KR102137885B1 - High-efficiency cell culture medium additive including butylated hydroxyanisole - Google Patents

Abstract

본 발명은 역분화 시 발생하는 세포 소기관의 항상성을 탐색하고 스트레스를 제어할 수 있는 새로운 조절인자인 부틸화하이드록시아니솔을 배양시 적용함으로써 고효율·고기능 세포전환이 가능한 세포전환방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 의하면, 세포전환을 위한 배양과정에 부틸화하이드록시아니솔을 첨가함으로써, 세포전환 유도 효율을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 세포전환 유도에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있다. 이 때, 부틸화하이드록시아니솔은 세포전환 유도 과정 중에서 발생하는 노화 유도와 산화 스트레스를 억제하고, 세포 증식 및 미토콘드리아 활동 증진 효과를 유도함으로써 세포전환 유도 배양조건을 효과적으로 개선한다. The present invention relates to a cell conversion method capable of high-efficiency and high-function cell conversion by applying butylated hydroxyanisole, a new regulator that can search for homeostasis of cell organelles generated during dedifferentiation and control stress. More specifically, according to the present invention, by adding butylated hydroxyanisole to the culture process for cell conversion, it is possible to not only improve the efficiency of cell conversion, but also significantly reduce the time required for cell conversion. . At this time, butylated hydroxyanisole effectively improves cell conversion-inducing culture conditions by suppressing aging induction and oxidative stress occurring during the process of cell conversion, and inducing cell proliferation and mitochondrial activity-enhancing effects.

Description

부틸화하이드록시아니솔을 포함하는 고효율 세포전환용 배지 첨가제 {High-efficiency cell culture medium additive including butylated hydroxyanisole}High-efficiency cell culture medium additive including butylated hydroxyanisole}

본 발명은 부틸화하이드록시아니솔을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 세포를 전환시키는 세포전환방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 역분화와 같은 세포전환 시 발생하는 세포 소기관의 항상성을 탐색하고 스트레스를 제어할 수 있는 새로운 조절인자인 부틸화하이드록시아니솔을 배양시 적용함으로써 고효율·고기능 세포전환이 가능한 세포전환 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cell conversion method for converting cells by culturing cells in a medium containing butylated hydroxyanisole, and more specifically, searching for homeostasis and stress of organelles occurring during cell conversion such as dedifferentiation. The present invention relates to a cell conversion method capable of high-efficiency and high-function cell conversion by applying butylated hydroxyanisole, a new modulator capable of controlling fluorescence.

종래의 세포전환 기술 연구는 세포핵에서 일어나는 변화에 많은 연구와 관심이 집중되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 여전히 세포전환 효율이 매우 낮고 세포 운명 결정 기저에 관한 많은 의문이 존재한다. 이와 같은 원인은 세포핵을 중심으로 일어나는 세포운명 전환 기전과 세포질 내 수많은 세포 소기관의 변화가 충분히 동반되지 못했기 때문이며, 특히 미토콘드리아 대사/변화 및 소포체 스트레스에 대한 이해와 연구가 거의 없기 때문이다.In the conventional cell conversion technology research, many studies and interests have been focused on changes occurring in the cell nucleus. Nevertheless, there are still very few cell conversion efficiencies and many questions regarding the basis of cell fate determination. The reason for this is that the mechanism of cell fate conversion centering on the cell nucleus and the change of numerous organelles in the cytoplasm are not sufficiently accompanied, and in particular, there is little understanding and research on mitochondrial metabolism/change and endoplasmic reticulum stress.

이러한 기존의 세포전환 기술은 하기와 같은 문제점에 직면해 있다.The existing cell conversion technology faces the following problems.

배아줄기세포를 이용하여 특정 표적세포로 분화하는 전통적인 자연분화 기술은 분화 효율이 낮고, 미분화 줄기세포에 의한 종양형성 가능성이 높으며, 임상적용에 있어서 면역 거부 문제나 염색체 이상 문제를 비롯한 다양한 윤리적인 문제들이 존재한다. 표적세포로의 분화 과정상 심근세포의 경우 ~3주, 신경 및 신경줄기세포의 경우 1~2주, 간세포의 경우 ~4주 이상 걸리는 등 소요시간이 상대적으로 길고 각 단계별 효율이 매우 낮다. 또한, 종양 형성 위험성이 없는 정제된 세포를 얻기가 매우 힘들고, 배아줄기세포를 배양 및 표적세포로 분화하는데 비용이 많이 들어가는 특성으로 인해 저효율·고비용의 한계를 지니고 있다.Traditional natural differentiation techniques using embryonic stem cells to differentiate into specific target cells have low differentiation efficiency, high tumorigenicity by undifferentiated stem cells, and various ethical issues, including immune rejection problems or chromosomal abnormalities in clinical applications. They exist. In the process of differentiation into target cells, the time required is relatively long and the efficiency of each step is very low, such as ~3 weeks for cardiomyocytes, 1-2 weeks for neural and neural stem cells, and ~4 weeks for hepatocytes. In addition, it is very difficult to obtain a purified cell without the risk of tumor formation, and has a limitation of low efficiency and high cost due to the costly nature of culturing embryonic stem cells into culture and target cells.

최초 역분화 만능줄기세포가 보고된 이후 많은 연구자들에 의해서 역분화 효율을 높이기 위한 다양한 저분자 화합물, 벡터의 개발, 그리고 신호기전 연구 등이 이루어지고 있으며, 또한 최근에는 논-코딩 RNA인 마이크로RNA (miR-302 클러스터)를 이용하거나 조합 단백질 또는 합성된 mRNA 등을 매개하는 도입 방법 등이 고안되었으나, 여전히 역분화 유도만능줄기세포 생산 효율이 매우 낮다는 문제점을 가지고 있다.Since the first dedifferentiated pluripotent stem cells have been reported, various researchers have developed various low-molecular compounds, vectors, and signaling mechanisms to increase the efficiency of dedifferentiation, and recently, non-coding RNA microRNA ( miR-302 cluster) or a method of introducing a protein to mediate a combination protein or synthesized mRNA, etc. was devised, but still has a problem that the efficiency of inducing pluripotent stem cell production is very low.

역분화 유도 4개 인자를 체세포에 도입하면, 약 14일 후에 군집을 이루는 세포 집단을 관찰할 수 있는데, 최초 출현한 세포 군집의 약 90~95% 이상은 불완전 역분화 세포이며, 이와 같은 불완전 역분화 세포는 시간의 경과에 따라서 자발적인 역분화가 일어나지 않을 뿐만 아니라 전분화능 특이 유전자 발현이 현저히 낮은 것으로 알려져 있다. 따라서 이 역분화 과정 속에서 출현하는 수많은 불완전 역분화 줄기세포에 대하여 깊이 있는 연구와 이해를 바탕으로 보다 우수하고 완벽한 줄기세포 치료 자원을 확보할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 현재까지 아쉽게도 이러한 역분화 중간 단계의 불완전 역분화 세포 집단에 대한 이해와 연구가 부족할 뿐 아니라 세포 소기관에 관한 국내 연구가 매우 미진한 상태이다.Introducing 4 factors of dedifferentiation into somatic cells, it is possible to observe a population of cells that form a cluster after about 14 days. More than 90-95% of the cell clusters that first appeared are incomplete dedifferentiated cells. Differentiated cells are known to not only spontaneously dedifferentiate over time, but also have a significantly low expression of a starch-potential specific gene. Therefore, it is expected that we will be able to secure better and more complete stem cell treatment resources based on in-depth research and understanding of numerous incomplete dedifferentiated stem cells that emerge during this dedifferentiation process. Unfortunately, to date, there is a lack of understanding and research on the incomplete dedifferentiated cell population in the middle stage of dedifferentiation, and domestic research on the organelles of the cell is very poor.

