KR102143795B1 - 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 그의 용도에 관한 것으로, 상기 프라이머 세트는 뎅기바이러스를 단시간에, 높은 특이성 및 민감도로 검출하는데 사용할 수 있으므로, 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도{Loop Mediated Isothermal Amplification Primer Set for Detection of Dengue Virus Serotype 2 or 4 and Uses Thereof}
본 발명은 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
뎅기바이러스(dengue virus, DENV)는 플라비바리데과(Flaviviridae)의 플라비바이러스속(flavivirus)에 속하는 바이러스로 네 개의 혈청형(DENV1, DENV2, DENV3, DENV4)으로 분류된다. 열대줄무늬모기나 한줄무늬모기를 통해 감염되며, 사람에게 감염되면 뎅기열, 뎅기 출혈열, 뎅기 쇼크증후군등의 질병이 발생한다. 이러한 질병들은 적절한 치료를 통해 호전될 수 있지만, 치료를 받지 못하면 사망률이 20%까지 증가할 수 있다. 다만, 바이러스 감염에 대한 치료는 바이러스 감염 자체를 치료하는 것이 아니라 증상을 완화시키는 대증요법(Symptomatic treatment)에 의한 것이라는 점에서, 치료법상 한계점이 존재하므로, 사전에 감염을 예방하는 것이 중요하다.
최근까지 개발된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 방법의 종류로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료의 정제 과정을 생략하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형으로 사용한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), 상온에서 일어나는 비특이 증폭을 획기적으로 감소시켜 PCR 반응의 특이성(specificity)을 개선시킨 핫-스타트 PCR(hot-start PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitering)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 있다. 이외에도 다양한 PCR 방법 및 관련 기술이 개발되었다.
그러나, 기존의 PCR 방법은 사이클의 반복에 의해 증폭이 진행되므로, 증폭에 많은 시간이 소요되며, 증폭에 사용되는 장치의 구성이 복잡하다. 또한, 증폭을 위한 온도 등의 조건을 최적화하는 데에도 많은 시간이 소요되며, 이에 숙련된 기술을 필요로 하므로, 신속한 바이러스의 검출에 기존의 PCR 방법을 사용하는 것은 적합하지 못하다.
한편, 등온고리매개 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP)은 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 루프모양처럼 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭유무를 확인하는 방법이다. LAMP는 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요하지 않은 Bst 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하기 때문에, 대상 물질을 30분 내에 검출할 수 있다. 또한, 등온에서 증폭을 진행하기 때문에, 증폭 장치를 간단하게 구성할 수 있어, 휴대하기 용이한 형태로 제작이 가능하므로, 현장에서 신속한 검출에 적합하다.
이에 본 발명자들은 뎅기바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP용 프라이머 세트를 제작하고, 이를 이용하여 뎅기바이러스를 검출함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2013-0031909호
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 및 상기 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 또는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 양상은 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 제공한다.
뎅기바이러스는 뎅기열의 병인이 되는 RNA 바이러스로써, 플라비바이러스과 플라비바이러스속으로 분류된다. 또한, 뎅기바이러스는 외피막을 가지는 정이십면체의 바이러스로써, DENV-1, 2, 3 및 4의 4가지의 혈청형으로 분류되며, 각 혈청형의 유전자 사이에는 약 65%의 유사성이 있는 것으로 알려져 있다.
고리매개등온 증폭법은 기존의 중합효소연쇄반응법(PCR)과는 달리 가닥 치환 활성(strand displacement activity)이 높은 Bst 중합효소를 사용하여 3단계의 온도변화 없이 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하기 때문에, 반응 시간이 1시간이내로 짧고, 온도변화에 따른 DNA 손실 및 손상이 없으며, 일정온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비가 필요없어 현장 활용성이 높다. 또한 증폭하고자 하는 유전자 서열의 6개 부위를 인지하는 특이적인 4개 프라이머를 이용하기 때문에 표적 유전자에 대한 특이성이 매우 높다.
본 발명의 뎅기바이러스에 특이적인 LAMP 프라이머 세트는 뎅기바이러스에 민감하고 특이적이기 때문에 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4를 효과적으로 구분하여 검출할 수 있다. 따라서, 뎅기바이러스 감염의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 표적 유전 물질의 등온고리매개 증폭은 하기의 과정으로 수행될 수 있다.
