KR102155623B1 - 성체 심장 줄기세포 군집 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 형태의 다분화능 성체 심장 줄기세포의 확인, 분리, 증식 및 특성과 관련된다. 이들 성체 줄기세포는, 이들이 이들의 분리 및 증식을 보조하는데 사용될 수 있는 특정 패턴의 마커를 자연적으로 발현한다는 점에 특징이 있다. 특히, 상기 세포는 SOX17 및 GATA4를 발현하지만, Oct4, Nanog, c-kit 및 텔로머라아제 역전사효소를 발현하지 않는다. 이러한 세포는 하나 이상의 다음의 세포로 분화할 수 있다: 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및/또는 평활근 세포. 또한, 이들은 면역조절뿐만 아니라 손상된 심장 조직의 복구를 제공, 활성화 및/또는 유도하는 전례 없는 능력을 나타낸다. 이러한 성체 줄기세포는 제한 없이 조직 재생 용도, 특히 심근과 같은 손상된 심장 조직의 재생 용도를 포함하는 치료제로서 사용될 수 있다.

Description

성체 심장 줄기세포 군집{ADULT CARDIAC STEM CELL POPULATION}

본 발명은 특정 형태의 성체 심장 줄기세포(adult cardiac stem cell)의 확인(identification), 분리(isolation), 증식(expansion) 및 특성(chracterization)과 관련된다. 이들 성체 줄기세포는, 이들이 이들의 분리 및 증식을 보조하는데 사용될 수 있는 특정 패턴의 마커(markers)를 자연적으로 발현한다는 점에 특징이 있다. 본 발명의 상기 세포는 손상된 심장 조직(damaged cardiac tissue)의 복구를 제공(providing), 활성화(activating) 및/또는 유도(inducing)하는 전례 없는 능력을 나타낸다. 이러한 성체 줄기세포는 제한 없이 조직 재생 용도, 특히 심근(myocardium)과 같은 손상된 심장 조직의 재생 용도를 포함하는 치료제(therapeutic agents)로서 사용될 수 있다.

WO 99/49015, WO 2005/012510, WO 2006/052925, WO 02/09650, WO 02/13760, WO 03/103611, WO 2007/100530, WO 2009/073616, WO 2011/057249, WO 2011/057251, WO 2012/048010, WO 2006/093276 및 WO 2009/136283에서 기재된 것을 포함하여, 수많은 상이한 심장 줄기세포주가 종래 기술에 기재되어 있다.

이러한 줄기세포주는 다양한 수단에 의해 모두 분리되지만, 이들 모두는 많은 동일한 특성을 공유하고, 사실상, 동일하거나 실질적으로 동등한 줄기세포 군집일 수 있다. 특히, 공지된 성체 심장 줄기세포는 일정한 특성, 마커 및 형태학적 특성을 모두 공유한다. 공지된 세포는 동일한 기원(심장 조직), 어떤 표면에 부착되어 배양될 때 동일한 형태를 공유하고, CD90 또는 CD44와 같은 성체 줄기세포의 표면 마커를 발현하고, 또한, 증식 과정 동안의 어떤 시점, 주로 줄기세포 배양이 개시될 때 c-kit를 대부분 발현한다. 또한, 텔로머라아제(telomerase)가 이들 세포에서 활성화되는 것을 보여준다. 또한, 이들 세포 모두는 평활근, 내피 세포 또는 심근 세포와 같은 심장 계통으로 분화하는 능력을 가지고 있다.

수많은 상이한 심장 줄기세포주가 종래 기술에 공지되었지만, 치료 용도로 사용될 수 있는 심장 줄기세포주의 확인(identification) 및 특성화에 대한 필요성이 남아있다. 치료 상황에서, 임의의 치료 효과를 볼 수 있기 전에, 수용자에게 유전학적으로 동일하지 않은 줄기세포주는 종종 줄기세포의 면역 거부 반응에서 문제가 발생한다. 성체-유래 다분화능 세포(adult-derived multipotent cells)는 성체 동물에 주입시 기형종을 형성하는 경향의 또 다른 문제가 종종 있어서, 치료용으로서의 사용에는 한계가 있다.

따라서, 치료 용도에 대한 잠재성을 가지고 있지만, 환자에게 주입시 기형종을 형성하는 경향을 가지지 않는 성체 심장 줄기세포의 군집을 확인하기 위한 지속적인 요구가 있다. 나아가, 면역 거부 반응의 위험을 일으키지 않는 이러한 세포에 대한 필요성이 있다.

발명의 요약

본 발명은 마커 프로파일(marker profile) 및 형태학적으로 공지된 세포 군집과는 다른 새로운 성체 심장 줄기세포 군집을 제공하며, 동종이계(allogeneic), 동계(syngenic) 또는 면역 결핍 숙주에 투여하는 경우 낮은 면역원성(immunogenicity) 및 기형종 형성이 불가능하기 때문에 치료 적용에 적합하다. 또한, 본 발명의 심장 줄기세포는 동종이계 세포에 숙주의 면역 반응을 조절할 수 있고 혈관 형성을 유도할 수 있다. 본 발명의 세포는 심장 조직, 바람직하게는 심근 조직으로부터 분리될 수 있고, 일반적으로 세포 은행의 제조를 위해 사용되는 표면에 부착된 시험관 내에서 증식될 수 있다. 전술한 다른 세포와 달리, 본 발명의 세포는 텔로머라아제 역전사효소가 음성이므로, 종양 형성을 방지하고 증식 기능을 제한한다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포의 심장 보호, 면역 조절 기능 및 심장 재생 가능성에서 이들 세포는 허혈성 심장 질환, 자가 면역 질환과 같은 다른 질환, 상처 치유 프로세스 또는 재생 요법의 치료를 위한 적합한 치료 도구이다. 특히, 본 발명의 성체 심장 줄기세포에 의해 매개되는 다음 현상에서 이들 세포는 세포사멸 또는 염증 반응이 관여하는 질환의 치료를 위한 유용한 치료 도구이다.

- 이러한 세포 생산물에 의해 매개되는 심장 보호 신호는 발병 후 세포 손실을 제한할 것이다.

- 심장 성체 줄기세포의 면역 조절 기능은 T 세포 및 대식 세포에 의해 매개되는 염증 치료를 조절할 것이다. 발병 후 초기 단계에서 면역 반응은 세포 파편을 제거하고 흉터 형성을 개시하는 것이 필수적이지만, 장기간 염증 치료에서 흉터 해결 및 조직 재생은 허용되지 않을 것이다.

- 마지막으로, 쥐 모델의 생체 내 실험에서, 새로운 조직의 형성을 유도하고, 흉터 크기를 감소시키며 새로운 근육 섬유의 존재를 증가시키는 성체 심장 줄기세포의 능력을 나타낸다. 이는 내성(endogenous) 줄기세포를 활성화하기 위한 성체 심장 줄기세포의 능력에 의해 매개될 것이다.

따라서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포에 의해 매개되는 이러한 모든 활동에서 이들 세포는 세포 사멸 또는 염증 반응이 관여하는 질환의 치료를 위해 유용한 치료제로 이용된다. 또한, 이들 세포는 병리적으로 새로운 조직 형성이 요구되는 조직 재생을 촉진하는데 사용될 수 있다. 이러한 점에서, 인간 허혈성 심장 질환은 이들 세포를 사용하여 치료될 수 있다. 성체 심장 줄기세포는 질병의 급성기(acute phase) 중 세포 손실을 제한하고, 더 빠른 재생을 허용하도록 염증 반응을 조절하며, 최종적으로 새로운 조직 형성을 촉진하기 위해 내성 조직 상주 세포를 활성화할 것이다.

성체 심장 줄기세포 및 성체 심장 줄기세포 군집

본 발명은 성체 심장 줄기세포, 특히, 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집의 형태를 제공하고, 상기 성체 심장 줄기세포(CSCs) 또는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집은 SOX17 및 GATA4 마커를 발현하고, 상기 성체 심장 줄기세포 또는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집은 Oct4, Nanog 및 c-kit 마커를 발현하지 않는다.

"성체"는 줄기세포가 배아가 아니라는 것을 의미한다. 일 구체예에서, "성체"는 후배아(post-embryonic) 또는 "산후(post-natal)"를 의미한다. 본 발명의 줄기세포에 대하여, "성체 줄기세포"는 줄기세포가 배아 단계 이후 성장 단계에서 동물의 조직 또는 장기로부터 분리되는 것을 의미한다. 일 측면에서, 본 발명의 줄기세포는 산후 단계에서 분리될 수 있다. 상기 세포는 쥐, 생쥐, 돼지 또는 인간과 같은 포유동물로부터 분리될 수 있다. 성체 줄기세포는 배반포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리를 기원으로 하여 정의되는 배아 줄기세포와는 다르다. 본 발명에 따른 줄기세포는 비-배아(non-embryonic) 조직으로부터 분리될 수 있고, 신생아, 아동, 청소년 및 성인 환자를 포함할 수 있다. 일반적으로 본 발명의 줄기세포는 비-신생아 포유류, 예를 들면 비-신생아 인간, 쥐, 생쥐 또는 돼지로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 줄기세포는 인간으로부터 분리되므로, 인간 성체 심장 줄기세포 또는 인간 성체 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집이다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포 및 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집은 분리될 수 있다.

"분리"는 참조하는 세포 또는 세포 군집이 자연적 환경에 있지 않은 것을 나타낸다. 상기 세포 또는 세포 군집은 실질적으로 주변 조직으로부터 분리되어진다. 일부 구체예에서, 상기 세포 또는 세포 군집은 실질적으로 주변 조직으로부터 분리되는데, 샘플은 적어도 약 75%, 일부 구체예에서는 적어도 약 85%, 일부 구체예에서는 적어도 약 90% 및 일부 구체예에서는 적어도 약 95% 성체 줄기세포를 포함한다. 즉, 상기 샘플은 실질적으로 주변 조직으로부터 분리되는데, 상기 샘플은 성체 줄기세포 이외의 물질 중 약 25% 미만, 일부 구체예에서는 약 15% 미만 및 일부 구체예에서는 약 5% 미만을 포함한다. 이러한 비율 값은 중량 또는 세포수에 의한 비율을 말한다. 상기 용어는 그들이 기원한 유기체에서 제거되어 배양물에 존재하는 세포를 포함한다. 또한, 상기 용어는 그들이 기원한 유기체에서 제거되어 순차적으로 어떤 유기체에 재삽입된 세포를 포함한다. 재삽입된 세포를 포함하는 유기체는 상기 세포가 제거되어진 동일한 유기체일 수 있고, 또는 다른 유기체, 예를 들면, 동일 종의 상이한 개체일 수 있다.

새로운 성체 심장 줄기세포의 마커 프로파일 및 성체 심장 줄기세포의 새로운 군집이 추가적인 마커의 존재 및/또는 부재에 의해, 또는 특정 프로파일의 존재 및 부재 마커의 조합에 의해 정의될 수 있다. 각각의 경우에, 마커의 특정 조합은 세포 군집 내 특정 프로파일 및/또는 군집 내에 개체 세포의 특정 프로파일 마커로서 존재할 수 있다.

따라서, 본 발명의 일 구체예에서는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포, 여기서 상기 세포는 다음의 마커를 발현하고: (a) SOX17 및 GATA4, 여기서 상기 세포는 다음의 마커를 발현하지 않고: (b) Oct4, Nanog, c-kit 및 텔로머라아제 역전사효소, 여기서 상기 세포는 하나 이상의 다음 세포 형태로 분화할 수 있다: 지방 세포, 골세포, 내피 세포 및/또는 평활근 세포. 또한, 본 발명은 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집을 제공하며, 여기서 상기 세포 군집은 다음의 마커를 발현하고/하거나: (a) SOX17 및 GATA4, 여기서 상기 군집은 다음의 군집을 발현하지 않고: (b) Oct4, Nanog, c-kit 및 텔로머라아제 역전사효소, 여기서 상기 세포는 하나 이상의 다음 세포 형태로 분화될 수 있다: 지방 세포, 골세포, 내피 세포 및/또는 평활근 세포.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집은 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 SOX17 및 GATA4를 발현한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집은 검출 가능한 수준에서 SOX17 과 GATA4 모두를 발현한다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한한 성체 심장 줄기세포 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%는 검출 가능한 수준에서 SOX17 및 GATA4를 발현한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 검출 가능한 수준에서 SOX17 및 GATA4를 발현한다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집의 세포는 하나 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL-8 머커 모두를 발현할 수 있다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 상기 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한한 군집의 세포는 또한 IL-1β 및 선택적으로 CD49c 및/또는 HHEX를 발현할 수 있다. 이러한 의미에서, 일 특정 구체예에서, 상기 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포의 세포 중 적어도 약 95%는 검출 가능한 수준에서 IL-1β, CD49c 및 HHEX를 발현할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실질적으로 순수한한 성체 심장 줄기세포 군집 내에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 검출 가능한 수준에서 IL-1β, CD49c 및 HHEX를 발현한다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 실질적으로 순수한한 군집의 성체 심장 줄기세포는 검출 가능한 수준에서 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX를 발현하고, 선택적으로 하나 이상, 즉 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14를 발현하거나, 검출 가능한 수준에서 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL8 마커 모두를 발현한다. 일 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집 내에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%는 검출 가능한 수준에서 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX를 발현하고, 선택적으로 하나 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14를 발현하거나, 검출 가능한 수준에서 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL8 마커 모두를 발현한다. 보다 구체적으로 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집 내에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 검출 가능한 수준에서 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX를 발현하고, 선택적으로 하나 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14를 발현하거나, 검출 가능한 수준에서 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL8 마커 모두를 발현한다.

일 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 검출 가능한 수준에서 CD31를 발현한다. 일 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집 내에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 60%(바람직하게는 적어도 62%)는 검출 가능한 수준에서 CD31를 발현한다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 하나, 둘 또는 다음의 마커 모두를 발현하고/하거나: (a) CD31, CD49c 및/또는 HHEX, 여기서 상기 세포는 하나, 둘 또는 다음의 마커 모두를 발현하지 않는다: (b) CD133, Nkx2.5 및/또는 CXCR4 단백질. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 하나, 둘 또는 다음의 마커 모두를 발현하고: CD31, CD49c 및/또는 HHEX, 여기서 상기 세포의 군집은 둘 또는 다음의 마커 모두를 발현하지 않는다: CD133, Nkx2.5 및/또는 CXCR4 단백질.

따라서, 본 발명의 일 구체예는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포를 제공하며, 상기 세포는 다음의 마커를 발현하고: SOX17, GATA4, IL-1β, CD31, CD49 및 HHEX; 여기서 상기 세포는 다음 마커를 발현하지 않고: Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질, Nkx2.5, 및 CD133, 여기서 상기 세포는 하나 이상의 다음의 세포 형태로 분화할 수 있다: 지방 세포, 골세포, 내피 세포 및/또는 평활근 세포. 또한, 본 발명은 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 제공하는데, 상기 세포의 군집은 다음의 마커를 발현하고: (a) SOX17, GATA4, IL-1β, CD31, CD49 및 HHEX, 여기서 상기 세포는 다음의 마커를 발현하지 않고: (b) Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질, Nkx2.5, 및 CD133, 여기서 상기 세포는 하나 이상의 다음의 세포 형태로 분화할 수 있다: 지방 세포, 골세포, 내피 세포 및/또는 평활근 세포.

바람직하게는, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 심근 조직으로부터 분리된다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 c-kit, Oct4 및/또는 Nanog를 발현하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 검출 가능한 수준에서 c-kit, Oct4 및/또는 Nanog의 어느 것도 발현하지 않는다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%는 검출 가능한 수준에서 c-kit 단백질을 발현하지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 검출 가능한 수준에서 c-kit 단백질을 발현하지 않는다.

추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%는 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 c-kit 단백질, Oct4 및/또는 Nanog를 발현하지 않는다. 보다 구체적으로 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 세포는 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 c-kit 단백질, Oct4 및/또는 Nanog를 발현하지 않는다.

추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집에서 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%는 검출 가능한 수준에서 c-kit 단백질, Oct4 및 Nanog의 어느 것도 발현하지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 세포는 검출 가능한 수준에서 c-kit 단백질, Oct4 및 Nanog의 어느 것도 발현하지 않는다.

또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 또한 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 Nkx 2.5, CXCR4 단백질 및/또는 CD133을 발현하지 않는다. 추가적인 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 검출 가능한 수준에서 Nkx 2.5, CXCR4 단백질 및 CD133의 어느 것도 발현하지 않는다.

