KR102137178B1 - 시료 내 폴리뉴클레오타이드 서열의 분포 분율 - Google Patents

Abstract

나노포어 센서를 사용하여, 예를 들어 시료 내 표적 분석물 또는 참조 분석물의 양에 대한 전기 신호를 식별하고 상관관계를 맺는 데에 고유한 오차를 보정함으로써, 시료 내 표적 분석물(예를 들어, 특정한 폴리뉴클레오타이드 서열)의 참(true) 분포 분율(fractional abundance)의 개선된 추정치의 결정을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다.

Description

시료 내 폴리뉴클레오타이드 서열의 분포 분율

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2016년 10월 24일에 출원된 미국 가출원 62/412,221 및 2017년 3월 31일에 출원된 국제 출원 PCT/US2017/025585의 이득을 주장하며, 이들의 내용은 각각 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

기술분야

본 발명은 고체상 나노포어를 사용하여 시료로부터 특정한 폴리뉴클레오타이드 서열의 분포 분율(fractional abundance)을 결정하는 방법 및 정밀하고 정확한 정량화를 위한 수학적 방법에 관한 것이다.

시료에 존재하는 구성성분들의 상대 존재비(relative abundance)의 결정에 의한 액체 시료의 특징화는 많은 과학 분야들 및 적용들을 위한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 순환하는 세포-무함유 DNA에서 점 돌연변이의 상대 존재비는 환자에서 암의 진행을 진단하거나 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 예를 들어 종자 수합물(collection of seeds)로부터 수득된 게놈 DNA 내의 비-GMO 참조 서열에 대한 유전자 변형 유기체(GMO)의 유전자이식(transgenic) 서열의 부분량(fractional amount)의 결정은 규제 및 경제적 이유에서 중요하다.

시료 내에서 표적 분석물의 부분량을 민감하게 검출하는 일부 방법들이 존재하지만, 이들 방법은 통상적으로 비용이 많이 들고 시간-소모적이거나 다른 제한들을 가진다. 예를 들어, 정량적 실시간 PCR(qPCR) 검정법이 시험 시료 내에서 불변 참조 서열에 대한 표적 핵산 서열의 상대량을 결정하는 데 사용되는 표준 방법으로 존재한다. 그러나, qPCR의 정량적 성능은 시료 당 및 앰플리콘(amplicon) 당 증폭 효율에서의 가변성에 의해 제한을 받는다. 증폭 효율에 영향을 미치는 인자들은 시료 기질 유래의 저해제와 캐리오버(carryover) 오염물 및 추출 시약 그 자체를 포함한다. 이들 인자는 시료 및 준비에 따라 다르며, 뿐만 아니라 이들 인자가 또 다른 서열과 비교하여 하나의 서열의 증폭 효율에 영향을 미치는 정도에 따라 다르다. 참조 앰플리콘과 비교하여 표적의 증폭 효율에서 약간의 가변적인 차이는 1.5x배 초과의 양 차이를 해결하기 위해 qPCR을 제한한다. 더욱이, 증폭 반응은 특수 시약 세트를 필요로 하고 적절하게 저장되어야 하며, 시간 소모적이고 반응 조건에 민감할 수 있다.

나노포어 장치의 사용은 단일 분자 식별을 위한 민감한 툴로서 출현하였으며, 여기서, 개별 분자는 인가된 전압 하에 나노포어를 통한 전위 시 식별된다. 나노포어 장치는 사용 적용점에 맞춰질 수 있고, 인간 건강, 농업 또는 다른 어떤 곳에서 충분히 저렴하고 일상적인 매일의 사용 사례에 효율적일 수 있다. 그러나, 나노포어 유래의 데이터의 사용에서는 오차가 생길 수 있으며, 이러한 오차는 시료 내 분석물의 정량적 추정치의 결정에 영향을 줄 수 있고, 따라서 이러한 데이터의 신뢰할 만한 사용은 실현 가능하지 않다.

따라서, 요망되는 것은, 다재다능하며 저렴하고 사용하기 용이한, 시료 내 참조 분석물과 비교하여 표적 분석물의 분포 분율의 개선된 결정 방법이다.

일부 실시형태에 따르면, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참(true) 상대 존재비의 개선된 추정치의 결정 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 나노포어 장치에서 나노포어를 가로질러 전압을 인가하여, 참조 분석물과 비교하여 표적 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 대조군 시료, 및 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합된 미공지 시료 각각에 대해 개별적으로 검출 가능한 전자 신호를 발생시키고 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계로서, 여기서, 상기 시료 내 상기 표적 분석물의 상대 존재비가 결정되어야 하는 단계; 각각의 시료에 대해 상기 나노포어를 통한 상기 표적 분석물 또는 상기 참조 분석물의 전위에 의해 발생된 복수의 이벤트 신호(event signature)들을 발생시키는 단계; 상기 복수의 이벤트 신호들로부터 상기 표적 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 상기 참조 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 양을 식별하여, 각각의 시료에 대해 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 결정하는 단계; 및 상기 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 조정하여, 검출된 상대 존재비에서 오차에 대해 보정하고, 이로써 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 액체 시료이다.

일부 실시형태에서, 상기 대조군 시료는 상기 참조 분석물이 아니라 상기 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료이다. 일부 실시형태에서, 대조군 시료는 상기 표적 분석물이 아니라 상기 참조 분석물을 포함하는 참조 대조군 시료이다.

일부 실시형태에서, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 방법은 추가로 나노포어 장치에 전압을 인가하여 상기 참조 분석물이 아니라 상기 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료에 대해 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 상기 검출된 상대 존재비의 조정은 상기 표적 대조군 시료 및 상기 참조 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 사용하여, 검출된 상대 존재비에서의 상기 오차를 보정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 오차는 상기 표적 분석물의 위양성(false positive) 또는 위음성(false negative) 검출 오차를 포함한다.

일부 실시형태에서, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 방법은 추가로, 나노포어 장치에 전압을 인가하여, 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합 대조군 시료에 대해 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물의 상대 존재비는 공지되어 있다.

일부 실시형태에서, 상기 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 상기 검출된 상대 존재비의 조정은 상기 표적 대조군 시료, 상기 참조 대조군 시료 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 사용하여, 검출된 상대 존재비에서 상기 오차를 보정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 오차는 위양성 표적 분석물 검출 오차, 위음성 표적 분석물 검출 오차, 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이(capture rate constant differential) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 실시형태에서, 대조군 시료는 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합 대조군 시료이며, 여기서, 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물의 상대 존재비는 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 오차는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합 대조군 시료는 상기 혼합된 미공지 시료에 비하여 1.2배 이하, 1.5배 이하, 2배 이하, 5배 이하 또는 10배 이하만큼 차이나는, 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 상대 존재비를 포함한다.

일부 실시형태에서, 참 상대 존재비의 추정치는 상기 혼합된 미공지 시료에서 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참비율(true ratio)의 추정치이다. 일부 실시형태에서, 참비율의 추정치(R ^* _혼합 )는 R ^* _혼합 =ρα에 의해 결정되며, 여기서, 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 파라미터 α는 참조 분석물 포착률을 표적 분석물 포착률로 나눈 비율의 추정치이다.

일부 실시형태에서, 참 상대 존재비의 추정치는 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 집단에서 상기 표적 분석물의 참분율(true fraction)의 추정치이다. 일부 실시형태에서, 참분율의 추정치(F ^* _혼합 )는

에 의해 결정되며, 여기서, 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 파라미터 α는 참조 분석물 포착률을 표적 분석물 포착률로 나눈 비율의 추정치이다.

일부 실시형태에서, 파라미터

이고,

이다. 일부 실시형태에서, 파라미터 Q _표적 은, 상기 대조군 시료가 사용되는 경우 상기 표적 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이거나, 또는 표적 대조군 시료가 사용되지 않는 경우, Q _표적 = 1이다. 일부 실시형태에서, 파라미터 Q _참조 는, 상기 참조 대조군 시료가 사용되는 경우 상기 참조 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이거나, 또는 참조 대조군 시료가 사용되지 않는 경우 Q _참조 = 0이다. 일부 실시형태에서, 파라미터 Q _X:Y 는 상기 혼합 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,

는 상기 대조군 시료가 사용되는 경우 혼합 대조군 시료에서 참조 분석물 (Y)에 대한 표적 분석물 (X)의 공지된 비율이거나, 또는 혼합 대조군 시료가 사용되지 않는 경우 α = 1이다. 일부 실시형태에서, 파라미터 Q _혼합 은 상기 혼합된 미공지 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이다.

일부 실시형태에서, 미공지 또는 대조군 시료는 핵산 증폭에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 미공지 또는 대조군 시료는 핵산 증폭에 의해 제조되지 않는다. 일부 실시형태에서, 시료는 실질적으로 참조 분자 및 표적 분자로 구성되도록 정제된다. 일부 실시형태에서, 시료는 정제되지 않는다.

일부 실시형태에서, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물의 양 또는 농도는 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 방법은 추가로 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 상기 추정치 및 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물의 상기 공지된 양 또는 농도를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 표적 분석물의 절대 양 또는 농도의 추정치를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 표적 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 상기 참조 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 상기 양은 한정된 역치(defined threshold)에 따라 식별된다. 일부 실시형태에서, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 방법은 추가로 Q-테스트, 서포트 벡터 머신(support vector machine) 또는 기댓값 최대화 알고리즘(expectation maximization algorithm)을 사용하여 상기 역치를 최적화하여 상기 참조 분석물 및/또는 상기 표적 분석물의 검출의 정확도를 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 서포트 벡터 머신은 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 양을 포함하는 대조군 시료로부터 전자 신호를 사용하여 트레이닝된다.

일부 실시형태에서, 한정된 역치는 이벤트 기간(event duration), 최대 δG, 중앙값 δG, 평균 δG, 이벤트 신호의 표준 편차, 50 Hz 미만의 이벤트의 노이즈 파워(noise power)의 평균 또는 중앙값, 상기 이벤트 신호에서의 독특한 패턴, 이벤트 면적(area of an event) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이벤트 신호의 하나 이상의 특징의 함수이다.

일부 실시형태에서, 검출된 상대 존재비에서 상기 오차를 보정하기 위해 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 상기 검출된 상대 존재비의 조정은 Q-테스트, 서포트 벡터 머신 또는 기댓값 최대화 알고리즘을 사용하여 수행된다.

일부 실시형태에서, 표적 분석물 및 상기 참조 분석물은 각각 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 분석물 폴리뉴클레오타이드 및 상기 참조 분석물 폴리뉴클레오타이드는 상이한 길이를 가진다. 일부 실시형태에서, 길이는 적어도 10개 뉴클레오타이드, 적어도 20개 뉴클레오타이드, 적어도 50개 뉴클레오타이드, 적어도 100개 뉴클레오타이드, 적어도 150개 뉴클레오타이드 또는 적어도 200개 뉴클레오타이드만큼 상이하다.

일부 실시형태에서, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 방법은 추가로 상기 대조군 또는 미공지 시료를 제1 페이로드(payload)에 결합된 제1 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 제1 프로브는 상기 제1 분석물에 특이적으로 결합되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 방법은 추가로 상기 대조군 또는 미공지 시료를 제2 페이로드에 결합된 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 제2 프로브는 상기 제2 분석물에 특이적으로 결합되도록 구성된다.

일부 실시형태에서, 표적 분석물은 유전자 변형 유기체와 상관관계가 있다. 일부 실시형태에서, 표적 분석물은 환자에서 암의 존재 또는 부재와 연관된 마커를 포함한다.

또한, 시료 내 표적 분석물의 상대 양을 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 나노포어 시스템에서, 참조 분석물을 포함하지만 표적 분석물은 포함하지 않는 제1 대조군 시료, 표적 분석물을 포함하지만 참조 분석물은 포함하지 않는 제2 대조군 시료, 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 제3 대조군 시료, 및 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 미공지된 상대 존재비로 포함하는 실험 시료 각각을 개별적으로 진행시키는 단계; 각각의 시료에 대해 참조 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 표적 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 양을 검출하는 단계; 및 상기 실험 시료 유래의 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 상기 양의 상대 존재비를 상기 제1 대조군 시료, 상기 제2 대조군 시료 및 상기 제3 대조군 시료 각각으로부터 유래한 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 상기 양의 상대 존재비와 비교하여, 상기 실험 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 이벤트 신호는 상기 나노포어를 통한 상기 참조 분석물의 전위에 의해 유도되는 전기 신호를 포함한다.

일부 실시형태에서, 표적 분석물 및 상기 참조 분석물은 각각 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 분석물 및 상기 표적 분석물은 길이에 의해 구별된다.

일부 실시형태에서, 참조 분석물 및 상기 표적 분석물은 상기 나노포어 장치에서 상기 참조 분석물과 상기 표적 분석물 사이의 구별을 용이하게 하기 위해 페이로드를 포함하는 서열-특이적 프로브에 각각 결합된다.

일부 실시형태에서, 상대 존재비는 상기 시료 내 표적 분석물 및 참조 분석물의 총 집단과 비교하여 상기 표적 분석물의 부분량이다.

또한, 미공지 시료 내 표적 분석물의 상대 존재비를 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 복수의 참조 분석물 및 복수의 표적 분석물을 포함하는 미공지 시료를 제공하는 단계; 상기 미공지 시료를 제1 챔버와 제2 챔버 사이에 배치된 나노포어를 포함하는 나노포어 장치의 상기 제1 챔버 내로 로딩하는 단계; 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하여, 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물을 상기 나노포어를 통해 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 통과시키는 단계; 상기 나노포어를 통한 상기 참조 분석물의 전위와 연관이 있는 다수의 제1 전기 신호들 각각을 검출하는 단계; 상기 나노포어를 통한 상기 표적 분석물의 전위와 연관이 있는 다수의 제2 전기 신호들 각각을 검출하는 단계; 및 상기 전기 신호 상대 존재비와 연관된 적어도 하나의 오차를 설명하는 참조값을 사용하여, 검출된 제1 전기 신호의 수 및 검출된 제2 전기 신호의 수의 상대 존재비를 상기 미공지 시료 내 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치로 전환시키는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 참조값은 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 양으로 포함하는 혼합 대조군 시료로부터 결정된 상기 제1 전기 신호의 분포 분율로부터 결정된다. 일부 실시형태에서, 참조값은 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 양으로 포함하는 혼합 대조군 시료로부터 결정된 상기 제1 전기 신호의 분포 분율로부터 결정된다. 일부 실시형태에서, 참조값은 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 양으로 포함하는 혼합 대조군 시료로부터 결정된 상기 제1 전기 신호의 분포 분율로부터 결정된다.

일부 실시형태에서, 혼합 대조군 시료, 상기 표적 대조군 시료 또는 상기 참조 대조군 시료는 상기 미공지 시료로부터 상기 제1 및 제2 전기 신호들의 상기 검출 동안 상기 나노포어 장치에서의 조건과 실질적으로 동일한 조건 하에 상기 나노포어 장치에서 진행된다.

일부 실시형태에서, 나노포어 장치는 장치의 내부 공간을 제1 챔버 및 제2 챔버로 분리하는 막을 포함하며, 여기서, 상기 막은 상기 나노포어를 포함하고, 여기서, 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버는 상기 나노포어를 통해 유체 소통(fluid communication)하고, 상기 장치는 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하기 위해 각각의 챔버 내에 전극을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전극은 상기 나노포어를 통해 전류를 모니터링하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 전극은 전원 장치(power supply)에 연결된다.

일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 위양성 또는 위음성 검출 오차, 또는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 설명함으로써 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 분포 분율의 추정치의 정확도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 위양성 표적 분석물 검출 오차를 설명하기 위한 참조-단독 대조군, 위음성 표적 분석물 검출 오차를 설명하기 위한 표적-단독 대조군, 및 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 설명하기 위한 하나 이상의 혼합 대조군 시료를 포함하는 일련의 대조군들이 분포 분율의 추정치의 정확도를 개선하기 위해 진행(run)된다.

일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률은 비교적 일관적이며, 따라서, 혼합 대조군이 상대 존재비의 추정치를 개선하는 데 사용될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 상대 포착률은 공지되어 있으며, 따라서 혼합 대조군 시료를 진행하는 일 없이 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 이러한 차이를 보상하기 위해 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 보정항(correction term)이 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료에서와 동일한 표적 분석물 및 참조 분석물 종(species)을 사용하여 실질적으로 동일한 나노포어 조건 하에 진행된 혼합 대조군 시료 유래의 데이터는 혼합 대조군 시료를 이러한 방법의 일부로서 실제로 진행하는 일 없이 분포 분율의 추정치를 개선하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 역치값은 혼합된 미공지 시료 유래의 위양성 값이 무시할 만하도록 결정되고, 참조-단독 대조군은 상대 존재비의 추정치를 개선하는 데 사용될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 혼합된 시료 유래의 위양성 값은 공지되어 있으며, 따라서 보정항은 참조-단독 대조군 시료를 진행하는 일 없이 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 위양성 오차를 보상하기 위해 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료에서와 동일한 참조 분석물 종을 사용하여 실질적으로 동일한 나노포어 조건 하에 진행된 참조-단독 대조군 시료 유래의 데이터는 참조-단독 대조군을 이러한 방법의 일부로서 실제로 진행하는 일 없이 분포 분율의 추정치를 개선하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 역치값은 혼합된 미공지 시료 유래의 위음성 값이 무시할 만하도록 결정되고, 표적-단독 대조군은 상대 존재비의 추정치를 개선하는 데 사용될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 혼합된 시료 유래의 위음성 값은 공지되어 있으며, 따라서 보정항은 표적-단독 대조군 시료를 진행하는 일 없이 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 위음성 오차를 보상하기 위해 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료에서와 동일한 표적 분석물 종을 사용하여 실질적으로 동일한 나노포어 조건 하에 진행된 표적-단독 대조군 시료 유래의 데이터는, 표적-단독 대조군을 이러한 방법의 일부로서 실제로 진행하는 일 없이 분포 분율의 추정치를 개선하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 참조 분석물에 대한 표적 분석물의 상대 존재비의 추정치를 결정하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 나노포어 장치에 전압을 인가하여, 참조 분석물에 대해 표적 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 혼합 대조군 시료, 및 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합된 미공지 시료 각각에 대해 개별적으로 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계로서, 여기서, 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 상대 존재비가 미공지되어 있는 단계; 각각의 시료에 대해 상기 참조 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 표적 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 양을 검출하는 단계; 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료로부터 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 조정함으로써, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 참조 분석물에 대한 표적 분석물의 상대 존재비의 추정치의 결정 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 나노포어 장치에 전압을 인가하여, 참조 분석물이 아니라 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료, 표적 분석물이 아니라 참조 분석물을 포함하는 참조 대조군 시료, 및 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합된 미공지 시료 각각에 대해 개별적으로 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계로서, 여기서, 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 상대 존재비가 미공지되어 있는 단계; 각각의 시료에 대해 상기 참조 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 표적 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 양을 검출하는 단계; 및 상기 표적 대조군 시료 및 상기 참조 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 조정함으로써, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 대조군 시료는 상기 혼합된 미공지 시료 유래의 표적 분석물의 위음성 검출에 대한 보정항을 제공한다. 일부 실시형태에서, 참조 대조군 시료는 상기 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 위양성 검출에 대한 보정항을 제공한다.

일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 참조 분석물에 대한 표적 분석물의 상대 존재비의 추정치의 결정 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 나노포어 장치에 전압을 인가하여, 참조 분석물에 대해 표적 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 혼합 대조군 시료, 참조 분석물이 아니라 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료, 표적 분석물이 아니라 참조 분석물을 포함하는 참조 대조군 시료, 및 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합된 미공지 시료 각각에 대해 개별적으로 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계로서, 여기서, 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 상대 존재비가 미공지되어 있는 단계; 각각의 시료에 대해 상기 참조 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 표적 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 양을 검출하는 단계; 상기 표적 대조군 시료 및 상기 참조 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비, 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료로부터 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 조정함으로써, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 참조 분석물에 대한 표적 분석물의 상대 존재비의 추정치의 결정 방법은 추가로 나노포어 장치에 전압을 인가하여, 상기 참조 분석물이 아니라 상기 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료에 대해 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 참조 분석물에 대한 표적 분석물의 상대 존재비의 추정치의 결정 방법은 추가로 나노포어 장치에 전압을 인가하여, 상기 표적 분석물이 아니라 상기 참조 분석물을 포함하는 참조 대조군 시료에 대해 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 상기 추정치의 결정 단계는, 상기 표적 대조군 시료, 상기 참조 대조군 시료 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비, 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 조정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 혼합 대조군 시료는 상기 혼합된 미공지 시료와 비교하여 1.2배 이하, 1.5배 이하, 2배 이하, 5배 이하 또는 10배 이하만큼 상이한 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 상대 존재비를 포함한다.

일부 실시형태에서, 상대 존재비는 표적 분석물 : 참조 분석물의 비율을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참비율(R ^* _혼합 )의 추정치는 R ^* _혼합 =ρα에 의해 결정되며, 여기서, 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 파라미터 α는 참조 분석물 포착률을 표적 분석물 포착률로 나눈 비율의 추정치이다.

일부 실시형태에서, 상대 존재비는 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물의 집단에서 상기 표적 분석물의 분율을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 집단에서 상기 표적 분석물의 참분율의 추정치(F ^* _혼합 )는

에 의해 결정되며, 여기서, 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 파라미터 α는 참조 분석물 포착률을 표적 분석물 포착률로 나눈 비율의 추정치이다.

일부 실시형태에서, 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 대조군 시료; 및 상기 대조군 시료, 및 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물을 포함하는 미공지 시료를 나노포어 장치에서 진행(run)시켜, 상기 미공지 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 상대 존재비를 결정하는 데 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.

일부 실시형태에서, 표적 분석물을 포함하는 제1 대조군 시료로서, 상기 제1 대조군 시료는 참조 분석물을 함유하지 않는, 제1 대조군 시료; 상기 참조 분석물을 포함하는 제2 대조군 시료, 상기 제2 대조군 시료는 상기 표적 분석물을 함유하지 않는, 제2 대조군 시료; 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 제3 대조군 시료; 및 상기 제1 대조군 시료, 상기 제2 대조군 시료, 상기 제3 대조군 시료, 및 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물을 포함하는 미공지 시료를 나노포어 장치에서 개별적으로 진행시켜, 상기 미공지 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 상대 존재비를 결정하는 데 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.