우선, 핵산 성분을 포함하는 표적 유전물질이 포함되어 있는지 판단하고자 하는 시료를 전처리한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 시료는 식품, 천연물 및 생물학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "천연물"은 유기체에 의해 생성된 물질을 말하며, 본 발명의 일 구체예에 따른 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 이용하여 상기 생성된 물질에 포함된 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4를 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리한 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
시료의 전처리 방법은 예를 들어, QIAamp® Viral RNA Mini Kit(50)(QIAGEN, 독일)를 사용한 통상적인 RNA 추출 과정일 수 있다.
다음으로, 전처리된 시료와 표적 유전물질에 반응하는 시약을 혼합한다. 예를 들어, 표적 유전 물질에 결합하는 4개의 프라이머 세트(F3, B3, FIP 및 BIP)와 Isothermal Amplification Buffer II, 황산마그네슘(MgSO4), dNTP Mix, Bst 3.0 DNA Polymerase, AMV Reverse Transcriptase 및 EvaGreen® Fluorescent 시약을 사용할 수 있다. 프라이머 세트로는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및/또는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트가 사용된다.
본 발명에서는 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 확인하기 위하여 선별을 진행하였다. 그 결과, 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 뎅기바이러스 혈청형 2에 특이적이며, 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 뎅기바이러스 혈청형 4에 특이적임을 확인하였다.
그 후, 시약을 혼합한 전처리된 시료를 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여 실시간으로 증폭, 예를 들어, 30분 동안 반응시켜 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 등온증폭반응은 60℃ 내지 67.5℃에서 수행될 수 있다.
등온증폭반응은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 60℃ 내지 67.5℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는, 뎅기바이러스 혈청형 2는 65.0℃에서, 뎅기바이러스 혈청형 4는 66.5℃에서 수행될 수 있다.
또한, 등온증폭반응은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 또는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 6mM 내지 10mM 농도의 MgSO4 조건에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는, 뎅기바이러스 혈청형 2는 8mM에서, 뎅기바이러스 혈청형 4는 6mM의 MgSO4 조건에서 수행될 수 있다.
본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지가 추가로 포함될 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트; 및 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 고리매개 등온 증폭 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 고리매개 등온 증폭 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 및 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 각 프라이머 세트는 각 혈청형에 특이적이고 민감하게 반응할 수 있으므로, 뎅기바이러스 혈청형 2, 혈청형 4, 및/또는 혈청형 2 및 4의 감염 여부를 신속하고 정확하게 판단하는데 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 LAMP 조성물은 LAMP를 위한 중합효소(polymerase), dNTP 혼합물 및/또는 반응완충액(buffer)이 더 포함될 수 있다. 뎅기바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에 증폭을 위해서는 역전사(reverse transcription)과정이 추가된 역전사고리매개등온 증폭법(RT-LAMP)이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 LAMP 조성물은 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지 화합물이 더 포함될 수 있다. 검출용 표지 화합물은 증폭과정에서 증폭산물에 포함되거나 증폭산물에 물리적으로 삽입되어 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물일 수 있다. 예를 들어, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreen®과 같은 fluorescent DNA binding dye가 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 증폭 반응을 수행하기 위해 Bst Polymerase, dNTPs 및/또는 완충액 등을 포함할 수 있다 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명 및/또는 LAMP를 수행하는데 부수적으로 필요한 도구나 시약 등이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 및 상기 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 또는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출 방법을 제공한다.
시료에서 RNA를 분리하는 단계는 핵산 성분을 포함하는 표적 유전물질이 포함되어 있는지 판단하고자 하는 시료로부터 통상적으로 RNA를 분리하기 위하여 사용하는 방법에 의해 RNA를 분리하는 것일 수 있다. 예를 들어, QIAamp® Viral RNA Mini Kit(50)(QIAGEN, 독일)를 사용하여 시료로부터 RNA를 추출할 수 있다.
