KR102154923B1 - 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치 및 방법 - Google Patents

배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치 및 방법이 제공된다.
상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치는, 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 장치로서, 상기 배양액을 수용하는 고압 용기, 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제2 용매를 공급하는 제1 공급부, 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제3 용매를 공급하는 제2 공급부, 상기 제1 공급부에 인접하게 배치되어 상기 제1 공급부에서 배출되는 상기 제2 용매를 예냉하는 예냉기, 및 상기 고압 용기에 인접하게 배치되어 상기 고압 용기에 공급되는 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 예열하는 예열기를 포함한다.
상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법은, 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 방법으로서, 상기 배양액에서 상기 제1 용매를 제2 용매로 치환하여 상기 타겟 물질을 결정화하는 단계 및 상기 제2 용매를 초임계 상으로 상전이 시키는 단계를 포함한다.

Description

배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치 및 방법{APPARATUS AND METHOD FOR CRYSTALLIZING AND SUPERCRITICAL DRYING OF CULTURE FLUID}
본 발명은 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치 및 방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로, 면역 거부 반응을 억제하여 성공적인 세포 재생을 이룰 수 있다는 점에서 재생 의학의 재료로 각광 받고 있다.
질병 치료를 위한 MSC 배양액은 시간이 충분하다면 치료를 필요로 하는 환자의 세포에서 추출하여 배양하지만 급성 환자의 경우 배양할 시간이 충분하지 않기 때문에 미리 배양해둔 MSC 배양액을 냉동시켜서 보관하다가 필요할 때 해동시켜서 사용한다. 만약 냉동하지 않은 수용액 상에서 보관한다면 수분에 의한 가수분해를 통한 아미노산 분해반응(deamination)으로 인해 물질의 3차원 구조 붕괴를 유발하고 그 결과, 약효가 사라질 수 있다. 또한, 의학적 인프라가 잘 되어있는 선진국에서는 냉동을 통한 보관이 가능하지만, 배양할 수 있는 설비가 없거나 냉동 보관을 할 수 있는 인프라조차 갖춰지지 않은 후진국에서도 MSC 배양액 분비 물질을 이용한 치료를 필요로 하는 사람이 많지만 그 혜택을 받기가 어렵다. 이러한 여러 가지 문제를 해결하기 위하여, 냉동 보관이 필요 없게끔 MSC 배양액의 건조가 요구되고 있다.
종래 사용되고 있는 동결 건조(lyophilization)는 건조하고자 하는 유체를 삼중점(triple point) 미만으로 온도를 낮춰서 얼린 뒤 감압하여 기체로 승화시키는 방법이다. 상기 동결 건조는 건조해야 할 유체인 물이 얼면서 부피가 늘기 때문에 냉동과정에서 단백질의 3차원 구조가 파괴될 수 있고, 건조하는데 많은 에너지와 긴 시간을 요구한다. 또 동결 건조의 공정이 복잡하고 어려울 뿐만 아니라 단백질의 미세구조 내 수분이 완벽히 건조가 되지 않아, 잔여 수분에 의한 가수분해로 아미노산 간의 결합이 끊어질 수 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치를 제공한다.
본 발명은 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예들에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법은, 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 방법으로서, 상기 배양액에서 상기 제1 용매를 제2 용매로 치환하여 상기 타겟 물질을 결정화하는 단계 및 상기 제2 용매를 초임계 상으로 상전이 시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예들에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치는, 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 장치로서, 상기 배양액을 수용하는 고압 용기, 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제2 용매를 공급하는 제1 공급부, 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제3 용매를 공급하는 제2 공급부, 상기 제1 공급부에 인접하게 배치되어 상기 제1 공급부에서 배출되는 상기 제2 용매를 예냉하는 예냉기, 및 상기 고압 용기에 인접하게 배치되어 상기 고압 용기에 공급되는 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 예열하는 예열기를 포함한다.
본 발명의 실시예들에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조는 배양액에 녹아있는 타겟 물질(건조물)의 구조 안정성 및 활성이 변성되는 것을 방지하면서 배양액을 건조할 수 있다. 상기 타겟 물질은 결정화되고 건조될 수 있다. 예를 들어, 상기 결정화 및 초임계 건조는 단백질 등 온도에 민감하고 미세구조를 유지하여야 하는 세포나 단백질을 결정화하고 건조하는데 사용될 수 있다. 상기 결정화 및 초임계 건조는 에너지 등의 공정 비용이나 공정 시간에 있어서 동결 건조보다 우수하다. 상기 결정화 및 초임계 건조에 의해 대량 생산이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치를 나타낸다.
