KR102136627B1 - Pharmaceutical composition and health functional food for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease including liposomes - Google Patents

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KR102136627B1 KR1020180079467A KR20180079467A KR102136627B1 KR 102136627 B1 KR102136627 B1 KR 102136627B1 KR 1020180079467 A KR1020180079467 A KR 1020180079467A KR 20180079467 A KR20180079467 A KR 20180079467A KR 102136627 B1 KR102136627 B1 KR 102136627B1
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Abstract

본 발명은 리포좀을 포함하는 염증성 장 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 포스파티딜콜린 및 상기 포스파티딜콜린 사이에 개재된 크릴오일을 포함하며, 상기 포스파티딜콜린 23 내지 32 중량부에 대하여 상기 크릴오일을 6 내지 40 중량부로 포함하는 리포좀을 함유함으로써, 항염 및 항산화 효과가 있고, 리포좀 내 활성 물질을 함유하더라도 저장 안정성이 뛰어나고, 리포좀 내 활성 물질의 장내 염증 부위로의 전달은 매우 우수한 효율로 할 수 있고, 리포좀의 지질 이중층 내 활성 물질이 포함되더라도 리포좀의 구조가 장시간 안정하게 유지되고, 리포좀을 동결건조시키더라도 항염, 항산화 효과가 유지되며 구조 안정성, 활성물질 저장 안정성이 낮아지지 않고, 구강 투여가 가능하여 복용이 편리하고, 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능할 수 있고, 본 발명의 리포좀을 포함한 약학 조성물, 건강기능식품은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능할 수 있는, 본 발명은 리포좀을 포함하는 염증성 장 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and a health functional food for preventing, improving or treating an inflammatory bowel disease containing liposomes, and comprises krill oil interposed between phosphatidylcholine and the phosphatidylcholine, with respect to 23 to 32 parts by weight of the phosphatidylcholine. By containing liposomes containing 6 to 40 parts by weight of krill oil, it has anti-inflammatory and antioxidant effects, and even if it contains an active substance in the liposome, it has excellent storage stability, and the delivery of the active substance in the liposome to the inflammatory site in the intestine is very effective. It can be, even if the active substance in the lipid bilayer of the liposome is contained, the structure of the liposome remains stable for a long time, and even if the liposome is lyophilized, the anti-inflammatory and antioxidant effects are maintained, and the structural stability and storage stability of the active substance are not lowered, and the oral cavity It is possible to administer it, it is convenient to take, and it can be prevented, improved or treated with inflammatory bowel disease, and the pharmaceutical composition including the liposome of the present invention and the health functional food can prevent, improve or treat inflammatory bowel disease, The present invention relates to pharmaceutical compositions and health functional foods for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease, including liposomes.

Description

리포좀을 포함하는 염증성 장질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품 {Pharmaceutical composition and health functional food for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease including liposomes}Pharmaceutical composition and health functional food for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease including liposomes}

본 발명은 염증성 장질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 리포좀을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and a health functional food containing liposomes capable of preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.

염증성 장 질환 (Inflammatory bowel disease, IBD)은 통증, 출혈 및 설사의 증상을 갖는 위장관의 전형적인 만성 염증성 질환이다. IBD의 두가지 주요 유형으로는 궤양염 (ulcerative colitis, UC)과 크론병 Crohn's disease, CD)가 있다. 아직까지 IBD 발병의 기전이 명확하지 않기 때문에, 완치보다는 증상을 완화시키고 이를 유지하기 위한 목적으로 치료가 이루어지고 있다. 현재 IBD의 내과적 치료는 메살라민(mesalamine) 등 항염증제, 부데소니드(budesonide)등 코티코스테로이드, 면역조절제, TNF-a 항체치료제 등에 의해 이루어지고 있다. 이들 치료제들은 재발을 억제하고 질병의 활성 기간(증상이 왕성하게 나타나는 기간)을 줄여 주기는 하나 반복 투여시 많은 환자에게서 전신부작용이 나타나며 고용량 투여에도 불구하고 치료효과를 보이지 않는 환자들이 나타난다.Inflammatory bowel disease (IBD) is a typical chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract with symptoms of pain, bleeding and diarrhea. The two main types of IBD are ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD). Since the mechanism of IBD development is still unclear, treatment is being conducted to relieve symptoms and maintain them rather than cure them. Currently, medical treatment of IBD is carried out by anti-inflammatory drugs such as mesalamine, corticosteroids such as budesonide, immunomodulators, and TNF-a antibody therapy. These treatments suppress recurrence and reduce the disease's active period (the period of active symptoms), but many patients have systemic side effects during repeated administrations and patients who do not show therapeutic effects despite high doses.

