEM)으로 교체하였다. 어세이 바로 직전에, 세포를 세척하고, 30분 동안 pr-/s-/lg DMEM + 10mM HEPES, 2mM 글루타민, 1.8mM CaCl2, 및 1mM MgCl2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 30분 동안 25μg/mL 로다민-접합된 소 알부민 (Invitrogen)에 노출시키고, 빙냉각 PBS로 세척하여 세포내 이입을 정지시키고 그리고 25μg/mL 훽스트(Hoechst) 핵 염료를 함유한 2% 파라포름알데하이드로 즉시 고정시켰다. 억제 실험을 위하여, 1μM 수용체-연관 단백질 (RAP) (Ray Biotech, Inc., Norcross GA)을 알부민 첨가에 앞서 10분에 첨가하였다. 현미경적 이미징 및 분석을 BD Pathway™ 855 고함량 바이오영상촬영기 (Becton Dickinson)로 수행하였다 (Kelley et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2010 Nov;299(5):F1026-39. Epub Sep 8, 2010을 참고).
결론적으로, HCA는 세포 수준 자료를 제공하고 다른 어세이로는 검출될 수 없는 모집단의 동력학, 즉 유전자 또는 단백질 발현을 밝힐 수 있다. 알부민 수송 (HCA-AT) 기능을 측정하기 위한 정량가능한 생체외 HCA 어세이를 활용하여 인간 NKA 원형의 성분으로서 인간 신장 세뇨관 세포를 특징지을 수 있다. HCA-AT는 세포 기능의 비교 평가를 가능하게 했으며, 이는 알부민 수송-적격 세포가 인간 CKD 신장으로부터 유래된 NKA 배양물에 보유되었다는 점을 보여준다. 또한, NKA 배양물의 특이적인 아분획물인 B2 및 B4가 표현형과 기능 면에서 다르고, 여기서 B2는 증진된 알부민 수송 활성을 갖는 세뇨관 세포-농축 분획물에 해당한다는 점을 보여주었다. 인간 CKD로부터의 B2 세포 아집단은 (상기 나타난 바와 같이) 생체 내에서 효능을 나타낸 설치류 B2 세포와 표현형적으로 및 기능적으로 유사하다.
실시예 7
구배 전 저-산소 배양은 밴드 분포, 조성물, & 유전자 발현에 영향을 미친다
원형 B2 및 B4의 조성물 및 분포에 미치는 산소 조건의 효과를 결정하기 위하여, 상이한 종으로부터의 네오(neo) 신장 세포 제조물을 구배 단계에 앞서 상이한 산소 조건에 노출시켰다. Kelley et al., 2010, supra에서 설명된 바와 같이, 랫트 세포 단리 및 배양 시작을 위한 표준 절차를 이용하여 설치류 네오-신장 증대 (NKA) 세포 제조물 (RK069)을 확립하였다. 모든 플라스크를 21% (대기) 산소에서 2-3일동안 배양하였다. 배지를 바꿔주었고 이후 플라스크의 절반을 2% 산소로 설정된 산소-조절 인큐베이터에 재배치시켰으며, 반면에 남아있는 플라스크는 추가적인 24시간 동안, 21% 산소 조건에 두었다. 이후 상기 설명된 표준 효소적 수확 절차를 이용하여 각각의 조건 세트로부터 세포를 수확하였다. 표준 절차에 따라 구배 단계를 준비하였고 그리고 "표준 산소" (21% 산소) 및 "저산소" (2% 산소) 배양물을 별도로 수확하고 동일한 구배 단계에 나란히 적용시켰다. 두 조건 모두에서 4개의 밴드 및 펠렛이 생겨났지만, 구배 전체에 걸친 세포의 분포는 21% 및 2% 산소-배양 배치(batch)에서 상이하였다 (표 7.1). 구체적으로, B2의 수득률은 저산소에서 증가되었고, 이때 B3에서의 감소를 수반하였다. 추가로, B4-특이 유전자 (가령 에리트로포이에틴)의 발현은 저산소-배양 세포으로부터 발생된 결과적 구배에서 증진되었다 (Presnell et al. WO/2010/056328의 도 73).
Basu et al., WO 2012/064369에서 설명된 바와 같이, 개 세포 단리 및 배양을 위한 표준 절차 (설치류 단리 및 배양 절차와 유사함)를 이용하여 개 NKA 세포 제조물 (DK008) 확립하였다. 모든 플라스크를 21% (대기) 산소 조건에서 4일 동안 배양하였고, 그 다음 플라스크의 서브세트를 24시간 동안 저산소 (2%)로 옮겼고, 반면에 플라스크의 나머지 서브세트는 21%에서 유지시켰다. 그 후에, 각각의 플라스크 세트를 수확하고 동일한 구배 단계를 수행하였다. 랫트 결과와 유사하게, 저산소-배양 개 세포는 대기 산소-배양 개 세포와는 상이하게 구배 전체에 걸쳐 분포되었다 (표 7.1). 다시 말해, B3 내에 분포에서의 감소를 수반하는 것과 함께, B2의 수득률은 구배 전 저산소 노출로 증가되었다.
<표 7.1>
Figure 112015049441899-pct00004
상기 데이터는 저산소로의 전-구배 노출이 B4 내에 특이적인 특수화 세포의 분포뿐만 아니라 B2의 조성물 증진시킨다는 점을 보여준다. 따라서, 저산소 배양, 그 다음 상기 Basu et al.에서 설명된 바와 같은 밀도-구배 분리는 종에 걸쳐, 'B2' 및 'B4' 세포 모집단을 발생시키는 데에 효과적인 방식이다.
실시예 8
자가면역 사구체 신염 환자 샘플로부터 단리된 신장 세포의 비분할 혼합물의 특성화
상기 설명된 바와 같이, 자가면역 사구체 신염 환자 샘플로부터 신장 세포의 비분할 혼합물을 단리시켰다. 신장 조직으로부터 단리되고 확장된 신장 세포의 특이적인 아집단의 무작위 유전자형 조성을 결정하기 위하여, 정량적 실시간 PCR (qRTPCR) 분석 (Brunskill et al., Dev. Cell. 2008 November; 15(5):781-791)을 이용하여 세포 아분획물 중 차등적인 세포-유형-특이적 및 경로-특이적 유전자 발현 패턴을 식별하였다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 6.1에서 나타난 바와 같이, HK20은 자가면역 사구체 신염 환자 샘플이다. Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 6.2에서 나타난 바와 같이, HK20으로부터 발생된 세포는 qRTPCR에 의해 결정된 바와 같이, 사구체 세포가 결핍되어 있다.