다양한 사례의 교차분화기술 기반의 세포전환은 기술의 특성상 전능성단계를 거치지 않고 특정체세포로 교차분화를 유도하기 때문에 표적세포를 생산 시 소요시간이 짧고 상대적으로 적은 비용이 드는 장점을 갖는다. 일반적으로 교차분화에 소요되는 시간은 보통 1~3주 정도이며 생산되는 세포의 순도도 상대적으로 높아 최소 2단계가 소요되는 역분화 기법에 비해 단기간에 고효율의 표적 세포 생산이 가능하다. 그러나 최근 연구결과(Cell Stem Cell 2012)에 따르면 교차분화 방법으로 확립된 세포들이 세포 특이 표시인자의 발현과 체외 및 체내 기능성 부분에서 체내세포 (primary cell)와 유사하다고 알려져 있는 것과 달리, 전반적인 유전자 발현양상을 비롯한 게놈-와이드한 분석 결과는 여전히 체내 유래의 세포와는 큰 차이점을 보인다. 이러한 차이는 교차 분화된 세포가 향후 임상적 중개연구에 활용되기 위해서 반드시 개선되어야 하며, 대부분 세포에서 교차분화 효율이 여전히 낮은 편이기 때문에 교차분화 기전연구를 통해 교차분화의 효율을 극대화할 수 있는 원천기술의 개발이 필요하다.Cell conversion based on cross-differentiation technology in various cases has the advantage of short time and relatively low cost when producing target cells because it induces cross-differentiation into specific somatic cells without going through an omnipotent phase due to the nature of the technology. In general, the time required for cross-differentiation is usually about 1 to 3 weeks, and the purity of the produced cells is relatively high, so it is possible to produce high-efficiency target cells in a short period of time compared to a reverse-differentiation technique that requires at least two steps. However, according to a recent study (Cell Stem Cell 2012), cells established by the cross-differentiation method are known to be similar to primary cells in terms of the expression of cell-specific markers and in vitro and functional functions in the body. The results of the genome-wide analysis, including aspects, still show great differences from cells derived from the body. These differences must be improved in order for the cross-differentiated cells to be used in clinical interim studies in the future, and since the efficiency of cross-differentiation is still low in most cells, the source to maximize the efficiency of cross-differentiation through cross-differentiation mechanism research Development of technology is necessary.

현재까지 세포핵에서 일어나는 변화 (transcriptome and epigenome)에 많은 연구와 관심이 집중되어 왔음에도 불구하고, 여전히 세포전환 효율이 매우 낮고 세포 운명 결정 기전에 관한 많은 의문이 존재한다. 이러한 이유는 세포핵을 중심으로 일어나는 세포운명 전환 기전과 세포질 내 수많은 세포 소기관의 변화가 충분히 동반되지 못했기 때문이며, 특히 미토콘드리아 대사·변화 및 소포체 스트레스에 대한 이해와 연구는 거의 이루어지고 있지 않다.Although much research and attention has been focused on changes occurring in the cell nucleus to date (transcriptome and epigenome), there are still many cell conversion efficiencies and many questions regarding the mechanism of cell fate determination. The reason for this is that the mechanism of cell fate conversion centering on the cell nucleus and the change of numerous organelles in the cytoplasm have not been sufficiently accompanied. In particular, little understanding and research has been done on mitochondrial metabolism/change and endoplasmic reticulum stress.

현재 소포체 스트레스 존재 유무 및 그 영향에 대한 연구는 주로 개체 발생 과정 또는 세포 분화의 과정에 나타나는 것에 집중되어 있으며, 체세포 역분화 과정 또는 교차분화 과정 중에 나타날 수 있는 세포 소기관의 스트레스 특히 소포체 스트레스에 대한 연구는 전무한 실정이다.Currently, studies on the presence or absence of endoplasmic reticulum stress and its effects are mainly focused on what appears in the process of individual development or cell differentiation. Is unprecedented.

암 발생 혹은 대사성 질환의 발병에 있어서 전체적인 유전자 발현이나 후생학적 변화뿐만 아니라 세포 소기관의 문제가 되어 발병하는 경우가 많다고 알려지고 있다. 즉, 세포가 제대로 기능을 하기 위해서는 세포 소기관의 항상성 유지가 매우 중요한 것으로 알려져 있으나, 아직까지 세포전환 시 변화되는 세포 소기관의 변화 양상 및 항상성 조절 기전에 대해선 거의 밝혀진 바가 없다.In the development of cancer or the development of metabolic diseases, it is known that in many cases, it is caused not only by overall gene expression or epigenetic changes, but also by problems of organelles. That is, in order for cells to function properly, it is known that maintenance of the organelle's homeostasis is very important, but little is known about the mode of change of the organelle and the mechanism of homeostasis control that changes during cell conversion.

일련의 연구 결과에 따르면 개체의 정상적인 발생과정에서 여러 종류의 특정 막 단백질 및 분비 단백질들이 소포체에서 만들어지며, 이에 따라 소포체내에 단백질의 이상 합성에 의한 스트레스(ER stress)가 발생하였다.According to the results of a series of studies, various types of specific membrane proteins and secreted proteins are produced in the endoplasmic reticulum during normal development of the individual, and accordingly, ER stress caused by abnormal synthesis of proteins in the endoplasmic reticulum.

케라티노사이트의 분화 과정에서 역시 미분화 세포의 경우 UPR(Unfolded Protein Response) 발현이 매우 낮지만, 케라티노사이트로의 분화 과정에서 BiP, ATF6, HRD1, PDI, CHOP 등의 ER 스트레스 마커(stress marker) 유전자들의 발현이 현저히 증가함이 보고되었다.In the process of differentiation of keratinocytes, unfolded protein response (UPR) expression is very low in undifferentiated cells, but ER stress markers such as BiP, ATF6, HRD1, PDI, and CHOP during differentiation into keratinocytes. It has been reported that the expression of genes is markedly increased.

세포의 분화 과정에서 역시 이러한 ER 스트레스를 제대로 해소하지 못할 경우 줄기세포의 분화능(stemness)이 현저하게 감소하게 된다. 예를 들어 ER 스트레스가 발생할 경우, 내장줄기세포의 여러 줄기세포의 마커의 발현이 현저히 감소하며, 결국 이들 세포의 줄기세포로서의 특징(signature)이 사라지게 된다.In the process of cell differentiation, if the ER stress is not properly relieved, the stem cell differentiation (stemness) is significantly reduced. For example, when ER stress occurs, the expression of markers of various stem cells of visceral stem cells is significantly reduced, and eventually, the signature of these cells as stem cells disappears.

이러한 연구결과를 바탕으로 소포체 스트레스가 세포의 분화 및 세포전환과정에서 중요한 역할을 하고 있다는 것을 알 수 있다. 그러나, 아직까지 이와 같은 연구가 주로 개체 발생과정 및 질환 발병 모델에서 연구되어 왔으며, 체세포 역분화 과정이나 교차분화 과정 중에서 일어날 수 있는 세포 소기관의 스트레스에 대한 연구는 전무하다.Based on these results, it can be seen that endoplasmic reticulum plays an important role in cell differentiation and cell transformation. However, such studies have been mainly studied in the developmental process and disease onset model, and there are no studies on the stress of the organelles that may occur during the somatic de-differentiation process or the cross-differentiation process.

상기와 같이 역분화/교차분화 개발 이후, 새로운 세포전환 기술을 개발하고자 다양한 기술이 시도되었으나, 많은 연구와 노력에도 불구하고 (한국특허출원 10-2013-0132270), 여전히 낮은 효율성과 저급한 기능성의 문제를 극복하지 못하였다.As described above, after the development of reverse differentiation/cross-differentiation, various technologies have been attempted to develop new cell conversion technologies, but despite many studies and efforts (Korean Patent Application No. 10-2013-0132270), there are still problems of low efficiency and low functionality. Did not overcome.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 세포 소기관 변화와 스트레스 유발 기전을 탐색하고 제어 인자를 탐색하던 중, 부틸화하이드록시아니솔의 세포 소기관 스트레스 억제 활성을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.The present invention has been devised to solve the above problems, while the cell organelle changes and stress-inducing mechanisms are being explored and control factors are being explored, the activity of inhibiting the organelle stress of butylated hydroxyanisole was confirmed. The present invention was completed on the basis of this.

본 발명의 목적은 부틸화하이드록시아니솔을 포함하는, 소포체 스트레스 (ER stress) 억제용 배지 첨가제를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a medium additive for inhibiting ER stress, comprising butylated hydroxyanisole.

본 발명의 다른 목적은 상기 배지 첨가제를 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a medium composition for inducing dedifferentiation into induced pluripotent stem cells, comprising the medium additive.

본 발명의 또 다른 목적은 부틸화하이드록시아니솔을 체세포 또는 불완전 역분화 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for inducing dedifferentiation into induced pluripotent stem cells, comprising the step of treating butylated hydroxyanisole with somatic cells or incomplete dedifferentiated cells.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 분화된 세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide cells differentiated by the above method.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다. However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object, the present invention

부틸화하이드록시아니솔을 포함하는, 소포체 스트레스 (ER stress) 억제용 배지 첨가제를 제공한다.It provides a medium additive for inhibiting ER stress, including butylated hydroxyanisole.

본 발명의 일 구현예로 상기 배지 첨가제는 배지에 1∼100 μM의 농도로 첨가될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the medium additive may be added to the medium at a concentration of 1 to 100 μM.

또한, 본 발명은 상기 배지 첨가제를 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a medium composition for inducing reverse differentiation into induced pluripotent stem cells, comprising the medium additive.

또한, 본 발명은 부틸화하이드록시아니솔을 체세포 또는 불완전 역분화 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inducing dedifferentiation into induced pluripotent stem cells, comprising the step of treating butylated hydroxyanisole to somatic cells or incomplete dedifferentiated cells.

본 발명의 일 구현예로 상기 체세포는 역분화 유도인자가 도입된 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the somatic cell may be introduced with a factor for inducing dedifferentiation.