추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 세포의 적어도 약 95%는 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 Nkx 2.5, CXCR4 단백질 및/또는 CD133을 발현하지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포에서 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 검출 가능한 수준에서 하나 이상의 Nkx 2.5, CXCR4 단백질 및/또는 CD133을 발현하지 않는다. 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 세포는 또한 하나 이상, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6를 발현하지 않거나, CD45, CD34, CD11b, 텔로머라아제 역전사효소, CD40, CD80 및/또는 CD86 마커 모두를 발현하지 않는다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 세포는 마커 SOX17 과 GATA4의 조합으로 발현하고, 마커 Oct4, Nanog 및 c-kit의 조합으로 발현하지 않는다. 일 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 군집에서 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 95%, 예를 들면, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 마커 SOX17과 GATA4의 조합으로 발현하고, 마커 Oct4, Nanog 및 c-kit의 조합으로 발현하지 않는다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 세포는 마커 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX의 조합으로 발현하고, 마커 Oct4, Nanog, c-kit, Nkx2.5, CXCR4 단백질, 텔로머라아제 역전사효소 및 CD133의 조합으로 발현하지 않는다. 일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 세포의 적어도 약 95%, 예를 들면 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 마커 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX의 조합으로 발현하고, 마커 Oct4, Nanog, c-kit, Nkx2.5, CXCR4 단백질, 텔로머라아제 역전사효소 및 CD133의 조합으로 발현하지 않는다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 마커 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX의 조합으로 발현하고, 마커 Oct4, Nanog, c-kit, Nkx2.5, CXCR4 단백질, 텔로머라아제 역전사효소 및 CD133의 조합으로 발현하지 않는다. 일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 세포의 적어도 약 95%, 예를 들면, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 마커 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX의 조합으로 발현하고, 마커 Oct4, Nanog, c-kit, Nkx2.5, CXCR4 단백질, 텔로머라아제 역전사효소 및 CD133의 조합으로 발현하지 않는다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 검출 가능한 수준에서 마커 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX 와 선택적으로 하나 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14를 발현하거나, 마커 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL8 모두의 조합으로 발현하고, 검출 가능한 수준에서 마커 Oct4, Nanog, c-kit, Nkx2.5, CXCR4 단백질, 텔로머라아제 역전사효소 및 CD133과 선택적으로 CD45, CD34, CD11b, 텔로머라아제 역전사효소, CD40, CD80, 및/또는 CD86 조합으로 발현하지 않는다. 추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 적어도 약 95%, 예를 들면 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 검출 가능한 수준에서 마커 SOX17, GATA4, IL-1β, CD49c 및 HHEX 와 선택적으로 하나 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13을 발현하거나, 마커 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL8 모두의 조합으로 발현하고, 검출 가능한 수준에서 마커 Oct4, Nanog, c-kit, Nkx2.5, CXCR4 단백질, 텔로머라아제 역전사효소 및 CD133과 선택적으로 CD45, CD34, CD11b, 텔로머라아제 역전사효소, CD40, CD80 및/또는 CD86 조합으로 발현하지 않는다.

일부 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 마커 SOX17, GATA4, WT1, HEY2 및 KDR 모두를 발현한다. 추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 마커 SOX17, GATA4, CD44, CD90, CD105, CD166, WT1, HEY2 및 KDR 모두를 발현한다. 바람직하게는, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 다음의 마커를 발현하고/하거나: CD31, IL-1β, CD44, CD90, CD105, CD166, WT1, HEY2, KDR, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-b, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 및/또는 IL- 8, 다음 마커를 발현하지 않는다: CD45, CXCR4 단백질, Nkx 2.5, CD34, CD11b, CD40, CD80 및/또는 CD86.

추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 마커 Oct4, Nanog, c-kit, CD40, CD80 및 CD86의 어느 것도 발현하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 마커 Oct4, Nanog, c-kit, CD45 및 텔로머라아제 역전사효소의 어느 것도 발현하지 않는다.

본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 다음 마커 발현 프로파일이 있다: SOX17, GATA4, CD44, CD90, CD105, CD166, WT1 및 KDR 양성, 및 Oct4, Nanog, c-kit, CD45 및 텔로머라아제 역전사효소 음성.

또한, 본 발명은 제한하진 않지만, 지방 조직 또는 골수, 심외막 세포, 내피 세포, 혈관 주위 세포 및 섬유아세포로부터 MSC와 같은 본 발명의 성체 CSC 이외 본 발명 세포의 성체 CSC의 적어도 약 0.5%(다른 측면에서 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 70%)를 포함하는 "혼합된 세포의 군집"을 제공한다. 바람직하게는, 혼합된 세포의 군집은 MSC를 포함한다. 보다 바람직하게는 혼합된 세포 군집의 세포의 적어도 약 80%(다른 측면에서 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%)는 MSC이다.

본 발명의 실질적으로 순수한 군집에 관하여 "실질적으로 순수한"은 줄기세포의 군집을 의미하는데, 여기서 상기 세포 군집은 본 발명의 성체 심장 줄기세포만을 필수적으로 포함한다. 즉 상기 세포 군집은 실질적으로 순수하다. 본 발명의 여러 측면에서, 상기 세포 군집은 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 80%(다른 측면에서 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100%)를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "마커"는 생물학적 분자의 존재, 농도, 활성 또는 인산화 상태가 감지되고 세포의 표현형을 확인하는데 사용될 수 있는 임의의 생물학적 분자를 포괄한다.

용어 "발현된"은 세포 내 마커의 존재를 설명하는데 사용된다. 발현되어진 것으로 간주되기 위해서, 마커는 검출 가능한 수준으로 존재 해야한다. "검출가능한 수준"은 PCR, blotting, 면역형광(immunofluorescence), ELISA 또는 FACS 분석과 같은 표준 실험 방법 중 하나를 사용하여 검출될 수 있음을 의미한다. "발현된"은 한정되진 않지만, 검출 가능한 단백질의 존재, 인산화 상태의 단백질 또는 mRNA 인코딩 단백질을 의미할 수 있다. 세포마다 적어도 약 100사본의 세포 발현 수준에 상응하는, PCR 30싸이클 이후, 바람직하게는 PCR 37싸이클 이후 발현이 합리적으로 검출될 수 있다면, 유전자는 본 발명의 세포 또는 본 발명의 군집 세포에 의해 발현되는 것으로 간주된다. 용어 "발현한다"와 "발현"은 사응하는 의미이다. 임계치 이하의 발현 수준에서, 마커는 발현할 수 없는 것으로 간주된다. 본 발명의 성체 줄기세포 내 마커의 발현 수준과 예를 들면 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)와 같은 또 다른 세포 내 동일한 마커의 발현 수준의 비교는 동일한 종으로부터 분리되어진 두 가지 종류의 세포를 비교함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게는 이 종은 포유동물이고, 보다 바람직하게 이 종은 인간이다. 이러한 비교는 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 실험을 이용하여 편리하게 수행될 수 있다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 군집은 그들이 특정 마커에 대해 특징적인 발현 수준이 있다는 점에 특징이 있다. 이는 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포 군집이 검출 가능한 수준에서 많은 특정 마커를 발현한다는 것을 나타낸다.

군집에서 본 발명의 세포의 적어도 약 80%가 마커의 검출 가능한 발현을 보인다면, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 군집은 상기 마커를 발현하는 것으로 간주된다. 다른 측면에서 군집에서 본 발명의 세포의 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 그 이상은 상기 마커의 검출 가능한 발현을 나타낸다. 특정 측면에서, 군집에서 본 발명 세포의 적어도 약 99% 또는 100%는 마커의 검출 가능한 발현을 나타낸다. 발현은 RT-PCR 실험, 면역블로팅법(immunoblotting), 면역 형광검사(immunofluorescence), ELISA 와 같은 임의의 적절한 수단을 사용하여 또는 형광 활성 세포 분리(FACS)를 통해 검출될 수 있다. 상기 리스트는 단지 예로서 제공되며 제한적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해해야 할 것이다.

대안적인 구체예에서, 마커의 발현 수준이 조절 세포, 예를 들면 간엽 줄기세포 내에서 보다 본 발명의 세포 내에서 더 크다면, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 마커를 발현하는 것으로 간주된다. 이러한 맥락에서, "보다 더 큰(greater than)"은 본 발명의 세포 군집에서 마커 발현 수준이 조절 세포 내 수준보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20배 크다는 것을 의미한다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에서 SOX17과 GATA4의 mRNA 전사 수준은 골수 또는 지방 조직으로부터 얻어진 간엽 줄기세포에서 동일한 mRNA 전사의 대응하는 수준보다 적어도 약 10배 이상, 예를 들면 10배 이상, 약 15배 이상 또는 약 20배 또는 그 이상이다.

일 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에서 WT1, HEY2의 mRNA 전사 수준은 지방 조직으로부터 얻어진 간엽 줄기세포에서 동일한 mRNA 전사의 대응하는 수준보다 적어도 약 10배 이상, 예를 들면 약 10배 이상, 약 15배 이상 또는 약 20배 또는 그 이상이다.

추가적인 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 군집의 심장 줄기세포에서 IL-1α, 콜로니 자극 인자 3(CSF3) 및/또는 PDGF-β의 mRAN 전사 수준은 지방 조직으로부터 얻어진 간엽 줄기세포에서 동일한 mRNA 전사의 대응하는 수준보다 적어도 약 5배 이상, 예를 들면 5배 이상, 약 10배 이상 또는 약 15배 이상 또는 그 이상이다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포 군집의 실질적으로 순수한 군집은 또한 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포 군집의 실질적으로 순수한 군집이 검출 가능한 수준에서 특정 마커 또는 조합 또는 마커를 발현하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 이들 중 대부분은 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 표시다. 여기에 정의된 바와 같이, 이러한 마커는 음성 마커가 될 수 있음을 말한다.

일부 구체예에서, 본 발명에 존재하는 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 80%가 마커의 검출 가능한 발현을 나타내지 않는다면, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집은 마커를 발현하지 않는 것으로 간주된다. 다른 구체예에서, 본 발명에 존재하는 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 97% 또는 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 또는 100%는 마커의 임의의 검출 가능한 발현을 나타내지 않는다. 또, 검출 가능한 발현의 결여는 RT-PCR 실험, 면역블로팅법, 면역 형광검사, ELISA의 이용 또는 FACS 사용을 통해 검증될 수 있다.

세포에서 세포당 약 100사본 미만의 발현 수준에 상응하는, PCR 30싸이클 수준에서 합리적으로 발현이 검출될 수 없다면, 및/또는 면역 형광검사, 면역블로팅법, ELISA 또는 FACS 에 의해 용이하게 검출될 수 없다면, 여기서 기술된 마커는 본 발명의 성체 심장 줄기세포에 의해 발현되지 않는 것으로 간주된다.

본 발명의 특이적 마커

본 발명에서 언급된 마커는 마커에 대한 특정 기준 서열(reference sequence) 및 이들 마커의 임의의 공지된 오솔로그(orthologs)를 포함한다. 상기 마커는 SOX17, GATA4, KDR, WT1, CCL2, IL-1α, IL-8, IL6, G-CSF, CXCL1, sICAM-1, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I, CD45, CD34, CD11b, 텔로머라아제 역전사효소, CD40, CD80, CD86, CD31, IL-1β, CD49c, HHEX, CXCR4 단백질, Nkx 2.5 및 CD133를 포함한다.

용어 Nanog는 Nanog 및 2410002E02Rik, ENK, ecat4 homeobox transcription factor Nanog 및 homeobox transcription factor Nanog-delta 48에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 Oct-4는 Oct-4 및 Pou5fl, POU domain 클래스 5 transcription factor 1, Oct-3, Oct-3/4, Oct3, Otf-3, Otf-4, Otf3-rs7 및 Otf3g에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 c-kit는 c-kit 및 CD117, Fdc, Gsfsco1, Gsfsco5, Gsfsow3, SCO1, SCO5, SOW3, Ssm, Tr-kit 및 KIT에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 TERT는 TERT 및 텔로머라아제 역전사효소, EST2, TCS1, TP2, TRT, hEST2 및 telomerase catalytic subunit에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 SOX17은 Sox17 및 NG_028171.1 GI:325053743에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD90은 CD90 및 Thy1, thymus cell antigen 1, theta, T25, Thy-1, Thy-1.2, Thy1.1 및 Thy1.2에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD166은 CD166 및 Alcam, activated leukocyte cell adhesion molecule, AI853494, BEN, DM-GRASP, MGC27910, MuSC 및 SC1에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 cd11b는 cd11b 및 Itgam, integrin alpha M, CD11b/CD18, CR3, CR3A, F730045J24Rik, Ly-40, MAC1, Mac-1, Mac-1a, CD11B (p170); Mac-1 alpha; cell surface glycoprotein MAC-1 alpha subunit; complement component receptor 3 alpha, complement component receptor 3 alpha-a, complement receptor type 3, leukocyte adhesion receptor MO1 및 macrophage antigen alpha에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD29는 CD29 및 ITGB1, integrin, beta 1 fibronectin receptor, beta polypeptide, MDF2, MSK12, FNRB, GPIIA, MDF2, MSK12, VLAB, OTTHUMP00000046253, OTTHUMP00000063731, OTTHUMP00000063732; OTTHUMP00000063733, fibronectin receptor beta subunit, integrin VLA-4 beta subunit 및 integrin beta 1에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD105는 CD105 및 ENG, endoglin, RP11-228B15.2, END, FLJ41744, HHT1, ORW 및 ORW1에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 Gata-4는 Gata-4 및 GATA-4 zinc-finger transcription factor에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD31은 CD31 및 PECAM1, platelet/endothelial cell adhesion molecule, CD31/EndoCAM, PECAM-1 및 CD31/EndoCAM adhesion molecule에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 IL-1β는 IL-1b 및 IL-1β, IL1-BETA, IL1F2 및 catabolin에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD49c는 CD49c 및 ITGA3, GAP-B3, VCA-2, VLA3a, antigen identified by monoclonal antibody J143 및 MSK18에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 HHEX는 HHEX 및 HEX, HOX11L-PEN 및 PRHX에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CXCR4 단백질은 CXCR4 단백질 및 fusin 또는 CD184, D2S201E, FB22, HM89, HSY3RR, LAP3, LCR1, LESTR, NPY3R, NPYR, NPYRL, NPYY3R 및 WHIM에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 Nkx 2.5은 Nkx 2.5 및 CHNG5, cardiac-specific homeo box, CSX, CSX1, HLHS2, NKX2-5, NKX2E, NKX4-1 및 VSD3에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

용어 CD133은 CD133 및 prominin 1, PROM1, MCDR2, STGD4, CORD12, RP41, AC133, MSTP061, PROMLI, hProminin, hematopoietic stem cell antigen 및 prominin-like 1에 한정되지 않지만 포함하고, 이들의 임의의 오솔로그를 포함한다.

세포 형태 및 기타 특징

본 발명의 성체 심장 줄기세포의 군집은 독특한 형태를 가진 세포로 구성된다. 통상적으로, 종래 기술에서 공지된 심장공 유래 세포(cardiosphere derived cell)는 직경이 적어도 20㎛이다. 그러나, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 일반적으로 더 작으며, 약 20㎛ 미만의 직경을 갖는다. 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 평균 직경은 ≤18㎛, ≤17㎛, ≤16㎛, ≤15㎛, ≤14㎛ 또는 더 작다. 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 평균 직경은 ≥약 10㎛ 내지 ≤약 15㎛의 범위이다. 추가적인 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 90%, 예를 들면 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 직경은 ≥약 10㎛ 내지 ≤약 15㎛의 범위이다.

그들의 상대적으로 작은 크기가 그들을 관상 동맥, 및 기타, 혈관 투여에 더 적합하게 되기 때문에 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 형태는 치료적 적용에서 세포 군집에 특별히 유용하게 된다. 예를 들면, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포는 특별히 관상 동맥, 관상 정맥 및/또는 직접 심근에 투여하는데 특히 매우 적합하다. 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집은 주사에 의해 또는 카테터(catheter)를 통해 투여하는 것이 매우 적합하다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포는, 즉 세포가 클론을 형성할 수 있는, 클론원성 능력(clonogenic capacity)을 갖는다. 용어 "클론원성"은 본 발명의 세포의 클론 증식 능력에 관한 것이다. 상기 용어는 시딩된 후 단일 세포는 증식하고 원 배양을 재현할 수 있는 것을 전달하고자 한다.

일부 구체예에서, 단일 세포로서 시딩된 후, 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 10%가 하나의 세포 배양으로 증식하고 확립되는 경우, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집은 클론원성 능력을 갖는다고 간주된다. 일부 구체예에서 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집의 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 15%, 일부 구체예에서 적어도 약 20%, 일부 구체예에서 적어도 약 25% 및 일부 구체예에서 적어도 30% 또는 그 이상은 클론원성 능력을 갖는다.

실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집 또는 본 발명의 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 또한 자가 재생이 가능하다. 즉, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 모세포(mother cell)와 같은 마커 발현 및 발달 잠재력의 동일한 특성 패턴을 갖는 딸세포(daughter cell)를 생기게 할 수 있다. 이러한 특성은 마커 발현의 패턴을 상실하지 않고 다중 패시지(passage)를 수행하기 위한 본 발명의 세포 배양 능력에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 무한히 패시지될 수 없다. 본 발명의 성체 줄기세포는 특성에 어떠한 변화 없이 20회까지 복제될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 성체 줄기세포는 특성에 어떠한 변화없이 50회까지 복제될 수 있다.