실시예 9
국소 분절 사구체경화증 환자로부터 단리된 치료학적 관련 신장 생물활성 세포 모집단의 유전적 프로파일링
신장 조직으로부터 단리되고 확장된 신장 세포의 특이적인 아집단의 무작위 유전자형 조성을 결정하기 위하여, 정량적 실시간 PCR (qRTPCR) 분석 (Brunskill et al., supra 2008)을 이용하여 세포 아분획물 중 차등적인 세포-유형-특이적 및 경로-특이적 유전자 발현 패턴을 식별하였다. 사구체 대부분이 파괴된 국소 분절 사구체경화증 (FSGS) 환자로부터 유래된, 인간 제조물 HK023을 수확 시 B4 분획물내 사구체 세포의 존재에 대해 평가하였다. 간단히 하자면, 비분할된 (UNFX) 배양물을 만들고 (Aboushwareb et al., World J Urol 26, 295, 2008) 그리고 표준 생검 절차를 이용하여 신장으로부터 취한 (4) 코어 생검 각각으로부터 독립적으로 유지시켰다. 생체 외에서 UNFX의 (2) 계대 후, 세포를 수확하고 Basu et al., WO2012/064369의 실시예 6에 따라 밀도 구배 방법을 수행하여, 설치류, 개, 및 다른 인간 샘플에서 수행된 작업에 기반하여 내분비, 혈관, 및 사구체 세포가 농축된 것으로 공지된, 아분획물 B4를 비롯한, 아분획물을 만들었다.
1.063 - 1.091 g/mL의 부력 밀도를 가진 세포의 뚜렷한 밴드로서 나타나는, HK023의 독립적인 UNFX 샘플 각각으로부터 별도로 B4 분획물을 수확하였다. RNA를 각각의 샘플로부터 단리시키고 정량적 실시간 PCR로 포도신 (사구체 세포 마커) 및 PECAM (내피 세포 마커)의 발현에 대해 검사하였다. 중증 FSGS 환자로부터의 생검-발생 샘플에서 예상되는 바와 같이, B4 분획물에서 포도신(+) 사구체 세포의 존재는 일치하지 않았으며, 여기서 포도신은 샘플의 2/4에서 검출이 불가하였다. 대조적으로, PECAM+ 혈관 세포는 생검-시작 배양의 4/4의 B4 분획물에서 일관되게 존재하였다. 따라서, B4 분획물은 심지어, 중증 질환 상태인 인간 신장으로부터, 1.063-1.091 g/mL의 밀도 범위에서 단리될 수 있다.
<표 9.1>
Figure 112015049441899-pct00005
추가로, Ilagan et al. PCT/US2011/036347의 표 7.2에서 보여진 바와 같이, 인간 샘플 (HK018)은 밀도 구배 원심분리 후 qRTPCR에 의해 비검출 포도신 (사구체 마커)을 나타내었다.
실시예 10
형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용한 생존 신장 세포 유형의 농축/고갈
형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 이용하여 하나 이상의 단리된 신장 세포를 농축시키고, 및/또는 하나 이상의 특이적인 신장 세포 유형을 단리된 일차 신장 조직으로부터 고갈시킬 수 있다.
시약: 70% 에탄올; 세척 완충액 (PBS); 50:50 신장 세포 배지 (50% DMEM 높은 글루코오스): 50% 케라티노사이트-SFM; 트립판 블루 0.4%; 표적 신장 세포 모집단에 대한 일차 항체, 가령 신장 내피 세포에 대한 CD31 및 신장 사구체 세포에 대한 네프린. 매칭된 이소형 특이적 형광 이차 항체; 염색 완충액 (PBS에서 0.05% BSA).
절차: 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)을 세척하기 위한 표준 절차 후, 일차 분리 또는 배양된 세포로부터 신장 세포의 단일 세포 현탁액을 T500 T/C 처리된 플라스크로부터 수득하고 신장 세포 배지에서 재현탁하고 그리고 얼음 상에 놓을 수 있다. 이후, 세포 수 및 생존력을 트립판 블루 배제 방법을 이용하여 결정한다. 예를 들어, 이질성 모집단으로부터의 사구체 세포 또는 내피 세포의 신장 세포 농축/고갈을 위하여, 적어도 70%의 생존력을 갖는 10 내지 50x106개 생세포를 수득한다. 이후, 신장 세포의 이질성 모집단을 개시 농도 1μg/0.1ml의 염색 완충액/1 x 106개 세포 (필요하다면, 적정농도)에서의 표적 세포 유형에 특이적인 일차 항체로 염색한다. 표적 항체는 가령 CD31 PE (신장 내피 세포에 특이적인)와 접합되거나 가령 네프린 (신장 사구체 세포에 특이적인)과 접합되지 않을 수 있다.
이후, 세포를 얼음 상에서 또는 빛으로부터 보호되는 4℃에서 30분 동안 염색한다. 30분의 인큐베이션 후, 세포를 5분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 이후 펠렛을 접합된 이소형 특이적 이차 항체가 요구되는 지에 따라 PBS 또는 염색 완충액에서 재현탁시킨다. 세포가 형광색소 접합된 일차 항체로 라벨링되면, 세포를 107개 세포 당 2ml의 PBS에서 재현탁시키고 그리고 FACS 아리아(aria) 또는 동등한 세포 분류기에서 분류를 수행한다. 세포가 형광색소 접합된 항체로 라벨링되지 않는다면, 1ug/0.1ml/106개 세포의 개시 농도에서 이소형 특이적 접합된 이차 항체로 라벨링한다.
이후, 세포를 얼음 상에서 또는 빛으로부터 보호되는 4℃에서 30분 동안 염색한다. 30분의 인큐베이션 후, 세포를 5분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛을 5x106/ml PBS의 농도로 PBS에서 재현탁시키고 이후, 12x75mm 당 4ml를 멸균 튜브에 옮긴다.
