KR102155868B1 - Method of Using Microfluidic Chip for 3-Dimensional Cell Spheroid Formation - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포의 공배양 방법 및 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상기 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 사용하는 경우, 세포를 3차원으로 배양하면서 별도의 이동 없이 이를 동시에 활용할 수 있으므로, 3차원 배양 세포를 이용하는 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a three-dimensional cell co-culture method and a drug screening method using a three-dimensional cell culture microfluidic chip, in the case of using the three-dimensional cell culture microfluidic chip, while culturing the cells in three dimensions Since it can be used at the same time without moving, it can be usefully used in various fields using 3D cultured cells.

Description

3차원 세포 형성용 미세유체칩 이용 방법{Method of Using Microfluidic Chip for 3-Dimensional Cell Spheroid Formation}Method of Using Microfluidic Chip for 3-Dimensional Cell Spheroid Formation}

본 발명은 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포의 형성, 공배양 방법 및 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a three-dimensional cell formation, co-culture method, and drug screening method using a microfluidic chip for three-dimensional cell culture.

세포치료법이나 약물전달을 비롯한 임상응용을 위해서는 대량의 세포가 필요한데, 일반적인 배양방법으로 세포를 배양할 경우 많은 양의 배양접시나 플라스크를 사용하여야 한다. 그러나, 배양접시나 플라스크에서의 배양은 2 차원인 경도의 환경에서 세포를 배양하여, 실제 생체 내에서 세포가 증식하는 3차원의 연성의 환경과 차이가 있어 배양된 세포의 변성을 유도할 위험성이 있다.A large amount of cells are required for clinical applications, including cell therapy or drug delivery. When cells are cultured by a general culture method, a large amount of culture dishes or flasks must be used. However, culture in a culture dish or flask is different from the three-dimensional soft environment in which cells proliferate in an actual living body by culturing cells in a two-dimensional, hardness environment, so there is a risk of inducing degeneration of the cultured cells. have.

이러한 위험성을 줄이기 위하여, 알지네이트 역 오팔(alginate inverse opal) 스캐폴드 및 어레이-웰(array-well) 등 여러 가지의 3차원 세포 배양방법이 개발되었다. 그러나, 이러한 배양방법은 3차원 세포(구조체) 형성 후, 배양을 위하여 이동하거나 배양액 교체 시 상기 세포(구조체)의 유지가 어려운 한계가 있다.In order to reduce this risk, various 3D cell culture methods such as alginate inverse opal scaffold and array-well have been developed. However, such a culture method has a limitation in that it is difficult to maintain the cells (structures) when the cells (structures) are formed and then moved for culture or when the culture medium is replaced.

이에 따라, 세포를 3차원으로 배양하면서, 동시에 별도의 세포 이동 없이 3차원 세포가 필요한 다양한 연구에 활용하거나 배양액 교체 시에도 세포의 3차원 형태가 유지될 수 있는 방법에 관한 기술의 개발이 시급하다.Accordingly, there is an urgent need to develop a technology for a method for culturing cells in three dimensions while simultaneously utilizing them for various studies requiring three-dimensional cells without separate cell movement or maintaining the three-dimensional shape of cells even when the culture medium is replaced. .

국내공개특허 10-2014-0129841호Korean Patent Publication No. 10-2014-0129841

본 발명자들은 세포를 3차원으로 형성 및 배양하면서 이를 동시에 활용할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 세포를 특정 유동 조건으로 배양하는 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 사용하는 경우, 세포를 3차원으로 배양하면서 별도의 이동 없이 이를 동시에 활용할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have worked hard to develop a method that can simultaneously utilize them while forming and culturing cells in three dimensions. As a result, when using a three-dimensional cell culture microfluidic chip for culturing cells under a specific flow condition, the present invention was completed by finding out that it can be simultaneously utilized without separate movement while culturing cells in three dimensions. .

따라서, 본 발명의 목적은 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포의 공배양(spheroid formation) 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for co-culture (spheroid formation) of three-dimensional cells using a microfluidic chip for three-dimensional cell culture.

본 발명의 다른 목적은 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a drug screening method using a microfluidic chip for 3D cell culture.

본 발명자들은 세포를 3차원으로 형성 및 배양하면서 이를 동시에 활용할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 세포를 특정 유동 조건으로 배양하는 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 사용하는 경우, 세포를 3차원으로 배양하면서 별도의 이동 없이 이를 동시에 활용할 수 있음을 규명하였다.The present inventors have worked hard to develop a method that can simultaneously utilize them while forming and culturing cells in three dimensions. As a result, it was found that in the case of using a microfluidic chip for three-dimensional cell culture in which cells are cultivated under a specific flow condition, the cells can be cultured in three dimensions and simultaneously utilized without separate movement.

본 발명은 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포의 공배양 방법 및 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for co-culture of three-dimensional cells and a method for screening drugs using a microfluidic chip for three-dimensional cell culture.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 양태는 세포 배양 지지체에 2종 이상의 세포를 순차적으로 접종(seeding)하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포 공배양(spheroid formation) 방법이다.One aspect of the present invention is a three-dimensional cell co-culture (spheroid formation) method using a microfluidic chip for three-dimensional cell culture comprising the step of sequentially seeding (seeding) two or more kinds of cells on a cell culture support.

상기 미세유체칩은 세포 배양액이 일정한 유량 및 유속으로 주입되는 것이다.The microfluidic chip is a cell culture medium is injected at a constant flow rate and flow rate.

본 명세서에서 "3차원 세포 배양용 미세유체칩"은 하나 이상의 세포 배양 지지체로 이루어진 세포 배양부; 세포 배양액을 주입하기 위하여 상기 세포 배양 지지체의 일측에 연결된 입구부; 세포 배양액을 일정한 유량 및 유속으로 주입하기 위하여 상기 입구부에 연결된 컨드롤부; 세포 배양액을 회수하기 위하여 상기 세포 배양 지지체의 다른 일측에 연결된 출구부;를 구비하는 미세유체칩을 의미한다.In the present specification, "3D cell culture microfluidic chip" refers to a cell culture unit made of one or more cell culture supports; An inlet connected to one side of the cell culture support to inject the cell culture solution; A control unit connected to the inlet to inject the cell culture solution at a constant flow rate and flow rate; It means a microfluidic chip having an outlet connected to the other side of the cell culture support in order to recover the cell culture medium.

상기 세포 배양 지지체는 콘케이브(concave)형 패턴을 포함한다.The cell culture support includes a concave pattern.

상기 하나 이상의 세포 배양 지지체에 연결된 출구부들 각각은 서로 연통되어 세포 배양액을 회수할 수 있다.Each of the outlets connected to the at least one cell culture support may communicate with each other to recover the cell culture solution.

본 명세서에서 "콘케이브(concave)"는 표면이 오목한 형태를 의미하며, 구체적으로는 표면이 오목한 반구 형태를 의미한다.In the present specification, "concave" refers to a shape having a concave surface, and specifically, means a hemispherical shape having a concave surface.

본 명세서에서 "콘케이브형 패턴"은 일정 방향으로 배열된 복수개의 콘케이브를 의미한다.In the present specification, "concave pattern" means a plurality of concaves arranged in a predetermined direction.

상기 콘케이브는 가로 세로 방향으로 다열(multiseriate) 배열될 수 있다.The concave may be arranged in multiple rows in a horizontal and vertical direction.

구체적인 일 양태에 있어서, 콘케이브형 패턴은 복수개의 콘케이브가 다열 배열되는 것으로서, 패턴의 각 열은 평행하게 배열되는 것일 수 있다.In a specific aspect, the concave-type pattern is that a plurality of concaves are arranged in multiple rows, and each row of the pattern may be arranged in parallel.

본 명세서에서 "평행"은 완전한 평행뿐만 아니라 실질적으로 평행하다고 볼 수 있는 수준으로 배열된 것까지 포함하는 의미이다.In the present specification, "parallel" means not only completely parallel but also arranged in a level that can be regarded as substantially parallel.