본 발명의 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집 또는 본 발명의 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 또한 고도의 게놈 안정성을 나타낸다. "고도의 게놈 안정성"에 있어서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집은 비교 게놈 혼성화 분석(Genome Hybridization analysis)을 이용하여 염색체 변형의 증거 없이 5회까지 패시지될 수 있고, 증식되고/되거나, 개체에 투여될 수 있는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집에서 세포의 ≤ 약 25%, 예를 들면 ≤ 약 20%, ≤ 약 15%, ≤ 약 10% 또는 그 이하는 임의의 염색체 변형를 나타낸다. 용어 "염색체 변형"은 염색체 구조가 정상적인, 예상되는 염색체 구조와 다르게 임의 재배열된 염색체 구조를 포함한다. 예로서, 상기 용어는 염색체 전좌, 염색체 절단 및 염색체 다중화 또는 손실을 포함한다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포는 현탁액 배양시 심장공을 형성할 수 있다. 용어 "심장공"은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 심장 줄기세포 클론으로 구성되는 의사-배아체(pseudo-embryoid bodies)를 포함한다. 본 출원에서 동일어로 사용되는 "배아체" 또는 "의사-배아체"는 본 출원에서 주어진 배양 조건하에서 다른 세포 유형으로 분화하기 시작하는 세포의 집합체이다.

특정 구체예에서, 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 20%가 의사 배아체를 형성할 수 있다면, 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 의사 배아체를 형성할 수 있는 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 성체 줄기세포 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 적어도 약 25%, 적어도 약 30% 도는 적어도 약 35% 또는 그 이상은 배아체를 형성할 수 있다.

종래, 이러한 의사 배아체는 handing drop method에 의해 제조되었다. 그러나 음전하로 코팅되지 않은 세균 배양 접시의 성장 배지에서 배양되는 경우, 본 발명의 세포는 용이하게 배아체를 형성한다. 상기 정의는 한정되도록 의도하지 않으며, 배아체의 생산에 대한 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 초-저 부착 접시에 저밀도로 플레이팅하는 경우, 의사 배아체를 형성하는 본 발명의 세포의 능력은 본 발명의 성체 줄기세포가 아닌 동일한 조직으로부터의 배양체 내에 존재하는 다른 세포로부터 분리 및 선별을 위하여 이용될 수 있는 자가 재생에 대한 그들의 능력이다. 또한, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 세포 이동 분석에서 단핵구 이동 및/또는 단핵구 수집을 유도할 수 있다. 바람직한 세포 이동 분석은 실시예 3D에 기재되어 있다. "단핵구 이동 또는 수집을 유도할 수 있는"에 있어서, 이는 본 출원에 기재된 바와 같이 세포 이동 분석에서 하부 챔버(chamber)에 위치할 때 본 발명의 성체 줄기세포의 성장을 위해 이전에 사용된 배양 배지가 간엽 줄기세포(MSC)를 성장하기 위해 이전에 사용된 배양 배지에 의해 유도된 속도보다 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상 속도로 5미크론 세포막 기공을 통해 하부 챔버로 이동하기 위해 상부 챔버에 위치하는 단핵구를 유도하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 단핵구 증식을 유도할 수 있다. "단핵구 증식을 유도하는"에 있어서, 단핵구와 함께 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 공동-배양은 단핵구가 단핵구 단독 또는 MSC와 함께 공동-배양된 단핵구의 증식 기저 속도보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20배 또는 그 이상 빠르게 증식하도록 하는 것을 의미한다. 단핵구 증식은 본원에 기재 또는 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.

단핵구 수집, 이동 및/또는 증식을 유도하기 위한 능력은 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 치료적 적용에 중요할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 발명자는 개체에 투여한 후, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 단핵구 수집 및 증식을 유도하는 것으로 판단된다. 다음으로, 단핵구는 개체의 면역 반응을 조절하는 역할을 수행한다. 또한, 단핵구의 존재는 개체에 혈관 형성을 유도할 수도 있다.

또한, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 T 림프구 반응을 조절할 수도 있다. T 림프구 반응의 조절은 당업계에 공지 또는 본원에 기재된 임의의 분석에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 분석은 실시예 3E에 제시되어 있다. "T 림프구 반응 조절"에 있어서, 이는 본 발명의 성체 심장 줄기세포가 활성화된 T-세포 증식을 조절할 수 있고, 특히 조절 T 세포 군집을 활성화 및 증식할 수 있고/있거나, CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포를 하향-조절할 수 있는 것을 의미한다. 특정 구체예에서, 조절 T-세포와 함께 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 포함하는 현탁액의 공동 배양은 단독 배양된 조절 T-세포와 비교하여 증식하는 조절 T-세포의 비율이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 그 이상 증가한다. 또 다른 특정 구체예에서, PHA-활성화된 T-세포와 함께 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 포함하는 현탁액의 공동-배양은 단독 배양된 PHA-활성화된 T-세포와 비교하여 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포의 증식이 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소한다. 또 다른 구체예에서, Mitomycin C로 처리된 본 발명의 성체 심장 줄기세포로 공동-배양되는 경우, IL2 + CD3/CD28 Dynabeads로 활성화된 인간의 기본 T 림프구의 복제 횟수는 본 발명의 성체 심장 줄기세포가 없는 음성 대조군과 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 감소된다.

이러한 T-림프구 조절 특성은 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 낮은 면역원성에 기여할 수 있고 따라서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명의 혼합된 군집은 차례로 이들을 치료에 사용하기에 적합하고 동종 세포로서 관리에 적합하게 한다. 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 약한 면역원성 프로파일을 나타낸다. 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집 또는 본 발명의 혼합된 군집에서 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 마커 CD40, CD80 및/또는 CD86을 발현하지 않는다. 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 낮은 면역원성 및 약한 면역원성 프로파일은 세포가 수용자의 면역 시스템에 의해 급성 거부 반응을 피할 수 있도록 하여 수용자로부터 제거를 방지 및/또는 지연하도록 한다. 따라서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 치료 효과가 나타내기에 충분한 상당한 시간 동안 수용자에 남아있다. 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 능력이 손상된 조직에서 흉터 형성을 방지하고 심근 재생을 촉진하는데 기여하기 때문에 수용자의 면역 반응을 조절하는 능력은 또한 치료적 적용에서 유용하다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포는 시험관 내 또는 생체 내 어디에서도 면역 반응을 유발하지 않고 또는 대상에 동종 세포 군집의 주입을 유발하도록 예상되는 것보다 실질적으로 더 약한 면역 반응을 유발한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 성체 심장 줄기세포 및/또는 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집의 세포의 적어도 약 70%가 면역 반응을 유발하지 않는다면, 성체 심장 줄기세포 및/또는 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집은 면역 반응을 유발하지 않는 것으로 간주된다. 일부 구체예에서, 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집의 세포의 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 그 이상은 면역 반응을 유발하지 않거나 단지 약한 면역 반응을 유발한다. 바람직하게는 본 발명의 세포는 면역 반응을 매개하는 항체를 유발하지 않거나 생체 내 체액성 면역 반응을 유발하지 않고, 또는 동종 세포의 주입시 유발될 것으로 예상되는 것보다 더 약한 반응을 유발하지 않는다.

"약한 면역 반응"에 있어서, 이는 본 발명의 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 실질적으로 순수한 군집에 의해 유발되는 면역 반응은 조절 동종 세포 또는 세포 군집에 의해 유발되는 대응하는 면역 반응 수준의 약 40%, ≤ 약 30%, ≤ 약 25%, ≤약 20% 또는 ≤ 약 10% 또는 그 이하의 수준 미만인 것을 의미한다.

면역 반응의 결여, 또는 약한 면역 반응의 존재는 임의의 통상적인 수단을 사용하고 실시예, 바람직하게는 실시예 4A에 기재된 바와 같이 분석할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 주입된 세포에 대한 동종 항체의 수준이 MSC 또는 비-매칭된 개체로부터 최종적으로 분화된 세포와 같은 주입된 조절 세포에 대한 동종 항체의 수준의 10% 미만인 경우, 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 실질적으로 순수한 군집의 성체 심장 줄기세포는 면역 반응을 유발하지 않는 것으로 간주되거나, 단지 약한 면역 반응을 유발하는 것으로 간주될 것이다. 구체적으로, 본 발명의 주입된 세포에 대한 동종 항체의 수준은 MSC 또는 비-매칭된 개체로부터 최종 분화된 세포와 같이 주입된 조절 세포에 대한 동종 항체의 수준의 ≤ 약 9%, ≤ 약 8%, ≤ 약 7%, ≤ 약 6%, ≤ 약 5%, ≤ 약 4%, ≤ 약 3%, ≤ 약 2%, ≤ 약 1%, ≤ 약 0.5% 또는 그 이하이다.

특히 바람직한 구체예에서, 주입된 세포 또는 본 발명의 세포의 군집에 대한 동종 항체의 수준은 유동 세포 계측법(flow cytometry)와 같은 종래 수단에 의해 검출 가능하지 않다.

일 구체예에서, 매칭되지 않는 개체로부터 T 세포로 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집의 배양 후 유도되는 IL2, IFNλ, TNFβ, IL4, IL5, IL10, IL3, TNFα 및/또는 TGFβ의 하나 이상의 발현 수준이 최종적으로 분화된 세포 또는 비-매칭된 개체로부터 분리된 MSC로 동등한 T 세포의 배양 후 하나 이상의 IL2, IFNλ, TNFβ, IL4, IL5, IL10, IL3, TNFα 및/또는 TGFβ의 발현 수준의 약 50% 미만인 경우, 성체 심장 줄기세포 및/또는 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집은 면역 반응을 유발하지 않는 것으로 간주되거나 또는 단지 약한 면역 반응을 유발하는 것으로 간주될 것이다. 일부 구체예에서, 매칭되지 않는 개체로부터 T 세포로 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집의 배양 후 유도되는 IL2, IFNλ, TNFβ, IL4, IL5, IL10, IL3, TNFα 및/또는 TGFβ의 하나 이상의 발현 수준은 최종적으로 분화된 세포 또는 비-매칭된 개체로부터 분리된 MSC로 동등한 T 세포의 배양 후 하나 이상의 IL2, IFNλ, TNFβ, IL4, IL5, IL10, IL3, TNFα 및/또는 TGFβ의 발현 수준의 약 40%, 약 30%, 약 25%, 약 20% 또는 약 10% 또는 미만이다. 특정 구체예에서, 매칭되지 않은 개체로부터 T 세포로 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집의 배양 후 유도되는 IL2 와 IFNλ 둘다의 수준은 비매칭된 개체로부터 동등한 T 세포로 최종적으로 분화된 세포의 배양 후에 유도되는 IL2와 IFNλ 둘다의 발현 수준의 약 50%(예를 들면, ≤ 약 40%, ≤ 약 30%, ≤ 약 25%, ≤ 약 20% 또는 ≤ 약 10% 또는 그 이하)미만이다.

또 다른 구체예에서, 상기 기재된 분석에 의해 생성된 결과적인 면역 반응은 분석에서 T 세포의 증식 속도를 검출함으로써 측정될 수 있다. 일 구체예에서, 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집으로 배양 후 매칭되지 않은 개체로부터 T 세포의 증식 속도가 최종적으로 분화된 세포 또는 비-매칭된 개체로부터 분리된 PBMC로 배양 후 동등한 군집의 2배 속도의 약 50% 미만인 경우, 본 발명의 실질적인 성체 심장 줄기세포 군집은 면역 반응을 유발하지 않는 것으로 간주될 것이다. 일부 구체예에서, 매칭되지 않은 개체로부터 T 세포로 분리된 성체 심장 줄기세포의 배양 후 유도되는 증식 속도는 비-매칭된 개체로부터 분리되는 최종적으로 분화된 세포로 동등한 T세포 군집의 배양 후 T세포 2배 속도의 약 40%, 약 30%, 약 25%, 약 20% 또는 약 10% 또는 그 이하이다.

상술한 분석은 단지 예시적으로 제공되며, 총망라하고자 하는 것은 아니다. 당업자는 이용될 수 있는 다양한 대안적인 분석을 인식하고 있을 것이다. 바람직한 분석은 구체예에서 설명된다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포는 또한 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic factor)를 분비할 수 있다. 항-세포사멸 인자의 분비는 본원에 기재된 바와 같이 특히 실시예 3F에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 항-세포사멸 인자의 분비는 본 발명 세포의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 증식을 위해 사용되는 배양 배지 또는 MCS의 증식을 위해 사용되는 배양 배지에 노출된 손상된 심근 세포의 세포 생존 능력을 비교하여 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에 노출된 세포의 세포 생존 능력은 대조군보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10배 또는 그 이상 크다.

또한, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 예를 들면, 내생 심근 세포(endogenous cardiomyocytes)의 재생을 유도, 새로운 근육 형성 및/또는 심장 조직의 흉터 형성 및 재형성을 함으로써 심장-재생을 촉진할 수 있다. 심장-재생의 촉진을 측정하기 위한 바람직한 분석은 실시예 4C에 제시되어 있다.

또한, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 현재 성체 심장 줄기세포는 다분화능도 있다. "다분화능"은 여러 계통으로부터 세포 유형을 생성할 수 있지만 제한된 수의 계통으로만 생성될 수 있음을 의미한다.

특히, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집에서 세포는 다음 세포 형태 중 하나 이상으로 분화할 수 있다: 지방 세포, 골세포, 내피 세포, 심근 및/또는 평활근 세포.

본 발명의 성체 심장 줄기세포의 군집의 생성 방법

심장 조직에서 심장 줄기세포를 제조하는 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명은 심장 줄기세포 및/또는 본 발명에 따른 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 성체 심장 줄기세포의 군집에서 고유의 많은 마커를 확인하기 위하여, 발명자는 다음의 단계를 포함하는 상기 군집의 제조 방법을 개발하였다:

(a)성체 심장 줄기세포의 군집을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계; 및

(b)적어도 SOX17 및 GATA4를 발현하는 세포를 선택하는 단계.

상기 선택은 임의의 통상적인 수단에 의해 적어도 SOX17 및 GATA4의 발현을 검출하고, 이들 마커를 발현하지 않는 세포를 폐기함으로써 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 펠렛(pellet)은 (a) 단계 후에 얻고 SOX17 및 GATA4에 대한 mRNA의 높은 수준을 발현하는 세포는 추가 처리를 위해 선택된다.

본 발명의 방법은 (b)단계에서 선택된 세포를 증식하시키는 (c)단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 성체 심장 줄기세포의 군집을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계;

(b) 적어도 SOX17 및 GATA4를 발현하는 세포를 선택하는 단계; 및

(c) (b) 단계에서 선택된 세포를 증식하는 단계.

상기 증식 단계는 많은 수의 세포를 포함하는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 제공한다. 그러므로 증식 단계는 본 발명에 기재된 치료적 적용과 같은 후속 용도로 이용 가능한 본 발명 세포의 군집 크기를 증가시키는데 유용하다.

본 발명의 방법은 적어도 SOX17 및 GATA4을 여전히 발현하는 증식 단계 (c)의 결과인 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 확인하는 (d)단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 (c)단계에서 증식된 세포에 적어도 SOX17 및 GATA4의 발현을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 구체예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명에 따른 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 성체 심장 줄기세포의 군집을 포함하는 현탁액을 제공하는 단계;

(b) 적어도 SOX17 및 GATA4을 발현하는 세포를 선택하는 단계;

(c) (b) 단계에서 선택된 세포를 증식하는 단계; 및

(d) 적어도 SOX17 및 GATA4을 여전히 발현하는 증식 단계(c)의 결과인 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 확인하는 단계. 바람직하게는, 증식 단계(c) 결과인 실질적으로 순수한 군집의 줄기세포를 확인하는 단계는 적어도 SOX17, GATA4 및 IL-1β을 발현하고, 다음 마커를 발현하지 않는다: Oct4, Nanog, C-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질 및 Nkx2.5; 및 다음 세포 형태 중 하나 이상으로 분화할 수 있는 세포를 선택적으로 확인: 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및 평활근 세포.

본 발명의 방법은 성체 심장 줄기세포의 군집을 포함하는 임의의 공지된 현탁액으로부터 시작할 수 있다. 그러나, 특정 구체예에서, 상기 방법은 또한 성체 심장 줄기세포의 군집을 포함하는 초기 세포 현탁액의 제조를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 세포 현탁액은 심장 생검(heart biopsy)(예를 들면 심장 수술 동안 획득, 심장 카테터리즘(catheterism) 중 생검 카테터에 의해, 또는 희생된 동물의 심장으로부터)과 같은 심장 조직으로부터 제조된다. 따라서, 상기 구체예에서, 본 발명의 방법은 심장 조직으로부터 성체 심장 줄기세포의 군집을 분리하고 세포 선택 전 상기 세포 군집을 증식하는 단계를 포함한다. 상기 구체예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함한다:

(a) 심장 조직으로부터 세포를 포함하는 현탁액을 제조하는 단계;

(b) 성체 심장 줄기세포의 군집을 분리하는 단계;

(c) 상기 성체 심장 줄기세포의 군집을 증식하는 단계; 및

(d) 적어도 SOX17 및 GATA4를 발현하는 세포를 선택하는 단계.

바람직하게는, (d) 단계는 적어도 SOX17, GATA4, IL-1β 및 임의로 CD31를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하고, 다음의 마커를 발현하지 않는다: Oct4, Nanog, C-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 및 Nkx2.5; 그리고 다음과 같은 세포 유형 중 하나 이상으로 분화할 수 있다: 지방세포, 골세포, 내피세포 및 평활근 세포.