FACS Aria는 제조자의 교시 (BD FACs Aria User Manual)에 따라 생존 세포 멸균 분류를 위해 준비된다. 샘플 튜브를 FACs Aria 상에 로딩하고 수집 시작 후 PMT 전압을 조절한다. 특정 파장을 이용하는 형광 강도를 이용하여 신장 특이적 세포 유형을 선별하도록 게이트를 드로잉한다. 또 다른 게이트는 음성 모집당을 선별하도록 드로잉한다. 일단 양성 표적 모집단 및 음성 모집단을 캡슐화하도록 바람직한 게이트를 드로잉하고 나면, 제작자의 교시를 이용하여 세포를 분류한다.
양성 표적 모집단은 하나의 15ml 원추형 튜브에 수집하고 음성 모집단은 1 ml의 신장 세포 배지로 채워진 또 다른 15 ml 원추형 튜브에 수집한다. 수집 후, 각각의 튜브로부터의 샘플을 유동세포 분석법으로 분석하여 순도를 결정한다. 수집된 세포를 5분 동안 300xg에서 원심분리하여 세척하고 그리고 추가 분석 및 실험을 위해 펠렛을 신장 세포 배지에서 재현탁시켰다.
실시예 11
자기적 세포 분류를 이용한 신장 세포 유형의 농축/고갈
하나 이상의 단리된 신장 세포를 농축시키고 및/또는 하나 이상의 특이적인 신장 세포 유형을 단리된 일차 신장 조직으로부터 고갈시킬 수 있다.
시약: 70% 에탄올, 세척 완충액 (PBS), 50:50 신장 세포 배지 (50% DMEM 높은 글루코오스): 50% 케라티노사이트-SFM, 트립판 블루 0.4%, 러닝 완충액 (PBS, 2mM EDTA, 0.5% BSA), 세정 완충액 (PBS, 2mM EDTA), 세척 용액 (70% v/v 에탄올), Miltenyi FCR 차단 시약, IgG 이소형에 특이적인 Miltenyi 마이크로비드, 표적 항체, 가령 CD31(PECAM) 또는 네프린, 또는 이차 항체.
절차: 생물학적 안전 캐비넷 (BSC)을 세척하기 위한 표준 절차 후, 일차 단리 또는 배양물로부터의 신장 세포의 단일 세포 현탁액을 수득하고 신장 세포 배지에서 재현탁시킨다. 세포 수 및 생존력을 트립판 블루 배제 방법을 이용하여 결정한다. 예를 들어, 이질성 모집단으로부터의 사구체 세포 또는 내피 세포의 신장 세포 농축/고갈을 위하여, 적어도 70%의 생존력을 갖는 적어도 106 내지 4x109개까지 생세포를 수득한다.
농축/고갈 접근을 위한 최적 분리를 관심 표적 세포에 기반하여 결정한다. 네프린 항체를 이용한 표적 빈도 10% 미만의, 예를 들어 사구체 세포의 농축을 위하여, Miltenyi autoMACS 또는 동등한, 장치 프로그램 POSSELDS (민감 모드에서 이중 양성 선별)을 이용한다. 표적 빈도 10% 초과의 고갈을 위해, Miltenyi autoMACS, 또는 동등한, 장치 프로그램 DEPLETES (민감 모드에서 고갈)을 이용한다.
생세포를 15 ml 원추형 원심분리 튜브에 0.05% BSA와 함께 1 μg/106개 세포/0.1ml의 PBS를 첨가함으로써, 표적 특이적 일차 항체, 예를 들어 네프린 rb 다클론 항체로 라벨링하고, 그 다음 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
라벨링 후, 107개 세포 당 1-2ml의 완충액을 첨가하고 그 다음 5분 동안 300xg에서 원심분리하여 세포를 세척하여 결합되지 않은 일차 항체를 제거하였다. 세척 후, 0.05% BSA와 함께 1ug/106/0.1ml의 PBS의 이소형 특이적 이차 항체, 가령 닭 항-토끼 PE를 첨가하고, 그 다음 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 107개 세포 당 1-2ml의 완충액을 첨가하고 그 다음 다음 5분 동안 300xg에서 원심분리하여 세포를 세척하여 결합되지 않은 이차 항체를 제거하였다. 상청액을 제거하고, 그리고 세포 펠렛을 107개 총 세포 당 60 μl의 완충액에서 재현탁시키고, 그 다음 107개 총 세포 당 20 μl의 FCR 차단 시약을 첨가하고, 이후 잘 혼합한다.
20 μl의 직접적 MACS 마이크로비드 (가령, 항-PE 마이크로비드)를 첨가하고 혼합하고 이후, 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 10-20x 라벨링 용적의 완충액을 첨가하고 5분 동안 300xg에서 세포 현탁액을 원심분리하여 세포를 세척하고 그리고 108개 세포 당 500μl-2ml의 완충액에서 세포 펠렛을 재현탁시켰다.
제조자의 교시에 따라, autoMACS 시스템을 세척하고 autoMACS를 이용하는 자기 세포 분리를 준비한다. 새로운 멸균 수집관을 배출구 포트(outlet port) 아래에 둔다. autoMACS 세포 분리 프로그램을 선택한다. 선별을 위해서는 POSSELDS 프로그램을 선택한다. 고갈을 위해서는 DEPLETES 프로그램을 선택한다.
라벨링된 세포를 흡수 포트 (uptake port)에 삽입하고, 이후 프로그램을 시작한다. 세포 선별 또는 고갈 후, 샘플을 수집하고 사용할 때까지 얼음에 놓는다. 고갈되거나 선별된 샘플의 순도를 유동세포 분석법으로 확인한다.
실시예 12
농축 이질성 신장 세포 모집단의 표현형 특성화
다음 실시예는 실시예 5의 선별된 이질성 인간 신장 세포를 특징짓기 위한 유동세포 분석법의 용도를 상세 설명한다. 이질성 신장 세포 모집단은 그들의 재생 능력으로 잘 알려진 신장 내피 세포로 주로 구성되었다. 다른 실질 (혈관) 및 기질 (집합관) 세포는 자가 세포 모집단에서 드물게 존재할 수 있다.