일부 실시형태에서, 시료 내 표적 분석물의 참 분포 분율의 추정치를 결정하기 위한 컴퓨터-실행 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 참조 분석물 대조군 또는 표적 분석물 대조군 중 적어도 하나로부터 유래된 데이터를 나노포어 센서로부터 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 데이터는 상기 나노포어를 통해 전위하는 표적 분석물 또는 참조 분석물 유래의 복수의 이벤트 신호들을 포함하는 단계; 표적 분석물과 상관관계가 있는 것들 및 참조 분석물과 상관관계가 있는 것들을 구별하기 위해 이벤트 신호의 하나 이상의 특징을 식별하는 단계; 최적화된 역치를 식별하여 상기 제1 이벤트를 상기 제2 이벤트로부터 구분하고 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치를 발생시키기 위해 상기 서포트 벡터 머신을 트레이닝하는 단계로서, 여기서, 상기 트레이닝은 참조 대조군 시료, 표적 대조군 시료 및 혼합 대조군 시료로 이루어진 군으로부터 선택되는 대조군의 사용을 포함하고, 트레이닝은 공지된 혼합된 시료를 사용하는 입증을 포함하는 단계; 및 상기 트레이닝된 서포트 벡터를 사용하여, 혼합된 시료로부터 나노포어 장치 상에 기록된 이벤트로부터 시료 내 표적 분석물의 분포 분율을 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 시료 내 표적 분석물의 참 분포 분율의 추정치를 결정하기 위한 컴퓨터-실행 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 나노포어 장치로부터 데이터 세트를 수득하는 단계로서, 상기 데이터는 적어도 하나의 대조군 시료 및 적어도 하나의 미공지 시료 유래의 이벤트 신호를 포함하는 단계; 상기 참조 분석물과 상관관계가 있는 제2 이벤트 신호로부터 상기 표적 분석물과 상관관계가 있는 제1 이벤트 신호를 구분하기 위해 역치를 발생시키는 데 사용되는 특징 세트를 식별하는 단계; 및 트레이닝된 서포트 벡터 머신을 사용하여 상기 미공지 시료 내 분포 분율의 참값을 추정하는 단계를 포함한다.

상기 내용 및 다른 목적, 특징 및 이점들은 첨부된 도면에 예시된 바와 같이 본 발명의 특정한 실시형태의 하기 설명으로부터 명확해질 것이며, 도면에서 유사한 참조 특질은 상이한 도면들 전체에서 동일한 부분(part)을 지칭한다. 도면은 본질적으로 축척대로 되어 있지 않으며, 그 대신에 본 발명의 다양한 실시형태들의 원리를 예시할 때 강조되어 있다.
도 1a는 나노포어를 통과하는 dsDNA에 의해 유발된 단일-분자 이벤트의 전형적인 전자 신호를 보여주며, 이는 전위의 특징적인 기간이고 전위 동안 전류가 감소한다.
도 1b는 22 nm 직경 나노포어에 기록된 5.6 kb dsDNA에 대한 최대 δG 대 기간의 모든-이벤트 산점도를 보여준다.
도 2a는 727 bp DNA가 1 M LiCl 내 100 mV에서 25 nm 직경 고체상 나노포어를 통과할 때의 전형적인 이벤트를 보여준다. 벤트 영역(vent area)은 음영 처리되어 있다.
도 2b는 dsDNA 길이가 증가함에 따라 이벤트 기간의 증가를 보여주며, 한편, 이벤트 깊이는 보존된다.
도 2c는 나타난 각 길이에서 dsDNA에 대해 기록된 모든 이벤트들의 영역의 log₁₀의 분포도를 보여준다.
도 3a는 유형 1 분석물(사각형) 유래 이벤트와 유형 2 분석물(원형) 유래 이벤트 사이에서 발생된 역치의 일례를 도시한 것이다.
도 3b는 유형 1 분석물(사각형) 유래의 이벤트와 유형 2 분석물(원형) 유래 이벤트 사이에서 선형 역치의 정확도를 증가시키기 위해, 입력 특징들을 고차원 공간으로 변환시킨 결과의 일례를 보여준다.
도 4a는 참조 분석물 시료, 표적 분석물 시료 및 혼합된 시료 유래의 모든 이벤트들에 대한 확률 히스토그램을 이벤트 면적에 따라 보여준다.
도 4b는 참조 분석물 단독(Q _참조 ), 표적 분석물 단독(Q _표적 ) 및 표적 분석물과 참조 분석물의 혼합된 시료(Q _혼합 ) 유래의 영역 역치 아래의 이벤트의 백분율에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 4c는 어떻게 부분량 파라미터 ρ(q)가 q 값에서 그래프적으로 나타나는지 보여준다. q = 5 pA*ms 역치(수직 파선)는 0.05의 위양성(즉, Q _참조 = 0.05) 및 0.1의 위음성(즉, Q _표적 = 0.9)에 상응한다.
도 5a는 표적 유전자의 상대 존재비의 추정치의 결정 결과를 보여준다(GMO(%)(R ^* _혼합 ) 대 표적 유전자의 참 상대 존재비(GMO(%)). 제로-오차 라인(기울기 = 1)보다 높고 낮은 10% 오차 경계(margin)가 비교를 위해 나타나 있다.
도 5b는 2개의 단리된 대조군들 및 6개의 공지된 혼합물들을 사용하여, 시료 내 유전자 변형 유기체의 참 상대 존재비의 추정치를 결정한 결과를 보여준다. 예측된 표적 존재비 백분율의 값들은 참 표적 존재비 백분율과 비교하여 도시되었다. 제로-오차 라인(기울기 = 1)보다 높고 낮은 10% 오차 경계가 비교를 위해 나타나 있다.
도 6은 이벤트 면적에 따라 참조 분석물로부터 표적 분석물을 구분하기 위한 역치 범위에 걸친 표적 분석물 존재비(GMO (%))의 추정치의 결과를 보여준다.
도 7은 표적 분석물 및 참조 분석물 유래의 이벤트 신호를 구분하기 위한 최적의 파라미터를 이용하여 트레이닝된 서포트 벡터 머신으로부터의 시험 데이터 세트에 걸친 정확도의 예측을 보여준다.
도 8은 동일한 포어 상에서 단리된 대조군으로서 순차적으로 진행된 2개의 분자 유형들(프로브/페이로드에 결합된 94 bp 표적 dsDNA 및 프로브/페이로드에 결합된 74 bp 참조 dsDNA)에 대한 이벤트 플롯을 보여준다.
도 9a는 오버레이된(overlaid) 100% 표적 분석물 대조군 시료(닫힌 원형) 및 100% 참조 분석물 대조군 시료(열린 사각형)에 대한 평균 δG 대 기간의 대표적인 이벤트 플롯을 보여준다. 표적 분석물은 3-분지(branch) PEG에 연결된 G12D-결합된 프로브(G12D-3bPEG로 지칭됨)가 있는 89 bp DNA다. 참조 분석물은 8-arm(-arm) PEG에 연결된 야생형 (c.35G)-결합된 프로브(WT-8-armPEG로 지칭됨)가 있는 89 bp DNA다. 나노포어를 통과하는 표적 분석물로부터 이벤트 신호를 식별하기 위한 역치(q₁ = 1 msec, q₂ = 0.4 nS 및 q₃ = 0.65 nS)는 표적 태깅 박스(tagging box)(파선)를 생성한다.
도 9b는 도 9a 유래의 플롯을 보여주며, 이때 표적 분석물 및 참조 분석물을 포함하는 공지 시료 A(삼각형) 및 시료 B(별모양) 유래 데이터는 이러한 플롯 상에 오버레이된다.
도 10은 오버레이된 100% 표적 분석물 대조군 시료(닫힌 원형) 및 100% 참조 분석물 대조군 시료(열린 사각형)에 대한 평균 δG 대 기간의 대표적인 이벤트 플롯을 보여준다. 표적 분석물을 참조 분석물로부터 구분하기 위한 서포트 벡터 머신-식별된 결정 경계선(decision boundary)(즉, 역치)이 또한 플롯화되어 있다.
도 11은 최대 δG 대 기간의 모든-이벤트 산점도 상에서 플롯화된 50% 표적 / 50% 참조 혼합 시료로부터의 이벤트를 보여준다. 표적 도메인 박스는 프로브-결합된 돌연변이체 표적과 연관된 이벤트를 포함한다.
도 12는 표적(돌연변이체) 및 참조(야생형) 집단의 식별을 위한, 도 11에 도시된 50% 표적 / 50% 참조 혼합 시료 유래의 데이터에, 3-가우시안 혼합 모델을 사용하여 가우시안 혼합에 대한 기댓값 최대화 알고리즘(EMGM)을 적용한 결과를 보여준다.
도 13은 위양성 분율을 구축하기 위해 참조-단독 대조군 시료 유래의 데이터에 3-가우시안 혼합 모델을 사용하여 EMGM을 적용한 결과를 보여준다.
도 14는 미공지 시료 내 돌연변이체(표적) 분자의 상대 존재비를 식별하기 위해, 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 3-가우시안 혼합 모델을 사용하여 EMGM을 적용한 결과를 보여준다.

본 발명의 다양한 실시형태들의 상세한 사항들은 하기 설명에 나타나 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점들은 상세한 설명 및 도면, 및 청구항으로부터 명확해질 것이다.

정의

본 출원 전체에서, 문맥은 본 영양소, 조성물 및 방법의 다양한 실시형태들을 지칭한다. 기재된 다양한 실시형태들은 여러 가지 예시적인 예들을 제공하는 것으로 의미되고, 대안적인 종의 설명으로서 간주되어서는 안 된다. 그보다는, 본원에 제공된 다양한 실시형태들의 설명은 중복되는 범위일 수 있음을 주지해야 한다. 본원에서 고찰된 실시형태는 단지 예시적이고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의미가 아니다.

또한, 본 개시내용 전체에서, 다양한 공개, 특허 및 공개된 특허 명세서들은 식별 인용에 의해 참조된다. 이들 공개, 특허 및 공개된 특허 명세서들의 개시내용은, 본 발명이 속한 당업계를 보다 완전히 기재하기 위해 본 개시내용에 참조로서 포함된다.

본 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같이, 단수형("a," "an" 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 가리키지 않는 한 복수형을 포함한다. 예를 들어, 용어 "일(an) 전극"은 이들의 혼합물을 포함하여 복수의 전극들을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은, 장치 및 방법이 언급된 구성성분들 또는 단계들을 포함하지만 다른 것들을 배제하지 않음을 의미하고자 한다.

"필수적으로 ~로 구성된"은 장치 및 방법을 정의하는 데 사용되는 경우, 조합에 임의의 필수적인 유의성의 다른 구성성분 또는 단계들을 배제함을 의미해야 한다. "~로 구성된"은 다른 구성성분 또는 단계를 배제함을 의미해야 한다. 이들 각각의 과도기 용어(transition term)에 의해 정의된 실시형태는 본 발명의 범위 내에 포함된다.

모든 수명칭(numerical designation)들, 예를 들어 거리, 크기, 온도, 시간, 전압 및 농도는 범위를 포함하여, 파라미터의 측정에서 일상적인 실험적 변화를 포함하고자 하는 근사치이며, 이러한 변화는 기재된 실시형태의 범위 내에 포함되고자 한다. 항상 명쾌하게 언급되지는 않지만, 모든 수명칭들 앞에는 용어 "약"이 선행되는 것으로 이해된다. 또한, 항상 명쾌하게 언급되지는 않지만, 본원에 기재된 구성성분은 단지 예시적이고, 이의 등가물은 당업게에 공지되어 있는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "분석물(analyte)"은 임의의 분자, 화합물, 복합체 또는 다른 엔터티(entity)를 지칭하며, 이의 존재는 포어 내 분석물의 상대 존재비의 결정을 용이하게 하기 위해 나노포어 센서를 사용하여 검출될 수 있다. 표적 또는 참조 분석물을 지칭할 때, 용어 표적 또는 참조 분자는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 분석물"은 시료 내 관심 분자 또는 복합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적 분석물은 관심 핵산의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 일부를 포함한다. 표적 분석물은, 본원에 기재된 바와 같이 나노포어 센서에서 표적 분석물의 검출을 용이하게 하기 위해 프로브에 의한 결합을 위해 특이적으로 표적화될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "참조 분석물"은 시료 내 관심 분자 또는 복합체를 지칭하며, 이의 존재비는 표적 분석물에 대한 정량화의 상대 측정치로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 참조 분석물은 관심 핵산의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 일부를 포함한다. 참조 분석물은, 본원에 기재된 바와 같이 나노포어 센서에서 표적 분석물의 검출을 용이하게 하기 위해 프로브에 의한 결합을 위해 특이적으로 표적화될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하다"는 표적 분석물 또는 참조 분석물에 대한 프로브의 표적화된 결합을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브"는 표적 분석물 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 프로브-페이로드 분자 또는 복합체에 결합된 표적 또는 참조 분석물을 포함하는 복합체의 전위 시 발생되는 전자 신호에 영향을 주도록 구성된 페이로드 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로브는 페이로드 분자에 결합하도록 적응된 페이로드 분자 결합 모이어티(moiety)를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "페이로드 분자(payload molecule)"는, 상관관계가 있는 범위의 규모(dimension) 내에서 나노포어에 포착된 경우, 독특한 전기 신호의 발생을 용이하게 하는 물리적 규모를 갖는 분자를 지칭한다. 페이로드 분자는 나노포어 장치에서 표적 분석물 또는 참조 분석물의 검출을 용이하게 하기 위해 표적 분석물 또는 참조 분석물에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 또한, 구동 분자(driver molecule)로서 작용하기 위해 하전될 수 있다. 일부 실시형태에서, 페이로드 분자는 프로브 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브 결합 모이어티를 포함하며, 이러한 프로브는 표적 분석물 또는 참조 분석물에 특이적으로 결합한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어　"나노포어(nanopore)"(또는 단순히 "포어")는 2개의 부피를 분리하는 막 내의 단일 나노-규모 개구부(opening)를 지칭한다. 포어는 지질　이중층 막에 삽입된 단백질 채널일 수 있거나, 예를 들어, 얇은 고체상 기질, 예컨대 실리콘 니트라이드, 실리콘 디옥사이드 또는 그래핀 또는 이들 또는 다른 물질들의 조합의 층을 통해 드릴링 또는 에칭에 의해 또는 전압-펄스 방법을 사용함으로써 조작될 수 있다. 기하학적으로, 포어는 0.1 nm 이상의 직경 내지 1 미크론 이하의 직경의 치수(dimension)를 가지며; 포어의 길이는 서브-나노미터 두께, 또는 1 미크론 이하 또는 그 이상의 두께일 수 있는 막 두께에 의해 좌우된다. 수백 나노미터보다 두꺼운 막의 경우, 나노포어는 "나노 채널"로서 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "나노포어 장비" 또는 "나노포어 장치"는 하나 이상의 나노포어(병렬로 또는 직렬로)를 단일　분자 이벤트 감지용 회로와 조합하는 장치를 지칭한다. 해당 나노포어로 감지를 용이하게 하는 데 사용되는 챔버 및 전극을 포함하는 나노포어 장치 내의 각각의 나노포어는 본원에서 나노포어 센서로서 지칭된다. 구체적으로, 나노포어 장비는 이온 전류를 포어(들)를 통해 측정하면서도 특정된 전압을 포어 또는 포어들에 걸쳐 인가하기 위해 민감한 전압-클램프 증폭기를 사용한다. 단일 하전된 분자, 예컨대 이중 가닥 DNA(dsDNA)가 전기 영동에 의해 포어를 통해 포착되고 구동되는 경우, 포착된 이벤트(즉, 나노포어를 통한 분자의 전위, 또는 나노포어에서 분자의 포착)을 가리키는 측정된 전류 시프트(current shift) 및 이벤트의 시프트 양(전류 진폭(current amplitude)) 및 기간은 나노포어에 포착된 분자를 특징화하는 데 사용된다. 실험 동안 많은 이벤트들을 기록한 후, 이벤트의 분포는 이의 시프트 양(즉, 이의 전류 신호(current signature))에 따라 상응하는 분자를 특징화하기 위해 분석된다. 이러한 방식으로, 나노포어는 생체분자 감지를 위한 단순하며 표지-무함유의 순수하게 전기적 단일-분자 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전기 신호"는 전자 회로의 구성에 따라 시간 경과에 걸쳐 전류, 임피던스 / 저항, 또는 전압 상에서 수합된 일련의 데이터를 포함한다. 통상적으로, 전류는 "전압 클램프" 구성(configuration) 내에서 측정되며; 전압은 "전류 클램프" 구성 내에서 측정되고, 저항 측정은 옴의 법칙 V = IR을 사용하여 구성 내에서 유도될 수 있다. 임피던스는 또한, 나노포어 장치로부터 수합된 전류 또는 전압 데이터로부터 측정되어 발생될 수 있다. 본원에서 지칭되는 전기 신호의 유형은 전류 신호 및 전류 임피던스 신호를 포함하지만, 다양한 다른 전기 신호들도 나노포어 내 입자를 검출하는 데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이벤트(event)"는 나노포어를 통해 검출 가능한 분자 또는 분자 복합체의 전위, 및 시간 경과에 따른 나노포어를 통한 전기 신호, 예를 들어 전류의 변화를 통한 이의 연관된 측정을 지칭한다. 이벤트는 이의 전류, 기준치 개방 채널로부터의 전류의 변화, 기간 및/또는 나노포어에서의 분자 검출의 다른 특징들에 의해 정의될 수 있다. 유사한 특징들을 갖는 복수의 이벤트들은, 동일하거나 또는 유사한 특징들(예를 들어 벌크, 전하)을 갖는 분자 또는 복합체의 집단을 가리킨다.

본원에 사용된 바와 같이, 이벤트의 "면적(area)"은 이벤트의 기간(즉, 전류가 개방 채널 전류 신호로부터 벗어나는 기간)을 이벤트의 기간에 걸친 개방 채널로부터의 평균 전류의 변화로 곱한 절대값(즉, pA*ms)을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상대 존재비(relative abundance)"는 그룹 내에서 관련된 아이템들의 총 수와 비교하여 아이템의 양을 지칭한다. 예를 들어, 시료 내 표적 분석물의 맥락에서, 표적 분석물의 상대 존재비는 참조 분석물과 비교하여 시료에 존재하는 표적 분석물의 양을 지칭한다. 이는 분포 분율(fractional abundance), 예를 들어 표적 분석물 및 참조 분석물의 총 집단과 비교하여 시료 내 표적 분석물의 백분율로서 표시될 수 있다. 상대 존재비는 또한, 예를 들어 표적 분석물 : 참조 분석물의 비율로서 표시될 수 있다. 전자 신호와 관련하여, 전자 신호의 그룹의 상대 존재비는, 참조 분석물과 상관관계가 있는 제2 전자 신호의 양과 비교하여 표적 분석물과 상관관계가 있는 제1 전자 신호의 양을 지칭할 수 있다. 시료 내 표적 분석물의 실제 상대 존재비(즉, 공지된 상대 존재비를 갖도록 이전에 측정되거나 제조됨)와 본원에 제공된 방법에 따라 결정된 상대 존재비 사이를 구분하기 위해, 본 발명자들은 실제 상대 존재비를 "참 상대 존재비"로서 지칭하고, 본원에 기재된 방법에 의해 결정된 상대 존재비를 "참 상대 존재비의 추정치"로서 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대조군 시료"는 참조 분석물과 비교하여 표적 분석물을 공지된 상대 존재비로 함유하는 시료를 지칭한다. 대조군 시료, 예컨대 참조 대조군 시료, 표적 대조군 시료 및 혼합 대조군 시료는 미공지 시료 내 분포 분율의 추정치의 정확도를 개선하기 위해 본원에 사용된다. 일부 실시형태에서, 대조군 시료는 표적 분석물, 참조 분석물 또는 둘 다를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미공지 시료", "미공지 혼합된 시료" 또는 "혼합된 미공지 시료"는 참조 분석물을 미공지된 상대 존재비로 함유하는 시료를 지칭한다. 참조 분석물의 상대 존재비는, 상대 존재비가 본원에 제공된 방법에 의해 결정되는 경우, 심지어 추정치의 일부 값이 이미 공지된 경우, 미공지인 것으로 간주된다. 일부 미공지 시료에 대해, 시료 내 참조 분석물의 양 또는 농도는 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공지된 시료"는 참조 분석물과 비교하여 표적 분석물을 공지된 상대 존재비로 함유하는 시료를 지칭하며, 분포 분율 추정 모델, 또는 이러한 모델의 특징, 예컨대 역치의 정확도의 추정치를 트레이닝하거나, 입증하거나 또는 제공하기 위해 사용된다.

도입 / 개요

일부 실시형태에서, 본원에 제공된 발명은 시료에 존재하는 참조 분석물과 비교하여 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치(예를 들어 부분량 또는 비율)의 결정 방법이다. 이러한 방법은 시료에서 표적 분석물과 참조 분석물을 검출하고 구분하기 위해 나노포어 단일 분자 계수기(즉, 나노포어 장치)를 이용한다.

시료 내 표적 분석물의 상대 존재비에 대한 추정치를 결정하기 위한 표적 분석물 및 참조 분석물과 상관관계가 있는 원(raw) 전자 이벤트 신호의 사용은 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차, 및 혼합된 시료 내 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이와 연관된 오차를 포함하여 몇 가지 이유들에서 부정확할 수 있다. 본원에서 일부 실시형태에 따르면, 본 발명자들은 시료 내 참조 분석물 및 표적 분석물의 참 분포 분율을 추정하는 정확도의 개선 방법법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이들 방법은 혼합된 시료 내 전자 신호 검출과 연관된 하나 이상의 오차를 보정하도록 특이적으로 디자인된 대조군 시료의 사용을 수반한다. 혼합된 시료가 공지된 양 또는 농도의 참조 분석물을 포함하는 경우, 상대 존재비의 개선된 추정치는 시료 내 표적 분석물의 참 양 또는 농도의 개선된 추정치를 제공하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 위양성 또는 위음성 검출 오차, 또는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 설명함으로써 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 분포 분율의 추정치의 정확도를 개선한다. 일부 실시형태에서, 분포 분율의 추정치의 정확도를 개선하기 위해, 위양성 표적 분석물 검출 오차를 설명하기 위한 참조-단독 대조군, 위음성 표적 분석물 검출 오차를 설명하기 위한 표적-단독 대조군, 및 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 설명하기 위한 하나 이상의 혼합 대조군 시료를 포함하는 일련의 대조군이 진행(run)된다.