심장 조직에서 성체 심장 줄기세포의 군집을 분리하는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 특정 구체예에서, 심장 조직에서 세포는 심근 세포를 제거하기 위해 여과되고 CD45-양성 세포에 대하여 면역 고갈된다. 고갈된 세포는 선택적으로 CD117 (c-kit)-양성 세포에 대하여 면역 선택될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 c-kit 음성이므로, 발명자는 이 단계는 선택적이며, 만약 존재한다면 진정한 면역 선택을 초래하지 않을 수도 있다고 믿는다. 이 단계는 단지 추가적인 크기 여과 단계를 나타내고 임의의 면역 선택 항체 또는 전혀 항체를 포함하지 않는 비드를 여과에 의해 대체할 수 있는 것이 가능하다. 대안적으로, 초기에 CD117에 대한 면역 선택을 이용하여 분리된 세포는 c-kit를 발현하는 성체 심장 줄기세포의 초기 군집을 초래할 수 있다. 그러나, 본 발명의 실질적으로 순수한 성체 심장 줄기세포 군집은 c-kit음성으로, 초기에 존재할 수 있는 임의의 c-kit 발현은 후속 선택 단계 또는 선택 및 증식 단계에서 손실됨을 의미하는 것이 명백하다. 상기 세포의 마커 프로파일은 상기 방법의 단계 사이, 특히, 성체 심장 줄기세포의 군집을 포함하는 초기 현탁액과 선택 단계 결과로 얻어진 세포 사이에서 변경할 수 있다.

상기 성체 심장 줄기세포의 군집을 증식하는 단계는 세포 성장에 도움이 되는 적합한 조건하(예를 들면, 3% O₂ 분위기)에서 증식 배지에 성체 심장 줄기세포의 분리된 군집이 성장하는 단계를 포함할 수 있다. 그 다음 성체 심장 줄기세포의 증식된 군집은 워킹 셀 뱅크(WCB)를 만들어서 동결 보존될 수 있다. 예를 들면, 성체 심장 줄기세포의 군집은 WCB를 만들기 위해서 21번의 복제 후 패시지 4에 동결 보존될 수 있다. 그 다음 상기 세포의 발현 프로파일은 분석될 수 있다.

추가적인 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 심근 조직으로부터 세포를 포함하는 현탁액을 제조하는 단계;

(b) 성체 심장줄기세포의 군집을 분리하는 단계;

(c) 상기 성체 심장 줄기세포 군집을 증식하는 단계;

(d) 복수의 세포주를 포함하는 하나의 워킹 셀 뱅크(WCB) 또는 하나의 세포주를 각각 갖는 워킹 셀 뱅크를 제조하는 단계;

(e) 워킹 셀 뱅크 또는 적어도 SOX17 및 GATA4을 발현하는 워킹 셀 뱅크에서 이들 세포주를 선택하는 단계; 바람직하게는 워킹 셀 뱅크 또는 SOX17, GATA4, IL-1β 및 선택적으로 CD31을 발현하는 워킹 셀 뱅크에서 이들 세포주를 선택하고 다음의 마커를 발현하지 않는다: Oct4, Nanog, C-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질 및 Nkx 2.5; 및 세포가 다음 세포 유형 중 하나 이상으로 분화할 수 있는 것을 선택적으로 확인하는 단계: 지방 세포, 골세포, 내피 세포 및 평활근 세포.

(f) 선택된 세포주를 증식하는 단계; 및

(g) 최종적으로 적어도 SOX17 및 GATA4의 발현을 확인하는 단계, 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집, 바람직하게는 적어도 OX17, GATA4, IL-1β 및 선택적으로 CD31의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집, 및 다음 마커의 발현의 부재:Oct4, Nanog, C-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질 및 Nkx2.5.

본 발명의 상기 방법의 특정 구체예에서, 단계 (b)와 (c) 사이에 추가적인 선택 단계가 있는데, 추가 처리를 위해 적어도 SOX17 및 GATA4을 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 세포가 17번의 복제를 포함할 수 있는 적어도 3 패시지 동안 증식되어진 이후 추가 선택 단계는 수행된다. 3패시지에서, 세포 펠렛을 수득하고 SOX17 및 GATA4에 대한 mRNA의 높은 수준을 발현하는 세포를 선택하여 워킹 셀 뱅크를 형성하도록 추가 증식된다. 상기 세포 표현형은 유동세포 분석기(flow cytometry) 및 qPCR에 의해 WCB 단계에서 확인되고, 세포들은 증식되어 최종 생성물을 얻는다.

본 발명의 임의의 방법에서, 선택 단계 및/또는 하나 이상의 추가 마커(들)에 대한 선택 또는 하나 이상의 추가 마커(들)의 검출을 또한, 선택적으로 포함한다. 이들 마커는 WT1, HEY2, KDR, PDGF, CCL2, IL1α및/또는 CSF3. 일 특정 구체예에서, 선택 단계(들)은 마커 SOX17, GATA4, WT1 및 HEY2 모두를 발현하는 세포에 대한 선택하는 것을 포함한다. 추가적인 특정 구체예에서, 선택 단계는 마커 SOX17, GATA4, KDR, PDGF-β, CCL2, IL1α및 CSF3 모두를 발현하는 세포에 대한 선택하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 확인 단계는 세포가 마커 SOX17, GATA4, WT1 및 HEY2 모두를 발현하는지 확인하는 것을 포함한다.

본 발명에서 용어 "워킹 셀 뱅크"는 종래의 의미로 사용되고 당업자에게 잘 이해될 것이다. "워킹 셀 뱅크"는 마스터 세포 은행 또는 분리된 세포의 일차 군집에서 유도된 세포의 배양이고, 본 발명의 약제 조성물을 생산(또한 "최종 생성물"이라 함)하는데 사용될 수 있는 세포 배양 생성물의 제조에 사용하기 위한 것이다.

다른 방법으로 본 발명의 세포를 발생시킬 수도 있지만, 본 발명자는 적어도 SOX17 및 GATA4를 발현하는 세포에 대한 선택 단계가 청구된 줄기세포 군집의 모든 유리한 특성을 보유하는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 생산 효율을 증가시킨다는 것을 발견하였다.

WCB에서 선택되어진 세포 및/또는 세포주는 그 다음 해동 및 증식될 수 있다. 일부 구체예에서, 선택된 세포주는 (25번 복제 축적된) 패시지 5까지 증식될 수 있으며 따라서 세포 품질을 분석하는 최종 생성물(FP)을 만든다. 품질 관리(QC)는 최종 생성물의 확인, 순도 및 안정성을 보장하기 위해 제조 공정 중에 수행될 수 있다.

성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집, 최종적으로 적어도 SOX17 및 GATA4의 발현을 확인하는 최종 검증 단계는 품질 제어 목적을 위해 유용하고, 최종 생성물이 본 발명에 따른 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집임을 확인하는데 유용하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 기재된 방법에 의해 수득되거나 수득할 수 있는 성체 심장 줄기세포 및 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집까지 연장된다.

성체 심장 줄기세포의 군집은 당업계에 공지된 임의의 적합한 배지에서 분리될 수 있다. "배양 배지" 또는 "배지"는 당업계에서 인식되고, 일반적으로 임의의 물질 또는 살아있는 세포의 배양을 위해 사용되는 임의의 물질 또는 제제(preparation)를 말한다. 세포 배양에 관련하여 사용되는 "배지"는 세포 주위 환경의 구성요소를 포함한다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상(phase)과 재료(materials)의 혼합물일 수 있다. 배지는 세포 성장을 유지하지 않는 액체 배지뿐만 아니라 액체 성장 배지도 역시 포함한다. 또한, 배지는 한천, 아가로스(agarose), 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스와 같은 젤라틴 배지를 포함한다. 대표적인 기체 배지는 페트리 접시(petri dish) 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체(support)에서 성장한 세포가 노출되어진 기체 상을 포함한다. 또한, "배지"는 아직 세포와 접촉되지 않은 경우에도, 세포 배양에 사용하고자 하는 재료를 말한다. 다시 말해, 세균 배양을 위해 제조된 영양이 풍부한 액체 배지이다. 유사하게, 물 또는 다른 액체와 혼합될 때 세포 배양에 적합한 분말 혼합물을 "분말 배지(powdered medium)"라고 한다. "제한 배지(Defined media)"는 화학적으로 정의된(일반적으로 정제된) 구성요소로 만들어진 배지를 말한다. "제한 배지"는 효모 추출물 및 소고기 국물과 같은 특성화가 약한 생물학적 추출물이 포함되어 있지 않다. "풍부 배지(rich medium)"는 특정 종의 대부분 또는 모든 생존 가능한 형태의 성장을 지원하기 위해 고안된 배지를 포함한다. 풍부 배지는 종종 복잡한 생물학적 추출물을 포함한다. "고밀도 배양의 성장에 적합한 배지"는 (온도 및 산소 전달 속도와 같은) 다른 조건이 이러한 성장을 허용할 경우, 세포 배양이 OD600의 3배 또는 그 이상에 도달하도록 허용하는 임의의 배지이다. "기본 배지"는 임의의 특수 영양소 보충을 필요로 하지 않는 많은 종류의 미생물 성장을 촉진하는 배지를 말한다. 대부분 기본 배지는 일반적으로 네 개의 기본적인 화학 그룹으로 이루어진다. 아미노산, 탄수화물, 무기염 및 비타민, 기본 배지는 일반적으로 혈청, 완충제, 성장 인자, 지질과 같은 보조제 및 이와 같은 것을 첨가하는, 보다 복잡한 배지를 위한 기초로서 작용한다. 일 측면에서, 성장 배지는 세포의 자가-재생 능력을 유지하면서, 본 발명의 세포의 성장과 증식을 지원하는데 필수적인 성자 인자를 갖는 복잡한 배지일 수 있다. 기본 배지의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, Eagles Basal Medium, Minimum Essential Medium, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Medium 199, Nutrient Mixtures Ham's F-10 및 Ham's F-12, McCoy's 5A, Dulbecco's MEM/F-12, RPMI 1640, 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 분리 배지는 EGF, bFGF, IGFII, 및 ITS를 포함한다. 분리 배지는 DMEM/F-12 배지, FBS, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin 및/또는 hEPO를 추가로 포함할 수 있다. 특정 바람직한 구체예에서, 분리 배지는 특정 농도에서 하나 이상의 다음 구성 요소를 포함한다:

ㆍ약 80-95%, 예를 들면 85-90%, 또는 86%, 87%, 88% 또는 89%의 농도에서 DMEM/FF-12배지;

ㆍ 약 5-15%, 예를 들면 7-13%, 8-12% 또는 9%, 10%, 11%, 또는 12% 의 농도에서 FBS;

ㆍ0.5-2%, 예를 들면 0.75%-1.5%, 0.8%-1.2% 또는 0.9%, 1% 또는 1.1%의 농도에서 또는 선택적으로 각각 100U/ml 및 100㎍/ml의 농도에서 Penicillin-Streptomycin;

ㆍ 약 5-15ng/ml, 7-13ng/ml, 8-12ng/ml 또는 9ng/ml, 10ng/ml, 11ng/ml 또는 12ng/ml의 농도에서 bFGF;

ㆍ 약 10-30mg/ml의 농도에서 EGF;

ㆍ 약 20-40ng/ml의 농도에서 IGF Ⅱ;

ㆍDIR 0.01-1x, 예를 들면 0.25-0.75x 또는 0.5x의 농도에서 ITS; 및/또는

ㆍ0.0001-0.05U/ml, 예를 들면 0.001-0.01U/ml, 0.0025-0.0075U/ml 또는 0.004-0.006U/ml 또는 0.005U/mldml 농도에서 hEPO.

특정 구체예에서, 분리 배지는 DMEM/F-12 배지, FBS, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin, EGF, bFGF, IGFII, ITS 및 hEPO 모두를 포함한다.

성체 심장 줄기세포의 군집은 당업계에서 공지된 임의의 적합한 배지에서 증식될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 증식 배지는 EGF, bFGF, IGFII 및 ITS을 포함한다. 증식 배지는 DMEM/F-12 배지, Neurobasal medium, FBS-ESCq, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin, B27, N2, 및/또는 β-mercaptoethanol을 추가로 포함할 수 있다.

특정 바람직한 구체예에서, 분리 배지는 특정 농도에서 다음 구성요소 중 하나 이상을 포함한다.

ㆍ약 40-50%, 예를 들면 42-45%, 또는 42%, 43%, 44% 또는 45%의 농도에서 DMEM/F-12 배지;

ㆍ약 40-50%, 예를 들면 42-45%, 또는 42%, 43%, 44% 또는 45%의 농도에서 Neurobasal 배지;

ㆍ 약 5-15%, 예를 들면 7-13%, 8-12%, 또는 9%, 10%, 11% 또는 12%의 농도에서 FBS-ESCq;

ㆍ 약 0.5mM 에서 5mM, 예를 들면 1mM-3mM, 1.5mM-2.5mM 또는 2mM의 농도에서 L-Glutamine;

ㆍ약 0.5-2%, 예를 들면 0.75-1.5%, 0.8-1.2% 또는 0.9%, 1%,또는 1.1% 농도에서 또는 선택적으로 각각 100U/ml 및 100㎍/ml의 농도에서 Penicillin-Streptomycin;

ㆍ 40-60μM, 예를 들면 45-55μM, 47-52μM 또는 50μM의 농도에서 β-mercaptoethanol;

ㆍ 0.01-1x, 예를 들면 0.25-0.75x 또는 0.5x의 농도에서 B27;

ㆍ 0.01-1x, 예를들면 0.25-0.75x 또는 0.5x의 농도에서 N2;

ㆍ 약 5-15ng/ml, 7-13ng/ml, 8-12ng/ml 또는 9ng/ml, 10ng/ml, 11ng/ml 또는 12ng/ml의 농도에서 bFGF;

ㆍ 약 10-30mg/ml의 농도에서 EGF;

ㆍ 약 20-40ng/ml의 농도에서 IGF Ⅱ; 및/또는

ㆍ약 0.01-1x, 예를 들면 0.25-0.75x 또는 0.5x의 농도에서 ITS.

특정 구체예에서, 증식 배지는 DMEM/F-12 medium, Neurobasal medium FBS ESCq, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin, B27, N2, β-mercaptoethanol, EGF, bFGF, IGFII 및 ITS 모두를 포함한다.

심장 줄기세포의 분리 및 폭발적인 증가를 위한 상기 정의된 배지의 사용은 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 특성을 갖는 소수의 세포에서 일어날 수 있다. 그러나 Lauden et al., (Circulation Research (2012) DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.112.276501)에서 정의된 바와 같이, 본 발명에 기재된 바와 같이 선택 단계가 없다면, 심장 줄기세포는 본 발명의 세포와 달리 Oct4와 Nanog 양성일 수 있다. 따라서, 본 발명에 기재된 선택 단계는 본 발명에 따른 큰 군집의 성체 심장 줄기세포를 제조하는데 유용하다.

본 발명의 방법은 세포 성장에 도움이 되는 임의의 적합한 조건하에서 수행될 수 있다. 대표적인 배양 조건은 약 30-40℃, 바람직하게는 약 35-38℃, 36-37.5℃ 또는 약 37℃의 온도를 포함한다. 산소 농도는 1-5%부터, 예를 들면 약 2-4% 또는 2.5-3.5% 또는 약 3%부터 일 수 있다.

치료 방법, 치료적 용도 및 약제학적 허용 가능한 조성물

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 얻어진 또는 수득되는 세포를 포함하는, 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 특히 세포 요법, 생체 내에서 조직 복구/재생의 유도를 포함한 허혈성 손상 및 심혈관 질환을 치료하는 방법 및 치료 사용에 적합하다. 본 발명의 성체 심장 줄기세포는 일반적으로 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집의 형성에서 치료 방법 및 치료 용도로 사용될 것이다.

따라서 본 발명은 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명의 혼합된 세포 군집을 수용 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공하고, 또한 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집을 치료에 사용하도록 제공할 수도 있다.

특히, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 심근 경색, 만성 허혈성 심근증, 심근 병증 및 만성 심부전과 같은 허혈성 손상 및 심혈관 질환을 치료하는데 유용하다. 본 발명의 면역 조절 능력으로 인해, 이들은 자가 면역 질환, 염증 치료, 만성 궤양 치료를 위해 사용될 수 있고 일반적으로 치유된다. 또한, 이들은 동종 이식 장기 거부 반응을 방지하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 세포가 혈관 신생 능력이 있기 때문에, 중증 사지 허혈증과 같은 허혈성 실신에 대해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 자가 면역 질환, 염증 치료, 만성 궤양을 치료하고, 본 발명의 성체 심장 줄기세포, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집, 본 발명의 혼합된 군집, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 수용 대상에 투여하는 것을 포함하는 상처 치유를 촉진하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 성체 심장 줄기세포, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집을 수용 대상에 투여하는 것을 포함하는 동종 장기 이식 거부 반응을 방지하기 위한 방법을 제공한다.