유동세포 분석법을 이용하여 신장 세포 마커의 발현 분석으로 세포 표현형을 모니터링한다. 세포의 표현형 분석은 분석되는 세포 유형에 특이적인 항원 마커의 용도에 기반한다. 유동 세포측정 분석은 분석되는 항원 마커를 발현하는 샘플 모집단내 세포의 정량적 측정을 제공한다.
신장 세포의 표현형 특성화를 위해 유용한 것으로서 여러 가지 마커가 본 문헌에서 보고되었다: (i) 사이토케라틴; (ii) 수송막 단백질 (아쿠아포린 및 쿠빌린); (iii) 세포 결합 분자 (어드헤린(adherin), 분화 클러스터, 및 렉틴); 및 (iv) 대사 효소 (글루타티온). 전체 신장 분해로부터 유래된 배양물에서 발견되는 다수의 세포는 상피 및 내피이기 때문에, 검사되는 마커는 이들 두 가지 군에 특이적인 단백질의 발현에 중점을 둔다.
사이토케라틴은 변화하는 정도에 대한 많은 유형의 상피 세포에 의해 발현되는 중간 섬유 단백질의 패밀리이다. 상피 세포에 의해 발현되는 사이토케라틴의 서브세트는 상피의 유형에 의존한다. 예를 들어, 사이토케라틴 7, 8, 18 및 19는 신장 및 남아있는 비뇨생식로 그리고 소화 및 호흡관의 정상적인 단층 상피에 의해 모두 발현된다. 조합한 이들 사이토케라틴은 상피 세포의 구조적 완전성의 원인이 된다. 이 조합은 산성 (유형 I) 및 염기성 (유형 II) 케라틴 패밀리 둘 모두를 나타내고 신장 세포에서 풍부하게 발현되는 것으로 밝혀진다 (Oosterwijk et al., J Histochem Cytochem, 38(3):385-392, 1990). 본 명세서에서 이용하기 위한 바람직한 사이토케라틴은 CK8, CK18, CK19 및 이의 조합이다.
아쿠아포린은 세포 내로 그리고 밖으로 물의 통과를 허용하는 동시에, 이온 및 다른 용질의 통과는 방지하는 수송 막 단백질이다. 본 문헌에서 설명된 아쿠아포린은 13개이며, 여기서 이들 중 6개는 신장에서 발견된다 (Nielsen et al., J Histochem Cytochem, 38(3):385-392, 2002). 물 흐름을 조절하는 엄격한 규제를 가함으로써, 아쿠아포린2는 물에 대해 높은 투과성을 갖는 신장 집합관 상피 세포의 혈장 막을 초래하며, 따라서 삼투성 구배의 방향으로 물이 흐르도록 허용한다 (Bedford et al., J Am Soc Nephrol, 14(10):2581-2587, 2003; Takata et al., Histochem Cell Biol, 130(2):197-209, 2008; Tamma et al., Endocrinology, 148(3):1118-1130, 2007). 아쿠아포린1은 근위 세뇨관의 특징이다 (Baer et al., Cells Tissues Organs:184(1), 16-22, 2006; Nielsen et al., 2002, supra).
쿠빌린은 수송 막 수용체 단백질이다. 이것이 단백질 메가린과 공동으로-배치될 때, 그들은 함께 쿠빌린-결합된 리간드, 가령 알부민의 내재화를 촉진한다. 쿠빌린은 장과 신장의 상피 내에 위치된다 (Christensen,. Am J Physiol Renal Physiol, 280(4):F562-573, 2001).
CXCR4는 SDF1에 대한 케모카인 수용체로서 역할을 하는 수송 막 단백질이다. 리간드가 결합시, 세포내 칼슘 수준은 증가하고 MAPK1/MAPK3 활성화가 증가된다. CXCR4는 신장에서 본질적으로 발현되고 신장 발달 및 세뇨관 형성에서 중요한 역할을 한다 (Ueland et al., Dev Dyn, 238(5):1083-1091, 2009).
카드헤린은 칼슘-의존 세포 부착 단백질이다. 카드헤린은 4개의 군으로 분류되며, 여기서 E-카드헤린은 상피 조직에서 발견되고, 카드헤린은 이동성 및 증식을 조절하는 것에 관여한다. E-카드헤린은 신장에서 원위 세뇨관을 구성하는 상피 세포의 부착 연접에 배치되는 것으로 밝혀진 막관통 글리코단백질이다 (Prozialeck et al., BMC Physiol, 4:10, 2004; Shen et al., Mod Pathol, 18(7):933-940, 2005).
DBA (돌리코스 비플로루스(Dolichos biflorus) 응집소)는 신장 집합관 구조의 표면에서 움직이는 α-N-아세틸갈락토스아민-결합 렉틴 (세포 결합 단백질)이고, 그리고 신장 집합관 및 원위 세뇨관을 발달시키는 일반적인 마커로서 간주되고 이용된다 (Michael et al., J Anat 210(1):89-97, 2007; Lazzeri et al., J Am Soc Nephrol 18 (12):3128-3138, 2007).
분화 클러스터 31 (CD31; 또한 혈소판 내피 세포 흡착 분자, PECAM-1로도 알려짐)은 면역 세포 그리고 내피 세포의 선별 모집단에 의해 발현되는 세포 부착 단백질이다. 내피 세포에서, 이 단백질은 세포 경계선에 집중된다 (DeLisser, 1997). 분화 클러스터 146 (CD146)은 액틴 세포 골격와 연관된 세포내 접합점에서 네피 세포의 세포 부착 및 응집에 관여한다. 혈관 내피 및 평활근에 의해 강하게 발현되어, CD146은 현재, 내피세포 계통에 대한 마커로서 이용되고 (Malyszko et al., J Clin Endocrinol Metab, 89(9):4620-4627, 2004), 그리고 개의 CD31과 동등하다.
