KR102142978B1

KR102142978B1 - A novel pegylated substance p

Info

Publication number: KR102142978B1
Application number: KR1020170174295A
Authority: KR
Inventors: 손영숙; 홍현숙; 김선아; 조승우; 이해신; 박현지; 윤강준; 임선기
Original assignee: 경희대학교 산학협력단; 연세대학교 산학협력단; (주)엘앤케이바이오메드
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2020-08-11
Also published as: KR20180000330A

Abstract

본 발명은 신규한 PEG화 서브스턴스 P를 제공한다. 본 발명의 신규한 PEG화 서브스턴스-P는 서브스턴스-P 본래의 활성은 유지하면서 시험관내 및 생체 내에서 향상된 안정성을 가지며, 특히, 생체 내에서 증가된 반감기를 가져, 인체 적용을 위한 신규 약학적 조성물로써 현저한 효과를 보인다. The present invention provides a novel PEGylation substance P. The novel PEGylated Substance-P of the present invention has improved stability in vitro and in vivo while maintaining the original activity of Substance-P, and in particular, has an increased half-life in vivo, a novel pharmaceutical for human application It shows a remarkable effect as a suitable composition.

Description

신규 페길화 서브스턴스 Ｐ{A NOVEL PEGYLATED SUBSTANCE P}New Pegylation Substance P{A NOVEL PEGYLATED SUBSTANCE P}

본 발명은 신규한 페길화 서브스턴스 P에 관한 것이다. The present invention relates to a novel pegylation substance P.

서브스턴스-P (Substance-P; 또한 'SP'라 함)는 면역, 신경계를 조절하는 신경 펩타이드로써, 종래에는 신경 전달 물질로만 알려져 왔지만 최근 들어서는 면역계와 신경계를 연결해주는 역할을 하며 상처치유과정에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 서브스턴스 P는 골수에서 분비될 수 있는 뉴로펩타이드로 다른 성장인자들처럼 특정 수용체 (receptor)에 결합하여 신호를 전달하고, 골수와 림프구의 기능을 조절한다. Substance-P (also referred to as'SP') is a neuropeptide that regulates the immune and nervous systems, and has been known only as a neurotransmitter in the past, but recently it plays a role in connecting the immune system and the nervous system, and is involved in the wound healing process. It turns out to play an important role. Substance P is a neuropeptide that can be secreted from the bone marrow. Like other growth factors, Substance P binds to specific receptors to transmit signals and regulate the functions of bone marrow and lymphocytes.

서브스턴스 P는 11개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 사람, 쥐, 토끼에서 동일한 아미노산 서열을 가지고 있어 종간 구별이 없는 인자이다. 뉴로키닌 리셉터 (neurokinin receptor)-1을 통해 시그널을 전달하고 이 리셉터는 각막, 피부, 면역세포 등에서 발현된다. 서브스턴스 P의 기능은 통증 유도, 혈관 확장 등이 있다. 이러한 결과들을 통해 서브스턴스 P가 기존에 알려진 기능인, 신경 전달 물질로서의 역할 외에도 신경-면역계 조절, 골수 섬유증, 암세포 증식, 상처치유 등에서도 중요한 역할을 할 수 있음을 알 수 있다. Substance P is a peptide composed of 11 amino acids and has the same amino acid sequence in humans, mice, and rabbits, so it is a factor that does not distinguish between species. Signals are transmitted through neurokinin receptor-1, and this receptor is expressed in the cornea, skin, and immune cells. The functions of Substance P include pain induction and vasodilation. These results show that Substance P can play an important role in neuro-immune system regulation, bone marrow fibrosis, cancer cell proliferation, and wound healing, in addition to its previously known function as a neurotransmitter.

서브스턴스 P의 구조는 하기 화학식 1과 같다. The structure of Substance P is shown in Formula 1 below.

[화학식 1][Formula 1]

최근 서브스턴스 P는 상처 치유에 이용되고 있으며, 그 중 하나로, 각막 손상 시 상피세포의 재생을 촉진시키는 안약으로의 개발이 진행되어 왔으며 각막손상 동물 모델에서 서브스턴스 P에 의한 치유 효과가 보고되었다. 또한, 현재 안약으로서의 개발이 일본에서 진행 중이다. 이외에도 다양한 분야에서 서브스턴스 P를 활용하기 위한 연구 개발이 지속적으로 진행중에 있다. Recently, Substance P has been used for wound healing, and as one of them, the development of an eye drop that promotes the regeneration of epithelial cells in case of corneal injury has been progressed, and the healing effect of Substance P has been reported in an animal model of corneal injury. In addition, development as an eye drop is currently underway in Japan. In addition, research and development to utilize Substance P in various fields are continuously underway.

그러나, 서브스턴스 P는 혈청 내에 있는 중성 엔도펩티다제(Neutral endopeptidase)에 의해 분해되기 때문에, 실제로 체내에서 머무르는 시간은 매우 짧다는 한계가 있다. However, since Substance P is degraded by neutral endopeptidase in serum, there is a limitation in that the time it actually stays in the body is very short.

이와 관련하여, 생체내 안정성이 증가된 서브스턴스 P 변이체에 관하여 연구 개발이 필요한데, 이와 관련된 연구 개발이 거의 진행된 바가 없다. 즉, 단백질의 안정성을 증가시키기 위한 기술로써, 시알화 (sialation), 당화 (glycosylation), 타 단백질과의 접합(conjugation), 점 돌연변이 (point mutation) 등과 같은 기술들을 서브스턴스 P에 적용하여 인체에서 이용가능성을 증진시킨 서브스턴스 P를 제조할 필요성이 크게 증가하고 있으나, 현재까지 서브스턴스 P를 이용한 관련 연구개발이 이루어지지 못하였다. In this regard, there is a need for research and development on the substance P variant with increased in vivo stability, and there has been little research and development in this regard. That is, as a technology to increase the stability of a protein, technologies such as sialation, glycosylation, conjugation with other proteins, and point mutations are applied to Substance P in the human body. Although the need to manufacture Substance P with improved availability is increasing significantly, related research and development using Substance P has not been made until now.

이러한 배경하에, 서브스턴스 P의 생체내 안정성 증진을 위한 연구 개발이 시급한 실정이다. Under this background, research and development for enhancing the stability of Substance P in vivo is urgent.

본 발명은 신규한 페길화 서브스턴스 P를 제공하고자 한다. The present invention seeks to provide a novel pegylation substance P.

본 발명은 페길화 서브스턴스 P를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하고자 한다. The present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a pegylated substance P as an active ingredient.

본 발명자들은 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성이 증진된 서브스턴스-P의 개발을 위해 연구 개발을 수행하여, 페길화된 서브스턴스 P가 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성, 특히 생체내 반감기를 크게 증가시켜 인체에 적용하기 적합한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors conducted research and development for the development of Substance-P with improved stability in vitro and/or in vivo, so that the pegylated Substance P has a large in vitro and/or in vivo stability, especially in vivo half-life. By increasing it, it was confirmed that it is suitable for application to the human body, and the present invention was completed.

이에, 본 발명은 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성이 증가된 신규한 페길화(PEG화) 서브스턴스 P를 제공한다. Accordingly, the present invention provides a novel PEGylated (PEGylated) substance P with increased stability in vitro and/or in vivo.

본 발명은 페길화 서브스턴스 P, 예컨대, 서브스턴스 P의 새로운 형태의 특히 제약 제형에서의 용도 및 제조방법에 관하여 신규한 페길화 서브스턴스 P를 제공한다. The present invention provides a novel pegylated substance P, such as a novel pegylated substance P, with respect to the use and method of preparation of a new form, particularly in pharmaceutical formulations.

본 발명은 페길화 서브스턴스 P를 제공하며, 이 서브스턴스 P는 적어도 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된다. 본 발명에 따른 페길화된 서브스턴스 P는 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성, 특히 생체 내 반감기를 크게 증가시키는 장점을 가진다. The present invention provides a PEGylated Substance P, which Substance P is covalently bonded to at least one polyethylene glycol molecule. The pegylated substance P according to the invention has the advantage of significantly increasing its stability in vitro and/or in vivo, in particular its half-life in vivo.

본 발명의 페길화 서브스턴스 P는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합되며, 바람직하게 한 개 또는 두 개의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 공유 결합된 서브스턴스 P (즉, 각각 모노- 또는 다이-페길화 서브스턴스 P), 및/또는 이의 혼합물을 포함한다. The PEGylated Substance P of the present invention is covalently bonded to at least one polyethylene glycol molecule, preferably a Substance P covalently bonded to one or two polyethylene glycol molecules (i.e., each mono- or di-PEGylated substance P), and/or mixtures thereof.