표적 서열을 증폭하는 단계는 시료로부터 추출한 RNA에 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 또는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트와 LAMP 반응에 필요한 시약, 예를 들어 Isothermal Amplification Buffer II, MgSO4, dNTP Mix, Bst 중합효소 및 AMV Reverse Transcriptase 등을 혼합하여 LAMP 반응액을 제조하고, 이를 LAMP 반응에 일반적으로 사용되는 장치, 예를 들어 MiniOpticon Real-Time machine(BIO-RAD)을 사용하여 증폭하는 것일 수 있다.
또한, 상기 증폭 산물의 검출은 예를 들어, 탁색도, 침전물 생성, SYBR Green I을 이용한 형광 측정, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통하여 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
검출의 편의성을 높이기 위해 프라이머에 검출용 표지를 추가하거나 별도의 검출용 표지 화합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 작업의 용이성, 검출 민감도 등을 고려하여 EvaGreen®과 같은 fluorescent DNA binding dye를 사용할 수 있다. 이 경우, 반응액 중 형광염색제를 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 SYBR Green I 등의 추가 없이 실시간으로 증폭을 확인하고, anneal peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 형광염색제를 검출할 수 있는 장비 중에는 현재 휴대가 용이하도록 가볍고 작은 크기로 이루어진 장비들이 있으므로, 이러한 장비를 이용하여 본 발명의 검출방법을 수행하면 야외에서도 신속하게 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출이 가능하다.
또한, 본 발명의 검출 방법에 따른 뎅기바이러스의 검출 한계는 뎅기바이러스 혈청형 2(제 1 프라이머 세트)에서 3.55 copies/rxn, 및 뎅기바이러스 혈청형 4(제 4 프라이머 세트)에서 9.06 copies/rxn이므로, 기존의 검출 방법에 비하여 민감도가 매우 우수하다.
따라서, 본 발명의 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 검출 방법을 통하여, 야외에서 뎅기바이러스를 특이적으로 신속하게 진단할 수 있으며, 신속면역진단기법(Rapid immunodiagnostic test, RIDT) 보다는 민감하고 정확하게, 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR) 보다는 민감하고 신속하게 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4를 검출할 수 있으므로, 뎅기바이러스의 신속진단 및 구별법으로 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에 따른 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트는 뎅기바이러스를 단시간에 진단하는데 사용할 수 있으며, 우수한 검출 한계를 나타내므로, 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 뎅기바이러스 혈청형 2(A 내지 C) 또는 4(D 내지 F)에 특이적으로 증폭하는 프라이머 서열을 선별하기 위하여, 각 프라이머 세트에 대한 증폭의 차이를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4에 대하여 각각, 본 발명의 제 1 프라이머 세트(A) 및 제 4 프라이머 세트(B)의 LAMP 반응 최적 온도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4에 8대하여 각각, 본 발명의 제 1 프라이머 세트(A) 및 제 4 프라이머 세트(B)의 LAMP 반응 최적 MgSO4 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 뎅기바이러스 혈청형 2에 대하여 본 발명의 제 1 프라이머 세트(A)가, 뎅기바이러스 혈청형 4에 대하여 본 발명의 제 4 프라이머 세트(B)가 특이적으로 반응함을 나타낸 그래프이다.
도 5는 뎅기바이러스 혈청형 2에 대하여 본 발명의 제 1 프라이머 세트의 검출 한계(LOD)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 뎅기바이러스 혈청형 4에 대하여 본 발명의 제 4 프라이머 세트의 검출 한계를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4 증폭 프라이머 제작
1-1. 시료 및 장비의 준비
등온고리매개 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP)에 사용되는 10X Isothermal Amplification Buffer II, 황산마그네슘(MgSO4), dNTP Mix, Bst 3.0 DNA Polymerase 및 AMV Reverse Transcriptase는 NEB(USA)로부터 구입하고, EvaGreen® Fluorescent DNA Stain은 BMS(한국)로부터 구입하였다. 초순수정제수(Ultra Pure Water For Molecular Biology)는 WELGENE(한국)으로부터 구입하였다.
증폭에 이용되는 뎅기바이러스 혈청형 2(KP406804.1) 및 4(KP406806.1)는 고려대학교 병원성바이러스은행(한국)으로부터 분양받았고, 프라이머(Primer)는 제노텍(한국)으로부터 합성되었다.
바이러스 추출에 사용하는 QIAamp® Viral RNA Mini Kit(50)는 QIAGEN(독일)로부터 구입하였다.