도 2 및 도 3은 노즐 내경 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 ELISA 분석 결과를 나타내며, 도 2는 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 3은 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 4 및 도 5는 노즐 내경 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석을 통한 안정성 테스트 그래프를 나타내며, 도 4는 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 5는 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 6 및 도 7은 총 유량(CO2+EtOH) 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 ELISA 분석 결과를 나타내며, 도 6은 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 7는 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 8 및 도 9는 총 유량(CO2+EtOH) 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석을 통한 안정성 테스트 그래프를 나타내며, 도 8은 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 9는 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 10 및 도 11은 온도 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 ELISA 분석 결과를 나타내며, 도 10은 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 11은 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 12 및 도 13은 온도 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석을 통한 안정성 테스트 그래프를 나타내며, 도 12는 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 13은 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 14 및 도 15는 압력 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 ELISA 분석 결과를 나타내며, 도 14는 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 15는 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 16 및 도 17은 압력 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석을 통한 안정성 테스트 그래프를 나타내며, 도 16은 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 17은 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 18 및 도 19는 CO2/EtOH ratio 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 ELISA 분석 결과를 나타내며, 도 18은 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 19는 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 20 및 도 21은 CO2/EtOH ratio 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석을 통한 안정성 테스트 그래프를 나타내며, 도 20은 같은 농도로 녹인 각 조건 별 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 나타내고, 도 21은 수율을 고려한 각 조건 별 VEGF의 총량을 나타낸다.
도 22는 각 공정의 최적 조건에서 얻어진 건조물의 성장 인자 어레이(Growth Factor Array)를 이용한 성장 인자의 발현 패턴을 나타낸다.
이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서, 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
본 명세서에서 제1, 제2 등의 용어가 다양한 요소들(elements)을 기술하기 위해서 사용되었지만, 상기 요소들이 이 같은 용어들에 의해서 한정되어서는 안 된다. 이러한 용어들은 단지 상기 요소들을 서로 구별시키기 위해서 사용되었을 뿐이다.
본 발명의 실시예들에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법은, 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 방법으로서, 상기 배양액에서 상기 제1 용매를 제2 용매로 치환하여 상기 타겟 물질을 결정화하는 단계 및 상기 제2 용매를 초임계 상으로 상전이 시키는 단계를 포함한다.
상기 용매 치환 단계는 상기 혼합물에서 상기 제1 용매를 상기 제2 용매와 제3 용매로 치환하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 상전이 단계는 상기 제3 용매를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제2 용매는 상기 타겟 물질의 변성 온도보다 낮은 임계 온도를 가질 수 있다. 상기 제3 용매는 상기 제1 용매 및 상기 제2 용매와 섞일 수 있다. 상기 제1 용매는 물을 포함할 수 있고, 상기 제2 용매는 이산화탄소 및 아산화질소 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 상기 제3 용매는 에탄올, 아세톤, 노말 메틸 피롤리돈((N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 타겟 물질은 상기 초임계 건조 후에 구조 안정성을 유지할 수 있다. 상기 타겟 물질은 줄기세포 등의 세포를 포함할 수 있다. 상기 타겟 물질은 단백질을 포함할 수 있다.
상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법은 상기 초임계 상의 상기 제2 용매를 기화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법은 0 ~ 40℃의 온도와 35 ~ 500bar의 압력에서 수행될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치는, 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 장치로서, 상기 배양액을 수용하는 고압 용기, 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제2 용매를 공급하는 제1 공급부, 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제3 용매를 공급하는 제2 공급부, 상기 제1 공급부에 인접하게 배치되어 상기 제1 공급부에서 배출되는 상기 제2 용매를 예냉하는 예냉기, 및 상기 고압 용기에 인접하게 배치되어 상기 고압 용기에 공급되는 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 예열하는 예열기를 포함한다.
상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치는 상기 고압 용기 내에 배치되고, 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 상기 고압 용기 내로 이송시키는 모세관 튜브를 더 포함할 수 있다. 상기 초임계 건조 장치는 상기 고압 용기 및 상기 예열기를 수용하는 수조를 더 포함할 수 있다. 상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치는 상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에서 배출되는 유체를 분리하는 기액 분리기를 더 포함할 수 있다. 상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치는 상기 고압 용기 및 상기 기액 분리기 사이에 배치되어 상기 고압 용기의 백프레셔를 조절하는 백프레셔 조절기를 더 포함할 수 있다.
상기 제2 용매는 상기 타겟 물질의 변성 온도보다 낮은 임계 온도를 가질 수 있다. 상기 제3 용매는 상기 제1 용매 및 상기 제2 용매와 섞일 수 있다. 상기 제1 용매는 물을 포함할 수 있고, 상기 제2 용매는 이산화탄소 및 아산화질소 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있으며, 상기 제3 용매는 에탄올, 아세톤, 노말 메틸 피롤리돈((N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 중에서 적어도 하나를 포함할 수 있다.
상기 타겟 물질은 상기 초임계 건조 후에 구조 안정성을 유지할 수 있다. 상기 타겟 물질은 줄기세포 등의 세포를 포함할 수 있다. 상기 타겟 물질은 단백질을 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치를 나타낸다.
도 1을 참조하면, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치(100)는 타겟 물질 및 제1 용매(예를 들어, 물)를 포함하는 혼합물을 건조하는 초임계 건조 장치로서, 고압 용기(110), 제1 공급부(120), 제2 공급부(130), 예열기(140), 및 예냉기(150)를 포함한다.