상기 콘케이브의 직경은 0.10 내지 1.00 mm, 0.15 내지 1.00 mm, 0.20 내지 1.00 mm, 0.25 내지 1.00 mm, 0.30 mm, 0.30 내지 1.00 mm, 0.35 내지 1.00 mm, 0.40 내지 1.00 mm, 0.45 내지 1.00 mm, 0.50 내지 1.00 mm, 0.55 내지 1.00 mm, 0.60 내지 1.00 mm, 0.65 내지 1.00 mm, 0.70 내지 1.00 mm, 0.75 내지 1.00 mm, 0.80 내지 1.00 mm, 0.85 내지 1.00 mm, 0.90 내지 1.00 mm 또는 0.95 내지 1.00 mm 일 수 있다. 상술한 콘케이브의 직경 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 생장율이 극대화 될 수 있다.The diameter of the corn cave is 0.10 to 1.00 mm, 0.15 to 1.00 mm, 0.20 to 1.00 mm, 0.25 to 1.00 mm, 0.30 mm, 0.30 to 1.00 mm, 0.35 to 1.00 mm, 0.40 to 1.00 mm, 0.45 to 1.00 mm, 0.50 To 1.00 mm, 0.55 to 1.00 mm, 0.60 to 1.00 mm, 0.65 to 1.00 mm, 0.70 to 1.00 mm, 0.75 to 1.00 mm, 0.80 to 1.00 mm, 0.85 to 1.00 mm, 0.90 to 1.00 mm, or 0.95 to 1.00 mm have. When the invention is carried out within the diameter of the concave described above, the cell growth rate can be maximized.

특히, 세포의 분화 과정 중 배상체(embryoid bodies; EB)의 크기는 분화에 있어 중요한 매개 변수로, 최적 크기의 EB 사용이 원하는 세포로의 분화 효율을 향상 시킬 수 있다. 또한, 세포주에 따라 EB 크기는 서로 다른 분화 효율을 가지므로, 분화 효율을 향상시키기 위하여 세포주에 맞는 EB 크기를 제어할 필요가 있다. 따라서, 세포주에 따라 3차원 세포 배양용 미세유체칩의 세포 배양 지지체에 포함된 콘케이브형 패턴의 직경이 상이할 수 있다.Particularly, the size of embryoid bodies (EB) during the differentiation process of cells is an important parameter for differentiation, and the use of the optimal size of EB can improve the differentiation efficiency into desired cells. In addition, since the EB size has different differentiation efficiencies depending on the cell line, it is necessary to control the size of the EB suitable for the cell line in order to improve the differentiation efficiency. Accordingly, the diameter of the concave pattern included in the cell culture support of the microfluidic chip for 3D cell culture may be different depending on the cell line.

상기 콘케이브의 직경 및 간격은 그 길이비가 1.0: 1.0 내지 1.5, 1.0: 1.0 내지 1.4, 1.0: 1.0 내지 1.3, 1.0: 1.0 내지 1.2 또는 1.0: 1.0 내지 1.1 일 수 있다.The diameter and spacing of the concave may have a length ratio of 1.0: 1.0 to 1.5, 1.0: 1.0 to 1.4, 1.0: 1.0 to 1.3, 1.0: 1.0 to 1.2, or 1.0: 1.0 to 1.1.

상술한 콘케이브의 직경 및 간격 내에서 발명을 실시하는 경우, 공급된 세포에 대하여 3차원으로 세포가 형성되는 비율인 세포 수율이 극대화 될 수 있다.When the invention is carried out within the diameter and spacing of the concave described above, the cell yield, which is the ratio at which cells are formed in three dimensions with respect to the supplied cells, can be maximized.

상기 콘케이브의 개수는 일 방향으로 1 내지 34 개, 예를 들어 가로 방향으로 1 내지 34 개 및 세로 방향으로 1 내지 10 개 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The number of concaves may be 1 to 34 in one direction, for example, 1 to 34 in a horizontal direction and 1 to 10 in a vertical direction, but is not limited thereto.

상기 콘케이브의 개수에 따른 가로-세로 비율은 제작하는 미세유체칩 구조에 따라 달라질 수 있으며, 세포마다 동일하게 적용 가능하다.The horizontal-to-vertical ratio according to the number of concaves may vary depending on the structure of the microfluidic chip to be manufactured, and can be applied equally to each cell.

상기 세포 배양 지지체는 폴리다이메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS), 유리(Glass), 및 폴리(Poly) 계열 플라스틱 재질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cell culture support may be made of polydimethylsiloxane (PDMS), glass, and poly-based plastic, but is not limited thereto.

상기 폴리 계열 플라스틱은 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌(Polyethylene) 및 폴리프로필렌(Polypropylene) 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The poly-based plastic may be polystyrene, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, or the like, but is not limited thereto.

상기 방법은 제1 세포를 접종하고 배양하는 응집(aggregation) 단계; 및 제 2 세포를 접종하고 배양하는 공동배양(co-culturing) 단계를 포함할 수 있다.The method includes an aggregation step of inoculating and culturing the first cells; And it may include a co-culturing (co-culturing) step of inoculating and culturing the second cell.

상기 응집 단계는 예를 들어, 1 내지 24 시간, 2 내지 24 시간, 3 내지 24 시간, 4 내지 24 시간, 5 내지 24 시간, 6 내지 24 시간, 7 내지 24 시간, 8 내지 24 시간, 9 내지 24 시간, 10 내지 24 시간, 11 내지 24 시간, 12 내지 24 시간, 13 내지 24 시간, 14 내지 24 시간, 15 내지 24 시간, 16 내지 24 시간, 17 내지 24 시간, 18 내지 24 시간, 19 내지 24 시간, 20 내지 24 시간, 21 내지 24 시간, 22 내지 24 시간, 23 내지 24 시간, 1 내지 23 시간, 1 내지 22 시간, 1 내지 21 시간, 1 내지 20 시간, 1 내지 19 시간, 1 내지 18 시간, 1 내지 17 시간, 1 내지 16 시간, 1 내지 15 시간, 1 내지 14 시간, 1 내지 13 시간, 1 내지 12 시간, 1 내지 11 시간, 1 내지 10 시간, 1 내지 9 시간, 1 내지 8 시간, 1 내지 7 시간, 1 내지 6 시간, 1 내지 5 시간, 1 내지 4 시간, 1 내지 3 시간 또는 1 내지 2 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The aggregation step is, for example, 1 to 24 hours, 2 to 24 hours, 3 to 24 hours, 4 to 24 hours, 5 to 24 hours, 6 to 24 hours, 7 to 24 hours, 8 to 24 hours, 9 to 24 hours, 10 to 24 hours, 11 to 24 hours, 12 to 24 hours, 13 to 24 hours, 14 to 24 hours, 15 to 24 hours, 16 to 24 hours, 17 to 24 hours, 18 to 24 hours, 19 to 24 hours, 20 to 24 hours, 21 to 24 hours, 22 to 24 hours, 23 to 24 hours, 1 to 23 hours, 1 to 22 hours, 1 to 21 hours, 1 to 20 hours, 1 to 19 hours, 1 to 18 hours, 1 to 17 hours, 1 to 16 hours, 1 to 15 hours, 1 to 14 hours, 1 to 13 hours, 1 to 12 hours, 1 to 11 hours, 1 to 10 hours, 1 to 9 hours, 1 to It may be performed for 8 hours, 1 to 7 hours, 1 to 6 hours, 1 to 5 hours, 1 to 4 hours, 1 to 3 hours, or 1 to 2 hours, but is not limited thereto.