일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률은 비교적 일관적이어서, 혼합된 대조군은 상대 존재비의 추정치를 개선하는 데 사용될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 혼합된 시료 내 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 상대 포착률은 공지되어 있어서, 혼합 대조군 시료를 진행하지 않으면서 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 이러한 차이를 보상하고자 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 보정항이 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료에서와 동일한 표적 분석물 및 참조 분석물 종을 사용하여 실질적으로 동일한 나노포어 조건 하에 진행된 혼합 대조군 시료 유래의 데이터는, 혼합 대조군 시료를 이러한 방법의 일부로서 실제로 진행시키지 않으면서 분포 분율의 추정치를 개선하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 역치값은 혼합된 미공지 시료 유래의 위양성 값이 무시할 만하도록 결정되고, 상대 존재비의 추정치를 개선하기 위해 참조-단독 대조군이 사용될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 혼합된 시료 유래의 위양성 값은 공지되어 있어서, 참조-단독 대조군 시료를 진행하지 않으면서 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 위양성 오차를 보상하고자 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 보정항이 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료에서와 동일한 참조 분석물 종을 사용하여 실질적으로 동일한 나노포어 조건 하에 진행된 참조-단독 대조군 시료 유래의 데이터는, 참조-단독 대조군를 이러한 방법의 일부로서 실제로 진행시키지 않으면서 분포 분율의 추정치를 개선하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 역치값은 혼합된 미공지 시료 유래의 위음성 값이 무시할 만하도록 결정되고, 상대 존재비의 추정치를 개선하기 위해 표적-단독 대조군이 사용될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 혼합된 시료 유래의 위음성 값은 공지되어 있어서, 표적-단독 대조군 시료를 진행하지 않으면서 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 위음성 오차를 보상하고자 혼합된 미공지 시료 유래의 데이터에 보정항이 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혼합된 미공지 시료에서와 동일한 표적 분석물 종을 사용하여 실질적으로 동일한 나노포어 조건 하에 진행된 표적-단독 대조군 시료 유래의 데이터는, 표적-단독 대조군를 이러한 방법의 일부로서 실제로 진행시키지 않으면서 분포 분율의 추정치를 개선하는 데 사용된다.

시료 용도

참조 핵산 분자와 비교하여 핵산 단편 내에서 표적 서열의 부분량을 결정하는 것은 많은 적용들을 가진다.

일례의 용도 경우에서, 본 발명자들은 예를 들어 종자 집합으로부터 수득된 게놈 DNA 내 비-GMO 참조 서열에 대한 유전자 변형 유기체(GMO)의 이식유전자 서열의 부분량을 결정하기 위해 본원의 방법을 사용한다. 이러한 결정은 규제 및 경제적 이유들에서 중요하다. 요망되는 형질을 갖는 종자의 구매자 및 판매자는, 가격 책정 및 거래를 공정하게 하기 위해 요망되는 형질을 포함하는 종자의 분율을 정밀하고 정확하게 알 필요가 있다.

따라서 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 1% 내지 100%의 GMO 함량을 함유하는 것으로 추정된 응집 종자, 낟알, 가루 및 피드(feed)로부터 %GMO 함량 결정을 제공한다. 종자 개발자, 재배자 및 규제 기관은 GMO 함량에서 10% 차이(1.1배)를 해결하기 위해 정밀한 측정 및 능력을 원한다. % GMO는 100x (GMO 이벤트 복제수) / (분류군(taxon)-특이적 게놈 참조 복제수)로서 정의된다.

또 다른 예의 용도 경우에서, 본 발명자들은 혈액 또는 소변 시료 유래의 세포-무함유 순환하는 DNA 내에서 비-돌연변이체(야생형) 서열에 대한 점 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 상대 존재비를 모니터링하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용한다. 특정한 게놈 유전자좌에서 점 돌연변이의 상대 존재비는 암 유형 및 치료 결과와 상관관계가 있어 왔다. 비-돌연변이체 서열과 비교하여 돌연변이체의 상대 존재비의 결정은 진단, 치료법 및 질병 진행 모니터링을 가이드하는 데 사용될 수 있다. 종양 이미징 결과가 수축/성장하는 덩어리를 드러내는 데 수주가 소요될 수 있긴 하지만, 본원에 기재된 방법은, 쉽게 접근 가능한 시료 유형을 사용함으로써 돌연변이 마커의 상대 존재비의 신속한 식별이 효율적이고 빈번한(예를 들어 매일의) 실험을 허용하는 것을 가능하게 한다. 중요하게는, 이러한 기술은, 재발의 조기 검출을 허용하면서도 질병 역학(disease dynamics)의 더 많은 시점들을 제공함으로써 치료 반응을 보다 효과적으로 보여줄 수 있을 것이다.

일부 실시형태에서, 본원에 제공된 방법은 유전적 암 스크리닝 검정법에서 복제수 변이 확인(CNV)을 제공한다. 복제수 변이(CNV) 시험은 유전적 암 소인에 대한 것이다. 목표는 참조로부터 1.5배 미만의 차이에서 유전자 조절 요소의 결실 또는 중복을 검출하는 것이다. 예를 들어, BRCA1 유전자의 복제수에서 10% 차이(1.1배)는 임상 작용을 보증할 수 있다.

나노포어 검출

나노포어는 고체상 실리콘-기반 기질에서 형성되고, 단일 분자 실험은 완충된 전해질 용액 내에서 포어를 가로질러 전압을 인가함으로써 수행된다.

도 1a는 dsDNA가 나노포어를 통과함으로써 유발되는 전형적인 단일-분자 이벤트를 보여준다. 이벤트는 기간 폭 및 최대 전도도 깊이, 최대 δG에 의해 정량화된다. 최대 δG는 인가된 전압 V에 의해 나누어진 전류 감쇠 δI이다. 도 1b는 22 nm 직경 나노포어를 이용하여 5분 이내에 기록된 5.6 kb dsDNA의 1072개 이벤트들에 대한 최대 δG 대 기간의 모든-이벤트 산점도를 보여준다(V = 100 mV, 1 nM DNA, 1 M LiCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH=8.8).

최대 δG 및 기간 외에도, 정량화될 수 있는 이벤트 프로파일의 다른 특징들은 이벤트 신호의 평균 δG, 중앙값 δG, 표준 편차, 및 다른 보다 고차원의 특징들이다. 또 다른 유용한 특징은 이벤트의 적분된 면적의 절대값이며, 이는 평균 δG X 기간으로서 계산될 수 있다(문헌[Storm, A J, J H Chen, H W Zandbergen, and C Dekker. "Translocation of Double-Strand DNA Through a Silicon Oxide Nanopore." Physical Review E 71, no. 5 (May 2005): 051903, doi:10.1103/PhysRevE.71.051903]). 적분된 면적 또는 단순히 "면적"은 또한, 전하 부족(electric charge deficit)으로서 공지되어 있다(문헌[Fologea, Daniel, Marc Gershow, Bradley Ledden, David S McNabb, Jene A Golovchenko, and Jiali Li. "Detecting Single Stranded DNA with a Solid State Nanopore." Nano Letters 5, no. 10 (October 2005): 1905-9. doi:10.1021/nl051199m]).

접힌 상태에서 나노포어를 통과하기에 충분히 긴(700 bp 초과) dsDNA의 경우, 이벤트는 1 초과의 진폭을 보여줄 수 있다. 도 1b는 이의 일례이며, 이때 완전히 접혀진 이벤트는 더 큰 최대 δG 값 및 더 짧은 기간을 나타내고, 접히지 않은 이벤트는 더 긴 기간 및 더 얕은 최대 δG 값을 나타낸다. 부분적으로 접힌 이벤트는, 더 깊은 수준에서 시작하고 더 얕은 수준에서 종료하며 접히지 않은 이벤트와 완전히 접힌 이벤트 사이에 존재하는 총 기간 폭을 갖는, 이벤트 내에서 2개의 진폭 수준을 나타낸다. δG 및 기간 분포가 접힐 수 있는 dsDNA에 대한 모드들의 혼합을 보여주긴 하지만, 이벤트 면적은, DNA가 나노포어를 통과할 때 접힐 정도로 충분히 긴지 아닌지의 여부와는 상관없이 dsDNA에 대해 단일 모드 분포를 가진다.

나노포어를 사용한 표적 분석물과 참조 분석물의 구별은 나노포어를 통한 각각의 전위 시 신뢰할만하고 민감한 검출이 가능하게 할 정도로 충분히 상이한 이벤트 신호의 검출을 기반으로 한다. 평균 이벤트 신호의 차이는 신호 기간, 전류 변화, 신호 내에서의 특징들 또는 다른 구분 가능한 특징들 및 이들의 조합을 기반으로 할 수 있다. 사용되는 특징들은, 본원에 기재된 분포 분율 결정에 사용되기 위해 참조 분석물 및 표적 분석물과 상관관계가 있는 이벤트 신호의 식별 방법으로서 작용하는 역치의 결정을 위한 근거이다.

일부 실시형태에서, 표적 및 참조 단편들은 상이한 나노포어 이벤트 기간들을 생성할 정도로 충분히 상이한 길이의 dsDNA 분자들이다.

일부 실시형태에서, 표적 및 참조 분석물은 dsDNA이고, 별개의 이벤트 유형을 생성하는 특징은 표적 및 참조 분석물의 길이의 차이일 수 있을 것이다. 이러한 실시형태에서, 표적 및 참조 이벤트 면적의 차이는 표적 및 참조 분석물의 길이의 차이에 의해 생성되며, 표적 및 참조 이벤트 신호(즉, 이벤트 프로파일)을 구분하는 데 사용된다.

dsDNA에 대한 이벤트 면적 분포는 단일 모드를 가진다. 이는 표적 및 참조 분석물이 충분히 상이한 길이의 dsDNA인 경우, 면적을 이벤트를 표적 유형 또는 참조 유형인 것으로 분류하기 위한 유용한 이벤트 특징으로 만든다. 충분히 상이한 면적 분포를 발생시키기 위해, 길이는 직경이 20 nm 초과인 나노포어에 대해 적어도 100 bp만큼 상이해야 한다. 예를 들어 조절된 절연 브레이크다운(controlled dielectric breakdown)에 의해 형성된 직경이 1 nm 내지 20 nm로 더 작은 나노포어의 경우(문헌[Yanagi, Itaru, Rena Akahori, Toshiyuki Hatano, and Ken-ichi Takeda. "Fabricating Nanopores with Diameters of Sub-1 Nm to 3 Nm Using Multilevel Pulse-Voltage Injection." Scientific Reports 4 (2014): 5000 doi:10.1038/srep05000]), 표적 및 참조에 대한 dsDNA가 길이가 적어도 20 bp만큼 상이해야 한다.

dsDNA 길이가 표적 분자 및 참조 분자에 대해 얼마나 상이할 수 있는지에 대해 분명한 상한은 존재하지 않는다.

도 2a는 727 bp DNA가 1 M LiCl 내 100 mV에서 25 nm 직경 고체상 나노포어를 통과할 때의 전형적인 이벤트를 보여준다. 이벤트 면적은 음영이 생긴 영역으로 나타나 있다. 도 2b는 이벤트 면적이 dsDNA 길이에 따라 어떻게 증가하는지 보여준다. 주로, 이벤트 깊이가 보존된 채로 유지되는 동안 증가하는 것은 이벤트 기간이고, 이벤트 면적(평균 깊이 x 기간)이 이러한 길이-의존적 증가를 포착하는데, 이는 상기 증가가 기간에 비례하기 때문이다. 도 2c는 동일한 나노포어 상에서 순차적으로 진행된, 보여진 각각의 DNA 길이에 대해 기록된 모든 이벤트들의 면적(pA*ms)의 log-밑수(base)-10의 분포를 보여준다. 이벤트 면적의 log-밑수-10이 분포는 대략 정상적이다(가우시안). DNA가 길이에서 길어짐에 따라, 분포의 평균은 증가한다.

dsDNA를 포함하는 표적-서열 및 dsDNA를 포함하는 참조-서열을 생성하기 위해, 2개의 dsDNA 길이는 적어도 300 bp 길이, 100,000 bp 이하의 길이이다. 일부 실시형태에서, 표적 및 참조 dsDNA 분석물은 적어도 10 bp, 20bp, 30 bp, 40 bp, 50 bp, 60 bp, 70bp, 80 bp, 90 bp 100 bp, 150 bp, 200 bp 또는 300 bp의 길이 차이를 가진다. 일반적으로, 표적 및 참조 dsDNA 분석물 사이의 길이의 증가된 차이는, 크기에 의해 구분할 때 표적 및 참조 분석물과 상관관계가 있는 이벤트 신호의 결정의 더 큰 민감성 및 특이성을 가능하게 하며, 이는 시료에서 상대 존재비의 추정을 개선한다.

일부 실시형태에서, 게놈 DNA(gDNA)로부터 절제된 폴리뉴클레오타이드 단편의 특성을 규명하는 것은 분포 분율 결정을 위한 작업 흐름의 일부이다. 이들 단편 사양은 예를 들어 이들 단편의 서열, 길이 및 2차 구조를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단편 사양은 나노포어 장치에 의한 특정한 서열의 포착 및 검출을 증강시킨다.

일부 실시형태에서, 표적 및 참조 단편은 상이한 페이로드 분자들에 결합되며, 따라서 표적/페이로드 및 참조 페이로드 분자는 충분히 상이한 나노포어 이벤트 신호를 생성한다. 일부 실시형태에서, 상이한 이벤트 신호는 이벤트 기간, 이벤트 최대 깊이, 이벤트 평균 깊이, 및/또는 다른 이벤트 특성들의 조합이다.

일부 실시형태에서, 표적 및 참조 분석물은, 각각의 분자 또는 복합체 유형(표적-페이로드, 참조-페이로드)이 포어를 통과할 때 독특한 나노포어 이벤트 신호가 발생되는 서열 특이적 페이로드에 의해 구별된다. 구별을 용이하게 하기 위해 각각의 분자 유형에 결합하는 페이로드에 결합된 프로브를 사용하는 방법은 국제 공개 WO/2015/171169, "나노포어를 이용한 표적 검출," 국제 공개 WO/2014/182634, "나노포어 및 융합 단백질 결합제를 사용하는 생물학적 표적 검출 방법," 국제 공개 WO/2016/049657, "합성 프로브의 나노포어 감지에 의한 표적 서열 검출," 국제 공개 WO/2016/126746, "시료 백그라운드로부터 표적 폴리뉴클레오타이드의 나노포어 검출" 및 국제 공개 WO/2017/173392, "단편화 및 페이로드 결합에 의한 시료 백그라운드로부터의 표적 뉴클레오타이드의 나노포어 구별"에 기재되어 있으며, 이들은 각각 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

일부 실시형태에서, 표적 및/또는 참조 분석물은 dsDNA이며, 이때, 독특한 페이로드-결합된 PNA는 각각의 dsDNA 유형(표적 및 참조)에 침범하여 나노포어를 이용하여 검출되는 2개의 거대분자 유형을 생성한다. 일부 실시형태에서, 표적 및/또는 참조 분석물은 DNA 또는 RNA를 포함하는 단일 가닥 핵산(ssNA)이다. 페이로드-결합된 상보적 핵산(예를 들어 LNA)은 ssNA 상의 영역에 혼성화하고, 하나 이상의 측면(flanking) 프라이머는 ssNA의 다른 영역에 혼성화하여, 페이로드가 결합된 이중 가닥 분자를 생성하고, 이러한 페이로드는 독특한 표적 및 참조 이벤트 프로파일을 생성하기 위해 표적 및 참조에 대해 독특하다.

분포 분율 프레임워크

일부 실시형태에서, 분포 분율 프레임워크는 1) 표적 분석물 및 참조 유형 둘 다에 대해 시료 물질을 나노포어 감지 포맷으로 전환하기 위해 생화학 방법을 디자인하고 적용하는 것; 2) 특정한 나노포어 실험 프로토콜을 적용하는 것; 및 3) 참조 분석물에 대한 표적 분석물의 상대 존재비에 대한 정량적 추정치를 발생시키기 위해 분석 방법을 적용하는 것을 수반한다. 이 섹션은 프레임워크의 파트 1에 초점이 맞춰져 있다.

나노포어 검출을 위한 시료 제조

표적 서열을 포함하는 분자("표적 분석물" 또는 "표적 분자"로 지칭됨) 및 참조 서열을 포함하는 분자("참조 분석물" 또는 "참조 분자"로 지칭됨)는 물리적으로 유사할 수 있으며: 예를 들어 표적 분자 및 참조 분자는 유사한 분자량 또는 폴리뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있고, 오로지 단일 뉴클레오타이드만큼 상이할 수 있다. 생화학 방법의 목표는 나노포어를 통한 전위 시 별개의 "표적" 또는 "참조" 이벤트 프로파일을 생성하기 위해 편견 없이 표적 분자 및 참조 분자를 제공하는 것이다. 이러한 방식으로, 나노포어 상에서 측정된 표적:참조 혼합물은 시료 내 표적:참조 농도 비율을 나타낸다.

일부 용도 경우에서, 별개의 이벤트 프로파일을 발생시키기 위해 표적, 참조, 또는 두 분자 모두에 폴리뉴클레오타이드 서열을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 혈액 또는 소변의 세포-무함유 순환하는 DNA 분율로부터 수득되는 대부분의 DNA 단편은 균일하게 짧은 150 bp 내지 200 bp 길이이다. PCR, 연결 및 직접적인 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 포함하는 보편적인 방법들에 의한 폴리뉴클레오타이드 서열의 첨가는 나노포어 이벤트 구분을 최대화하기 위해 유연성(flexibility)을 허용한다. 다른 경우에서, 공유 결합된 중합체 페이로드를 운반하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화는, 폴리뉴클레오타이드 길이에 영향을 주지 않으면서 표적 또는 참조 분석물 전하 및 분자량을 변경시키는 데 사용된다. 모든 경우들에서, 목표는 표적 분자 및 참조 분자 그룹마다 구별되는 이벤트 프로파일이다.

나노포어 감지 전에 PCR을 할 필요 없이 없이 풍부화(enrichment) 전략이 사용될 수 있는 충분한 출발 물질이 존재하는 GMO 예(GMO 표적 서열을 함유하는 대두 종자의 부분량)를 포함하는 용도 경우들이 존재한다. 혈액 또는 소변 시료가 유체 1 mL 당 10개 미만의 표적 서열을 함유할 수 있을 것이기 때문에, 풍부화의 일부로서 PCR이 요구되는 액체 생검을 포함하는 다른 경우들이 존재한다. 제안된 방법은 시료 수합, 정제 및 표적 및 참조의 농도를 포함하는 시료 프렙(prep) 필요조건에 아그노스틱(agnostic)하다. 나노포어 측정 및 후속적인 분포 분율 정량화는, 표적 및 참조가 백그라운드(< 1 pM)와 비교하여 충분히 풍부화되고(> 10 pM) 표적 및 참조 분석물이 서로, 및 백그라운드가 존재하는 경우 백그라운드로부터 구분될 수 있는 전기적 이벤트 신호를 생성하는 한, 실시될 수 있다.

일부 실시형태에서, 표적 또는 참조 분석물은 20 nt 내지 100,000 nt 길이의 폴리뉴클레오타이드 서열(이중 가닥 및 단일 가닥 DNA, RNA 및 합성 폴리뉴클레오타이드 포함)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 식물, 인간, 동물, 곤충, 박테리아 또는 바이러스를 포함하는 유기체의 gDNA로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은, 플라스미드, BAC, 선형 서열-입증된 유전자 블록, 발현 카세트를 포함한 공급원들로부터의 이중 또는 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 포함하는 외인성 비-게놈 서열로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 본 발명자들은 나노포어 장치에 의한 분포 분율(예를 들어 복제수 변이) 검출에 특이적인 풍부화를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명자들은 나노포어에 의한 검출을 위한 시료를 제조하기 위해 부위-특정 단편화 방법을 사용한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 검출 방법은 20 nt 내지 100,000 nt 크기 또는 염기쌍 길이로의 핵산 시료, 예를 들어 gDNA의 폴리뉴클레오타이드 단편화의 업스트림 단편화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 제한 효소를 사용하거나 Cas9/sgRNA, TALENS, 징크 핑거 단백질 / 뉴클레아제를 포함하는 부위-특정 뉴클레아제를 사용함으로써 또는 당업계에 공지된 또 다른 단편화 방법에 의해 서열-특이적으로 단편화된다.

일부 실시형태에서, 표적 또는 참조 분석물 풍부화는 표적 단편 크기를 보유하며, 폐기하고 용출시키기 위해 양성 및 음성 크기 선별을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 고분자량 폴리뉴클레오타이드 종(예를 들어 > 8,000 bp DNA)을 보유하고 폐기하기 위해 PEG의 존재 시 낮은 비율의 SPRI 비드:DNA(0.6), 후속해서 단편 크기(예를 들어 2000 bp 내지 8000 bp)를 결합하며, 세척하고 용출시키기 위해 SPRI 비드:DNA(1.5:1)를 사용한다. 일부 실시형태에서, 표적 또는 참조 핵산은 나노포어에서 검출을 용이하게 하기 위해 핵산 증폭을 수행할 수 있다.

나노포어 검출

분포 분율 프레임워크는, 1) 표적 분석물 및 참조 유형 둘 다에 대해, 시료 물질을 나노포어 감지 포맷으로 전환시키기 위해 생화학 방법을 디자인하고 적용하는 단계; 2) 특정한 나노포어 실험 프로토콜을 적용하는 단계; 및 3) 참조 분석물에 대한 표적 분석물(표적: 참조)의 부분량에 대한 정량적 추정치를 발생시키기 위해 수학적 방법을 적용하는 단계를 수반한다. 이 섹션은 파트 2, 실험 프로토콜에 초점을 맞춘다.

혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 제공하기 위해 나노포어에서 진행되는 시료의 반복(iteration)이 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 표적 분석물 및 참조 분석물은 나노포어 센서를 사용하여 각각의 종들 사이에서 신뢰할 만한 구별을 보장하기 위해 제조된다. 일부 실시형태에서, 표적 서열을 포함하는 단편(즉, "표적 단편")의 특징 및 참조 서열을 포함하는 단편(즉, "참조 단편")의 특징은, 2개의 단편들이 하나 이상의 신호 특성에 의해 구별될 수 있는 나노포어 이벤트 신호를 생성하도록 선택된다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 대조군 혼합물(즉, 대조군 시료)은, 미공지 혼합물 내 참조에 대한 표적의 부분량의 추정치를 교정하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 교정은 표적 분자 유형과 참조 분자 유형 사이에서 나노포어 포착 효율의 차이를 보상한다.

일부 실시형태에서, 표적 분석물과 참조 분석물의 미공지 혼합물은 나노포어 상에서 측정되고, 참조에 대한 표적의 분율 존재비는 수학적으로 정량화된다. 일부 실시형태에서, 동일한 시료로부터 유래되는 표적 분자와 참조 분자 유형의 하나 초과의 미공지 혼합물은 동일한 나노포어 상에서 순차적으로 측정된다. 일부 실시형태에서, 동일한 시료로부터 유래되는 표적 분자와 참조 분자 유형의 하나 초과의 미공지 혼합물은 상이한 나노포어 상에서 동시에 측정된다.