고압 용기(110)(high pressure cell)는 상기 혼합물을 수용하여 결정화 및 건조할 수 있다. 제1 공급부(120)는 고압 용기(110)에 연결되어 제2 용매(예를 들어, 이산화탄소)를 공급할 수 있다. 상기 제2 용매는 제1 공급부(120)와 고압 용기(110) 사이에 배치되는 제1 펌프(125)에 의해 이송될 수 있다. 제2 공급부(130)는 고압 용기(110)에 연결되어 제3 용매(예를 들어, 무수 에탄올)을 공급할 수 있다. 상기 제3 용매는 제2 공급부(130)와 고압 용기(110) 사이에 배치되는 제2 펌프(135)에 의해 이송될 수 있다.
예열기(140)는 고압 용기(110)에 인접하게 배치되어 고압 용기(110)에 공급되는 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 예열할 수 있다. 예열기(140)의 가열 매체는 예열기(140)에 연결된 가열조(145)에 의해 가열될 수 있다.
고압 용기(110)와 예열기(140)는 수조(115) 내에 배치될 수 있고, 고압 용기(110)는 타겟 물질, 제1 용매, 제2 용매, 및 제3 용매의 공정 온도를 효과적으로 제어할 수 있다.
예냉기(150)는 제1 공급부(120)에 인접하게 배치되어 제1 공급부(120)에서 배출되는 상기 제2 용매를 예냉할 수 있다. 예냉기(150)의 냉각 매체는 예냉기(150)에 연결된 냉각조(155)에 의해 냉각될 수 있다.
배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치(100)는 모세관 튜브(111)를 포함할 수 있다. 모세관 튜브(111)는 고압 용기(110) 내에 배치되고, 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 고압 용기(110) 내로 이송시킨다. 모세관 튜브(111)에 의해 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매는 잘 혼합된 후 고압 용기(110) 내 혼합물에 효과적으로 공급될 수 있다.
배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치(100)는 고압 용기(110)에 연결되어 고압 용기(110)에서 배출되는 유체를 분리하는 기액 분리기(170)를 포함할 수 있고, 고압 용기(110) 및 기액 분리기(170) 사이에 배치되어 고압 용기(110)의 백프레셔를 조절하는 백프레셔 조절기(160)를 포함할 수 있다.
배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치(100)를 이용한 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법의 일 예는 다음과 같다.
배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치(100)의 고압 용기(110) 내에 건조하고자 하는 줄기세포 배양액을 5mL 넣는다. 고압 용기(110)를 25℃의 온도와 250bar 압력을 유지하면서 -5℃로 과냉각된 액체 이산화탄소를 고압 펌프(125)를 통해 10mL/min의 유량으로 공급한다. 동시에 무수 에탄올을 고압 펌프(135)를 이용해 상온에서 0.475mL/min의 유량으로 공급한다. 공급되는 이산화탄소와 무수 에탄올의 혼합 용액은 25℃로 예열된 뒤 0.02“ 내경의 노즐(모세관 튜브)을 통해 고압 용기(110) 내 줄기세포 배양액에 분사되어 작은 액적으로 쪼개어진다. 이산화탄소와 무수 에탄올의 혼합액은 단백질을 녹이고 있는 물을 조금씩 추출하여 제거한다. 160분간 액상 치환 단계를 거쳐 물을 완전히 제거하여 배양액에 녹아있던 물질을 결정화시킨 뒤에는 고압 용기(110)의 온도를 36℃로 상승시킴과 동시에 무수 에탄올의 공급을 중단하여 고압 용기(110) 내의 유체를 액체 이산화탄소로 교체한다. 45분간의 승온 시간 및 무수 에탄올의 제거 시간을 보낸 뒤 온도가 31℃보다 떨어지지 않도록 유지하면서 감압하여 초임계 이산화탄소를 기체 이산화탄소로 상전이 시켜 결정화된 물질을 건조한다.
초임계 건조(Supercritical Drying, SCD)는 초임계 유체-액체, 초임계 유체-기체 간의 계면에는 표면 장력이 존재하지 않으므로 단백질의 미세구조 파괴를 방지하면서 건조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 줄기세포 배양액의 용매인 물의 임계온도가 374℃로 매우 높아서 물을 초임계 건조를 할 경우, 온도에 의한 단백질의 비활성화를 피할 수 없다. 따라서 임계 온도가 낮은 용매로 치환(displacement)을 하고 초임계 건조를 하는 것이 바람직하다. 단백질의 변성온도보다 낮은 임계 온도를 가지는 유체가 적합하며, CO2가 물리화학적 성질, 가격, 독성 면에서 가장 적합하다. 그러나 초임계 건조 공정에서 CO2만으로 물을 치환하기에는 서로 섞이지 않으므로 공용매를 이용해 물을 빠르게 치환할 수 있다. 공용매로 무수 에탄올(Ethyl alcohol anhydrous, EtOH)을 사용할 수 있다. 초임계 건조 공정은 CO2와 EtOH의 혼합물이 물을 치환하여 배양액에 녹아있는 물질을 결정화하는 단계인 액상 단계(용매 치환 단계), EtOH의 제거 및 임계점 이상으로의 승온 또는 승압을 통한 초임계 상으로의 상전이가 일어나는 초임계 단계, 및 초임계 CO2를 기화시키는 감압 단계를 포함할 수 있다. 감압 단계에서는 온도가 임계 온도 아래로 감소하지 않도록 주의하며 감압한다. 초임계 건조 공정은 동결 건조 공정에 비해서 공정 시간이 짧고 온화한 온도 조건에서 수행된다. 또, 초임계 건조 공정은 동결 건조와 달리 배양액을 얼릴 필요가 없기 때문에 물 분자의 결정화 과정에 수반되는 부피 팽창으로 인한 단백질의 미세구조 파괴도 방지할 수 있다.
