KR102159577B1 - 블루베리 잎 추출물을 포함하는 주름 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 블루베리(Vaccinium ashei) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에서 유효성분으로 함유되는 블루베리 잎 추출물은 엘라스틴 및 콜라겐 합성의 촉진, 주름 관련 단백질인 MMP-1, MMP-3, MMP-9, 및 프로콜라겐 단백질의 발현을 억제 또는 촉진시키는 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 주름 개선 효능을 나타내며, 세포독성이 없고 피부 안전성이 우수하여 화장료, 의약품 및 식품 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

블루베리 잎 추출물을 포함하는 주름 개선용 조성물{A composition for improving skin wrinkle comprising Vaccinium ashei leaves extract}

본 발명은 블루베리(Vaccinium ashei) 잎 추출물을 포함하는 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 콜라겐 합성 증진, 콜라겐 분해효소 억제, 주름 관련 단백질의 발현 억제 효능이 있는 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물, 약학적 조성물, 및 식품 조성물에 관한 것이다.

인체에서 노화란 시간의 경과에 따라 필연적으로 발생하며 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되는 현상이다. 이는 비록 완전히 멈출 수는 없으나 현대의 다양한 기술과 그 응용을 통해 그 진행 과정을 늦출 수 있으며 그로 인해 현대 사회의 구성원들의 삶의 질을 향상시킬 수 있다.

피부 노화는 외인성 노화(extrinsic aging)와 내인성 노화(intrinsic aging)로 구분할 수 있다. 내인성 노화는 인체 내부의 작용으로 인해 진행되는 노화로서 그 요인으로는 유전자의 특정 부위인 텔로미어(telomere)의 손실(Imbert, I., Botto, J. M., Farra, C. D., & Domloge, N. (2012). Modulation of telomere binding proteins: a future area of research for skin protection and anti-aging target. Journal of cosmetic dermatology, 11(2), 162-166.), 중력, 체내 내분비기능 저하, 만성 소모성 질병 등이 있다. 외인성 노화는 주변 환경에 의해서 진행되는 노화로서 그 요인으로는 기후, 먼지, 화학물질, 자외선 등이 있다(김효철, & 오경동. (2011). 피부 노화에 영향을 미치는 원인과 예방, 치료의 연구 진전. 대한피부미용학회지, 9(1), 1-9.). 이러한 요인들에 따라 피부는 색소침착, 주름, 염증 등의 현상이 나타나고 노화가 진행된다.

한편 현대의 사람들은 육체적 아름다움과 건강에 대한 관심이 늘고 있으며 최근 들어 피부에 더욱 친화적인 천연물을 이용하여 피부 노화를 방지하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그 내용으로는 주로 인체의 대사과정에서 발생하는 자유라디칼(free radical)에 의한 세포의 산화적 스트레스(oxidative stress) 소거 효과(현송화, 김가윤, 유지연, 김지원, 양예림, 전영희, 박수남. (2016). 사람피부세포에서 카렌둘라 꽃 추출물의 항산화 및 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과. Applied Chemistry for Engineering, 27(6), 620-626.), 티로신(tyrosine)이 DOPA와 DOPA quinone, indole-5,6-quinone을 거쳐 멜라닌을 합성하게 되는 과정에서의 저해 효과(Choi, S. W., & Kim, H. J. (1998). Inhibitioin of tyrosinase activity by polyphenols of chestnut leaf. HSJAS, 6, 321-327.), 섬유아세포로부터 생성되는 피부 진피층의 주요 구성 단백질인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin) 등의 분해에 관여하는 물질인 콜라게나제(collagenase)와 엘라스타제(elastase)의 저해 효과 등이 있다(최원식, 장도연, 남석우, 어진용, & 이경주. (2008). 세포내 멜라닌 생성 및 Collagenase 와 Elastase 에 대한 Coenzyme Q10 유도체들의 억제활성. 한국응용생명화학회지 (구 한국농화학회지), 51(3), 164-170.).