1-2. 프라이머 제작
표적 유전물질을 LAMP를 통해 검출하기 위하여, 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4 RNA의 전체 염기서열(Genbank accession number: KP406804.1 및 KP406806.1)을 기반으로 하여, Primer Explore(http://primerexplorer.jp/e/index.html)를 사용하여 프라이머를 제작하였다. LAMP를 이용하기 위해서는 4개의 프라이머가 하나의 세트로 작용하여야 하므로, 혈청형에 따라 3가지 세트로 나누어 제조하였으며, 프라미머 세트 중 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4에 특이적으로 증폭하는 프라이머 서열을 선별하였다.
하기 표 1은 LAMP에 사용한 각 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
혈청형 프라이머
세트		 프라이머
명칭		 LAMP 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
뎅기
바이러스 혈청형 2		 제 1
프라이머 세트		 F3 GTTAAAAGTTGCCACTGGC 서열번호 1
FIP CCAGCGAGATTCTTTGGAATTATCAGTCACACACTCTTTGGAGC 서열번호 2
B3 ACTGTAGTTCCTTTGCAGAA 서열번호 3
BIP CAGTGTCACAACACAATAACAGACCCCATCTCAAGTTTGCCTAGA 서열번호 4
제 2
프라이머 세트		 F3 GGATATTTGTCACAGATAACGT 서열번호 5
FIP CTGAATAGCTGAAGCCAGTTTTGAAATACATGGACAGAACAATACAAGT 서열번호 6
B3 TCACTTCATTTTCTGATAGGATG 서열번호 7
BIP GAGGGCATTTGTGGAATCCGTGGTTCAATTCCGGTGTT 서열번호 8
제 3
프라이머 세트		 F3 CACATCCTATCAGAAAATGAAGT 서열번호 9
FIP GGCTGCAGAGATCGTTTTCCTAGAAGCTGACTATCATGACAGG 서열번호 10
B3 AGGTCTGGTTGTGGAGTT 서열번호 11
BIP CAACCCACTGAGCTGAGGTACTGTGGAGAGCATTTTTGC 서열번호 12
뎅기
바이러스 혈청형 4		 제 4
프라이머 세트		 F3 ACCGAACCTGAGGACATTGA 서열번호 13
FIP CGTTCCCCACTCTGAGTGCATGTTGCTGGTGCAATCTCACG 서열번호 14
B3 CCCTCTGAGCATGTTTCCAA 서열번호 15
BIP GAAGCGCTCAGTAGCCCTAACACCCCTTCCGATGACATCCA 서열번호 16
제 5
프라이머 세트		 F3 CAATCTCACGTCTGCCTGG 서열번호 17
FIP CAGCCCTTGTCTCCAATCCCATACTCAGAGTGGGGAACGG 서열번호 18
B3 GGCCATAAATCCTGCCAAGA 서열번호 19
BIP ATGGATGTCATCGGAAGGGGCAGCGAATCCTGGGTTTCTG 서열번호 20
제 6
프라이머 세트		 F3 TGCTCAGAGGGTAGAGAGTT 서열번호 21
FIP CGCTGGATTCCTGTTTGCCCACTCAGAAACCCAGGATTCGC 서열번호 22
B3 TCCTCCATGTTCTAGCACCA 서열번호 23
BIP GGTCGCCCCATCCTACGGAATGCTCCACCTGAGACTCC 서열번호 24
실시예 2. 뎅기바이러스로부터 RNA 추출 및 분리
바이러스로부터 RNA를 추출하기 위하여 바이러스 RNA 키트(QIAamp Viral RNA Mini, QIAGEN, 독일)를 이용하여 바이러스 배양액으로부터 RNA를 추출하였다.
