KR102150490B1 - Method and Composition for Detecting Parkinson's Disease by using epigenetic marker - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 특정 게놈 지역의 활성도를 이용한 파킨슨 병 진단방법 및 이를 이용한 진단용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 염색체 특정 위치의 활성도를 나타내는 후성유전학적 마커의 양을 정상 샘플과 비교하여 분석함으로써, 높은 정확도로 파킨슨 병을 진단할 수 있는 방법 및 이를 위한 파킨슨 병 진단용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for diagnosing Parkinson's disease using the activity of a specific genomic region and a diagnostic composition using the same, and in more detail, by comparing the amount of an epigenetic marker indicating the activity of a specific chromosome position with a normal sample, high accuracy It relates to a method for diagnosing Parkinson's disease and a composition for diagnosing Parkinson's disease therefor.
파킨슨 병은 중추신경계 퇴행성질환의 하나로 중뇌의 흑색질 밀집부 (Substantia nigra pars compacta)의 변형을 시작으로 뇌 부피의 감소, 알파-시누클레인(α-synuclein, αSyn)의 응집 등을 병태생리적 증상으로 갖는 퇴행성 뇌질환으로 보행의 불완전, 손 떨림, 강직된 행동 등을 보인다. 뇌 전체에 인산화된 알파-시누클레인의 비정상적 축적 및 흑질 (substantia nigra, SN)에서의 신경 손실에 의한 도파민 결핍은 파킨슨병 병리의 진단적 표식이다. Parkinson's disease is one of the degenerative diseases of the central nervous system, starting with the transformation of the substantia nigra pars compacta of the midbrain, reducing the volume of the brain, and the aggregation of α-synuclein (αSyn) as pathophysiological symptoms. It is a degenerative brain disease that shows incomplete walking, trembling hands, and rigid behavior. Abnormal accumulation of phosphorylated alpha-synuclein throughout the brain and dopamine deficiency due to nerve loss in substantia nigra (SN) are diagnostic markers of Parkinson's disease pathology.
최근 게놈 (유전체) 기술의 발전은 알파-시누클레인 단백질 분해, 미토콘드리아 기능, 산화 스트레스, 칼슘 항상성, 축삭 수송 및 신경 염증을 포함한 여러 생물학적 경로와 관련된 질병 발병에 역할을 하는 다수의 유전자를 식별하는 데 성공하였다 (Poewe W et al., Nat Rev Dis Primers. Vol. 3:17013, 2017). 특히나 가족성 파킨슨병의 경우 SNCA(PARK1/4), PRKN(PARK2), PINK1(PARK6), LRRK2(PARK8) 및 GBA 유전자에 빈번한 점돌연변이가 나타남이 보고되었다 (Pankratz et al., Genetics in Medicine. Vol 9:801-811, 2007). 하지만 총 파킨슨병 환자의 90-95%를 차지하는 산발적 형태의 파킨슨병 연관 유전자 또는 진단 마커 발굴 관련하여 수차례의 대규모 전장유전체 연구(Genome-wide association study)가 진행되었음에도 불구하고 높은 정확도를 파킨슨병의 위험도를 예측하거나 진단을 내릴 수 있는 지표는 현재까지 개발되어 있지 않은 상황이다(Poewe W et al., Nat Rev Dis Primers. Vol. 3:17013, 2017).Recent advances in genomic (genetic) technology have been used to identify a number of genes that play a role in disease pathogenesis associated with several biological pathways, including alpha-synuclein proteolysis, mitochondrial function, oxidative stress, calcium homeostasis, axon transport and neuroinflammation. It was successful (Poewe W et al., Nat Rev Dis Primers. Vol. 3:17013, 2017). In particular, in the case of familial Parkinson's disease, frequent point mutations in SNCA (PARK1/4), PRKN (PARK2), PINK1 (PARK6), LRRK2 (PARK8) and GBA genes have been reported (Pankratz et al., Genetics in Medicine. Vol 9:801-811, 2007). However, despite several large-scale genome-wide association studies related to the discovery of sporadic forms of Parkinson's disease-related genes or diagnostic markers, which account for 90-95% of total Parkinson's disease patients, high accuracy was achieved. Indicators for predicting or diagnosing risk have not been developed to date (Poewe W et al., Nat Rev Dis Primers. Vol. 3:17013, 2017).
최근에, 이러한 기존 게놈 기술의 한계를 극복하고자 게놈의 후성유전적 지표에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 후성유전적 지표란 DNA와 DNA가 감싸고 있는 히스톤 단백질체의 조합인 염색질(chromatin)의 생화학적 활성도 (biochemical activity)를 의미한다. 이러한 염색질 생화학적 활성도는 일반적으로 DNA 메틸화, 히스톤 단백질의 메틸화 및 아세틸화, 히스톤 단백질체의 게놈상의 배열을 의미하나 포괄적으로는 DNA 서열을 제외한 모든 게놈 또는 이와 관련된 생물학적 지표의 변화를 포함한다. Recently, in order to overcome the limitations of such existing genome technology, studies on the epigenetic index of the genome have been actively conducted. The epigenetic indicator refers to the biochemical activity of chromatin, which is a combination of DNA and histone protein body wrapped around DNA. Such chromatin biochemical activity generally refers to DNA methylation, methylation and acetylation of histone proteins, and genomic arrangement of histone proteomic bodies, but comprehensively includes changes in all genomes except DNA sequences or biological indicators related thereto.
최근 알츠하이머 병에서 이러한 염색질의 생화학적 변화가 알츠하이머병의 신경 병리와 관련이 있음이 제시되었다. DNA 메틸화 및 히스톤 아세틸화의 변화 그리고 히스톤 단백질체의 배열 변화가 알츠하이머병 환자 특이적으로 보고되었다 (Klein HU et al., Nat Neurosci. Vol. 22(1), pp. 37-46, 2019; Outeiro TF et al., Science. Vol. 27;317(5837), pp. 516-9, 2007). 따라서, 파킨슨병의 경우도 환자 특이적 후성유전적 지표 발굴 및 이를 활용한 진단 방법 개발에 대한 기대가 높아지고 있다. Recently, it has been suggested that the biochemical changes in chromatin in Alzheimer's disease are related to the neuropathology of Alzheimer's disease. Changes in DNA methylation and histone acetylation and changes in the sequence of histone protein bodies have been reported specifically for Alzheimer's disease patients (Klein HU et al., Nat Neurosci. Vol. 22(1), pp. 37-46, 2019; Outeiro TF et al., Science. Vol. 27;317(5837), pp. 516-9, 2007). Accordingly, in the case of Parkinson's disease, there is an increasing expectation for the discovery of patient-specific epigenetic indicators and the development of diagnostic methods using the same.
한편, 대한민국 내 파킨슨병 환자 현황으로는 2010년 6만 1,565명이였으며 연평균 8.7%로 성장하여 2014년 8만 5,888명으로 증가하였고, 2014년 환자의 경우 60세 이상 환자 비율이 95.7%로, 유병율은 환자의 나이와 상관관계를 보였으며 성비율의 경우 남성이 3만 3,831명이고 여성은 5만 2,057명을 나타내었다 (최근 5년 파킨슨 병 환자·진료비 증가세, 청년의사, 2015년). 파킨슨병은 알츠하이머병에 비해 발병 시기가 60세 정도로 매우 빠른 편이며 이로 인해 질환의 진행이 20년 이상 지속되기에 조기 발견을 통한 질환 진행을 늦추는 치료법이 적극적으로 요구된다. Meanwhile, the current status of Parkinson's disease patients in Korea was 61,565 in 2010, and grew to an annual average of 8.7%, increasing to 85,888 in 2014, and in 2014, the proportion of patients over 60 was 95.7%, and the prevalence was There was a correlation with the age of the patients, and in terms of the sex ratio, there were 33,831 males and 52,057 females (Parkinson's disease patients and medical expenses increase in the last 5 years, young doctors, 2015). Parkinson's disease has a very early onset compared to Alzheimer's disease at around 60 years of age, and because of this, the disease progression lasts for more than 20 years. Therefore, treatment to slow the progression of the disease through early detection is actively required.