블루베리는 진달래과(Ericaceae)의 산앵두나무속(Vaccinium)에 속하는 관목식물로서, 로우부시 블루베리(Vaccinium myritillus) 하이부시 블루베리(Vaccinium corymbosum), 및 래빗아이 블루베리(Vaccinium ashei) 세 품종이 주종을 이루고 있으며 상업적으로 중요한 과실로서 재배되고 있다(Westwood, M. N. (1993). Hormones and growth regulators. Temparate Zone Pomology: Physiology and Culture. Timber Press, Inc, 9999.). 최근 우리나라에서도 급격하게 블루베리에 대한 관심과 활용이 높아진 상태이며(Song, G. C. (2012). The cultural status and the industrial prospects on blueberry. In Proceedings of the Plant Resources Society of Korea Conference. The Plant Resources Society of Korea.), 그에 따른 블루베리의 효능 연구도 상당히 진행되어져 있다(Woo, N. R. Y., Chung, H. K., Kim, J. H., & Lee, T. R. (2010). Development of rice noodles with lotus leaf. In Proceedings of the KAIS Fall Conference. The Korea Academia-Industrial cooperation Society.). 반면 블루베리 잎은 블루베리 재배의 산업적 부산물로 취급되어 관련 연구 또한 상대적으로 미비한 실정으로 한국등록특허 제1361785호 및 한국공개특허 제2011-0051547호에서 블루베리 잎 추출물이 퇴행성 뇌신경질환이나 통풍의 예방에 유용하다고 개시하고 있을 뿐이다.

이에 본 발명자들은 블루베리 잎과 같은 산업적 부산물을 활용하기 위한 다양한 방안을 연구하던 중, 블루베리 잎이 식품 및 화장품소재로서 매우 유용함을 밝혀내고 그에 따라 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 블루베리(Vaccinium ashei) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 블루베리(Vaccinium ashei) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 블루베리(Vaccinium ashei) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 블루베리(Vaccinium ashei) 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 블루베리(Vaccinium ashei)는 진달래과(Ericaceae) 산앵두나무속(Vaccinium)의 과수로 비타민 K와 C가 다량으로 함유되어 있으며 망간도 많이 들어있다. 그 외 영양소인 비타민 E, 티아민, 리보플라빈, 비타민 B6, 구리가 골고루 균형을 이루고 있으며, 블루베리의 선명한 색을 나타내는 안토시아닌도 활성 산소를 중성화시키는 효과가 있다고 알려져 있다. 또한, 블루베리는 산화방지제와 눈의 망막까지 보호하는 효능이 있기 때문에 영양분이 풍부한 식품으로 알려져 있다.

본 발명에 있어서, "피부주름 개선"은 호르몬 분비 감소 또는 생리적 기능 저하 등으로 인한 내인성 피부노화나 자외선 또는 공해 등으로 인한 외인성 피부노화에 의해 인간을 포함한 동물의 피부에 형성되는 주름을 완화, 제거 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명의 블루베리 잎 추출물은 블루베리 재배 산업에서 부산물로 취급되는 블루베리 잎으로부터 추출되거나 이로부터 분리된 피부주름 개선의 활성을 가지는 물질을 말한다.

또한, 상기 블루베리 잎 추출물은 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 건조물 또는 이용하여 제형화된 모든 형태를 말한다.

상기 블루베리 잎 추출물의 추출 방법으로는 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 방법 또는 초임계 추출방법 등을 이용한다.

또한, 상기 블루베리 잎 추출물은 당 분야에 공지된 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용되거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용될 수 있다. 이때, 상기 용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO) 또는 이들의 혼합용매중 어느 하나의 용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 아세톤을 사용한다. 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 아세톤을 사용한다. 그러나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니며, 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 하는 것이 바람직하다.

하나의 구체적인 예로, 블루베리 잎 추출물은 블루베리 잎을 분쇄한 후 용매로 침지 추출한 다음, 추출물을 회수한 후 여과하여 수득될 수 있다. 상기 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.