본 발명의 다른 구현예로 상기 역분화 유도인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the dedifferentiation inducer may be selected from the group consisting of Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 세포를 제공한다.In addition, the present invention provides cells differentiated by the above method.

본 발명에 의하면, 세포전환을 위한 배양과정에 부틸화하이드록시아니솔을 첨가함으로써, 세포전환 유도 효율을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라 세포전환 유도에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있다. 부틸화하이드록시아니솔은 세포전환 유도 과정 중에서 발생하는 노화 유도와 산화 스트레스를 억제하고, 세포 증식 및 미토콘드리아 활동 증진 효과를 유도함으로써 세포전환 유도 배양조건을 효과적으로 개선한다. According to the present invention, by adding butylated hydroxyanisole to the culture process for cell conversion, it is possible to not only improve the efficiency of cell conversion, but also significantly reduce the time required for cell conversion. Butylated hydroxyanisole effectively improves the cell conversion-inducing culture conditions by inhibiting aging induction and oxidative stress occurring during the cell conversion-induction process, and inducing cell proliferation and mitochondrial activity-enhancing effects.

본 발명은 다양한 소스에서 확보된 적은 양의 환자-특이적 체세포로부터 유도만능줄기세포의 제작과정, 환자-특이적 체세포로부터 다른 기능을 갖는 환자-특이적 체세포의 제작과정, 줄기세포에서 체세포로의 제작과정을 최적화하는데 기여할 수 있고, 이로써 임상적용 가능한 개인 맞춤형 줄기세포 세포 치료제 개발 및 신약개발과정을 획기적으로 개선하고, 실용화 시기를 앞당기는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다. The present invention is a process for producing induced pluripotent stem cells from a small amount of patient-specific somatic cells obtained from various sources, a process for producing patient-specific somatic cells having different functions from patient-specific somatic cells, stem cells to somatic cells It can be expected to contribute to optimizing the manufacturing process, and thus, it is expected to significantly improve the development of a new drug development process and personalized stem cell therapeutics that can be clinically applied, and accelerate the time to commercialization.

또한, 본 발명은 세포전환시 목적하는 세포들을 대량으로 배양가능한 시스템을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.In addition, it is expected that the present invention can be usefully used to develop a system capable of culturing desired cells in large quantities during cell conversion.

도 1은 본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 역분화 효율을 확인한 결과를 나타낸 것으로서, 도 1a는 partially reprogrammed cell에서 역분화 마커인 SSEA4 및 TRA1-60을 이용하여 역분화 효율을 확인한 결과이며, 도 1b는 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)로 유도된 iPSC에서 역분화 마커인 SSEA4 및 TRA1-60을 이용하여 역분화 효율을 확인한 결과이다.
도 2는 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)로 유도된 iPSC에 대한 Alkaline Phosphatase (AP) 염색에서 양성 반응을 통해 역분화 효율을 확인한 결과이다.
도 3은 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)를 이용하여 역분화를 유도할 때, 농도 별 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 ER-stress 관련 유전자 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과이다.Figure 1 shows the results of confirming the dedifferentiation efficiency according to the butylated hydroxyanisole treatment according to the present invention, Figure 1a is a partially reprogrammed cell using the dedifferentiation markers SSEA4 and TRA1-60 to confirm the dedifferentiation efficiency As a result, FIG. 1B is a result of confirming the efficiency of dedifferentiation using the dedifferentiation markers SSEA4 and TRA1-60 in iPSC induced by human fibroblast cells.
2 is a result confirming the efficiency of dedifferentiation through a positive reaction in Alkaline Phosphatase (AP) staining for iPSC induced by human fibroblast cells.
3 is a result of confirming ER-stress related gene expression according to butylated hydroxyanisole treatment according to concentration by qRT-PCR when inducing dedifferentiation using human fibroblast cells.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 효율적인 세포전환에 대해서 연구한 결과, 세포 소기관 스트레스가 세포의 분화 및 세포전환과정에서 중요한 역할을 하고 있다는 점을 근거로 세포소기관 변화와 스트레스 유발 기전을 탐색하고 제어 인자를 탐색하던 중, 부틸화하이드록시아니솔의 세포 소기관 스트레스 억제 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.As a result of research on efficient cell conversion, the present inventors searched for cell organelle changes and stress-induced mechanisms and search for control factors based on the fact that organelle stress plays an important role in cell differentiation and cell conversion processes. The present invention was completed by confirming the activity of butylated hydroxyanisole to inhibit organelle stress.

이에, 본 발명은 부틸화하이드록시아니솔을 포함하는, 소포체 스트레스 (ER stress) 억제용 배지 첨가제 및 상기 배지 첨가제를 포함하는 유도만능줄기세포로의 역분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a medium composition for inducing reverse differentiation into induced pluripotent stem cells comprising a medium additive for inhibiting ER stress, and a medium additive containing butylated hydroxyanisole.

본 발명에서 부틸화하이드록시아니솔(Butylated hydroxyanisole)은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 하기 화학식 2로 표시되는 2-터셔리-부틸-4-히드록시아니솔과 하기 화학식 3으로 표시되는 3-터셔리-부틸-4-히드록시아니솔의 두 이성체의 혼합물로 존재한다.In the present invention, butylated hydroxyanisole (Butylated hydroxyanisole) is a compound represented by the following formula (1), 2-tertiary-butyl-4-hydroxyanisole represented by the following formula (2) and 3 represented by the following formula (3) Exists as a mixture of two isomers of tertiary-butyl-4-hydroxyanisole.

[화학식 1][Formula 1]

[화학식 2][Formula 2]

[화학식 3][Formula 3]

본 발명에서 사용되는 용어, "세포전환"이란 배아줄기세포의 자연분화법 (spontaneous differentiation), 역분화 유도만능줄기세포 전환 (reprogramming)과 교차분화 (direct conversion), 그리고 체세포 핵이식 줄기세포 (SCNT) 확립 과정을 포괄하는 세포전환 기술을 의미한다.As used in the present invention, the term "cell conversion" refers to natural differentiation of embryonic stem cells (spontaneous differentiation), reverse differentiation induced pluripotent stem cell reprogramming and direct conversion, and somatic cell nuclear transfer stem cells (SCNT) ) It means the cell conversion technology that covers the establishment process.

상기 자연분화는 줄기세포를 체세포 또는 전구세포로 분화시키는 것이고, 상기 역분화는 체세포 또는 전구세포를 줄기세포로 역분화시키는 것이며, 상기 교차분화는 체세포를 다른 기능의 체세포 또는 전구세포로 교차분화시키는 것일 수 있다The natural differentiation is to differentiate stem cells into somatic cells or progenitor cells, the reverse differentiation is to differentiate somatic cells or progenitor cells into stem cells, and the cross-differentiation cross-differentiates somatic cells into somatic or progenitor cells of other functions. Can be

상기 줄기세포는 목적에 따라 적절히 제한 없이 선택될 수 있으며, 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 공지된 모든 조직, 세포 등의 성체 세포로부터 유래할 수 있으며, 예를 들어, 골수, 제대혈, 태반(또는 태반 조직세포), 지방(또는 지방조직 세포) 등으로부터 유래할 수 있다.The stem cells may be appropriately selected without limitation depending on the purpose, and may be derived from adult cells such as mammals including humans, preferably all known tissues or cells derived from humans, for example, bone marrow, Cord blood, placenta (or placental tissue cells), fat (or adipose tissue cells), and the like.

예컨대, 상기 줄기세포는 골수, 지방 조직, 근육 조직, ex vivo 배양된 자기조직 간엽 줄기 세포, 동종 이계 간엽 줄기 세포, 제대혈, 배 난황낭, 태반, 제대, 골막, 태아 및 사춘기 피부, 그리고 혈액으로부터 제한없이 얻어지는 줄기세포일 수 있으며, 태아 또는 출생직후 또는 성인으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다.For example, the stem cells are restricted from bone marrow, adipose tissue, muscle tissue, ex vivo cultured autologous mesenchymal stem cells, allogeneic mesenchymal stem cells, umbilical cord blood, embryonic yolk sac, placenta, umbilical cord, periosteum, fetal and adolescent skin, and blood It may be stem cells obtained without, or may be stem cells derived from a fetus or immediately after birth or from an adult.