상기 공배양 단계는 예를 들어, 1 내지 48 시간, 24 내지 48 시간, 25 내지 48 시간, 26 내지 48 시간, 27 내지 48 시간, 28 내지 48 시간, 29 내지 48 시간, 30 내지 48 시간, 31 내지 48 시간, 32 내지 48 시간, 33 내지 48 시간, 34 내지 48 시간, 35 내지 48 시간, 36 내지 48 시간, 37 내지 48 시간, 38 내지 48 시간, 39 내지 48 시간, 40 내지 48 시간, 41 내지 48 시간, 42 내지 48 시간, 43 내지 48 시간, 44 내지 48 시간, 45 내지 48 시간, 46 내지 48 시간, 47 내지 48 시간, 1 내지 47 시간, 1 내지 46 시간, 1 내지 45 시간, 1 내지 44 시간, 1 내지 43 시간, 1 내지 42 시간, 1 내지 41 시간, 1 내지 40 시간, 1 내지 39 시간, 1 내지 38 시간, 1 내지 37 시간, 1 내지 36 시간, 1 내지 35 시간, 1 내지 34 시간, 1 내지 33 시간, 1 내지 32 시간, 1 내지 31 시간, 1 내지 30 시간, 1 내지 29 시간, 1 내지 28 시간, 1 내지 27 시간, 1 내지 26 시간, 1 내지 25 시간 또는 1 내지 24 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The co-culture step is, for example, 1 to 48 hours, 24 to 48 hours, 25 to 48 hours, 26 to 48 hours, 27 to 48 hours, 28 to 48 hours, 29 to 48 hours, 30 to 48 hours, 31 To 48 hours, 32 to 48 hours, 33 to 48 hours, 34 to 48 hours, 35 to 48 hours, 36 to 48 hours, 37 to 48 hours, 38 to 48 hours, 39 to 48 hours, 40 to 48 hours, 41 To 48 hours, 42 to 48 hours, 43 to 48 hours, 44 to 48 hours, 45 to 48 hours, 46 to 48 hours, 47 to 48 hours, 1 to 47 hours, 1 to 46 hours, 1 to 45 hours, 1 To 44 hours, 1 to 43 hours, 1 to 42 hours, 1 to 41 hours, 1 to 40 hours, 1 to 39 hours, 1 to 38 hours, 1 to 37 hours, 1 to 36 hours, 1 to 35 hours, 1 To 34 hours, 1 to 33 hours, 1 to 32 hours, 1 to 31 hours, 1 to 30 hours, 1 to 29 hours, 1 to 28 hours, 1 to 27 hours, 1 to 26 hours, 1 to 25 hours or 1 It may be performed for 24 hours, but is not limited thereto.

상기 미세유체칩에서 평균 유량은 0.001 내지 0.100 mL/h, 0.002 내지 0.100 mL/h, 0.003 내지 0.100 mL/h, 0.004 내지 0.100 mL/h, 0.005 내지 0.100 mL/h, 0.006 내지 0.100 mL/h, 0.007 내지 0.100 mL/h, 0.008 내지 0.100 mL/h, 0.009 내지 0.100 mL/h, 0.010 내지 0.100 mL/h, 0.020 내지 0.100 mL/h, 0.030 내지 0.100 mL/h, 0.040 내지 0.100 mL/h, 0.050 내지 0.100 mL/h, 0.060 내지 0.100 mL/h, 0.070 내지 0.100 mL/h, 0.080 내지 0.100 mL/h, 0.090 내지 0.100 mL/h, 0.001 내지 0.090 mL/h, 0.001 내지 0.080 mL/h, 0.001 내지 0.070 mL/h, 0.001 내지 0.060 mL/h, 0.001 내지 0.050 mL/h, 0.001 내지 0.040 mL/h, 0.001 내지 0.030 mL/h, 0.001 내지 0.020 mL/h, 0.001 내지 0.010 mL/h, 0.001 내지 0.009 mL/h, 0.001 내지 0.008 mL/h, 0.001 내지 0.007 mL/h, 0.001 내지 0.006 mL/h, 0.001 내지 0.005 mL/h, 0.001 내지 0.004 mL/h, 0.001 내지 0.003 mL/h, 0.001 내지 0.002 mL/h 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The average flow rate in the microfluidic chip is 0.001 to 0.100 mL/h, 0.002 to 0.100 mL/h, 0.003 to 0.100 mL/h, 0.004 to 0.100 mL/h, 0.005 to 0.100 mL/h, 0.006 to 0.100 mL/h, 0.007 to 0.100 mL/h, 0.008 to 0.100 mL/h, 0.009 to 0.100 mL/h, 0.010 to 0.100 mL/h, 0.020 to 0.100 mL/h, 0.030 to 0.100 mL/h, 0.040 to 0.100 mL/h, 0.050 To 0.100 mL/h, 0.060 to 0.100 mL/h, 0.070 to 0.100 mL/h, 0.080 to 0.100 mL/h, 0.090 to 0.100 mL/h, 0.001 to 0.090 mL/h, 0.001 to 0.080 mL/h, 0.001 to 0.070 mL/h, 0.001 to 0.060 mL/h, 0.001 to 0.050 mL/h, 0.001 to 0.040 mL/h, 0.001 to 0.030 mL/h, 0.001 to 0.020 mL/h, 0.001 to 0.010 mL/h, 0.001 to 0.009 mL/h, 0.001 to 0.008 mL/h, 0.001 to 0.007 mL/h, 0.001 to 0.006 mL/h, 0.001 to 0.005 mL/h, 0.001 to 0.004 mL/h, 0.001 to 0.003 mL/h, 0.001 to 0.002 mL /h may be, but is not limited thereto.

상기 미세유체칩에서 평균 유속은 0.2 내지 20.0 mm/h, 0.3 내지 20.0 mm/h, 0.4 내지 20.0 mm/h, 0.5 내지 20.0 mm/h, 0.6 내지 20.0 mm/h, 0.7 내지 20.0 mm/h, 0.8 내지 20.0 mm/h, 0.9 내지 20.0 mm/h, 1.0 내지 20.0 mm/h, 2.0 내지 20.0 mm/h, 3.0 내지 20.0 mm/h, 4.0 내지 20.0 mm/h, 5.0 내지 20.0 mm/h, 6.0 내지 20.0 mm/h, 7.0 내지 20.0 mm/h, 8.0 내지 20.0 mm/h, 9.0 내지 20.0 mm/h, 10.0 내지 20.0 mm/h, 11.0 내지 20.0 mm/h, 12.0 내지 20.0 mm/h, 13.0 내지 20.0 mm/h, 14.0 내지 20.0 mm/h, 15.0 내지 20.0 mm/h, 16.0 내지 20.0 mm/h, 17.0 내지 20.0 mm/h, 18.0 내지 20.0 mm/h, 19.0 내지 20.0 mm/h, 0.2 내지 19.0 mm/h, 0.2 내지 18.0 mm/h, 0.2 내지 17.0 mm/h, 0.2 내지 16.0 mm/h, 0.2 내지 15.0 mm/h, 0.2 내지 14.0 mm/h, 0.2 내지 13.0 mm/h, 0.2 내지 12.0 mm/h, 0.2 내지 11.0 mm/h, 0.2 내지 10.0 mm/h, 0.2 내지 9.0 mm/h, 0.2 내지 8.0 mm/h, 0.2 내지 7.0 mm/h, 0.2 내지 6.0 mm/h, 0.2 내지 5.0 mm/h, 0.2 내지 4.0 mm/h, 0.2 내지 3.0 mm/h, 0.2 내지 2.0 mm/h, 0.2 내지 1.0 mm/h, 0.2 내지 0.9 mm/h, 0.2 내지 0.8 mm/h, 0.2 내지 0.7 mm/h, 0.2 내지 0.6 mm/h, 0.2 내지 0.5 mm/h, 0.2 내지 0.4 mm/h 또는 0.2 내지 0.3 mm/h 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The average flow rate in the microfluidic chip is 0.2 to 20.0 mm/h, 0.3 to 20.0 mm/h, 0.4 to 20.0 mm/h, 0.5 to 20.0 mm/h, 0.6 to 20.0 mm/h, 0.7 to 20.0 mm/h, 0.8 to 20.0 mm/h, 0.9 to 20.0 mm/h, 1.0 to 20.0 mm/h, 2.0 to 20.0 mm/h, 3.0 to 20.0 mm/h, 4.0 to 20.0 mm/h, 5.0 to 20.0 mm/h, 6.0 To 20.0 mm/h, 7.0 to 20.0 mm/h, 8.0 to 20.0 mm/h, 9.0 to 20.0 mm/h, 10.0 to 20.0 mm/h, 11.0 to 20.0 mm/h, 12.0 to 20.0 mm/h, 13.0 to 20.0 mm/h, 14.0 to 20.0 mm/h, 15.0 to 20.0 mm/h, 16.0 to 20.0 mm/h, 17.0 to 20.0 mm/h, 18.0 to 20.0 mm/h, 19.0 to 20.0 mm/h, 0.2 to 19.0 mm/h, 0.2 to 18.0 mm/h, 0.2 to 17.0 mm/h, 0.2 to 16.0 mm/h, 0.2 to 15.0 mm/h, 0.2 to 14.0 mm/h, 0.2 to 13.0 mm/h, 0.2 to 12.0 mm /h, 0.2 to 11.0 mm/h, 0.2 to 10.0 mm/h, 0.2 to 9.0 mm/h, 0.2 to 8.0 mm/h, 0.2 to 7.0 mm/h, 0.2 to 6.0 mm/h, 0.2 to 5.0 mm/ h, 0.2 to 4.0 mm/h, 0.2 to 3.0 mm/h, 0.2 to 2.0 mm/h, 0.2 to 1.0 mm/h, 0.2 to 0.9 mm/h, 0.2 to 0.8 mm/h, 0.2 to 0.7 mm/h , 0.2 to 0.6 mm/h, 0.2 to 0.5 mm/h, 0.2 to 0.4 mm/h, or 0.2 to 0.3 mm/h, but are not limited thereto.