하나의 구체적인 예로, 블루베리 잎 추출물은 상기 여과액을 건조하여 수득될 수 있다. 여과액을 건조하는 방법으로 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조 또는 적외선건조 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체적 양태로, 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 조성물은 화장료 조성물이다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인 블루베리 잎 추출물을 전체 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%로 포함할 수 있다. 상기 포함량이 0.00001 중량% 미만인 경우 피부주름 개선의 효과를 기대할 수 없고, 15.0 중량%를 초과하는 경우 주름개선 효과의 차이가 미미하고 또는 제형상의 제조에 어려움이 있다.

상기 화장료 조성물은 블루베리 잎 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다. 그러나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있다. 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 세포독성도 낮으면서도, 섬유아세포 보호 작용 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부주름 개선 효과를 나타낸다.

하나의 구체적 양태로, 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 조성물은 약학적 조성물이다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분인 블루베리 잎 추출물을 전체 약학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%로 포함할 수 있다. 상기 포함량이 0.00001 중량% 미만인 경우 피부주름 개선의 효과를 기대할 수 없고, 15.0 중량%를 초과하는 경우 주름개선 효과의 차이가 미미하고 또는 제형상의 제조에 어려움이 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 약학적 조성물의 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 주사제 또는 외용제 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 피부주름 개선 효과가 있으며, 투여방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여하는 것을 포함한다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있으며, 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 300㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 세포독성도 낮으면서도, 섬유아세포 보호 작용 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부주름을 개선 효과를 나타낸다.

본 발명의 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 개체 내 투여, 피하 투여 또는 도포에 의한 국부 투여 등에 의하여 개체의 피부주름 개선의 목적을 달성할 수 있는 이점이 있다.

다른 하나의 구체적 양태로, 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 조성물은 식품 조성물이다.

블루베리 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 실시양태에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 블루베리 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 블루베리 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 세포독성도 낮으면서도, 섬유아세포 보호 작용 및 콜라겐 합성의 촉진 등의 분자적 기전을 통하여 우수한 피부주름을 개선 효과를 나타낸다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 개체의 주름을 치료, 개선 및 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 블루베리 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 개체 내 투여, 피하 투여 또는 도포에 의한 국부 투여 등에 의하여 개체의 주름을 개선 및 예방하는 등의 목적을 달성할 수 있는 이점이 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 개선될 수 있는 상태 또는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "치료" 및 "개선"은 개체에서 염증 세포의 파괴 또는 염증 (a) 발전의 억제, (b) 경감, (c) 제거를 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여로 염증을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

한편, 본 발명의 블루베리 잎 추출물은 식물로부터 유래한 천연 추출물로서 독성 및 부작용이 없는 인체에 무해한 안전한 물질로, 피부주름 개선을 위한 유효성분으로 화장료, 의약품 및 식품 조성물에 안전하게 적용될 수 있다.

본 발명의 피부주름 개선용 조성물은 블루베리 잎 추출물이 유효성분으로 포함된 것으로, 피부세포 내 엘라스틴 및 콜라겐의 분해를 억제하고 합성을 촉진하며, MMP-1 억제, MMP-3 억제, MMP-9 억제, 프로콜라겐(procollagen) 합성 촉진 등의 세부적 기전을 통하여 우수한 피부주름 개선 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 추출물은 천연소재로부터 유래한 것으로 인체에 대한 피부자극 실험 결과 독성 및 부작용이 없는 인체에 무해한 안전한 물질로 화장료, 의약품, 및 식품 조성물에 안전하게 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 블루베리 잎 추출물의 제조 공정을 도시한 그림이다.
도 2는 본 발명의 블루베리 잎 추출물에 의한 엘라스타제 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명의 블루베리 잎 추출물에 의한 콜라게나제 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 블루베리 잎 추출물에 의한 인간 유래 섬유아세포 CCD986sk의 세포 생존율을 나타낸 그림이다.
도 5는 UV-B로 자극된 CCD986sk 세포에서 본 발명의 블루베리 잎의 열수 추출물에 의한 MMP-1 단백질의 발현 억제 효과를 분석한 그림이다.
도 6은 UV-B로 자극된 CCD986sk 세포에서 본 발명의 블루베리 잎의 70% 에탄올 추출물에 의한 MMP-3 단백질의 발현 억제 효과를 분석한 그림이다.
도 7은 UV-B로 자극된 CCD986sk 세포에서 본 발명의 블루베리 잎의 70% 아세톤 추출물에 의한 MMP-9 단백질의 발현 억제 효과를 분석한 그림이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성(*p<0.05,**p<0.01) 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 터키 테스트(Turkey test)로 다중비교를 실시하였다.