현재 활용되고 있는 파킨슨병의 진단과 관련하여 수행되는 검사로는 1) PET 검사, 2) MRI 검사, 3) 내과적 질환에 대한 검사 등이 있다. 뇌 도파민 운반체 양전자 단층 촬영(dopamine transporter PET, positron emission tomography) 검사는 도파민성 세포의 손상 여부를 알 수 있는 검사로서, 뇌 도파민 운반체 양전자 단층 촬영을 하게 되면 파킨슨 병 때문이 아닌 다른 원인들에 의한 파킨슨 증상을 확인할 수 있다. 약물 유발성 파킨슨 증후군, 혈관성 파킨슨 증후군, 알츠하이머병에서 동반되는 파킨슨 증상, 본태성 진전에서 동반되는 파킨슨 증상의 경우 언뜻 봐서는 파킨슨 증상과 유사한 떨림, 운동 완서를 보이는 경우가 있으나, 도파민성 신경세포는 정상임을 확인할 수 있다.The tests that are currently used in connection with the diagnosis of Parkinson's disease include 1) PET test, 2) MRI test, and 3) tests for medical diseases. The brain dopamine transporter positron emission tomography (PET) test is a test that can determine whether dopaminergic cells are damaged.If the brain dopamine transporter positron emission tomography is performed, Parkinson's disease is not caused by Parkinson's disease. Symptoms can be checked. Drug-induced Parkinson's syndrome, vascular Parkinson's syndrome, Parkinson's symptoms associated with Alzheimer's disease, Parkinson's symptoms associated with essential tremors may at first glance show tremors similar to Parkinson's symptoms, and complete movement, but dopaminergic neurons are normal. Can be confirmed.
파킨슨 증상을 보이는 경우에 파킨슨 병과 유사한 질환들과 구분하는 것이 중요하고, 이차성 파킨슨 증후군 및 비전형성 파킨슨 증후군등과 구분하기 위해서는 가장 먼저 뇌 자기공명영상(MRI) 검사가 필요하다. 파킨슨 병의 경우에는 MRI가 정상소견인 반면에 다른 질환들은 특징적인 MRI 소견을 보인다.In the case of Parkinson's symptoms, it is important to distinguish it from diseases similar to Parkinson's disease, and to distinguish it from secondary Parkinson syndrome and atypical Parkinson syndrome, brain magnetic resonance imaging (MRI) is the first thing to do. In Parkinson's disease, MRI is normal, while other diseases have characteristic MRI findings.
하지만, 상기 파킨슨병 진단 방법들은 고가이고 진단 절차가 복잡하며, 다른 질환과의 감별 진단에 문제가 있다. 이에 파킨슨 병의 치료 및 진단에 주력하고 있는 최고의 기업 중 하나인 룬드백(Lundbeck)사의 경우 홈페이지에 파킨슨 병의 빠른 진단을 위한 도구 개발의 중요성에 대한 언급은 있지만, 상용화 되어 있는 시약 또는 키트는 현재 판매하고 있지 않다. However, the methods for diagnosing Parkinson's disease are expensive and complicated, and there is a problem in differential diagnosis from other diseases. In the case of Lundbeck, one of the best companies focusing on the treatment and diagnosis of Parkinson's disease, there is a mention on the website of the importance of developing a tool for rapid diagnosis of Parkinson's disease, but commercially available reagents or kits are currently Not for sale.
이러한 어려움으로 인해 파킨슨 병을 앓고 있는 환자는 해마다 크게 증가하고 치료제 시장도 이에 비례하여 크게 성장하고 있지만, 정작 파킨슨병 조기 진단 시장의 발전은 미진한 실정이다. 따라서, 파킨슨병을 진단하고 유사질환과 구분하여 신속하고 경제적으로 진단할 수 있는 기술에 대한 개발이 시급한 상황이다.Due to these difficulties, the number of patients suffering from Parkinson's disease increases year by year, and the market for treatments is also growing in proportion to this, but the development of the early diagnosis market for Parkinson's disease is insufficient. Therefore, there is an urgent need to develop a technology that can diagnose Parkinson's disease and distinguish it from similar diseases quickly and economically.
이에 본 발명자들은 민감도와 정확성이 높은 파킨슨 병 진단방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 인간 게놈의 특정 영역에서 염색질의 후성유전학적 지표를 마커로 활용하여 정상 샘플과 비교할 경우, 주어진 샘플의 파킨슨병 진단을 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors made diligent efforts to develop a method for diagnosing Parkinson's disease with high sensitivity and accuracy, and as a result of using epigenetic indicators of chromatin as a marker in a specific region of the human genome, when comparing with normal samples, diagnosis of Parkinson's disease of a given sample It was confirmed that can be detected with high sensitivity and accuracy, and the present invention was completed.
본 발명의 목적은 후성유전학적 마커를 이용한 파킨슨병 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method of providing information for diagnosis of Parkinson's disease using an epigenetic marker.
본 발명의 다른 목적은 후성유전학적 마커를 확인할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 파킨슨병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing Parkinson's disease comprising a primer set capable of identifying an epigenetic marker.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention
(a) 생체시료에서 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치 전체 또는 그 단편, 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치 전체 또는 그 단편 및 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치 전체 또는 그 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치의 활성도를 확인하는 단계;(a) selected from the group consisting of all or fragments thereof at
(b) 생체시료에서 1번 염색체 207762489 내지 207766014번 째 위치 전체 또는 그 단편, 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편 및 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치의 활성도를 확인하는 단계; 및(b) Selected from the group consisting of the
(e) 상기 (a) 단계의 위치의 활성도가 정상 대비 20% 이상 감소하고, 상기 (b) 단계의 위치의 활성도가 정상 대비 20% 이상 증가할 경우, 파킨슨 병인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 파킨슨 병 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다. (e) When the activity of the position of the (a) step decreases by 20% or more compared to normal, and the activity of the position of the step (b) increases by 20% or more compared to normal, Parkinson's disease comprising the step of determining Provides a method of providing information for disease diagnosis.
본 발명은 또한, 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치 전체 또는 그 단편, 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치 전체 또는 그 단편, 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치 전체 또는 그 단편, 생체시료에서 1번 염색체 207762489 내지 207766014번 째 위치 전체 또는 그 단편, 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편 및 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편의 활성도를 확인하기 위한 프라이머를 포함하는 파킨슨 병 진단용 조성물을 제공한다.The present invention also includes all or fragments thereof at
본 발명에 파킨슨병 진단을 위한 정보의 제공방법은 높은 재현성 및 정확도로 파킨슨병 진단을 위해 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물로 간편하게 정보를 제공할 수 있어서 유용하다. The method of providing information for diagnosis of Parkinson's disease in the present invention is useful not only to provide information for diagnosis of Parkinson's disease with high reproducibility and accuracy, but also to conveniently provide information with the composition of the present invention.
도 1은 본 발명을 위해 수집한 파킨슨병 환자 및 정상인의 샘플 정보이다.
도 2의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 후성유전학적 마커 후보군 도출을 위한 개략도이고, (B)는 후보군 도출 및 검증을 위한 분석 파이프라인에 관한 개략도이다.
도 3의 (A)는 인간 염색질 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치에서 파킨슨병 환자 특이적으로 59.4% 이상 감소를 보이는 후성유전적 마커 변화를 정상인 및 환자 샘플에서 확인한 결과이며, (B)는 지놈 브라우저의 결과이다.
도 4의 (A)는 인간 염색질 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치에서 파킨슨병 환자 특이적으로 45.9% 이상 감소를 보이는 후성유전적 마커 변화를 정상인 및 환자 샘플에서 확인한 결과이며, (B)는 지놈 브라우저의 결과이다.
도 5의 (A)는 인간 염색질 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치에서 파킨슨병 환자 특이적으로 48.6% 이상 감소를 보이는 후성유전적 마커 변화를 정상인 및 환자 샘플에서 확인한 결과이며, (B)는 지놈 브라우저의 결과이다.
도 6의 (A)는 인간 염색질 1번 염색체 207762489 내지 207766014번째 위치에서 정상인 특이적으로 33.5% 이상 감소를 보이는 후성유전적 마커 변화를 정상인 및 환자 샘플에서 확인한 결과이며, (B)는 지놈 브라우저의 결과이다.