상술한 유량 및 유속 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 배양액 공급 시 세포에 가해지는 물리적 영향이 최소화 될 수 있다.When the invention is carried out within the above-described flow rate and flow rate, the physical influence applied to the cells when the cell culture solution is supplied can be minimized.

상기 세포는 당업계에서 3차원으로 배양이 가능한 세포라면 어떠한 세포도 포함할 수 있으며, 예를 들어 배아줄기세포(Embryonic stem cell; ESC), 유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cell; iPSC), 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell; MSC) 및 섬유아세포(Fibroblast)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cell may include any cell as long as it can be cultured in three dimensions in the art, for example, embryonic stem cell (ESC), induced pluripotent stem cell (iPSC), intermediate Mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts may be, but are not limited thereto.

상기 세포 배양액은 당업계에서 세포(줄기세포)의 배양 및/또는 분화에 사용 가능한 배양액이라면 어떠한 배양액도 포함할 수 있으며, 상기 배양액에 포함되는 성분 또는 인자의 종류 및/또는 농도는 통상의 기술자가 용이하게 조절할 수 있다.The cell culture medium may include any culture medium as long as it is a culture medium that can be used for culturing and/or differentiation of cells (stem cells) in the art, and the type and/or concentration of components or factors included in the culture medium is determined by a skilled person. It can be easily adjusted.

본 발명의 3차원 세포 공배양 방법에 이용되는 3차원 세포 배양용 미세유체칩은 세포 배양액이 일정한 유량 및 유속으로 주입되고 방출되기 때문에, 이를 이용하여 2종 이상의 세포에 대하여 별도의 세포 이동 없이도 안정적으로 다 층의 3차원 세포의 응집(aggregation) 및 공동배양(co-culturing)을 한 번에 수행할 수 있는 장점이 있다.Since the microfluidic chip for 3D cell culture used in the 3D cell coculture method of the present invention is injected and discharged at a constant flow rate and flow rate, the cell culture solution is stable without separate cell movement for two or more cells. As a result, there is an advantage of being able to perform aggregation and co-culturing of multi-layered three-dimensional cells at once.

본 발명의 다른 양태는 세포 배양 지지체에 세포를 접종(seeding)하고 약물 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 약물 스크리닝 방법이다.Another aspect of the present invention is a drug screening method using a microfluidic chip for 3D cell culture comprising the step of seeding cells on a cell culture support and treating a drug candidate.

상기 미세유체칩은 세포 배양액이 일정한 유량 및 유속으로 주입되는 것이다.The microfluidic chip is a cell culture medium is injected at a constant flow rate and flow rate.

상기 약물 스크리닝 방법은 상기 약물 후보물질을 처리한 세포 배양 지지체의 세포와 약물 후보물질을 처리하지 않은 세포 배양 지지체의 세포를 상호 비교하는 단계를 포함할 수 있다.The drug screening method may include comparing cells of a cell culture support treated with the drug candidate and cells of a cell culture support not treated with the drug candidate.

상기 약물 스크리닝 방법은 세포의 생존능(viability), 산소 소비율(Oxygen Consumption Rate; OCR) 및/또는 세포 기능을 상호 비교하는 것일 수 있다.The drug screening method may be a comparison of cell viability, oxygen consumption rate (OCR), and/or cell function.

상기 약물 후보물질을 처리한 세포 배양 지지체와 약물 후보물질을 처리하지 않은 세포 배양 지지체는 하나의 3차원 세포 배양용 미세유체칩에 포함될 수 있다.The cell culture scaffold treated with the drug candidate material and the cell culture scaffold not treated with the drug candidate material may be included in one microfluidic chip for 3D cell culture.

상기 미세유체칩에서 평균 유량은 0.001 내지 0.100 mL/h, 0.002 내지 0.100 mL/h, 0.003 내지 0.100 mL/h, 0.004 내지 0.100 mL/h, 0.005 내지 0.100 mL/h, 0.006 내지 0.100 mL/h, 0.007 내지 0.100 mL/h, 0.008 내지 0.100 mL/h, 0.009 내지 0.100 mL/h, 0.010 내지 0.100 mL/h, 0.020 내지 0.100 mL/h, 0.030 내지 0.100 mL/h, 0.040 내지 0.100 mL/h, 0.050 내지 0.100 mL/h, 0.060 내지 0.100 mL/h, 0.070 내지 0.100 mL/h, 0.080 내지 0.100 mL/h, 0.090 내지 0.100 mL/h, 0.001 내지 0.090 mL/h, 0.001 내지 0.080 mL/h, 0.001 내지 0.070 mL/h, 0.001 내지 0.060 mL/h, 0.001 내지 0.050 mL/h, 0.001 내지 0.040 mL/h, 0.001 내지 0.030 mL/h, 0.001 내지 0.020 mL/h, 0.001 내지 0.010 mL/h, 0.001 내지 0.009 mL/h, 0.001 내지 0.008 mL/h, 0.001 내지 0.007 mL/h, 0.001 내지 0.006 mL/h, 0.001 내지 0.005 mL/h, 0.001 내지 0.004 mL/h, 0.001 내지 0.003 mL/h, 0.001 내지 0.002 mL/h 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The average flow rate in the microfluidic chip is 0.001 to 0.100 mL/h, 0.002 to 0.100 mL/h, 0.003 to 0.100 mL/h, 0.004 to 0.100 mL/h, 0.005 to 0.100 mL/h, 0.006 to 0.100 mL/h, 0.007 to 0.100 mL/h, 0.008 to 0.100 mL/h, 0.009 to 0.100 mL/h, 0.010 to 0.100 mL/h, 0.020 to 0.100 mL/h, 0.030 to 0.100 mL/h, 0.040 to 0.100 mL/h, 0.050 To 0.100 mL/h, 0.060 to 0.100 mL/h, 0.070 to 0.100 mL/h, 0.080 to 0.100 mL/h, 0.090 to 0.100 mL/h, 0.001 to 0.090 mL/h, 0.001 to 0.080 mL/h, 0.001 to 0.070 mL/h, 0.001 to 0.060 mL/h, 0.001 to 0.050 mL/h, 0.001 to 0.040 mL/h, 0.001 to 0.030 mL/h, 0.001 to 0.020 mL/h, 0.001 to 0.010 mL/h, 0.001 to 0.009 mL/h, 0.001 to 0.008 mL/h, 0.001 to 0.007 mL/h, 0.001 to 0.006 mL/h, 0.001 to 0.005 mL/h, 0.001 to 0.004 mL/h, 0.001 to 0.003 mL/h, 0.001 to 0.002 mL /h may be, but is not limited thereto.