감마-글루타밀 트랜스펩티다아제 (GGT)는 아미노산, 펩티드, 또는 물일 수 있는 수용자로 글루타티온의 감마-글루타밀 모이어티의 수송을 촉매하는 대사 효소이다. 이 효소는 또한 글루타티온의 합성과 분해 및 세포막을 걸쳐 아미노산의 수송에서 중요한 역할을 한다. GGT는 신장의 근위 세뇨관 세포를 비롯한, 많은 조직의 세포막에 존재한다 (Horiuchi et al., Eur J Biochem, 87(3):429-437, 1978; Pretlow et al., J Histochem Cytochem, 35(4):483-487, 1987; Welbourne et al., Am J Physiol, 277(4 Pt 2):F501-505, 1999). 표 12.1은 유동세포 분석법으로 검출되는 바와 같은 이들 마커를 발현하는 특이적인 유형의 신장 세포의 목록을 제공한다.
<표 12.1>
Figure 112015049441899-pct00006
특이적인 바이오마커의 표현형에 대해 실시예 5의 SRC 세포를 연구하였다.
면역표현형검사(immunophenotyping)를 위하여: 특이적인 항체를 100 마이크로리터의 세포 현탁액에 첨가하였고 이 혼합물을 4℃에서 30-45분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 원심분리하여 과잉 항체를 제거하였다. 세포를 세포/마이크로리터 PBS에서 재현탁시키고 유동세포 분석법으로 분석하였다. FACSAria 유동 세포계수기 (Becton Dickinson) 및 FlowJo 소프트웨어 (Treestar, Inc.)로 유동세포 분석법 분석을 수행하였다. 표면 마커 표현형을 특징짓는 데에 이용되는 항체는 표 12.2와 12.3에서 나타난다. 이소 유형-특이적 일차 항체 음성 대조는 모든 실험에서 이용하였다. 음성 모집단을 게이팅하는 데에 적절한 이소형-매칭된 대조를 이용하였다.
<표 12.2>
Figure 112015049441899-pct00007
<표 12.3>
Figure 112015049441899-pct00008
Figure 112015049441899-pct00009
세포 현탁액을 부착 배양의 초기 조직 해리 또는 트립신화로부터 발생시키고 유동세포 분석법으로 분석하여 세포 성분을 식별하였다. 이용된 항체는 표 12.2 및 12.3 (상기)에 열거된다. 이소형-특이적 일차 항체 음성 대조는 모든 실험에서 이용하였다. 라벨링된 세포를 ACSAria 유동 세포계수기 (Becton Dickinson) 및 FlowJo 소프트웨어 (Treestar, Inc.)로 분석하였다. 적절한 이소형-매칭된 대조는 음성 모집단을 게이팅하는 데에 이용하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션 후, 세포를 펠렛화하고 Triton 완충액 (PBS에서 0.2% Triton X-100)으로 2회 세척하고, 형광색소 Alexa A647 (Invitrogen)과 접합된 이차 항체 염소 항-생쥐 IgG2A를 함유한 1 mL의 DBPS에서 재현탁시키고, 그리고 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 FACSAria 및 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 제조자의 교시에 따라 분석을 위하여 세포를 세척하고 1 mL의 PBS에서 재현탁시켰다. 음성 대조로서, 세포를 동일한 형광색소와 적합된 이소형-매칭된 단클론 항체와 병행하여 인큐베이션하였다.
도5 (표현형 분포)는 모집단에서 각각의 표현형의 백분율 값으로서 플로팅된 SRC 모집단에서 이들 마커의 정량화된 발현을 보여준다.
CK8/18/19는 종에 걸쳐 검출되는 가장 지속적으로 발현된 신장 세포 단백질이다. GGT1 및 아쿠아포린-1 (AQP1)은 지속적으로 발현되지만 그 수준은 변화한다. 또한 DBA, 아쿠아포린2 (AQP2), E-카드헤린 (CAD), CK7, 및 CXCR4는 더욱 가변성이 있지만 보통의 수준으로 관찰되고 그리고 CD31/146 및 쿠빌린은 발현이 가장 낮았다. 표 12.4 는 선별된 마커, SRC에서 표현형의 범위 및 평균 백분율 값 그리고 이들 선별에 대한 근거를 제공한다.
<표 12.4>
Figure 112015049441899-pct00010
SRC 유전자 발현
정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR)에 의한 인간 신장 세포 배양물로부터 단리된 SRC의 유전자 발현 프로파일은 단백질 생성에 대해서도 또한 검사되었던 아쿠아포린2, E-카드헤린, 쿠빌린, VEGF 및 CD31의 것들을 포함한다. 표 12.5에서의 유전자형 마커는 신장 세포 배양물에서 발견될 것으로 예상될 수 있는 세포 모집단을 나타낸다. NCAD, 쿠빌린 및 CYP2R1은 세뇨관 상피 세포의 마커이고 AQP2 및 ECAD는 집합관 및 원위 세뇨관의 마커이다. 포도신 및 네프린은 족세포의 마커이다. VEGF 및 CD31은 내피 마커이다. VEGF 및 EPO는 여러 가지 상이한 조직과 세포 유형에 존재하는 mRNA와 관련된 산소 반응성 유전자이다.
이용된 유전자 프로브는 TaqMan으로부터 수득하였다. 계대 2 인간 신장 세포를 70-90% 합류에서 수확하였다. 동물 세포로부터 전체 RNA의 정제를 위한 프로토콜에 따라 Qiagen의 RNeasy 플러스 미니 키트를 이용하여 세포로부터 RNA를 정제하였다. 제조자의 교시에 따라 Invitrogen의 SuperScript® VILO™ cDNA 합성 키트를 이용하여 1.4 μg과 동일한 RNA의 용량으로부터 cDNA를 발생시켰다. SRC 모집단 (n=3)에 대한 평균 qPCR 데이터는 표 12.5에서 나타난다.
결과는 NCAD, 쿠빌린 및 CYP2R1의 상대적으로 더 높은 수준의 발현으로 입증된 바와 같이 세뇨관 상피 세포의 모집단이 존재한다는 점을 제시한다. 원위 집합관 세뇨관 및 원위 세뇨관 마커 AQP2 및 ECAD는 상대적으로 낮고 심지어 내피마커, CD31은 더 낮다 (표 12.5).
<표 12.5>
Figure 112015049441899-pct00011
초기 유전자형 평가에 기반하여 표현형 및 기능적 마커를 선택하였다. VEGF 유전자 발현 수준은 높고 아쿠아포린2 유전자 발현 수준은 낮았으며, 이는 단백질 분석 데이터와 일치한다 (표 12.4 및 표 12.6).