서브스턴스 P가 작용하기 위해서 neurokinin receptor (NKR)와 결합할 때 직접적으로 참여하는 부분인 C-terminus의 7 내지 11의 잔기의 활성이 필수적이기 때문에, C-terminus를 페길화하는 것은 서브스턴스 P의 효능을 저하시킬 가능성이 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 PEG화 서브스턴스 P는 pegylation시 N-terminus 아민과 서브스턴스 P 서열 중간에 위치한 lysine 잔기의 side chain의 아민기에 PEG를 결합함으로써 receptor binding에 요구되는 C-terminus 위치는 보존하여 서브스턴스 P의 활성을 크게 유지 시키는 장점을 가진다. In order for Substance P to act, the activity of residues 7 to 11 of C-terminus, which is a part that directly participates when binding to the neurokinin receptor (NKR), is essential, so pegylating C-terminus is a It has the potential to reduce efficacy. Accordingly, the PEGylated substance P according to the present invention preserves the C-terminus position required for receptor binding by binding PEG to the amine group of the side chain of the lysine residue located between the N-terminus amine and the substance P sequence during pegylation. Therefore, it has the advantage of maintaining the activity of Substance P large.

본 발명의 특정 실시 양태에서, 본 발명의 페길화 서브스턴스 P는 한 개 또는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 서브스턴스 P이다. 예컨대, Mono-PEG화 서브스턴스 P는 하기 화학식 2 또는 화학식 3의 구조를 가질 수 있다. In certain embodiments of the invention, the PEGylated Substance P of the invention is a Substance P covalently linked to one or two PEG molecules. For example, the Mono-PEGylated Substance P may have a structure represented by the following Formula 2 or Formula 3.

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

상기 mono-PEG 서브스턴스 P는 pegylation 시 N-terminus 아민 또는 서브스턴스 P 서열 중간에 위치한 lysine 잔기의 side chain의 아민기에 PEG가 결합된 것이다. The mono-PEG substance P is an N-terminus amine or PEG is bound to the amine group of the side chain of the lysine residue located in the middle of the substance P sequence during pegylation.

보다 바람직하게, 페길화 서브스턴스 P는 두 개의 PEG 분자에 공유 결합된 서브스턴스 P로 하기 화학식 4의 구조를 가진다. More preferably, the PEGylated substance P is a substance P covalently bonded to two PEG molecules and has the structure of the following formula (4).

[화학식 4][Formula 4]

본 발명의 가장 바람직한 예인 상기 화학식 4의 구조는 서브스턴스 P의 N-terminus 아민 및 서브스턴스 P 서열 중간에 위치한 lysine 잔기의 side chain의 아민기에 PEG가 결합되는 구조이다. The structure of Formula 4, which is the most preferred example of the present invention, is a structure in which PEG is bonded to the amine group of the side chain of the N-terminus amine of the substance P and the lysine residue located in the middle of the substance P sequence.

본원에서 사용되는 바, "PEG"라는 용어는 폴리에틸렌 글리콜 분자를 의미한다. 그의 전형적인 형태의 경우, PEG는 말단 하이드록실기를 가진 선형 중합체로서, 이는 식 HO-(CH₂CH₂O)_n-H (여기서, n은 약 8 내지 약 4,000이다)를 가진다. 말단 수소는 캡핑기, 예를 들어, 알킬기 또는 알카놀기로 치환될 수 있다. 바람직하게, PEG는 적어도 하나의 하이드록실기를 가지며, 더욱 바람직하게, 이는 말단 하이드록실기이다.As used herein, the term "PEG" refers to a polyethylene glycol molecule. In its typical form, PEG is a linear polymer with terminal hydroxyl groups, which is the formula HO-(CH ₂ CH ₂ O) _n -H (where n is about 8 to about 4,000). The terminal hydrogen may be substituted with a capping group, for example an alkyl group or an alkanol group. Preferably, PEG has at least one hydroxyl group, more preferably it is a terminal hydroxyl group.

이러한 하이드록실기는 바람직하게 펩티드와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 링커 모이어티에 부착된다. 본 발명의 서브스턴스 P에 공유적으로 결합되는 PEG 분자의 평균 분자량은 대략 3000, 4000, 5000, 8000, 10,000, 20,000, 30,000, 또는 40,000 달톤일 수 있다. PEG 분자는 바람직하게, 3,000 내지 12,000 달톤이다. 더욱 바람직하게는, 4,000 내지 12,000 달톤이다. 가장 바람직하게는 대략 10,000 달톤이다. PEG화 시약은 선형 또는 분지형 분자일 수 있고, 단일로 또는 나란히 직렬로 존재할 수 있다. 본 발명의 PEG화된 서브스턴스 P는 바람직하게 펩티드의 N-terminus 아민 및/또는 서브스턴스 P 서열 중간에 위치한 lysine 잔기의 side chain의 아민기에 PEG가 붙도록 다양한 반응성 모이티를 보유하기 위해 변형될 수 있다. 보다 바람직하게는 직렬형으로 N-terminus 아민 및 서브스턴스 P 서열 중간에 위치한 lysine 잔기의 side chain의 아민기에 PEG가 결합된다. These hydroxyl groups are preferably attached to a linker moiety that can react with the peptide to form a covalent bond. The average molecular weight of a PEG molecule covalently bound to Substance P of the present invention may be approximately 3000, 4000, 5000, 8000, 10,000, 20,000, 30,000, or 40,000 Daltons. The PEG molecule is preferably 3,000 to 12,000 Daltons. More preferably, it is 4,000 to 12,000 Daltons. Most preferably, it is approximately 10,000 Daltons. The PEGylation reagent can be a linear or branched molecule, and can exist singly or side by side in series. The PEGylated Substance P of the present invention can be modified to retain various reactive moieties such that PEG is attached to the amine group of the side chain of the N-terminus amine of the peptide and/or the lysine residue located in the middle of the Substance P sequence. have. More preferably, PEG is bonded to the amine group of the side chain of the lysine residue located in the middle of the N-terminus amine and the substance P sequence in tandem.

이러한 활성화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자는 mPEG-숙시니미딜 숙시네이트, mPEG-숙시니미딜 카보네이트, mPEG-니트로페닐 카보네이트, mPEG-이미데이트, mPEG-숙시닐 글루타레이트 및 mPEG-시아누르 클로라이드를 포함한다. 바람직하게, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 숙시네이트는 트리스 용매 하에 서브스턴스 P와 반응하여, PEG화 서브스턴스 P를 제조할 수 있다. These activated polyethylene glycol (PEG) molecules include mPEG-succinimidyl succinate, mPEG-succinimidyl carbonate, mPEG-nitrophenyl carbonate, mPEG-imidate, mPEG-succinyl glutarate and mPEG-cyanuric chloride. Include. Preferably, methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate can be reacted with Substance P in a Tris solvent to prepare PEGylated Substance P.

본원에서 사용되는 바, "PEG화"라는 용어는 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자를 서브스턴스 P에 공유적으로 부착시키는 것을 의미한다.As used herein, the term “PEGylated” refers to covalently attaching one or more PEG molecules as described above to Substance P.

본 발명은 또한 Di-PEG화 서브스턴스 P의 제조 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for preparing a Di-PEGylated Substance P.

본 발명에 따른 제조방법은 바람직하게 하기 단계를 포함한다:The manufacturing method according to the invention preferably comprises the following steps:

(a) pH 6.0 내지 pH8.5의 트리스, PBS, 소듐 보레이트 포스페이트 또는 증류수로부터 선택되는 어느 하나의 용매 하에 서브스턴스 P를 용해시키는 단계;(a) dissolving Substance P in any one solvent selected from Tris, PBS, sodium borate phosphate or distilled water of pH 6.0 to pH 8.5;

(b) 상기 (a) 단계의 서브스턴스 P 용액에 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 숙시네이트를 혼합하여 2 ℃ 내지 8 ℃에서 10 내지 30시간동안 교반하는 단계; 및(b) mixing methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate with the Substance P solution of step (a) and stirring at 2° C. to 8° C. for 10 to 30 hours; And

(c) 상기 (b) 단계의 교반액으로부터 Di-PEG화 서브스턴스 P를 분리하는 단계.(c) separating the Di-PEGylated Substance P from the agitated solution of step (b).

본 발명에서, 서브스턴스-P는 아미노산 서열 "RPKPQQFFGLM"을 가지며, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 펩티드로써, 시판되는 것을 이용하거나 당 분야에 알려진 방법으로 화학적, 또는 유전공학적으로 합성할 수 있다. In the present invention, Substance-P has an amino acid sequence "RPKPQQFFGLM" and is a peptide having the structure of Formula 1, and can be synthesized chemically or genetically by a commercially available method or by a method known in the art.

본 발명에서, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 숙시네이트는 5,000 내지 40,000 Dalton의 분자량을 가지는 것이 바람직하며 당 분야에서 일반적으로 사용되는 것으로 시판되는 것을 사용할 수 있으며, 본 발명의 가장 바람직한 실시양태에 따르면, 10,000 dalton의 분자량을 가지는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 숙시네이트를 사용할 수 있다. In the present invention, the methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate preferably has a molecular weight of 5,000 to 40,000 Dalton, and those commercially available as those generally used in the art can be used, according to the most preferred embodiment of the present invention, Methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate having a molecular weight of 10,000 daltons can be used.