일부 실시형태에서, 100% 표적 단독, 100% 참조 단독, 및 표적 분자와 참조 분자의 공지된 혼합물을 포함하는 하나 이상의 대조군이 미공지 혼합물 이전 및/또는 이후에 나노포어 상에서 측정된다.

일부 실시형태에서, 실험 프로토콜은 미공지 혼합물을 나노포어 상에서 진행시키기 이전 또는 이후에, 또는 이전 및 이후에, 나노포어 상에서 하나 이상의 대조군을 순차적으로 진행시키는 단계를 수반한다. 대조군은 100% 표적 분석물 또는 100% 참조 분석물로 구성될 수 있고, 이들은 "단리된 대조군"으로 지칭된다. 대조군은 또한, "혼합물 대조군" 또는 "대조군 혼합물"로 지칭되는 표적 분석물과 참조 분석물의 임의의 공지된 혼합물일 수 있다. 대조군 혼합물은 1:1 비율의 표적:참조 분석물, 또는 임의의 다른 비율의 표적:참조 분석물, 0.01:1 내지 100:1, 또는 0.01:1 미만의 임의의 비율(예를 들어 0.001:1) 또는 100:1 초과의 임의의 비율(예를 들어 1000:1)의 표적:참조 분석물일 수 있을 것이다. 하나 이상의 대조군은 1회 초과로 진행될 수 있다. 대조군(단리된 대조군 및 혼합물 대조군) 및 미공지 혼합물은 동일한 나노포어 상에서 임의의 순서로 순차적으로 진행될 수 있다. 대조군과 미공지 시료 사이에서, 나노포어가 분자를 포착하는 유체 채널(즉, 챔버)이 플러싱(flush)된다.

일부 실시형태에서, 어떠한 대조군도 진행되지 않고, 오로지 미공지 혼합물만 진행되고, 별개의 선행 실험에서 대조군을 진행시킴으로써 구축된 참조 표와 비교되고, 즉, 대조군은 사용 시점에 진행되지 않는다.

일부 실시형태에서, 하나 이상의 유체적으로 단리된 채널 및 나노포어 센서는 미공지를 측정하는 하나 이상의 유체적으로 단리된 채널 및 나노포어 센서와 동시에 대조군을 측정하고 있다. 1개 초과의 나노포어가 각각의 유체 채널에 접근할 수 있을 것이다. 동시화된 실행에서, 플러싱은 필요하지 않을 수 있으며, 그 이유는 각각의 포어가 오로지 1개의 시약 세트, 즉 대조군(단리된 또는 혼합물) 또는 미공지(1개 이상의 미공지 세트)를 보기 때문이다.

일부 실시형태에서, 대조군 혼합물 농도에서 표적 분석물에 대한 참조 분석물의 비율은 미공지 시료 내 표적 분석물에 대한 참조 분석물의 예상된 비율에 근접하며, 그렇긴 하지만 이것은 미리 공지되지 않을 수 있다.

임의의 수의 미공지 혼합물이 동일한 나노포어 상에서 순차적으로 진행될 수 있으며, 각각의 새로운 미공지가 측정을 위해 첨가되기 전에 선행 미공지를 플러싱 아웃시킬 수 있다. 이는, 미공지 혼합물이 동일한 표적 및 참조 분석물 유형으로 구성될 것을 필요로 하며, 그렇긴 하지만 이들의 비율은 상이한 미공지에서 동일하거나 상이할 수 있다.

각각의 기록 기간은 각각의 시약 유형에 대해 적어도 100개의 이벤트를 검출하기에 충분할 정도로 길어야 하고, 더 많은 이벤트들이 기록됨에 따라 성능이 개선되고, 여기서, 개선은 500개 초과의 이벤트가 기록되는 경우 유의하고, 1000개 초과의 이벤트가 기록되는 경우 매우 유의하다. 각각의 시약 세트에 대한 기록 기간은 동일하거나 상이할 수 있다. 적응 반응식(adaptive scheme)은 표적 수의 분자가 검출되는 경우 동적으로 기록하는 것을 중단할 수 있다. 본 발명자들은, 제시된 작업 흐름에서 임의의 시약 세트(대조군 또는 미공지)에 적용될 수 있는 요망되는 신뢰도 수준(예를 들어 95%, 98%, 99%, 99.9% 등)을 달성하는 데 필요한 분자의 수를 결정하기 위한 방법을 이전에 구축하였다(문헌[SI Section 10.2, Morin, Trevor J, Tyler Shropshire, Xu Liu, Kyle Briggs, Cindy Huynh, Vincent Tabard-Cossa, Hongyun Wang, and William B Dunbar. "Nanopore-Based Target Sequence Detection." Edited by Meni Wanunu. PloS One 11, no. 5 (May 5, 2016): e0154426-21. doi:10.1371/journal.pone.0154426]).

일부 실시형태에서, 단일 나노포어를 이용한 실험 프로토콜은 1) 기록 기간 T에 대한 100% 표적, 2) 나노포어 챔버 플러쉬, 3) 기록 기간 T에 대한 100% 참조, 4) 나노포어 챔버 플러쉬, 5) 기록 기간 T에 대한 50:50 표적:참조 혼합물, 6) 나노포어 챔버 플러쉬, 7) 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물을 진행하는 것이다. 기록 기간 T는 15초, 30초, 45초, 1분, 5분, 10분, 또는 1초 내지 15초 또는 10분 내지 60분 사이의 임의의 기간일 수 있다.

또 다른 보편적인 실험 프로토콜은 (1) 내지 (7)을 진행하고, 후속해서 8) 나노포어 챔버 플러쉬, 9) 기록 기간 T에 대한 100% 표적 반복, 10) 나노포어 챔버 플러쉬, 11) 기록 기간 T에 대한 100% 참조 반복, 12) 나노포어 챔버 플러쉬, 13) 기록 기간 T에 대한 50:50 표적:참조 혼합물의 반복을 진행하는 것이다.

또 다른 보편적인 실험 프로토콜은 (1) 내지 (7)을 진행하고, 후속해서 8) 나노포어 챔버 플러쉬, 9) 기록 기간 T에 대한 50:50 표적:참조 혼합물 반복, 10) 나노포어 챔버 플러쉬, 11) 기록 기간 T에 대한 100% 참조 반복, 12) 나노포어 챔버 플러쉬, 13) 기록 기간 T에 대한 100% 표적 반복을 진행하는 것이다.

보다 또 다른 보편적인 실험 프로토콜은 1) 기록 기간 T에 대해, 미공지 혼합물 내 표적:참조 비율에 대략 근접한 것으로 의심되는 표적:참조 대조군 혼합물 비율, 2) 나노포어 챔버 플러쉬, 3) 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물을 진행하는 것이다.

보다 또 다른 보편적인 실험 프로토콜은 1) 기록 기간 T에 대한 1:1 표적:참조 대조군 혼합물 비율, 2) 나노포어 챔버 플러쉬, 3) 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물을 진행하는 것이다.

일부 실시형태에서, 단일 나노포어를 이용한 실험 프로토콜은 1) 기록 기간 T에 대한 100% 표적, 2) 나노포어 챔버 플러쉬, 3) 기록 기간 T에 대한 100% 참조, 4) 나노포어 챔버 플러쉬, 5) 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물을 진행하는 것이다.

일부 실시형태에서, 단일 나노포어를 이용한 실험 프로토콜은 1) 기록 기간 T에 대한 100% 표적, 3) 나노포어 챔버 플러쉬, 4) 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물을 진행하는 것이다.

일부 실시형태에서, 단일 나노포어를 이용한 실험 프로토콜은 1) 기록 기간 T에 대한 100% 참조, 2) 나노포어 챔버 플러쉬, 3) 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물을 진행하는 것이다.

일부 실시형태에서, 단일 나노포어를 이용한 실험 프로토콜은 기록 기간 T에 대한 미공지 혼합물만 진행하고, 순람표(lookup table) 유래의 데이터 또는 100% 참조 대조군 시료, 100% 표적 대조군 시료, 공지된 표적:참조 대조군 혼합물, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래되는 오차 보정 정보를 함유하는 이전의 데이터를 사용하여, 미공지 혼합물 내 표적 분석물의 분포 분율의 추정치를 개선하기 위해 기록 기간 T로부터 발생된 데이터에 적어도 하나의 보정항을 제공하는 것이고, 각각은 미공지 혼합물에 대한 실험 프로토콜과 실질적으로 유사한 조건 하에 진행된다.

실험 프로토콜의 완료 시, 대조군(진행되는 경우)으로부터 기록된 이벤트 및 미공지(들)로부터 기록된 이벤트는 하나 이상의 미공지 내 참조에 대한 표적의 분율 양을 예측하기 위해 수학적으로 분석된다.

분포 분율 추정 및 역치 결정

분포 분율 프레임워크는: 1) 생화학 방법을 디자인하고 적용하여, 표적 분석물 및 참조 유형 둘 다에 대해 시료 물질을 나노포어 감지 포맷으로 전환시키는 단계; 2) 특정한 나노포어 실험 프로토콜을 적용하는 단계; 및 3) 수학적 방법을 적용하여, 참조 분석물에 대한 표적 분석물(표적:참조)의 부분량에 대한 정량적 추정치를 발생시키는 단계를 수반한다. 이 섹션은 프레임워크의 파트 3에 초점을 맞춘다.

일부 경우, 참조 서열 "r"에 대한 표적 서열 "t"의 추정된 농도비 R=[t]/[r]이 정량화된다. 이식유전자 백분율 또는 GMO%는 백분율로 전환된 R 비율이다. 일부 경우, 전체(표적 서열 + 참조 서열)에 대한 표적 서열의 추정된 부분량 F=[t]/([t]+[r])이 정량화된다. 비율 R과 분율 F 사이에 간단한 전환, 즉, F = R/(R+1) 또는 동등하게는 R = F/(1-F)가 존재한다.

분포 분율 방법은 참조에 대한 표적, 또는 전체(표적 및 참조의 합)에 대한 표적의 상대량을 예측한다. 일부 실시형태에서, 칼리브런트(calibrant) 분자가 부가되어, 표적 분자 또는 참조 분자의 절대 농도를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 나노포어 이벤트 특징은 분포 분율을 계산하기 위해 표적 분석물 유형과 참조 분석물 유형 사이에서 비교된다. 일부 실시형태에서, 1개 초과의 나노포어 이벤트가 분포 분율을 계산하기 위해 표적 분석물 유형과 참조 분석물 유형 사이에서 비교된다.

표적 분석물 및 참조 분석물과 상관관계가 있는 이벤트 신호를 구분하기 위해 역치 결정을 개선하고 분포 분율을 결정하며 나노포어로부터의 이벤트 신호의 사용으로부터 오차를 보정하기 위해 본 발명자들이 본원에 기재하고 있는 3가지 방법들이 존재한다: 1) Q-테스트 방법, 2) 서포트 벡터 머신(SVM) 및 3) 가우시안 혼합 방법에 대한 기댓값 최대화 알고리즘(EMGM).

하기의 일반적인 개념이 이러한 방법에 적용된다. 우선, 참조 분석물 "r"에 대한 표적 분석물 "t"의 참비율은 R=[t]/[r]로 지칭된다. 전체(표적 + 참조) 분석물에 대한 표적 분석물의 참분율은 F=[t]/([t]+[r])로 지칭된다. 비율 R 및 분율 F 사이에서의 간단한 전환은 F = R/(R+1) 또는 동등하게는 R = F/(1-F)이다. 미공지 혼합물의 참비율은 R_혼합으로 지칭되고, 혼합물의 참분율은 F_혼합으로 지칭된다. 수학적 방법은 F_혼합 및 R_혼합에 대한 추정치를 발생시키고, 이들은 F ^* _혼합 및 R ^* _혼합 으로 지칭된다. 표적 및 참조 분자 구축물들은 별개의 나노포어 이벤트 신호를 제공하기 위해 디자인되고 생성된다.

Q-테스트 방법

수학적 방법은 우선, 모든 기록된 이벤트들을 1개 또는 2개의 범주, 즉 표적 양성(동등하게는 참조 음성) 또는 표적 음성(동등하게는 참조 양성)으로 분류(binning)하기 위한 기준을 디자인한다. 이벤트 기준은 하나 이상의 이벤트 특징을 사용한다. 일부 실시형태에서, 단일 특징은 이벤트를 분류하기 위한 기준을 생성하는 데 사용된다. 기준이 주어지면, 모든 이벤트는 표적 이벤트 또는 참조 이벤트으로 태깅된다. 이들은 "표적-태깅된" 또는 "참조-태깅된"으로 지칭된다.

표적-태깅된 이벤트의 분율은 Q로 지칭되며, 이는 표적-태깅된 이벤트의 수를 이벤트의 총 수로 나눈 것과 동일하다. 참조-태깅된 이벤트의 분율은 1-Q이다. 태깅된 분율 Q는 나노포어 상의 농도 분율 F의 함수이며, Q(F)로 기재된다.

혼합물 Q(F_혼합) 내 표적-태깅된 이벤트의 분율은 Q _혼합 으로 지칭되며; 100% 표적 대조군 내 표적-태깅된 이벤트Q(1)의 분율은 Q _표적 으로 지칭되며; 100% 참조 대조군 내 표적-태깅된 이벤트Q(0)의 분율은 Q _참조 로 지칭되며; 표적:참조 대조군 혼합물 내 표적-태깅된 이벤트의 분율은 Q _X:Y 로 지칭되고, 여기서, X:Y는 대조군 혼합물 내 표적-대-참조의 혼합물의 비율이다. 분율 z = X / (X + Y)의 경우, 본 발명자들은 Q(z) = Q _X:Y 를 가진다. 일부 실시형태에서, 1:1 비율의 대조군 혼합물이 바람직하며, 이때 z = 0.5이고, 태깅된 분율은 Q _1:1 또는 Q _50:50 으로 기재된다.

전형적으로, Q _표적 은 1에 근접하고, 이때 1-Q _표적 은 위음성 분율을 나타낸다. 전형적으로, Q _참조 는 0에 근접하고, 이때 Q _참조 는 위양성 분율을 나타낸다. 대조군들은 Q _표적 > Q _X:Y > Q _참조 를 충족시킨다. 혼합물은 Q _표적 > Q _혼합 > Q _참조 를 충족시킨다.

일부 실시형태에서, 대조군들 유래의 표적-태깅된 분율(Q _표적 , Q _참조 , Q _X:Y )은 개별적으로 진행되고, 선람표는 Q _혼합 을 측정하는 임의의 새로운 검정법에 대한 값을 지칭하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, (Q _표적 , Q _참조 , Q _X:Y )는 이러한 검정법의 일부로서 사용 시점에 구축된다. 일부 실시형태에서, (Q _표적 , Q _참조 )는 개별적으로 진행되고, 선람표는 이들의 값을 지칭하는 데 사용되며, 반면에 (Q _X:Y ) 값은 Q _혼합 을 측정하는 검정법의 일부로서 사용 시점에 구축된다.

일부 실시형태에서, 대조군들 유래의 표적-태깅된 분율(Q _표적 , Q _참조 , Q _X:Y )은 사용 시점에 1회 초과로 진행되고, 이들의 값은 하기 식에서 후속적인 사용을 위해 평균화된다.

참 부분량 F_혼합에 대한 추정치 F ^* _혼합 에 대한 식은 하기에 의해 주어진다:

(방정식 1)

여기서,

및

이다.

참비율 R_혼합에 대한 추정치 R ^* _혼합 에 대한 식은 하기에 의해 주어진다:

R ^* _혼합 = ρα (방정식 2)

이식유전자(GMO)에 대한 부분량을 예측하기 위한 실시예에서, GMO(%)는 R ^* _혼합 x 100 (%)와 동일하다.

파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이다. 일부 실시형태에서, Q _참조 의 값은 위양성 오차를 보상하는 데 사용될 수 있다. 위양성 오차에 대한 어떠한 보상도 사용되지 않는 경우, Q _참조 는 0으로 설정될 수 있다. 일부 실시형태에서, Q _표적 의 값은 위음성 오차를 보상하는 데 사용될 수 있다. 위음성 오차에 대한 어떠한 보상도 사용되지 않는 경우, Q _표적 은 0으로 설정될 수 있다.

파라미터 α는 비율 보상 배율기(ratio compensation multiplier)다. 분석적으로, 파라미터 α는 2개의 포착률 상수들의 비율이다. 포착률 상수는, 주어진 분자 유형에 대한 농도로 나누어진 나노포어 이벤트 비율이다. 구체적으로, 파라미터 α는 표적 분석물 포착률 상수로 나누어진 참조 분자 포착률 상수이다. 따라서, 배율기 α는 표적 분자 유형과 참조 분자 유형 사이의 나노포어 포착 및 검출의 차이를 보상한다.

대조군 혼합물이 1:1 비율인 경우,

이다.

표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이에 대한 보상이 사용되지 않는 경우, α는 방정식 (1) 및 (2)에서 1과 동일하도록 설정되어, 각각 F* _혼합 및 R* _혼합 에 대한 추정치를 제공한다.

방정식 (1) 및 (2)를 적용하는 것은 각각 F ^* _혼합 및 R ^* _혼합 에 대한 추정치를 제공한다. F ^* _혼합 및 R ^* _혼합 에 대한 불확실성 추정치 또는 오차 막대가 또한, 계산될 수 있다. 단리된 대조군 및 혼합물 대조군에 대한 각각의 Q는 이것과 연관된 표준 오차,

를 가지며, 여기서, N은 이벤트들의 총 수이다. 수치적으로, 각각의 Q 분포로부터의 무작위 시료는 방정식 (1) 및 (2)를 적용함으로써 여러 번 도출되어, F ^* _혼합 및 R* _혼합 에 대한 값들의 분포를 발생시킬 수 있다. 그런 다음, F ^* _혼합 및 R ^* _혼합 에 대한 분포가 불확실성 경계를 계산하는 데 사용되어, F ^* _혼합 ± F ^* _sd 및 R ^* _혼합 ± R ^* _sd 를 초래할 수 있다.

일부 실시형태에서, 이벤트 특징 기준에 매칭하거나 초과하는 이벤트들의 비율 또는 분율은 미공지 혼합물 내 참조에 대한 표적의 부분량을 추정하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 기준은 역치이다.

본 발명자들의 이전의 연구는, 단일 태깅 기준이 Q 및 이의 오차 막대를 계산하는 데 어떻게 이용되는지를 기재하고 있다(문헌[Morin, Trevor J, Tyler Shropshire, Xu Liu, Kyle Briggs, Cindy Huynh, Vincent Tabard-Cossa, Hongyun Wang, and William B Dunbar. "Nanopore-Based Target Sequence Detection." Edited by Meni Wanunu. PloS One 11, no. 5 (May 5, 2016): e0154426-21. doi:10.1371/journal.pone.0154426]). 해당 연구에 상술된 바와 같이, 기준을 적용함으로써, 각각의 이벤트 j는 이것에 할당된 변수 Z _j 를 가진다. 이벤트 j가 태깅되는 경우, Z _j = 1이고; 그렇지 않으면, Z _j = 0이다. 각각의 시약 세트(대조군 및 미공지)의 경우, Q = (∑ _j Z _j )/N이며, 여기서, N은 이벤트의 총 수이다. 동일한 기준이 모든 대조군, 단리물 및 혼합물 및 모든 미공지들에 적용되어, 상기 식에서 이용된 모든 Q 값들을 계산한다(방정식 (1) 내지 (2)).

이러한 기준은 1개 또는 1개 초과의 불균등 방정식(inequality equation)을 수반하고, 하나 이상의 이벤트 특징들의 선형 또는 비선형 함수일 수 있다. 각각의 불균등 방정식은 이와 연관된 역치 또는 역치 범위를 가진다. 따라서, 기준은 불균등 세트 및 상응하는 역치 세트에 의해 완전히 명시된다.

일부 실시형태에서, 기준은 표적 분자 유형 및 참조 분자 유형의 부류에 대해 구축되고, 해당 부류에 대한 분자 유형을 사용하는 새로운 검정법이, 이미 구축된 기준을 이용할 것이다.

일부 실시형태에서, 기준은 임의의 새로운 검정법을 위해 수합된 대조군 데이터로부터 식별된다. 즉, 기준은 진행 시간에 분포 분율 프로토콜의 일부로서 구축된다.

일부 실시형태에서, 기준에 대한 불균등 세트는 유사한 표적 분자 유형 및 참조 분자 유형을 사용하여 이전의 실험 세트로부터 선험적으로 구축되는 한편, 하나 이상의 기준 불균등에 대한 역치 세트는 진행 시간에 대조군 데이터를 사용하여 구축된다.

일부 실시형태에서, 단일 이벤트 특징은 이러한 기준을 구축하는 데 이용된다.

"q"로 표지된 역치는 불균등을 기반으로 비-표적-태깅된(즉, 참조-태깅된) 이벤트으로부터 표적-태깅된 이벤트을 나눈 스칼라(scalar) 값이다. 1개 초과의 불균등이 기준에 사용되는 경우, q는 불균등 세트에 사용되는 역치값의 벡터를 나타낸다.

표적 및 참조에 2개의 상이한 길이의 dsDNA들을 사용한 예를 고려한다. 보편적으로, 이벤트 면적을 사용한 단일 불균등은 실행 가능한 기준이다. 표적이 참조 dsDNA보다 긴 dsDNA인 경우, 면적이 역치를 초과한다면 이벤트이 태깅된다. 표적이 참조 dsDNA보다 짧은 dsDNA인 경우, 면적이 역치보다 작다면 이벤트이 태깅된다.

q-역치값 또는 값들의 자동 선별에 상이한 방법들이 이용될 수 있으며, 여기서 1개의 q 값은 기준에서 각각의 불균등에 의해 식별된다.

일부 실시형태에서, q-역치는 Q _참조 에 대한 요망되는 위양성을 생성하는 값으로서 확인된다. 예를 들어, q-역치는 5%의 위양성을 생성하기 위해 Q _참조 의 95 백분위수에서 설정될 수 있을 것이다. 해당 경우, 95%의 참조 분자 이벤트이 q보다 작은 면적을 가진다. 대안적으로, SFT q-역치는 Q _표적 에 대한 요망되는 위음성을 생성하는 값으로서 결정되며, 즉, q-역치는 5%의 위음성을 생성하기 위해 Q _표적 의 5 백분위수에서 설정될 수 있을 것이다.

일부 실시형태에서, SFT q-역치는

에 대한 해결방안으로서 확인된다. 역치는, Q _표적 과 Q _참조 사이의 가장 큰 거리에 상응하는 값일 것이다.