도 7의 (A)는 인간 염색질 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치에서 정상인 특이적으로 62.7% 이상 감소를 보이는 후성유전적 마커 변화를 정상인 및 환자 샘플에서 확인한 결과이며, (B)는 지놈 브라우저의 결과이다.
도 8의 (A)는 인간 염색질 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치에서 정상인 특이적으로 75.4% 이상 감소를 보이는 후성유전적 마커 변화를 정상인 및 환자 샘플에서 확인한 결과이며, (B)는 지놈 브라우저의 결과이다.
도 9은 기존에 알려졌던 유전체 바이오마커를 활용 했을 때, 파킨슨병 진단 마커로써 효과 및 정확성이 매우 낮다는 것을 확인한 결과이다.
도 10의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 3개의 후성유전체 바이오마커를 조합하여 파킨슨 병을 진단할 경우의 정확도를 확인한 결과이며, (B)는 또 다른 마커 3개를 조합하여 진단할 경우를 확인한 결과이다.1 is a sample information of Parkinson's disease patients and normal people collected for the present invention.
2A is a schematic diagram for deriving an epigenetic marker candidate group according to an embodiment of the present invention, and (B) is a schematic diagram for an analysis pipeline for deriving and verifying a candidate group.
3A is a result of confirming changes in epigenetic markers showing a 59.4% or more decrease specifically for Parkinson's disease patients at positions 6212894 to 6233153 of
Figure 4 (A) is a result of confirming the change in epigenetic markers showing a decrease of 45.9% or more specifically for Parkinson's disease patients at positions 117470364 to 117492742 of
Figure 5 (A) is a result of confirming changes in epigenetic markers showing a decrease of 48.6% or more specifically for Parkinson's disease patients at positions 77459729 to 77483628 of human chromatin 17 chromosome, and (B) is a genome This is the result of the browser.
Figure 6 (A) is a result of confirming the change in epigenetic markers showing a decrease of 33.5% or more specifically for a normal person at positions 207762489 to 207766014 of
Figure 7 (A) is the result of confirming the change in epigenetic markers showing a decrease of 62.7% or more in a normal person specificly at positions 60128776 to 60136149 of
Figure 8 (A) is the result of confirming the change of the epigenetic marker showing a decrease of 75.4% or more in a normal person specificly at positions 77389739 to 77395313 of the human chromatin 16 chromosome in the normal person and patient samples, (B) is the genome browser It is the result.
9 is a result of confirming that the effect and accuracy are very low as a diagnostic marker for Parkinson's disease when using a previously known genomic biomarker.
Figure 10 (A) is a result of confirming the accuracy when diagnosing Parkinson's disease by combining three epigenetic biomarkers according to an embodiment of the present invention, (B) is a diagnosis by combining another three markers This is the result of checking the case.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by an expert skilled in the art to which the present invention belongs. In general, the nomenclature used in this specification is well known and commonly used in the art.
본 발명에서 용어 '증폭'은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당 업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), WO 89/06700 및 EP 329,822의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; MA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR, 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA, 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the term'amplification' means a reaction to amplify a nucleic acid molecule. Various amplification reactions have been reported in the art, which are polymerase chain reaction (hereinafter referred to as PCR) (U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, and 4,800,159), reverse transcription-polymerase chain reaction (hereinafter referred to as RT-PCR). (Sambrook et al., Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)), method of
사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.Other amplification methods that can be used are described in US Pat. Nos. 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 and US 09/854,317.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR, D-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends, RACE), DL-PCR(PC), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.PCR is the most well-known nucleic acid amplification method, and its many modifications and applications have been developed. For example, touchdown PCR, hot start PCR, nested PCR and booster PCR have been developed by modifying traditional PCR procedures to enhance the specificity or sensitivity of PCR. In addition, real-time PCR, differential display PCR (D-PCR), rapid amplification of cDNA ends (RACE), DL-PCR (PC), inverse polymerase chain reaction (inverse polymerase chain reaction: IPCR), vectorette PCR, and thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) have been developed for specific applications. For more information on PCR, see McPherson, M.J., and Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000), the teachings of which are incorporated herein by reference.
상기 멀티플렉스 증폭은 멀티플렉스 PCR (Polymerase Chain Reaction) 증폭이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 57-61℃의 어닐링(annealing) 온도 조건을 갖고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58-60℃의 어닐링 온도 조건을 가지며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 58.5-59.5℃의 어닐링 온도 조건을 갖는다.The multiplex amplification is a multiplex PCR (Polymerase Chain Reaction) amplification. According to an embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification has an annealing temperature condition of 57-61°C, and according to another embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification is an annealing of 58-60°C. It has a temperature condition, and according to a specific embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification has an annealing temperature condition of 58.5-59.5°C.
상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 PCR을 실시하는 데 적정한 싸이클 수가 요구된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 멀티플렉스 PCR 증폭은 27-35 싸이클로 실시한다. The multiplex PCR amplification requires an appropriate number of cycles to perform PCR. According to an embodiment of the present invention, the multiplex PCR amplification is performed in 27-35 cycles.
본 발명에서 용어 '프라이머(primer)'는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드트리포스페이트 및 중합 반응 효소 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 디자인용 프로그램(예를 들어, PRIMER 3, VectorNTI 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.In the present invention, the term'primer' refers to a single template that can serve as an initiation point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., 4 different nucleoside triphosphates and polymerases) in a suitable buffer at a suitable temperature. It refers to the oligonucleotide of the strand The suitable length of a primer varies depending on various factors, eg temperature and application of the primer, but is typically 15 to 30 nucleotides Short primers form sufficiently stable hybridization complexes with the template. In general, lower temperatures may be required in order to achieve the term “forward primer” and “reverse primer” the 3'end and 5 end of a constant site of the template amplified by polymerase chain reaction. It means a primer that binds to each end. The sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some of the sequences of the template, and it is hybridized with the template to provide sufficient complementarity within the range that can perform the unique function of the primer. Therefore, the primer set according to one embodiment does not need to have a sequence that is completely complementary to the nucleotide sequence as a template, and it is sufficient if it has sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to this sequence to function as a primer. The design of these primers can be easily carried out by those skilled in the art by referring to the base sequence of the polynucleotide used as the template, for example, using a primer design program (eg,
본 발명에서 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.In the present invention, the term "probe" refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, includes deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and can specifically hybridize to a target nucleotide sequence, and exists naturally or Or artificially synthesized. The probe of the present invention is preferably single-chain and is an oligodeoxyribonucleotide.
혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다.After the hybridization reaction, a hybridization signal generated through the hybridization reaction is detected. The hybridization signal may be performed in various ways depending on the type of label bound to the probe, for example. For example, when a probe is labeled with an enzyme, the substrate of the enzyme can be reacted with the result of a hybridization reaction to confirm whether or not hybridization has occurred. Combinations of enzymes/substrates that can be used include peroxidase (e.g. horseradish peroxidase) and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nit Rate), resorupine benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2, 2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol/pyronine; Alkaline phosphatase and bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate and ECF substrate; Glucose oxidase, nitroblue tetrazolium (t-NBT) and phenzaine methosulfate (m-PMS). When the probe is labeled with gold particles, it can be detected by a silver staining method using silver nitrate.
본 발명에서 용어 “”는 Next Generation Sequencing을 의미하는 것으로, 차세대 시퀀싱, 차세대 염기서열 분석을 의미하기도 한다. 이는 전장유전체(Whole genome)를 조각 내고, 상기 조각을 화학적인 반응(hybridization)에 기초하여 대용량으로 시퀀싱을 수행하거나, multiplex PCR로 표적 유전자 영역들을 증폭 시켜 대용량으로 시퀀싱을 수행하는 기술을 의미하고, Agilent, Illumina, Roche 및 Life Technologies사의 기술을 포함하고, 넓은 의미로는 제3세대 기술인 Pacificbio사의 기술, Nanopore Technology 등의 기술 및 제 4세대 기술을 포함하는 것으로 정의한다.In the present invention, the term “” refers to Next Generation Sequencing, and also refers to next-generation sequencing and next-generation sequencing. This refers to a technology that fragments the whole genome and performs sequencing at a large volume based on a chemical reaction (hybridization) the fragment, or amplifies target gene regions by multiplex PCR to perform high-capacity sequencing, It includes technologies from Agilent, Illumina, Roche, and Life Technologies, and in a broad sense, it is defined as including technologies such as Pacificbio, Nanopore Technology, and fourth generation technologies, which are third generation technologies.