[실험예 및 분석예]
초임계 건조(SCD)을 이용하여 다양한 조건에서 줄기세포 배양액을 결정화 및 건조하였고 건조된 고형물을 분석하였다. 비교예로 동결 건조(FD)를 이용하여 줄기세포 배양액을 건조하였고 건조된 고형물을 분석하였다. 상기 동결 건조는 -80℃의 온도와 5mTorr의 압력에서 수행되었다.
상기 건조된 고형물은 일정한 농도로 물에 녹여 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 분석되었다. 특정 단백질의 구조 유지 정도를 측정하고 각 조건 별 결과를 비교하였다. 수율이 100%일 때의 질량 값을 57.5mg으로 하고 5mL 당 57.5mg이 녹아 있도록 각 공정에서 얻어진 건조물의 질량에 맞춰서 물을 넣어 녹여 ELISA 분석을 수행하였다. 해당 질량 값은 여러 차례의 오븐 건조를 통해 얻어진 건조물의 질량 평균값을 통해 얻었다. 오븐 건조는 60℃ 이상의 고온에서 이루어지며, 증발 건조가 진행되면서 미세구조의 파괴도 수행된다. 따라서 이렇게 얻어진 건조물은 활성을 잃게 된다. 단, 해당 온도에서 배양액이 포함하는 유기물이 이산화탄소와 물 등으로 분해되지는 않아 건조물의 질량 손실을 고려할 필요가 없으므로 오븐 건조에서 얻어진 건조물은 ELISA 분석 없이 다른 건조 공정의 수율 계산을 위해 질량만 측정되었다.
건조물의 질량에 비례하여 물에 녹이면 각 조건에서 얻어진 건조물을 같은 농도로 만들 수 있다. 같은 농도로 녹인 건조물에서 분석을 통해 얻은 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 농도 값은 100% 수율 기준에서 해당 조건의 공정 중에 손실이 나거나 구조 변형 등을 통해 비활성화가 된 VEGF를 제외한 구조를 유지하고 있는 VEGF의 농도이다. 구해진 VEGF 농도 값의 상대적인 수치를 통해 어떠한 공정 조건이 VEGF의 구조를 유지할 수 있는 최적 조건인지 판단할 수 있다. 이렇게 구한 각 공정에서의 VEGF 농도 값도 중요하지만 각 공정의 수율을 고려하여 얻어진 목표 단백질의 총량을 계산하는 것도 중요하다. 5mL 당 57.5mg이 녹아 있도록 건조물의 농도를 맞추었으므로 수율을 고려한 VEGF의 총량을 계산할 때는 ELISA 분석을 통해 얻어진 VEGF 농도 값에
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을 곱하여 계산할 수 있다.
이렇게 얻어진 단백질들이 상업적으로 이용될 때는 수분이 존재하는 환경에 노출되게 된다. 따라서 얻어진 건조물이 얼마나 단백질의 구조를 유지하고 있는가도 중요하지만 얼마나 수용액 상에서 오래 구조를 유지하는 가도 중요하다. ELISA 분석에 사용한 건조물 수용액을 4℃에서 보관하고 2주 뒤에 다시 ELISA 분석을 하여 건조물에 포함된 VEGF의 농도를 얻고 그 구조 유지율을 계산하였다.
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노즐 내경 변수에 따른 단백질 구조 유지 및 안정성 비교
초임계 건조 공정에서 노즐 내경 조건(0.01”0.02”)만을 변화시켜가며 실험을 수행하였고, 실험 조건 및 결과를 표 1 내지 3과 도 2 내지 5에 나타내었다. 표 1은 초임계 건조 공정에서의 노즐 내경 변수 별 실험 결과를 나타내고, 표 2는 노즐 내경 변수 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석 결과를 나타내며, 표 3은 CO2/EtOH ratio 변수 별 초임계 건조 공정 건조물이 14일간 수용액에 노출되었을 때의 VEGF 구조 유지율(%)을 나타낸다.
[표 1]
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[표 2]
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[표 3]
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표 1 내지 3과 도 2 내지 5를 참조하면, VEGF의 농도는 노즐 내경이 작을수록 감소하는 것으로 나타났다. 노즐 내경이 작을수록 CO2와 EtOH의 혼합 유체가 분사될 때 더 작은 액적을 형성하여 H2O와 접촉하는 표면적이 증가하여 물질 전달 속도가 향상되어 용매를 치환하는 액상 단계의 시간을 줄일 수 있다. 0.01”내경 노즐을 이용할 경우 액적이 너무 작아져서 깨어지지 않고 에멀전(emulsion)이 형성되고, 이렇게 형성된 에멀전은 초임계 건조기를 빠져나갈 때까지 사라지지 않아서 상당수의 H2O이 CO2와 EtOH에 혼합되지 않은 상태로 단백질을 녹인 채 빠져나가기 때문에 수율이 떨어질 수 있다. 따라서 VEGF 총량에 대해서는 0.02”내경의 노즐이 유리하다.