일반적으로 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 주입 또는 이식에 의해 대상의 체내에 삽입된다. 일반적으로 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 그들이 작용하고자 하는 조직으로 직접 주입될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥, 동맥, 관상동맥, 심근 내로 투입된다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포는 1×10⁶ 내지 50×10⁶ 세포의 투여량, 바람직하게는 25×10⁶ 내지 45×10⁶ 세포의 투여량, 보다 바람직하게는 35×10⁶ 내지 40×10⁶ 세포의 투여량, 및 가장 바람직하게는 38×10⁶ 세포의 투여량으로 투여될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 심근의 재생을 포함하는 심장 조직의 재생에 사용될 수 있다. 상기 구체예에서, 본 발명의 세포는 심장 내막을 통하여 손상된 심장 조직에 직접적으로 주입되거나 이식될 수 있다; 심근 내, 동맥 내에 세포를 주입하는 바늘 카테터(needle catheter)를 사용하여; 손상된 조직영역 또는 퇴행된 부분을 연결하는 동맥 내로 풍선 카테터를 사용하여; 손상된 조직을 배출하는 관상 정맥으로 세포를 주입함으로써. 심근의 치료를 위한 선택적인 구체예는 NOGA 시스템 또는 임의의 유사한 주입 시스템과 같은 시스템을 가지는 전기 매핑(mapping)으로 또는 전기 매핑 없이, 심장 내막을 통하여 트랜스 카테터를 주입한다. 일 구체예에서, 본 발명은 생체 적합성 임플란트에 선택적으로 부착된 본 발명의 성체 심장 줄기세포, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 심장 조직의 재생에 사용하기 위해 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 도는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 생체 적합성 임플란트에 부착되어 손상된 조직으로 이식될 수 있다. 상기 구체예 내에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 대상에 이식되기 전에, 시험관 내에서 생체 적합성 임플란트에 부착될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 다수의 부착물 중 어느 하나는 이식 전에, 임플란트에 세포를 부착하여 사용될 수 있다. 단지 구체예로서, 이러한 부착물은 섬유소(fibrin), 하나 이상의 인테그린군(integrin family)의 멤버, 하나 이상의 카테인군(cadherin family)의 멤버, 하나 이상의 선택군의 멤버, 하나 이상의 세포 부착 분자(CAMs), 하나 이상의 면역 글로블린군 및 하나 이상의 인공 부착물을 포함할 수 있다. 이 목록은 단지 구체예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것이 아니다. 하나 이상의 부착물의 임의의 조합이 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 대상에 매트릭스의 이식 전에, 매트릭스에 매립될 수 있다. 일반적으로, 상기 매트릭스는 대상의 손상된 조직으로 이식될 수 있다. 매트릭스의 구체예는 콜라겐 기반 매트릭스, 섬유소 기반 매트릭스, 라미닌(laminin) 기반 매트릭스, 섬유 결합소(fibronectin) 기반 매트릭스 및 인공 매트릭스를 포함한다. 상기 목록은 단기 구체예로서 제공되고, 제한하고자 하는 것은 아니다.

추가 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 매트릭스를 형성 성분과 함께 대상에 이식되거나 주입될 수 있다. 이것은 세포가 주입 또는 이식 다음 매트릭스를 형성하도록 할 수 있고, 대상 내에 적절한 위치에 세포가 남아 있게 한다. 매트릭스 형성 성분의 구체예로는 덱스트란, 에틸렌 옥사이드 함유 올리고머와 같은 fibrin glue liquid alkyl, 시아노아크릴레이트 모노머, 가소화제, 다당류, 폴록사머 및 플루오닉스와 같은 블록 공중합체, 트윈 및 트리톤 '8'과 같은 비이온성 계면활성제 및 인공 매트릭스 형성 성분을 포함한다. 상기 목록은 단지 구체예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 하나 이상의 매트릭스 형성 성분의 임의의 조합이 사용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

추가 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 미소구 내에 포함될 수 있다. 상기 구체예에서, 세포는 미소구의 중심에서 캡슐화될 수 있다. 또한, 상기 구체예에서, 세포는 미소구의 매트릭스 재료에 매립될 수 있다. 상기 매트릭스 재료는 임의의 적합한 생분해성 중합체를 포함할 수 있고, 알기네이트(alginates), 폴리 에틸렌 글리콜(poly ethylene glycol(PLGA)), 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 한정하진 않지만 포함한다. 상기 목록은 단지 구체예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.

치료 및 치료 방법에 사용하기 위하여, 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명 세포의 혼합된 군집은 치료적 유효량으로 대상에 전달될 것이다. 생체 내 또는 생체 외로 전달된 많은 세포는 다수의 변수(parameter)에 기초하며 대상의 체중, 조직 손상의 중증도, 및 대상 내 생존 세포의 수를 포함한다. 세포의 전형적인 개수는 약 1×10⁶ 내지 1×10⁸ 세포, 보다 구체적으로 체중 kg당 10⁵ 내지 10⁷ 세포일 수 있다. 일반적으로, 단일 치료법으로 대상에 전달되는 세포의 총 수는 약 1×10⁶ 내지 50×10⁶ 세포일 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 그들이 특히 치료적 용도로 사용하기에 매우 적합하도록 여러 특성을 갖는다. 특히, 낮은 면역원성, 수용자에 T 세포 반응을 조절하는 능력, 혈관신생을 유도하는 능력 및 심장-재생을 촉진하고 내생 심근의 재생을 유도하는 능력은 치료 효능에 모두 기여할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공 및/또는 심혈관 질환의 치료를 위해 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집을 치료용으로 제공하는데, 여기서 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 하나 이상의 다음 메커니즘에 의해 심장 조직 복구를 유도한다:

(a) 단핵구의 수집;

(b) 면역조절;

(c) 혈관신생의 활성화;

(d) 심장-재생을 촉진 및/또는

(e) 내생 심근의 재생 유도.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 성체 심장 줄기세포, 본 발명의 성체 심장 다능성 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집, 본 발명의 혼합된 군집 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하여, 심혈관 질환 또는 허혈성 손상으로 고통받고 있는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 낮은 면역원성 및/또는 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 면역 조절 능력은 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집이 급성 거부 반응을 방지 및/또는 투여 후 수용자 대상의 면역 시스템에 의한 제거를 방지하도록 한다. 따라서, 적어도 24시간, 예를 들면 36시간, 48시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일, 한달 이상의 기간 동안, 투여된 세포의 검출 가능한 양이 여전히 대상에 존재한다. 특정 구체예에서, 24시간 이후, 투여된 세포의 적어도 약 50% 또는 그 이상, 예를 들면 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상은 여전히 대상에 존재한다.

투여된 세포의 보유는 세포가 심혈관 또는 허혈성 질환을 치료하는데 그들의 기능을 수행하도록 한다. 예를 들면, 상기 세포는 약 24시간 이상, 예를 들면 최대 36시간, 48시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일, 한 달 이상 기간 동안 그들의 면역 조절 효과를 발휘, 단핵구 수집을 유도 및/또는 활성화, 혈관신생을 유도 및/또는 내생 심근의 재생을 유도할 수 있다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집으로 투여된 세포가 치료적 효과를 발휘하기 위해 충분한 시간 동안 대상에 남아 있을 수 있지만, 세포는 대상에 영구적으로 남아 있지는 않다. 치료적 효과를 발휘하기 위한 충분한 시간은 적어도 24시간이고 최대 한 달 이상 일 수 있다. 예를 들면, 세포는 최대 36, 48, 72시간, 4일, 5일, 6일, 1주일, 2주일 또는 한달 동안 남아 있을 수 있다.

성체 심장 줄기세포 및 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 추가로 유익한 특성은 실시예 4E에 기재된 바와 같이, 이들이 투여 후 면역 결핍 대상에 종양을 유발하지 않는다는 것이다.

성체 심장 줄기세포 및 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집은 또한 별도의 심장 독성의 증거 없이, 관상 동맥 내 투여에 의해 적어도 50×10⁶ 세포 투여량으로 투여된다. 본 발명의 맥락에서, 심장 독성은 허용되는 정상 한계 이상에서 특정 심장 효소의 상승된 수준의 존재 또는 부재를 검출함으로써 특정된다. 특히, cardio Troponin I (cTnI), Creatine Kinase-MB (CK_MB) 및/또는 Myoglobin(Mb)의 레벨은 심장 독성을 가리킨다. 실시예 4D에 기재된 바와 같이, 이들 효소의 수준은 대상에게 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 투여 후에도 상승되지 않는다. 본 발명은 또한 다음을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다: (a) 본 발명의 성체 심장 줄기세포, (b)본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집, 또는 (c) 본 발명 세포의 혼합된 군집 및 약제학적 허용 가능한 담체. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 1×10⁶ 내지 50×10⁶ 세포, 바람직하게는 25×10⁶ 내지 45×10⁶ 세포, 보다 바람직하게는 35×10⁶ 내지 40×10⁶ 세포, 가장 바람직하게는 38×10⁶세포를 포함한다.

약제학적으로 허용 가능한 담체는 세포 생존 능력을 지원하는 세포 배양 배지를 포함할 수 있다. 상기 배지는 일반적으로 수용자 내에서 면역 반응을 유발하지 않기 위해 무혈청일 것이다. 상기 담체는 일반적으로 버퍼링 및/또는 무발열원일 것이다.

약제학적 허용 가능한 담체 및 희석제는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산 매질을 포함한다. 이러한 담체와 희석제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 상기 용액은 바람직하게는 쉬운 세척력(syringability)이 존재하는 정도의 살균 유체이다. 많은 구체예에서, 제조 및 보관 조건하에서 상기 용액은 안정되고, 예를 들면 파라벤, 클로로 부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살의 사용을 통한 박테리아와 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존된다. 상기 목록은 단지 구체예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 성체 줄기세포 조성물인 용액은 본 발명에 기재된 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제 및, 필요하다면 여과에 의해 살균 되어진 상기 열거된 다른 성분을 성체 줄기세포에 도입함으로써 제조될 수 있다.

약제학적으로-허용 가능한 담체로서 역할 할 수 있는 재료 및 용액의 일부 구체예는 다음을 포함한다: (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; (4) 분말 트래거캔스; (5) 맥아(malt); (6) 젤라틴; (7) 활석(talc); (8) 코코아 버터 및 서포지터리 왁스(suppository waxes)와 같은 첨가제; (9) 땅콩 오일, 코튼시드 오일, 황화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일과 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 아가; (14) 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 무발열원 물; (17) 등장염; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충액; (21) 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 (22) 그밖에 약제학적 제형으로 이용되는 호환 가능한 무독성 물질. 상기 목록은 단지 구체예로서 제공되며, 제한하고자 하는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 동결 배지에서 냉동될 수 있다. 약 -20℃ 이하의 온도(예를 들면, 약 -40℃, 또는 약 -80℃ 이하의 온도)에서 세포의 생존 능력을 보존하는 임의의 배지는 동결 배지가 적합하다. 예를 들면, 동결 배지는 2.5% 에서 10% DMSO를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 동결 배지는 5-7.5% DMSO를 포함할 수 있다.

동결 배지는 본 발명에 기재된 배양 배지 또는 증식 배지에 기초하며, 추가로 소태아 혈청(foetal bovine serum) 또는 사람 혈청 또는 기타 단백질 또는 세포 해동후 세포 무결성을 유지할 수 있는 단백질의 혼합을 포함한다. 본 발명의 세포는 또한 덱스트란에 기초하여 무 단백질 배지에서 냉동될 수 있다.

해동 후, 본 발명의 세포는 투여 용액에 투여 또는 재부유(re-suspension) 전에, DMSO 또는 기타 동결 배지 성분을 제거하도록 세척할 수 있다. 투여 용액은 독성이 없이 환자에게 주입될 수 있는 생리적 해결책이 될 것이다. 투여 용액은 사람 혈청 알부민과 같은 3-5% 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 본 발명에 기재된 임의의 치료 방법 또는 치료 용도에 사용될 수 있다.

일반적 정의

숫자 값과 관련하여 용어 "약"은 숫자 값의 +/-10%를 의미한다. 또한, 숫자 값과 관련하여 용어 "약"은 숫자 값의 +/-5%를 포함한다.

용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 포함하는, 열린 의미(open sense), 추가 요소가 포함될 수 있는 것을 의미한다. 또한 용어 "구성되는"은 포괄하다 및 용어 "이루어지는" 및 "필수적으로 이루어지는"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "실질적으로 순수한"은 "완전히 순수하게"를 포함하고 이 용어와 함께 상호 교환적으로 사용될 수 있다.

도 1. 본 발명의 심장줄기세포의 생산을 위한 프로토콜의 개략도.
도 2. A) 본 발명의 심장 줄기세포(CSC)는 골수 또는 지방 조직 기원의 MSC와 비교할 때 (qPCR에 의해 결정된 바와 같이) SOX17 및 GATA4에 대한 높은 mRNA 발현을 갖는다. B) 단백질 발현 배열 연구에서 관찰될 수 있는 바와 같이, CSC는 SOX17 및 GATA4 단백질을 발현한다.
도 3. A) CSC에서 c-kit 발현이 없거나 매우 낮은 발현이 유동 세포 계측기 분석에 의해 관찰된다. c-kit(검은 선)의 대표적인 발현을 나타낸다. 회색으로 채워진 영역은 아이소타입 컨트롤(isotype control)을 나타낸다. B) 유동 세포 계측법 분석은 CSC가 그들 세포 세포막에 CD45, CD11b, CD34, CXCR4 및 CD133의 발현에 대해 음성임을 드러낸다. 아이소타입 컨트롤에 대한 CD45, CD11b, CD34, CXCR4 및 CD133(검은 히스토그램)의 발현을 나타낸다.
도 4. A) CSC는 텔로머라아제를 발현하지 않는다. 텔로머라아제의 촉매 서브 유닛의 비발현은 CSC에서 qPCR 분석에 의해 관찰되었다. B) CSC에서 Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP) 텔로머라아제 활성은 MSC 또는 HDF와 비교되었다. 활성이 없는 텔로머라아제는 CSCs에서 관찰되었다. C) 시험관 내에서 광범위한 증식 (> 30 군집 배가수(population doubling)) 후 인간 CSC의 세포화학적 분석이 노화와 관련된 β-galactosidase activity (SA-βGal)의 검출을 위하여 수행되었다.
도 5. A) CSC는 단백질 배열에 의해 분석된 Oct3/4 또는 Nanog를 발현하지 않는다. B) CSC는 웨스터 블롯(westem blot)에 의해 분석된 Oct3/4 또는 Nanog를 발현하지 않는다.
도 6. A) ELISA 연구는 워킹 셀 뱅크 및 최종 생산물(FP)에서 CSC가 얼마나 많은 양의 CCL2를 발현하는지 나타낸다. MSC는 기준 세포주로 사용되었다. B) 단백질 발현 배열 연구에서 관찰될 수 있는 바와 같이, CSC는 IL-8, IL-6, CXCL6, sICAM1 및 IL-1α 단백질을 발현한다.
도 7. CSC는 MHC 클래스 Ⅰ을 발현하지만, 이들은 co-stimulatory molecules CD40, CD80 및 CD86은 발현하지 않는다.
도 8. A) CSC 세포 크기는 분리 후 및 시험관 내 증식 후 분석된다. B) CSC는 분리 후 둥근 형태를 갖는다. C) CSC는 시험관 내 증식 중에 스트로머(stromal)와 같은 형태를 취득한다. D) CSC는 패시지 2(P2) 및 패시지 7(P7)에서 클론원성 능력을 갖는다. E) 및 F)는 단일 세포가 초저 부착판에 시딩될 때, CSC가 심장공을 형성하고 현탁액에서 성장할 수 있다.
도 9. A) 세포 이동 분석 트랜스-웰 플레이트. B) CSC는 단핵구를 통한 강한 수집 능력을 갖는다. C) CSC 활성화된 T 림프구에서 면역 조절 능력이 나타났다.
도 10. A) CSC에 의해 분비된 성장 인자는 생존을 촉진한다. B) CSC에 의해 분비된 인자의 전-생존 능력은 혈청 결핍 후 H9c2세포에서 또한 분석되었다.
도 11. A) 심장 계통에 CSC의 분화 가능성은 면역 형광법에 의해 분석된다. 특정 분화 배지에서 배양 후, CSC는 평활근, 혈관 내피 세포 및 심근 세포에 상응하는 마커의 발현을 나타내었다. B) 또한, 최적 배지에서 배양 한 후, CSC는 또한 지방 세포 및 골세포로 분화될 수도 있다. 지방 세포의 분화는 (세포질 지질 방울을 나타내도록) 오일 레드 O 염색에 의해 분석되고 골세포의 분화는 (칼슘 침전물을 표시하도록) 알라지린 레드 염색에 의해 확인되었다.
도 12. 중복 또는 삭제와 같은 염색체 변경 없이, 인간 여성 게놈에 대응하는 도면에 나타낸 비교 게놈 혼성화 분석이 관찰된다.
도 13. 동종 CSC는 관상 동맥 투여 후 강한 체액성 반응을 유도하지 않는다. A) 동종 돼지 CSC는 면역 경색 돼지의 관상 동맥으로 주입되고, 세포 투여 전 또는 15 또는 30일 후에 혈액 샘플을 수집한다. 30일에 동일 세포의 새로운 투여가 정맥 주입되고 두번째 주입후 3, 7, 15 및 30일에 혈액 샘플을 수집한다. B) 특정 면역반응 면역 글로블린(IgG 및 IgM)의 존재는 다른 혈액 샘플에서 분석되였다. 처음 30일 동안 주입된 세포에 대한 특정 면역 반응 IgG를 찾아내는 것은 불가능하였다. 반대로 두번째 주입후 7, 15 및 30일에 동종 CSC 특정 IgM 및 IgG의 존재가 관찰되었다. 이러한 결과는 투여 후, 동종 CSC가 강한 체액 반응을 유발하진 않지만, 두번째 투여 후 강하고 빠른 반응을 유도하는 면역 기억을 생성하는 면역 시스템에 의해 이들이 인식되고 아마도 제거된다는 것을 나타낸다.
도 14. CSC는 투입후 적어도 24시간 심장에 머문다. GFP 표지된 세포를 이용하는 추적실험은 CSC가 주입한 다음 경색 영역에 적어도 24시간 남아 있음을 증명하였다. 인간 CSC는 GFP(>)로 표지되고 이들이 경색된 후 7일에 면역 결핍 쥐의 심근에 주입하였다. 24시간 후 동물은 희생되었고 GFP 양성 세포의 존재가 조직학에 의해 분석되었다. 형광-표지된 미립구는 (화살 머리로 채워진) 투여 장소를 식별할 수 있는 세포와 함께 공동-주입되었다. 세포핵은 DAPI(*)로 염색되었다.
도 15. A) 면역 결핍 쥐가 전방 관상 하위 동맥(anterior coronary descendent artery)의 결찰에 의해 경색되었고, 다른 공여자로부터 CSC가 심근 내 이식되고 (5×10⁵), PBS와 함께 주입된 동물과 비교되었다. B) Masson's tricromic stain을 이용한 조직학적 분석은 또한 대조군과 비교할 때 세포와 함께 처리된 쥐에서 흉터 크기의 상당한 감소 및 환부 심근의 증가를 나타낸다.
도 16. 투여 용액(위약) 또는 투여량 50×10⁶ 인간 CSC는 건강한 돼지의 관상 동맥 내에 주입되었다. 심장 효소는 세포 투여 후 24시간에 기초하여 실험되었고 독성은 관찰되지 않았다.
도 17. 특정 프로브(TaqMan probes from Life Technologies)를 이용한 정량적 PCR(qPCR) 분석은 기준 세포주로서 사용된 MSC와 비교할 때, GATA4, SOX17, WT1, HEY2, KDR, HHEX 및 HAND2가 과발현되었음을 나타내었다. 유전자 GUSB는 내생 조절 유전자로서 사용되었다. 그 수치는 상대 정량(Relative Quantitation) Log2이다.
도 18. 유동 세포 계측법 분석은 CSC가 그들 세포 세포막에 높은 수준의CD166, CD90, CD44, CD105, CD31 및 CD49c를 발현하는 것을 나타낸다(검은 막대그래프). 아이소타입 컨트롤은 회색으로 채워진 막대 그래프로 나타낸다.