본 발명의 '혼성화'는 표적 핵산(검출하고자 하는 서열)에 상보 서열의 교잡(annealing)을 의미한다. 상보 서열을 포함한 두 핵산 고분자가 서로를 발견하고 염기 쌍 상호작용을 통해 교잡하는 능력은 잘 알려진 현상이다."Hybridization" of the present invention refers to annealing of a sequence complementary to a target nucleic acid (a sequence to be detected). The ability of two nucleic acid polymers containing complementary sequences to discover each other and to hybridize through base pair interactions is a well-known phenomenon.
본 발명의 '하이브리드'는 상보적인 염기 사이의 왓슨-크릭 염기 쌍 또는 비표준 염기 쌍에 의해 두 개의 단일가닥 뉴클레오타이드 서열 사이에 형성된 복합체이다.The'hybrid' of the present invention is a complex formed between two single-stranded nucleotide sequences by a Watson-Crick base pair or a non-standard base pair between complementary bases.
본 발명의 '표지'는 검출 가능한 (구체적으로는 정량가능한) 시그날을 제공하고 핵산에 결합될 수 있는 모든 원자 또는 분자를 가리킨다. 표지는 형광, 방사성, 색도, X-선 회절 또는 흡수, 마그네티즘 등에 의해 검출 가능한 시그날을 제공할 수 있다.The'label' of the present invention refers to any atom or molecule that provides a detectable (specifically quantifiable) signal and can be bound to a nucleic acid. The label may provide a signal detectable by fluorescence, radioactivity, chromaticity, X-ray diffraction or absorption, magnetism, or the like.
본 발명에서 용어 “피검자”는 인간, 침팬지를 포함한 영장류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다. 또한, “정상군”도 또한 이러한 의미로 해석되며, 검출하고자 하는 파킨슨 병에 이환되어 있지 않은 객체를 의미한다.In the present invention, the term "subject" is interpreted to include mammals such as humans and primates including chimpanzees. In addition, "normal group" is also interpreted in this sense, and refers to an object not affected by Parkinson's disease to be detected.
본 발명에서는 특정 게놈 지역에서 활성도가 파킨슨병 환자와 정상 샘플에서 차이가 나고, 이를 후성유전학적 마커를 이용하여 확인할 경우, 높은 정확도로 파킨슨 병을 진단할 수 있는 지를 확인하고자 하였다.In the present invention, the activity in a specific genomic region is different from that of Parkinson's disease patients and normal samples, and when this is confirmed using an epigenetic marker, it was attempted to confirm whether or not Parkinson's disease can be diagnosed with high accuracy.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 정상인과 파킨슨 병으로 사망한 환자 뇌 조직 샘플의 흑질(substantia nigra)을 수집하고(도1) 히스톤 단백질 H3의 27번째 라이신의 아세틸화를 ChIP-Seq 실험을 수행한 후 정량화하여(도2), 파킨슨병 환자 특이적인 후성유전적 마커 변화를 보이는 6개의 주요 지역을 선별한 결과 상기 지역이 파킨슨병의 진단에 중요한 정보를 제공한다는 것을 확인하였다(도 3 내지 8). That is, in an embodiment of the present invention, substantia nigra of brain tissue samples of normal people and patients who died from Parkinson's disease were collected (Fig. 1), and ChIP-Seq experiment was performed to acetylate the 27th lysine of histone protein H3. After quantification (Fig. 2), as a result of selecting six major regions showing changes in epigenetic markers specific to Parkinson's disease patients, it was confirmed that these regions provide important information for the diagnosis of Parkinson's disease (Figs. 3 to 8). ).
또한 본 발명에서 제시하는 후성유전적 마커는 기존의 유전체 마커에 비해 훨씬 높은 정확도를 보이는 것을 확인하였다(도 9). 이러한 후성유전적 마커는 프라이머 서열 정보를 활용하여 선택적으로 탐지할 수 있다(도 10).In addition, it was confirmed that the epigenetic marker presented in the present invention exhibits much higher accuracy than the conventional genomic marker (FIG. 9). These epigenetic markers can be selectively detected using primer sequence information (FIG. 10).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 생체시료에서 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치 전체 또는 그 단편, 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치 전체 또는 그 단편 및 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치 전체 또는 그 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치의 활성도를 확인하는 단계;Accordingly, in one aspect, the present invention provides, in one aspect, (a) the entire 6212894 to 6233153 position of
(b) 생체시료에서 1번 염색체 207762489 내지 207766014번 째 위치 전체 또는 그 단편, 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편 및 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치의 활성도를 확인하는 단계; 및(b) Selected from the group consisting of the
(e) 상기 (a) 단계의 위치의 활성도가 정상 대비 20% 이상 감소하고, 상기 (b) 단계의 위치의 활성도가 정상 대비 20% 이상 증가할 경우, 파킨슨 병인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 파킨슨 병 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.(e) When the activity of the position of the (a) step decreases by 20% or more compared to normal, and the activity of the position of the step (b) increases by 20% or more compared to normal, Parkinson's disease comprising the step of determining It relates to a method of providing information for disease diagnosis.
본 발명에서 상기 단편은 각각의 염색체 위치 전체 길이의 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%의 길이를 포함하는 단편일 수 있으며, 이러한 단편에서 후성유전학적 마커의 양을 확인하는 것 역시 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 통상의 기술자에게 자명한 것이다.In the present invention, the fragment is 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.1 of the total length of each chromosomal position It may be a fragment including a length of% and 0.01%, and it is obvious to those skilled in the art that it is also within the scope of the present invention to confirm the amount of epigenetic markers in such fragments.
본 발명에서 게놈 활성도는 유전자를 제외하는 비전사 지역의 염색질이 주변에 위치한 유전자들(대게 2Mb 이하)의 전사 조절에 직접적으로 미치는 영향의 정도를 의미한다. 대부분의 유전자의 경우, 유전자의 발현 정도는 주변 DNA 조절 서열 및 그 위치에 결합한 히스톤 단백질의 활성화 정도에 의해 결정 되며, 이러한 조절 DNA 서열들은 해당 세포의 특정 기능, 환경 자극 및 유전적 다양성에 의해 결정 된다.In the present invention, genomic activity refers to the degree of influence that chromatin in the non-transcribed region excluding genes directly affects transcriptional regulation of nearby genes (usually 2 Mb or less). For most genes, the level of expression of the gene is determined by the degree of activation of the surrounding DNA regulatory sequence and the histone protein bound to the position, and these regulatory DNA sequences are determined by the specific function of the cell, environmental stimulus, and genetic diversity. do.
본 발명에서 활성도의 증가, 감소는 정상인의 검체를 대상으로(n>=3) 해당 활성도를 동일한 실험 방법을 통해 측정하고, 이들 정상 검체의 활성도의 평균값(또는 중간값) 대비 20% 이상 변화가 생긴 경우를 증가 또는 감소했다고 정의한다. In the present invention, the increase or decrease of the activity is measured by the same experimental method for a sample of a normal person (n>=3), and there is a change of 20% or more compared to the average value (or median value) of the activity of the normal sample. The occurrence is defined as increasing or decreasing.
본 발명에서 활성도의 차이란, 정상 샘플 대비 20% 이상 증가 또는 감소하는 경우를 의미한다. 활성도를 정량화 하기 위해서는 앞서 언급한 PCR 증폭 및 NGS 방법을 적용 할 수 있다. NGS 방법을 적용한 경우에는 통상적으로 해당 분야에서 사용하는 RPM, RPKM 을 비롯한 여러 정량적 방법을 사용할 수 있다. In the present invention, the difference in activity refers to an increase or decrease of 20% or more compared to a normal sample. To quantify the activity, the aforementioned PCR amplification and NGS methods can be applied. When the NGS method is applied, several quantitative methods, including RPM and RPKM, which are commonly used in the field can be used.