0.01”내경의 노즐 조건에서 건조된 샘플은 수용액 상에서의 VEGF 구조를 유지하지 못하는 것으로 나타났다. 이것은 단백질에 가해지는 전단 응력의 차이에 의한 것으로 판단된다. 전단 응력은 연속 상의 유속에 비례하는데, 0.01”내경 노즐의 경우 0.02”내경 노즐보다 분사 순간의 유속이 4배이므로 전단 응력도 4배 높게 작용하게 된다. 이러한 0.01”내경 노즐 환경에 노출되어서 VEGF의 구조가 상당히 손상이 진행된 상태로 건조될 수 있다. 0.02”내경 노즐을 이용한 초임계 건조의 경우에는 상당히 높은 구조 유지율을 보인다. 동결 건조 공정의 건조물은 수용액 상에서의 구조 유지율이 현저히 떨어져서 14일 후에는 초임계 건조 공정의 건조물보다 VEGF 총량이 크게 감소한다.
VEGF 총량과 구조 유지율에서 더 유리한 0.02”내경의 노즐을 이용하여 이후 초임계 건조 공정에서의 실험들을 수행하였다.
CO 2 유량 + EtOH 유량에 따른 단백질 구조 유지 및 안정성 비교
초임계 건조 공정에서 CO2 유량과 EtOH 유량의 합(10.350, 15.525, 20.700, 25.875mL/min)만을 변화시켜가며 실험을 수행하였고, 실험 조건 및 결과를 표 4 내지 6과 도 6 내지 9에 나타내었다. 표 4는 초임계 건조 공정에서의 총 유량(CO2+EtOH) 별 실험 결과를 나타내고, 표 5는 총 유량(CO2+EtOH) 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석 결과를 나타내며, 표 6은 총 유량(CO2+EtOH) 별 초임계 건조 공정 건조물이 14일간 수용액에 노출되었을 때의 VEGF 구조 유지율(%)을 나타낸다.
[표 4]
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[표 5]
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[표 6]
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표 4 내지 6과 도 6 내지 9를 참조하면, VEGF의 농도는 총 유량에 관계없이 비슷한 값으로 나타났다. 이는 CO2의 온도, 압력 조건에서의 차이가 없어서 단백질이 노출된 산성 환경에 차이가 없기 때문이다. 그러나, 수율은 총 유량이 증가할수록 감소한다. 총 유량이 증가하면 노즐에서 유체가 분사될 때 발생하는 제트 기류(jet stream)에 의해 CO2 + EtOH 혼합 유체에 섞이지 않은 미세한 H2O 액적이 발생하게 되는데 이 액적에는 단백질이 녹아 있다. 액적은 유체의 흐름에 따라 올라가게 되는데 총 유량이 많을수록 유속이 증가하게 되고, 유속이 증가하면 미세한 H2O 액적이 단백질을 상당히 녹인 상태로 초임계 건조기를 빠져나가기 때문에 수율이 급감하게 된다. 따라서 VEGF 총량에 대해서는 낮은 유량이 유리하다.
총 유량의 차이는 건조된 샘플의 수용액 상에서의 VEGF 구조를 유지하는 정도에는 크게 영향을 주지 못한다. 총 유량이 20.700mL/min일 때의 구조 유지율이 가장 높게 나오지만 다른 조건과 크게 차이 나지 않으며, 수율에서 10.350mL/min에 비해 불리하기 때문에 낮은 유량 조건이 바람직하다. 동결 건조 공정의 건조물은 수용액 상에서의 구조 유지율이 현저히 떨어져서 14일 후에는 초임계 건조 공정의 건조물보다 VEGF 총량이 크게 감소한다.
이후 초임계 건조 공정 실험들은 VEGF 총량에서 더 유리한 10.350 mL/min의 총 유량으로 수행하였다.
온도에 따른 단백질 구조 유지 및 안정성 비교
초임계 건조 공정에서 온도(10, 15, 20, 25℃)만을 변화시켜가며 실험을 수행하였고, 실험 조건 및 결과를 표 7 내지 9와 도 10 내지 13에 나타내었다. 표 7은 초임계 건조 공정에서의 온도 변수 별 실험 결과를 나타내고, 표 8은 온도 조건 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석 결과를 나타내며, 표 9는 온도 변수 별 초임계 건조 공정 건조물이 14일간 수용액에 노출되었을 때의 VEGF 구조 유지율(%)을 나타낸다.
[표 7]
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[표 8]
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[표 9]
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표 7 내지 9와 도 10 내지 13을 참조하면, VEGF의 농도는 온도에 크게 영향 받지는 않는 것으로 나타났다. 이는 온도가 높을수록 액상 단계에서 CO2의 H2O에 대한 용해도가 증가하여 낮은 pH의 산성 환경에 단백질이 노출되지만 온도가 높음으로써 빠른 치환이 진행되어 노출 시간 자체가 감소하는 상반되는 영향이 서로 상쇄되기 때문이다. 25℃일 때 가장 높은 농도 수치를 보였다. 수율에 있어서도 온도 조건 별로 크게 다른 결과가 나오지는 않았다. 이는 제트 기류에 의한 미세 H2O 액적 형성에 영향을 주는 유량 조건이 변하지 않았기 때문에 수율이 비슷한 것으로 판단된다. VEGF의 총량은 25℃일 때 미세하지만 높게 나왔다.