SRC 효소 활성
PrestoBlue의 대사 및 VEGF 및 KIM-1의 생성으로 생세포의 존재 및 SRC 기능을 입증하였다.
SRC는 조건화 배지의 분석을 통하여 검출될 수 있는 단백질을 활발하게 분비한다. 세포 기능을 세포 활성으로 평가하여 PrestoBlue를 대사시키고 VEGF (혈관 내피 성장 인자) 및 KIM-1 (신장 손상 분자-1)을 분비한다.
PrestoBlue를 대사시키는 그들의 능력으로 생존가능 기능 세포를 NKA에서 모니터링할 수 있다. PrestoBlue 세포 생존력 시약은 세포 투과성, 비-형광 청색 염료인 변형된 레사주린-기반 어세이 시약이다. 급증하는 데에 충분히 생존가능한 세포 안으로의 유입시, 염료는 데하이드로게나아제 효소를 포함한 천연 세포 공정을 통해, 형광성 또는 흡광도로 측정될 수 있는 밝은 적색의 형광단으로 감소된다.
생물분자 VEGF 및 KIM-1은 신장 손상 및 기능의 민감하고 특이적인 분석용 비임상 바이오마커로서 제안된 것들로부터 분자의 선별을 나타낸다 (Sistare, 2010; Warnock, 2010). 생체 내에서, 이들 마커 두 가지 모두, 세뇨관 기능, 손상 및/또는 수복을 나타내고 시험관 내에서는 세뇨관 상피 세포 배양물의 특징이 인지된다. KIM-1은 손상 및 세포 대사회전 동안 떨어져 나간 사멸 세포를 인지하고 식균하는 역할을 하는 신장 근위 세뇨관 세포의 막에서 앵커링된 세포외 단백질이다. 신장 세포에 의해 본질적으로 발현되는, VEGF는 세포 분할, 이동, 내피 세포 생존 및 혈관 맹아를 촉진하는 핵심 혈관신생 인자 및 프로-생존 인자이다. SRC는 VEGF mRNA를 본질적으로 발현하고 (표 12.5) 단백질을 활발하게 생성하는 (표 12.6) 것으로서 특징지어졌다. 이들 단백질은 신장 세포 및 SRC에 노출된 배양 배지에서 검출할 수 있다. 표 12.6은 신장 세포 및 SRC 배양물로부터의 조건화 배지에서 존재하는 VEGF 및 KIM-1의 정량을 나타낸다. 신장 세포를 거의 합류까지 배양하였다. 신장 세포 배양물 및 SRC에 하룻밤 동안 노출한 것으로부터의 조건화 배지를 VEGF 및 KIM-1에 대해 검사하였다.
<표 12.6>
Figure 112015049441899-pct00012
신장 근위 세뇨관에서 발견된, 두 가지 특이적인 효소; GGT (γ-글루타밀 트랜스펩티다아제) 및 LAP (류신 아미노펩티다아제) (Chung, 1982, J Cell Biol 95(1):118-126)의 활성을 측정함으로써 전-제제, SRC의 세포 기능을 또한 평가하였다. 세포에서 이들 효소의 활성을 측정하기 위한 방법은 활성 효소를 발현하는 세포에 첨가될 때, 절단되고 발색성 산물을 방출하는, 용액내 효소-특이적 기질을 활용한다 (Nachlas, 1960 J Biophys Biochem Cytol 7:261-264; Tate, 1974 Proc Natl Acad Sci USA 71(9):3329-3333). 세포-노출 용액의 흡광도를 측정하고 상기 흡광도는 활성 효소로부터 기인한 절단 산물의 양에 관계한다. GGT에 대해 활용된 기질은 L-글루탐산 γ-p-니트로아날라이드 하이드로클로라이드이고 LAP에 대해 활용된 기질은 L-류신 p-니트로아날라이드이다. 도 6은 인간 공여자 (BP1-BP4)로부터 생성된 6개의 SRC 샘플에서 LAP 및 GGT 활성을 보여준다.
SRC 특성화의 요약
Image Library에서 이미지를 이용한 배양 관찰의 비교로 세포 확장 동안 세포 형태학을 모니터링하였다. 세포 성장 동역학을 각각의 세포 계대에서 모니터링하였다. 세포 성장은 환자마다 가변적인 것으로 예상된다. 트립판 블루 염료 배제 및/또는 PrestoBlue의 대사로 SRC 수 및 가변성을 모니터링하였다. CK18, GGT1의 표현형 발현으로 SRC를 특징짓는다. 추가로, AQP2 발현을 모니터링할 수 있다. 생존가능 및 기능적인 SRC의 존재에 대한 마커로서 PrestoBlue의 대사 그리고 VEGF 및 KIM-1의 생성을 이용한다. 추가적으로 SRC 기능을 LAP 및 GGT로의 효소 활성 측정 및 유전자 발현 프로파일링으로 밝힐 수 있다.
실시예 13
생체물질 제조
2개의 주요 파라미터를 통해 NKA (젤라틴 용액)에서 이용된 생체물질을 특징짓는다:
농도 - 분광광도계를 이용하여 280nm에서의 흡광도로 젤라틴 용액의 농도를 측정한다. 흡광도 대 농도의 검정선(calibration curve)으로부터 젤라틴 농도를 결정한다.
반전 검사 - 반전 검사는 2-8℃의 온도에서 겔을 형성하고 유지시키는 젤라틴 용액의 능력 그리고 겔에 대해 실온에서 액화시키는 능력의 가시적인 평가를 제공한다.
다른 생체물질 특징의 설명
NKA에서 이용된 생체물질을 유동학적 특성과 점도에 대해 추가로 특징지을 수 있다. 단지 검증 목적만을 위해 유동학 및 점도 검사를 수행할 것이고 다른 판매자로부터 얻은 생체물질의 확장된 특성을 위해 이용되는 것으로 의도된다.