본 발명에서 RPM, RPKM은 read per million 또는 read per kilobase per million 이라는 의미로 샘플마다 분석되는 서열의 총량이 다르고 이를 정규화 시켜주기 위해 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 정량화 수식이다 (Mortazavi A et al., Nat Methods. Vol. 5(7), pp. 621-8, 2008; Wagner GP et al., Theory Biosci. Vol. 131(4), pp. 281-5, 2012). 이러한 정량화 수식은 계속해서 새로 개발되기에 본 발명에서 마커의 양을 정량화는 수식은 바람직하게는 RPM값을 사용하나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, RPM and RPKM mean read per million or read per kilobase per million and are quantification formulas generally used in the field to normalize the total amount of sequences analyzed for each sample (Mortazavi A et al., Nat Methods. Vol. 5(7), pp. 621-8, 2008; Wagner GP et al., Theory Biosci. Vol. 131(4), pp. 281-5, 2012). Since such a quantification equation is continuously developed, an equation for quantifying the amount of a marker in the present invention preferably uses an RPM value, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 염색체의 위치정보는 인간 유전체 데이터베이스에 따라 변화하기 때문에, 본 발명에서 제시하는 염색체의 위치정보는 hg19 genome 을 기준으로 작성 되었으며, 본 발명에서 상기 hg19 genome은 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/에서 수득할 수 있는 인간 유전체 정보를 의미한다. 다른 인간 유전체 데이터베이스를 활용할 경우 해당 위치정보를 토대로 추출한 DNA 서열정보와 95% 이상 동일한 지역을 모두 포함한다.In the present invention, since the location information of the chromosome changes according to the human genome database, the location information of the chromosome presented in the present invention was created based on the hg19 genome, and the hg19 genome in the present invention is https://www. Refers to human genome information that can be obtained from .ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/ . When using other human genome databases, all regions that are 95% or more identical to the DNA sequence information extracted based on the location information are included.
본 발명에 있어서, 상기 활성도는 핵산 또는 히스톤 단백질의 후성유전학적 마커일 수 있으며, 해당 마커는 이와 상관관계가 높은 다른 후성유전적 마커로 대체 가능하다. 본 발명에서 상관관계가 높다는 것은 정상인 검체 대상(n>=3) 실시한 임의의 후성유전적 마커가 0.2 이상의 Pearson correlation coefficient value를 또는 이에 준하는 상관 관계를 보이면 된다. In the present invention, the activity may be an epigenetic marker of a nucleic acid or a histone protein, and the marker can be replaced with another epigenetic marker having a high correlation therewith. In the present invention, the high correlation means that any epigenetic marker performed on a normal specimen (n>=3) should have a Pearson correlation coefficient value of 0.2 or higher or a similar correlation.
본 발명에서 있어서, 상기 활성도는 히스톤 단백질의 후성유전학적 마커일 수 있고, 더욱 바람직하게는 히스톤 단백질의 메틸레이션(methylation), 아세틸레이션(acetylation), 인산화(phosphorylation), 유비퀴티네이션(ubiquitination), 크로마틴 접근성(chromatin accessibility) 또는 eRNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 히스톤 H3 단백질의 27번째 라이신의 아세틸레이션 (H3K27ac) 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the activity may be an epigenetic marker of histone protein, more preferably methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitination, and more preferably of histone protein. It may be chromatin accessibility or eRNA, and most preferably, it may be characterized by acetylation of the 27 th lysine of histone H3 protein (H3K27ac), but is not limited thereto.
본 발명에서 상기 생체시료는 피검자로부터 자연적 또는 인위적으로 분리되어 피검자의 파킨슨병 관련 유전정보를 포함하는 한 제한되지 않으며, 바람직하게는 체외로 분리된 분변, 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 모발, 뇌척수액, FFPE 조직, 뇌 생검 조직 또는 뇨 등으로부터 분리될 수 있으며, 보다 바람직하게는 FFPE 조직, 뇌 생검 조직 또는 체외로 분리된 혈액, 혈장, 혈청 등을 이용할 수 있다.In the present invention, the biological sample is not limited as long as it is naturally or artificially separated from the subject and includes genetic information related to Parkinson's disease, and preferably, feces, cells, blood, plasma, serum, hair, cerebrospinal fluid separated from the subject , FFPE tissue, brain biopsy tissue or urine, and the like, and more preferably, FFPE tissue, brain biopsy tissue, or blood, plasma, serum, etc. separated from the body may be used.
본 발명에 있어서, 상기 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 특정 게놈 지역의 활성도를 확인하는 방법은 각 염색체 위치의 후성유전학적 마커의 양을 확인할 수 있는 공지된 방법이면 제한없이 이용할 수 있으나, ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq 및 luciferase assay로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 확인하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. In the present invention, the method for checking the activity of a specific genomic region in steps (a) and (b) may be used without limitation, as long as it is a known method capable of confirming the amount of epigenetic markers at each chromosome position. , ChIP-Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq, and luciferase assay may be characterized by a method selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
본 발명의 파킨슨병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 공지된 다양한 시험방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 혼성화법, 면역분석(immunoassay) 방법 또는 유전자 증폭방법을 이용하여 실시할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 후성유전학적 마커의 존재를 확인한다. The method of providing information for diagnosis of Parkinson's disease of the present invention may be performed using a variety of known test methods, such as hybridization method, immunoassay method or gene amplification method, but is not limited thereto. . The hybridization method uses a probe to confirm the presence of an epigenetic marker.
생물학적 시료에서 상기 후성유전학적 마커에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 증가 또는 감소되는 경우에는 파킨슨병으로 진단된다. 본 발명의 파킨슨병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 면역분석 방법에 의해 실시될 수 있다. 상기 면역분석 방법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA), inMethodsinMolecularBiology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.When the hybridization signal for the epigenetic marker in a biological sample increases or decreases compared to a normal sample, it is diagnosed as Parkinson's disease. The method of providing information for diagnosis of Parkinson's disease of the present invention may be performed by an immunoassay method. The immunoassay methods include radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), capture-ELISA, inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunohistochemistry. Including, but not limited to, chemical tablets. The immunoassay method was described in Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA), in Methodsin Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.
본 발명의 파킨슨병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 유전자 증폭방법에 의해 실시될 수 있다. 유전자 증폭방법을 이용한 후성유전학적 마커의 검출은 당 업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 이 경우 후성유전학적 마커의 프라이머 또는 프로브가 이용될 수 있다.The method of providing information for diagnosing Parkinson's disease of the present invention may be carried out by a gene amplification method. The detection of an epigenetic marker using a gene amplification method can be performed using various methods known in the art, and in this case, a primer or a probe of an epigenetic marker may be used.
본 발명에서 후성유전학적 마커는 파킨슨병에서 양이 감소되거나 증가되는 생체 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “감소” 또는 “증가”은 조사 대상의 생물학적 시료에서 대상후성유전학적 마커의 양이 정상 시료와 비교하여 낮은/높은 경우를 의미한다. 예컨대, 당업계에서 통상적으로 이용되는 발현 분석 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 또는 ELISA 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 분석을 한 경우, 양이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예컨대, 상술한 진단 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 후성유전학적 마커가 정상 시료와 비교하여 20% 이상 감소 또는 증가하는 경우, 본 발명에서의 “감소” 또는 “증가”으로 판정하고 파킨슨 병으로 판정한다.In the present invention, the epigenetic marker is a biomolecule whose amount is decreased or increased in Parkinson's disease. As used herein, the term "reduce" or "increase" refers to a case in which the amount of epigenetic markers in the biological sample to be investigated is lower/higher than that of a normal sample. For example, expression analysis methods commonly used in the art, such as RT-PCR method or ELISA method (see Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)). If the analysis is performed according to the method, it means the case that the amount is analyzed as large. For example, as a result of analysis according to the above-described diagnostic method, when the epigenetic marker of the present invention decreases or increases by 20% or more compared to the normal sample, it is determined as “reduction” or “increase” in the present invention and Parkinson's disease Is judged as.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 진단방법이 포함하는 상기 후성유전학적 마커는 정상인과 비교하여 파킨슨병 환자에서 증가 또는 감소 되어 있으며, 최소 33.5% 이상, 바람직하게는 100% 이상 증가 또는 감소 되어 있음을 확인하였다(도 3 내지 도 8).According to an embodiment of the present invention, the epigenetic marker included in the diagnostic method of the present invention is increased or decreased in Parkinson's disease patients compared to normal subjects, and is increased or decreased by at least 33.5% or more, preferably by 100% or more, or It was confirmed that it was reduced (FIGS. 3 to 8).