상기 줄기세포는, 예를 들어 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 말초혈줄기세포 및 골수줄기세포, 신경줄기세포, 조혈모줄기세포, 유도배반엽 상피줄기세포, 지방줄기세포, 혈관내피전구세포 및 중간엽줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.The stem cells are, for example, embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, placental stem cells, umbilical cord stem cells, peripheral blood stem cells and bone marrow stem cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, induced blastodermal epithelial stem cells, fat Stem cells, vascular endothelial progenitor cells and mesenchymal stem cells may be any one cell selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

상기 체세포는 섬유아세포(fibroblst), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 성상교세포(astrocyte), 혈액세포, 제대혈유래 조혈모줄기세포 및 혈관내피세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 세포일 수 있다. 상기 체세포는, 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미할 수 있는 것으로, 예를 들어, 섬유아세포, 근육세포, 신경세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, 주피세포(pericyte), 성상교세포(astrocyte), B세포, 혈액세포, 상피세포 신경줄기세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 제대혈유래 조혈모줄기세포, 혈관내피세포 또는 제대혈 줄기세포 등도 사용할 수 있다. 그러나, 교차분화는 시작세포가 체세포이면 특정 조직세포 여부에 상관없이 적용할 수 있으므로, 상기에 제한되지 않는다.The somatic cells include fibroblst, epithelial cells, muscle cells, nerve cells, gastric mucosal cells, goblet cells, G cells, B cells, epidermal cells, astrocytes, blood cells, cord blood-derived hematopoietic stem cells, and It may be any one cell selected from the group consisting of vascular endothelial cells. The somatic cells may mean all cells except germ cells, for example, fibroblasts, muscle cells, nerve cells, gastric mucosal cells, goblet cells, G cells, pericyte, astrocytes ), B cells, blood cells, epithelial cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, cord blood-derived hematopoietic stem cells, vascular endothelial cells, or cord blood stem cells may also be used. However, cross-differentiation is not limited to the above, since it can be applied irrespective of whether or not a specific tissue cell is a starting cell.

본 발명에서 사용되는 용어 "분화"란 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화이며, 좁게는 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정도 분화에 해당된다. 또한, "자연분화"라 칭하기도 한다.The term "differentiation" as used in the present invention refers to a phenomenon in which cells divide and proliferate and the structure or function of cells is specialized during the growth of an entire individual. In other words, it refers to a process in which cells, tissues, etc. of an organism are transformed into a suitable form and function to perform a role given to each. For example, the process of transforming an omnipotent stem cell such as an embryonic stem cell into ectodermal, mesodermal, and endoderm cells is also differentiated, and narrowly, the process by which hematopoietic stem cells turn into red blood cells, white blood cells, platelets, etc. also corresponds to differentiation. It is also referred to as "natural differentiation."

본 발명에서 사용되는 용어 "분화된 세포"란 상기 분화과정이 진행되어 일정 형태 및 기능을 가지게 된 세포를 말한다. 본 발명의 분화된 세포는 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 생식세포, 체세포 (somatic cell) 또는 전구세포 (progenitor cell)이다. 또한, 바람직하게는 인간에게서 유래한 세포이다The term "differentiated cell" used in the present invention refers to a cell that has a certain shape and function through the differentiation process. The differentiated cells of the present invention are not particularly limited, but are preferably germ cells, somatic cells or progenitor cells. In addition, it is preferably a human-derived cell.

본 발명에서 사용되는 용어 "역분화 (de-differentiation)"는 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 상태로 복원될 수 있는 프로세스를 의미한다. 또한, 상기 역분화는 본 발명에서 세포 리프로그래밍과 동일한 의미로 사용된다. 이러한 세포의 역분화 기작은 핵 내의 후생유전학 (뉴클레오타이드 서열에서의 변화없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득한다.As used herein, the term "de-differentiation" refers to a process by which differentiated cells can be restored to a state with the potential for a new type of differentiation. In addition, the dedifferentiation is used in the same sense as cell reprogramming in the present invention. The mechanism of dedifferentiation of these cells means establishing a different set of epigenetic marks after the epigenetic marks in the nucleus (the DNA state associated with causing genetic changes in function without changes in the nucleotide sequence) are deleted. However, while multicellular organisms differentiate and grow, different cells and tissues acquire different gene expression programs.

본 발명에서 사용되는 용어 "고효율 세포전환"이란 세포전환이 일어나는 과정에서 세포전환의 과정이 빠르게 일어나게 하거나, 세포전환되는 효율이 증가된 것을 말한다. 곧, 세포전환의 효율을 속도 또는 비율면에서 증진한다는 의미를 포함한다.The term "high-efficiency cell conversion" used in the present invention means that the process of cell conversion occurs rapidly in the process of cell conversion or the efficiency of cell conversion is increased. In other words, it includes the meaning of improving the efficiency of cell conversion in terms of speed or ratio.

본 발명에서 사용되는 용어 "역분화 유도인자"란 최종적으로 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 유도만능줄기세포로 역분화 되도록 유도하는 물질이다. 상기 역분화 유도인자는 최종적으로 분화된 세포의 역분화를 유도하는 물질이면 제한 없이 포함할 수 있으며, 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 역분화 유도인자로서 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 추가로 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 Oct4 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, Oct4, Sox2, KlF4 및 c-Myc 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있다.The term "de-differentiation inducer" used in the present invention is a substance that induces finally differentiated cells to de-differentiate into induced pluripotent stem cells having a new type of differentiation potential. The dedifferentiation inducer may include, without limitation, any substance that induces dedifferentiation of the finally differentiated cells, and may be selected according to the type of cells to be differentiated. Although not limited thereto, preferably, a protein selected from the group consisting of Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28, and Rex1 as a dedifferentiation inducer or a nucleic acid molecule encoding these proteins is additionally included. It may, and more preferably, may include Oct4 protein or nucleic acid molecules encoding these proteins, may include Oct4, Sox2, KlF4 and c-Myc proteins or nucleic acid molecules encoding these proteins.

본 발명에서 사용되는 용어 "교차분화 (또는 이하, "직접교차분화(Direct Reprogramming/Direct Conversion/Transdifferentiation)라 칭하기도 함)"는 고등생물에서 전혀 다른 세포타입을 가지는 성숙한 (분화가 끝난) 세포 간의 전환을 유도하는 과정으로서, 이는 유도만능줄기세포 (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 과정과 달리, 유도만능줄기세포단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가진다. 현재 교차분화는 질병모델링과 신약 발굴 등에 이용될 가능성을 인정받고 있으며, 미래에는 유전자 치료 그리고 재생의학 등에도 응용될 수 있을 것이라 기대된다. The term “cross-differentiation” (or hereinafter also referred to as “direct reprogramming/direct conversion/transdifferentiation”), as used in the present invention, is between mature (differentiated) cells with completely different cell types in higher organisms. As a process of inducing conversion, unlike the process of reprogramming into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and re-differentiating it into a desired cell, it does not go through an induced pluripotent stem cell stage, but instead becomes a desired cell immediately. It has a difference in that it induces the conversion of the present.It is currently recognized that it can be used for disease modeling and discovery of new drugs, and is expected to be applied to gene therapy and regenerative medicine in the future.

본 발명에서 사용되는 용어 "체세포"는 생식세포를 제외한 동식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 염색체가 2n을 유지한다는 특성이 있다.The term "somatic cell" used in the present invention refers to all cells that have completed differentiation constituting animals and plants except germ cells, and has a characteristic that the chromosome maintains 2n.

본 발명에서 사용되는 용어 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화운명 (fate)을 가지고 있는 부모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포 (뉴런)에 대해서는 신경아세포 (뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다The term "progenitor cell" used in the present invention refers to a parent cell that does not express a differentiation trait but has a differentiation fate when the cell corresponding to a progeny expresses a specific differentiation trait. For example, neurons (neurons) correspond to progenitor cells for neurons (neurons), and myoblasts to progenitor cells for myotubes.

본 발명에서 사용되는 용어 "다능성 줄기세포 (pluripotent stem cell)"란 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성 (pluripotent)이거나 전능성 (totipotent)이 있는 자가재생산능 (self-renewal)을 갖는 줄기세포를 말하며, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 포함하나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 해당 다능성 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 다능성 줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 다능성 줄기세포이다.The term "pluripotent stem cell" used in the present invention refers to a pluripotent or totipotent self-renewal capable of differentiating into cells of all tissues of an individual. Refers to a stem cell having, and includes, but is not limited to, embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. The pluripotent stem cells include pluripotent stem cells derived from humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, etc., but are preferably pluripotent stem cells derived from humans. .

본 발명에서 사용되는 용어 "배아줄기세포"란, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성이거나 전능성이 있는 자가재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 본 발명의 배아줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 배아줄기세포이다.As used in the present invention, the term "embryonic stem cell" refers to an inner cell mass extracted from the blastocyst embryo just before the fertilized egg implants into the mother's uterus and cultured in vitro, and differentiates into cells of all tissues of the individual. Refers to a cell having a pluripotent or omnipotent self-renewal capable, and broadly includes embryoid bodies derived from embryonic stem cells. The embryonic stem cells of the present invention include embryonic stem cells derived from humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, etc., but are preferably human-derived embryonic stem cells.