일부 실시형태에서, q-역치 범위는 Q _참조 에 대한 요망되는 위양성을 생성하는 값으로서 계산된다. 예를 들어, q-역치 범위는 Q _참조 의 95 백분위수 내지 99 백분위수를 스패닝할 수 있을 것이다.

일부 실시형태에서, q-역치 범위가 이용되는 경우, 방정식 (1) 및 (2)는 F ^* _혼합 (q) 및 R ^* _혼합 (q) 값의 범위를 생성하고, 이들 범위의 평균은 예측된 F ^* _혼합 및 R ^* _혼합 값으로서 계산되고 기록된다.

표적 DNA 및 참조 DNA에 결합된 2개의 상이한 페이로드들을 사용하는 예를 고려한다. 보편적으로, 이벤트 평균 전도도 및 이벤트 기간을 사용한 3개의 불균등은 실행 가능한 기준이다. 구체적으로, 특정한 페이로드-표적 DNA 분자 구축물의 경우, 표적 이벤트은 평균 δG 대 기간의 2D 이벤트 플롯 상에서 독특한 부분 공간(subspace)을 생성하고, 기간이 역치보다 큰 경우, 및 평균 δG가 하나의 역치보다 크고 또 다른 역치보다 작은 경우 이벤트이 태깅된다. 이러한 경우, 태깅 기준은 2개의 이벤트 특징들(평균 δG, 기간)을 사용하여 3개의 선형 불균등 및 3개의 역치로 표시된다.

SVM 방법

일부 실시형태에서, 머신 러닝은 각각의 이벤트을 표적 분석물 이벤트 또는 참조 분석물 이벤트으로서 태깅하기 위한 특징들 및 특징 기준의 세트를 식별하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 서포트 벡터 머신은 이벤트을 표적 분석물 또는 참조 분석물로서 분류하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 서포트 벡터 머신 작업 흐름의 개발은 하기 단계들: 1) 나노포어 데이터를 로딩하는 단계, 2) 이벤트을 구별하기 위해 나노포어 이벤트 특징들을 선별하는 단계, 3) 대조군을 사용한 모델 트레이닝 및 시험 단계, 4) 대조군을 사용한 데이터 교정 단계, 5) 미공지 표적:참조 혼합물의 예측 단계를 가진다. 일부 실시형태에서, 이미 개발되고 감소된 서포트 벡터 머신 작업 흐름은 자동화된 분포 분율 예측을 위해 실행된다.

일부 실시형태에서, 머신 러닝 툴은 이벤트 특징들의 선별, 불균등의 형태(선형 및/또는 비선형) 및 불균등에 사용된 역치값 q를 포함하는 기준의 선별을 자동화하는 데 적용된다. 일부 실시형태에서, 분류 문제을 해결하는 슈퍼바이즈드 머신 러닝 방법, 서포트 벡터 머신(SVM)이 실행되어, 태깅 기준을 발생시킨다. SVM에 대한 참조는 문헌[Cortes, C. & Vapnik, V. Machine Learning (1995) 20: 273; and Boser, B. E., Guyon, I. M., and Vapnik, V. N. (1992). "A training algorithm for optimal margin classifiers,"　Proceedings of the fifth annual workshop on Computational learning theory]를 참조하며, 이들은 각각 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명자들의 분포 분율 프레임워크에 SVM 방법을 적용한 일례는 하기에 제공된다:

선형으로 분리 가능한 데이터의 경우, {x ₁,....,x _n}을 데이터 세트로 두고,

을 x _i의 부류 표지로 두며, 결정 경계선은 하기에 의해 모든 포인트들을 분류해야 한다:

모든 포인트들을 분류하는 경계를 최대화하기 위해, 분류 문제는 하기 최적화 문제가 된다:

(방정식 3)을 최소화한다.

로 처리한다.

결정 경계선에 근접한 데이터 포인트는 서포트 벡터로 지칭된다.

실제-단어 문제의 경우, 데이터는 통상적으로, 일부 아웃라이어(outlier) 또는 노이즈때문에 선형으로 분리 가능하지 않다. 분류를 최적화하기 위해, 몇몇 잘못 분류된 포인트들을 허용하기 위해 경계를 조정하였다. 한편, 잘못 분류된 경우들은 높은 비용이 소요되었다. 이러한 경계는 소프트 경계가 된다. 소프트 경계 분류화는 "슬랙(slack)" 변수를 비용 함수 내에 첨가함으로써 사용될 수 있다(도 3a):

을 최소화한다.

로 처리한다.

선형으로 분리 가능하지 않은 데이터를 다루는 제2 방식은 커널(kernel) 방법이다(상기 인용된 Boser, B. E. 등). 이는 입력 특징 공간을 고차원 공간으로 변환시킨다. 이렇게 함으로써, 데이터는 선형으로 분리 가능할 수 있다(도 3d). 맵핑 함수(mapping function)를 Φ(x)로서 지칭하며, 그러면 커널 함수 K는 하기와 같이 기재될 수 있다:

(방정식 4)

이용 가능한 커널 함수 유형 세트가 존재한다. 가장 보편적인 유형은 본원에 열거되어 있다:

선형 커널

다항(polynomial) 커널

가우시안(RBF) 커널

통상적으로, 커널 트릭 및 소프트 경계는 둘 다 분류화 문제에 대한 보다 양호한 해결방안을 생성하기 위해 함께 사용된다.

SVM을 분포 분율용 나노포어 데이터에 적용하는 것은 하기 단계들을 가진다: 1) 대조군 및 미공지 데이터 세트를 로딩하며, 이들은 각각의 세트에 대한 모든 이벤트들을 포함하는 단계; 2) 특징 선별; 3) 모델 트레이닝 및 시험; 4) 데이터 교정; 및 5) F ^* _혼합 및 R ^* _혼합 의 예측. 제공된 실시예에서, 이들 5개 단계들의 적용은 보다 상세히 언급된다. 방정식 (3) 및 (4), 커널 유형을 포함하는 하이퍼-파라미터 그리드 검색, 소프트 경계 상수, 및 커널 함수가 의존할 수 있는 임의의 파라미터는 이러한 방법의 적용 일부로서 해결된다. 보편적인 결정 경계선 및 보편적인 교정비(calibration ratio)를 포함하는 SVM로부터 발생된 검정법-기반 일반화 모델은 대조군 데이터 세트의 필요 없이 미공지 혼합물에 적용될 수 있다.

보편적인 결정 경계선 및 보편적인 교정비를 포함하는 SVM로부터 발생된 검정법-기반 일반화 모델은 대조군 데이터 세트의 필요 없이 미공지 혼합물에 적용될 수 있다. 결정 트레스(decision tress), 뉴럴 네트워크(neural network), 네이티브 바이어(Native Bayer), 로지스틱 회귀(Logistic regress), K-최근접 이웃(K-nearest neighbor) 및 부스팅(boosting)을 포함하는 다른 데이터 마이닝(mining) 방법들이 또한, 나노포어 데이터에 적용 가능한 방법으로 주장된다.

EMGM 방법(가우시안 혼합에 대한 기댓값 최대화 알고리즘)

일부 실시형태에서, 클러스터링 방법은 표적 이벤트 및 참조 이벤트을 태깅하기 위한 기준을 형성하는 데 적용된다. 각각의 이벤트은 표적 이벤트 또는 참조 이벤트으로서 태깅된다. 일부 실시형태에서, 분포 분율은 표적 이벤트 및 참조 이벤트의 합계와 비교하여 표적 이벤트의 비율이다. 보상 정보(compensatory information)를 제공하는 진행 대조군(running control)은 분포 분율의 추정치를 개선하는 조정을 가능하게 한다.

일부 실시형태에서, 클러스터링 방법은 하나 이상의 이벤트 파라미터의 분포의 파라미터화된 모델에 적용되는 최대우도법(maximum likelihood method)이다. 대조군 세트에 최우추정법(maximum likelihood estimation)을 반복적으로 적용하면, 피팅된 모델 파라미터를 초래하며, 이때 하나의 분포 세트는 표적 분석물 유형과 연관이 있고 다른 분포 세트는 참조 분석물 유형과 연관이 있다. 후속적으로, 파라미터화된 모델을 미공지 혼합물에 적용하면, 참조 분포(들)의 표적에 이벤트의 할당을 초래하고, 표적 + 참조 분포(들)에 할당된 이벤트들의 총 수에 대한 표적 분포(들)에 할당된 이벤트들의 비율은 부분량 추정치를 발생시키는 데 사용된다.

로그 우도 함수(log likelihood function)는 알고리즘의 반복에서 진전(progress)을 추적하기 위한 측정 기준(metric)으로서 사용되고, 이는 대조군 데이터에서 각각의 이벤트의 멤버쉽 할당을 귀납적으로 업데이트하고 데이터에 대한 분포의 피트를 개선한다. 일부 실시형태에서, 데이터는 파라미터화된 가우시안 분포의 혼합을 사용하여 모델링된다. 수치 데이터를 특징화하기 위해 가우시안 혼합 모델을 포함하는 유한 혼합 모델을 사용하는 방법은 통계학 및 응용 수학에서 잘 특징화되어 있다(문헌[Hand, David J., Heikki Mannila, and Padhraic Smyth. Principles of data mining. MIT press, 2001]).

일부 실시형태에서 가우시안 혼합(GM) 모델을 고려하면, 이러한 방법은 구성성분의 평균 및 공분산 및 혼합 계수를 포함하는 파라미터들에 대해 우도 함수를 최대화한다. 로그 우도에 대한 밀폐형(closed-form) 해결방안이 존재하지 않기 때문에, 데이터를 모드에 할당하기 위한 모드 파라미터 및 중량은 기댓값 최대화(EM; Expectation Maximization) 기술을 사용하여 반복적으로 계산된다(문헌[C.M. Bishop, Pattern Recognition and Machine Learning, Springer, 2006]).

분율 존재비 추정치를 발생시킬 목적으로, GM 모델에 적용된 EM 알고리즘을 나노포어 데이터에 적용하는 방법은 EMGM으로 지칭된다. Q-테스트 방법과 마찬가지로, EMGM 방법은 표적 이벤트을 참조 이벤트으로부터 구분하는 데 사용될 수 있는 하나 이상의 나노포어 이벤트 신호에 대한 선행 지식을 사용한다.

언급된 바와 같이, 표적 집단은 단일 분포, 또는 하나 초과의 분포로 표시될 수 있다. 마찬가지로, 참조 집단은 단일 분포, 또는 하나 초과의 분포로 표시될 수 있다. 표적 분포(들) 및 참조 분포(들)는 알고리즘을 하나 이상의 단리된 대조군 및 하나 이상의 대조군 혼합물에 적용함으로써 구축된다.

후속적으로, 표적 분포(들)가 구축된 후, 미공지 혼합물 내 이벤트은, 이것이 모델링된 표적 분포(들)와 연관이 있다면 표적 이벤트으로서 태깅된다.

예로서, 총 3개의 가우시안 분포들은 1:1 대조군 혼합물 내에서 전체 데이터 세트를 피트할 수 있을 것이고, 이때 1개의 모드는 표적 유형과 연관이 있고 2개의 모드들은 참조 유형과 연관이 있다.

알고리즘은 EMGM의 적용을 위해 오로지 1개의 대조군 혼합물을 필요로 한다. 후속적으로, 결과적인 모델은 미공지 혼합물에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 단리된 참조 대조군은 위양성의 효과를 상쇄하는 데 사용된다. 구체적으로, EMGM 모델을 100% 참조 대조군에 적용하는 것은 위양성 분율을 구축하였으며, 이는 EMGM 모델을 미공지 혼합물에 적용함으로써 발생된 예측된 분율로부터 차감된다(subtracted). 이러한 차감은 위양성 보상(또는 "FP" 보상)으로 지칭될 수 있다.

나노포어 장치

제공된 바와 같은 나노포어 장치는 장치의 내부 공간을 2개의 부피로 분리하는 구조물 내에서 개구부를 형성하는 적어도 하나의 포어, 및 상기 포어를 통과하는 물체를 (예를 들어 물체를 가리키는 파라미터에서의 변화를 검출함으로써) 식별하도록 구성된 적어도 하나의 센서를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 나노포어 장치는 또한, PCT 공개 WO/2013/012881에 개시되어 있고, 이는 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

나노포어 장치 내의 포어(들)는 나노 규모 또는 마이크로 규모이다. 일 양태에서, 각각의 포어는 작거나 큰 분자 또는 미생물이 통과할 수 있는 크기를 가진다. 일 양태에서, 각각의 포어의 직경은 적어도 약 1 nm이다. 대안적으로, 각각의 포어의 직경은 적어도 약 2 nm, 적어도 약 3 nm, 적어도 약 4 nm, 적어도 약 5 nm, 적어도 약 6 nm, 적어도 약 7 nm, 적어도 약 8 nm, 적어도 약 9 nm, 적어도 약 10 nm, 적어도 약 11 nm, 적어도 약 12 nm, 적어도 약 13 nm, 적어도 약 14 nm, 적어도 약 15 nm, 적어도 약 16 nm, 적어도 약 17 nm, 적어도 약 18 nm, 적어도 약 19 nm, 적어도 약 20 nm, 적어도 약 25 nm, 적어도 약 30 nm, 적어도 약 35 nm, 적어도 약 40 nm, 적어도 약 45 nm, 적어도 약 50 nm, 적어도 약 60 nm, 적어도 약 70 nm, 적어도 약 80 nm, 적어도 약 90 nm 또는 적어도 약 100 nm이다.

일 양태에서, 포어의 직경은 약 100 nm 이하이다. 대안적으로, 포어의 직경은 약 95 nm 이하, 90 nm 이하, 85 nm 이하, 80 nm 이하, 75 nm 이하, 70 nm 이하, 65 nm 이하, 60 nm 이하, 55 nm 이하, 50 nm 이하, 45 nm 이하, 40 nm 이하, 35 nm 이하, 30 nm 이하, 25 nm 이하, 20 nm 이하, 15 nm 이하 또는 10 nm 이하이다.

일 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 대안적으로 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm의 직경을 가진다.

일부 양태에서, 나노포어 장치는 포어를 가로질러 중합체 스캐폴드를 이동시키기 위한 수단 및/또는 포어를 통과하는 물체를 식별하기 위한 수단을 추가로 포함한다. 보다 상세한 사항은 하기에서 2-포어 장치의 맥락에 기재되어 제공된다.

단일-포어 나노포어 장치와 비교하여, 2-포어 장치는 포어를 가로질러 중합체 스캐폴드의 이동의 속도 및 방향의 양호한 조절을 제공하기 위해 보다 쉽게 구성될 수 있다.

일 실시형태에서, 나노포어 장치는 복수의 챔버들을 포함하며, 각각의 챔버는 적어도 하나의 포어를 통해 인접 챔버와 소통한다. 이들 포어 중에서, 2개의 포어들, 즉 제1 포어 및 제2 포어는, 적어도 일부의 표적 폴리뉴클레오타이드가 제1 포어를 나와 제2 포어 내로 이동할 수 있도록 위치된다. 나아가, 이러한 장치는 각각의 포어에서 이동 중 표적 뉴클레오타이드를 식별할 수 있는 센서를 포함한다. 일 양태에서, 식별은 표적 폴리뉴클레오타이드의 개별 구성성분의 식별을 수반한다. 또 다른 양태에서, 식별은 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합된 페이로드 분자의 식별을 수반한다. 단일 센서가 이용되는 경우, 이러한 단일 센서는 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정하기 위해 상기 포어의 양 말단에 위치한 2개의 전극들을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 단일 센서는 전극 이외의 구성성분을 포함한다.

일 양태에서, 장치는 2개의 포어들을 통해 연결된 3개의 챔버들을 포함한다. 3개 초과의 챔버들을 갖는 장치는 3-챔버 장치의 어느 한 면 상에 또는 3개의 챔버들 중 임의의 2개의 챔버들 사이에 하나 이상의 추가의 챔버를 포함하도록 쉽게 디자인될 수 있다. 마찬가지로, 2개 초과의 포어들은 챔버를 연결하도록 장치에 포함될 수 있다.

일 양태에서, 다수의 중합체 스캐폴드들이 하나의 챔버로부터 다음 챔버로 동시에 이동할 수 있도록, 2개의 인접 챔버들 사이에 2개 이상의 포어들이 존재할 수 있다. 이러한 다중-포어 디자인은 장치 내에서 표적 폴리뉴클레오타이드 분석의 처리량을 증강시킬 수 있다. 멀티플렉싱의 경우, 하나의 챔버는 하나의 유형의 표적 폴리뉴클레오타이드를 가질 수 있을 것이고, 또 다른 챔버는 또 다른 표적 폴리뉴클레오타이드 유형을 가질 수 있을 것이다.

일부 양태에서, 장치는 하나의 챔버로부터 또 다른 챔버로 표적 폴리뉴클레오타이드를 이동시키기 위한 수단을 추가로 포함한다. 일 양태에서, 이동은 제1 포어 및 제2 포어 둘 다에 걸쳐 표적 폴리뉴클레오타이드(예를 들어 표적 서열을 포함하는 증폭 생성물 또는 앰플리콘)의 로딩을 동시에 초래한다. 또 다른 양태에서, 이러한 수단은 추가로, 표적 폴리뉴클레오타이드를 2개의 포어 둘 다를 통해 동일한 방향으로 이동시킬 수 있다.

예를 들어, 3-챔버 2-포어 장치("2-포어" 장치) 내에서, 각각의 챔버는 전원 장치에 연결하기 위한 전극을 함유할 수 있어서, 개별 전압이 챔버들 사이에서 각각의 포어를 가로질러 인가될 수 있다.

본 개시내용의 일 실시형태에 따르면, 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 장치가 제공되며, 여기서, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 소통하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 소통한다. 이러한 장치는 발명의 명칭이 이중-포어 장치인 미국 공개 2013-0233709에서 이미 개시된 치수 또는 다른 특징들 중 임의를 가질 수 있으며, 이러한 문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

일 양태에서, 각각의 포어의 직경은 적어도 약 1 nm이다. 대안적으로, 각각의 포어의 직경은 적어도 약 2 nm, 적어도 약 3 nm, 적어도 약 4 nm, 적어도 약 5nm, 적어도 약 6 nm, 적어도 약 7 nm, 적어도 약 8 nm, 적어도 약 9 nm, 적어도 약 10 nm, 적어도 약 11 nm, 적어도 약 12 nm, 적어도 약 13 nm, 적어도 약 14 nm, 적어도 약 15 nm, 적어도 약 16 nm, 적어도 약 17 nm, 적어도 약 18 nm, 적어도 약 19 nm, 적어도 약 20 nm, 적어도 약 25 nm, 적어도 약 30 nm, 적어도 약 35 nm, 적어도 약 40 nm, 적어도 약 45 nm, 적어도 약 50 nm, 적어도 약 60 nm, 적어도 약 70 nm, 적어도 약 80 nm, 적어도 약 90 nm, 또는 적어도 약 100 nm이다.

일 양태에서, 각각의 포어의 직경은 약 100 nm 이하이다. 대안적으로, 포어의 직경은 약 95 nm 이하, 90 nm 이하, 85 nm 이하, 80 nm 이하, 75 nm 이하, 70 nm 이하, 65 nm 이하, 60 nm 이하, 55 nm 이하, 50 nm 이하, 45 nm 이하, 40 nm 이하, 35 nm 이하, 30 nm 이하, 25 nm 이하, 20 nm 이하, 15 nm 이하, 또는 10 nm 이하이다.

일 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 대안적으로 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 직경을 가진다.

일부 양태에서, 포어는 실질적으로 둥근 모양을 가진다. 본원에 사용된 바와 같이 "실질적으로 둥근"은, 원통 형태에서 적어도 80% 또는 90%인 모양을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포어는 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형 또는 육각형 모양이다.

일 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 10,000 nm, 또는 대안적으로 약 2 nm 내지 약 9,000 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 8,000 nm 등인 깊이를 가진다.

일부 양태에서, 나노포어는 막을 통해 확장된다. 예를 들어, 포어는 지질 이중층 막에 삽입된 단백질 채널일 수 있거나 고체상 기질, 예컨대 실리콘 디옥사이드, 실리콘 니트라이드, 그래핀 또는 이들 또는 다른 물질들의 조합으로 형성된 층을 통해 드릴링, 에칭 또는 포어의 형성에 의해 조작될 수 있다. 나노포어는 스캐폴드:융합:페이로드의 포어, 또는 효소 활성 후 이러한 분자의 생성물을 통과할 수 있는 크기를 가진다. 다른 실시형태에서, 포어의 일시적인 차단은 분자 유형의 구별에 바람직할 수 있다.

일부 양태에서, 나노포어의 길이 또는 깊이는 2개의 다른 별개의 부피들을 연결하는 채널을 형성할 정도로 충분히 크다. 일부 이러한 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 100 nm 초과, 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과, 800 nm 초과, 또는 900 nm 초과이다. 일부 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.

일 양태에서, 포어들은 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 거리만큼 이격된다. 일부 양태에서, 포어들 사이의 거리는 1000 nm 초과, 2000 nm 초과, 3000 nm 초과, 4000 nm 초과, 5000 nm 초과, 6000 nm 초과, 7000 nm 초과, 8000 nm 초과, 또는 9000 nm 초과이다. 일부 양태에서, 포어들은 30000 nm 이하, 20000 nm 이하, 또는 10000 nm 이하만큼 이격된다. 일 양태에서, 이러한 거리는 적어도 약 10 nm, 또는 대안적으로, 적어도 약 20 nm, 적어도 약 30 nm, 적어도 약 40 nm, 적어도 약 50 nm, 적어도 약 60 nm, 적어도 약 70 nm, 적어도 약 80 nm, 적어도 약 90 nm, 적어도 약 100 nm, 적어도 약 150 nm, 적어도 약 200 nm, 적어도 약 250 nm, 또는 적어도 약 300 nm이다. 또 다른 양태에서, 이러한 거리는 약 1000 nm 이하, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 200 nm 이하, 150 nm 이하, 또는 100 nm 이하이다.

보다 다른 양태에서, 포어들 사이의 거리는 약 20 nm 내지 약 800 nm, 약 30 nm 내지 약 700 nm, 약 40 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 300 nm이다.

2개의 포어들은, 이들 포어가 챔버들 사이에서 유체 소통을 허용하고 이들 사이에 예정된 크기 및 거리를 갖는 한 임의의 위치에 구성될 수 있다. 일 양태에서, 포어는, 이들 포어 사이에 직접적인 차단이 존재하지 않도록 놓인다. 또한 일 양태에서, 포어들은 실질적으로 동축(coaxial)이다.