본 발명은 다른 관점에서, 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치 전체 또는 그 단편, 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치 전체 또는 그 단편, 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치 전체 또는 그 단편, 생체시료에서 1번 염색체 207762489 내지 207766014번 째 위치 전체 또는 그 단편, 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편 및 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편의 활성도를 확인하기 위한 프라이머를 포함하는 파킨슨 병 진단용 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention is a whole or a fragment thereof at
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 반응 완충액, DNA 중합 효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물)를 더 포함할 수 있다. 상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다. 또한, 반응 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 필요에 따라, DNA 중합 효소 조인자를 더 포함할 수 있다.In the present invention, the composition may further include a reaction buffer, DNA polymerase, dNTP (a mixture containing dATP, dCTP, dGTP, and dTTP). The DNA polymerase may be, for example, a thermostable DNA polymerase obtained from Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Pyrococcus furiosus (Pfu). In addition, the reaction buffer is a compound added to the amplification reaction that modifies the stability, activity, and/or lifespan of one or more components of the amplification reaction by adjusting the pH of the amplification reaction, and such buffer solutions are well known in the art, For example, it may be Tris, Tricine, MOPS, or HEPES, but is not limited thereto. In addition to this, the kit may further include a DNA polymerase cofactor, if necessary.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 각 위치의 후성유전학적 마커에 특이적으로 결합하는 프로브, 항체 또는 앱타머 또는 트랜스포제이즈(transposase)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the composition may be characterized in that it further comprises a probe, antibody or aptamer or transposase that specifically binds to an epigenetic marker at each position.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 12의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the primer may be characterized in that it is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 12.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예 1. 인간 뇌 조직 샘플 수집Example 1. Human brain tissue sample collection
1-1. 뇌 샘플 정보1-1. Brain sample information
하기 도 1에 기재된 것처럼 본 발명의 예시로 정상인 및 파킨슨병 환자 중뇌의 흑질 조직이 확보 되어있다. 대조군 및 파킨슨병 환자 중뇌 흑질에서 신경 병리학을 확인하기 위해, 포르말린-고정 뇌를 40㎛에서 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신에 의한 조직 병리학적 검사를 위해 처리하고, 브락 단계(Braak stage)를 평가 하였다(Braak H et al., Acta Neuropathol. Vol. 82(4), pp. 239-59 1991). 이러한 뇌 조직의 사용에 대하여 KAIST로부터 기관 검토위원회 (IRB) 승인을 획득하였다.As shown in Figure 1 below, as an example of the present invention, black matter tissues of the midbrain of normal people and Parkinson's disease patients are secured. To confirm the neuropathology in the midbrain black matter of the control and Parkinson's disease patients, formalin-fixed brain was cut at 40 μm, processed for histopathological examination by hematoxylin and eosin, and evaluated the Braak stage (Braak H et al., Acta Neuropathol. Vol. 82(4), pp. 239-59 1991). Institutional Review Board (IRB) approval was obtained from KAIST for the use of this brain tissue.
실시예 2. ChIP-Seq 실험을 통한 파킨슨병 환자 후성유전체 마커 정량화Example 2. Quantification of epigenetic markers in Parkinson's disease patients through ChIP-Seq experiment
2-1. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-seq 실험2-1. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-seq experiment
하기 도 2에 표시한 것처럼 4개의 정상인 중뇌 흑질 (X4689, X4870, X5628, X5130) 및 6개의 파킨슨병 환자 중뇌 흑질(X5778, X5742, X5649, X5591, X4831, X5215)에 히스톤 H3 라이신 27 아세틸화 (H3K27ac)의 게놈 전체 패턴을 프로파일링하기 위해 ChIP-seq 실험을 수행하였다. As shown in Figure 2 below,
대략 40 내지 50 mg의 조직을 분쇄한 후 조직 샘플을 25℃에서 10분 동안 크로스링킹 버퍼(100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 5mM Hepes, pH 8.0, 1% 포름알데히드)에서 크로스링킹 시킨 다음, 이를 회전시키면서 25 ℃에서 5 분 동안 125 mM 글리신으로 퀀칭하고, 빙냉 PBS로 2 회 세척 하였다. 샘플을 30 μm 스트레이너 (Sysmex, 04-0042-2316)로 통과시켜 과도한 잔해를 제거하고, 단백질 분해 효소 억제제(Roche, 04-693-159-001)와 함께 SDS 용해 버퍼(1% SDS, 50mM Tris-HCl, pH8.0, 10mM EDTA)에 현탁시켰다. After crushing approximately 40-50 mg of tissue, the tissue sample is crosslinked in crosslinking buffer (100mM NaCl, 0.1mM EDTA, 5mM Hepes, pH 8.0, 1% formaldehyde) at 25°C for 10 minutes, then rotated At 25 ℃ while quenching for 5 minutes with 125 mM glycine, and washed twice with ice-cold PBS. Pass the sample through a 30 μm strainer (Sysmex, 04-0042-2316) to remove excess debris, and SDS lysis buffer (1% SDS, 50 mM Tris) with a protease inhibitor (Roche, 04-693-159-001). -HCl, pH8.0, 10mM EDTA).
초음파 처리(Covaris, S220)를 통해 모노-및 디-뉴클레오솜 크기 염색질을 수득하였다. 초음파 처리 된 염색질을 회전시키면서 4 ℃에서 4 시간 동안 항체 (하기 참조) 및 비드 (Thermo Fisher, 10001D) 복합체와 함께 배양한 다음, 염색질-항체-비드 복합체를 사용된 각각의 항체에 최적화된 다양한 염 농도로 연속 세척하였다. 면역 침전된 복합체를 RNaseA(QIAGEN, 19101)로 처리하고, 68℃에서 밤새 역 가교(reverse crosslink)시켰다. 면역 침전된 DNA를 AMPure XP 비드 (Beckman Coulter, A63881)를 사용하여 회수하고, 제조업체의 지시에 따라 NEBNext Ultra II DNA 라이브러리 준비 키트 (NEB, E7645)를 사용하여 ChIP-seq 라이브러리를 준비한 다음, Illumina Hiseq 4000 플랫폼을 사용하여 시퀀싱하였다. ChIP 분석에 사용 된 항체는 다음과 같다:Mono- and di-nucleosomal size chromatin was obtained through sonication (Covaris, S220). After incubation with the antibody (see below) and beads (Thermo Fisher, 10001D) complex for 4 hours at 4° C. while rotating the sonicated chromatin, various salts optimized for each antibody using the chromatin-antibody-bead complex Washed continuously to concentration. The immunoprecipitated complex was treated with RNaseA (QIAGEN, 19101) and reverse crosslinked overnight at 68°C. Immunoprecipitated DNA was recovered using AMPure XP beads (Beckman Coulter, A63881), and a ChIP-seq library was prepared using NEBNext Ultra II DNA library preparation kit (NEB, E7645) according to the manufacturer's instructions, and then Illumina Hiseq It was sequenced using the 4000 platform. The antibodies used in the ChIP assay are:
항-아세틸-히스톤 H3 (Lys27) 항체 (Active Motif, 39133).Anti-acetyl-histone H3 (Lys27) antibody (Active Motif, 39133).
2-2. 후성유전적 지표 정량화2-2. Quantification of epigenetic indicators
하기 도 3에 표시한 것처럼 히스톤 H3 27번째 라이신 아세틸화를 정량화 하기 위해 ChIP-seq 라이브러리를 시퀀싱하여 확보한 DNA 리드를 BWA 라는 프로그램 (Li H et al., Bioinformatics. Vol.26(5), pp.589-95, 2010)을 사용하여 인간 참조 게놈(hg19)에 매핑하였다. 낮은 정렬 품질 (MAPQ <10)의 리드를 제거하고 Picard를 사용하여 PCR 복제본을 폐기하였다. 입력에 대한 피크 영역은 컷오프와 함께 MACS2 프로그램 (PMID: 18798982)으로 식별하였다 (p-value < 1e-5). As shown in FIG. 3 below, a DNA read obtained by sequencing a ChIP-seq library to quantify the acetylation of histone H3 27th lysine was obtained from a program called BWA (Li H et al., Bioinformatics. Vol. 26(5), pp. .589-95, 2010) was used to map to the human reference genome (hg19). The leads of low alignment quality (MAPQ <10) were removed and the PCR copies were discarded using Picard. The peak area for the input was identified with the MACS2 program (PMID: 18798982) with cutoff (p-value <1e -5 ).