IBD 환자가 복용한 약물의 장통과시간은 설사 증상으로 인해 흔히 매우 단축된다. 따라서 약물의 장내 체류시간을 연장시키기 위해서는 액체보다는 고체가, 마이크로 보다는 나노크기의 입자가 효과적이다. IBD환자의 염증 부위에는 다양한 면역세포들이 모여들게 되며 이들의 고체 입자 식균작용 (phagocytosis)은 염증 부위에 나노입자 축적이 증가될 수 있는 또다른 요인이 된다. 또한 나노입자 표면 하전이 음성인 경우 양성인 경우에 비해 IBD 환자 염증부위에의 부착이 훨씬 큰데 이는 장염증 부위에 강하게 침투하는 호산구(eosinophil)가 분비한 호산구 양이온성 단백질(eosinophil cationic protein)등 양성 하전의 단백질이 많이 존재하기 때문으로 생각된다. 따라서 음성 하전의 나노크기 고체입자가 IBD의 치료에 가장 적합한 제제라 할 수 있다The intestinal transit time of medications taken by IBD patients is often very short due to diarrhea symptoms. Therefore, in order to extend the residence time of the drug, solids rather than liquids and nano-sized particles rather than micros are effective. Various immune cells are gathered in the inflamed area of IBD patients, and their solid particle phagocytosis is another factor that may increase the accumulation of nanoparticles in the inflamed area. In addition, when the nanoparticle surface charge is negative, the adhesion to the inflammatory site of the IBD patient is much greater than that of the positive case, which is positively charged, such as eosinophil cationic protein secreted by eosinophil, which strongly penetrates the intestinal inflammation site. It is thought that there are a lot of proteins. Therefore, negatively charged nano-sized solid particles can be said to be the most suitable agent for the treatment of IBD.

리포좀은 대표적 나노입자 제형으로, 주성분인 포스파티딜콜린 (PC)은 장점막의 주성분이기도 하기에 PC의 보충은 염증반응에 의해 손상된 장점막의 장벽능을 회복시켜 염증반응을 시켜주는 효과가 있으며 PC외 추가적인 인지질 성분 조정에 의해 표면 하전도 음성으로 조절이 가능하다. 이에, 보관 및 위장관계 내에서의 분산 안정성이 양호하면서 우수한 약효를 갖는 나노크기의 리포좀 개발의 필요성이 있다.Liposomes are representative nanoparticle formulations, and the main component, phosphatidylcholine (PC), is also the main component of the mesenteric membrane, so supplementation of the PC has the effect of restoring the barrier function of the mesenteric membrane damaged by the inflammatory reaction, causing an inflammatory reaction, and additional phospholipid components other than PC By adjusting, the surface charge can be adjusted negatively. Accordingly, there is a need for development of nano-sized liposomes having good medicinal properties while having good dispersion stability in storage and gastrointestinal system.

한국특허공보 제2005-0086648호Korean Patent Publication No. 2005-0086648

본 발명은 항염 효과가 있는 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes with anti-inflammatory effects.

본 발명은 리포좀 내 활성 물질을 함유하더라도 저장 안정성이 뛰어난 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes having excellent storage stability even if they contain active substances in the liposomes.