Di-PEG화 서브스턴스 P의 제조 방법의 제조 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 pH 6.0 내지 pH8.5의 트리스, PBS, 소듐 보레이트 포스페이트 또는 증류수로부터 선택되는 어느 하나의 용매 하에서 서브스턴스 P를 용해시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 서브스턴스 P의 구조적 변형을 유발하지 않고 활성에 영향을 주지 않는 중성 조건의 pH에서 반응을 수행하는 장점을 가진다. In the production method of the method for preparing Di-PEGylated Substance P, the step (a) comprises substance P in any one solvent selected from Tris, PBS, sodium borate phosphate, or distilled water of pH 6.0 to pH 8.5. And dissolving. The method of the present invention has the advantage of carrying out the reaction at a pH of a neutral condition that does not cause structural modification of Substance P and does not affect the activity.

상기 (b) 단계에서 서브스턴스 P 용액에 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 숙시네이트를 혼합하는 단계는 2 ℃ 내지 8 ℃에서 반응이 수행되어 서브스턴스 P 펩티드의 활성에 변형을 주지 않으며, 10 내지 30시간동안 교반하는 것이 바람직하다. The step of mixing methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate with the Substance P solution in step (b) does not modify the activity of the Substance P peptide by performing the reaction at 2 ℃ to 8 ℃, 10 to 30 It is preferred to stir for an hour.

상기 (c) 단계의 교반액으로부터 Di-PEG화 서브스턴스 P를 분리하는 단계는 당업계에 알려진 방법에 따라 분리 가능하며, 예컨대, amicon centrifugal filter, Hydrophobic interaction chromatography (HIC 정제), ion exchange chromatography (IEC, 이온교환 정제), affinity chromatography 등을 이용하여 분리하는 것이 바람직하다. The step of separating the Di-PEGylated Substance P from the stirring solution in step (c) can be separated according to a method known in the art, for example, amicon centrifugal filter, Hydrophobic interaction chromatography (HIC purification), ion exchange chromatography ( It is preferable to separate using IEC, ion exchange purification), affinity chromatography, etc.

상기 Di-PEG화 서브스턴스-P의 제조는 당 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시하는 기술수준의 범위에 해당하며, 구체적인 제조방법은 본원 실시예를 참조할 수 있다. The preparation of the Di-PEGylated Substance-P falls within the range of the technical level easily carried out by a person skilled in the art, and specific preparation methods may be referred to the Examples herein.

본 발명은 또한 PEG화 서브스턴스-P를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 PEG화 서브스턴스 P는 화학식 2 내지 4의 구조를 가질 수 있으며, 보다 바람직하게 화학식 4의 구조를 가진다. The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising a PEGylated Substance-P as an active ingredient. The PEGylated substance P according to the present invention may have a structure of Formulas 2 to 4, more preferably a structure of Formula 4.

본 발명의 약학적 조성물은 서브스턴스-P에 의해 매개되는 질환이나 상태의 개선, 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be used for improvement, prevention or treatment of a disease or condition mediated by Substance-P.

본 발명에 있어서, 약학적 조성물은 허혈성 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게 본 발명에 있어서 허혈성 질환은 허혈성 궤양, 허혈성 심장 질환, 심근 경색, 협심증, 뇌졸중, 뇌경색, 당뇨성 궤양, 당뇨성 하지 허혈질환 또는 하지 허혈질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명에 있어서 허혈성 질환은 하지 허혈 질환, 특히 당뇨성 하지 허혈질환이다. In the present invention, the pharmaceutical composition is preferably used for the prevention or treatment of ischemic diseases. More preferably, in the present invention, the ischemic disease may be any one selected from the group consisting of ischemic ulcer, ischemic heart disease, myocardial infarction, angina pectoris, stroke, cerebral infarction, diabetic ulcer, diabetic lower limb ischemic disease or lower limb ischemic disease. . Most preferably, in the present invention, the ischemic disease is a lower extremity ischemic disease, especially a diabetic lower extremity ischemic disease.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 인체 내에서 긴 반감기를 가지며, 줄기세포의 이동을 촉진시키며, 허혈에 따른 세포 괴사를 억제하고, 혈류를 증진시키며, 조직 섬유화를 억제하며, 근육 조직의 비율을 증진시킴으로써 허혈성 질환에 현저한 예방 및 치료 효과를 보인다. The pharmaceutical composition according to the present invention has a long half-life in the human body, promotes the migration of stem cells, inhibits cell necrosis due to ischemia, increases blood flow, inhibits tissue fibrosis, and increases the ratio of muscle tissue. By doing so, it shows remarkable preventive and therapeutic effects on ischemic diseases.

본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 적절한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is formulated in an appropriate form, such as oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to a conventional method. Can be used.

본 발명의 약학적 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 설하, 직장, 피부, 피하, 근육, 복강, 정맥, 동맥 등으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 목적하는 순도를 갖는 PEG화 서브스턴스 P를 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장 또는 투여용으로 제조될 수 있다. 이러한 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 복용자에게 무독성인 것으로, 인산염, 시트르산염, 아세트산염 및 다른 유기산염과 같은 완충제 아스코르브산과 같은 산화방지제 폴리아르기닌, 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 저분자량 (약 10개 미만의 잔기를 갖는) 펩티드 폴리비닐피롤리디논과 같은 친수성 중합체 글리신, 글루탐산, 아스파르트산 또는 아르기닌과 같은 아미노산 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 셀룰로오스 또는 그의 유도체를 포함하는 다른 탄수화물, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린 EDTA와 같은 킬레이트제 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜 나트륨과 같은 카운터 이온 및(또는) 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌글리콜과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes, for example, oral, sublingual, rectal, skin, subcutaneous, muscle, abdominal cavity, vein, artery, etc. . The pharmaceutical composition may be prepared for storage or administration by mixing a PEGylated Substance P having a desired purity with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer. These substances are non-toxic to the user at the dosages and concentrations used, buffers such as phosphates, citrates, acetates and other organic acid salts, antioxidants such as ascorbic acid, polyarginine, proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins. Hydrophilic polymers such as low molecular weight (having less than about 10 residues) peptides such as polyvinylpyrrolidinone, including amino acid monosaccharides such as glycine, glutamic acid, aspartic acid or arginine, disaccharides, and cellulose or derivatives thereof. Other carbohydrates, glucose, chelating agents such as mannose or dextrin EDTA, counterions such as mannitol or sugar alcohol sodium such as sorbitol, and/or nonionic surfactants such as Tween, Pluronics or polyethylene glycol. Include.

본 발명의 약학적 조성물은 주사용 멸균 조성물의 형태로 당업계의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 주사용 멸균 조성물은 비히클, 예를 들면, 물 또는 참깨유, 땅콩유 또는 면실유와 같은 천연 식물성 오일 또는 에틸 올레이트와 같은 합성 지방 비히클 중의 활성 화합물의 용액 또는 현택액을 포함할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of a sterile composition for injection according to a conventional method in the art. The sterile composition for injection may comprise a solution or suspension of the active compound in a vehicle, for example, water or a natural vegetable oil such as sesame oil, peanut oil or cottonseed oil, or a synthetic fat vehicle such as ethyl oleate.

상기 주사용 멸균 조성물에는 또한 완충제, 방부제, 산화 방지제 등이 당업계에 통상적으로 사용되는 모습에 따라 혼입될 수 있다.In the sterilized composition for injection, buffers, preservatives, antioxidants, and the like may also be incorporated according to the form commonly used in the art.

본 발명에서 사용되는 PEG화 서브스턴스 P의 "치료적으로 유효한 양"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.The "therapeutically effective amount" of the PEGylated Substance P used in the present invention refers to an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in an animal or human, as considered by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician. By means of an amount, it includes an amount that induces symptomatic relief of the disease or disorder being treated. It is apparent to those skilled in the art that the therapeutically effective dosage and frequency of administration of the active ingredient of the present invention will vary according to the desired effect.

그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 일례로, 성인의 경우, 본 발명의 PEG화 서브스턴스-P를 1일 1회 투여시, 0.000005 - 500 mg/체중kg, 바람직하게는 0.00005-50 mg/체중 kg 의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. Therefore, the optimal dosage to be administered can be easily determined by those skilled in the art, and the type of disease, the severity of the disease, the content of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the age, weight, and general health of the patient. It can be adjusted according to various factors including condition, sex and diet, time of administration, route of administration and rate of secretion of the composition, duration of treatment, and drugs used simultaneously. For example, in the case of an adult, when the PEGylated Substance-P of the present invention is administered once a day, it is preferable to administer at a dose of 0.000005-500 mg/kg body weight, preferably 0.00005-50 mg/kg body weight. .

본 발명의 약학적 조성물의 투여용량은 상기 설명된 질병들을 치료하는 방법에 관련하여 의사에 의해 약물의 효과를 변형시킬 만한 요인들, 예를 들어 나이, 상태, 체중, 성별, 식이, 어떤 감염에 의한 중증도, 투여시점 등의 기타 임상학적인 조건에 따른 요인들에 따라서 결정되어야 한다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is dependent on factors that may alter the effectiveness of the drug by the physician in relation to the method of treating the diseases described above, for example age, condition, weight, sex, diet, any infection. It should be determined according to factors related to other clinical conditions, such as the severity of the drug and the time of administration.