실시예

실시예 1 - 세포 분리 및 증식

본 발명의 세포는 (생쥐, 쥐, 돼지 등) 희생 동물의 우심방 부속기 및 심장에서 얻어진 심근 생검으로부터 분리되었다. 세포 현탁액은 생검을 작은 조각(< 1mm³)으로 잘게 썰어, 30분마다 3사이클 동안 collagenase type 2(Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ, USA)로 처리함으로서 얻어졌다. 심근 세포는 40㎛ 세포 여과기를 사용하여 원심 분리 및 여과에 의해 제거되었다. 심장 줄기/전구(progeniter) 세포는 마이크로비드(Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach, Germany)를 사용하여 제조사 추천 사항에 따라 CD45-양성 세포의 면역 고갈 및 CSC의 선별 후 얻어졌다. 사용된 마이크로비드는 CS117(c-kit) 마이크로비드지만, CSC의 분리가 c-kit의 존재에 의존하지 않기 때문에, 다른 마이크로비드도 사용될 수 있다.

분리 후, 세포는 분리 배지에 마트리겔(BD Biosciences, Madrid, Spain)-코팅된 플레이트에 시드되었다(10% fetal bovine serum embryonic stem cell qualified (FBS ESCq)로 보충된 DMEM/F12 medium, L-Glutamine (2mM), Penicillin-Streptomycin (100 U/mL 및 100 μg/mL), bFGF (10ng/mL) 및 ITS (Invitrogen, Madrid, Spain and Saint-Aubin, France), IGF-II (30ng/mL) 및 EGF (20ng/mL) (Peprotech, Neuilly-sur-Seine, France) 및 hEPO (Sigma-Aldrich, Madrid, Spain)(표 1 참조).

표 1 - CSC 분리 배지

세포는 적절한 기능을 촉진하고 생리적/병리적 조건을 모방한 3% O₂ 분위기 하의 37℃에서 성장되었다. 세포 시딩 후 일주일, 분리 배지는 10% FBS ESCq, L-Glutamine, Penicillin-Streptomycin, B27 (1X), N2 (1X), β-mercaptoethanol(50μM), ITS 및 성장 인자(bFGF, IGF-II, EGF)로 보충된 DMEM/F12 및 Neurobasal medium (1:1)의 조합인 증식 배지로 대체되었다(표 2 참조).

표 2 - 증식 배지

세포는 3% O₂ 분위기의 증식 배지에서 성장하였고, 그 다음 워킹 셀 뱅크(WCB)를 만들기 위해 21번의 복제 후 패시지 4에서 동결 보존하였다. 세포의 발현 프로파일은 그 다음 분석되었다. 오른쪽 발현 프로파일 세포는 패시지 5(25 축적된 복제)까지 해동 및 증식되었고, 따라서 세포 품질을 분석하는 최종 생성물(FP)를 만들었다. 품질 관리(QC)는 최종 생성물의 확인, 순도 및 안정성을 보장하기 위해 제조 공정 중에 수행된다.

실시예 2 - CSC에서 mRNA 및 단백질 발현의 특징

A. CSC는 SOX17 및 GATA4 mRNA를 발현한다.

실시예 1의 방법에 의해 얻어진 심장 줄기세포(CSC)에서 SOX17 및 GATA4의 mRNA 발현은 골수 또는 지방 조직으로부터 간엽 줄기세포(MSC)와 비교되었다. CSC 및 MSC로부터 mRNA는 분리되었고, cDNA는 qPCR 및 발현 배열 실험으로 생산되었다.

발현 배열 실험에서, 지방 조직으로부터 1×10⁶ CSC 또는 MSC의 RNA는 Qiagen columns(RNeasy columns)을 사용하여 분리되었고, RNA 품질은 Bioanalyzer assay(Agilent Technologies)에 의해 분석되었다. RIN > 7을 갖는 RNA만이 Low Input Labeling Kit (Agilent Technologies)을 사용하여 증식되고 표지되었다. 상기 연구는 WCB 수준에서 8개의 다른 공여자 CSC 및 FP 수준에서 6개의 다른 공여자 CSC로 수행되었다. 참조 샘플로서, WCB에서 4개의 다른 공여자 MSC 및 FP에서 4개의 다른 공여자 것을 사용하였다. 마이크로어레이 발현 SurePrint G3v2, 60K platform이 사용되었고, 분석에는 GeneSpring v12.1 software를 사용하였다. 통계적 유의성(p-값 수정)은 One-Way Analysis of Variance(ANOVA)를 사용하여 계산되었고 multiple test(Benjamini-Hochderg)에 의해 수정되었다. 수정된 p-값 < 0.05은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 도 2A에 도시된 바와 같이, SOX17 및 GATA4 mRNA 발현은 지방 조직에서 MSCs 보다 CSCs에서 20배 이상이었다.

마이크로어레이 발현 분석의 확인은 qPCR을 사용하였다. CSC 및 인간 MSC가 수거되였고, 제조자의 지시에 따라 TRI-Reagent(Sigma-Aldrich)를 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. RNA 농도는 광도 측정법에 의해 결정되었다. cDNA는 제조자의 지시에 따라 SuperScript III First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) 를 사용하여 2㎍ RNA로 합성되었다. 합성된 cDNA는 1:10으로 희석되고, 50-200ng의 cDNA는 human-specific TaqMan probes(Applied Biosystems, 표 3 참조)을 사용하여 정량적 실시간 PCR(qPCR)로 수행하였다. qPCR 반응은 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 세번 수행되었다. PCR 반응은 StepOnePlus(Applied Biosystems) machine 기반으로 운영되었고, StepOne Software v2.2.2 및 Data Assist v3.0 software가 결과를 분석하는데 사용되었다. mRNAs의 발현은 beta Glucoronidase의 발현을 정상화하였다. RQ caculation (2-△△CT)인간 골수 MSC는 참고 세포주로서 사용되었다.

표 3 - TaqMan qPCR 분석을 위한 프라이머 리스트

도 2B에 나타낸 바와 같이, 인간 MSC에 관련된 CSC에서 SOX17 및 GATA4에 대한 mRNA 발현의 높은 수준은 상기 방법을 사용하여 확인되었다.

B. CSC 는 SOX17 및 GATA4 단백질을 발현한다.

단백질 발현 배열 연구는 GATA4 및 SOX17 mRNA가 번역되는지 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 10×10⁶ 세포의 펠렛(pellets)은 성장의 선형 위상 배양으로부터 제조되었고, PBS로 2번 세척되고, -80℃에서 건조 보관되었다. 혼성화를 수행하기 전에, 제조자의 지시에 따라 펠렛을 해동시키고, CSC 용해물을 제조하였다. 각 세포 용해물에 단백질 농도는 정량되었다.

배열 연구는 프로테옴 프로파일러 인간 배열 키트, 즉 proteome Profiler Human Cytokine Array Kit Panel A(ARY005) 및 인간 다능성 줄기세포 배열 키트(ARY010)를 사용하여 수행되었다. 용해물(200㎍의 단백질 추출물)은 배열로 존재하는 단백질에 대한 항체와 혼합되고(인간 사이토카인 및 줄기세포 조절 단백질), 그 다음 단백질-항체 복합체는 세포막에서 배양되었다. 항체 어레이 세포막과 함께 혼성화는 제조자의 지시에 따라 수행되었다. CSC는 SOX17 및 GATA4 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다(도 2B).

C. CSC는 CD166, CD90, CD40 및 CD105를 발현하지만 c-kit, CD45, CD34, 및 CD11b는 발현하지 않는다.

c-kit, CD45, CD34, CD11b, CD166, CD90, CD44 및 CD105의 발현은 유동 세포 계측법으로 측정되었다. 세포는 트립신-EDTA와 함께 분해되고, DMEM에 재현탁되었다. 세포 생존률은 Trypan Blue dye exclusion technique에 의해 > 85% 임이 밝혀졌다. 세포는 원심분리되고, 0.2-1.0×10⁶ cell/ml의 농도에서 PBS에 재현탁되었다. 염색 전에, 세포는 얼음에 20분 동안 PBS에서 1%(v/v) 인간 혈청으로 블로킹되었다. 약 0.5-3.0×10⁵ 세포가 표면 마커 특정 항체 및 아이소타입 매치된 대조군의 포화 농도로 염색되었다. 세포는 1시간 동안 4℃ 어두운 곳에서 배양되었다. 배양 후, 세포는 PBS로 2번 세척되었다. 일차 항체가 정제된 형태일 때, 상기 세포는 4℃ 어두운 곳에서 20분 동안 fluorochrome-conjugated species-specific anti-Ig antibody와 함께 추가로 배양되었다. 주어진 마커에 대한 양성 염색 세포의 수는 측정된 양성 이벤트의 2% 미만이 아이소타입 매치된 대조군에 의해 비특이적 결합을 대신하도록 설정된 게이트 내에 존재하는 세포의 비율에 의해 결정되었다. 최소 2,500이벤트가 각 분석에 의해 계산되었다. 세포 표면 마커의 발현은 제조자에 의해 권장된 희석에서 상업적인 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 분석되었다. 세포는 Epics XL flow cytometer(Beckman Coulter)를 사용하여 획득되었고, FCS Express 3 software를 사용하여 분석되었다.

표 4 - 유동 세포 계측법에 사용된 항체

도 3A에 나타낸 바와 같이, c-kit이 없거나 매우 낮은 발현은 CSC에서 관찰되었다. 유사한 결과가 두 개의 다른 항체(Miltenyi로부터 얻어진 하나 및 BD로부터 다른 하나)를 사용하여 획득되었다.

도 3B에 나타낸 바와 같이, CSC는 또한 계통 마커(liseages makers) CD45, CD11b, 및 CD34에 대해 음성인 것으로 밝혀졌다.

D. CSC 는 텔로머라아제를 발현하지 않는다.

CSC가 실시예 2A에 기재된 방법에 따라 텔로머라아제의 촉매 서브 유닛을 발현하는지 여부를 결정하기 위해, CSC는 qPCR에 의해 분석되었다. 종양 세포주 KG1 및 MCF7은 양성 대조군으로서 사용되었고, Human Diploid Fibroblast(HDF)뿐만 아니라 골수로부터 MSC(BM-MSC)는 음성 대조군으로서 사용되었다. 실시예 2A에 기재된 바와 같이, mRNA가 분리되었고, 텔로머라아제의 촉매 서브유닛의 발현은 특정 TaqMan 프로브를 사용하는 qPCR에 의해 시험하였다. 텔로머라아제의 촉매 서브유닛의 발현은 CSC에 검출되지 않았다(도 4A).

또한, CSC에서의 텔로머라아제의 활성은 텔로머라아제 활성의 형광 검출 및 실시간 정량에 기초하여 고도로 민감한 분석인 Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP)에 의한 MSC 또는 HDF와 비교되었다. 텔로머라아제 활성은 온도에 민감하고 85℃에서 비활성화 된다. 85℃에서 배양하거나 배양하지 않은 샘플로 텔로머라아제 활성을 비교하였다. 1×10⁶ CSC의 펠렛을 준비하여, TRAPEZE RT Telomerase Detection kit(CHEMICON)을 사용하는 텔로머라아제 활성 검출을 위해 사용되었다. 다른 수여자로부터 CSC 및 시험관 내 증식의 다른 단계에서 시험되었다. 세포주 K562 및 MCF7은 양성 대조 샘플로 사용되었다. 텔로머라아제 활성은 제조자에 의해 제공된 지시에 따라 분석되었다. PCR 반응은 StepOnePlus(Applied Biosystems)에서 실행하였다. 상이한 양의 텔로미어 서열을 갖는 표준 곡선을 수행하고, 텔로머라아제 활성 정량은 Quantification-Standard Curve software을 사용하여 분석되었다. 유의한 활성은 세 가지 세포 유형 중 어느 것에도 검출되지 않았다. 또한, 시험관 내 세포 증식 중 CSC에 텔로미어 길이의 감소가 검출되었고, 이들 세포는 텔로미어가 연장되지 않는다는 것을 나타낸다. 각 세포 분열과 함께 텔로미어 길이의 감소는 광범위한 시험관 내 세포 배양 후 궁극적으로 증식의 중단을 초래할 것이다.

E. 시험관 내에서 광범위한 증식 후 CSC의 노화

CSC가 시험관 내에서 광범위한(> 30 군집 분열) 증식 후 노화되는지 여부를 확인하기 위해 세포 화학적으로 분석되었다. 노화는 노화와 관련된 β-galactosidase activity(SA-βGal)를 기반으로 검출되었다. CSC는 시험관 내에서 증식되었고 chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indoylβ-D-galactopyranoside (X-gal)와 함께 pH 6에서 고정되고 배양되어 β-galactosidase에 의해 분해될 때 불용성의 파란색 화합물을 얻을 수 있다. 도 4C에 나타낸 바와 같이, 시험관 내 증식 후, 일부 CSC는 X-gal로 배양될 때 파란색이 되며, 따라서 이들 세포가 노화됨을 가리킨다.

F. CSC는 Oct3 /4 또는 Nanog를 발현하지 않는다.

상술한 바와 같이, 줄기세포 발달에 관여하는 다른 유전자의 발현은 단백질 발현 어레이를 사용하여 분석되었다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, Oct3/4 또는 Nanog의 발현은 관찰되지 않았다.

Oct3/4 발현은 또한 쥐 CSC와 인간 CSC에 세 가지 다른 항체를 사용하는 Western Blot에 의해 분석되였다. 1-5×10⁶ 세포의 세포 펠렛을 프로테아제 억제제의 혼합제로 보충된 RIPA 용해 완충액(20mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% Na-deoxicolate, 1% Triton X-100, 0.25% sodium dodecyl sulfate)에 용해시켰다. 전체 세포 추출물(WCE)의 단백질 농도는 Nanodrop를 사용하여 확인되었고, 동일한 양의 WCE(50㎍)는 Tris-glycine 겔에 로딩하고 0.45㎍ polyvinylidene fluoride membrane (PVDF)로 옮겨졌다. 세포막은 Tween(10 mM Tris-HCl, pH 8, 150mM NaCl, 및 0.05% Tween 20)와 함께 Tris-buffered saline로 세척되었고, Tween와 함께Tris-buffered saline 내 5% 무지방 우유 또는 1% BSA로 실온에서 1시간 블로킹한 다음, 제조자에 의해 권장된 농도로 상이한 1차 항체로 4℃에서 밤새 프로브 처리되었다. 면역 블롯은 ECL-plus로 발광 반응에 이어서 HRP-접합된 2차 항체로 처리되었다. 동일한 로딩이 항-β-액틴 항체로 재프로빙된 세포막에 의해 보장되었다.