본 발명은 리포좀 내 활성 물질의 장내 염증 부위로의 전달은 매우 우수한 효율로 할 수 있는 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes capable of delivering an active substance in a liposome to an inflammatory site in the intestine with very good efficiency.

본 발명은 리포좀의 지질 이중층 내 활성 물질이 포함되더라도 리포좀의 구조가 다양한 생리적 조건에서 장시간 안정하게 유지되는 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes in which the structure of liposomes is stably maintained for a long time under various physiological conditions even when the active substance in the lipid bilayer of the liposome is included.

본 발명은 리포좀을 동결건조 시키더라도 구조 안정성이 유지되는 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes whose structural stability is maintained even when lyophilized the liposomes.

본 발명은 구강 투여가 가능하여 복용이 편리한 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes that can be administered orally and are convenient to take.

본 발명은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능한 리포좀의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide liposomes capable of preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.

본 발명은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능한 약학 조성물, 건강기능식품의 제공을 목적으로 한다.The present invention aims to provide a pharmaceutical composition capable of preventing, improving or treating inflammatory bowel disease, and a health functional food.

1. 포스파티딜콜린 및 상기 포스파티딜콜린 사이에 개재된 크릴오일을 포함하며, 상기 포스파티딜콜린 23 내지 32 중량부에 대하여 상기 크릴오일을 6 내지 40 중량부로 포함하는 리포좀을 함유하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.1. A pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease, comprising liposomes containing 6 to 40 parts by weight of the krill oil, containing 23 to 32 parts by weight of phosphatidylcholine and krill oil interposed between the phosphatidylcholines.

2. 위 1에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 eggPC, soyPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC), hydrogenated eggPC, hydrogenated soyPC, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC), 및 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DMPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.2. In the above 1, wherein the phosphatidyl choline is eggPC, soyPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), hydrogenated eggPC, hydrogenated soyPC, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), inflammatory bowel, at least one selected from the group consisting of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), and 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Pharmaceutical composition for preventing or treating diseases.

3. 위 1에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양염 또는 크론병인, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.3. The method of 1 above, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative or Crohn's disease, a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease.

4. 위 1에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 사이에 스테롤계 화합물 또는 토코페롤이 더 개재되는, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.4. The pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease according to the above 1, wherein the phosphatidylcholine is further interposed with a sterol-based compound or tocopherol.

5. 위 4에 있어서, 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부, 스테롤계 화합물 0.4 내지 2중량부 및 토코페롤 0.2 내지 1.5중량부를 포함하는, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.5. In the above 4, phosphatidylcholine 23 to 32 parts by weight, 0.4 to 2 parts by weight of a sterol-based compound and 0.2 to 1.5 parts by weight of tocopherol, pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease.

6. 위 1에 있어서, 상기 리포좀 내에 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나가 개재되는, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.6. In the above 1, at least one selected from the group consisting of an immunosuppressive agent, an anti-inflammatory agent, a steroid, an immunomodulatory agent, a cytokine, and a tumor necrosis factor (TNF) antagonist is interposed in the liposome. The pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease.

7. 포스파티딜콜린 및 상기 포스파티딜콜린 사이에 개재된 크릴오일을 포함하며, 상기 포스파티딜콜린 23 내지 32 중량부에 대하여 상기 크릴오일을 6 내지 40 중량부로 포함하는 리포좀을 함유하는 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.7. Health functional food for preventing or improving inflammatory bowel disease comprising phosphatidylcholine and krill oil interposed between the phosphatidylcholine and containing liposomes containing 6 to 40 parts by weight of the krill oil relative to 23 to 32 parts by weight of the phosphatidylcholine .

8. 위 7에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 eggPC, soyPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC), hydrogenated eggPC, hydrogenated soyPC, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC), 및 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DMPC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.8. In the above 7, the phosphatidylcholine is eggPC, soyPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), hydrogenated eggPC, hydrogenated soyPC, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), inflammatory bowel, at least one selected from the group consisting of 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), and 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) Health functional food for disease prevention or improvement.