본 발명의 약학적 조성물은 단회 또는 계속적 투여가 가능하다. 다만, 초회 투여 후 일정한 순환계 농도를 유지시키기 위해 계속적인 투여를 하는 것이 바람직하다. 효과적인 투여용량과 방법은 당업계에 공지된 일반적 기술들에 기초하여 최적화될 것이며, 반복투여 횟수는 각 환자의 약동학적인 인자들과 투여경로에 따라 달라질 것이다. 상기 투여용량, 용법 및 투여횟수는 또한 투여된 약물의 물리적인 상태, 안정성, 생체내 방출속도, 생체내 제거율 등에 따라 최적화될 수 있다. 또한, 투여경로에 따른 적절한 투여용량이 체중, 체표면적, 장기의 크기에 따라 계산될 수 있다. 적절한 용량은 적절한 용량-반응 자료와 함께 혈중농도의 자료와 함께 판단하여 확정되어야 한다. 최종의 투여법은 의사에 의해 결정될 것이며, 의사는 약물의 비활성, 환자의 중증도, 약물에 대한 환자의 반응정도, 나이, 컨디션, 체중, 성별, 그리고 식이와 기타 다른 임상학적인 요인들을 고려하여 처방해야 한다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered once or continuously. However, after the initial administration, it is desirable to continue administration in order to maintain a constant circulatory system concentration. Effective dosage and method of administration will be optimized based on general techniques known in the art, and the number of repeated administrations will depend on the pharmacokinetic factors and route of administration of each patient. The dosage, administration, and frequency of administration may also be optimized according to the physical state, stability, release rate in vivo, elimination rate in vivo, and the like of the administered drug. In addition, an appropriate dosage according to the route of administration can be calculated according to body weight, body surface area, and organ size. Appropriate doses should be determined by judging with data of blood concentrations with appropriate dose-response data. The final dosage method will be decided by the doctor, and the doctor must prescribe it taking into account the inactivity of the drug, the severity of the patient, the degree of reaction of the patient to the drug, age, condition, weight, sex, diet and other clinical factors. do.

본 발명의 신규한 PEG화 서브스턴스-P는 서브스턴스-P 본래의 활성은 유지하면서 시험관내 및 생체내에서 향상된 안정성을 가지며, 특히, 생체 내에서 증가된 반감기를 가져, 인체 적용을 위한 신규 약학적 조성물로써 현저한 효과를 보인다. The novel PEGylated Substance-P of the present invention has improved stability in vitro and in vivo while maintaining the original activity of Substance-P, and in particular, has an increased half-life in vivo, a novel pharmaceutical for human application It shows a remarkable effect as a suitable composition.

도 1은 본 발명의 일실시양태에 따른 서브스턴스 P의 페길화를 위한 과정의 모식도를 나타내는 도이다.
도 2는 Gel permeation chromatography (GPC)을 통한 Di-PEG화 서브스턴스 P의 정제 전후의 크로마토그래피 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 Di-PEG화 서브스턴스 P의 ¹H-NMR 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 PEG화 서브스턴스 P의 MALDI-ToF 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 Di-PEG화 서브스턴스 P의 Digestion 후 MALDI-ToF 결과를 나타내는 도이다.
도 6은 Di-PEG화 서브스턴스 P의 Digestion 후 MALDI-ToF 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 PEG화 서브스턴스 P 혼합물의 Digestion 후 MALDI-ToF 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 인간 혈청 내 서브스턴스 P 및 PEG화 서브스턴스 P의 반감기를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 하지 허혈 마우스 동물 모델을 이용한 PEG화 서브스턴스 P의 치료 효과 확인 실험에 관한 모식도이다.
도 10은 유세포 분석법을 통하여 PEG화 서브스턴스 P의 중간엽줄기세포(MSC)와 혈관내피전구세포(EPC) 이동 촉진 작용을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 11은 비당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 하지 생존율 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 12는 비당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 혈류량 변화를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 13은 비당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 조직학적 변화를 H&E 염색, Masson's trichrome 염색, 및 CD31(capillary: 모세혈관) 및 SMA(arteriole: 세동맥) 염색을 통해 분석한 결과와 허혈 조직 내 Fibrosis 면적 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 14는 당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 하지 생존율 변화를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 15는 당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 혈류량 변화를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 16은 당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 괴사 및 정상군의 비율을 통해 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 혈류량 비율 변화를 분석한 결과를 나타내는 도이다.
도 17은 당뇨성 하지 허혈 동물 모델에서 PEG화 서브스턴스 P 투여에 의한 조직학적 변화를 H&E 염색 및 Masson's trichrome 염색을 통해 분석한 결과와 허혈 조직 내 fibrosis 면적 분석 결과를 나타내는 도이다. 1 is a diagram showing a schematic diagram of a process for pegylation of substance P according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a diagram showing chromatographic results before and after purification of Di-PEGylated Substance P through Gel permeation chromatography (GPC).
Fig. 3 is a diagram showing ¹ H-NMR results of Di-PEGylated Substance P.
4 is a diagram showing MALDI-ToF results of PEGylated substance P.
5 is a diagram showing MALDI-ToF results after Digestion of Di-PEGylated Substance P.
6 is a diagram showing MALDI-ToF results after Digestion of Di-PEGylated Substance P.
7 is a diagram showing MALDI-ToF results after digestion of a PEGylated Substance P mixture.
8 is a diagram showing the results of analyzing the half-life of substance P and PEGylated substance P in human serum.
9 is a schematic diagram of an experiment to confirm the therapeutic effect of PEGylated Substance P using an animal model of lower limb ischemia.
10 is a diagram showing the results of confirming the movement promoting action of PEGylated Substance P of mesenchymal stem cells (MSC) and vascular endothelial progenitor cells (EPC) through flow cytometry.
11 is a diagram showing the results of confirming the change in the survival rate of the lower limbs by administration of PEGylated Substance P in a non-diabetic lower limb ischemia animal model.
12 is a diagram showing the results of analysis of changes in blood flow by administration of PEGylated Substance P in a non-diabetic lower limb ischemia animal model.
13 is an analysis of histological changes by administration of PEGylated Substance P in a non-diabetic lower extremity ischemia animal model through H&E staining, Masson's trichrome staining, and CD31 (capillary: capillary) and SMA (arteriole: arteriole) staining. It is a diagram showing the results and the analysis results of the area of fibrosis in ischemic tissue.
14 is a diagram showing the results of analyzing changes in the survival rate of lower limbs by administration of PEGylated Substance P in the diabetic lower limb ischemia animal model.
15 is a diagram showing the result of confirming the change in blood flow by administration of PEGylated Substance P in the diabetic lower limb ischemia animal model.
FIG. 16 is a diagram showing the results of analyzing the blood flow rate change by administration of PEGylated Substance P through the ratio of necrosis and normal group in the diabetic lower limb ischemia animal model.
17 is a diagram showing the results of analyzing the histological changes caused by the administration of PEGylated Substance P in the diabetic lower extremity ischemia animal model through H&E staining and Masson's trichrome staining, and the results of fibrosis area analysis in ischemic tissue.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 후술하는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되지 않는다. Advantages and features of the present invention, and a method of achieving them will be clarified with reference to embodiments described below. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below.

<실시예 1> PEG화 서브스턴스 P의 제조 및 분석<Example 1> Preparation and analysis of PEGylated Substance P

1. PEG화 서브스턴스 P의 제조1. Preparation of PEGylated Substance P

PEG화 서브스턴스 P 제조를 위한 합성 모식도를 도 1에 나타내었다. 구체적으로, 100 mg 서브스턴스 P (출처: Anygene)를 20 ml Tris buffer (10 mM, pH 7.5)에 녹인 후, 5 equivalent mPEG(10K)-succinimidyl succinate (출처: sunbio)를 서브스턴스 P 용액에 넣어준 뒤 4 ℃에서 overnight으로 교반하여 반응시켰다. 합성물을 Amicon centrifugal filter (10K MWCO)를 이용하여 수 회 반복된 원심분리를 수행함으로써 Di-pegylated 서브스턴스 P (Di-PEG화 서브스턴스 P)를 분리하였다. A schematic diagram of the synthesis for the preparation of PEGylated Substance P is shown in FIG. 1. Specifically, after dissolving 100 mg Substance P (source: Anygene) in 20 ml Tris buffer (10 mM, pH 7.5), 5 equivalent mPEG (10K)-succinimidyl succinate (source: sunbio) was added to the Substance P solution. After giving, the mixture was stirred overnight at 4°C to react. Di-pegylated Substance P (Di-PEGylated Substance P) was separated by performing centrifugation repeated several times using an Amicon centrifugal filter (10K MWCO).

2. Gel permeation chromatography (GPC) 분석2. Gel permeation chromatography (GPC) analysis

상기 합성된 PEG화 서브스턴스 P를 Gel permeation chromatography (GPC)를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. The synthesized PEGylated Substance P was confirmed using Gel permeation chromatography (GPC). The results are shown in FIG. 2.

정제 전 결과를 도 2의 A에 나타냈으며, 정제 후 결과를 도 2의 B에 나타내었다. The results before purification are shown in Fig. 2A, and the results after purification are shown in Fig. 2B.

정제 전(도 2 A)에 분홍색 선은 PEG화 서브스턴스 P 혼합물을 나타내며, 회색 점선은 서브스턴스 P를 나타낸다. Before purification (Fig. 2A), the pink line represents the PEGylated Substance P mixture, and the gray dotted line represents the Substance P.