실시예 1: 블루베리 잎 추출물의 제조

본 실험에 사용된 블루베리(Vaccinium ashei) 잎은 울산시 블루베리농장에서 공급 받아 사용하였으며, 블루베리 잎의 추출 공정은 도 1과 같이 진행하였다. 블루베리 잎의 열수 추출물은 건조된 시료 중량의 20배의 초순수를 용매로 사용하여 90℃에서 4시간 동안 3회 반복하여 추출하였다. 블루베리 잎의 에탄올 추출물 및 블루베리 잎의 아세톤 추출물은 70% 에탄올 및 70% 아세톤 각각을 건조된 시료 중량의 20배로 가하여 상온에서 24시간 동안 침지시켜 추출하였으며 3번 반복하였다. 열수 추출물의 수율은 38.31%, 70% 에탄올 추출물의 수율은 21.78%, 70% 아세톤 추출물의 수율은 21.68% 이었다. 상기 추출물들은 여과지(No. 20 filter paper, Hyundai micro Co., Ltd., Korea)로 여과, 농축 후 동결 건조하여 분말화하고 4℃ 냉장실에 보관하면서 이하 실험의 시료로 사용하였다.

실시예 2: 시약 준비

2-1: 엘라스타제 및 콜라게나제 저해 효과 실험 시약

주름개선 효과 측정 실험에 사용된 시약은 다음과 같다. N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide, 돼지 췌장 유래 엘라스타제(Elastase from porcine pancreas), 클로스트리디움 히스트디티쿰 유래 콜라게나제(Collagenase from clostridium histdyticum) 등은 시그마(Sigma aldrich Co., Ltd.; St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol, 염화수소(Hydrogen chloride), CaCl₂, 시트르산(Citric acid), 아세트산에틸(Ethyl acetate) 등은 덕산약품(Duksan pure chemicals Co., Ltd.; Korea)의 제품을 사용하였다. Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH Trifluoroacetate는 바켐(BACHEM Co., Ltd.)의 제품을 사용하였다.