상기 미세유체칩에서 평균 유속은 0.2 내지 20.0 mm/h, 0.3 내지 20.0 mm/h, 0.4 내지 20.0 mm/h, 0.5 내지 20.0 mm/h, 0.6 내지 20.0 mm/h, 0.7 내지 20.0 mm/h, 0.8 내지 20.0 mm/h, 0.9 내지 20.0 mm/h, 1.0 내지 20.0 mm/h, 2.0 내지 20.0 mm/h, 3.0 내지 20.0 mm/h, 4.0 내지 20.0 mm/h, 5.0 내지 20.0 mm/h, 6.0 내지 20.0 mm/h, 7.0 내지 20.0 mm/h, 8.0 내지 20.0 mm/h, 9.0 내지 20.0 mm/h, 10.0 내지 20.0 mm/h, 11.0 내지 20.0 mm/h, 12.0 내지 20.0 mm/h, 13.0 내지 20.0 mm/h, 14.0 내지 20.0 mm/h, 15.0 내지 20.0 mm/h, 16.0 내지 20.0 mm/h, 17.0 내지 20.0 mm/h, 18.0 내지 20.0 mm/h, 19.0 내지 20.0 mm/h, 0.2 내지 19.0 mm/h, 0.2 내지 18.0 mm/h, 0.2 내지 17.0 mm/h, 0.2 내지 16.0 mm/h, 0.2 내지 15.0 mm/h, 0.2 내지 14.0 mm/h, 0.2 내지 13.0 mm/h, 0.2 내지 12.0 mm/h, 0.2 내지 11.0 mm/h, 0.2 내지 10.0 mm/h, 0.2 내지 9.0 mm/h, 0.2 내지 8.0 mm/h, 0.2 내지 7.0 mm/h, 0.2 내지 6.0 mm/h, 0.2 내지 5.0 mm/h, 0.2 내지 4.0 mm/h, 0.2 내지 3.0 mm/h, 0.2 내지 2.0 mm/h, 0.2 내지 1.0 mm/h, 0.2 내지 0.9 mm/h, 0.2 내지 0.8 mm/h, 0.2 내지 0.7 mm/h, 0.2 내지 0.6 mm/h, 0.2 내지 0.5 mm/h, 0.2 내지 0.4 mm/h 또는 0.2 내지 0.3 mm/h 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The average flow rate in the microfluidic chip is 0.2 to 20.0 mm/h, 0.3 to 20.0 mm/h, 0.4 to 20.0 mm/h, 0.5 to 20.0 mm/h, 0.6 to 20.0 mm/h, 0.7 to 20.0 mm/h, 0.8 to 20.0 mm/h, 0.9 to 20.0 mm/h, 1.0 to 20.0 mm/h, 2.0 to 20.0 mm/h, 3.0 to 20.0 mm/h, 4.0 to 20.0 mm/h, 5.0 to 20.0 mm/h, 6.0 To 20.0 mm/h, 7.0 to 20.0 mm/h, 8.0 to 20.0 mm/h, 9.0 to 20.0 mm/h, 10.0 to 20.0 mm/h, 11.0 to 20.0 mm/h, 12.0 to 20.0 mm/h, 13.0 to 20.0 mm/h, 14.0 to 20.0 mm/h, 15.0 to 20.0 mm/h, 16.0 to 20.0 mm/h, 17.0 to 20.0 mm/h, 18.0 to 20.0 mm/h, 19.0 to 20.0 mm/h, 0.2 to 19.0 mm/h, 0.2 to 18.0 mm/h, 0.2 to 17.0 mm/h, 0.2 to 16.0 mm/h, 0.2 to 15.0 mm/h, 0.2 to 14.0 mm/h, 0.2 to 13.0 mm/h, 0.2 to 12.0 mm /h, 0.2 to 11.0 mm/h, 0.2 to 10.0 mm/h, 0.2 to 9.0 mm/h, 0.2 to 8.0 mm/h, 0.2 to 7.0 mm/h, 0.2 to 6.0 mm/h, 0.2 to 5.0 mm/ h, 0.2 to 4.0 mm/h, 0.2 to 3.0 mm/h, 0.2 to 2.0 mm/h, 0.2 to 1.0 mm/h, 0.2 to 0.9 mm/h, 0.2 to 0.8 mm/h, 0.2 to 0.7 mm/h , 0.2 to 0.6 mm/h, 0.2 to 0.5 mm/h, 0.2 to 0.4 mm/h, or 0.2 to 0.3 mm/h, but are not limited thereto.

상술한 유량 및 유속 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 배양액 공급 시 세포에 가해지는 물리적 영향이 최소화 될 수 있다.When the invention is carried out within the above-described flow rate and flow rate, the physical influence applied to the cells when the cell culture solution is supplied can be minimized.

상기 세포는 당업계에서 3차원으로 배양이 가능한 세포라면 어떠한 세포도 포함할 수 있으며, 예를 들어 간세포(Hepatocyte), 심근세포(Cardiomyocyte), 혈관내피세포(Endothelial cell) 및 신경세포(Neural cell)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cells may include any cells as long as they can be cultured in three dimensions in the art, for example, hepatocytes, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and neural cells. May be, but is not limited thereto.

상기 세포 배양액은 당업계에서 세포(줄기세포)의 배양 및/또는 분화에 사용 가능한 배양액이라면 어떠한 배양액도 포함할 수 있으며, 상기 배양액에 포함되는 성분 또는 인자의 종류 및/또는 농도는 통상의 기술자가 용이하게 조절할 수 있다.The cell culture medium may include any culture medium as long as it is a culture medium that can be used for culturing and/or differentiation of cells (stem cells) in the art, and the type and/or concentration of components or factors included in the culture medium is determined by a skilled person. It can be easily adjusted.

상기 3차원 세포 배양용 미세유체칩의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.The overlapping content of the 3D cell culture microfluidic chip is omitted in consideration of the complexity of the present specification.

본 발명의 약물 스크리닝 방법에 이용되는 3차원 세포 배양용 미세유체칩은 세포 배양액이 일정한 유량 및 유속으로 주입되고 방출되기 때문에, 이를 이용하여 별도의 세포 이동 없이도 3차원 세포의 응집(aggregation) 및 약물에 의한 세포 반응 분석을 한 번에 수행할 수 있는 장점이 있다.Since the microfluidic chip for three-dimensional cell culture used in the drug screening method of the present invention is injected and released at a constant flow rate and flow rate, the cell culture solution is used to aggregate three-dimensional cells and drugs without separate cell movement. There is an advantage of being able to perform cell response analysis by one time.

또한, 본 발명의 약물 스크리닝 방법에 이용되는 3차원 세포 배양용 미세유체칩은 여러 개의 세포 배양 지지체(채널)을 가지고 있기 때문에, 이를 이용하여 다중 농도 조건의 약물에 의한 세포 반응을 한 번에 분석할 수 있는 장점이 있다.In addition, since the microfluidic chip for three-dimensional cell culture used in the drug screening method of the present invention has several cell culture supports (channels), it is used to analyze the cell reaction by drugs under multiple concentration conditions at once. There is an advantage to be able to do.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 3차원 세포 배양용 미세유체칩에 대하여 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the microfluidic chip for three-dimensional cell culture of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 도식화한 평면도이다. 구체적으로, 도 1a는 세포 배양 지지체가 1 개 포함된 미세유체칩을 도식화한 평면도이고, 도 1b는 세포 배양 지지체가 3 개 포함된 미세유체칩을 도식화한 평면도이다.1 is a plan view schematically illustrating a microfluidic chip for 3D cell culture according to an embodiment of the present invention. Specifically, FIG. 1A is a plan view schematically illustrating a microfluidic chip including one cell culture support, and FIG. 1B is a plan view schematically illustrating a microfluidic chip including three cell culture supports.

상기 도면을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 3차원 세포 배양용 미세유체칩(1)은, 세포 배양부(10), 입구부(20), 컨트롤부(30) 및 출구부(40)를 포함하여 구성될 수 있다.Referring to the drawings, the microfluidic chip 1 for 3D cell culture according to an embodiment of the present invention includes a cell culture unit 10, an inlet unit 20, a control unit 30 and an outlet unit 40 It can be configured to include.

세포 배양부(10)는 하나 이상의 세포 배양 지지체(11)로 이루어지도록 구성될 수 있다. 하나 이상의 세포 배양 지지체로 이루어지는 경우, 각각의 세포 배양 지지체는 병렬로 연결되도록 구성될 수 있다.The cell culture unit 10 may be configured to be made of one or more cell culture supports 11. When composed of one or more cell culture supports, each of the cell culture supports may be configured to be connected in parallel.

상기 세포 배양 지지체는 콘케이브(concave)형 패턴을 포함할 수 있다.The cell culture support may include a concave pattern.

상기 콘케이브형 패턴은 일정 방향으로 배열된 복수개의 콘케이브를 포함할 수 있다.The concave pattern may include a plurality of concaves arranged in a predetermined direction.

상기 콘케이브는 가로 세로 방향으로 다열(multiseriate) 배열될 수 있다.The concave may be arranged in multiple rows in a horizontal and vertical direction.