구체적으로, 1.5㎖ 튜브에 고려대학교 병원성바이러스은행으로부터 분양받은 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4 배양액, 및 AVL 버퍼(carrier RNA 포함)(QIAGEN) 560㎕를 넣고, 15초 동안 혼합(pulse-vortex)하였다. 실온에서 10분 동안 정치하고, 가볍게 스핀다운(spin-down)한 후, 에탄올(≥99.9%) 560㎕을 넣고, 15초 동안 혼합한 다음 스핀다운하였다. 그 후, 얻어진 혼합 시료 중 630㎕을 스핀칼럼(QIAamp Mini spin column)(2㎖ 튜브 포함)에 넣고, 6,000×g에서 1분간 원심분리 하였다(RNA 흡착단계). 여과된 액과 튜브를 버린 후, 스핀칼럼을 새로운 2㎖ 튜브에 옮겼다. AW1 세척버퍼 500㎕을 스핀칼럼에 넣고, 6,000×g에서 1분간 원심분리한 다음(첫 번째 세척단계), 스핀칼럼을 새로운 2㎖ 튜브에 옮기고, AW2 세척버퍼 500㎕을 스핀칼럼에 넣었다. 20,000×g에서 3분간 원심분리하고(두 번째 세척단계), 스핀칼럼을 최대속도로 1분간 원심분리한 후, 1.5㎖ 튜브에 스핀칼럼을 장착하여, AVE 용출버퍼 60㎕을 칼럼에 주입하고, 1분간 방치하였다. 마지막으로, 6,000×g에서 1분간 원심분리하여 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4의 RNA를 각각 추출하였으며, 추출한 RNA는 -70℃에서 보관하여 사용하였다.
실시예 3. 뎅기바이러스 LANP 프라이머 세트 선별
실시예 1-2에서 제작한 LAMP용 프라이머 세트가 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4에 특이적으로 증폭되어 검출이 가능한지 확인하기 위하여, LAMP 반응을 분석하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 추출한 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 RNA에 1X의 10X Isothermal Amplification Buffer II, 6mM 황산마그네슘(MgSO4), 1.4mM dNTP Mix, 320U/㎖ Bst 3.0 DNA Polymerase, 200U/㎖ AMV Reverse Transcriptase 및 1X EvaGreen® Fluorescent DNA Stain를 혼합하여 LAMP 반응액을 제조하였다.
반응액을 제조한 후 뎅기바이러스의 RNA는 2μl를 사용하였고 RNA 농도는 DV2와 DV4 각각 16.9 ng/μl와 13.1 ng/μl를 사용하였다.
LAMP 반응액에 표 1의 프라이머 세트를 각각 첨가한 후(1.6μM FIP/BIP 및 0.2μM F3/B3), 초순수정제수로 최종 부피 25㎕가 되도록 하였으며, 음성 대조군으로는 초순수정제수를 사용하였다. LAMP 반응은 65℃에서 30분 동안 BIO-RAD의 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여, 뎅기바이러스 혈청을 넣은 것과 음성 대조군의 증폭을 실시간으로 비교하였다.
그 결과, 제 1 프라이머 세트(도 1A)에 의하여 뎅기바이러스 혈청형 2가 증폭되었고, 제 4 프라이머 세트(도 1D)에 의하여 뎅기바이러스 혈청형 4가 증폭되었으며, 각각 증폭에 따른 음성대조군과의 뚜렷한 차이를 확인하여 각 프라이머 세트는 각 혈청형에 대하여 특이적으로 반응함을 확인하였다. 반면, 제 2 프라이머 세트(도 1B), 제 3 프라이머 세트(도 1C), 제 5 프라이머 세트(도 1E) 또는 제 6 프라이머 세트(도 1F)을 사용한 경우, 증폭에 따른 음성대조군과의 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다. 따라서, 제 1 프라이머 세트 및 제 4 프라이머 세트를 선별하여, 최적화 조건 및 특이성을 확인하였다.
실시예 4. 뎅기바이러스 혈청형에 따른 LANP 온도 및 농도 최적화
4-1. 뎅기바이러스의 LAMP 반응 온도 최적화
실시예 3에서 선별한 뎅기바이러스 혈청형 2에 특이적으로 증폭하는 제 1 프라이머 세트 및 혈청형 4에 특이적으로 증폭하는 제 4 프라이머 세트를 각각 이용하여, 뎅기바이러스 증폭의 최적 온도를 확인하였다.
구체적으로, BIO-RAD의 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여 60.0℃, 60.6℃, 61.7℃, 63.2℃, 65.0℃, 66.5℃ 또는 67.5℃의 온도에서 30분 동안, 제 1 프라이머 세트 또는 제 4 프라이머 세트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조한 LAMP 반응액을 동시다발적으로 증폭하였으며, BIO-RAD의 CFX Manager 3.1를 통하여 온도 최적화 분석을 진행하였다.