한편, 정제 후 (도 2 B)에 회색 점선 및 회색 실선은 각각 반응에 참여하지 않은 SP 및 PEG을 나타내는 것이며, 빨간선은 Amicon centrifugal filter (10K)를 이용해 혼합물을 분리정제한 후 filter되지 않고 filter 위쪽 부분에 남아있는 시료로 diPEG-SP (Di-PEG화 서브스턴스 P)을 나타낸다. On the other hand, after purification (Fig. 2B), the gray dotted line and the gray solid line indicate SP and PEG that did not participate in the reaction, respectively, and the red line was filtered after separating and purifying the mixture using an Amicon centrifugal filter (10K). The sample remaining in the upper part shows diPEG-SP (Di-PEGylated Substance P).

분리된 Di-PEG화 서브스턴스 P는 하기 화학식 4와 같다. The separated Di-PEGylated Substance P is as shown in Formula 4 below.

[화학식 4][Formula 4]

3. Di-pegylated 서브스턴스 P의 3. Di-pegylated Substance P ^1One H-NMR 분석H-NMR analysis

상기에서 분리된 Di-PEG-10K-서브스턴스 P를 ¹H-NMR을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, Di-PEG화 서브스턴스 P의 분석 peak가 확인되었으며, 이는 예상되었던 ¹H-NMR 값과 동일한 분석 결과를 보여준다. The Di-PEG-10K-substance P isolated above was confirmed through ¹ H-NMR, and the results are shown in FIG. 3. As shown in FIG. 3, the analysis peak of the Di-PEGylated Substance P was confirmed, which shows the same analysis result as the expected ¹ H-NMR value.

4. MALDI-ToF 분석4. MALDI-ToF analysis

MALDI-ToF 분석을 통하여, 서브스턴스 P의 PEG화 위치를 확인하였다. Through MALDI-ToF analysis, the PEGylation position of Substance P was confirmed.

Digestion 전에 Di-PEG화 서브스턴스 P와 PEG화 서브스턴스 P 혼합물의 MALDI-ToF 분석 결과를 도 4에 나타내었다. The results of MALDI-ToF analysis of a mixture of Di-PEGylated Substance P and PEGylated Substance P before digestion are shown in FIG. 4.

도 4의 A는 분리된 Di-PEG화 서브스턴스 P이며, 도 4의 B는 PEG화 서브스턴스 P 혼합물을 보여준다. Figure 4A shows the separated Di-PEGylated Substance P, and Figure 4B shows the PEGylated Substance P mixture.

도 4의 A에서 확인되는 바와 같이, 20,000 근처의 peak는 Dipegylated SP를, 10,000 근처의 peak은 +2 charge가 된 dipegylated SP를 (m/z에서 z가 2)보여준다. 또한, 도 4의 B에서 확인되는 바와 같이, PEG화 서브스턴스 P 혼합물의 경우 Mono-PEG화 SP (11,386 peak), Di-PEG화 SP (22,582 peak), unpurified free PEG (10,505)이 혼합되어 있는 것이 확인되었다. As can be seen from A of FIG. 4, a peak near 20,000 shows dipegylated SP, and a peak near 10,000 shows dipegylated SP with +2 charge (z is 2 at m/z). In addition, as shown in FIG. 4B, in the case of the PEGylated Substance P mixture, Mono-PEGylated SP (11,386 peak), Di-PEGylated SP (22,582 peak), and unpurified free PEG (10,505) are mixed. Was confirmed.

상기 DI-PEG화 SP 및 PEG화 서브스턴스 P혼합물은 Digestion 방법에 의해 PEG화 위치가 확인되었다. 시료는 8 M Urea 와 1: 1의 비율(각 100 ul)로 혼합된 뒤, 200 ul의 1 % 암모니윰 바이카보네이트 용매가 첨가되었다. 여기에 10 ug 트립신이 첨가되고, CaCl₂를 첨가하여 5 mM CaCl₂ 용액이 제조되었다. 상기 용액은 37 ℃에서 3.5 시간동안 반응이 수행되었다. Digestion 위치의 경우, 빗금 친 (N)-R/PK/PQQFFGLM-(C) 2 군데에 해당하며, PEG화 서브스턴스 P의 경우 밑줄 친 하기 (N)-RPKPQQFFGLM-(C) 위치에서 이루어질 것으로 예상되었으며, Digestion에 따른 peptide 단편은 하기 표 1과 같다. The DI-PEGylated SP and PEGylated Substance P mixture were PEGylated by the Digestion method. The sample was mixed with 8 M Urea in a ratio of 1: 1 (100 ul each), and then 200 ul of 1% ammonium bicarbonate solvent was added. 10 ug trypsin was added thereto, and CaCl ₂ was added to prepare a 5 mM CaCl ₂ solution. The solution was reacted at 37° C. for 3.5 hours. In the case of the digestion position, it corresponds to the hatched (N)-R/PK/PQQFFGLM-(C) 2 locations, and in the case of the PEGylated substance P, the underlined ( N )-RP K PQQFFGLM-(C) position It was expected, and the peptide fragments according to digestion are shown in Table 1 below.

[표 1] 펩타이드 단편 [Table 1] Peptide fragment

해당 분석 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다. The analysis results are shown in FIGS. 5 to 7.

도 5는 Di-PEG화 서브스턴스 P 분석 결과를 나타내며, Digestion에 따라서 10489 peak(ΔMW : 11,735-10,489 = 1,246)이 새로 확인되었다. 이는 Digestion 전후의 분자량 차이를 통해 PEG+N-R/PKPQQFFGLM-C로 나눠진 것이라 볼 수 있으며, N-terminus가 pegylation됨을 보여준다. 5 shows the results of Di-PEGylation Substance P analysis, and 10489 peak (ΔMW: 11,735-10,489 = 1,246) was newly identified according to Digestion. This can be seen as being divided into PEG+N-R/PKPQQFFGLM-C through the difference in molecular weight before and after digestion, showing that N-terminus is pegylation.

도 6 역시 Di-PEG화 서브스턴스 P 분석 결과를 나타내며, 1192 peak(PKPQQFFGLM-C, 1192.44)가 확인되지 않았다. 이는, PKQQFFGLM-C 쪽에 PEG이 붙어있기 때문(다시 말하면 PEG이 붙어서 MW가 증가했기 때문)이며, 이에 따라, 해당 위치에서의 PEG화가 이루어졌음을 보여준다. Figure 6 also shows the result of Di-PEGylation Substance P analysis, and 1192 peak (PKPQQFFGLM-C, 1192.44) was not confirmed. This is because PEG is attached to the PKQQFFGLM-C side (that is, because PEG is attached and MW is increased), and accordingly, it shows that PEGylation at the corresponding position was made.

즉, 상기 도 5 및 도 6의 결과를 통해, 본 발명에 따른 화학식 4의 Di-PEG화 서브스턴스 P의 PEG화 위치가 확인되었다. That is, through the results of FIGS. 5 and 6, the PEGylation position of the Di-PEGylation substance P of Formula 4 according to the present invention was confirmed.

도 7은 PEG화 서브스턴스 혼합물의 분석 결과를 나타내며, PKQQFFGLM-C 만큼의 MW(ΔMW : 11386-10452 = 934)이 떨어진 것으로 보아 N-RPK쪽에 PEG화가 이루어졌음을 확인하였다. 즉, 화학식 2 또는 3의 mono-PEG화 서브스턴스 P 및 화학식 4의 Di-PEG화 서브스턴스 P가 확인되었다. FIG. 7 shows the analysis results of the PEGylated substance mixture, and it was confirmed that PEGylation was made on the N-RPK side as it was seen that MW (ΔMW: 11386-10452 = 934) as much as PKQQFFGLM-C fell. That is, the mono-PEGylated substance P of Formula 2 or 3 and the Di-PEGylated substance P of Formula 4 were identified.

< 실시예 2> 인간 혈청 내에서 서브스턴스 P와 PEG화 서브스턴스 P의 반감기 분석 < Example 2> Substance P and PEGylation in human serum Half-life analysis of Substance P

R&D Biosystems 사의 서브스턴스 P 정량 분석용 parameter ELISA kit를 이용해 인간 혈청 내에서의 서브스턴스 P와 분리된 Di-PEG화 서브스턴스 P의 반감기를 분석하였다. The half-life of the substance P and the isolated Di-PEGylated substance P in human serum was analyzed using a parameter ELISA kit for quantitative analysis of Substance P of R&D Biosystems.

그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 서브스턴스 P는 37 ℃의 인간 혈청 내에서 10~20분 안에 전부 분해되어 사라지는 것을 확인하였다. 반면, PEG화 서브스턴스 P는 PEG의 효과로 인해 안정성이 증진되어 반감기가 크게 증가되었으며, 이에 따라 37℃ 조건의 혈청 내에서 48시간까지 안정한 형태를 유지하고 있음을 확인하였다.The results are shown in FIG. 8. As shown in FIG. 8, it was confirmed that substance P was completely decomposed and disappeared within 10 to 20 minutes in human serum at 37°C. On the other hand, it was confirmed that the PEGylated Substance P had improved stability due to the effect of PEG, and thus its half-life was greatly increased, and thus maintained its stable form in serum at 37°C for up to 48 hours.