상기 콘케이브의 직경은 0.10 내지 1.00 mm, 0.15 내지 1.00 mm, 0.20 내지 1.00 mm, 0.25 내지 1.00 mm, 0.30 mm, 0.30 내지 1.00 mm, 0.35 내지 1.00 mm, 0.40 내지 1.00 mm, 0.45 내지 1.00 mm, 0.50 내지 1.00 mm, 0.55 내지 1.00 mm, 0.60 내지 1.00 mm, 0.65 내지 1.00 mm, 0.70 내지 1.00 mm, 0.75 내지 1.00 mm, 0.80 내지 1.00 mm, 0.85 내지 1.00 mm, 0.90 내지 1.00 mm 또는 0.95 내지 1.00 mm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상술한 콘케이브의 직경 내에서 발명을 실시하는 경우, 세포 생장율이 극대화 될 수 있다.The diameter of the corn cave is 0.10 to 1.00 mm, 0.15 to 1.00 mm, 0.20 to 1.00 mm, 0.25 to 1.00 mm, 0.30 mm, 0.30 to 1.00 mm, 0.35 to 1.00 mm, 0.40 to 1.00 mm, 0.45 to 1.00 mm, 0.50 To 1.00 mm, 0.55 to 1.00 mm, 0.60 to 1.00 mm, 0.65 to 1.00 mm, 0.70 to 1.00 mm, 0.75 to 1.00 mm, 0.80 to 1.00 mm, 0.85 to 1.00 mm, 0.90 to 1.00 mm, or 0.95 to 1.00 mm However, it is not limited thereto. When the invention is carried out within the diameter of the concave described above, the cell growth rate can be maximized.

상기 콘케이브의 직경 및 간격은 그 길이비가 1: 1 내지 1.5 일 수 있다.The diameter and spacing of the concave may have a length ratio of 1: 1 to 1.5.

상술한 콘케이브의 직경 및 간격 내에서 발명을 실시하는 경우, 공급된 세포에 대하여 3차원으로 세포가 형성되는 비율인 세포 수율이 극대화 될 수 있다.When the invention is carried out within the diameter and spacing of the concave described above, the cell yield, which is the ratio at which cells are formed in three dimensions with respect to the supplied cells, can be maximized.

상기 콘케이브의 개수는 일 방향으로 1 내지 34 개, 예를 들어, 가로 방향으로 1 내지 34 개 및 세로 방향으로 1 내지 10 개 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The number of concaves may be 1 to 34 in one direction, for example, 1 to 34 in a horizontal direction and 1 to 10 in a vertical direction, but is not limited thereto.

상기 콘케이브의 개수에 따른 가로-세로 비율은 제작하는 미세유체칩 구조에 따라 달라질 수 있으며, 세포마다 동일하게 적용 가능하다.The horizontal-to-vertical ratio according to the number of concaves may vary depending on the structure of the microfluidic chip to be manufactured, and can be applied equally to each cell.

상기 세포 배양 지지체는 폴리다이메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS), 유리(Glass), 및 및 폴리(Poly) 계열 플라스틱 재질일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The cell culture support may be made of polydimethylsiloxane (PDMS), glass, and poly-based plastic, but is not limited thereto.

상기 폴리 계열 플라스틱은 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌(Polyethylene) 및 폴리프로필렌(Polypropylene) 등인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The poly-based plastic may be polystyrene, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, or the like, but is not limited thereto.

입구부(20)는 세포 배양액을 주입하기 위한 주입구로, 상기 세포 배양 지지체의 일 측에 연결되도록 구성될 수 있다.The inlet part 20 is an injection port for injecting a cell culture solution, and may be configured to be connected to one side of the cell culture support.

상기 입구부에는 배양액을 저장할 수 있는 배양액 저장 용기가 추가로 배치될 수 있다.A culture solution storage container capable of storing the culture solution may be additionally disposed at the inlet.

상기 입구부와 세포 배양 지지체를 연결하는 관은 파이프(튜브) 구조로 이루어질 수 있으며, 외경(바깥 지름)이 1.0 내지 1.5 mm, 내경(안쪽 지름)이 0.1 내지 0.5 mm일 수 있다.The tube connecting the inlet portion and the cell culture support may have a pipe (tube) structure, and an outer diameter (outer diameter) of 1.0 to 1.5 mm, and an inner diameter (inner diameter) of 0.1 to 0.5 mm.

상기 관의 재질은 당업계에서 관을 제조하기 위하여 이용되는 어떠한 재질도 포함할 수 있다.The material of the tube may include any material used to manufacture a tube in the art.

컨트롤부(30)는 세포 배양액을 일정한 유량 및 유속으로 주입하기 위한 구성으로, 상기 입구부에 연결되도록 구성될 수 있다.The control unit 30 is configured to inject the cell culture solution at a constant flow rate and flow rate, and may be configured to be connected to the inlet.

출구부(40)는 세포 배양액을 회수하기 위한 배출구로, 상기 세포 배양 지지체의 다른 일 측에 연결되도록 구성될 수 있다.The outlet portion 40 is an outlet for recovering the cell culture solution, and may be configured to be connected to the other side of the cell culture support.

상기 출구부와 세포 배양 지지체를 연결하는 관은 파이프(튜브) 구조로 이루어질 수 있으며, 외경(바깥 지름)이 1.0 내지 1.5 mm, 내경(안쪽 지름)이 0.1 내지 0.5 mm일 수 있다.The tube connecting the outlet portion and the cell culture support may have a pipe (tube) structure, and may have an outer diameter (outer diameter) of 1.0 to 1.5 mm, and an inner diameter (inner diameter) of 0.1 to 0.5 mm.

상기 관의 재질은 당업계에서 관을 제조하기 위하여 이용되는 어떠한 재질도 포함할 수 있다.The material of the tube may include any material used to manufacture a tube in the art.

특히, 세포 배양부가 하나 이상의 세포 배양 지지체로 이루어진 구성에서, 상기 세포 배양 지지체에 연결된 출구부들 각각은 서로 연통되어 세포 배양액을 회수할 수 있다.In particular, in the configuration of the cell culture unit consisting of at least one cell culture support, each of the outlet portions connected to the cell culture support can communicate with each other to recover the cell culture solution.

본 발명은 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포의 공배양 방법 및 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상기 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 사용하는 경우, 세포를 3차원으로 배양하면서 별도의 이동 없이 이를 동시에 활용할 수 있으므로, 3차원 배양 세포를 이용하는 다양한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a three-dimensional cell co-culture method and a drug screening method using a three-dimensional cell culture microfluidic chip, in the case of using the three-dimensional cell culture microfluidic chip, while culturing the cells in three dimensions Since it can be used at the same time without moving, it can be usefully used in various fields using 3D cultured cells.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 지지체가 1 개 포함된 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 도식화한 평면도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양 지지체가 3 개 포함된 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 도식화한 평면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시에 따른 세포 배양 지지체 제조를 위한 모델링 형상에 대한 도면(단위: mm, R: 반지름)이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩을 이용하여 지방-유래중간엽줄기세포 및 섬유아세포를 공배양한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩을 이용하여 간세포에 대한 약물(아자타이오프린) 스크리닝 결과(세포사멸 효과)를 나타낸 도이다.
도 4a는 발명의 일 실시예에 따른 미세유체칩을 이용하여 간세포에 대한 약물(아자타이오프린) 스크리닝 결과(산소 소비량 감소 효과)를 나타낸 도이다.1A is a plan view schematically illustrating a microfluidic chip for culturing a 3D cell including one cell culture support according to an embodiment of the present invention.
1B is a schematic plan view of a microfluidic chip for 3D cell culture including three cell culture supports according to an embodiment of the present invention.
2 is a diagram (unit: mm, R: radius) of a modeling shape for manufacturing a cell culture scaffold according to an embodiment of the present invention.
3 is a diagram showing the result of co-culture of fat-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts using a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4A is a diagram showing a drug (azathioprine) screening result (cell death effect) for hepatocytes using a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4A is a diagram showing a drug (azathioprine) screening result for hepatocytes (an effect of reducing oxygen consumption) using a microfluidic chip according to an embodiment of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

제조예. 콘케이브(concave)형 패턴의 제조Manufacturing example. Preparation of concave pattern

세포 배양 지지체에 포함된 콘케이브형 패턴은 공지된 방법에 의해 제조하였다(Moon et al., Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies, Biomaterials, 2014;35:5987-97.).The concave pattern included in the cell culture support was prepared by a known method (Moon et al., Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies, Biomaterials, 2014;35:5987-97. ).

실시예. 세포 배양 지지체를 포함하는 미세유체칩의 제조Example. Preparation of microfluidic chip including cell culture support

도 2에 나타낸 모델링 형상 규격을 바탕으로 콘케이브형 패턴이 포함된 세포 배양 지지체를 제조하고, 상기 세포 배양 지지체 3 내지 5 개를 연결하여 미세유체칩을 제조하였다.A cell culture scaffold including a concave pattern was prepared based on the modeling shape specification shown in FIG. 2, and a microfluidic chip was prepared by connecting 3 to 5 of the cell culture scaffolds.