본 발명에서 사용되는 용어 "유도만능줄기세포"란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 유도만능줄기세포 (iPSCs: induced pluripotent stem cells)라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기 세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, 인 비트로 (in vitro) 및 인 비보 (in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이 (germline transmission)가 가능하다.The term "derived pluripotent stem cell" used in the present invention refers to cells induced to have pluripotent differentiation ability through artificial dedifferentiation process from differentiated cells, also called induced pluripotent stem cells (iPSCs) do. The artificial dedifferentiation process is performed by retroviral and lentiviral virus-mediated or non-viral vector use, introduction of non-viral-mediated dedifferentiation factors using protein and cell extracts, or by stem cell extracts, compounds, etc. Includes a dedifferentiation process. Induced pluripotent stem cells have almost the same characteristics as embryonic stem cells, specifically showing similar cell shapes, similar to gene and protein expression patterns, and capable of differentiating in vitro and in vivo . It forms a teratoma, and when inserted into the blastocyst of a mouse, forms a chimera mouse, and germline transmission of the gene is possible.

본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"란 숙주세포에서 목표 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미할 수 있다. 상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.The term "vector" used in the present invention is an expression vector capable of expressing a target protein in a host cell, and may mean a gene construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a gene insert. The vector includes a signal sequence or a leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, an operator, an initiation codon, a termination codon, a polyadenylation signal, and an enhancer, and may be variously prepared according to the purpose. The promoter of the vector can be constitutive or inducible. In addition, the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, the origin of replication. Vectors can be self-replicating or integrated into host DNA.

본 발명에서 사용되는 용어 "배지 (culture media)"는 시험관내 (in-vitro)에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지 (cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, aMEM (a Minimal essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 배지는 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신 (gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.The term "culture media" used in the present invention refers to a medium capable of supporting stem cell growth and survival in vitro (in-vitro), and is conventionally used in the art suitable for culturing cells. All media are included. Media and culture conditions can be selected according to the cell type. The medium used for culture is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), and generally contains a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component. These cell culture minimal media include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI1640, F-10, F-12, aMEM (a Minimal Essential Medium), GMEM (Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, and the like. In addition, the medium may include antibiotics such as penicillin, streptomycin, and gentamicin.

본 발명에서 사용되는 용어 "단백질을 코딩하는 핵산분자"는 세포 내에 전달되면 그 자체로 해당 단백질을 발현할 수 있도록 프로모터 등에 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있으며, 또한, 세포 내 염색체에 삽입되어 해당 단백질을 발현할 수 있는 핵산 분자를 폭넓게 포함한다. 예를 들어, 역분화 유도인자로서 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산분자가 발현벡터 안에 작동 가능하게 연결되어 세포 내로 전달될 수도 있으며, 숙주 세포의 염색체 내로 삽입되는 형태로 세포 내로 전달될 수도 있다.The term "nucleic acid molecule encoding a protein" used in the present invention may be in a form operably linked to a promoter or the like so as to express the protein itself when delivered in a cell, and is also inserted into a chromosome in a cell and the corresponding protein Nucleic acid molecules capable of expressing a wide range. For example, a nucleic acid molecule encoding any one or more proteins selected from the group consisting of Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28 and Rex1 as dedifferentiation inducers is operably linked in an expression vector. It may be delivered into the cell, or may be delivered into the cell in a form inserted into the host cell's chromosome.

본 발명에서 사용되는 용어 "세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다.As used in the present invention, the term "cell therapy agent" is a pharmaceutical product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention with cells and tissues prepared through separation, culture, and special authoring from humans, and functions of cells or tissues Refers to a medicine used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through a series of actions such as proliferation, selection of living autologous, allogeneic, or xenogeneic cells in vitro, or altering the biological properties of cells by other methods to restore them. .

본 발명의 일실시예에서는 인간 혈액세포 (human mononuclear cell) 를 이용하여 역분화 유도 인자를 이용하여 역분화를 유도하면 대다수 불완전 역분화 세포 (partially reprogrammed cell)가 출현하는데, 본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔을 처리한 뒤, FACS 분석을 통해 역분화 효율을 정량적으로 분석한 결과, 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따라 ER-stress가 억제되어 역분화가 유의적으로 증가되는 것을 구체적으로 확인하였으며, 또한 인간 섬유아세포를 역분화 유도 인자를 이용하여 역분화가 유도 되는 초기부터 본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔을 처리한 뒤, FACS 분석을 통해 역분화 효율을 정량적으로 분석한 결과, 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따라 ER-stress가 억제되어 역분화가 유의적으로 증가되는 것을 구체적으로 확인하였고, Alkaline Phosphatase (AP) 염색을 진행한 결과, AP 양성 콜로니가 대조군과 유사한 수준에서 형성되는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 1 및 2 참조).In one embodiment of the present invention, when inducing dedifferentiation using a dedifferentiation inducing factor using human blood cells (human mononuclear cell), a majority of partially reprogrammed cells appear, butylation according to the present invention After treatment with hydroxyanisole, quantitative analysis of reverse differentiation efficiency through FACS analysis revealed that ER-stress was suppressed according to the treatment with butylated hydroxyanisole, thereby specifically increasing the reverse differentiation. In addition, after the treatment of the butylated hydroxyanisole according to the present invention from the initial stage of dedifferentiation inducing human fibroblasts using a dedifferentiation inducer, the result of quantitatively analyzing the dedifferentiation efficiency through FACS analysis, The ER-stress was suppressed according to the treatment with butylated hydroxyanisole, and it was specifically confirmed that the reverse differentiation was significantly increased. As a result of staining with Alkaline Phosphatase (AP), AP positive colonies formed at a level similar to that of the control group. It could be confirmed (see Examples 1 and 2).

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 ER-stress 관련 유전자 (ATF3 ,ATF4, ATF6, GADD34, CHOP, BIP, tXBP1, SxBP1)의 발현을 확인하였다. 그 결과, 부틸화하이드록시아니솔 처리에 의해 ER-stress 관련 유전자 발현이 경감되는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 3 참조).In addition, in another embodiment of the present invention, the expression of ER-stress related genes (ATF3,ATF4, ATF6, GADD34, CHOP, BIP, tXBP1, SxBP1) according to butylated hydroxyanisole treatment was confirmed. As a result, it was confirmed that ER-stress-related gene expression was reduced by treatment with butylated hydroxyanisole (see Example 3).

상기 결과에 따라 부틸화하이드록시아니솔에 의한 세포 소기관 스트레스의 효율적인 억제 및 그에 따른 역분화 효율 향상 효과를 확인하였는바, 세포전환시 목적하는 세포들을 대량으로 배양하는 세포 전환기술로써 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.According to the results, it was confirmed that the effective suppression of the stress of organelles by butylated hydroxyanisole and the effect of improving the dedifferentiation efficiency accordingly, can be usefully used as a cell conversion technology for culturing desired cells in large quantities during cell conversion. It suggests that you can.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 부틸화하이드록시아니솔을 체세포 또는 불완전 역분화 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 방법을 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention provides a method for inducing dedifferentiation into induced pluripotent stem cells, comprising the step of treating butylated hydroxyanisole with somatic cells or incomplete dedifferentiated cells.

본 발명에서 사용되는 용어 ‘불완전 역분화 세포’란 세포의 역분화시 중간단계에서 부분적으로 역분화된 세포들을 일컫는다.The term'incomplete dedifferentiated cell' used in the present invention refers to cells partially dedifferentiated at an intermediate stage during dedifferentiation of cells.

본 발명에서 사용되는 용어 “불완전 역분화 세포 (partially reprogrammed cell)”란 최초 역분화를 유도하기 위하여 4가지 유도인자 (Yamanaka factor; OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC)를 체세포에 도입하면, 약 14일 후에 군집 (colony)을 이루는 세포 집단을 관찰할 수 있다. 이 때, 출현한 세포 군집의 약 90~95% 이상은 불완전 역분화 세포 (TRA1-60 표지 인자 음성)이며, 이와 같은 불완전 역분화 세포는 시간의 경과에 따라서 자발적인 역분화 (TRA1-60 양성)가 일어나지 않을 뿐만 아니라 전분화능 특이 유전자 발현이 현저히 낮은 것으로 알려진 세포를 말한다. 따라서 불완전 역분화 세포는 새로운 세포 내 신호 자극이 있을 때 완전 역분화 세포로 이행될 수 있는 역분화 중간 단계 세포이다. The term “partially reprogrammed cell” used in the present invention is introduced into somatic cells by introducing four inducers (Yamanaka factor; OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC) to induce first dedifferentiation. After 14 days, a population of cells forming a colony can be observed. At this time, about 90-95% or more of the appeared cell populations are incomplete dedifferentiated cells (TRA1-60 marker factor negative), and such incomplete dedifferentiated cells spontaneously dedifferentiate over time (TRA1-60 positive). Refers to cells that are known to not only occur but also have a significantly low expression of starch-specific genes. Thus, incomplete dedifferentiated cells are intermediate cells of dedifferentiation that can migrate to fully dedifferentiated cells when there is signal stimulation within the new cells.