상기 결과로부터, 본원 발명에 따른 PEG화 서브스턴스 P가 시험관 내를 비롯하여 생체 내에서 높은 안정성을 가짐을 확인하였다. From the above results, it was confirmed that the PEGylated Substance P according to the present invention has high stability in vivo including in vitro.

<실시예 3> 비당뇨성 하지 허혈 모델에서의 PEG화 서브스턴스 P의 효과 확인<Example 3> Confirmation of the effect of PEGylated Substance P in a non-diabetic lower extremity ischemia model

1. 비당뇨성 하지 허혈 동물 모델의 제조1. Preparation of non-diabetic lower limb ischemia animal model

하지 허혈 동물 모델 제조를 위한 모식도는 도 9에 나타내었다. A schematic diagram for preparing a lower extremity ischemia animal model is shown in FIG. 9.

마우스 (ICR, male, 5w)를 마취한 후, 수술 부위의 털을 제거하고 70% 에탄올과 베타딘을 이용하여 수술부위를 3회 소독하였다. 그 후, 왼쪽 뒷다리의 대퇴부 안쪽 피부를 절개하고 대퇴동맥 (femoral artery)을 노출시켰다. 6-0 prolene 봉합사를 이용하여 대퇴동맥의 proximal, distal 양 부분을 2회 묶은 뒤, 묶인 부위 사이의 femoral artery를 microforcep 또는 fine-point tweezers를 이용해 제거하였다. 절개된 피부를 6-0 prolene 봉합사로 봉합한 후 saline, 서브스턴스 P(SP), 또는 PEG화 서브스턴스 P 혼합물 (Di-PEG-SP, mono-PEG-SP 혼합물로, 즉, 화학식 2 내지 4의 화합물)을 2주간 주 3회 정맥 주사(용량: 5 nmole per mouse kg)하였다. After anesthetizing the mouse (ICR, male, 5w), the hair on the surgical site was removed and the surgical site was sterilized three times with 70% ethanol and betadine. Then, the skin inside the femur of the left hind limb was incised and the femoral artery was exposed. The proximal and distal parts of the femoral artery were tied twice with 6-0 prolene sutures, and the femoral artery between the tied parts was removed using microforcep or fine-point tweezers. After suturing the incised skin with 6-0 prolene sutures, saline, substance P(SP), or PEGylated substance P mixture (Di-PEG-SP, mono-PEG-SP mixture, that is, Formulas 2 to 4 Compound) was injected intravenously 3 times a week for 2 weeks (dose: 5 nmole per mouse kg).

그 후, 4주간의 회복 관찰을 통해 실험 결과를 분석하였다.After that, the experimental results were analyzed through observation of recovery for 4 weeks.

2. 유세포 분석법을 통한 PEG화 서브스턴스 P의 효과 확인2. Confirmation of the effect of PEGylated Substance P through flow cytometry

서브스턴스 P의 줄기세포 이동 촉진 작용이 PEG화 서브스턴스 P 주입 시, 더 개선 된 작용을 보이는지 확인하기 위하여 유세포 분석법을 통해 실험동물의 혈중 단핵구세포 중 중간엽줄기세포(MSC)와 혈관내피전구세포(EPC)의 비율을 조사하였다. 실험이 종료된 하지허혈질환 마우스의 전혈을 채취한 후, 피콜 구배 원심분리를 이용하여 적혈구를 제거하고 단핵구 세포를 분리하였고, 1 % bovine serum albumin이 포함된 PBS 완충액에 재현탁 시켰다. 전체 단핵구 세포 중 중간엽줄기세포(MSC)의 비율을 조사하기 위해 중간엽줄기세포(MSC) 마커, 항-CD-29 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-096-309, 1:10), 항-CD-105 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-092-930, 1:10)와 중간엽줄기세포(MSC)에서는 발현되지 않는 항-CD-45 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-091-610, 1:10) 항체를 처리하여 중간엽줄기세포(MSC)를 표지하였으며, 혈관내피전구세포(EPC)의 비율을 조사하기 위해 혈관내피전구세포(EPC) 마커, 항-CD-31 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-097-422, 1:10), 항-CD-309 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-096-405, 1:10), 및 항-CD-133 (BioLegend Inc.; Cat #141204) 항체를 처리하여 혈관내피전구세포(EPC)를 표지하였다. 표지된 세포 수를 FACS Calibur (BD Bioscience)를 이용하여 측정하고 CELLQuest software (Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였다. Mesenchymal stem cells (MSCs) and vascular endothelial progenitor cells among monocytes in the blood of experimental animals through flow cytometry to confirm that the stem cell migration promoting action of Substance P shows a more improved effect when injected with PEGylated Substance P. The ratio of (EPC) was investigated. After collecting whole blood from mice with ischemic limbs after the experiment was completed, red blood cells were removed using Ficoll gradient centrifugation, monocytes were isolated, and resuspended in PBS buffer containing 1% bovine serum albumin. Mesenchymal stem cell (MSC) marker, anti-CD-29 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-096-309, 1:10), to investigate the proportion of mesenchymal stem cells (MSC) among all monocytes. Anti-CD-105 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-092-930, 1:10) and anti-CD-45 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130- not expressed in mesenchymal stem cells (MSC)) 091-610, 1:10) antibody was treated to label mesenchymal stem cells (MSC), and vascular endothelial progenitor cells (EPC) marker, anti-CD-31 to investigate the proportion of endothelial progenitor cells (EPC). (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-097-422, 1:10), anti-CD-309 (Miltenyi Biotec Inc.; Cat #130-096-405, 1:10), and anti-CD-133 ( BioLegend Inc.; Cat #141204) antibody was treated to label endothelial progenitor cells (EPC). The number of labeled cells was measured using FACS Calibur (BD Bioscience) and analyzed using CELLQuest software (Becton Dickinson).

그 결과를 도 10에 나타내었다. The results are shown in FIG. 10.

비당뇨성 하지 허혈 질환 마우스에 서브스턴스 P(SP)를 주입한 후 1일차에 혈중 중간엽줄기세포(MSC)와 혈관내피전구세포(EPC)의 수가 증가하였고, PEG화 서브스턴스 P(PEG-SP) 주입 시에도 서브스턴스 P와 같은 결과를 보였다. 한편, 이 작용은 서브스턴스 P에 대한 antagonist 처리(Ant+SP)에 의해 감소하였다. The number of mesenchymal stem cells (MSC) and vascular endothelial progenitor cells (EPC) in blood increased on day 1 after substance P (SP) was injected into mice with non-diabetic limb ischemia, and PEGylated substance P (PEG- SP) also showed the same results as Substance P. On the other hand, this action was reduced by antagonist treatment (Ant+SP) for Substance P.

즉, PEG화에 의한 서브스턴스 P의 개질을 통해 물질의 안정성이 증가되었고 그 활성 측면에서 서브스턴스 P와 동등한 수준의 활성이 나타내는 것이 확인되었다. 이는 안정성 효과를 함께 고려 할 때, 본 발명에 따른 PEG화 서브스턴스 P가 서브스턴스 P와 대비하여 우수한 인체 내 약리적 활성을 보일 수 있음을 확인시켜준다. That is, it was confirmed that the stability of the substance was increased through the modification of Substance P by PEGylation, and an activity equivalent to that of Substance P was exhibited in terms of its activity. This confirms that when the stability effect is considered together, the PEGylated Substance P according to the present invention can exhibit superior pharmacological activity in the human body compared to Substance P.

3. 비당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서의 하지 생존율 분석3. Analysis of lower limb survival rate in a mouse model of non-diabetic limb ischemia

비당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서 하지 생존율을 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 치료를 받지 않은 비당뇨성 하지허혈 마우스 모델(PBS 그룹)이 40% 정도의 하지 절단율을 보이며 괴사도 거의 모든 마우스에서 일어나는 것과 달리, 서브스턴스 P나 PEG화 서브스턴스 P를 주사한 치료군의 다수에서 다리가 생존하거나, 괴사만 일부 일어나는 정도로 유지됨을 확인되었다. 특히, PEG화 서브스턴스 P 치료군의 경우는 하지가 모두 보존되고 극히 일부의 세포 괴사만을 보여, 서브스턴스 P 치료군보다 현저한 치료 효과가 있음이 확인되었다. 즉, PEG화 서브스턴스 P의 증진된 반감기로 인해 체내 안정성이 향상되어 서브스턴스 P보다 더 높은 치료 효능이 있음을 확인하였다. The survival rate of the lower extremities was analyzed in a mouse model of non-diabetic lower extremity ischemia, and the results are shown in FIG. 11. Unlike the untreated non-diabetic lower extremity ischemia mouse model (PBS group), which shows a 40% lower extremity amputation and necrosis occurs in almost all mice, the majority of treatment groups injected with Substance P or PEGylated Substance P It was confirmed that the leg survived or maintained to the extent that only some necrosis occurred. In particular, in the case of the PEGylated Substance P treatment group, all of the lower extremities were preserved and only a small part of cell necrosis was shown, and it was confirmed that there is a remarkable therapeutic effect than the Substance P treatment group. That is, it was confirmed that the stability in the body was improved due to the enhanced half-life of the PEGylated Substance P, and thus there was a higher therapeutic effect than the Substance P.