준비예. 세포 배양Preparation Yes. Cell culture

인간 지방-유래중간엽줄기세포(human Adipose-derived Mesenchymal stem cell; human AD-MSC, LONZA, Swiss)는 10 % 우태아혈청(Fetal bovine serum; FBS, Gibco, USA)이 첨가된 RPMI 1640(Gibco) 배지에서 배양하였다.Human Adipose-derived Mesenchymal stem cells (human AD-MSC, LONZA, Swiss) are RPMI 1640 (Gibco) supplemented with 10% Fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA). ) Cultured in medium.

인간 섬유아세포(human Fibroblast, ATCC, USA)는 10 % 우태아혈청(Gibco)이 첨가된 둘베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium; DMEM, Sigma-Aldrich, USA)에서 유지하였다.Human Fibroblast (ATCC, USA) was maintained in Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich, USA) to which 10% fetal calf serum (Gibco) was added.

상기 각 배지에는 1 % 비필수 아미노산(Non-essential amino acid; NEAA, Gibco), 1 % 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin; PS, Gibco) 및 100 mM β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol, Gibco)을 첨가하였다.Each medium contains 1% non-essential amino acid (NEAA, Gibco), 1% penicillin-streptomycin (PS, Gibco), and 100 mM β-mercaptoethanol (β-mercaptoethanol, Gibco). ) Was added.

상기 지방-유래중간엽줄기세포 및 섬유아세포는 0.25 % 트립신(trypsin) 용액을 사용하여 5~6 회의 계대 후에 사용되었으며, 유체 챔버 내에서 5 % CO2, 37 ℃로 유지하였다.The adipose-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts were used after 5-6 passages using a 0.25% trypsin solution, and maintained at 5% CO 2 and 37°C in a fluid chamber.

인간 간세포(human Hepatocyte)는 ScienCell 사(ScienCell Research Laboratories, USA)로부터 각각 5 % FBS 및 간세포 성장 보충제(hepatocyte growth supplement)를 포함하는 간세포 배지에서 배양된 것으로 구입하였다.Human Hepatocytes were purchased from ScienCell (ScienCell Research Laboratories, USA) as cultured in hepatocyte medium containing 5% FBS and hepatocyte growth supplement, respectively.

실험예 1. 미세유체칩을 이용한 공배양(spheroid formation)Experimental Example 1. Co-culture using microfluidic chips (spheroid formation)

3 개의 세포 배양 지지체를 포함하는 미세유체칩에서, 하기 3 가지 조건 하에 지방-유래중간엽줄기세포 및 섬유아세포를 공배양하였다. 각각의 세포에 대하여 상이한 형광 표지(Molecular Probes)인 DiI 및 DiO를 사용하여 염색하였다.In a microfluidic chip containing three cell culture supports, adipose-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts were co-cultured under the following three conditions. Each cell was stained using different fluorescent labels (Molecular Probes), DiI and DiO.

- 조건 1(제1 세포 배양 지지체): 섬유아세포를 접종(seeding)하여 응집(aggregation)시킨 후, 2 일째에 지방-유래중간엽줄기세포를 접종하고 공동배양(co-culturing)함.-Condition 1 (first cell culture support): Fibroblasts were seeded and aggregated, and then adipose-derived mesenchymal stem cells were inoculated and co-cultivated on the second day.

- 조건 2(제2 세포 배양 지지체): 지방-유래중간엽줄기세포를 접종하여 응집시킨 후, 2 일째에 섬유아세포를 접종하고 공동배양함.-Condition 2 (Second cell culture support): After inoculation of adipose-derived mesenchymal stem cells and aggregation, fibroblasts were inoculated and co-cultured on the second day.

- 조건 3(제3 세포 배양 지지체): 지방-유래중간엽줄기세포 및 섬유아세포를 함께 접종하고 응집 후 공동배양함.-Condition 3 (3rd cell culture support): Inoculate adipose-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts together, and co-culture after aggregation.

보다 구체적으로, 지방-유래중간엽줄기세포 및 섬유아세포를 0.25 % 트립신 처리하여 2 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고 1000 rpm에서 5 분 동안 원심 분리 후, 최종 농도 5x105 세포/mL가 되도록 배지에 재현탁시켰다. 조건 1 및 2의 경우 상기 지방-유래중간엽줄기세포 또는 동일한 양의 섬유아세포를 세포 배양 지지체에 각각 200 mL씩 접종하고 37 ℃에서 하루 동안 배양한 후, 서로 다른(반대의) 세포를 각 세포 배양 지지체에 추가로 접종하고 공동배양하였다. 조건 3의 경우 상기 지방-유래중간엽줄기세포 및 동일한 양의 섬유아세포를 혼합하여 세포 배양 지지체에 200 mL 접종하여 배양하였다. More specifically, adipose-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts were treated with 0.25% trypsin, incubated at 37°C for 2 minutes, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and then reproduced in a medium to a final concentration of 5 ×10 5 cells/mL. It was cloudy. In the case of conditions 1 and 2, 200 mL each of the adipose-derived mesenchymal stem cells or fibroblasts of the same amount were inoculated on a cell culture support and cultured at 37° C. for one day, and then different (opposite) cells were added to each cell. The culture support was further inoculated and cocultured. In the case of condition 3, the adipose-derived mesenchymal stem cells and fibroblasts of the same amount were mixed, and 200 mL of the cell culture support was inoculated and cultured.

이때, 세포 배양액은 0.8 μL/min의 속도로 미세유체칩의 입구부를 통해 주입되었으며, 입구부에 배치된 배양액 저장 용기에는 12-24 시간 주기로 500-1,000 μL의 새로운 배양액이 첨가되었다.At this time, the cell culture solution was injected through the inlet of the microfluidic chip at a rate of 0.8 μL/min, and 500-1,000 μL of new culture solution was added to the culture solution storage container disposed at the inlet at intervals of 12 to 24 hours.

도 3에서 확인할 수 있듯이, 순차적인 공동배양 그룹(조건 1 및 조건 2)에서는 각각 2 일째에 접종한 세포가 1 일째에 응집된 세포 배양체(Embryoid Body; EB)의 표면을 둘러싸면서 배양되는 것을 확인하였다. 반면, 단순 공동배양 그룹(조건 3)에서는 각 세포의 구별 없이 융합되어 하나의 컴팩트한 형태로 응집체가 형성되는 것을 확인하였다.As can be seen in Figure 3, in the sequential co-culture group (condition 1 and condition 2), it was confirmed that the cells inoculated on the second day were cultured while surrounding the surface of the aggregated cell culture (Embryoid Body; EB) on the first day. I did. On the other hand, in the simple co-culture group (condition 3), it was confirmed that each cell was fused without distinction to form an aggregate in a single compact form.

실험예 2. 미세유체칩을 이용한 약물 스크리닝Experimental Example 2. Drug screening using microfluidic chip

4 개의 세포 배양 지지체를 포함하는 미세유체칩에서, 간세포를 접종(seeding)하여 배상체(EB)를 형성시키면서 동시에 다중 농도(1 μM, 10 μM 및 100 μM)의 아자타이오프린(Azathioprine)에 의한 약물 스크리닝을 실시하였다.In a microfluidic chip containing four cell culture supports, hepatocytes are seeded to form embryoid bodies (EBs), while at the same time in multiple concentrations (1 μM, 10 μM and 100 μM) of azathioprine. Drug screening was performed.

보다 구체적으로, 간세포는 0.25 % 트립신 처리하여 2 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리 후, 최종 농도 5x105 세포/mL가 되도록 배지에 재현탁시켰다. 상기 간세포를 4 개의 세포 배양 지지체에 200 μL씩 접종하고 37 ℃에서 하루 동안 배양하여 배상체를 형성시켰다. 24 시간 후, 새로운 200 μL 배지에 아자타이오프린을 다중 농도로 처리하여 3 일 동안 약물 반응을 확인하였다.More specifically, hepatocytes were treated with 0.25% trypsin, incubated at 37° C. for 2 minutes, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and then resuspended in the medium to a final concentration of 5 ×10 5 cells/mL. The hepatocytes were inoculated into four cell culture supports at 200 μL and cultured at 37° C. for one day to form embryoid bodies. After 24 hours, azathioprine was treated at multiple concentrations in a new 200 μL medium to confirm the drug reaction for 3 days.