일 양태에서, 장치는 하나 이상의 전원 장치에 연결된 챔버 내에 전극을 가진다. 일부 양태에서, 전원 장치는 전압-클램프 또는 패치-클램프를 포함하며, 이들 클램프는 각각의 포어를 가로질러 전압을 공급하고 각각의 포어를 통한 전류를 독립적으로 측정할 수 있다. 이러한 측면에서, 전원 장치 및 전극 배치는 중간 챔버를 2개의 전원 장치들 모두에 대한 보편적인 그라운드로 설정할 수 있다. 일 양태에서, 전원 장치 또는 장치들은 상부 챔버(챔버 A)와 중간 챔버(챔버 B) 사이에 제1 전압 V₁, 및 중간 챔버와 하부 챔버(챔버 C) 사이에 제2 전압 V₂를 인가하도록 구성된다.

일부 양태에서, 제1 전압 V₁ 및 제2 전압 V₂는 독립적으로 조정 가능하다. 일 양태에서, 중간 챔버는 2개의 전압들과 비교하여 그라운드인 것으로 조정된다. 일 양태에서, 중간 챔버는 이러한 중간 챔버 내에서 각각의 포어와 전극 사이에 전도도를 제공하기 위한 매질을 포함한다. 일 양태에서, 중간 챔버는 이러한 중간 챔버 내에서 각각의 포어와 전극 사이에 저항을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 이러한 저항을 나노포어 저항과 비교하여 충분히 작게 유지하는 것은, 포어를 가로질러 2개의 전압 및 전류를 디커플링하는 데 유용하고, 이는 전압의 독립적인 조정에 유용하다.

전압의 조정은 챔버 내에서 하전된 입자의 이동을 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 전압이 모두 동일한 극성에서 설정되는 경우, 적절하게 하전된 입자가 상부 챔버로부터 중간 챔버로, 다시 하부 챔버로, 또는 그 반대의 순서로 순차적으로 이동될 수 있다. 일부 양태에서, 2개의 전압이 반대 극성으로 설정되는 경우, 하전된 입자가 상부 챔버 또는 하부 챔버로부터 중간 챔버로 이동되고, 그 곳에서 유지될 수 있다.

장치 내에서 전압의 조정은 특히, 큰 분자, 예컨대 하전된 중합체 스캐폴드, 즉 2개의 포어들을 동시에 가로지르기에 충분힌 긴 분자의 이동을 조절하는 데 유용할 수 있다. 이러한 양태에서, 분자의 이동 방향 및 속도는 하기에 기재되는 바와 같은 전압의 상대 크기 및 극성에 의해 조절될 수 있다.

장치는 액체 시료, 특히 생물학적 시료를 보유하는 데 적합한 물질, 및/또는 나노제조(nanofabrication)에 적합한 물질을 함유할 수 있다. 일 양태에서, 이러한 물질은 유전 물질, 예컨대 비제한적으로 실리콘, 실리콘 니트라이드, 실리콘 디옥사이드, 그래핀, 탄소 나노튜브, TiO₂, HfO₂, Al₂O₃ 또는 다른 금속층, 또는 이들 물질의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 예를 들어 약 0.3 nm 두께의 그래핀 막의 단일 시트는 포어-함유 막으로서 사용될 수 있다.

미세유체이고 2-포어 미세유체 칩 실행을 하우징하는(house) 장치는 여러 가지 수단 및 방법에 의해 제조될 수 있다. 2개의 평행한 막들로 구성된 미세유체 칩의 경우, 2개의 막들은 둘 다 단일 빔에 의해 동시에 드릴링되어서 2개의 동심(concentric) 포어를 형성할 수 있긴 하지만, 막의 각각의 면 상에 상이한 빔을 사용하는 것은 또한 임의의 적합한 정렬 기술과 협력하여 가능하다. 일반적으로, 하우징(housing)은 챔버 A-C의 밀봉 분리를 보장한다.

일 양태에서, 장치는 스페이서에 의해 연결된 2개의 평행한 막들로 구성된 미세유체 칩("이중-포어 칩"으로 표지됨)을 포함한다. 각각의 막은 이러한 막의 중심을 통해 단일 빔에 의해 드릴링된 포어를 함유한다. 나아가, 장치는 바람직하게는, 칩을 위한 Teflon® 하우징 또는 폴리카르보네이트 하우징을 가진다. 하우징은 챔버 A-C의 밀봉 분리를 보장하고, 각각의 전압이 원칙적으로 각각의 포어를 가로질러 인가되는 것을 보장하기 위해 전극에게 최소 접근 저항(minimal access resistance)을 제공한다.

보다 구체적으로, 포어-함유 막은 5 nm 내지 100 nm 두께의 실리콘, 실리콘 니트라이드 또는 실리콘 디옥사이드 윈도우를 이용하여 투과 전자 현미경(TEM) 그리드를 이용하여 제조될 수 있다. 스페이서는 절연재(insulator), 예컨대 SU-8, 포토레지스트, PECVD 옥사이드, ALD 옥사이드, ALD 알루미나 또는 증발된 금속 물질, 예컨대 Ag, Au 또는 Pt를 사용하고 막들 사이에서 챔버 B의 수성 부분 내에 소량의 부피를 점유시켜, 막들을 분리하는 데 사용될 수 있다. 홀더는 챔버 B의 가장 큰 부피 분율로 구성된 수성 배쓰(bath) 내에 위치한다. 챔버 A 및 챔버 C는 막 밀봉을 초래하는 더 큰 직경 채널(낮은 접근 저항의 경우)에 의해 접근 가능하다.

초점을 맞춘 전자 또는 이온 빔은 천연적으로 이들을 정렬하여 막을 통해 포어를 드릴링하는 데 사용될 수 있다. 포어는 또한, 올바른 빔을 각각의 층에 초점을 맞춰 적용함으로써 더 작은 크기로 절단(축소)될 수 있다. 임의의 단일 나노포어 드릴링 방법은 또한, 2개의 막들 내에서 포어 쌍을 드릴링하는 데 사용될 수 있으며, 이때, 주어진 방법 및 막의 두께에 가능한 드릴 깊이를 고려한다. 마이크로-포어를 예정된 깊이까지 프리드릴링하고 그런 다음 나노포어를 막의 나머지를 통해 프리드릴링하는 것은 또한, 막 두께를 더 개량하는 것이 가능하다.

장치의 포어에 존재하는 전압으로 인해, 하전된 분자는 챔버들 사이에서 포어를 통해 이동될 수 있다. 이동 속도 및 방향은 전압의 크기 및 극성에 의해 조절될 수 있다. 나아가, 2개의 전압들이 각각 독립적으로 조정될 수 있기 때문에, 하전된 분자의 이동 방향 및 속도는 각각의 챔버 내에서 미세하게 조절될 수 있다.

일례는, 2개의 포어들의 깊이 + 2개의 포어들 사이의 거리를 포함하는 조합된 거리보다 더 긴 길이를 갖는 표적 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 예를 들어, 1000 by dsDNA의 길이는 약 340 nm이고, 20 nm에 의해 분리된 2개의 10 nm-깊이 포어들에 의해 스패닝되는 40 nm보다 실질적으로 더 길 것이다. 제1 단계에서, 폴리뉴클레오타이드는 상부 챔버 또는 하부 챔버 내로 로딩된다. pH 약 7.4의 생리학적 조건 하에서 이의 음전하로 인해, 폴리뉴클레오타이드는 전압이 인가되는 포어를 가로질러 이동될 수 있다. 따라서, 제2 단계에서, 동일한 극성 및 동일하거나 유사한 크기에서 2개의 전압들이 포어에 인가되어, 폴리뉴클레오타이드를 2개의 포어들에 걸쳐 순차적으로 이동시킨다.

폴리뉴클레오타이드가 제2 포어에 도달할 때즈음, 1개 또는 2개의 전압이 변할 수 있다. 2개의 포어들 사이의 거리가 폴리뉴클레오타이드의 길이보다 짧도록 선택되기 때문에, 폴리뉴클레오타이드가 제2 포어에 도달할 때, 이는 또한 제1 포어 내에 존재한다. 따라서, 제1 포어에서 전압의 극성의 즉각적인 변화는 폴리뉴클레오타이드를 제2 포어로부터 멀리 당기는 힘을 발생시킬 것이다.

2개의 포어들이 동일한 전압-힘 영향 및 ｜V ₁ ｜=｜V ₂ ｜+δV을 가진다고 가정할 경우, 값 δV > 0(또는 < 0)이 ｜V ₁ ｜(또는 V ₂ ) 방향에서 조정 가능한 이동을 위해 조정될 수 있다. 사실상, 각각의 포어에서 전압-유도 힘이 V ₁ = V ₂ 와 일치하지 않을 것이라도, 교정 실험은 주어진 2-포어 칩에 대해 동일한 견인력을 초래할 적절한 바이어스 전압(bias voltage)을 식별할 수 있고; 그런 다음, 해당 바이어스 전압 부근으로 변화가 방향 조절(directional control)에 사용될 수 있다.

이때, 제1 포어에서 전압-유도 힘의 크기가 제2 포어에서 전압-유도 힘의 크기보다 작은 경우, 폴리뉴클레오타이드는 2개의 포어들을 가로질러 제2 포어 쪽으로 그렇지만 낮은 속도로 계속 향할 것이다. 이러한 측면에서, 폴리뉴클레오타이드의 이동 속도 및 방향은 2개의 전압 모두의 극성 및 크기에 의해 조절될 수 있음이 쉽게 이해된다. 하기에 더 기재될 바와 같이, 이동의 이러한 미세한 조절은 광범위한 적용을 가진다. 표적 폴리뉴클레오타이드를 정량화하기 위해, 2-포어 장치 실행의 이용성은, 조절된 전달 및 감지 동안 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 페이로드-결합된 표적 폴리뉴클레오타이드가 반복적으로 측정될 수 있어서 검출 결과에 신뢰성을 부가한다는 것이다.

이에 일 양태에서, 나노포어 장치를 통한 하전된 중합체 스캐폴드의 이동을 조절하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 상기 실시형태들 중 임의의 실시형태의 장치의 상부 챔버, 중간 챔버 또는 하부 챔버 중 하나에 표적 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 앰플리콘)를 포함하는 시료를 로딩하는 단계로서, 여기서, 장치는 상부 챔버와 중간 챔버 사이에 제1 전압 및 중간 챔버와 하부 챔버 사이에 제2 전압을 제공하기 위한 하나 이상의 전원 장치에 연결되는 단계; (b) 표적 폴리뉴클레오타이드가 챔버들 사이에서 이동하도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정함으로써, 중합체 스캐폴드를 제1 포어 및 제2 포어 둘 다를 가로질러 위치시키는 단계; 및 (c) 제1 전압 및 제2 전압이 하전된 표적 폴리뉴클레오타이드를 중간 챔버로부터 멀리 견인시키기 위한 힘을 발생시키도록 2개의 전압을 조정하는 단계(전압-경쟁 모드)로서, 여기서, 2개의 전압들의 크기가 상이하여, 조절된 조건 하에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 스캐폴드가 어느 방향으로나 조절된 방식으로 2개의 포어들을 가로질러 이동하는 단계를 포함한다.

일 양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 시료는 상부 챔버 내에 로딩되고, 초기 제1 전압은 표적 폴리뉴클레오타이드를 상부 챔버로부터 중간 챔버로 견인하도록 설정되고, 초기 제2 전압은 표적 폴리뉴클레오타이드를 중간 챔버로부터 하부 챔버로 견인하도록 설정된다. 마찬가지로, 시료가 초기에 하부 챔버 내에 로딩될 수 있고, 표적 폴리뉴클레오타이드가 중간 챔버 및 상부 챔버로 견인될 수 있다.

또 다른 양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 시료는 중간 챔버 내에 로딩되고; 초기 제1 전압은 하전된 중합체 스캐폴드를 중간 챔버로부터 상부 챔버로 견인하도록 설정되고, 초기 제2 전압은 표적 폴리뉴클레오타이드를 중간 챔버로부터 하부 챔버로 견인하도록 설정된다.

일 양태에서, 단계 (c)에서 제1 전압 및 제2 전압에 대한 실시간 또는 온라인 조정은 전용 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하여 수백 메가헤르츠 이하의 클록 속도(clock rate)에서 능동 조절 또는 피드백 조절에 의해 수행된다. 제1 전압, 제2 전압 또는 두 전압 모두의 자동화된 조절은 제1, 제2 또는 둘 다의 이온 전류 측정의 피드백을 기반으로 한다.

센서

상기 고찰된 바와 같이, 다양한 양태에서, 나노포어 장치는 표적 폴리뉴클레오타이드의 검출을 수행하기 위해 하나 이상의 센서를 추가로 포함한다.

장치에 사용되는 센서는 페이로드 분자에 결합되거나 결합되지 않은 표적 폴리뉴클레오타이드 앰플리콘을 식별하는 데 적합한 임의의 센서일 수 있다. 예를 들어, 센서는 중합체와 연관된 전류, 전압, pH 값, 광학적 특징 또는 체류 시간을 측정함으로써 표적 폴리뉴클레오타이드를 식별하기 위해 구성될 수 있다. 다른 양태에서, 센서는 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 개별 구성성분 또는 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합되거나 부착된 하나 이상의 구성성분을 식별하기 위해 구성될 수 있다. 센서는 측정 가능한 파라미터에서의 변화를 검출하도록 구성된 임의의 구성성분으로 형성될 수 있으며, 여기서 이러한 변화는 표적 폴리뉴클레오타이드, 표적 폴리뉴클레오타이드의 구성성분, 또는 바람직하게는 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합되거나 부착된 구성성분을 가리킨다. 일 양태에서, 센서는, 분자 또는 다른 엔터티, 특히 표적 폴리뉴클레오타이드가 포어를 통해 이동할 때 이러한 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정하기 위해 포어의 2개의 면에 위치된 한 쌍의 전극을 포함한다. 소정의 양태에서, 포어를 가로지르는 이온 전류는, 이러한 포어를 통과하는 표적 폴리뉴클레오타이드 절편이 페이로드 분자에 결합된 경우 측정 가능하게 변화한다. 이러한 전류 변화는 예를 들어 존재하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 존재, 부재 및/또는 크기에 상응하는 예측 가능하며 측정 가능한 방식으로 다양할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 센서는, 전압을 인가하고 나노포어를 가로지르는 전류를 측정하는 데 사용되는 전극을 포함한다. 나노포어를 통한 분자의 전위는 전기적 임피던스(electrical impedance)(Z)를 제공하며, 이는 옴의 법칙, V= IZ에 따라 나노포어를 통한 전류에 영향을 미치고, 여기서, V는 인가된 전압이며, I는 나노포어를 통한 전류이고, Z는 임피던스이다. 역으로, 전도도 G = I/Z는 나노포어 이벤트를 신호화하고 정량화하기 위해 모니터링된다. 분자가 전기장에서(예를 들어 인가된 전압 하에) 나노포어를 통해 전위할 때의 결과는, 전류 신호의 추가 분석 시 나노포어를 통과하는 분자와 상관관계가 있을 수 있는 전류 신호이다.

전류 신호로부터의 체류 시간 측정이 사용되는 경우, 구성성분의 크기는, 감지 장치를 통과하는 데 소요되는 시간의 길이를 기반으로 특정한 구성성분과 상관관계가 있을 수 있다.

일 실시형태에서, 센서는 중합체, 중합체의 구성성분(또는 단위), 또는 중합체에 결합되거나 부착된 구성성분의 광학적 특징을 측정하는 나노포어 장치에 제공된다. 이러한 측정의 일례는 적외선(또는 자외선) 분광법에 의해 특정 단위에 독특한 흡수 밴드의 식별을 포함한다.

일부 실시형태에서, 센서는 전기 센서이다. 일부 실시형태에서, 센서는 형광 신호을 검출한다. 포어의 유출구에서 방사선원은 해당 신호을 검출하는 데 사용될 수 있다.

등가물 및 범위

당업자는, 일상적인 정도의 실험을 사용하여, 본원에 기재된 본 발명에 따른 특정한 실시형태에 대한 많은 등가물들을 인지하거나 확신할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명으로 제한되지 않고자 하며, 그보다는 첨부된 청구항에 나타난 바와 같다.

청구항에서, 관사, 예컨대 "a," "an," 및 "the"는, 문맥으로부터 반대로 또는 다르게 명백하게 가리켜지지 않는 한, 1개 또는 1개 초과를 의미한다. 그룹의 하나 이상의 멤버들 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 상세한 설명은, 문맥으로부터 반대로 또는 다르게 명백하게 가리켜지지 않는 한, 그룹 멤버들 중 1개, 또는 1개 초과 또는 모두가 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나, 이용되거나 그렇지 않으면 관련이 있는 경우 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은, 그룹 중 정확하게 1개의 멤버가 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나 이용되거나 그렇지 않으면 관련이 있는 실시형태를 포함한다. 본 발명은, 그룹 중 1개 초과 또는 모든 멤버들이 주어진 생성물 또는 과정에 존재하거나 이용되거나 그렇지 않으면 관련이 있는 실시형태를 포함한다.

또한, 용어 "포함하는"은 개방적인 것으로 의도되고 허용하지만 추가의 요소 또는 단계의 포함을 필요로 하지 않는 것이 주지된다. 용어 "포함하는"이 본원에 사용되는 경우, 따라서 용어 "~로 구성된"이 또한 포함되고 개시된다.

범위가 주어지는 경우, 종점이 포함된다. 더욱이, 문맥 및 당업자의 이해로부터 다르게 가리켜지거나 그렇지 않으면 명백하지 않는 한, 범위로서 표현된 값들은 문맥상 명백하게 다르게 가리키지 않는 한 본 발명의 상이한 실시형태들에서 언급된 범위 내의 임의의 특정한 값 또는 하위범위를 이러한 범위의 하한의 단위의 1/10까지 취할 수 있는 것으로 이해된다.

모든 인용된 공급원, 예를 들어 참조, 공개, 데이터베이스, 데이터베이스 엔트리 및 본원에 인용된 기술은, 인용에서 표현적으로 언급되지 않더라도, 참조로서 본 출원에 포함된다. 인용된 공급원 및 본 출원의 언급들이 상충하는 경우, 본 출원의 언급이 좌우해야 한다.

섹션 및 표 머릿말은 제한하려는 것이 아니다.

실시예

본 발명을 수행하기 위한 특정한 실시형태들의 실시예가 하기에 존재한다. 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공될 뿐이고, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다. 사용되는 숫자(예를 들어 양, 온도 등)에 대해 정확도를 보장하려고 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차는 당연하게도 허용되어야 한다.

본 발명의 실시는 다르게 지시되지 않는 한, 당업계의 종래의 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약학 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington′s Ph-armaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)]를 참조한다.

실시예 1 - 표적 및 참조에 대한 상이한 길이의 dsDNA를 사용하는 Q-테스트 기반 FA

이러한 실시예는, 유전자이식(transgenic)(GMO) 표적 서열이 788 bp 표적 dsDNA(즉, 표적 분석물) 내에 존재하고 참조 서열(렉틴 하우스키핑 유전자)이 466 bp 참조 dsDNA(즉, 참조 분석물) 내에 존재하는 데이터에 분포 분율(FA) 프레임워크를 적용한 결과를 제시한다. 시료 내 이식유전자 표적의 부분량의 정량화는 하기에서, 우선 이벤트 면적을 기반으로 단일 특징 기준을 이용하는 Q-테스트 방법을 적용하고 방정식 (1) 및 (2)를 사용하고, 둘째로 SVM 방법을 적용하고 방정식 (3) 및 (4)를 사용함으로써 달성된다.

466 bp 참조 DNA 및 788 bp 표적 이식유전자 DNA 단편들을, 서열 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 종래의 게놈 DNA 시료와 이식유전자-함유 게놈 DNA 시료의 혼합물로부터 PCR에 의해 발생시켰다. PCR 생성물을 표준 실리카 막 컬럼을 사용하여 정제하고 농축시켰다. 2개의 앰플리콘들의 정밀한 분율 혼합물을 큰 부피의 개별적으로 발생된 앰플리콘으로부터 제조하고, 분율 혼합물 및 단일 앰플리콘의 분취물들을 모든 검정법에 대한 표준 참조 물질로서 사용하였다.

우선, 466 bp 참조 DNA를 함유하는 참조 대조군 시료를 나노포어 장치에서 측정하였다. 다음, 788 bp 이식유전자 DNA를 함유하는 표적 대조군 시료를 나노포어 장치에서 측정하였다. 표적 분석물(788 bp)과 참조 분석물(466 bp) 사이의 길이 차이는, 이벤트 신호의 면적을 기반으로 구별될 수 있는 나노포어를 통한 전위 시 독특한 이벤트 신호를 발생시킨다.

도 4a는 2개의 단리된 대조군 진행들(runs)에 대한 모든 이벤트 면적 히스토그램들을 보여주며, 하나는 466 bp 참조 DNA에 대한 것이고 다른 하나는 788 bp 표적 유전자이식 DNA에 대한 것이다. 또한, 3:10 표적:참조 대조군 혼합물로부터의 면적 히스토그램이 나타나 있다. 도 4b는 대조군 혼합물(Q _표적 , Q _참조 ) 및 공지된 혼합물(Q _혼합 ) 트렌드를 면적 기준 역치 q의 함수로서 보여주며, Q _혼합 = Q _3:10 이다. 도 4c는, 부분량 파라미터 ρ(q)가 q 값에서 어떻게 그래프적으로 나타나는지 보여준다. q = 5 pA*ms 역치(수직 파선)는 0.05의 위양성(즉, Q _참조 = 0.05) 및 0.1의 위음성(즉, Q _표적 = 0.9)에 상응한다.

R ^* _혼합 을 예측된 GMO(%)로서 발생시키기 위한 방정식 (2)의 적용은, 공지된 혼합물에 대한 분포 분율의 추정치를 발생시키기 위해 참조 단독 대조군 및 표적 단독 대조군을 사용하는 방법의 정확도 및 정밀도를 시험하기 위해, 대조군 혼합물을 사용하는 것이 본원에 수행된다. 방정식 (2)를 우선, 공지된 혼합물에 적용하였다. Q _X:Y )를 발생시키는 데에 어떠한 대조군 혼합 시료도 사용하지 않았기 때문에, 모델을 입증하기 위해 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이(즉, α = 1로 설정함)에 대한 보상을 사용하지 않으면서 추정치를 발생시켰다. 도 5a는 예측된 GMO(%)(R ^* _혼합 ) 대 참 GMO(%)의 플롯을 보여주고, 비교를 위해 제로-오차 라인(기울기 = 1)보다 높고 낮은 10% 오차 경계(error margins)가 있다. 이들 결과를, 100% 표적 및 100% 참조(단리된) 대조군들, 및 후속해서 5개의 공지된 혼합물들을 단일 나노포어 상에서 순차적으로 진행시킴으로써 구축하였다. 표 1은 도 5a에 플롯화된 예측된 값 및 오차 막대, 및 각각의 혼합물에 대해 검출된 이벤트의 총 수를 기록한다.