이 때, 부틸화하이드록시아니솔을 체세포에 처리할 경우, 상기 체세포는 역분화 유도인자가 도입된 것일 수 있으며, 역분화 유도인자를 체세포에 전달하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역분화 유도인자를 분화된 세포의 배양액에 투여하는 방법, 역분화 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법 또는 역분화 유도인자의 유전자를 삽입한 바이러스 벡터로 트랜스펙션시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스로 분화된 세포를 감염시키는 것인 방법을 사용할 수 있다.At this time, when butylated hydroxyanisole is treated on somatic cells, the somatic cells may be introduced with a dedifferentiation inducer, and a method for delivering the dedifferentiation inducer to somatic cells may be performed on cells normally used in the art. A method for providing a nucleic acid molecule or a protein can be used without limitation, but preferably, a method of inducing a dedifferentiation inducer to a culture medium of differentiated cells, a method of injecting a dedifferentiation inducer directly into differentiated cells, or inducing dedifferentiation It is possible to use a method that infects cells differentiated with a virus obtained from packaging cells transfected with a viral vector into which the gene of the factor has been inserted.

상기 역분화 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microijection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.The method for directly injecting the dedifferentiation inducer into differentiated cells may be used by selecting any method known in the art, but is not limited thereto, microijection, electroporation, and particles It can be appropriately selected and applied from a method using a particle bombardment, a direct muscle injection method, an insulator, and a transposon.

본 발명에 있어서, 상기 역분화 유도인자는 역분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28, Rex1 및 microRNA-302 cluster로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 어느 하나 이상의 핵산분자를 더 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 Oct4 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있으며, Oct4, Sox2, KlF4 및 c-Myc 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함할 수 있다.In the present invention, the dedifferentiation inducer may be selected according to the type of cells to be dedifferentiated, but is not limited thereto, preferably Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog, Lin-28, Rex1 and It may further include any one or more proteins selected from the group consisting of microRNA-302 clusters or any one or more nucleic acid molecules encoding these proteins, more preferably Oct4 proteins or nucleic acid molecules encoding these proteins. And may include Oct4, Sox2, KlF4 and c-Myc proteins or nucleic acid molecules encoding these proteins.

본 발명에 있어서, 상기 패키징 세포는 사용된 바이러스 벡터에 따라 당업계에 공지된 다양한 세포를 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 GP2-293 패키징 세포를 사용할 수 있다.In the present invention, the packaging cells can be used by selecting various cells known in the art according to the viral vector used, but is not limited thereto, preferably, GP2-293 packaging cells can be used.

또한, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retroviruses), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), mMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 렌티바이러스(Lentiviruses), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스바이러스(Herpes simplex virus), 센다이 바이러스(Sendai virus) 및 에피조말(episomal) 벡터 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 pMXs를 사용할 수 있다.In addition, the viral vectors are retroviruses, for example, human immunodeficiency virus (HIV), Murine leukemia virus (MLV), Avian sarcoma/leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), Rous sarcoma virus (RSV) , mMTV (Mouse mammary tumor virus), Lentiviruses, Adenovirus, Adeno-associated virus, Herpes simplex virus, Sendai virus and It may include vectors derived from epizomal vectors and the like, but is not limited thereto, preferably retroviral vectors may be used, and more preferably retroviral vector pMXs may be used.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 분화된 세포를 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention provides cells differentiated by the above method.

상기 세포전환방법을 통해 제조되는 역분화된 다능성 줄기세포는, 분화된 세포에 부틸화하이드록시아니솔과 역분화 유도인자를 처리하여 얻어지는 시험관 내 모든 세포 배양물을 포함할 수 있다. 상기 세포 배양물은 역분화 과정에 있는 각종 세포들과 이를 배양하는 과정에서 얻어지는 각종 단백질 및 효소, 전사체들과 이를 함유하는 배양액까지 포함할 수 있다.The dedifferentiated pluripotent stem cells prepared through the cell conversion method may include all cell cultures in vitro obtained by treating the differentiated cells with butylated hydroxyanisole and a dedifferentiation inducer. The cell culture may include various cells in the process of reverse differentiation, various proteins and enzymes obtained from the process of culturing them, and even transcripts containing the same.

본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 역분화 유도인자를 형질도입하고, 부틸화하이드록시아니솔이 포함된 배양액에서 배양한 역분화된 다능성 줄기세포가 분화된 세포에 대비하여 세포성장 및 증식이 증진되며, 세포사멸이 억제되고, 미토콘드리아 활성이 증진되며, 노화가 억제되고, 산화스트레스가 감소되며, p53 신호전달이 억제되고, 역분화 유도 시간이 단축되며, 역분화 유도 효율이 증진되는 특징을 보이는 것을 확인하였다.In a preferred embodiment of the present invention, cell growth and proliferation are promoted in comparison with differentiated pluripotent stem cells cultured in a culture medium containing butylated hydroxyanisole by transducing a dedifferentiation inducer. , Apoptosis is suppressed, mitochondrial activity is enhanced, aging is suppressed, oxidative stress is reduced, p53 signaling is suppressed, induction time for dedifferentiation is shortened, and dedifferentiation induction efficiency is enhanced. Was confirmed.

상기 전달 단계 및 배양 단계는 동시, 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있다.The delivery step and the culture step may be performed simultaneously, sequentially or in reverse order.

상기 세포전환이 교차분화인 경우, 본 발명의 세포전환방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:When the cell conversion is cross-differentiation, the cell conversion method of the present invention may include the following steps:

(a) 체세포에 교차분화인자를 도입하는 단계; 및(A) introducing a differentiation factor into the somatic cells; And

(b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 불완전 역분화 세포를 부틸화하이드록시아니솔을 포함하는 배지에서 배양하는 단계.(b) Incubating the incomplete dedifferentiated cells obtained in step (a) in a medium containing butylated hydroxyanisole.

상기 (a) 단계에서 교차분화인자의 도입은 벡터를 이용할 수 있다.In the step (a), a vector may be used for the introduction of the cross-differentiation factor.

상기 교차분화인자는 OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2, Hnf4a, Foxa1, Foxa3, Gata4, Hnf1a, FLI1 (Friend leukemia virus integration 1), ETV2 (Ets variant gene 2), GATA1, TAL1, LMO2, KLF1 및 RUNX1로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다The cross-differentiation factors include OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2, Hnf4a, Foxa1, Foxa3, Gata4, Hnf1a, FLI1 (Friend leukemia virus integration 1), ETV2 (Ets variant gene 2), It may be any one or more selected from the group consisting of GATA1, TAL1, LMO2, KLF1 and RUNX1

상기 OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2 유전자는 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공될 수 있는데, 단백질은 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2,NKX6.2 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 각 유전자의 단백질 변이체를 포함한다.The OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, and NKX6.2 genes may be provided in the form of a protein or a nucleic acid encoding a protein thereof, the proteins being human and mouse, horse, sheep, pig, goat, It can contain any protein from animals such as camels, antelopes, and dogs. In addition, the OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2 proteins used in the present invention include proteins having amino acid sequences of their wild type, as well as protein variants of each gene.

상기 단백질의 변이체란, 상기 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있고, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.Variant of the protein means a protein in which the natural amino acid sequence of the protein and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. The variant may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein, or a variant in which the physical and chemical properties of the protein are modified as necessary, or may be a variant in which structural stability to the physical and chemical environments is increased or a physiological activity is increased. have.

또한, 상기 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기한 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(genomic DNA, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.In addition, the nucleic acid encoding the protein is a wild-type or a nucleotide sequence encoding a protein in a variant form as described above, and one or more bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof. It can be prepared using a chemical synthesis method. The nucleic acid having the nucleotide sequence encoding the protein may be a single chain or a double chain, and may be a DNA molecule (genomic DNA, cDNA) or an RNA molecule.

본 발명의 일 구체예로서, 본 발명에서 OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2 단백질을 코딩하는 핵산분자는 각 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단백질을 발현하는 벡터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, in the present invention, the nucleic acid molecules encoding OCT4, SOX1, SOX2, SOX10, OLIG2, NKX2.2, and NKX6.2 proteins are vectors expressing proteins containing nucleic acids encoding each protein. Can.

본 발명에서 사용가능한 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 (Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스 (Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 센다이 바이러스(Sendai virus) 및 에피조말 (episomal) 벡터 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 벡터 시스템은 특정 세포에 관련된 유전자를 체세포에서 과발현시켜 교차분화를 유도하는 목적을 위해 사용하는 것으로서 어떠한 벡터 시스템을 사용하더라도 본 발명의 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 일구체예에서, 상기 벡터는 OCT4를 발현하는 pMX 기반의 레트로바이러스 벡터일 수 있다Vectors usable in the present invention include plasmid vectors, cosmid vectors, viral vectors, epiisomal vectors, and the like. Preferably, it can be a viral vector. Virus vectors include lentiviral vectors, retroviruses, such as Human immunodeficiency virus (HIV), Murineleukemia virus (MLV), Avian sarcoma/leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), Rous sarcoma virus (RSV) , MMTV (Mouse mammary tumor virus), adenovirus (Adenovirus), adeno-associated virus (Adeno-associated virus), herpes simplex virus (Herpes simplex virus), Sendai virus (Sendai virus) and epizomal (episomal) vector It includes, but is not limited to, one vector. Such a vector system is used for the purpose of inducing cross-differentiation by overexpressing a gene related to a specific cell in somatic cells, and can exhibit the effect of the present invention regardless of using any vector system. In one embodiment of the present invention, the vector may be a pMX-based retroviral vector expressing OCT4.