그 결과, 뎅기바이러스 혈청형 2(제 1 프라이머 세트)에서는 65.0℃의 온도(도 2A)가 최적 온도이며, 뎅기바이러스 혈청형 4(제 4 프라이머 세트)에서는 66.5℃의 온도(도 2B)가 최적 온도임을 확인하였다. 따라서, 이후의 실험에 있어서는 위의 온도로 고정하여 실험을 진행하였다.
4-2. 뎅기바이러스의 LAMP 반응 MgSO 4 농도 최적화
실시예 3에서 선별한 뎅기바이러스 혈청형 2에 특이적으로 증폭하는 제 1 프라이머 세트 및 혈청형 4에 특이적으로 증폭하는 제 4 프라이머 세트를 각각 이용하여, 뎅기바이러스 MgSO4 농도의 최적 조건을 확인하였다.
구체적으로, BIO-RAD의 MiniOpticon Real-Time machine을 이용하여 6mM, 7mM, 8mM, 9mM 또는 10mM의 MgSO4 농도에서 30분 동안, 제 1 프라이머 세트 또는 제 4 프라이머 세트를 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 방법으로 제조한 LAMP 반응액을 동시다발적으로 증폭하였으며, BIO-RAD의 CFX Manager 3.1를 통하여 MgSO4 농도 최적화 분석을 진행하였다.
그 결과, 뎅기바이러스 혈청형 2(제 1 프라이머 세트)에서는 8mM의 농도(도 3A)가 최적 농도이며, 뎅기바이러스 혈청형 4(제 4 프라이머 세트)에서는 6mM의 농도(도 3B)가 최적 농도임을 확인하였다. 따라서, 이후의 실험에 있어서는 위의 농도로 고정하여 실험을 진행하였다.
실시예 5. LANP 프라이머 세트의 특이성 확인
뎅기바이러스 혈청형 2 및 4를 다른 바이러스들과 구분하여 검출이 가능한지 확인하기 위하여, 실시예 3에서 각 혈청형에 대하여 선별한 제 1 프라이머 세트 및 제 4 프라이머 세트를 이용하여, LAMP 반응에 따른 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4의 특이성을 분석하였다.
구체적으로, 뎅기바이러스 혈청형 1 내지 4, 노로바이러스(Norovirus), 로타바이러스(Rotavirus) 및 소바이러스성설사증바이러스(Bovine viral diarrhea)를 사용하였으며, 대조군으로 초순수정제수를 이용하였다. 바이러스의 종류, 및 실시예 4에서 확인한 최적의 온도 및 최적의 MgSO4 농도를 사용한 것을 제외하면 실시예 3과 동일한 방법으로 증폭하여 비교하였다.
그 결과, 제 1 프라이머 세트 및 제 4 프라이머 세트의 경우 다른 바이러스와는 반응하지 않았고, 뎅기바이러스 혈청형 2(제 1 프라이머 세트, 도 4A) 또는 4(제 4 프라이머 세트, 도 4B)에만 특이적으로 반응함을 확인하였다.
실시예 6. LANP 프라이머 세트의 민감도 확인
병원균의 검출 방법은 미량 농도의 병원균 DNA 및 RNA에도 유의적인 검출이 가능한 것이 요구되므로, 다양한 농도의 RNA에 대하여 LAMP 반응을 수행하여 제 1 프라이머 세트 및 제 4 프라이머 세트의 민감도를 분석하였다.
구체적으로, 뎅기바이러스를 배양한 후 RNA를 추출하고 정량하여 뎅기바이러스 혈청형 2의 경우 초순수정제수를 이용하여 7.91×100 copies 내지 7.91×109 copies로 희석하였고, 뎅기바이러스 혈청형 4의 경우 초순수정제수를 이용하여 5.98×101 copies 내지 5.98×109 copies로 희석하였다. 각각 음성 대조군으로 초순수정제수를 이용하였으며, 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 농도, 실시예 4에서 확인한 최적의 온도 및 최적의 MgSO4 농도를 사용한 것을 제외하면 실시예 3과 동일한 방법으로 증폭하여 비교하였다.