2-2: 세포 실험을 위한 세포주 및 시약

세포주 쥐 유래 대식세포(Murine macrophage cell; RAW 264.7), 인간 섬유아세포(Human fibroblast cell; CCD986sk)는 ATCC(American type culture collection; Manassas, VA, USA)의 제품을 사용하였다. DMEM(Dulbecco's modified eagle medium), 페니실린(Penicillin), FBS(Fetal bovine serum) 등은 GE헬스케어(GE Healthcare life sciences hyclone laboratories; Logan, Utah, USA)의 제품을 사용하였다. MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide), LPS(Lipopolysaccharides), 포스파타제 억제 칵테일 3(Phosphatase inhibitor cocktail 3), 리파버퍼(Ripa buffer), 그리스시약(Griess reagent(modified)), 프로테아제 억제 칵테일(Protease inhibitor cocktail for use with mammalian cell and tissue extract) 등은 시그마(Sigma aldrich Co., Ltd.; St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. Prostaglandin E₂ ELISA Kit는 R&D Systems(USA)의 제품을 사용하였다. 항체(Antibodies(goat anti-rabbit IgG-HRP, donkey anti-mouse IgG-HRP, Bovine anti-goat IgG-HRP, COX-2, iNOS, NF-κB, MMP-1, MMP-3, MMP-9, Procollagen))등은 산타크루즈(Santa cruz Co., Ltd.; USA)의 제품을 사용하였다. 아크릴-비스아크릴아미드 30% 저장 용액(Acryl-bisacrylamide(29:1) 30% stock solution)은 엠바이오텍(m.biotech Co., Ltd.; Korea)의 제품을 사용하였다. Tris-base(2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol), 글라이신(Glycine), 20X PBS buffer, SDS(sodium dodecyl sulfate), TEMED는 바이오세상(Biosesang Co., Ltd.; Korea)의 제품을 사용하였다. Protein assay dye reagent concentrate는 Bio-rad laboratories Co., Ltd.(USA)의 제품을 사용하였다. pH 7 albumin-bovine은 USB Co., Ltd.(Cleveland, OH, USA)의 제품을 사용하였다. PageRular™ prestained protein ladder, Western blot stripping buffer, Power SYBR green PCR master mix, NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents kit은 Thermo scientific Co., Ltd.(Lithuania)의 제품을 사용하였다. Tween 20은 Daejung chemicals & metals Co., Ltd.(Korea)의 제품을 사용하였다. Nuclease-free water는 Integrated DNA technologies Co., Ltd.(USA)의 제품을 사용하였다. Total RNA isolation regent-solution은 Bio science technology의 제품을 사용하였다. PCR primer는 Bionics Co., Ltd.(Korea)의 제품을 사용하였다. Transfer membrane은 Millipore Co., Ltd.(billerica, MA, USA)의 제품을 사용하였다. 3mm CHR은 GE healthcare life sciences Co., Ltd.(China)의 제품을 사용하였다.

2-3. 실험에 사용된 기기

본 실험에 사용된 기기는 자외선/가시광선 분광광도계(Hitachi, Tokyo, Japan), 편광현미경(polarization microscope, Olympus BX 51, Tokyo, Japan), 웨스턴 이미징 시스템(western imaging system, CAS-400SM, Davinch-K, Seoul, Korea), 회전감압농축기(rotary vacuum evaporator, EYELA, Tokyo, Japan), 원심분리기(centrifuge, Hitachi, Tokyo, Japan), 동결 건조기(freeze drier, Ilshin, Gimpo, Korea), 현미경(microscope, Olympus, Tokyo, Japan), CO2 배양기(CO2 incubator, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea), pH 미터(pH meter, Metrohm, Herisau Switzerland), 저온배양기(BOD Incubator, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea), 오토클레이브(autoclave, Hanbaek Scientific Co., Bucheon, Korea), 엘리사 리더(ELISA reader, Molecular Devices, California, USA)를 사용하였다.

실시예 3: 블루베리 잎 추출물의 엘라스타제 저해 효과 측정

엘라스타제 저해 효과 측정은 Cannell(Cannell, R. J., Kellam, S. J., Owsianka, A. M., & Walker, J. M. (1988). Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta medica, 54(01), 10-14.) 등의 방법에 준하여 측정하였다. 각각의 시료는 5, 10, 50, 100, 500, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비하였고 양성 대조군으로는 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 사용하였다. 버퍼용액은 Tris(2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol)에 염화수소(hydrogen chloride)를 pH 8.6이 되도록 첨가한 뒤 사용하였다. 기질로서 사용된 N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide는 50 mM 버퍼 용액을 용매로 하여 3 mM 농도로 희석하여 사용하였다. 효소로서 사용된 돼지 췌장 유래 엘라스타제(Elastase from porcine pancreas)는 50 mM 버퍼 용액을 용매로 하여 1 unit/ml 농도로 희석하여 사용하였다. 96 well plate에 버퍼, 효소, 시료 용액을 각각 40 μL 씩을 넣고 37℃에서 5 min 동안 반응시킨후 기질 용액을 80 μL 첨가한후 37℃에서 15 min 동안 더 반응시키고 445 nm 에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 1을 이용하여 결과를 계산하였다.