또한, 상기 단백질을 암호화하는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나, 리포좀 (Liposome), 양이온성 고분자 (Cationic polymer)등을 이용하여 세포 내로 도입할 수 있다.In addition, the nucleic acid encoding the protein can be introduced into cells using known methods in the art, for example, naked DNA in the form of vectors, or introduced into cells using liposomes, cationic polymers, and the like. Can.

상기 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체를 형성하여 세포 내로 도입될 수 있다.The liposome is a phospholipid membrane prepared by mixing cationic phospholipids such as DOTMA or DOTAP for gene transfer. When cationic liposomes and anionic nucleic acids are mixed at a certain ratio, nucleic acid-liposomal complexes can be formed and introduced into cells. .

구체적으로, 본 발명에서 상기 단백질을 암호화하는 핵산분자는, 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 패키징(packaging) 세포로 형질전환 및 감염시켜 각 유전자를 발현하도록 제작한 벡터 및 바이러스에 포함되어 체세포 내로 도입될 수 있다. 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다.Specifically, in the present invention, the nucleic acid molecule encoding the protein is included in a vector and a virus designed to express each gene by transforming and infecting a viral vector containing the nucleic acid encoding the protein with packaging cells. Can be introduced into somatic cells. The virus includes, but is not limited to, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes simplex virus, and the like.

상기 배지는 특별히 제한되지 않으며, 종래에 알려져 있는 배지를 사용할 수 있으며, 그 구체예로서 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, L-알라닐-L-글루타민, 글리세롤 2-포스페이트, 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 셀레늄염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 DMEM(Dulbeco’s Modified Eagle’s Media) 배지일 수 있으며, 상기 인슐린, 트랜스페린, 및 셀레늄 염은 상업적으로 시판되는 ITS (Gibco, USA)를 사용할 수도 있다. 또한, 상기 배지는 필요에 따라, 우태아혈청(FBS) 및 항생제를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 약 10%의 FBS, 약 1%페니실린-스트렙토마이신을 포함할 수 있다.The medium is not particularly limited, and a conventionally known medium can be used, and specific examples thereof include dexamethasone, ascorbic acid, insulin, transferrin, L-alanyl-L-glutamine, glycerol 2-phosphate, fibroblast growth factor ( bFGF) and DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) medium containing a compound selected from the group consisting of selenium salt, the insulin, transferrin, and selenium salt may be used commercially available ITS (Gibco, USA) . In addition, the medium may further include fetal bovine serum (FBS) and antibiotics, if necessary, for example, about 10% FBS, and about 1% penicillin-streptomycin.

상기 세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 세포를 포함하나, 바람직하게는 인간 유래의 세포이다.The cells include cells derived from humans, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, dogs, cats, mice, rabbits, etc., but are preferably human-derived cells.

상기 배양은 펠렛 배양 형태로 통상의 배양 플레이트 상에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양될 수 있다. 배양기간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 약 3주간 동안 수행될 수 있다. 배양 완료 후, 세포는 펠렛 형태로 얻어지게 되며, 배지를 제거함으로써 분리할 수 있다.The culture may be performed on a conventional culture plate in the form of pellet culture, for example, cultured at 37°C, 5% CO ₂ . The culture period is not particularly limited, but may be performed, for example, for about 3 weeks. After incubation, the cells are obtained in pellet form and can be isolated by removing the medium.

또한, 상기 배양은 다수의 연속 계대 배양일 수 있다.In addition, the culture may be a plurality of continuous passage culture.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments are provided to help understanding of the present invention. However, the following examples are only provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법Example 1. Experiment preparation and experiment method

1-1. 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)의 배양1-1. Culture of induced pluripotent stem cells (iPSC)

역분화 과정에서 부틸화하이드록시아니솔의 효율을 확인하기 위해서, 인간 혈액 세포 유래 불완전 역분화 세포 (partially reprogrammed cell) 및 섬유아세포 (fibroblast cell)를 배양하였다.In order to confirm the efficiency of butylated hydroxyanisole during the reverse differentiation, human blood cell-derived partially reprogrammed cells and fibroblast cells were cultured.

먼저, Partially reprogrammed cell를 배양하기 위해서, 환자 혈액 10 ㎖를 병원으로부터 수득하여 Ficoll-paque를 사용하여 mononucleocytes를 확보하였으며, SCF, TPO, Flt3, IL-6, 및 IL-3를 함유한 RPMI1640 배지에서 약 6 일간 배양을 진행하였다. 이 후, Sendai virus (cytotune-iPS reprogramming kit, Invitrogen)를 사용하여 역분화 인자 (Yamanaka factor; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 도입하였으며, 이 후, 상기 배양액으로 4 일간 배양을 진행한 뒤, 배양이 완료되면 비트로넥틴 (Vitronectin)으로 코팅된 배양접시로 옮긴 후, mTesR-E8 배지에서 배양을 진행하였다.First, in order to cultivate partially reprogrammed cells, 10 ml of patient blood was obtained from the hospital to obtain mononucleocytes using Ficoll-paque, and in RPMI1640 medium containing SCF, TPO, Flt3, IL-6, and IL-3. Incubation was carried out for about 6 days. Subsequently, a Sendai virus (cytotune-iPS reprogramming kit, Invitrogen) was used to introduce a de-differentiation factor (Yamanaka factor; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc), and thereafter, culture was performed for 4 days with the culture medium. Then, when the culture was completed, it was transferred to a culture dish coated with Vitronectin, and then cultured in mTesR-E8 medium.

일정 기간 배양 후, fully reprogrammed iPS 세포 및 partially reprogrammed 세포를 수득하였다.After incubation for a period of time, fully reprogrammed iPS cells and partially reprogrammed cells were obtained.

다음으로, 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)를 이용한 유도만능줄기세포 배양하기 위해서, 인간 섬유아세포주 (BJ1)를 10 % FBS를 함유한 DMEM 배지에서 배양을 진행한 후, Sendai virus (cytotune-iPS reprogramming kit, Invitrogen)를 사용하여 역분화 인자 (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 도입하였으며, 이 후, 상기 배양액으로 4 일간 배양을 진행한 뒤, 배양이 완료되면 MEF (Mouse embryonic fibroblst)가 있는 배양접시 또는 비트로넥틴 (Vitronectin)으로 코팅된 배양접시로 옮긴 후, hESC 전용 또는 mTesR-E8 배지에서 배양을 진행하였다.Next, in order to culture induced pluripotent stem cells using human fibroblast cells, the human fibroblast line (BJ1) was cultured in DMEM medium containing 10% FBS, and then Sendai virus (cytotune-iPS reprogramming) kit, Invitrogen) was used to introduce de-differentiation factors (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc).After this, the culture was performed for 4 days, and when the culture was completed, mouse embryonic fibroblst (MEF) was generated. After transferring to a culture dish or a culture dish coated with Vitronectin, the culture was performed in hESC only or mTesR-E8 medium.

1-2. FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 분석1-2. FACS (Fluorescence-activated cell sorting) analysis

상기 실시예 1-1로부터 수득한 partially reprogrammed cell 5x10⁴/24 wells에 50 uM의 부틸화하이드록시아니솔을 6 일간 처리한 후, 초기 역분화 마커인 SSEA4 및 최종 역분화 마커인 TRA1-60을 발현하는 세포를 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 분석하였다.After treating the partially reprogrammed cell 5x10 ⁴ /24 wells obtained from Example 1-1 with 50 uM of butylated hydroxyanisole for 6 days, the initial dedifferentiation marker SSEA4 and the final dedifferentiation marker TRA1-60 were obtained. The expressing cells were analyzed using FACS (Fluorescence-activated cell sorting).

마찬가지로 역분화 인자 (Yamanaka factor; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)가 처리된 인간 섬유아세포 (BJ1) 5x10⁴/24 wells에 10, 50 및 100 uM의 부틸화하이드록시아니솔이 들어간 E8 배양액 (Vitronectin 코팅된 배양접시)에서 14 일간 역분화를 유도한 후, 초기 역분화 마커인 SSEA4 및 최종 역분화 마커인 TRA1-60을 발현하는 세포를 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 분석하였다.Similarly, human fibroblasts (BJ1) treated with a reverse differentiation factor (Yamanaka factor; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 5x10 ⁴ /24 wells containing 10, 50 and 100 uM of butylated hydroxyanisole in E8 culture ( After inducing 14 days of reverse differentiation in a Vitronectin coated culture dish, cells expressing the initial dedifferentiation marker SSEA4 and the final dedifferentiation marker TRA1-60 were analyzed using FACS (Fluorescence-activated cell sorting).