4. 비당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서의 혈류 개통 정도 확인4. Confirmation of blood flow patency in a mouse model of non-diabetic lower extremity ischemia

Doppler analysis를 통해 4주간의 혈류량 변화를 관찰하였다. Changes in blood flow over 4 weeks were observed through Doppler analysis.

구체적으로, 하지허혈모델 제작 직후를 포함하여 2, 7, 14, 21, 및 28일에 각 실험동물을 마취하여 High resolution laser doppler imager (출처: Moor Instruments)를 이용해 혈류량의 변화 정도를 측정하였다. 이 때 허혈을 유발한 하지와 허혈을 유발하지 않은 정상 하지를 동시에 측정하여 그 비율을 회복된 혈류량으로 계산하였다.Specifically, each experimental animal was anesthetized on the 2nd, 7, 14, 21, and 28 days, including immediately after the lower limb ischemia model was produced, and the degree of change in blood flow was measured using a high resolution laser doppler imager (source: Moor Instruments). At this time, the lower limb that caused ischemia and the normal lower limb that did not cause ischemia were measured at the same time, and the ratio was calculated as the recovered blood flow.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 대조군 (PBS 그룹 및 antagonist + 서브스턴스 P 그룹)의 경우 혈류량 회복 정도가 매우 낮은 수준임을 확인하였다. PEG화 서브스턴스 P 및 서브스턴스 P 치료 그룹에서의 혈류량이 크게 개선되는 것을 확인하였으며, 특히 PEG화 서브스턴스 P의 경우 허혈 질환 유발 일주일 이내에 60% 이상의 혈류가 회복되는 것을 확인하여, PEG화 서브스턴스 P의 증진된 반감기로 인해 체내 안정성이 향상되어 서브스턴스 P보다 더 빠르게 혈류량을 회복시킨 것을 확인하였다. The results are shown in FIG. 12. In the case of the control group (PBS group and antagonist + substance P group), it was confirmed that the degree of blood flow recovery was very low. It was confirmed that blood flow in the PEGylated Substance P and Substance P treatment groups was significantly improved.In particular, in the case of the PEGylated Substance P, it was confirmed that more than 60% of the blood flow was restored within a week of inducing ischemic disease. It was confirmed that the stability in the body was improved due to the enhanced half-life of P, and the blood flow was restored more rapidly than the substance P.

5. 비당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서의 조직학적 형상 분석 확인5. Confirmation of histologic shape analysis in a mouse model of non-diabetic lower extremity ischemia

비당뇨성 하지 허혈 모델 제작 4주 후, 조직학 분석을 통해 혈관이 제거된 허혈 근육 조직을 분석하였다. 조직학 분석을 위해 치료 4주 후 허혈 부위의 근육을 수거하여 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 Masson's trichrome 염색을 수행하였다. Four weeks after the preparation of the non-diabetic lower extremity ischemia model, the ischemic muscle tissue from which blood vessels were removed was analyzed through histological analysis. For histological analysis, after 4 weeks of treatment, the muscles of the ischemic area were collected and stained with hematoxylin & eosin (H&E) and Masson's trichrome.

H&E 염색을 위하여, 조직을 4 μm 두께로 파라핀 섹션한 후 xylene에서 파라핀을 제거하였다. 그 후 알코올을 통해 hydration 시켰다. Hematoxyline (Weigert, sigma)을 5분 동안 처리한 뒤 eosin Y로 1분간 처리하였다. 염색된 슬라이드를 95% 알코올에서 1회 워싱 한 뒤 dehydration을 거쳐 마운팅하였다. For H&E staining, the tissue was paraffin sectioned to a thickness of 4 μm, and then paraffin was removed from xylene. After that, it was hydrated through alcohol. Hematoxyline (Weigert, sigma) was treated for 5 minutes and then eosin Y for 1 minute. The stained slides were washed once in 95% alcohol and then mounted through dehydration.

Masson's trichrome 염색을 위하여, 파라핀 섹션된 샘플을 xylene과 알콜에서deparaffination, hydration, washing. Bouin soln을 샘플에 처리하고 56 ℃에서, 1 시간동안 두었다. 이차 증류수로 washing (노란색이 없어질 때까지)한 뒤. Weigert iron hematoxylin를 상온에서 10분간 처리하였다. 다시 이차증류수로 washing 10분을 진행한 후, Biebrich Scarlet-acid fuchsin soln을 상온에서 10분간 처리하였다. 이차 증류수로 다시 washing을 10분간 진행 후, 5% phosphotungstic acid를 10분간 처리하였다. 다음으로, aniline blue를 5 분간 처리하였다. 다시 이차 증류수로 washing을 10분간 진행한 후 1% acetic acid를 3분간 처리하고 다시 한번 워싱 단계를 거쳤다. 마지막으로 알코올을 거쳐 dehydration & mounting을 수행하였다. For Masson's trichrome staining, paraffin sectioned samples were deparaffination, hydration, and washing in xylene and alcohol. The sample was treated with Bouin soln and placed at 56° C. for 1 hour. After washing with distilled water (until the yellow color disappears). Weigert iron hematoxylin was treated at room temperature for 10 minutes. After 10 minutes of washing with secondary distilled water, Biebrich Scarlet-acid fuchsin soln was treated at room temperature for 10 minutes. After washing again with distilled water for 10 minutes, 5% phosphotungstic acid was treated for 10 minutes. Next, aniline blue was treated for 5 minutes. After washing with distilled water for 10 minutes, 1% acetic acid was treated for 3 minutes, and the washing step was performed again. Finally, dehydration & mounting was performed through alcohol.

실험 결과를 도 13에 나타내었다. Fig. 13 shows the experimental results.

허혈 조직 내 근육 괴사 정도를 확인할 수 있는 H&E 염색을 통해 대조군(PBS 주입군과 antagonist + 서브스턴스 P 주입군)에서는 근육 조직의 괴사가 광범위하게 일어나고 있음이 관찰되었다. 이와는 달리 PEG화 서브스턴스 P 치료군에서는 근육의 괴사가 가장 크게 감소하였으며, 근육조직의 형태가 정상 다리근육 조직에서의 형태와 비슷함을 확인하였다. It was observed that muscle tissue necrosis occurred extensively in the control group (PBS injection group and antagonist + substance P injection group) through H&E staining that can confirm the degree of muscle necrosis in ischemic tissue. In contrast, in the PEGylated Substance P treatment group, muscle necrosis was significantly reduced, and it was confirmed that the shape of the muscle tissue was similar to that of the normal leg muscle tissue.

또한, 근육조직의 섬유화 정도를 확인할 수 있는 Masson's trichrome 염색을 통해 조직 내 섬유화 정도를 확인하고 이를 정량화한 결과를 살펴보면, 조직 내 섬유화가 많이 일어난 대조군(PBS 주입군과 antagonist + SP 주입군)과는 달리 서브스턴스 P(SP) 및 PEG화 서브스턴스 P (PEG-SP) 치료군에서는 섬유화 정도가 현저히 낮으며 H&E 염색에서의 결과와 마찬가지로 근육다발의 형태가 정상 다리근육 조직에서의 형태와 비슷함을 확인하였다. 특히, PEG화 서브스턴스 P 투여 그룹의 경우 서브스턴스 P 그룹보다 유의미하게 낮은 섬유화 정도를 보여주었으며 이는 PEG화 서브스턴스 P의 향상된 치료 효능을 보여준다. In addition, Masson's trichrome staining, which can confirm the degree of fibrosis in muscle tissue, is used to check the degree of fibrosis in the tissue and look at the results of quantification. It is different from the control group (PBS injection group and antagonist + SP injection group) in which fibrosis in the tissues occurred a lot. Unlike the substance P (SP) and PEGylated Substance P (PEG-SP) treatment groups, the degree of fibrosis was remarkably low, and the shape of the muscle bundle was similar to that of the normal leg muscle tissue as the result of H&E staining. I did. In particular, the PEGylated Substance P administration group showed a significantly lower degree of fibrosis than the Substance P group, which shows an improved therapeutic efficacy of the PEGylated Substance P.

또한, 모세혈관(capillary) 염색(CD31)과 세동맥(arteriole) 염색(smooth muscle alpha-actin; SMA)의 co-staining을 통해 허혈 근육 부위의 조직을 염색한 결과, 비치료군(PBS 그룹 및 antagonist + 서브스턴스 P 그룹)과 대비하여, 서브스턴스 P(SP) 및 PEG화 서브스턴스 P (PEG-SP) 치료군에서 현저히 증가한 혈관 재생을 확인할 수 있었다. 특히, PEG화 서브스턴스 P를 투여한 그룹에서 근육의 괴사가 가장 크게 감소하였으며 섬유화 정도가 가장 낮으며 근육다발의 형태가 정상 다리근육 조직에서의 형태와 비슷한 것이 확인되었다. 즉, CD31 및 SMA 염색을 수행한 결과에서 확인되는 바와 같이, PEG-SP 처리에 따라 혈관 재생 효과가 현저히 높아졌음이 확인되었다. In addition, as a result of staining the tissues of the ischemic muscle region through co-staining of capillary staining (CD31) and arteriole staining (smooth muscle alpha-actin; SMA), the result of staining the tissues of the ischemic muscle region, the non-treated group (PBS group and antagonist + In contrast to the substance P group), remarkably increased vascular regeneration was observed in the substance P (SP) and PEGylated substance P (PEG-SP) treatment groups. In particular, in the group administered with the PEGylated Substance P, muscle necrosis was most significantly reduced, the degree of fibrosis was the lowest, and the shape of the muscle bundle was confirmed to be similar to that of the normal leg muscle tissue. That is, as confirmed from the results of performing CD31 and SMA staining, it was confirmed that the blood vessel regeneration effect was remarkably increased according to the PEG-SP treatment.