이때, 세포 배양액은 0.8 μL/min의 속도로 미세유체칩의 입구부를 통해 주입되었으며, 입구부에 배치된 배양액 저장 용기에는 12-24 시간 주기로 500-1,000 μL의 새로운 배양액이 첨가되었다.At this time, the cell culture solution was injected through the inlet of the microfluidic chip at a rate of 0.8 μL/min, and 500-1,000 μL of new culture solution was added to the culture solution storage container disposed at the inlet at intervals of 12 to 24 hours.

도 4a에서 확인할 수 있듯이, 아자타이오프린을 100 μM 농도로 처리한 간세포에서만 3 일 이내에 약물 반응으로 인한 세포사멸이 나타나는 것을 확인하였다. As can be seen in Figure 4a, it was confirmed that only the hepatocytes treated with azathioprine at a concentration of 100 μM showed apoptosis due to a drug reaction within 3 days.

또한, 도 4b에서 확인할 수 있듯이, 아자타이오프린을 1 μM 및 10 μM 농도로 처리한 간세포의 산소 소비량은 대조군보다 다소 높거나 유사하였으나, 아자타이오프린을 100 μM 농도로 처리한 간세포의 산소 소비량은 대조군보다 낮게 나타나는 것을 확인하였다.In addition, as can be seen in Figure 4b, the oxygen consumption of hepatocytes treated with azathyoprine at 1 μM and 10 μM concentrations was somewhat higher or similar than that of the control group, but oxygen consumption of hepatocytes treated with azathyoprine at 100 μM concentrations It was confirmed that the consumption amount appeared lower than that of the control group.

1: 3차원 세포 배양용 미세유체칩
10: 세포 배양부
11: 세포 배양 지지체
20: 입구부
30: 컨트롤부
40: 출구부1: Microfluidic chip for 3D cell culture
10: cell culture unit
11: cell culture support
20: inlet
30: control unit
40: exit

Claims (12)

세포 배양 지지체에 2종 이상의 세포를 순차적으로 접종(seeding)하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 3차원 세포 공배양(spheroid formation) 방법으로서,
상기 미세유체칩은 하나 이상의 세포 배양 지지체로 이루어진 세포 배양부;
세포 배양액을 주입하기 위하여 상기 세포 배양 지지체의 일 측에 연결된 입구부;
세포 배양액을 일정한 유량 및 유속으로 주입하기 위하여 상기 입구부에 연결된 컨드롤부; 및
세포 배양액을 회수하기 위하여 상기 세포 배양 지지체의 다른 일 측에 연결된 출구부;를 구비하고,
상기 세포 배양 지지체는 일정 방향으로 배열된 복수개의 0.3 내지 1.0 mm 직경의 콘케이브를 포함하는 콘케이브(concave)형 패턴을 포함하고,
상기 하나 이상의 세포 배양 지지체에 연결된 출구부들 각각은 서로 연통되어 세포 배양액을 회수하고,
세포 배양액이 일정한 유량 및 유속으로 주입되는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.As a three-dimensional cell co-culture (spheroid formation) method using a three-dimensional cell culture microfluidic chip comprising the step of sequentially seeding (seeding) two or more kinds of cells on a cell culture support,
The microfluidic chip includes a cell culture unit made of at least one cell culture support;
An inlet connected to one side of the cell culture support to inject a cell culture solution;
A control unit connected to the inlet to inject the cell culture solution at a constant flow rate and flow rate; And
And an outlet connected to the other side of the cell culture support for recovering the cell culture solution,
The cell culture support includes a concave-type pattern including a plurality of 0.3 to 1.0 mm diameter concaves arranged in a predetermined direction,
Each of the outlet portions connected to the one or more cell culture supports are in communication with each other to recover the cell culture solution,
The cell culture medium is injected at a constant flow rate and flow rate, three-dimensional cell co-culture method. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은
제1 세포를 접종하고 배양하는 응집(aggregation) 단계; 및
제 2 세포를 접종하고 배양하는 공동배양(co-culturing) 단계를 포함하는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.The method of claim 1, wherein the method
An aggregation step of inoculating and culturing the first cells; And
The method comprising the step of inoculating and culturing the second cell co-culturing (co-culturing). 제 2 항에 있어서, 상기 응집 단계는 1 내지 24 시간 동안 수행되는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.The method of claim 2, wherein the aggregation step is performed for 1 to 24 hours. 제 2 항에 있어서, 상기 공동배양 단계는 1 내지 48 시간 동안 수행되는 것인, 3차원 세포 공배양 방법.The method of claim 2, wherein the co-culture step is performed for 1 to 48 hours. 제 1 항에 있어서, 상기 유량은 0.001 내지 0.100 mL/h 인 것인, 3차원 세포 공배양 방법.The method of claim 1, wherein the flow rate is 0.001 to 0.100 mL/h. 제 1 항에 있어서, 상기 유속은 0.2 내지 20.0 mm/h 인 것인, 3차원 세포 공배양 방법.The method of claim 1, wherein the flow rate is 0.2 to 20.0 mm/h. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell; ESC), 유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cell; iPSC), 중간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell; MSC) 및 섬유아세포(Fibroblast)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 3차원 세포 공배양 방법.The method of claim 1, wherein the cells are embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSCs), mesenchymal stem cells (MSCs), and fibroblasts. Which is selected from the group consisting of, three-dimensional cell co-culture method. 세포 배양 지지체에 세포를 접종(seeding)하고 약물 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는 3차원 세포 배양용 미세유체칩을 이용한 약물 스크리닝 방법으로서,
상기 미세유체칩은 하나 이상의 세포 배양 지지체로 이루어진 세포 배양부;
세포 배양액을 주입하기 위하여 상기 세포 배양 지지체의 일 측에 연결된 입구부;
세포 배양액을 일정한 유량 및 유속으로 주입하기 위하여 상기 입구부에 연결된 컨드롤부; 및
세포 배양액을 회수하기 위하여 상기 세포 배양 지지체의 다른 일 측에 연결된 출구부;를 구비하고,
상기 세포 배양 지지체는 일정 방향으로 배열된 복수개의 0.3 내지 1.0 mm 직경의 콘케이브를 포함하는 콘케이브(concave)형 패턴을 포함하고,
상기 하나 이상의 세포 배양 지지체에 연결된 출구부들 각각은 서로 연통되어 세포 배양액을 회수하고,
세포 배양액이 일정한 유량 및 유속으로 주입되는 것인, 약물 스크리닝 방법.As a drug screening method using a microfluidic chip for three-dimensional cell culture comprising the step of inoculating (seeding) cells on a cell culture support and treating a drug candidate,
The microfluidic chip includes a cell culture unit made of at least one cell culture support;
An inlet connected to one side of the cell culture support to inject a cell culture solution;
A control unit connected to the inlet to inject the cell culture solution at a constant flow rate and flow rate; And
And an outlet connected to the other side of the cell culture support for recovering the cell culture solution,
The cell culture support includes a concave-type pattern including a plurality of 0.3 to 1.0 mm diameter concaves arranged in a predetermined direction,
Each of the outlet portions connected to the one or more cell culture supports are in communication with each other to recover the cell culture solution,
The cell culture medium is injected at a constant flow rate and flow rate, drug screening method. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 상기 약물 후보물질을 처리한 세포 배양 지지체의 세포와 약물 후보물질을 처리하지 않은 세포 배양 지지체의 세포를 상호 비교하는 단계를 포함하는 것인, 약물 스크리닝 방법.The drug screening method according to claim 8, wherein the method comprises comparing cells of a cell culture scaffold treated with the drug candidate and cells of a cell culture scaffold not treated with the drug candidate with each other. 제 8 항에 있어서, 상기 유량은 0.001 내지 0.100 mL/h 인 것인, 약물 스크리닝 방법.The method of claim 8, wherein the flow rate is 0.001 to 0.100 mL/h. 제 8 항에 있어서, 상기 유속은 0.2 내지 20.0 mm/h 인 것인, 약물 스크리닝 방법.The method of claim 8, wherein the flow rate is 0.2 to 20.0 mm/h. 제 8 항에 있어서, 상기 세포는 간세포(Hepatocyte), 심근세포(Cardiomyocyte), 혈관내피세포(Endothelial cell) 및 신경세포(Neural cell)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 약물 스크리닝 방법.The method of claim 8, wherein the cells are selected from the group consisting of hepatocytes, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and neural cells.
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