표 5 - 웨스턴 블롯에 사용된 항체

NTERA 세포는 양성 대조군으로 사용되었다. CSC로부터 추출된 50㎍의 세포 단백질은 SDS-PAGE gel 상에서 실행시키고, 단백질을 니트로 셀룰로오스 막으로 이동시켜서, 특정 항체로 Oct3/4의 존재를 시험하였다(표 5 참조). 액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, Oct3/4 발현의 부족은 Western Blot에 의해 확인되었다.

G. WT1, HEY2 , KDR , HHEX 및 HAND2 mRNA 발현은 MSC에서 보다 CSC에서 더 높다.

CSC에서 WT1, HEY2, KDR 및 HHEX의 발현은 실시예 2A에 기재된 방법에 따른 발현 어레이를 사용하는, 지방조직으로부터의 MSC와 비교되었다. 표 6에 나타낸 바와 같이, CSC는 지방 조직에서 얻어진 MSC에서 보다 CSC에 WT1, HEY2, KDR 및 HHEX에 대한 적어도 20배 이상의 mRNA 전사를 발현하는 것으로 밝혀졌다.

표 6 - 지방 조직으로부터의 CSC 및 MSC에서의 WT1, HEY2 , KDR 및 HHEX의 상대적 발현

이러한 결과는 특정 TaqMan probes를 사용하는 qPCR에 의해 확인되었다(실시예 2A 참조). 도 17은 기준 세포주로서 사용된 MSC와 비교할 때, GATA4, SOX17, WT1, HEY2, KDR, HHEX 및 HAND2는 CSC에서 과다 발현되었다는 것을 나타낸다는 qPCR 분석 결과로 요약된다. 도 17에서 수치는 Log2의 상대 정량이다.

H. CSC 는 분비 인자 IL -1α, CSF , PDGF 및 IL - 1β를 과다 발현한다.

분비 인자 IL-1α, 클로니 자극 인자 3(CSF3), PDGF 및 IL-1β의 상대적 발현(변화 배수)는 mRNA 발현 어레이에 의해 지방 조직으로부터 MSC 대 CSC로 평가되었다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 분비 인자 IL-1α, CSF, PDGF 및 IL-1β의 mRNA 발현은 지방 조직으로부터 MSC에서 보다 적어도 10배 높았다.

표 7 - 지방 조직으로부터의 CSC 및 MSC에서 IL- 1α , CSF , PDGF 및 IL- 1β의 상대적 발현

I. CSC 는 많은 양의 CCL2 를 분비한다.

WCB 및 FB에서 CCL2의 분비 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. CSC는 10% 혈청으로 보충된 DMEM/F12:Neurobasal medium (1:1) 배지에 5000 cells/cm²로 시드되었다. 다음날, 배양 배지는 성장 인자 Insulin-like Growth Factor 2(IGF-II), basic Fibroblast Growth Factor(bFGF) 및 Epidermal Growth Factor(EGF)로 보충된 태아 혈청 없는 배지로 대체되었다. 세포 배양으로부터 상층액은 3일 후 수집되었고, 잔여물은 3분 동안 1500 x g에서 원심분리에 의해 제거되어 즉시 분석되었다. 인간 CCL2/MCP-1 Quantikine ELISA kit (R&D systems)은 제조자의 지시에 따라 사용되었다.

도 6A에 나타낸 바와 같이, CSC는 WCB와 FP 둘 다에서 많은 양의 CCL2을 발현한다. 대조적으로, MSC는 적은 양의 CCL2를 생산하였다.

J. CSC는 IL-8, IL-6, CXCL1 , sICAM1 , IL- 1α , IL- 1β , G- CSF 단백질을 과다 발현한다.

단백질 어레이 연구는 CSCs에 IL-8, IL-6, CXCL1, sICAM1, IL-1α, IL-1β, G-CSF 단백질의 발현 수준을 평가하기 위해 수행되었다. 골수로부터 간엽 줄기세포(MSC-BM)는 대조군 세포주로 사용되었다. R&D 인간 다분화능 줄기세포 항체 어레이가 사용되었다. CSC 용해물(200㎍의 단백질 추출물)은 줄기세포 조절과 관련된 단백질에 대한 항체와 혼합된 다음 단백질-항체 복합체는 단백질 정량을 위해 세포막에서 배양되었다.

도 6B에 나타낸 바와 같이, CSC는 MSC에서 보다 CSC에서 높은 수준의 G-CSF, IL-8, IL-6, CXCL1, sICAM-1, IL-1β 및 IL-1α 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.

K. CSC는 Nkx2 .5를 발현하지 않는다.

정량적 PCR(qPCR)는 기준 세포주로서 사용된 골수 MSC와 비교되는 CSC에서 Nkx2.5의 발현 수준을 결정하는데 사용되었다. mRNA는 이들 세포로부터 분리되었고 Nkx2.5의 발현은 특정 TaqMan probes를 사용하는 qPCR에 의해 평가되었다. Nkx2.5의 발현은 CSC에서 검출되지 않았다.

L. CSC는 CD31 및 CD49c 단백질을 발현하지만, CD133 또는 CXCR4 단백질을 발현하지 않는다.

CD31, CD49c, CD133 및 CXCR4 단백질의 발현은 실시예 2C에 기재된 방법에 따라 유동 세포계측법에 의해 평가되었다.

실시예 2C에서와 같이, 세포 수의 히스토그램 대 형광 세기는 각각의 항체 염색으로 수득되고, 잔해를 제거하기 위해서 세포는 순방향 대 사이드 산란 파라미터를 사용하여 게이트하였다. 발현 수준(형광 세기)의 관점에서, 양성 세포에 대응하는 히스토그램이 아이소타입 대조군 및/또는 음성 세포 이후 얻어진 이들로부터 명확히 분화될 수 있을 때, 게이팅 분석이 적용되었다. 낮은 형광 세기에 대해서, 마커 특정 및 비특정 아이소타입 매치된 컨트롤 항체, 둘 다에 세포의 결합으로 인한 부분적으로 오버랩하는 히스토그램의 영역 감산에 의해, 양성 세포의 수는 또한 확인되었다. 발현 수준을 정량화하는데 영역 감산 접근 방식을 사용하는 경우, 30% 이상 발현을 하면, 세포는 양성으로 간주되었다.

도 3B의 결과인 유동 세포 계측법은 CSC가 그 표면에 케모카인 수용체 CXCR4를 발현하지 않는다는 것을 나타낸다. CSC는 또한 ckit(CD117) 마커에 대해 음성이다(이미 언급한 바와 같이, 도 3A 참조). 대응하는 마커 항체에 의해 생성된 신호가 아이소타입 컨트롤에 의해 생성된 신호와 동일한 강도일 때, 이들 마커의 발현은 음성이다. 유사하게, CD133 발현은 CSC의 표면 세포막에서 유동 세포 계측법으로 검출되지 않는다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 특정 항-CD133 항체와 함께 CSC의 배양 후 관찰된 신호는 대조군 항체(회색 영역)에서 관찰되는 신호와 유사하였다.

CD31은 CSC의 군집 중 동종으로 발현된다. 항-CD31 항체에 CSC를 결합하여 생성된 히스토그램이 고유 피크와 균일한 분포를 도시하고, 아이소타입 컨트롤 히스토그램(고체 회색)에 상대적인 증가된 형광 강도를 나타내는 것이 도 18에서 관찰될 수 있다. 즉, CSC는 CD31 세포 표면 마커에 대하여 양성이다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 영역 감산 접근을 사용할 경우 CD31의 발현은 30% 이상이다. CD49c는 또한 100% CSC로 동종으로 발현되는 것을 보여준다.

실시예 3 - 시험관 내에서 CSC 표현형 특징의 분석

A. CSC는 낮은 면역원성 프로파일을 갖는다.

CSCs에서 공동-자극 분자 CD40, CD80 및 CD86 및 MHC 클래스 Ⅰ(또는 HLA 클래스 Ⅰ)의 발현은 실시에 2C에 기재된 유동 세포 계측법 어레이 방법을 사용하여 확인되었다. CSCs는 MHC 클래스 Ⅰ을 발현하는 것으로 밝혀졌지만, 공동-자극 분자 CD40, CD80 및 CD86을 발현하지 못하거나 매우 낮은 수준(< 2%)으로 발현한다.

B. CSC의 형태와 크기는 특이하다.

CSC의 크기는 분리 후 및 시험관 내 증식 후 분석되었다. 또한, 세포 크기는 동결 세포를 해동한 후 최종 생성물로 측정되었다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, 분리된 CSC 세포는 MSC 및 섬유아세포보다 작고, 이 작은 크기는 배양한 후에 유지된다. CSC의 평균 크기는 도 7에 나타낸 바와 같이, 직경 15㎛ 이하이고 10㎛보다 크다.

도 8B에 나타낸 바와 같이, CSC 세포는 분리 후 둥근 형태를 갖는다. 도 8C에 나타낸 바와 같이, 세포는 시험관 내 증식하는 동안 스트로머-같은 형태를 획득한다.

C. 클론원성 능력과 심장공을 형성하기 위한 CSC의 능력

CSC의 증식성 세포는 패시지 2(P2) 및 패시지 7(P7)에서 단일 세포를 ultra low adherent 96-well plates wells에 시딩함으로써 평가되었다. 심장공의 존재는 시딩 후 14일 및 21일에 현미경으로 육안으로 분석되었다. 도 8D-F에 나타낸 바와 같이, CSC는 패시지 2(P2) 및 패시지 7(P7)에서 클론원성 능력이 있음이 밝혀졌고, 심장공을 형성할 수 있으며, ultra low adherent plate에 시딩될 경우 부유하여 성장할 수 있다.

D. CSC는 단핵구 수집을 유도할 수 있다.

세포 이동 분석은 CSC가 다공성 막에 걸쳐 단핵구의 이동을 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 수행되었다. 5미크론 기공 크기 인서트 24-well migration chambers(Costar, USA)를 사용하였다. MonoMac-1 세포는 분석시에 지수상에 있도록 적절한 농도로 배양되었다. 상기 세포를 카운트하고, 두 번 세척하고 이동 챔버의 인서트(10㎕에 2.5×10⁵ 세포)에 위치시켰다. CSC의 세포 상등액, (골수로부터) MSC 또는 HDF에 상응하는 조건 배지는 well의 하부에 위치시켰다. 상기 세포는 5% CO₂, 37℃에서 240분 동안 배양되었다. 모든 지점에서 중복적으로 수행하였다. 인터트를 제거한 다음 챔버의 하부로 이동된 세포는 유동 세포 계측법으로 계산되었다. 도 9B에 나타낸 바와 같이, MSC 또는 HDF와 비교할 때 CSC는 더 강한 단핵구 수집을 유도한다.

E. CSC는 활성화된 T 림프구에서 면역 조절 능력을 증명한다.

CSFE로 T 세포를 표지한 후, T 세포 면역 조절에서 CSC의 효과를 분석하였다. HLA-mismatched CFSE-labeled PBMC (1x10⁵)는 mitomycin-C-treated CSC (1x10⁴)의 부재 또는 존재 하에서 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life Technologies) + IL-2(10ng/ml) 또는 phytohaemagglutinin(PHA)로 5일 동안 자극받았다. T 세포의 공동 배양 증식의 마지막은 CD3, CD4, 또는 CD8 양성 세포에서 CFSE 추적을 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 확인되었다. 도 9C에 나타낸 바와 같이, CSC는 활성화된 T 림프구(CD3 양성)에 면역 조절 능력을 증명한다.

F. CSC에 의해 분비된 성장 인자는 세포 생존을 촉진한다.

H9C2 근아세포(myoblastic cell)의 CSC에 의해 분비된 인자의 심혈관 용량은 CSC 조정 배지를 사용하여 시험관 내에서 조사하였다. H9C2 세포의 세포 사멸은 1mM 과산화 수소(H₂O₂)를 사용하여 유도되고, 세포사멸 유발 활성 산소의 생산을 초래한다. H9C2 세포는 20×10³ cell/ml에 시딩되고, 24시간 후 1mM의 H₂O₂가 추가되며, 세포는 추가로 30분 동안 배양된다. 그 다음 성장 배지는 CSC, MSC-BM 또는 HDF로부터 조정된 배양 배지로 대체되고, 세포는 또 다시 16시간 동안 배양된다. 마지막으로, Alamar Blue가 추가되고(1:10 희석) 2시간 후 세포 생존도는 EnVision multilabel Plate reader로 570nm에서 흡광도를 정량화하여 분석하였다. 도 10A에 나타낸 바와 같이, 과산화수소로 처리된 H9C2 세포에 CSC 조정 배지의 추가는 세포 사멸을 방지하고 세포의 신진 대사를 증가하는 것으로 확인되었다.

또한, CSC에 의해 분비된 인자의 친-생존(pro-survival) 능력은 혈청 결핍 후 H9C2 세포에서 분석되었다. 혈청 결핍 세포 사멸은 혈청이 없는 배지에서 24시간동안 세포를 배양하여 유도된다. 혈청 결핍에 의한 세포 사멸 프로그램을 시작하면, H9C2 세포는 전-형태(pro-form)와 caspase 3의 절단으로 caspase 3를 활성화한다. 소태아 혈청이 없는 CSC, MSC-BM, 또는 HDF의 조정 배지를 추가하고 24시간 후 caspase 3의 활성은 실시예 2F에 기재된 방법에 따라, Western Blot에 의해 분석되었다. 도 10B에 나타낸 바와 같이, pro-caspase 3 활성은 혈청 없는/CSC WHWJD 배지에서 공동 배양된 기아 H9C2세포를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

G. CSC는 다양한 계통으로 분화할 수 있다.

심장 계통에서 CSC의 분화 가능성은 면역 형광 현미경으로 분석되었다. 인간 CSC는 0.1% 젤라틴 코팅된 6 wells plates에 5000 cell/cm²로 플레이팅되고, 24시간 동안 성장 인자를 추가한 10% FBS ESCq로 보충된 DMEM/F12 및 Neurobasal(1:1)배지에서 배양되었다. 세포는 3일 동안 100nM Oxytocin(Sigma-Aldrich)으로 처리되었고, 그 다음 트립신 처리 및 p24 ultra-low adherent wells (Costar)(2000 cells/well)에 시딩하였다. 7일 후, 심장공을 채취하여 분화 배지: α-MEM, FBS 2%, dexamethasone(1μM)(Sigma-Aldrich), beta-glycerolphosphate(10 nM)(Sigma-Aldrich), 아스코르브산(50μg/ml)(Sigma-Aldrich)에서 laminin(Sigma-Aldrich) pre-coated glass slides (10 μg/ml)와 함께 24 well plates에 분배하였다. 첫 4일 동안 배지는 TGF-β1 (5 ng/ml)(Peprotech), BMP-2 (10ng/ml)(R&D systems, Madrid, Spain) 및 BMP-4(10ng/ml)(R&D systems)로 보충되고, 그 다음 상기 보충물은 DKK-1(0.15μg/ml)(Peprotech)로 대체된다. 분화 프로토콜의 종료시(30일) 세포는 면역 형광 현미경에 의해 분석되었다. 도 11A-C에 나타낸 바와 같이, CSC는 특정 분화 배지에서 배양한 후, 평활근, 혈관 내피 세포 및 심근 세포에 상응하는 마커의 발현을 증명하였다.

또한, CSC는 전유 배지에서 배양한 후 지방 세포 및 골세포로 분화할 수 있다. 지방 세포 분화는 oil red O staining으로 분석되고 골 세포 분화는 Alizarin red staining으로 확인되었다.

H. CSC의 게놈 안정성

비교 게놈 혼성화 분석은 분리된 인간 CSC의 게놈 안정성을 결정하고, 시험관 내 증식 후에 중복 또는 삭제와 같은 임의의 염색체 변이가 CSC에서 발생하는지 여부를 평가하기 위해 수행되었다. Oligo array-CGH 분석은 Human Genome CGH 44k microarrays(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 세포로부터 1μg의 게놈 DNA 전체 및 참조용으로 건강한 게놈 DNA(Promega, Madison, WI, USA)는 Cy5-dCTP 및 Cy3-dUTP의 랜덤 프라이밍에 의해 별도로 표지되었다. 혼성화는 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다. 카피 수 변경 영역은 최소 5개의 연속적인 프로브를 갖는 AGW에 의해 제공된 ADM-2(6으로 설정) 통계를 사용하여 검출되었으며, 따라서 적어도 200kb의 임의의 비정상적 영역의 검출을 허용하였다. 도 12는 인간 여성 게놈에 대한 비교 게놈 혼성화 분석을 나타낸다. 염색체 변형이 없음이 관찰되었고, 따라서, CSC 게놈의 안정성을 증명하였다.