온도의 차이는 건조된 샘플의 수용액 상에서의 VEGF 구조를 유지율에도 크게 영향을 주지 못한다. 전술한 바와 같이, 온도가 높을수록 액상 단계에서 CO2의 H2O에 대한 용해도가 증가하여 낮은 pH의 산성 환경에 단백질이 노출되지만 온도가 높음으로써 빠른 치환이 진행되어 노출 시간 자체가 감소하는 상반되는 영향이 서로 상쇄되기 때문이다. 동결 건조 공정의 건조물은 수용액 상에서의 구조 유지율이 현저히 떨어져서 14일 후에는 초임계 건조 공정의 건조물보다 VEGF 총량이 크게 감소한다.
이후 초임계 건조 공정 실험들은 VEGF 총량에서 미세하게 더 높게 관찰되었으며, 상온에 가까워 에너지 소모 측면에서 유리한 25℃의 온도 조건으로 수행하였다.
압력에 따른 단백질 구조 유지 및 안정성 비교
초임계 건조 공정에서 압력(100, 150, 200, 250bar)만을 변화시켜가며 실험을 수행하였고, 실험 조건 및 결과를 표 10 내지 12와 도 14 내지 17에 나타내었다. 표 10은 초임계 건조 공정에서의 압력 변수 별 실험 결과를 나타내고, 표 11은 압력 조건 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석 결과를 나타내며, 표 12는 압력 변수 별 초임계 건조 공정 건조물이 14일간 수용액에 노출되었을 때의 VEGF 구조 유지율(%)을 나타낸다.
[표 10]
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[표 11]
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[표 12]
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표 10 내지 12와 도 14 내지 17을 참조하면, VEGF의 농도는 100bar 일 때를 제외하고는 압력에 크게 영향받지는 않는 것으로 나타났다. 100bar에서 다른 압력 조건보다 약간 낮은 VEGF 농도를 보이는 이유는 초임계 상에 도달하기 위해서는 임계 온도와 임계 압력보다 높은 온도, 압력 조건이 주어져야 하는데, 해당 CO2와 EtOH의 혼합물 조건에서 혼합물 임계 압력은 100 bar보다 높기 때문이다. 즉, 초임계 상 단계에서의 압력이 충분하게 주어지지 않았기 때문에 감압 시에 초임계 건조가 제대로 이루어지지 않았을 것으로 판단된다. 이는 VEGF의 구조 유지에 악영향을 줄 수 있다. 수율은 압력 조건에 크게 영향을 받지 않았다. 이는 제트 기류에 의한 미세 H2O 액적 형성에 영향을 주는 유량 조건이 변하지 않았기 때문에 수율이 비슷한 것으로 판단된다. VEGF의 총량은 100bar일 때를 제외하고는 나머지 압력 조건에 대해서는 비슷하게 나왔다.
건조된 샘플의 수용액 상에서의 VEGF 구조 유지율은 압력에 크게 영향을 받지 않는다. 초임계 건조 공정에서는 물과 에탄올 혼합물의 지속적인 전달로 인해 단백질이 장기간 전단 응력에 노출된다. 따라서 한 번에 단백질의 구조를 비가역적으로 변성시킬 정도의 전단 응력이 아니더라도 손상을 조금씩 시킬 수 있는 정도의 전단 응력 이상으로만 올라가면 구조 손상이 진행하게 된다. 0.01”내경의 노즐 실험에서는 전단 응력 값이 그 이상으로 올라가서 손상이 진행할 수 있지만 250bar 이하의 0.02”내경 노즐 실험에서는 그 정도의 전단 응력이 발생하지는 않는다. 동결 건조 공정의 건조물은 수용액 상에서의 구조 유지율이 현저히 떨어져서 14일 후에는 초임계 건조 공정의 건조물보다 VEGF 총량이 크게 감소한다. 아무런 건조 공정을 거치지 않은 샘플(Control)보다도 초임계 건조를 통한 건조물이 높은 VEGF 구조 유지율을 나타내는데 이는 배양액 내 단백질의 가수 분해 속도를 촉진할 가능성이 있는 첨가물의 유무가 영향을 주었을 것으로 판단된다.
150, 200, 250bar 조건의 실험 결과가 상당히 유사하여 이후 초임계 건조 공정 실험들은 실험 오차 범위가 더 좁은 250bar 조건으로 수행하였다.
CO 2 / EtOH ratio에 따른 단백질 구조 유지 및 안정성 비교
초임계 건조 공정에서 CO2/EtOH ratio(10/0.225, 10/0.350, 10/0.475 mL/mL)만을 변화시켜가며 실험을 수행하였고, 실험 조건 및 결과를 표 13 내지 15와 도 18 내지 21에 나타내었다. 표 13은 초임계 건조 공정에서의 CO2/EtOH ratio 변수 별 실험 결과를 나타내고, 표 14는 CO2/EtOH ratio 조건 별 초임계 건조 공정 건조물의 시간에 따른 ELISA 분석 결과를 나타내며, 표 15는 CO2/EtOH ratio 변수 별 초임계 건조 공정 건조물이 14일간 수용액에 노출되었을 때의 VEGF 구조 유지율(%)을 나타낸다.