1-3. 콜로니 형성률 확인 (Alkaline Phosphatase staining)1-3. Confirmation of colony formation rate (Alkaline Phosphatase staining)

MMC 처리-MEF 5x10⁴/24 wells를 준비하여 역분화 인자 (Yamanaka factor; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)가 처리된 인간 섬유아세포 (BJ1) 2.5x10⁴/24 wells를 10 및 100 uM의 부틸화하이드록시아니솔이 들어간 hESC 배양액에서 14 일간 역분화를 유도한 후, 제조사 프로토콜에 따라 Alkaline Phosphatase (AP) 염색 (Staemgent 사)을 수행하였다.MMC treated-MEF 5x10 ⁴ /24 wells were prepared to prepare human fibroblasts (BJ1) treated with dedifferentiation factors (Yamanaka factor; Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 2.5x10 ⁴ /24 wells at 10 and 100 uM. After inducing reverse differentiation for 14 days in hESC culture containing butylated hydroxyanisole, Alkaline Phosphatase (AP) staining (Staemgent) was performed according to the manufacturer's protocol.

1-4. ER-stress 관련 유전 발현 확인 (qRT-PCR)1-4. Confirmation of genetic expression related to ER-stress (qRT-PCR)

본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔에 의한 세포의 역분화 과정에서 ER-stress 관련 유전자의 발현 변화를 확인하고자 하였다.It was intended to confirm the expression change of ER-stress related gene in the process of dedifferentiation of cells by butylated hydroxyanisole according to the present invention.

보다 구체적으로, 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)를 이용하여 역분화를 유도할 때, 부틸화하이드록시아니솔 처리 농도 (10, 50 및 100 uM)에 따른 ER-stress 관련 유전자 (ATF3 ,ATF4, ATF6, GADD34, CHOP, BIP, tXBP1, SxBP1)의 발현을 qRT-PCR를 수행하여 확인하였다.More specifically, when inducing dedifferentiation using human fibroblast cells, ER-stress related genes (ATF3,ATF4, ATF6) according to the concentration of butylated hydroxyanisole treatment (10, 50 and 100 uM) , GADD34, CHOP, BIP, tXBP1, SxBP1) was confirmed by performing qRT-PCR.

실시예 2. 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 세포 전환 효율 확인Example 2. Confirmation of cell conversion efficiency according to treatment with butylated hydroxyanisole

2-1. partially reprogrammed cell의 역분화 효율 확인2-1. Check the efficiency of reverse differentiation of partially reprogrammed cells

본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 partially reprogrammed cell의 역분화 효율을 확인하기 위해서, 상기 실시예 1-2에 따라 배아줄기세포 특이 마커인 SSEA4 및 TRA1-60을 이용하여 역분화 효율을 정량하였다.In order to confirm the efficiency of dedifferentiation of partially reprogrammed cells according to the treatment with butylated hydroxyanisole according to the present invention, dedifferentiation efficiency using SSEA4 and TRA1-60, which are embryonic stem cell specific markers according to Example 1-2, was performed. Was quantified.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, ER-stress 유도제인 TG에 의해서는 역분화가 유의적으로 감소하였으나, 본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔 처리에 의해서 역분화가 유의적으로 증가하는 것을 구체적으로 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로, 부틸화하이드록시아니솔은 SSEA4 및 TRA1-60의 발현은 단순 증가를 유도하였다.As a result, as shown in Figure 1a, the ER-stress inducer TG was significantly reduced, but the differentiation was significantly increased by the butylated hydroxyanisole treatment according to the present invention. It was confirmed specifically. More specifically, the expression of SSEA4 and TRA1-60 in the butylated hydroxyanisole induced a simple increase.

2-2. 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)로부터 유도된 iPSC의 역분화 효율 확인2-2. Determination of iPSC-induced differentiation efficiency from human fibroblast cells

본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)로부터 유도된 iPSC의 역분화 효율을 확인하기 위해서, 상기 실시예 1-2에 따라 배아줄기세포 특이 마커인 SSEA4 및 TRA1-60을 이용하여 역분화 효율을 정량하였다.In order to confirm the efficiency of dedifferentiation of iPSC derived from human fibroblast cells according to the treatment with butylated hydroxyanisole according to the present invention, the embryonic stem cell specific markers SSEA4 and TRA1 according to Example 1-2 above The reverse differentiation efficiency was quantified using -60.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)를 이용할 경우, 역분화 최종 마커 (TRA1-60)의 발현 차이는 거의 없었으나, 부틸화하이드록시아니솔 처리 농도에 따라 역분화 초기 마커 (SSEA4)는 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. As a result, as shown in Figure 1b, when using human fibroblasts (Fibroblast cells), there was little difference in the expression of the final marker of dedifferentiation (TRA1-60), but dedifferentiation according to the concentration of butylated hydroxyanisole treatment It can be seen that the initial marker (SSEA4) increases significantly.

2-3. 인간 섬유아세포 (Fibroblast cell)로부터 유도된 iPSC의 Alkaline Phosphatase (AP) 염색에서 양성 반응 확인2-3. Confirmation of a positive response in Alkaline Phosphatase (AP) staining of iPSC derived from human fibroblast cells

다음으로, 상기 실시예 1-3에 따라 각 농도에 따른 역분화 효율은 hESC-특이 인자인 Alkaline Phosphatase (AP) 염색에서 양성 반응을 나타내는바, 염색된 콜로니 수를 카운트하여 본 발명에 따른 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 역분화 효율 정량화하였다.Next, the dedifferentiation efficiency according to each concentration according to Examples 1-3 shows a positive reaction in the staining of hESC-specific factor Alkaline Phosphatase (AP), and the number of stained colonies is counted to butylate according to the present invention. Quantification of reverse differentiation efficiency according to hydroxyanisole treatment.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 부틸화하이드록시아니솔 10 uM에서 control에 비하여 유의적으로 AP 양성 콜로니가 형성되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that AP-positive colonies were formed significantly at 10 µM of butylated hydroxyanisole compared to control.

실시예 3. 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 ER-stress 경감 효과 확인Example 3. Confirmation of ER-stress mitigation effect according to butylated hydroxyanisole treatment

본 발명의 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 ER-stress 경감 효과를 확인하기 위해서, 상기 실시예 1-4에 따라 부틸화하이드록시아니솔 처리에 따른 ER-stress 관련 유전자 (ATF3 ,ATF4, ATF6, GADD34, CHOP, BIP, tXBP1, SxBP1)의 발현을 확인하였다.In order to confirm the effect of reducing ER-stress according to the treatment of the butylated hydroxyanisole of the present invention, ER-stress related genes (ATF3, ATF4, ATF6) according to the butylated hydroxyanisole treatment according to Examples 1-4 above , GADD34, CHOP, BIP, tXBP1, SxBP1).

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 부틸화하이드록시아니솔 처리에 의해 ER-stress 관련 유전자의 발현이 경감되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 부틸화하이드록시아니솔이 ER-stress를 직접적으로 제어함으로써 역분화 효율을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the expression of the ER-stress related gene is reduced by the treatment with butylated hydroxyanisole. It was confirmed from the above results that the butylated hydroxyanisole can increase the efficiency of reverse differentiation by directly controlling ER-stress.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustration only, and those skilled in the art to which the present invention pertains can understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims (7)

부틸화하이드록시아니솔을 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 증진용 배지 조성물.Media composition for promoting induction of dedifferentiation into induced pluripotent stem cells, comprising butylated hydroxyanisole. 제1항에 있어서, 상기 부틸화하이드록시아니솔은 배지에 1∼100 μM의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 조성물.The composition of claim 1, wherein the butylated hydroxyanisole is added to the medium at a concentration of 1 to 100 μM. 제1항의 상기 부틸화하이드록시아니솔은 소포체 스트레스(ER stress)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.The butylated hydroxyanisole of claim 1, characterized in that to suppress the vesicle stress (ER stress), the composition. 부틸화하이드록시아니솔을 체세포 또는 불완전 역분화 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 유도만능줄기세포로의 역분화 유도 증진 방법.A method of enhancing induction of dedifferentiation into induced pluripotent stem cells, comprising treating butylated hydroxyanisole with somatic cells or incomplete dedifferentiated cells. 제4항에 있어서, 상기 체세포는 역분화 유도인자가 도입된 것을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 4, wherein the somatic cell is characterized in that a factor for inducing dedifferentiation is introduced. 제5항에 있어서, 상기 역분화 유도인자는 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 5, wherein the dedifferentiation inducer is selected from the group consisting of Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. 삭제delete

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