실시예 4 - 생체 내에서 CSC의 분석

A. CSC는 관상동맥 주입 후 강한 체액성 면역 반응을 유도하지 않는다.

도 13A에 나타낸 시간 비율에 따라, 관상 동맥 주입 후 CSC의 면역원성이 돼지에서 평가되었다. 100×10⁶ 동종 돼지 CSC 세포가 면역 능력이 있는 경색증 거대 흰색 돼지로 관상 동맥 주입에 의해 투여되었고, 세포 투여 전과 세포 투여 후 15일 및 30일에 주입된 세포에 대해 동종 항체 IgG 및 IgM의 존재를 분석하였다. 투여 후 30일, 동일한 CSC의 50×10⁶가 정맥 내로 주입되었고, 혈청 내 특정 동종 항체의 존재가 두 번째 주입 후 3, 7, 15 및 30일에 실험되었다. 혈액 샘플로부터 얻은 혈청은 주입된 세포와 함께 배양되었다. 혈청에 주입된 세포에 대한 동종 반응성 항체의 존재는 항-IgG 또는 항-IgM 표지된 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 분석되었다.

특정 면역 반응 면역 글로불린(IgG 및 IgM)의 존재는 다른 혈액 샘플로 분석되었다. 처음 30일 동안 주입된 세포에 대한 특정 면역 반응 IgG를 발견하는 것은 가능하지 않다. 반대로, 도 13B에 나타낸 바와 같이, 두 번째 주입 후 7, 15 및 30일에 CSC-특정 IgM 및 IgG의 존재를 관찰하였다. 이러한 결과는 CSC가 투여 후 강한 체액성 면역 반응을 유발하진 않지만, 두 번째 투여 후 강하고 빠른 반응을 유도하는 면역학적 메모리를 생성하는 면역 체계에 의해 인식되고 아마도 제거된다는 것을 나타낸다.

B. 생체 내 투여 후 CSC의 유지

심장 CSC 내 CSC의 사후 투여 유지는 추적 실험에 의해 확인되었다. 인간 CSC를 GFP로 표지하고, 쥐들이 경색된 후 7일에 면역 결핍 쥐의 심근에 주입하였다. 상기 동물은 주입 후 24시간에 희생되었고 GFP 양성 세포의 존재는 조직학적 분석에 의해 분석되었다. 형광-표지된 미소구는 투여 사이트를 식별할 수 있는 세포와 공동 주입되었다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 이들 추적 실험은 CSC가 주입된 다음 적어도 24시간 동안 경색 영역에 남아 있다는 것을 증명하였다.

C. CSC는 심장-재생을 촉진한다.

경색 쥐 심장에서 CSC의 효과는 심장 초음파 검사 및 조직학적 분석에 의해 평가하였다. 200에서 250g의 면역 결핍 누드 쥐(HIH-Foxn1 rnu, Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, Massachusetts)는 전방 관상 하위 동맥의 영구 결찰에 의해 경색되었다. 영향받은 조직이 창백한 색을 띠면, Hamilton syringe로 경색 경계 영역의 2 지점에서 심근 내 이식을 수행하였다 (다른 공여자로부터 PBS 또는 5x10⁵ CSC). 세포 투여 후 15일, 1개월 및 2개월, 동물들은 진정되었고 심장 기능은 심초음파로 분석되었다.

이식 후 두 달, 동물들은 죽었고, 심장을 제거하여 4% 파라포름알데히드로 24시간동안 고정된 인산-완충 식염수로 세척하고 추가처리까지 70% 에탄올로 저장되었다. 봉입하기 전에, 심방을 제거하고, 심장을 비슷한 크기의 세 부분으로 절단하였다: 정점 영역(A zone), 결찰이 수행된 배지 영역(B zone), 및 밸브에 가까운 영역(C zone). 모든 영역은 파라핀에 포함되고, 선택된 심장으로부터 5mm, 간격 75mm의 세 부분(이하 도시)은 Masson's Thrichrome stain technique을 사용하여 염색하였다. 조직학적 분석을 수행하였고, 좌심실의 전체 직경에 대해 흉터 크기를 계산하였다. 전체 벽 두께에 대해 근육 섬유의 비율이 대표적인 경색 영역으로 계산되었다. CellA Olympus software는 조직 형태학적 측정을 얻기 위해 사용되었다. Student's t test는 심장 초음파 또는 조직학적 분석에 의해 얻어진 데이터의 의미를 분석하기 위해 사용되었다.

도 15A에 나타낸 바와 같이, 대조군 동물과 비교할 때, CSC를 주입한 동물에서 상당히 높은 심장 기능이 관찰되었다. 세포-처리 군에서, Fractional Area Change(FAC) 측면에서 심장 성능 향상은 이식 후 1개월에 관찰되었고, 2개월에 유지되었다. 보다 구체적으로, 이식 후 2개월, FAC는 식염수에서 33.76 ± 1.69% 및 CSC-처리군에서 42.53 ± 8.29%이었다. 전방 벽 비후(anterior Wall Thickening(AWT))는 CSC로 이식된 동물에서 상당히 높았고(식염수에서 18.93±4.18% 및 CSC-처리군에서 27.37±5.14%), CSC는 새로운 근육 형성을 촉진하고, 식염수보다 리모델링을 방지하는데 보다 효과적임을 나타낸다.

또한, Masson's tricromic stain을 사용한 조직학적 분석은 대조군 동물과 비교할 때 세포로 처리된 쥐에서, 흉터 크기의 상당한 감소 및 환부에 심근 증가를 나타낸다. 이러한 실험은 분리와 증식 과정의 재현성을 확인하고 다른 군집(batch) 사이의 생물학적 동등성을 검증하기 위해 4개의 다른 공여자로부터 얻은 CSC로 수행되었다.

D. CSC는 관상 동맥 내 주입 후 심장 독성을 유발하지 않는다.

투여한 CSC의 안정성을 테스트하기 위해서, 건강한 돼지에 인간 CSC를 주입한 후, 심장 효소의 존재를 모니터하였다. 투여 용액(위약) 또는 투여량 5×10⁶ 인간 CSC는 돼지에 관상 동맥 내 주입으로 투여되었다. 세포는 2ml/min의 속도로 주입되었고, cardiac Troponin I (cTnl), Myoglobin 및 Creatin Kinase-MB는 세포 투여 전 및 투여 후 24시간에 정량화하였으며, 독성은 관찰되지 않았다. cTnl에 대한 결과는 도 16에 나타내었다.

E. CSC는 종양 형성을 유발하지 않는다.

CSC의 종양 형성 가능성을 테스트하기 위해, 두 개의 다른 실험이 면역 결핍 생쥐(SCID 생쥐)에 수행되었다. 면역 결핍 생쥐 정맥(3×10⁶ 세포) 또는 피하(10×10⁶ 세포)에 CSC를 주입하였고, 각각 8개월 또는 4개월 동안 종양 형성을 분석하였다. 모든 동물은 매일(월요일에서 금요일까지) 하루에 한 번 일반적인 임상 관찰을 실시하였을 뿐만 아니라, 테스트 항목 투여 후 즉시, 테스트 항목 투여에 대한 거시적으로 보이는 부작용의 출연에 대해서도 실시하였다. 실험 기간의 종료시에, 각 동물의 완전 부검을 수행하였고, 복부, 흉부, 두개강(cranial cavities), 이들과 연관된 기관과 함께 반응계에서 조사되었다. 또한, 실험 기간의 종료시에, 일부 기관의 조직학적 평가는 각 동물에 대해 수행되었다. 이러한 연구의 결과(임상 관찰, 신체와 장기의 무게, 부검 결과 및 조직학적 평가)는 분석 기간에 걸쳐 SCID 생쥐에 테스트된 투여량에 CSC의 종양 형성의 부존재를 증명한다.

F. 인간 치료용 제품으로 본 발명의 성체 심장 줄기세포의 사용에 대한 정당성

본 발명의 성체 심장 줄기세포의 심장-보호, 면역 조절 능력과 심장-재생 전위는 이들을 허혈성 심장 질환, 자가 면역 질환, 상처 치유 치료 또는 재생 요법과 같은 다른 질환의 치료를 위해 적절한 치료도구가 되게 하였다. 특히, 본 발명의 CSC에 의해 매개된 다음의 현상은 이들을 세포 사멸 또는 염증 치료에 관여하는 질병의 치료를 위한 유용한 치료 도구가 되게 하였다:

- 이들 세포 생산물(도 10 참조)에 의해 매개된 심장 보호 신호는 손상 후 세포의 손실을 제한할 것이다.

- CSC의 면역 조절 능력은 T 세포와 대식세포에 의해 매개된 염증 치료를 조절할 것이다. 손상 후, 초기 단계에서 면역 반응은 세포 잔해를 제거하고, 흉터 형성을 개시하는 것이 필수적이지만, 장기간 염증 치료는 흉터 해결과 조직 재생을 허용하지 않을 것이다.

- 마지막으로, 쥐 모델의 생체 내 실험은 새로운 조직의 형성을 유도하고, 흉터 크기의 감소 및 새로운 근육 섬유의 존재를 증가시키기 위한 CSC의 능력을 보여주었다.

따라서, CSC에 의해 매개된 이러한 모든 활동은 이들이 세포 사멸 또는 염증 반응과 관련된 질병의 치료에 유용한 치료제가 되게 하였다. 또한, 이들 세포는 새로운 조직 형성이 요구되는 병리적 조직 재생을 촉진하는데 사용될 수 있다. 이러한 의미에서, 인간 허혈성 심장 질환은 이들 세포를 사용하여 치료될 수 있다. CSC는 질병의 급성기 동안 세포 손실을 제한할 것이고, 빠른 재생을 허용하는 염증 반응을 조절할 것이며, 최종적으로 새로운 조직 형성을 촉진하기 위해 내생 조직 상주 세포를 활성화할 것이다.

또한, 이들 세포는 질병 발전의 상이한 단계에 투여될 수 있다. 세포는 질병의 급성기 동안 세포 손실을 막기 위해서 투여될 수 있고, 아-급성 또는 만성 단계동안 면역 반응을 조절하고 내생 재생을 활성화하기 위해서 투여될 수 있다. CSC의 면역 조절 능력뿐만 아니라 낮은 면역원성 프로파일은 생체 내에서 그들의 생존을 연장시킬 것이고, 따라서, 그들의 치료 가능성을 증가시킬 것이다.

본 발명의 성체 심장 줄기세포는 관상 동맥, 심근, 정맥, 피하 등과 같은 다른 경로를 사용하여 투여될 수 있다. MSC에 비해 CSC의 감소된 크기는 이들 세포를 관상 동맥 투여에 특히 적합하도록 하였다. cTnl 상승의 관찰 없이, 30×10⁶ 이상의 세포가 관상 동맥에 전달될 수 있다.

실시예 5 - 급성 심근 경색 및 좌심실 기능장애 환자에 대한 동종이계 인간 CSC의 관상동맥 주입을 위한 임상 프로토콜의 예

Claims (42)

1. 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포로서, 상기 세포는 (a) SOX17, GATA4, IL-1β 및 CD31 마커를 발현하고, 상기 세포는 (b) Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질, Nkx2.5 및 CD133 마커를 발현하지 않고, 상기 세포는 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및 평활근 세포의 적어도 모두의 세포 형태로 분화할 수 있는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
2. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 CD49c 및 HHEX를 더 발현하는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 심근 조직으로부터 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
4. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 또는 IL-8 마커 중 하나 이상을 발현하는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
5. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 CD45, CD34, CD11b, CD40, CD80 또는 CD86 마커 중 하나 이상을 발현하지 않는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
6. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 10μm 내지 15μm의 직경을 갖는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
7. 제 1항에 따른 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에 있어서, 상기 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에서 상기 다분화능 성체 심장 줄기세포의 적어도 95%는 검출 가능한 수준에서 SOX17 및 GATA4를 발현하는 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집.
8. 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집으로서, 상기 군집의 성체 심장 줄기세포는 (a) SOX17, GATA4, IL-1β 및 CD31 마커를 발현하고, 상기 군집은 (b) Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4 단백질, Nkx2.5 및 CD133 마커를 발현하지 않고, 상기 세포의 군집의 성체 심장 줄기세포는 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및 평활근 세포의 적어도 모두의 세포 형태로 분화할 수 있고, 상기 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에서 상기 다분화능 성체 심장 줄기세포의 적어도 95%는 검출 가능한 수준에서 SOX17 및 GATA4를 발현하는 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집.
9. 제 8항에 있어서, 상기 세포의 군집의 성체 심장 줄기세포는 CD49c 및 HHEX를 더 발현하는 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집.
10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 세포의 군집은 KDR, HEY2, WT1, CCL2, IL-1α, CSF3, PDGF-β, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, HAND2, MHC 클래스 I 또는 IL-8 마커 중 하나 이상을 더 발현하는 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집.
11. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 세포의 군집은 CD45, CD34, CD11b, CD40, CD80 또는 CD86 마커 중 하나 이상을 더 발현하지 않는 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집.
12. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 군집의 성체 심장 줄기세포는 10μm 내지 15μm의 평균 직경을 갖는 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집.
13. 제 1항에 있어서, 상기 성체 심장 줄기세포는 (a) 서스펜션으로 배양될 때 구형을 형성할 수 있고, (b) 단핵구 수집을 유도할 수 있고, (c) T 림프구 응답을 조절할 수 있고, (d) 항-아폽토시스 인자를 분비할 수 있고/있거나, (e) 클론을 형성할 수 있는 분리된 다분화능 성체 심장 줄기세포.
14. (a) 심근 조직으로부터 세포를 포함하는 서스펜션을 준비하고, (b) 성체 심장 다분화능 줄기세포의 군집을 분리하고, (c) 성체 심장 줄기세포의 군집을 증식하고, (d) 적어도 SOX17, GATA4, IL-1β 및 CD31을 발현하고, Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4, CD133 및 Nkx2.5 마커를 발현하지 않고, 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및 평활근 세포의 적어도 모든 세포 형태로 분화할 수 있는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 심근 조직으로부터 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에서 상기 다분화능 성체 심장 줄기세포의 적어도 95%는 검출 가능한 수준에서 SOX17 및 GATA4를 발현하는 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 제조 방법.
15. (a) 심근 조직으로부터 세포를 포함하는 서스펜션을 준비하고, (b) 성체 심장 다분화능 줄기세포의 군집을 분리하고, (c) 성체 심장 줄기세포의 군집을 증식하고, (d) 다수의 세포주를 포함하는 워킹 셀 뱅크(WCB)를 준비하고, (e) 적어도 SOX17, GATA4, CD31 및 IL-1β를 발현하고, Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4, CD133 및 Nkx2.5 마커를 발현하지 않고, 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및 평활근 세포의 모든 세포 형태로 분화할 수 있는 워킹 셀 뱅크로부터 세포주를 선택하고, (f) 선택된 세포를 증식시키고, (g) 성체 심장 다분화능 줄기세포의 최종적으로 실질적으로 순수한 군집에서 적어도 SOX17, GATA4, CD31 및 IL-1β의 발현을 확인하고, Oct4, Nanog, c-kit, 텔로머라아제 역전사효소, CXCR4, CD133 및 Nkx2.5 마커의 발현 결핍을 확인하고, 지방 세포, 골 세포, 내피 세포 및 평활근 세포의 모든 세포 형태로 분화하는 능력을 확인하는 단계를 포함하는 심근 조직으로부터 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집에서 상기 다분화능 성체 심장 줄기세포의 적어도 95%는 검출 가능한 수준에서 SOX17 및 GATA4를 발현하는 다분화능 성체 심장 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 제조 방법.
16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 선택 단계는 WT1, HEY2, KDR, PDGF, CCL2, IL-1α 또는 CSF3를 발현하는 세포를 선택하는 것으로 포함하는 성체 심장 다분화능 줄기세포의 실질적으로 순수한 군집의 제조 방법.
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19. 제 1항에 따른 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
20. 제 19항에 있어서, 상기 조성물은 1 × 10⁶ 내지 50 × 10⁶ 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
21. 치료 용도로서의 제 1항에 따른 세포.
22. (a) 심혈관 질환 또는 (b) 허혈성 손상의 치료 용도로서의 제 1항에 따른 세포.
23. 삭제
24. 제 1항에 있어서, 상기 성체 심장 다분화능 줄기세포는 동종이계인 세포.
25. 제 1항에 있어서, 상기 세포는 (a) 정맥, 동맥, 관상동맥, 심근 내로, 또는 (b) 1 × 10⁶ 내지 50 × 10⁶ 세포의 투여량으로 투여하는 세포.
26. 제 1항에 있어서, 상기 성체 심장 줄기세포는 (a) 단핵구의 수집, (b) 면역조절, (c) 혈관신생의 활성화, (d) 심장-재생 촉진 또는 (e) 내생 심근세포의 재생 유도 중 하나 이상의 메커니즘에 의한 심장 조직 복구를 유도하는 세포.
27. (a) 자가면역 질환, 염증 과정, 만성 궤양 및 상처 치료, 또는 (b) 동종이계 조직 이식 거부 방지 용도로서의 제 1항에 따른 세포.
28. 심장 조직의 재생 용도로서 선택적으로 생적합성 임플란트에 부착된 제 1항 에 따른 세포.
29. 제 1항에 있어서, 급성 심근경색의 치료에 사용되고, 상기 세포는 관상동맥으로 투여되고, 상기 성체 심장 다분화능 줄기세포의 투여량은 1 × 10⁶ 내지 50 × 10⁶ 세포인 세포.
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