[표 13]
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[표 14]
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[표 15]
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표 13 내지 15와 도 18 내지 21을 참조하면, VEGF의 농도는 EtOH 비율이 증가할수록 미세하게 증가하지만 큰 차이를 나타내지 않는다. 이것은 공정 온도, 압력이 각 조건 실험에서 동일하기에 H2O에 포화되는 CO2의 양도 동일하여 같은 pH의 환경을 조성하지만 EtOH 비율이 증가할수록 H2O의 치환 속도가 빨라져 액상 단계의 시간이 감소하기 때문이다. 수율의 경우, 10mL/0.225mL ratio 조건에서 다른 조건보다 약간 낮게 나오긴 했지만 전체적으로 80 ~ 90%의 수율을 보인다.
EtOH 비율이 증가할수록 초임계 건조기 내부에서 건조물을 회수할 때 건조물이 회수되는 최대 높이가 점점 높아져서 10mL/0.475mL ratio 조건에서는 거의 건조기 최상단까지 올라가는 것을 확인할 수 있다. 이것보다 EtOH 비율이 높아지면 단백질의 손실이 일어날 수 있다. 배양액 수면 위로 CO2와 EtOH의 연속 상이 흐르게 되는데 이때 CO2와 EtOH의 밀도차이 때문에 높이에 따른 EtOH의 농도 구배가 형성된다. H2O와 EtOH의 인력이 CO2와 EtOH의 인력보다 높기에 배양액 근처에서는 높이가 올라갈수록 EtOH 농도가 감소하는 쪽으로 농도구배가 형성된다. CO2 + EtOH + H2O의 삼성분계에서 EtOH가 감소하면 단일 상에 포함될 수 있는 H2O의 양이 줄어들기 때문에 섞여있던 일부 H2O이 미세한 액적으로 분리되게 된다. EtOH가 CO2보다 가볍기 때문에 배양액 수면에서 일정이상 떨어지면 H2O와의 인력에 영향을 받지 않아서 높이가 올라갈수록 EtOH의 농도가 증가하는 쪽으로 농도 구배가 형성된다. 따라서 EtOH의 농도 구배가 밀도에 영향을 받기 시작하는 지점까지 미세 H2O 액적이 형성되어 분산 상태로 존재하게 되는데, EtOH 비율이 증가할수록 해당 지점이 건조기 내의 더 높은 위치에서 형성되게 된다. 이렇게 형성된 H2O 액적은 시간이 지남에 따라 결국은 CO2 + EtOH 혼합 유체에 의해 추출이 되고 H2O 액적에 녹아있던 단백질 입자들이 석출되어 건조기 벽면에 붙는다. EtOH 비율이 너무 높아지면 CO2 + EtOH + H2O의 단일 상이 형성되어 수율 손상이 커질 수 있다. 따라서 10mL/0.475 mL가 H2O가 완전히 치환되기 전에 단일 상이 형성되어 단백질을 손실하는 결과를 방지할 수 있는 최대 CO2/EtOH ratio 값으로 판단된다. VEGF의 총량은 VEGF의 농도와 동일하게 10mL/0.475mL의 CO2/EtOH ratio 조건에서 가장 좋은 결과를 나타낸다.
건조된 샘플의 수용액 상에서의 VEGF 구조 유지율은 CO2/EtOH 비율이 10/0.350일 때 가장 높고 증가하거나 감소할 때 다시 약간 감소하지만 10/0.475일 때의 샘플 중 하나는 구조 유지율이 98.3%인 것에 반해 하나는 79.7%를 보여 큰 차이를 나타낸다. CO2의 온도, 압력, 총 유량 조건이 일정하여 단백질에 가해지는 스트레스는 비슷하기 때문에 구조 유지율이 낮은 샘플을 제외하고 EtOH의 비율에 영향을 받지 않는다. 동결 건조 공정의 건조물은 수용액 상에서의 구조 유지율이 현저히 떨어져서 14일 후에는 초임계 건조 공정의 건조물보다 VEGF 총량이 크게 감소한다. 아무런 건조 공정을 거치지 않은 샘플(Control)보다도 초임계 건조를 통한 건조물이 높은 VEGF 구조 유지율을 나타내는데, 이는 배양액 내 단백질의 가수 분해 속도를 촉진할 가능성이 있는 첨가물의 유무가 영향을 주었을 것으로 판단된다.
일련의 실험 결과를 통해 초임계 건조 공정에서의 최적 CO2/EtOH 비율은 공정 시간을 절약할 수 있는 10mL/min/0.475mL/min으로 나타난다.
최적 조건에 대하여 샘플에 포함된 잔류 용매가 인체에 해가 되는 수준인지 판단하기 위해서 기체 크로마토그래피를 통해 그 양을 측정하였다. FDA에 의하면 EtOH의 섭취 제한량은 16,670ppm인데, 측정 결과는 1.62 ppm으로 인체에 해가 되지 않는다.