각각의 피크 영역에 대해 정상인과 파킨슨병 환자 샘플에서 히스톤 H3 27번째 라이신 아세틸화 리드 수를 얻고 다음과 같이 RPM (Read Per Million)을 계산하였다.For each peak region, the number of histone H3 lysine acetylated reads was obtained from the samples of normal subjects and Parkinson's disease patients, and RPM (Read Per Million) was calculated as follows.
수식 1: Equation 1:
실시예 3. 후성유전체 마커 정량화를 통한 파킨슨병 환자 특이적 지표 발굴Example 3. Identification of specific indicators for Parkinson's disease patients through quantification of epigenetic markers
정량화된 히스톤 H3 27번째 라이신 아세틸화 후성유전적 지표를 토대로 하기 도 3-8에 기재된 바와 같이, 특정 유전적 지역에서 파킨슨병 환자 특이적으로 히스톤 H3 27번째 라이신 아세틸화 지표가 증가 또는 감소하는 사실을 확인하였다. Based on the quantified histone H3 27th lysine acetylation epigenetic index, the fact that the histone H3 27th lysine acetylation index increases or decreases specifically for Parkinson's disease patients in a specific genetic region as shown in FIGS. Was confirmed.
도 3의 경우는 생체시료에서 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치 전체 또는 그 단편으로, 이 지역은 히스톤 아세틸화 지표가 파킨슨병 환자에서 59.4% 이상 감소 하는 것을 확인하였다. 도 4의 경우는 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치 전체 또는 그 단편으로, 이 지역은 히스톤 아세틸화 지표가 파킨슨병 환자에서 45.9% 이상 감소하는 것을 확인하였다. 도 5의 경우는 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치 전체 또는 그 단편으로, 이 지역은 히스톤 아세틸화 지표가 파킨슨병 환자에서 48.6% 이상 감소하는 것을 확인하였다. In the case of FIG. 3, it was confirmed that the whole or fragment of the position of
도 6의 경우는 1번 염색체 207762489 내지 207766014번째 위치 전체 또는 그 단편으로, 이 지역은 히스톤 아세틸화 지표가 정상인에서 33.5% 이상 감소하는 것을 확인하였다. 도 7의 경우는 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편으로, 이 지역은 히스톤 아세틸화 지표가 정상인에서 62.7% 이상 감소하는 것을 확인하였다. 도 8의 경우는 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편으로, 이 지역은 히스톤 아세틸화 지표가 정상인에서 75.4% 이상 감소하는 것을 확인하였다. In the case of FIG. 6, it was confirmed that the whole or fragment thereof at positions 207762489 to 207766014 on
실시예 4. 기존 유전체 지표 대비 제시된 마커의 성능 분석Example 4. Analysis of the performance of the presented marker compared to the existing genome index
기존에 알려진 파킨슨병 연관 유전체 지표들이 실제 정상과 파킨슨병 환자에서 통계적으로 유의한 차이가 있는지 알아보기 위해서, 파킨슨병 연관 유전체 지표들을 이미 공개된 http://pdgene.org/ (Nalls MA et al., Nat Genet. Vol. 46(9), pp. 989-93, 2014)에서 얻은 후, 이들 중 P-value < 1e-5를 만족하는 3,871개의 지표들을 선별하였다. In order to find out whether there is a statistically significant difference between the known Parkinson's disease-related genomic indicators in actual normal and Parkinson's disease patients, Parkinson's disease-related genomic indicators have already been published at http://pdgene.org/ (Nalls MA et al. , Nat Genet. Vol. 46(9), pp. 989-93, 2014), among them, 3,871 indicators satisfying P-value <1e-5 were selected.
국립보건연구원에서 보유한 정상 5,000명의 한국인칩 genotype 데이터와 서울아산병원에서 보유한 파킨슨병 환자 1,038명의 한국인칩 genotype 데이터를 이용해서 실제 이들 마커들의 변화 빈도를 알아보기 위해 하기 수식 2의 방법으로 odd ratio를 계산하였다.Using the genotype data of 5,000 normal Koreans owned by the National Institute of Health and the genotype of 1,038 Koreans with Parkinson's disease possessed by the Seoul Asan Hospital, calculate the odd ratio by the method of
수식 2:Equation 2:
위에서 Ca는 altered allele을 가지고 있는 파킨슨병 환자의 숫자, Cr은 reference alelle을 가지고 있는 파킨슨 병 환자의 숫자, Na는 altered allele을 가지고 있는 정상인의 숫자, Nr은 reference allele을 가지고 있는 정상인의 숫자이다. Above, C a is the number of Parkinson's disease patients with altered allele, C r is the number of Parkinson's disease patients with a reference alelle, N a is the number of normal people with altered allele, and N r is the normal person with reference allele. Is the number of.
그 결과, 도 9에 기재된 바와 같이, 파킨슨병 연관 유전체 지표들은 무작위로 뽑혀진 게놈상의 다른 서열들을 대조군으로 사용되어 비교하였고, 마커로서의 효과가 거의 없을 정도로 정상인과 환자군 사이에서 유의미한 차이가 나타나지 않는 것을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 9, Parkinson's disease-related genomic indicators were compared using different sequences on the randomly selected genome as a control, and there was no significant difference between the normal person and the patient group to the extent that there was little effect as a marker. Confirmed.
실시예 5. 제시된 마커의 조합에 따른 성능 확인Example 5. Performance confirmation according to the combination of the presented markers
실시예 3 및 도 3 내지 8에 기재된 바와 같이, 본 발명에서 개발한 개별 마커들은 파킨슨병과 정상인의 샘플을 구분하는 특성을 충분히 나타내었지만, 이들 마커의 조합은 훨씬 높은 정확도로 파킨슨 병을 진단할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.As described in Example 3 and FIGS. 3 to 8, the individual markers developed in the present invention sufficiently exhibited the characteristics of distinguishing samples from Parkinson's disease and normal subjects, but the combination of these markers can diagnose Parkinson's disease with much higher accuracy. I tried to confirm that there was.
그 결과 도 10에 기재된 바와 같이, 1번 염색체 6212894 내지 6233153번째 위치 전체 또는 그 단편, 12번 염색체 117470364 내지 117492742번째 위치 전체 또는 그 단편 및 17번 염색체 77459729 내지 77483628번째 위치 전체 또는 그 단편의 조합은 파킨슨병 환자에서 정상인 대비 평균 93.4%의 해당 후성유전적 신호가 감소하는 것을 확인하였으며, 개별 마커의 통계적 유의성은 평균 P=0.01094(one-tailed paired t-test)인 것에 반해, 마커의 조합을 사용한 경우 데이터 포인트의 증가로 인해 통계적 유의성이 P=9.862e-06(one-tailed paired t-test)으로 향상되는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 10, the entire 6212894 to 6233153 position of
또한, 1번 염색체 207762489 내지 207766014번 째 위치 전체 또는 그 단편, 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편 및 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편의 조합은 파킨슨병 환자에서 정상인 대비 평균 84.7%의 해당 후성유전적 신호가 증가하는 것을 확인하였으며, 개별 마커의 통계적 유의성은 평균 P=0.004306(one-tailed paired t-test)인 것에 반해, 마커의 조합을 사용한 경우 데이터 포인터의 증가로 인해 통계적 유의성이 P=3.312e-08(one-tailed paired t-test)으로 향상되는 것을 확인하였다.In addition,
실시예 6. 마커 검출을 위한 프라이머 설계Example 6. Primer design for marker detection
실시예 3에서 발굴한 마커를 좀 더 간단한 방법으로 확인하기 위하여 PCR 프라이머를 설계하였다. 상기 프라이머는 샘플에서 ChIP, Transposase 처리 등을 수행한 다음, 수득한 핵산을 증폭하여 그 증폭산물의 양을 정상 샘플과 비교하여 sequencing을 수행하지 않더라도 간편하게 파킨슨 병을 진단하는데 사용할 수 있다. PCR primers were designed to identify the markers discovered in Example 3 by a simpler method. The primer can be used to diagnose Parkinson's disease simply without sequencing by performing ChIP, Transposase treatment, etc. on a sample, and then amplifying the obtained nucleic acid and comparing the amount of the amplified product with a normal sample.