생체물질의 유동학적 특성을 Couette 세포 방식 유량계의 사용을 통해 처음에는 4℃에서, 그 다음 25℃에서 측정할 수 있다. 샘플을 각각의 온도에서 적어도 30분 동안 평형시킨다. 더 낮은 온도에서의 허용가능한 저장 탄성률 (G'>10)은 2-8℃의 NKA 배송 및 수송 온도에서 겔을 형성하고 유지시키는 용액의 능력을 반영한다. 더 높은 온도에서의 허용가능한 손실 탄성률 (G" <10)은 NKA 전달과 이식에 요구되는 바와 같이 실온에서 액화시키는 겔의 능력을 반영한다.
200-300 s-1의 전단 속도 및 37℃에서 원추형 및 평판 점도계를 이용하여 생체물질의 점도를 측정한다. 1.05-1.35 cP 범위의 점도를 가진 용액을 18-27 가우지 바늘을 통하여 효과적으로 전달할 수 있다.
NKA 제제를 위한 제조에서, 젤라틴을 명시된 농도 (0.88% ± 0.12% w/v)까지 DPBS에서 용해시켜 젤라틴 용액을 만든다 (도 2D). 0.1 μm 여과기를 통해 젤라틴 용액을 여과 멸균시키고 튜브 내로 등분하였다. NKA의 냉동 또는 조제에 앞서 젤라틴 용액의 방출을 위해 샘플을 취하였다. 조제를 위해 준비된 벌크 물질로서, 겔화된 하이드로겔을 냉장 또는 냉동 저장한다 (도 2D).
실시예 14
NKA 제제
트립판 블루 염료 배제를 이용하여 실시예 5에서의 세척된 SRC의 수를 세었다. 저온 저장으로부터 젤라틴 용액을 제거하고 26-30℃까지 예열하여 액화시켰다. 필요한 수의 세포를 함유한 SRC 현탁액의 용적을 원심분리하고 최종 세척 단계를 위해 액화된 젤라틴 용액에서 재-현탁시켰다. 이 현탁액을 원심분리하고 SRC 펠렛을 충분한 젤라틴 용액에 재-현탁시켜 조제된 NKA에서 100x106개 세포/mL의 결과적 SRC 농도를 성취하였다 (도 2D).
NKA는 멸균된, 일회용(single-use) 10 mL 주사기에 존재한다. 100x106개 SRC/mL의 NKA의 농도 및 3.0x106개 SRC/g 신장 무게의 표적 용량 (MRI로 추산됨)으로부터 최종 용적을 계산하였다.
실시예 15
NKA 채움(filling) 및 겔화
조직 가공처리 및 세포 배양 작업을 위해 BSC에서 NKA 패키지의 주사기 내로 NKA 산물을 무균적으로 채웠다 (도 2D). 채우는 과정의 기간 동안, 생존가능 및 비-생존가능 샘플링(sampling)을 비롯한, 동적인 공기 샘플링을 수행하였다.
조제된 NKA를 50mL의 멸균 원심분리 튜브에 담았다. 멸균 캐뉼라(cannula)를 10mL 전달 주사기에 부착시켰다. 캐뉼라를 통하여 50mL 튜브로부터 전달 주사기 내로 NKA를 수동으로 뽑아내었다. 캐뉼라를 제거하였고 그리고 전달 주사기를 NKA 패키지 관의 끝에 맞는 루어-락(luer-lock)에 연결시켰다. 전달 주사기 상에 플런저(plunger)를 누름으로써 NKA 패키지의 주사기에 NKA를 옮겼다. 최소 8.5mL의 산물을 NKA 패키지의 주사기에 옮겼다. 주사기를 거꾸로 두고 플런저를 천천히 누름으로써 주사기에서 갇힌 공기를 제거하였다. 채우는 것이 완료된 후, NKA 패키지에서의 튜빙(tubing)을 RF 밀봉재로 밀봉시켰다. 전달 주사기에서 남아 있는 산물을 50mL 튜브로 되돌려 보냈다. 50mL 튜브로부터 품질 관리 (방출 검사) 샘플을 취하였다. NKA 패키지를 최소 2시간 동안 회전시켜 현탁액에서 세포를 유지시키고 동시에 2-8℃까지 냉각시켜 최종 겔화 NKA를 형성시켰다 (도 2D).
세포가 젤라틴 용액에서 침전하지 않도록 일어나야 할 겔화를 위해 신속한 냉각이 요구되었다. 냉장 상태로 두었기 때문에 주사기내 젤라틴 용액의 온도를 모니터링하였다. 빠른 온도 저하가 관찰되었다. 1시간 후, 온도는 최종 온도 4.4℃에서 0.3℃ 내로 떨어졌다.
젤라틴 용액의 냉각은 겔화 과정을 개시하지만 형성되는 겔에 대해 안정화시키기 위해서는 시간에 유한한 양이 요구되었으며 따라서 SRC는 저장 시 겔에서 현탁된 상태로 남아있을 것이다. 조제된 NKA를 함유한 주사기를 하룻밤 동안 또는 1.25시간 동안 회전시키고 이후 하룻밤 동안 수직으로 유지시켰다. 차후, 함유물을 제거하였고 그리고 산물의 4개의 상이한 절편에서 세포 농도를 측정하였다. 분석은 4개의 절편 가운데 차이가 없었으며, 따라서 NKA가 최소 1.25시간 동안 냉온에서 회전되고 나면 측정가능한 세포 침전이 일어나지 않는다는 점을 명시한다 (데이터는 나타나지 않음).
실시예 16
NKA 포장 및 배송
NKA를 NKA 배송함 내에 적절한 문서와 함께 포장하였다. 배송함은 병원으로의 수송 동안 2-8 ℃ 범위의 온도를 유지시키도록 설계되었다. 냉각된 (겔화된) 조제 산물은 보존 기간이 3일이다.
배송 동안 온도를 모니터링하기 위해 온도 기록기를 NKA 패키지에 함께 포함시켰다. 품질 그룹에 의해 배송/수신 로그 북(log book)에 기록된 고유 환자 ID에 대하여 NKA의 배치 수를 확인하였다. NKA 배송함은 택배회사 또는 유사한 안전 수송기관을 통해 병원으로 배송되었다.
실시예 17
NKA (SRC 세포 모집단)의 이식
이 실시예는 선별된 이질성 인간 신장 세포의 재생 특성을 입증한다.