표 1. 도 5a 데이터에 대한 GMO 예측 결과

참 GMO %	에측된 GMO %	백분율 오차 (예측. - 참)	총 이벤트
10 %	12.0 ± 1.07 %	2.0 ± 1.0 %	5,225
15%	16.3 ± 1.1 %	1.3 ± 1.1 %	4,267
20%	20.8 ± 1.1 %	0.75 ±1.1%	6,605
25%	29.3 ± 1.2 %	4.3 ± 1.2 %	6,647
30%	34.5 ± 1.4 %	4.4 ± 1.4 %	5,605

유사한 프로토콜(2개의 단리된 대조군들 및 6개의 공지된 혼합물들)에 따른 별개의 나노포어 실험과 생성된 결과는 도 5b 및 표 2에 나타난다.

표 2. 도 5b 데이터에 대한 GMO 예측 결과

참 GMO %	예측된 GMO %	백분율 오차 (예측. - 참)	총 이벤트
5%	2.87 ± 0.7 %	-2.1 ± 0.7 %	4,783
10 %	11.1 ± 0.93 %	1.1 ± 0.9 %	4,884
15%	16 ± 1.1 %	1.0 ± 1.1%	4,326
20%	20.4 ± 1.1 %	0.35 ± 1.1 %	5,895
25%	27.1 ± 1.2 %	2.1 ± 1.2 %	6,587
33.33%	36.2 ± 1.3%	2.8 ± 1.3 %	7,862

도 5a 및 도 5b 및 표 1 및 표 2로부터의 결과들은, 5% 이내에서의 GMO% 예측 정확도가 단일 나노포어를 사용하여 2개의 DNA 길이들을 구분하는 데 가능함을 제시한다. 이들 결과는 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이에 대한 보상을 사용하지 않으면서 달성되었다(방정식 (2)에서 α = 1로 설정함). 포착률 상수 차이에 대한 보상은 결과를 더 개선하는 것으로 예상된다.

단일 값 대신에 q-역치 범위가 이용되는 경우의 일례는 도 6에 나타나 있다. 구체적으로, q-역치 범위는 Q _참조 의 75 백분위수 내지 99 백분위수를 스패닝(span)하도록 선택되었다. 결과적인 R ^* _혼합 (q) 트렌드를 q 범위에 걸쳐 플롯화하였으며, 공지된 15% GMO와 비교하여 평균값 {R ^* _혼합 (q)} = 12.7%이었다. 이는, 심지어 역치가 최적화되지 않은 경우에도 본원에 제공된 분석 프레임워크가 역치 범위에 걸쳐 위양성 오차 및 위음성 오차를 보상하여, 시료 내 표적 분석물의 상대 존재비의 개선된 추정치를 제공할 수 있음을 보여준다.

집단 내에서 표적 서열의 존재비를 정량화하기 위해 이러한 실시예에서 언급된 작업 흐름은 임의의 증폭, 정제, 농축 또는 완충제(buffer) 교환 단계를 필요로 하지 않았다. 이러한 작업 흐름은 저렴하며 폐기 가능한 시료 프렙 카트리지(prep cartridge)와 상용성이어서, 초소형(핸드헬드 또는 데스크탑) 유닛 내에서 시료-인 앤서-아웃(sample-in answer-out) 작업 흐름을 허용한다.

또 다른 실험 세트에서, 다양한 GMO% 시료들을 미공지로서 시험하였다. 각각의 나노포어 상에서의 프로토콜은 하기와 같았다: a) 100% 466 bp 참조를 5분 동안, 그런 다음 플러쉬(flush)하는 단계; b) 100% 788 bp 표적을 5분 동안, 그런 다음 플러쉬하는 단계; c) 1개 내지 4개의 미공지를 진행(run)시키는 단계로서, 각각을 5분 동안 진행시키고, 진행 사이에 플러쉬하는 단계; d) 대조군 혼합물을 진행시키는 단계. 면적 기준을 사용하였고, Q _참조 의 75 백분위수 내지 99 백분위수를 스패닝하는 q-역치 범위를 실행하였으며, 평균 R ^* _혼합 (q)을 예측된 GMO%로서 기록하였다. 방정식 (2)에서, 대조군 혼합물을 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이에 대한 보상에 사용하였다. 실험은 1:1, 0.75:1 또는 0.35:1의 표적:참조 대조군 혼합물을 사용하였다.

표 3은 보상을 위해 0.35:1(35% GMO)의 대조군 혼합물을 사용하여 4개의 "미공지" 혼합된 시료(S1 내지 S4)에 대한 하나의 나노포어 검정법으로부터의 예측 결과를 기록한 것이다. 미공지는 각각의 나노포어 검정법에서 맹검되었으며, 따라서, 백분율 오차는 표에 기록되어 있지 않다. 표는 또한, 각각 5분의 기간 내에 기록된 이벤트의 총 수를 기록한다.

표 3. 맹검 시료 S1 내지 S4에 대한 GMO 예측 결과

참 GMO %	예측된 GMO %	총 이벤트
* 35 %	35.1 ± 3.0%	1,175
Sample S1	32.0 ± 2.2 %	2,039
Sample S2	10.2 ± 1.4 %	1,767
Sample S3	20.9 ± 2.4 %	1,031
Sample S4	6.2 ± 1.4 %	1,125

총 12개의 나노포어 실험을 상기 언급된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 각각의 혼합된 시료를 2회 내지 5회 시험하였고, 항상 상이한 나노포어들 상에서, 상이한 실험자들에 의해 또는 상이한 날짜에 시험하였다. 나노포어 크기 범위는 25 nm 내지 35 nm 직경이었다. 총 11개의 혼합된 시료들(S1 내지 S11)을 검정하였다. 표 4는 조합된 추정치를 기록한 것이며, 가장 작은 예측된 GMO% 값으로부터 가장 큰 예측된 GMO% 값까지 순서대로 기록되어 있다. 기록된 평균 GMO% 값은, 단일-나노포어 예측들을 평균내어 계산한 것이다. 각각의 평균 추정치의 불확실성은 개별 추정치 분포의 반복된 무작위 시료화(sampling)로부터 계산된다(몬테 카를로 방법). 수치적으로 발생된 95-백분위수 신뢰 구간이 기록되어 있다. 각각의 시료를 시험한 횟수 및 각각의 시료에 대한 참 GMO%가 또한 기록되어 있다.

표 4. 시료 S1 내지 S11에 대한 조합된 GMO% 예측(평균 ± 2 시그마))

[표 4]

표 4의 결과는, 본 발명자들의 방법이 표적 분석물의 분포 분율(예를 들어 GMO%)을 높은 정확도로 예측할 수 있음을 보여준다. 범위 10-90% GMO 내에서, 정확도는 단일-나노포어 추정치들을 조합함으로써 2% 이내이다. 5-10%와 100% GMO 사이에서, 예측 오차가 포화 한계에 접근함으로써 증가할 것으로 예측될 수 있을 경우, 2개의 나노포어 추정치들을 조합하면 5% 미만의 오차를 초래하였다. 일반적으로, 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이에 대한 보상의 사용은 포착률 상수 차이에 대한 보상이 없는 경우(표 1 내지 2)와 비교하여 정확도를 개선한다. 전체 GMO% 예측 범위에 대해, 더 많은 나노포어 추정치들은 정확도 및 정밀도를 더 크게 개선할 것이다. 보편적인 툴로부터 각각 측정하는 어레이된 나노포어들이 또한, 본 연구의 일부로서 존재한 사람-대-사람 및 일-대-일(day-to-day), 및 시약 세트-대-세트 변이들을 제거함으로써 불확실성을 더 감소시킬 수 있다.

실시예 2 - 표적 및 참조에 대한 상이한 길이의 dsDNA를 사용하는 SVM-기반 FA

실시예 1에 기록되고 분석된 것과 동일한 나노포어 데이터를, 이전에 제시된 SVM 방법을 사용하여 본원에서 재분석하였다(방정식 (3) 내지 (4)).

단리된 대조군 세트를 우선, 초기 특징 선별에 사용하였다. 초기 선별은, 소정의 분류화 방법에 다중공선성(multicollinearity) 문제를 유발할 수 있는 고도로 상관관계가 있는 특징들을 제거하는 것을 목적으로 한다. 7개의 식별된 특징들은 하기와 같았다: (i) 이벤트 기간의 log₁₀(드웰(dwell)), 또는 단순히 "드웰", 밑-10 로그; (ii) maxAmp: 최대 δG; (iii) sdAmpSub: 상승 및 하강 시간을 제거하는, 이벤트 신호의 표준 편차; (iv) medAmp: 중앙값 δG; (v) LFN평균: 50 Hz 미만의 이벤트의 노이즈 파워의 평균; (vi) LFN중앙값: 50 Hz 미만의 이벤트의 노이즈 파워의 중앙값; (vii) 면적: 실시예 1에 사용된 것과 동일한 이벤트 면적.

추가의 특징 추출을 수행하여, 데이터 차원(data dimension)을 제거하였다. 이 단계의 목적은, 계산 시간 및 분류화 정확도의 균형을 이루는 것이다. 2개의 알고리즘들을 실행하였다: 1) 단변량 특징 선별 방법. ANOVA F-값을 이벤트의 각각의 특징과 표지 사이에서 계산하였다. 역치를, 최고 F 점수를 가진 특징들의 일부를 선별하기 위해 수동으로 설정하였다. 2) 재귀 특징 제거법(RFE; recursive feature elimination). 추정자(estimator)(예컨대 SVM)는 초기 특징 세트 상에서 트레이닝되고, 각각의 특징의 중요성이 수득된다. 가장 덜 중요한 특징은 현재의 특징들 세트로부터 배제될 것이다. 이러한 절차는 요망되는 수의 특징 세트가 도달할 때까지 재귀적으로 반복된다.

실시예 1 데이터의 경우, 단변량 특징 선별 방법을 이용하였다. 특징의 백분율의 역치를 60%까지 수동으로 설정하였다. 알고리즘에 의해 선택된 4개의 최적 특징들은 하기와 같았다: (i) 드웰, (ii) sdAmpSub, (iii), medAmp, (iv) 면적.

이러한 방법에서 다음 단계는 모델 트레이닝 및 시험이다. 단리된 대조군에서 수합적으로 모든 이벤트들을 7:3 분할을 사용하여 트레이닝 데이터세트 및 시험 데이터세트로 무작위로 소팅하였다(sorted). SVM을, 분류화를 수행하기 위한 최적 파라미터를 찾기 위해 하이퍼-파라미터 검색 알고리즘과 함께 트레이닝 데이터세트를 기반으로 트레이닝하였다. 그리도 알고리즘에서 시험된 하이퍼-파라미터는 하기와 같다: 커넬 유형(선형, rbf), 조직화 파라미터(C) 및 커넬 계수(감마). ROC 곡선의 곡선 아래 면적(roc_auc)을 사용하여, 각각의 하이퍼-파라미터 조합의 성능을 평가하였다. 최고 roc_auc 점수를 갖는 모델을 다운-스트림 데이터 가공에 사용하였다. 최상의 파라미터 조합의 경우, 시험 데이터로부터의 각각의 부류의 평균 정밀도 및 재현(recall)을 계산하였다. 그런 다음, 최적 파라미터를 갖는 모델을, 데이터세트를 트레이닝함으로써 트레이팅하고 시험 데이터세트 상에서 시험하였다. 시험 데이터세트 상에서의 정확도의 예측이 발생되었으며, 도 7에 나타나 있다. 전체 세트에 걸친 정확도는 97.5% 초과였다.

이러한 방법에서 다음 단계는 데이터 교정이었다. 교정은, 단계 3에서 모델을 대조군 혼합물 데이터에 적용함으로써 달성될 수 있으며, 이는 보정비(correction ratio)를 발생시킨다. 그런 다음, 보정비에, 미공지 혼합물에 대한 각각의 예측된 양을 곱한다. 이는 방정식 (1) 및 (2)에서 파라미터 α에 의해 곱하는 것과 동등하다. 파라미터 α에 대한 값은, SVM 방법에서 이러한 모델을 대조군 혼합물에 적용함으로써 발생되며, 반면 (1) 및 (2)는 대조군 데이터세트 Q 값으로부터 α의 직접적인 계산을 수반한다.

표 5는 Q-테스트 방법과 SVM-기반 방법 사이에서 GMO% 예측의 비교를 보여준다.

표 5. 단일 나노포어 GMO% 예측 비교, Q-테스트 대 SVM

[표 5]

시료를 하기와 같이 나누었다: a) SVM 예측이 더 정확하였으며(1,5,6,8,9,16,19,20,21), b) Q-테스트 예측이 더 정확하였고(3,4,7,10,11,12,14,15,17), c) 상기 방법들의 정확도가 동등하였다(2,3,18,22). 이들 22개의 시료들에 대해, 2개의 방법들의 성능이 전반적으로 대체로 동등하였으며, 각각은 9/22개의 경우들에서 다른 것들을 능가하였다.

SVM 방법의 값은, 데이터세트에 적용하도록 자동화될 수 있다는 점이며, 이는 선험적으로 Q-테스트 방법에 대한 필요조건인 적용될 수 있는 유한 기준을 가질 수 없다. 한편, Q-테스트 방법은 계산적으로 더 간단하고, Q-테스트 포맷에서 잘-특징화된 기준을 이용할 수 있는 분포 분율 적용에 바람직한 경향이 있다.

실시예 3 - 독특한 페이로드와 함께 짧은 DNA(74 bp 참조, 94 bp 표적 이식유전자)를 사용하는 Q-테스트 기반 FA

GMO% 예측 적용의 맥락에서, 이러한 실시예는, 2개의 유사한 길이들이 표적 dsDNA 및 참조 dsDNA에 사용될 수 있으며, 여기서 나노포어 이벤트 신호의 구별은 2개의 별개의 서열-특이적 페이로드들을 사용함으로써 달성됨을 보여준다.

방법: 입증된 qPCR 프라이머 세트(GM 식품 및 사료에 대한 유럽 연합 참조 실험실로부터 공개적으로 입수 가능함)를 사용함으로써, 본 발명자들은 종래의 게놈 DNA 시료와 이식유전자-함유 게놈 DNA 시료의 혼합물로부터 94 bp 이식유전자-특이적인 단편 및 74 bp 분류군-특이적인 단편을 둘 다 증폭시켰다. 나노포어 검출 이전에, 이들 앰플리콘을, PEG 중합체 프로브(그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된 국제 공개 WO/2016/187159, "표지된 중합체 스캐폴드를 사용한, 나노포어에서 표적 검출을 위한 방법 및 조성물")에 공유 연결된 서열-특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브와 혼성화시켰다(Data Storage 특허 #5520281-v2-29517, 5/16/2016에 기재된 방법). 구체적으로, 이식유전자-표적화 프로브를 4-arm 40 kDa PEG에 연결하였고, 참조-표적화 프로브를 8-arm 40 kDa PEG에 연결하였다.

모든 이벤트 산점도의 대표적인 예로서, 도 8은 동일한 포어 상에서 단리된 대조군으로서 순차적으로 진행된 2개의 분자 유형들에 대한 이벤트 플롯을 보여준다. 우선, 96 bp DNA/프로브-페이로드 복합체를 함유하는 시료를 제조하고, 나노포어 장치에서 측정하였다. 복합체는 표적 서열을 포함하고 프로브-페이로드에 결합된 단편에 대한 모델이다. 프로브-페이로드는 4-arm PEG 구조를 갖는 PNA-PEG이었다. 다음, 나노포어를 통한 전위 시 독특한 이벤트 신호를 발생시키기 위해 참조 서열을 포함하는 단편을 디자인하였으며, 이를 이용하여 분포 분율 계산을 달성할 수 있을 것이다. 참조 분자는 PNA-PEG가 결합된 74 bp DNA이고, 여기서 PEG는 8-arm 구조를 가진다. 주요점은, 참조/프로브-페이로드 분자가 표적/프로브-페이로드 분자와 구분되는 독특한 이벤트 하위집단을 발생시킨다는 것이고, 이들 분자는 둘 다 임의의 백그라운드 이벤트가 존재하는 경우 이러한 백그라운드 이벤트로부터 구분된다.

각각의 나노포어에 따른 프로토콜은 하기와 같았다: a) 100% 74 bp/페이로드-2 참조를 5분 동안, 그런 다음 플러쉬하는 단계; b) 100% p4 bp/페이로드-1 표적을 5분 동안, 그런 다음 플러쉬하는 단계; c) 1개 내지 4개의 미공지를 진행시키는 단계로서, 각각을 5분 동안 진행시키고, 진행 사이에 플러쉬하는 단계; d) 대조군 혼합물을 진행시키는 단계. 면적 기준을 사용하였고, Q _참조 의 75 백분위수 내지 99 백분위수를 스패닝하는 q-역치 범위를 실행하였으며, 평균 R ^* _혼합 (q)를 예측된 GMO%로서 기록하였다. 방정식 (2)에서, 1:1 대조군 혼합물을 표적 분석물과 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이에 대한 보상에 사용하였다.

나노포어 실험 세트를 상기 언급된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 각각의 혼합된 시료를 2회 내지 4회 시험하였고, 항상 상이한 나노포어들 상에서, 상이한 실험자들에 의해 또는 상이한 날짜에 시험하였다. 나노포어 크기 범위는 25 nm 내지 35 nm 직경이었다. 총 6개의 혼합된 시료들(Sp1-Sp6)을 검정하였다. 표 6은 조합된 추정치를 기록한 것이며, 가장 작은 예측된 GMO% 값으로부터 가장 큰 예측된 GMO% 값까지 순서대로 기록되어 있다. 기록된 평균 GMO% 값은, 단일-나노포어 예측들을 평균내어 계산한 것이다. 각각의 평균 추정치의 불확실성은 계산되고, 95-백분위수 신뢰 구간이 기록된다. 각각의 시료를 시험한 횟수 및 각각의 시료에 대한 참 GMO%가 또한 기록되어 있다.

표 6. 표적/참조를 구분하기 위해 별개의 페이로드를 사용하는 조합된 GMO% 예측

[표 6]

2개의 페이로드들을 이용한 예측 성능은 dsDNA 길이 구별을 사용할 때(실시예 1, 2)만큼은 양호하지 않은 것으로 보인다. 임의의 경우, 정확도는 모든 경우들에서 6%보다 양호하고, 분자 풀을 병행하여 측정하고 결과적인 추정치들을 조합하는 더 많은 나노포어들을 가짐으로써 더 개선될 수 있다.

실시예 4 - 짧은 DNA(89 bp) 및 2개의 독특한 페이로드들을 사용하여, 야생형과 비교하여 KRAS G12D SNP의 FA를 위한 Q-테스트 및 SVM 방법

본 발명자들은 고도로 단편화되고 세포-무함유의 순환하는 DNA로부터 인간 KRAS 유전자의 짧은(58 bp, 70 bp 또는 89 bp) 단편을 증폭시키기 위해 프라이머를 디자인하였다. cfDNA 프라이머 서열은 KRAS G12D SNP 서열(CosmicID 521)의 어느 면 상에나 어닐링되도록 디자인되었다. 앰플리콘을, 혈장으로부터 수득한 세포-무함유의 순환하는 DNA 분획으로부터 발생시키고, 야생형 및 돌연변이체 KRAS 대립유전자들을 둘 다 표적화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브와 혼성화시키고, PEG 중합체 페이로드에 공유 연결하였으며: KRAS wt 대립유전자(c.35G)를 표적화하는 프로브를 40 kDa 8-arm 또는 80 kDa 2-branch PEG 중합체에 연결하였고, G12D(c.35G->A) 대립유전자를 표적화하는 프로브를 40 kDa 3-branch PEG 중합체에 연결하였다.

도 9a는 오버레이된 100% 표적 분석물 대조군 시료(청색 닫힌 원형) 및 100% 참조 분자 대조군 시료(검정색 열린 사각형)에 대한 평균 δG 대 기간의 대표적인 이벤트 플롯을 보여준다. 표적 분석물은 3-branch PEG에 연결된 G12D-결합된 프로브(G12D-3bPEG로 지칭됨)를 갖는 89 bp DNA이었다. 참조 분자는 8-arm PEG에 연결된 야생형(c.35G)-결합된 프로브(WT-8-armPEG로 지칭됨)를 갖는 89bp DNA이었다. 2개의 대조군들을 215 mV(1.0 M LiCl 10 mM tris 1 mM EDTA)에서 35 nm 직경 나노포어를 사용하여 순차적으로 진행시켰다. 시각적으로, 플롯은 표적 이벤트를 태깅하기 위해 3개의 불균등들을 기반으로 한 기준을 제시한다:

기간 ≥ q₁

평균 ∂G ≥ q₂

평균 ∂G ≤ q₃.

역치 q₁ = 1 msec, q₂ = 0.4 nS 및 q₃ = 0.65 nS는 또한 도 9a에 나타낸 표적 태깅 박스(파선)를 생성한다. 언급된 역치와 함께 3개의 불균등의 기준을 사용하여, 단리된 대조군은 Q _참조 = 0.006 및 Q _표적 = 0.795를 생성한다. 등몰 농도의 표적-페이로드 분자 및 참조-페이로드 분자는 Q _1:1 = 0.274를 초래하였으며, 대조군 혼합물로서 사용되었다. 2개의 후속적인 미공지 시료들, A 및 B는 Q _A = 0.066 및 Q _B = 0.041을 등록하였다. 2개의 시료들을 도 9b에 나타낸 이벤트 플롯에서 2개의 단리된 대조군들 상에 오버레이한다. 시각적으로, 시료 A는 시료 B보다 높은 G12D 함량을 보여주지만, 둘 다 100% WT 대조군의 0.6% 위양성 비율과 비교하여 양성이다. 방정식 (1)을 적용하고 보상을 위해 대조군 혼합물을 사용한 후, 야생형에 대한 G12D 돌연변이체의 예측된 분율은 각각 시료 A 및 시료 B에 대해 F ^* _A = 11.1±0.9% 및 F ^* _B = 6.0±0.7%이다.