<실시예 4> 당뇨성 하지 허혈 모델에서의 PEG화 서브스턴스 P의 효과 확인<Example 4> Confirmation of the effect of PEGylated Substance P in a diabetic lower extremity ischemia model

1. 당뇨성 하지 허혈 모델의 제조1. Preparation of diabetic lower limb ischemia model

당뇨성 하지 허혈 모델을 제조하기 위하여, Streptozotocin (Sigma)을 주 2회 복강 투여함 (투여량: 100 mg/kg mouse)으로써, 당뇨를 유발하였다. Streptozotocin 주사 2주 후 혈당량 확인을 통해 혈당이 500 mg/dL 이상인 쥐만을 선별하여 당뇨성 하지허혈 질환 마우스 모델 제작에 사용하였다.In order to prepare a diabetic lower extremity ischemia model, by intraperitoneal administration of Streptozotocin (Sigma) twice a week (dose: 100 mg/kg mouse), diabetes was induced. Two weeks after the injection of streptozotocin, only mice with a blood glucose level of 500 mg/dL or more were selected by checking blood glucose levels and used to make a mouse model for diabetic ischemic disease.

상기 마우스 (ICR, male, 5w)를 마취한 후, 수술 부위의 털을 제거하고 70% 에탄올과 베타딘을 이용하여 수술부위를 3회 소독하였다. 그 후, 왼쪽 뒷다리의 대퇴부 안쪽 피부를 절개하고 대퇴동맥 (femoral artery)을 노출시켰다. 6-0 prolene 봉합사를 이용하여 대퇴동맥의 proximal, distal 양 부분을 2회 묶은 뒤, 묶인 부위 사이의 femoral artery를 microforcep 또는 fine-point tweezers를 이용해 제거하였다. 절개된 피부를 6-0 prolene 봉합사로 봉합한 후 saline, 서브스턴스 P(SP), 또는 Di-PEG화 서브스턴스 P(Di-PEG-SP)를 2주간 주 3회 정맥 주사(용량: 5 nmole per mouse kg)하였다. 그 후, 4주간의 회복 관찰을 통해 실험 결과를 분석하였다.After anesthetizing the mouse (ICR, male, 5w), the hair on the surgical site was removed, and the surgical site was sterilized three times using 70% ethanol and betadine. Then, the skin inside the femur of the left hind limb was incised and the femoral artery was exposed. The proximal and distal parts of the femoral artery were tied twice with 6-0 prolene sutures, and the femoral artery between the tied parts was removed using microforcep or fine-point tweezers. After suturing the incised skin with 6-0 prolene suture, saline, Substance P (SP), or Di-PEGylated Substance P (Di-PEG-SP) was injected intravenously 3 times a week for 2 weeks (dose: 5 nmole) per mouse kg). After that, the experimental results were analyzed through observation of recovery for 4 weeks.

2. 당뇨성 하지허혈 질환 마우스 모델에서의 하지 생존율 분석 2. Analysis of survival rate of lower limbs in diabetic ischemic disease mouse model

상기 실시예 3의 4.와 동일한 방식으로, 앞서 제조된 당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서 하지 생존율을 분석하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. In the same manner as in Example 4 of Example 3, the survival rate of the lower extremities was analyzed in the previously prepared diabetic ischemic disease mouse model, and the results are shown in FIG. 14.

도 14에 나타낸 바와 같이, 치료를 받지 않은 비당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델(PBS 그룹)이 90%에 가까운 하지 절단과 괴사율을 보임과 달리, 서브스턴스 P나 PEG화 서브스턴스 P를 주사한 치료군에서는 60% 이상의 하지허혈 마우스에서 허혈 하지가 보존된 것이 확인되었다. 특히, PEG화 서브스턴스 P 치료군의 경우는 80% 정도의 모델에서 정상 하지 형태를 유지하여, PEG화 서브스턴스 P의 치료 효능이 서브스턴스 P와 대비하여 현저한 것을 확인하였다. As shown in Fig. 14, unlike the non-diabetic lower extremity ischemic disease mouse model (PBS group) that did not receive treatment shows a lower extremity amputation and necrosis rate close to 90%, substance P or PEGylated substance P was injected. In the treatment group, it was confirmed that the ischemic limb was preserved in more than 60% of the ischemic limb mice. In particular, in the case of the PEGylated Substance P treatment group, it was confirmed that the normal leg morphology was maintained in about 80% of the model, and the treatment efficacy of the PEGylated Substance P was remarkable compared to that of the Substance P.

3. 당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서의 혈류 개통 정도 확인3. Confirmation of blood flow patency in diabetic lower extremity ischemic disease mouse model

상기 실시예 3의 4.와 동일한 방식으로, 혈류 개통 정도를 확인하여 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다. In the same manner as in Example 3 of 4, the degree of blood flow patency was checked, and the results are shown in FIGS. 15 and 16.

도 15은 시간 경과에 따른 혈류량 변화를 마우스에서 확인한 결과를 나타낸다. 실험 결과, PEG화 서브스턴스 P를 처리한 실험군에서 혈류량이 가장 높게 나타나는 것이 확인되었다. 15 shows the results of confirming changes in blood flow in mice over time. As a result of the experiment, it was confirmed that the blood flow was highest in the experimental group treated with the PEGylated Substance P.

또한, 도 15의 실험 결과를 정량화하여 도 16에 나타내었다. 도 16에서도 확인되는 바와 같이, PEG화 서브스턴스 P에 의한 효과가 서브스턴스 P 단독과 대비하여서도 현저히 높은 것이 확인되었다. 즉, 서브스턴스 P의 Pegylation에 의한 증대된 치료 효과를 확인하였다. In addition, the experimental results of FIG. 15 were quantified and shown in FIG. 16. As can be seen in Fig. 16, it was confirmed that the effect of the PEGylated Substance P was significantly higher than that of Substance P alone. In other words, it was confirmed that the enhanced therapeutic effect by Pegylation of Substance P.

4. 당뇨성 하지 허혈 질환 마우스 모델에서의 조직학적 형상 분석 확인4. Confirmation of histologic shape analysis in diabetic lower extremity ischemic disease mouse model

실시예 3의 5에서와 같이 hematoxylin & eosin (H&E) 염색과 Masson's trichrome 염색을 통해 조직학적 형상 분석을 수행하여, 그 결과를 도 17에 나타내었다. Histological shape analysis was performed through hematoxylin & eosin (H&E) staining and Masson's trichrome staining as in Example 3 of 5, and the results are shown in FIG. 17.

상기 결과들로부터, PEG화 서브스턴스 P가 증가된 시험관 내 및/또는 생체 내 안정성 향상을 통해, 인체에서 더 높은 치료 효능을 가질 수 있음을 확인하였다. From the above results, it was confirmed that the PEGylated Substance P may have higher therapeutic efficacy in the human body through increased stability in vitro and/or in vivo.

Claims

하기 화학식 4의 Di-PEG화 서브스턴스 P:
[화학식 4]

Di-PEGylated Substance P of Formula 4:
[Formula 4]

제1항에 있어서, 상기 Di-PEG화는 N-말단의 아민 및 리신 잔기의 아민 위치에서 이루어지는 것인 PEG화 서브스턴스 P.The PEGylation substance P according to claim 1, wherein the Di-PEGylation is performed at the amine position of the N-terminal amine and lysine residue.

(a) pH 6.0 내지 pH8.5의 트리스, PBS, 소듐 보레이트 포스페이트 또는 증류수 용매 하에 서브스턴스 P를 용해시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 서브스턴스 P 용액에 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 숙시니미딜 숙시네이트를 혼합하여 2 ℃ 내지 8 ℃에서 10 내지 30시간동안 교반하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 교반액으로부터 Di-PEG화 서브스턴스 P를 분리하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 4의 Di-PEG화 서브스턴스 P의 제조 방법:
[화학식 4]

(a) dissolving Substance P in a solvent of Tris, PBS, sodium borate phosphate or distilled water of pH 6.0 to pH 8.5;
(b) mixing methoxy polyethylene glycol succinimidyl succinate with the Substance P solution of step (a) and stirring at 2° C. to 8° C. for 10 to 30 hours; And
(c) A method for preparing a Di-PEGylated Substance P of Formula 4, comprising the step of separating the Di-PEGylated Substance P from the agitated solution of Step (b):
[Formula 4]