NKA 전달 시스템
NKA 전달 시스템은 세포 전달에 적합한 캐뉼라 (바늘) 및 주사기로 구성되었다. 상이한 판매자는 세포 전달 산물을 설명하는 데에 용어 캐뉼라 또는 바늘을 사용한다. 이 설명을 위하여 용어 캐뉼라 및 바늘은 호환적으로 사용된다. 제안된 임상 시험은 인간 크기 및 해부에 개작된 동물 연구에서 이용되는 동일한 전달 시스템 (캐뉼라 및 주사기)를 활용하였다. 복강경 수술 절차를 이용하였다.
NKA 전달 시스템의 주요 구성은 캐뉼라였다. NKA에 적합한 캐뉼라를 이용하였다.
NKA 이식
이식을 위한 준비에서, 신장 내로 주사하기 직전에 실온까지 NKA를 예열하여 산물을 액화시켰다.
NKA는 세포 전달에 적합한 바늘 또는 캐뉼라 및 주사기를 통하여 신장 피질 내로 주사하기 위한 목표대상이었다. 신장 캡슐을 관통하기 위한 뾰족한 바늘 (캐뉼라)의 이용은 신장 피질 내로 전달 바늘/캐뉼라의 도입을 허용하였다. NKA를 함유한 주사기를 전달 바늘에 부착하였고 그리고 NKA를 신장 피질의 다수의 부위에 주사하였다. 도 7에서의 도해는 세포 전달 및 고형 기관 내로의 배분에 적합한 바늘을 이용하여 신장 내로 NKA를 주사하는 개념을 설명한다.
NKA는 신장 피질 내로 직접적으로 전달되었다. 환자에서의 NKA 전달은 표준화된 복강경 수술을 이용하였다.
본 명세서에서 설명된 실시예 및 구체예는 오로지 설명 목적을 위한 것이고 그리고 이의 교시에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 해당 분야의 통상의 기술자에게 제시될 것이며 본 출원의 정신과 범위 그리고 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 한다는 점이 이해된다. 본 명세서에 열거된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.

Claims (19)

  1. 포유류 신장 샘플로부터 세포를 단리시키는 단계,
    상기 단리된 세포의 샘플을 라벨링된 검출 모이어티에 노출시키는 단계, 여기서 각각의 라벨링된 검출 모이어티는 상이한 바이오마커를 표적으로 하고 상이한 라벨로 라벨링되며, 검출된 바이오마커가 GGT-1, 사이토케라틴, VEGF 및 KIM-1을 포함함, 및
    (i) 이질성 신장 세포 모집단 내의 단리된 세포의 4.5% 초과가 GGT-1을 발현하는지, (ii) 이질성 신장 세포 모집단 내의 단리된 세포의 80% 초과가 사이토케라틴을 발현하는지, 및 (iii) 이질성 신장 세포 모집단 내의 단리된 세포가 VEGF 및 KIM-1을 발현하는 세포를 포함하는지를 결정하는 단계
    를 포함하는, (a) 이식 및/또는 (b) 고유 신장에서의 재생 반응 유발에 적합한 이질성 신장 세포 모집단을 식별하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, AQP1, AQP2, AQP4, 칼비딘, 칼포닌, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK40 내지 67, CK7, CK8, CK18, CK19, 코넥신 43, 쿠빌린, CXCR4 (푸신), DBA, E-카드헤린 (CD324), EPO (에리트로포이에틴), GLEPP1 (사구체 상피 단백질 1), 합토글로불린, Itgb1 (인테그린 β1), MAP-2 (미세소관-연관 단백질 2), 메갈린, N-카드헤린, 네프린, NKCC (Na-K-Cl- 공수송체), OAT-1 (유기성 음이온 수송체 1), 오스테오폰틴, 판-카드헤린, PCLP1 (포도칼신-유사 1 분자), 포도신, SMA (평활근 알파-액틴), 시냅토포딘, THP (탐-호스펄 단백질), 비멘틴, 및 αGST-1 (알파 글루타티온 S-전이효소)로부터 선택된 하나 이상의 추가의 바이오마커를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 라벨링된 검출 모이어티가 항체인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이질성 신장 세포 모집단 내의 단리된 세포의 10% 초과가 GGT-1을 발현하는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 모집단 내의 단리된 세포의 18% 초과가 GGT-1을 발현하는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 세포 모집단 내의 단리된 세포의 18% 초과가 GGT-1을 발현하는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 사이토케라틴이 CK18인 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 검출된 바이오마커가 AQP2를 추가로 포함하며, 이질성 신장 세포 모집단 내의 단리된 세포의 3.0% 내지 53.7%가 AQP2를 발현하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류 신장 샘플이 신장 조직 생검 또는 전체 신장 조직인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 포유류 신장 샘플로부터 농축된 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 세포가 형광 활성화된 세포 분류 또는 자기 세포 분류에 의해 농축된 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 신장 조직 생검 또는 전체 신장 조직으로부터 확립된, 포유류 세포의 시험관내 배양으로부터 유래되는 방법.
  13. 제4항의 방법에 따라 이식 및 재생 반응 유발에 적합한 이질성 신장 세포 모집단을 식별하고, 식별된 이질성 신장 세포 모집단을 생체물질과 조합하는 것을 포함하는, 포유류에서 신장 질환을 치료하기 위한 조성물을 조제하는 방법.
  14. 제5항의 방법에 따라 이식 및 재생 반응 유발에 적합한 이질성 신장 세포 모집단을 식별하고, 식별된 이질성 신장 세포 모집단을 생체물질과 조합하는 것을 포함하는, 포유류에서 신장 질환을 치료하기 위한 조성물을 조제하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 세포 모집단은 매트릭스 상에서 배양되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 세포 모집단은 젤라틴-기반 생체물질에서 현탁되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 포유류는 인간인 방법.
  18. 제8항의 방법에 따라 이식 및 재생 반응 유발에 적합한 이질성 신장 세포 모집단을 식별하고, 식별된 이질성 신장 세포 모집단을 생체물질과 조합하는 것을 포함하는, 포유류에서 신장 질환을 치료하기 위한 조성물을 조제하는 방법.
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