표 7은 1열 및 2열에서 시료 A 및 시료 B에 대한 결과를 보여준다. 또한, 시험된 모든 환자 시료들에 대한 결과가 나타나 있다. 총 5개의 상이한 환자 시료들을 검정하였다. 시료 C 및 시료 C2를 동일한 환자 시료로부터 부시료화(subsample)하였으며; 마찬가지로, 시료 D, D2 및 E, E2에 대해서도 수행하였다. 동일한 환자 시료로부터 취해진 상이한 부시료들은 고려된 모든 3가지 경우들에서 서로 2% 이내에 존재하였다. 이는, 상이한 사람들에도 불구하고 상이한 나노포어 상에서 각각의 나노포어 실험을 진행하고 2가지 경우에는 상이한 날짜에 진행하는 것이다. 이는, 재현 가능한 작업 흐름 및 정량적 분포 분율 방법을 제시한다.

표 7. Q-테스트 방법을 사용하는 혈액 시료 내 예측된 G12D 돌연변이체 분율

나노포어 ID, 직경	시료 표지	추정된 G12D 분율 %	총 이벤트
NP1, 35 nm	A	11 ± 0.89%	1,494
NP1, 35 nm	B	6.9 ± 0.75	1,508
NP2, 30 nm	C	7 ± 0.9%	1,488
NP3, 33 nm	D	5.9 ± 0.5%	2,503
NP4, 33 nm	C2	5.3 ± 0.9%	1,188
NP5, 38 nm	D2	6.5 ± 1.0%	1,741
NP6, 23 nm	E	30 ± 0.9%	2,455
NP7, 32 nm	E2	28 ± 0.9%	3,299

G12D의 참 양은 이들 시료에 대해 미공지되어 있다. 시료를, 암 치료(화학요법)의 개시 후 몇 주째에 환자로부터 수합하고, 이후, 각각의 환자의 DNA를 시퀀싱하였으며, G12D 돌연변이에 대해 양성인 것으로 확인하였다. 대조군 환자 유래의 비-양성 대조군 시료를 또한 검정하였으며, G12D의 예측된 분율은 2% 이하였고, 이는 총 작업 흐름 위양성이 2%임을 제시한다. 작업 흐름에서 추가의 최적화는 검출 한계를 더 감소시킬 수 있다.

SVM 방법을 비교에 적용하였다. 하나의 대표적인 실험(표 1에서 나노포어 NP4)을 사용하여, 데이터를 SVM 방법을 적용하는 데 기재된 단계들을 사용하여 가공하였다. 중앙값 δG 대 log₁₀(기간) 의 이벤트 산점도는 오버레이된 100% 참조 대조군 및 100% 표적 대조군에 대해 도 10에 나타나 있다. 또한, SVM-식별된 결정 경계선이 플롯화되어 있다. 시료 C2에서 예측된 G12D 분율은 Q-테스트 및 SVM 방법 둘 다에 대해 표 8에 기록되어 있다. 2개의 방법들은 서로 5% 이내에 존재한다.

표 8. 최적화된 역치(q)를 결정하기 위해 Q-테스트 및 SVM을 사용하는 예측된 G12D 분율

[표 8]

실시예 5: 짧은 DNA (89 bp ) 및 2개의 독특한 페이로드들을 사용하여, 야생형과 비교하여 KRAS G12D SNP의 FA에 대한 EMGM

가우시안 혼합에 대한 기댓값 최대화 알고리즘(EMGM)을 대표적인 데이터 세트에 적용하는 것이 기재되어 있다. 표적 및 참조는 실시예 4에 기재된 바와 같이 페이로드-결합된 dsDNA 단편 내의 돌연변이체 KRASG12D SNP 및 야생형 서열이다. 대표적인 작업 흐름에서, 오로지 1:1 대조군 혼합물만 측정하였으며, 오로지 하나의 100% 참조 대조군을 측정하였고, 후속해서 미공지 혼합물을 측정하였다.

단계 1: 50% 표적 및 50% 참조 혼합 시료의 드웰 시간의 log(log(드웰)) 및 중앙값 진폭(medAmp)을 EMGM 알고리즘을 위한 입력 데이터로서 사용하였다(도 11). 표적인 돌연변이체 KRASG12D SNP의 처음에 식별된 예상 영역을, 이러한 검정법에 대한 이전에 구축된 지식을 사용하여 플롯 내에서 직사각형 영역으로 표시한다. 선행 지식은, 개별 실험들에서 유사한 조건(동일한 완충제)에서 100% 표적 대조군을 시험으로써 구축되었다. 박스는 태깅에 사용되지 않는다. 그보다는, EMGM을 대조군 혼합물에 적용한 후, 박스 내의 가우시안 혼합과 연관된 임의의 이벤트를 표적 이벤트로서 태깅한다.

단계 2: 집단을 기반으로, 3-가우시안 혼합 모델을 사용하여, 모델을 트레이닝하였다. 이러한 모델은 하나의 클러스터(다이아몬드) 내에서 돌연변이체(표적) 영역을 예측하였다. 다른 2개의 클러스터들(별모양 및 정사각형)은 야생형에 상응한다(도 12). 본 발명자들은, 초기 표적 도메인 박스(도 11) 내의 일부 이벤트들이 EMGM 알고리즘에 의한 참조 모드와 연관이 있음을 관찰한다. 이는 Q-테스트 방법과는 상이하며, 여기서 박스 그 자체는 표적 대 참조로서 태깅된 이벤트 집단을 정의한다.

단계 3: 모델을 100% 야생형 (참조) 시료 상에 적용하였다. 이벤트들의 총 수에 대한 돌연변이체(표적) 영역 내의 이벤트들의 수의 비율은 위양성 분율을 구축하며(도 13), 이는 분포 분율 추정치를 개선하는 데 사용될 수 있다.

단계 4: 모델을 미공지 혼합물을 예측하는 데 사용하였다. 이벤트들의 총 수에 대한 돌연변이체 영역 내의 이벤트들의 수의 비율을 미공지 혼합물 내 돌연변이체 분자의 백분율의 예측자(predictor)로서 사용하였다(도 14).

위양성 보상에 의한 성능 증강 시험으로서, 보정을 위해 단계 3의 위양성 분율을 단계 4에서 계산된 분율에서 차감하였다. 나노포어 실험 세트 내에서 다수의 혼합물들에 EMGM을 적용한 결과는 표 9에 기록되어 있다. 혼합물은 EMGM 결과가 어셈블리될 때까지 맹검이었고, 그런 다음 결과는 참 G12D 분포 분율 값과 비교되었다.

표 9. 위양성(FP) 보상이 없고 보상이 있는 경우 EMGM을 비교하는 예측된 G12D 분율

[표 9]

NP-a의 경우, 성능은 위양성 보상을 사용함으로써 20% 경우에서만 증강되었다. NP-b의 경우, 성능은 모든 경우들에서 증강되었다. 위양성 보상을 NP-c에 대해서는 시험하지 않았지만, 성능은 이미 양호하였고, 특히 50% 및 20% 추정치에 대해 양호하였다.

요약하자면, 오로지 대조군 혼합물만이, EMGM 모델을 분포 분율 추정을 위한 미공지 혼합물에 적용하기 전에, EMGM 방법을 적용하는 데 필요하다.

다른 실시형태

사용된 단어들은 제한보다는 설명을 위한 단어이고, 본 발명의 참 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 첨부된 청구항의 관점 내에서 변화가 이의 보다 넓은 양태들 내에서 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명이 몇몇 기재된 실시형태들과 관련하여 일부 길이 및 일부 특정성에서 기재되긴 하였지만, 이러한 임의의 특정성 또는 실시형태 또는 임의의 특정한 실시형태로 제한되어야 하는 것으로 의도되지 않고, 그보다는 첨부된 청구항을 참조로 하여 선행 기술의 관점에서 이러한 청구항의 가장 넓은 가능한 해석을 제공하고, 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함하는 것으로 여겨진다.

본원에서 언급된 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 다른 참조들은 이들 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 좌우할 것이다. 또한, 섹션 머릿말, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적일 뿐이고 제한하려는 것이 아니다.

Claims (55)

1. 나노포어 장치를 사용하여 혼합된 미공지 시료 내 표적 분석물의 참(true) 상대 존재비(relative abundance)의 개선된 추정치의 결정 방법으로서,
   상기 방법은,
   나노포어 장치에서 나노포어를 가로질러 전압을 인가하여, 혼합된 미공지 시료에 대해; 또는 대조군 시료 및 상기 혼합된 미공지 시료 각각에 대해 개별적으로; 상기 나노포어를 통해 검출 가능한 전기 신호(electrical signals)를 발생시키고 하전된 분석물의 전위(translocation)를 유도하는 단계로서:
   상기 대조군 시료는 참조 분석물에 대해 표적 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하고,
   상기 혼합된 미공지 시료는 상기 시료 내 상기 표적 분석물의 상대 존재비가 결정되어야 하는 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 단계;
   상기 혼합된 미공지 시료; 또는 상기 대조군 시료 및 상기 혼합된 미공지 시료 각각;에 대해 상기 나노포어를 통한 상기 표적 분석물 또는 상기 참조 분석물의 전위에 의해 발생된 복수의 이벤트 신호(event signature)들을 발생시키는 단계;
   상기 복수의 이벤트 신호들로부터 상기 표적 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 양 및 상기 참조 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 양을 식별하여, 상기 혼합된 미공지 시료; 또는 상기 대조군 시료 및 상기 혼합된 미공지 시료 각각;에 대해 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 결정하는 단계; 및
   상기 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비, 또는 상기 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 미리 결정된 상대 존재비를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 조정하여, 검출된 상대 존재비에서 오차에 대해 보정하고, 이로써 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 개선된 추정치를 결정하는 단계
   를 포함하고,
   상기 참 상대 존재비의 상기 추정치는 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적분석물의 참비율(true ratio)의 추정치(R^* _혼합 ) 또는 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 집단에서 상기 표적 분석물의 참분율(true fraction)의 추정치(F^* _혼합 )이며,
   상기 참비율의 상기 추정치(R^* _혼합 )는 R^* _혼합 =ρα에 의해 결정되며 상기 참분율의 상기 추정치(F^* _혼합 )는

   

   에 의해 결정되고,
   상기 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 상기 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있으며,
   

   

   이고,

   

   이며,
   상기 Q_표적 , Q_참조 및 Q_X:Y 각각은 미리 결정된 또는 상기 방법에 의해 관찰된 분율이고,
   Q_표적 이, 표적 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이며,
   Q_참조 가, 참조 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,
   Q_X:Y 가, 혼합 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,

   

   는 상기 혼합 대조군 시료에서 참조 분석물 (Y)에 대한 표적 분석물 (X)의 공지된 비율이며,
   Q_혼합 이 상기 혼합된 미공지 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율인, 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 대조군 시료가 상기 참조 분석물이 아니라, 상기 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료인, 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 대조군 시료가 상기 표적 분석물이 아니라, 상기 참조 분석물을 포함하는 참조 대조군 시료인, 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 방법이 나노포어 장치에 전압을 인가하여 상기 참조 분석물이 아니라, 상기 표적 분석물을 포함하는 표적 대조군 시료에 대해 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 상기 검출된 상대 존재비의 상기 조정이 표적 대조군 시료 및 참조 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 사용하여, 검출된 상대 존재비에서의 상기 오차를 보정하는 단계를 포함하는, 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 오차가 상기 표적 분석물의 위양성(false positive) 또는 위음성(false negative) 검출 오차를 포함하는, 방법.
7. 제1항에 있어서,
   나노포어 장치에 전압을 인가하여 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합 대조군 시료에 대해 나노포어 센서를 통해 하전된 분석물의 전위를 유도하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물의 상대 존재비가 공지되어 있는, 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 상기 검출된 상대 존재비의 상기 조정이 표적 대조군 시료, 참조 대조군 시료 및 상기 혼합 대조군 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 검출된 상대 존재비를 사용하여 상기 검출된 상대 존재비에서 상기 오차를 보정하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 오차가 위양성 표적 분석물 검출 오차, 위음성 표적 분석물 검출 오차, 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이(capture rate constant differential) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 대조군 시료가 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 포함하는 혼합 대조군 시료이고, 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물의 상대 존재비가 공지되어 있는, 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 오차가 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 포함하는, 방법.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합 대조군 시료가 상기 혼합된 미공지 시료에 비하여 1.2배 이하, 1.5배 이하, 2배 이하, 5배 이하 또는 10배 이하만큼 차이 나는 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 상대 존재비를 포함하는, 방법.
13. 삭제
14. 삭제
15. 제1항에 있어서,
    α가 참조 분석물 포착률 상수를 표적 분석물 포착률 상수로 나눈 비율의 추정치인, 방법.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
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20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 제1항에 있어서,
    상기 미공지 또는 대조군 시료가 핵산 증폭에 의해 제조되는, 방법.
25. 제1항에 있어서,
    상기 미공지 또는 대조군 시료가 핵산 증폭에 의해 제조되지 않는, 방법.
26. 제1항에 있어서,
    상기 시료가 실질적으로 참조 분자 및 표적 분자로 구성되도록 정제되는, 방법.
27. 제1항에 있어서,
    상기 시료가 정제되지 않는, 방법.
28. 제1항에 있어서,
    상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물의 양 또는 농도가 공지되어 있는, 방법.
29. 제28항에 있어서,
    상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 상기 추정치 및 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 참조 분석물의 상기 공지된 양 또는 농도를 사용하여 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 표적 분석물의 절대 양 또는 농도의 추정치를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
30. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물과 연관된 제1 이벤트 신호의 상기 양 및 상기 참조 분석물과 연관된 제2 이벤트 신호의 상기 양이 한정된 역치(defined threshold)에 따라 식별되는, 방법.
31. 제30항에 있어서,
    Q-테스트, 서포트 벡터 머신(support vector machine) 또는 기댓값 최대화 알고리즘(expectation maximization algorithm)을 사용하여 상기 역치를 최적화하여 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물 중 하나 이상의 검출의 정확도를 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
32. 제31항에 있어서,
    상기 서포트 벡터 머신이 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 양으로 포함하는 대조군 시료로부터 이벤트 신호와 연관된 전기 신호를 사용하여 트레이닝되는, 방법.
33. 제30항에 있어서,
    상기 한정된 역치가 이벤트 기간(event duration), 최대 δG, 중앙값 δG, 평균 δG, 이벤트 신호의 표준 편차, 50 Hz 미만의 이벤트의 노이즈 파워(noise power)의 평균 또는 중앙값, 상기 이벤트 신호에서의 독특한 패턴, 이벤트 면적(area of an event) 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이벤트 신호의 하나 이상의 특징의 함수인, 방법.
34. 제1항에 있어서,
    검출된 상대 존재비에서 상기 오차를 보정하기 위해 상기 혼합된 미공지 시료 내 상기 제1 이벤트 신호 및 상기 제2 이벤트 신호의 상기 검출된 상대 존재비의 상기 조정이 Q-테스트, 서포트 벡터 머신 또는 기댓값 최대화 알고리즘을 사용하여 수행되는, 방법.
35. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물이 각각 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
36. 제35항에 있어서,
    상기 표적 분석물 폴리뉴클레오타이드 및 상기 참조 분석물 폴리뉴클레오타이드가 상이한 길이를 가지는, 방법.
37. 제36항에 있어서,
    상기 길이가 적어도 10개 뉴클레오타이드, 적어도 20개 뉴클레오타이드, 적어도 50개 뉴클레오타이드, 적어도 100개 뉴클레오타이드, 적어도 150개 뉴클레오타이드 또는 적어도 200개 뉴클레오타이드만큼 상이한, 방법.
38. 제1항에 있어서,
    상기 대조군 또는 미공지 시료를 제1 페이로드(payload)에 결합된 제1 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제1 프로브가 제1 분석물에 특이적으로 결합되도록 구성되는, 방법.
39. 제1항에 있어서,
    상기 대조군 또는 미공지 시료를 제2 페이로드에 결합된 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 상기 제2 프로브가 제2 분석물에 특이적으로 결합되도록 구성되는, 방법.
40. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물이 유전자 변형 유기체와 상관관계가 있는, 방법.
41. 제1항에 있어서,
    상기 표적 분석물이 환자에서 암의 존재 또는 부재와 연관된 마커를 포함하는, 방법.
42. 시료 내 표적 분석물의 상대량의 결정 방법으로서,
    참조 분석물을 포함하지만 표적 분석물은 포함하지 않는 제1 대조군 시료,
    표적 분석물을 포함하지만 참조 분석물은 포함하지 않는 제2 대조군 시료,
    상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 공지된 상대 존재비로 포함하는 제3 대조군 시료, 및
    상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물을 미공지된 상대 존재비로 포함하는 실험 시료를, 나노포어 시스템에서 각각을 개별적으로 진행시키는(run) 단계;
    각각의 시료에 대해, 상기 나노포어 시스템을 통한 참조 분석물의 전위로부터의 신호로부터 발생한 제1 이벤트 신호의 양 및 상기 나노포어 시스템을 통한 표적 분석물의 전위로부터의 신호로부터 발생한 제2 이벤트 신호의 양을 검출하는 단계; 및
    상기 실험 시료로부터 유래한 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 상기 양의 상대 존재비를 상기 제1 대조군 시료, 상기 제2 대조군 시료 및 상기 제3 대조군 시료 각각으로부터 유래한 제1 이벤트 신호 및 제2 이벤트 신호의 상기 양의 상대 존재비와 비교하여, 상기 실험 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치를 결정하는 단계
    를 포함하고,
    상기 참 상대 존재비의 상기 추정치는 상기 실험 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참비율(true ratio)의 추정치(R^* _혼합 ) 또는 상기 시료 내 상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물의 총 집단(population)과 비교하여 상기 표적 분석물의 참부분량(true fractional amount)의 추정치(F^* _혼합 )이며,
    상기 참비율의 상기 추정치(R^* _혼합 )는 R^* _혼합 =ρα에 의해 결정되며 상기 참부분량의 상기 추정치(F^* _혼합 )는

    

    에 의해 결정되고,
    상기 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 상기 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있으며,
    

    

    이고,

    

    이며,
    Q_표적 이, 표적 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이며,
    Q_참조 가, 참조 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,
    Q_X:Y 가, 혼합 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,

    

    는 상기 혼합 대조군 시료에서 참조 분석물 (Y)에 대한 표적 분석물 (X)의 공지된 비율이며,
    Q_혼합 이 상기 혼합된 미공지 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율인, 방법.
43. 제42항에 있어서,
    상기 이벤트 신호가 상기 나노포어를 통한 상기 참조 분석물의 전위에 의해 유도되는 전기 신호를 포함하는, 방법.
44. 제42항에 있어서,
    상기 표적 분석물 및 상기 참조 분석물이 각각 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
45. 제44항에 있어서,
    상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물이 길이에 의해 구별되는, 방법.
46. 제42항에 있어서,
    상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물이 상기 나노포어 장치에서 상기 참조 분석물과 상기 표적 분석물 사이의 구별을 용이하게 하기 위해, 페이로드를 포함하는 서열-특이적 프로브에 각각 결합되어 있는, 방법.
47. 삭제
48. 미공지 시료 내 표적 분석물의 상대 존재비의 결정 방법으로서,
    복수의 참조 분석물 및 복수의 표적 분석물을 포함하는 미공지 시료를 제공하는 단계;
    상기 미공지 시료를 제1 챔버와 제2 챔버 사이에 배치된 나노포어를 포함하는 나노포어 장치의 상기 제1 챔버 내로 로딩하는 단계;
    상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하여, 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물을 상기 나노포어를 통해 상기 제1 챔버로부터 상기 제2 챔버로 통과시키는 단계;
    상기 나노포어를 통한 상기 참조 분석물의 전위와 연관이 있는 다수의 제1 이벤트 신호들 각각을 발생시키는 단계;
    상기 나노포어를 통한 상기 표적 분석물의 전위와 연관이 있는 다수의 제2 이벤트 신호들 각각을 발생시키는 단계; 및
    상기 이벤트 신호 상대 존재비와 연관된 적어도 하나의 오차를 설명하는 참조값을 사용하여, 검출된 제1 이벤트 신호의 수 및 검출된 제2 이벤트 신호의 수의 상대 존재비를 상기 미공지 시료 내 상기 표적 분석물의 참 상대 존재비의 추정치로 전환시키는 단계
    를 포함하고,
    상기 참 상대 존재비의 상기 추정치는 상기 미공지 시료 내 상기 참조 분석물에 대한 상기 표적 분석물의 참비율(true ratio)의 추정치(R^* _혼합 ) 또는 상기 미공지 시료 내 상기 참조 분석물 및 상기 표적 분석물의 집단(population)에서 상기 표적 분석물의 참분율(true fraction)의 추정치(F^* _혼합 )이며,
    상기 참비율의 상기 추정치(R^* _혼합 )는 R^* _혼합 =ρα에 의해 결정되며 상기 참분율의 상기 추정치(F^* _혼합 )는

    

    에 의해 결정되고,
    상기 파라미터 ρ는 위양성 검출 오차, 위음성 검출 오차 또는 둘 다를 보상할 수 있는 비율에 대한 추정치이고, 상기 파라미터 α는 상기 표적 분석물과 상기 참조 분석물 사이의 포착률 상수 차이를 보상하는 데 사용될 수 있으며,
    

    

    이고,

    

    이며,
    Q_표적 이, 표적 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이며,
    Q_참조 가, 참조 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,
    Q_X:Y 가, 혼합 대조군 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율이고,

    

    는 상기 혼합 대조군 시료에서 참조 분석물 (Y)에 대한 표적 분석물 (X)의 공지된 비율이며,
    Q_혼합 이 상기 혼합된 미공지 시료에서 관찰된 상기 제1 이벤트 신호의 분율인, 방법.
49. 제48항에 있어서,
    상기 참조값이 표적 분석물 및 참조 분석물을 공지된 양으로 포함하는 혼합 대조군 시료로부터 결정된 상기 제1 이벤트 신호의 분포 분율(fractional abundance)로부터 결정되는, 방법.
50. 삭제
51. 삭제
52. 제49항에 있어서,
    상기 혼합 대조군 시료, 표적 대조군 시료 또는 참조 대조군 시료가, 상기 미공지 시료로부터 상기 제1 및 제2 이벤트 신호들의 상기 검출 동안 상기 나노포어 장치에서의 조건과 실질적으로 동일한 조건 하에 상기 나노포어 장치에서 진행되는, 방법.
53. 제48항에 있어서,
    상기 나노포어 장치가 장치의 내부 공간을 제1 챔버 및 제2 챔버로 분리하는 막을 포함하고, 상기 막이 상기 나노포어를 포함하며, 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버가 상기 나노포어를 통해 유체 소통(fluid communication)하고, 상기 장치가 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하기 위해 각각의 챔버 내에 전극을 포함하는, 방법.
54. 제53항에 있어서,
    상기 전극이 상기 나노포어를 통해 전류를 모니터링도록 구성되는, 방법.
55. 제53항 또는 제54항에 있어서,
    상기 전극이 전원 장치(power supply)에 연결되어 있는, 방법.

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