본 발명자들은 상기 증폭산물을 Real-time PCR로 확인하였다. The present inventors confirmed the amplification product by Real-time PCR.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 구체적인 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. As described above, specific parts of the present invention have been described in detail, and for those of ordinary skill in the art, it is obvious that these specific techniques are only specific embodiments, and the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.
SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method and Composition for Detecting Parkinson's Disease by using epigenetic marker <130> P19-B202 <160> 12 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> 1F <400> 1 tttctgccct tggacactct c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 1R <400> 2 ctctgcgtct tggaaccctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> 2F <400> 3 gaagtgtcct cagaggctgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> 2R <400> 4 cttcactcat gggtcctccg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> 3F <400> 5 ggtgatcagg aagagtcctg g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 3R <400> 6 agaaagccag gcaaggaagg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> 4F <400> 7 acccatctca tgtgcaaaga c 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> 4R <400> 8 gccattatgt aatgctcttg tctc 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> 5F <400> 9 aaccatttgg atgaggcagg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> 5R <400> 10 gatttccatg gatagcggac g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> 6F <400> 11 atgtagctca tagaagatac tggc 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> 6R <400> 12 tagtacagat gaggtttcac ca 22 SEQUENCE LISTING <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method and Composition for Detecting Parkinson's Disease by using epigenetic marker <130> P19-B202 <160> 12 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> 1F <400> 1 tttctgccct tggacactct c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> 1R <400> 2 ctctgcgtct tggaaccctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> 2F <400> 3 gaagtgtcct cagaggctgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> 2R <400> 4 cttcactcat gggtcctccg 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> 3F <400> 5 ggtgatcagg aagagtcctg g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 3R <400> 6 agaaagccag gcaaggaagg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> 4F <400> 7 acccatctca tgtgcaaaga c 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> 4R <400> 8 gccattatgt aatgctcttg tctc 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> 5F <400> 9 aaccatttgg atgaggcagg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> 5R <400> 10 gatttccatg gatagcggac g 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> 6F <400> 11 atgtagctca tagaagatac tggc 24 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> 6R <400> 12 tagtacagat gaggtttcac ca 22
Claims (8)
(b) 생체시료에서 1번 염색체 207762489 내지 207766014번 째 위치 전체 또는 그 단편, 3번 염색체 60128776 내지 60136149번째 위치 전체 또는 그 단편 및 16번 염색체 77389739 내지 77395313번째 위치 전체 또는 그 단편으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치의 히스톤 단백질의 메틸레이션(methylation), 아세틸레이션(acetylation), 크로마틴 접근성(chromatin accessibility) 또는 eRNA의 양을 확인하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 위치의 히스톤 단백질의 메틸레이션(methylation), 아세틸레이션(acetylation), 크로마틴 접근성(chromatin accessibility) 또는 eRNA의 양이 정상 대비 20% 이상 감소하고, 상기 (b) 단계의 위치의 히스톤 단백질의 메틸레이션(methylation), 아세틸레이션(acetylation), 크로마틴 접근성(chromatin accessibility) 또는 eRNA의 양이 정상 대비 20% 이상 증가할 경우, 파킨슨 병인 것으로 결정하는 단계를 포함하는 파킨슨 병 진단을 위한 정보의 제공방법.
(a) In the isolated biological sample, in the group consisting of the entire 6212894 to 6233153 position or a fragment thereof, the entire chromosome 12 117470364 to 117492742 position or a fragment thereof, and the entire 77459729 to 77483628 position of chromosome 17 or a fragment thereof Confirming the amount of methylation, acetylation, chromatin accessibility, or eRNA of the histone protein at one or more selected positions;
(b) Selected from the group consisting of the entire chromosome 1 position 207762489 to 207766014 or a fragment thereof, the entire chromosome 3 position 60128776 to 60136149 or a fragment thereof, and the entire chromosome 16 77389739 to 77395313 position or a fragment thereof Checking the amount of methylation, acetylation, chromatin accessibility, or eRNA of the histone protein at one or more positions to be used; And
(c) The amount of methylation, acetylation, chromatin accessibility, or eRNA of the histone protein at the position of step (a) decreases by 20% or more compared to normal, and the (b) Parkinson, including the step of determining Parkinson's disease when the amount of the histone protein at the stage of methylation, acetylation, chromatin accessibility, or eRNA increases by 20% or more compared to normal. How to provide information for disease diagnosis.
The method for providing information for Parkinson's disease diagnosis in claim 1, wherein the sequence information of the chromosome is 95% or more identical to the sequence information extracted based on the hg19 genome.
The method of claim 1, wherein the amount of acetylation of the histone protein is the amount of acetylation of the 27 th lysine of the histone H3 protein (H3K27ac).
The method of claim 1, wherein the method of determining the amount of the histone protein in the steps (a) and (b) is ChIP- methylation, acetylation, chromatin accessibility, or the amount of eRNA. Seq, ChIP-qPCR, ATAC-Seq, DNase-seq, FAIRE-seq, and a method of providing information for Parkinson's disease diagnosis, characterized in that the method selected from the group consisting of luciferase assay.
Chromosome 1 6212894 to 6233153 all or a fragment thereof, chromosome 12 117470364 to 117492742 all or a fragment thereof, chromosome 17 77459729 to 77483628 all or a fragment thereof, chromosome 1 207762489 to 207766014 in a biological sample The entire position or a fragment thereof, chromosome 3 at the 60128776 to 60136149 position or the entire fragment and at the chromosome 16 at 77389739 to 77395313, the entire histone protein, methylation, acetylation, chromatin accessibility (chromatin accessibility) or a composition for diagnosis of Parkinson's disease comprising a primer for confirming the amount of eRNA.
The composition for diagnosing Parkinson's disease according to claim 6, wherein the composition further comprises a probe, antibody or aptamer or transposase that specifically binds to an epigenetic marker at each location.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102259695B1 (en) * | 2020-09-21 | 2021-06-02 | 이화여자대학교 산학협력단 | Novel biomarker for predicting drug-responsibility to colon cancer |
| KR102259708B1 (en) * | 2020-09-21 | 2021-06-02 | 이화여자대학교 산학협력단 | Novel biomarker for predicting drug-responsibility to colon cancer |
-
2020
- 2020-01-30 KR KR1020200010844A patent/KR102150490B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| Acta Neuropathologica (2016) 132(4):515-530 * |
| HUANG 등, "Mitochondrial Dysfunction Induces Epigenetic Dysregulation by H3K27 Hyperacetylation to Perturb Active Enhancers in Parkinson’s Disease Models", BioRxiv, Article no.808246 (2019.10.17.) * |
| Journal of Pharmacological and Toxicological Methods (2012) 66:215-220 * |
| Journal of the Neurological Sciences (2015) 349:3-9 * |
| Neural Regeneration Research (2016) 11(11):1735-1738 * |
| Neuroscience Letters (2016) 627:121-125 * |
| Neuroscience Letters (2018) 666:48-57 * |
| The Journal of Biological Chemistry (2014) 289(50):34743-34767 * |
| The Journal of Biological Chemistry (2016) 291(7):3531-3540 * |
| TOKER 등, "Genome-wide dysregulation of histone acetylation in the Parkinson’s disease brain", BioRxiv, Article no.785550 (2020.01.24.) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102259695B1 (en) * | 2020-09-21 | 2021-06-02 | 이화여자대학교 산학협력단 | Novel biomarker for predicting drug-responsibility to colon cancer |
| KR102259708B1 (en) * | 2020-09-21 | 2021-06-02 | 이화여자대학교 산학협력단 | Novel biomarker for predicting drug-responsibility to colon cancer |
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