도 22는 각 공정의 최적 조건에서 얻어진 건조물의 성장 인자 어레이(Growth Factor Array)를 이용한 성장 인자의 발현 패턴을 나타낸다.
도 22를 참조하면, 초임계 건조(SCD)와 동결 건조(FD) 모두에 대해서 40가지의 성장 인자들이 제대로 발현되는 것으로 나타났다.
초임계 건조 공정의 경우, 0.02”내경의 노즐을 이용하여 25℃, 250bar, 10mL/min의 CO2 유량, 0.475mL/min의 EtOH 유량 조건으로 액상 단계 160분, 온도 상승을 포함한 초임계 단계 45분 동안 건조를 수행하였을 때 초기 VEGF의 구조 유지율과 총량, 그리고 14일간의 수용액 환경에 노출되었을 시의 VEGF의 구조 유지율과 총량에 있어서 가장 우수한 결과를 보인다.
초임계 건조 공정을 통해 얻은 VEGF는 동결 건조 공정을 통해 얻은 VEGF에 비해 14일간 수용액 환경에 노출되더라도 상대적으로 더 높은 구조 유지율을 보인다. 시간이 지날수록 VEGF 총량에 있어서 동결 건조보다 초임계 건조가 더 유리하다. 따라서 초임계 건조 공정을 통해 단백질을 건조하는 것이 동결 건조 공정을 이용하는 것보다 단백질의 손상을 억제할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
100 : 초임계 건조 장치 110 : 고압 용기
111 : 모세관 튜브 115 : 수조
120 : 제1 공급부 125 : 제1 펌프
130 : 제2 공급부 135 : 제2 펌프
140 : 예열기 145 : 가열조
150 : 예냉기 155 : 냉각조
160 : 백프레셔 조절기 170 : 기액 분리기

Claims (18)

  1. 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 방법으로서,
    상기 배양액을 고압 용기에 제공하는 단계;
    상기 배양액 내에 제2 용매와 제3 용매를 공급하여 상기 제1 용매를 상기 제2 용매와 상기 제3 용매로 치환하여 상기 타겟 물질을 결정화하는 단계; 및
    상기 제2 용매를 초임계 상으로 상전이 시키는 단계를 포함하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 고압 용기 내에 모세관 튜브가 배치되고,
    상기 제2 용매와 상기 제3 용매는 상기 모세관 튜브를 통하여 상기 배양액 내에 분사되어 액적으로 쪼개어지는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2 용매는 상기 타겟 물질의 변성 온도보다 낮은 임계 온도를 갖는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제3 용매는 상기 제1 용매 및 상기 제2 용매와 섞이는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 용매는 물을 포함하고,
    상기 제2 용매는 이산화탄소 및 아산화질소 중에서 적어도 하나를 포함하고,
    상기 제3 용매는 에탄올, 아세톤, 노말 메틸 피롤리돈((N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 중에서 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 타겟 물질은 상기 초임계 건조 후에 구조 안정성을 유지하는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 상전이 단계는 상기 제3 용매를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 타겟 물질은 세포 또는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 초임계 상의 상기 제2 용매를 기화시키는 단계를 더 포함하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법은,
    0 ~ 40℃의 온도와 35 ~ 500bar의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 방법.
  11. 제1 용매 및 상기 제1 용매에 녹아있는 타겟 물질을 포함하는 배양액을 건조하여 상기 타겟 물질을 획득하기 위한 장치로서,
    상기 배양액을 수용하는 고압 용기;
    상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제2 용매를 공급하는 제1 공급부;
    상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에 제3 용매를 공급하는 제2 공급부;
    상기 제1 공급부에 인접하게 배치되어 상기 제1 공급부에서 배출되는 상기 제2 용매를 예냉하는 예냉기;
    상기 고압 용기에 인접하게 배치되어 상기 고압 용기에 공급되는 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 예열하는 예열기; 및
    상기 고압 용기 내에 배치되고, 상기 제2 용매 및 상기 제3 용매를 상기 고압 용기 내로 이송시키는 모세관 튜브를 포함하고,
    상기 제2 용매와 상기 제3 용매는 상기 모세관 튜브를 통하여 상기 배양액 내에 분사되는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
  12. 삭제
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 고압 용기 및 상기 예열기를 수용하는 수조를 더 포함하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
  14. 제 11 항에 있어서,
    상기 고압 용기에 연결되어 상기 고압 용기에서 배출되는 유체를 분리하는 기액 분리기를 더 포함하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 고압 용기 및 상기 기액 분리기 사이에 배치되어 상기 고압 용기의 백프레셔를 조절하는 백프레셔 조절기를 더 포함하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
  16. 제 11 항에 있어서,
    상기 제2 용매는 상기 타겟 물질의 변성 온도보다 낮은 임계 온도를 갖는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
  17. 제 11 항에 있어서,
    상기 제3 용매는 상기 제1 용매 및 상기 제2 용매와 섞이는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
  18. 제 11 항에 있어서,
    상기 제1 용매는 물을 포함하고,
    상기 제2 용매는 이산화탄소 및 아산화질소 중에서 적어도 하나를 포함하고,
    상기 제3 용매는 에탄올, 아세톤, 노말 메틸 피롤리돈((N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO) 중에서 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양액의 결정화 및 초임계 건조 장치.
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