[수학식 1]

엘라스타제 저해 효과(%) = (1-시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)×00

엘라스틴(Elastin)은 진피 내 피부 탄력을 유지하는데 중요한 단백질이며 피부의 결합조직에 존재하여 조직의 신축성, 유연성에 크게 관여하고 있다. 엘라스타제(elastase)는 이러한 엘라스틴을 분해하는 효소이며 피부가 처지고 주름이 생기는 등의 피부노화를 발생시키는 원인 중 하나이다(안봉전, 이진태, & 이창언. (2009). 화장품 생물신소재. 파주, 광문각. p, 82.). 따라서 엘라스타제 저해제는 피부 주름개선을 통한 노화를 방지하는 작용을 하게 되는데 블루베리 잎 추출물의 엘라스타제 저해 활성 효과를 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 블루베리 잎은 모든 추출물에서 농도의존적으로 엘라스타제 저해 효과가 나타났다. 1000 μg/mL 농도에서 70% 아세톤 추출물의 효과가 75.90%로 열수 추출물(73.61%)과 70% 에탄올 추출물(55.53%)보다 높게 나타나 70% 아세톤 추출물이 세 추출물중 가장 효과가 뛰어난 것으로 나타났다. 이는 특히 양성 대조군으로 사용된 Epigallocatechin gallate(44.87%)보다도 월등히 높은 수치로서 블루베리 잎 추출물은 천연물로서 주름개선 작용에 매우 탁월한 도음울 줄 수 있을 것으로 판단되었다.

실시예 4: 블루베리 잎 추출물의 콜라게나제 저해 효과 측정

Collagenase 저해 효과 측정은 Wunsch(Wㆌnsch, E., & Heidrich, H. G. (1963). Zur quantitativen bestimmung der kollagenase. Hoppe-Seylerㅄ s Zeitschrift fㆌr physiologische Chemie, 333(1), 149-151.) 등의 방법에 준하여 측정하였다. 각각의 시료는 10, 100, 1000 μg/mL 농도로 희석하여 준비하였고 양성 대조군으로는 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 사용하였다. 버퍼용액은 0.1 M Tris, 4 mM CaCl₂ 용액에 염화수소를 pH 7.5가 되도록 첨가한 뒤 사용하였다. 기질용액은 Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg-OH Trifluoroacetate에 버퍼 용액을 용매로 하여 0.3mg/ml 농도로 희석하여 사용하였다. 효소 용액은 버퍼 용액을 용매로 하여 클로스트리디움 히스트디티쿰 유래 콜라게나제(Collagenase from clostridium histdyticum)를 0.5mg/ml 농도로 희석하여 사용하였다. 시험관에 버퍼 500 μL, 기질 250 μL, 효소 150 μL, 시료 100μL를 넣고 37℃에서 30 min 동안 반응시키고 6% citric acid를 500 μL 넣은 뒤 Ethyl acetate를 3 ml 넣어 격렬히 진탕시키고 상등액의 흡광도를 320 nm 에서 측정하고 하기 수학식 2를 이용하여 결과를 계산하였다.

[수학식 2]

콜라게나제 저해 효과(%) = (1-시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)×00

콜라겐(Collagen)은 피부 진피층의 주요 구성 단백질의 하나로 섬유아세포로부터 생성되며 피부구조와 탄력 유지에 중요한 역할을 한다. 피부는 자연적인 노화를 포함한 다양한 요인에 의해서 콜라겐의 생성 감소, 분해 증가 현상이 일어나게 되는데 콜라게나제(collagenase)에 의한 콜라겐(collagen) 분해 현상은 피부처짐, 주름 등이 발생하게 되는 내인적인 원인이다. 따라서 콜라게나제를 저해하는 물질은 주름형성 방지 등 노화에 대한 보호 효과가 크며 피부의 탄력을 개선시킬 수 있다.