그 결과, 검출 한계(LOD)는 뎅기바이러스 혈청형 2(제 1 프라이머 세트)에서 3.55 copies/rxn(도 5), 및 뎅기바이러스 혈청형 4(제 4 프라이머 세트)에서 9.06 copies/rxn(도 6)임을 확인하였다.
즉, 상기 결과를 통하여, 제 1 프라이머 세트 또는 제 4 프라이머 세트는 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4가 미량으로 존재할 경우에도, 이를 검출하는데 이용할 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Loop Mediated Isothermal Amplification Primer Set for Detection of Dengue Virus Serotype 2 or 4 and Uses Thereof <130> PN180147 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-1-F3 <400> 1 gttaaaagtt gccactggc 19 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-1-FIP <400> 2 ccagcgagat tctttggaat tatcagtcac acactctttg gagc 44 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-1-B3 <400> 3 actgtagttc ctttgcagaa 20 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-1-BIP <400> 4 cagtgtcaca acacaataac agaccccatc tcaagtttgc ctaga 45 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-2-F3 <400> 5 ggatatttgt cacagataac gt 22 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-2-FIP <400> 6 ctgaatagct gaagccagtt ttgaaataca tggacagaac aatacaagt 49 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-2-B3 <400> 7 tcacttcatt ttctgatagg atg 23 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-2-BIP <400> 8 gagggcattt gtggaatccg tggttcaatt ccggtgtt 38 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-3-F3 <400> 9 cacatcctat cagaaaatga agt 23 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-3-FIP <400> 10 ggctgcagag atcgttttcc tagaagctga ctatcatgac agg 43 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-3-B3 <400> 11 aggtctggtt gtggagtt 18 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue2-3-BIP <400> 12 caacccactg agctgaggta ctgtggagag catttttgc 39 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-4-F3 <400> 13 accgaacctg aggacattga 20 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-4-FIP <400> 14 cgttccccac tctgagtgca tgttgctggt gcaatctcac g 41 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-4-B3 <400> 15 ccctctgagc atgtttccaa 20 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-4-BIP <400> 16 gaagcgctca gtagccctaa caccccttcc gatgacatcc a 41 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-5-F3 <400> 17 caatctcacg tctgcctgg 19 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-5-FIP <400> 18 cagcccttgt ctccaatccc atactcagag tggggaacgg 40 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-5-B3 <400> 19 ggccataaat cctgccaaga 20 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-5-BIP <400> 20 atggatgtca tcggaagggg cagcgaatcc tgggtttctg 40 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-6-F3 <400> 21 tgctcagagg gtagagagtt 20 <210> 22 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-6-FIP <400> 22 cgctggattc ctgtttgccc actcagaaac ccaggattcg c 41 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-6-B3 <400> 23 tcctccatgt tctagcacca 20 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dengue4-6-BIP <400> 24 ggtcgcccca tcctacggaa tgctccacct gagactcc 38

Claims (9)

  1. 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭(Loop mediated isothermal amplification: LAMP) 프라이머 세트에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어지고,
    상기 프라이머 세트의 고리매개등온 증폭 온도는 65.0℃인 것인
    뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트.
  2. 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어지고,
    상기 프라이머 세트의 고리매개등온 증폭 온도는 66.5℃인 것인
    뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트.
  3. 뎅기바이러스 혈청형 2 및 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트 및 서열번호 13 내지 16의 염기서열로 이루어진 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하고,
    상기 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트의 고리매개등온 증폭 온도는 65.0℃이고, 상기 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 고리매개등온 증폭 프라이머 세트의 고리매개등온 증폭 온도는 66.5℃인 것인 고리매개 등온 증폭 프라이머 세트.
  4. 제 1 항에 따른 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 검출용 조성물.
  5. 제 2 항에 따른 고리매개등온 증폭 프라이머 세트를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 4 검출용 조성물.
  6. 시료에서 RNA를 분리하는 단계; 및
    상기 RNA를 주형으로 하고, 제 1 항 또는 제 2 항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    를 포함하는 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출 방법.
  7. 삭제
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 시료는 식품, 천연물 및 생물학적 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리한 혈액, 땀, 소변, 대변 및 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출 방법.
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