블루베리 잎 추출물의 콜라게나제(collagenase) 저해 활성 효과를 측정한 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 블루베리 잎 추출물은 농도의존적으로 콜라게나제 저해 효과가 나타났다. 1000 μg/mL 농도에서 70% 아세톤 추출물의 효과가 94.62%로 열수 추출물(93.88%)과 70% 에탄올 추출물(92.78%)보다 높게 나타나 70% 아세톤 추출물이 세 추출물 중 가장 효과가 뛰어난 것으로 나타났다. 이는 특히 양성 대조군으로 사용된 Epigallocatechin gallate(86.48%)보다도 높은 수치로서 블루베리 잎 추출물은 천연물로서 주름개선 작용에 매우 탁월한 도음울 줄 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 5: 블루베리 잎 추출물의 MTT 분석에 의한 세포 생존율 측정

본 실험에 이용한 CCD-986sk cell은 10% FBS와 1% peniillin/streptomycin(100 unit/mL)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에 적응시켜 계대 배양하였다.

세포주 CCD-986sk을 96 well plate에 1 x 10⁴ cells/well이 되도록 분주(seeding) 하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24 h 동안 배양시켰다. 그 뒤에 배양액을 혈청 무첨가 DMEM 배지로 교환하고 각 시료용액을 농도별로 처리한 뒤 37 ℃, 5% CO₂ incubator에서 24 h 동안 배양시켰다. 그 뒤에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액을 0.02 mL/well로 첨가하여 4 h 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 0.1 mL/well으로 첨가하여 실온에서 10 min 동안 반응 시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 3을 이용해 결과를 계산하였다.

[수학식 3]

세포 생존률(%) = (시료첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)×100

이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. CCD986sk cell에 UV-B를 40초간 처리하고 동시에 열수, 70% 에탄올, 70% 아세톤 추출물을 각각 10, 25, 50, 100, 200, 400, 800 μg/mL 농도로 48 h 동안 처리한 결과 모든 추출물이 50 μg/mL 농도까지 사용 가능한 것으로 나타났다. 이후의 항주름 세포 실험에서 세포에 안전하게 사용 가능한 블루베리 잎 추출물의 최고 농도를 열수 추출물 50 μg/mL로 설정하였다.

실시예 6: 블루베리 잎 추출물의 MMP-1, MMP-3, MMP-9, 및 Procollagen 발현 억제 효과 측정

MMP-1, MMP-3, MMP-9, 프로콜라겐(Procollagen) 단백질의 발현을 확인하기 위하여 CCD-986sk 세포를 1ㅧ10⁵cells/well로 6 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후에 UVB (20 mJ/cm²)를 조사한 뒤 블루베리 잎 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 세포를 RIPA buffer로 용해하고 원심분리한 후 얻은 상층액을 Brad-ford assay로 정량하였다. 준비된 단백질 시료는 10% SDS-PAGE를 이용해 전기영동하고 PVDF membrane으로 transfer 시킨 뒤, 5% skim milk가 함유된 tris 완충용액으로 1시간 blocking 한 후, pro-collagen, MMP-1, MMP-3, MMP-9, β-actin 각각의 1차 및 2차 항체와 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 5분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용하여 현상하였다. 이에 대한 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다. 도 5 내지 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 블루베리 잎 추출물은 MMP-1, MMP-3, MMP-9, Procollagen 단백질의 발현을 유의성 있게 감소시켰다는 것을 확인하였다.

Claims (3)

1. 블루베리(Vaccinium ashei) 잎의 아세톤 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 피부주름 개선은 피부에 형성되는 주름의 완화, 제거 또는 예방인 것을 특징으로 하는 피부주름 개선용 화장료 조성물.
3. 삭제

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