9. 위 7에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양염 또는 크론병인, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.9. In the above 7, the inflammatory bowel disease is ulcerative or Crohn's disease, inflammatory bowel disease prevention or improvement health functional food.

10. 위 7에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 사이에 스테롤계 화합물 또는 토코페롤이 더 개재되는, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.10. The health functional food for preventing or improving inflammatory bowel disease according to the above 7, wherein the phosphatidylcholine is further interposed with a sterol-based compound or tocopherol.

11. 위 10에 있어서, 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부, 스테롤계 화합물 0.4 내지 2중량부 및 토코페롤 0.2 내지 1.5중량부를 포함하는, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.11. In the above 10, phosphatidyl choline 23 to 32 parts by weight, 0.4 to 2 parts by weight of a sterol-based compound and 0.2 to 1.5 parts by weight of tocopherol, inflammatory bowel disease prevention or improvement health functional food.

12. 위 7에 있어서, 상기 리포좀 내에 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나가 개재되는, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.12. In the above 7, at least one selected from the group consisting of immunosuppressants, anti-inflammatory agents, steroids, immunomodulators, cytokines, and tumor necrosis factor (TNF) antagonists in the liposomes Health functional food for preventing or improving inflammatory bowel disease.

본 발명의 리포좀은 항염 및 항산화 효과가 있다.The liposome of the present invention has anti-inflammatory and antioxidant effects.

본 발명의 리포좀은 리포좀 내 활성 물질을 함유하더라도 저장 안정성이 뛰어나다.The liposome of the present invention has excellent storage stability even if it contains an active substance in the liposome.

본 발명의 리포좀은 위장관계 안정성이 우수하여 리포좀 내 활성 물질의 장내 염증 부위로의 전달은 매우 우수한 효율로 할 수 있다.The liposome of the present invention has excellent gastrointestinal stability, and thus the delivery of the active substance in the liposome to the inflamed site of the intestine can be performed with very good efficiency.

본 발명의 리포좀은 리포좀의 지질 이중층 내 크릴오일이 포함되더라도 리포좀의 구조가 장시간 안정하게 유지된다.The liposome of the present invention maintains the structure of the liposome stably for a long time even when krill oil is contained in the lipid bilayer of the liposome.

본 발명의 리포좀은 리포좀을 동결건조 시키더라도 항염, 항산화 효과가 유지되며 구조적 특성이 변화하지 않는다.In the liposome of the present invention, even if the liposome is lyophilized, the anti-inflammatory and antioxidant effects are maintained and structural properties are not changed.

본 발명의 리포좀은 구강 투여가 가능하여 복용이 편리하다.The liposome of the present invention can be administered orally and is convenient to take.

본 발명의 리포좀은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능할 수 있다.The liposome of the present invention may be capable of preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.

본 발명의 리포좀을 포함한 약학 조성물, 건강기능식품은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능할 수 있다.The pharmaceutical composition including the liposome of the present invention, the health functional food may be capable of preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.

도 1은 DOPC 또는 DSPC를 주성분으로 하고 항산화제 알파 토코페롤 및 리포좀 막 안정성 증진을 위한 콜레스테롤을 가하여 만든 리포좀에의 각종 오메가-3-지방산 삽입이 리포좀의 분산 안정성에 미치는 영향의 지표로서 시간에 따른 리포좀의 평균 입자 크기의 변화를 나타낸 것이다. 각 리포좀의 제조 직후 (0주)와 비교하여 유의성있는 변화는 별표 (p<0.01, *; p<0.005, **; p<0.001, ***)로 표시하였다.
도 2에서 (A)는 왼쪽부터 차례로 PC만으로 구성된 이중층, PC 분자 사이에 오메가-3-지방산을 끼워넣은 PC 이중층, PC 분자사이에 크릴 오일을 끼워 넣은 PC 이중층의 모식도이다. (B)는 EPA를 넣어 제조한 리포좀 및 크릴 오일을 넣어 제조한 리포좀의 제조 직후 및 상온에서 3주 보관 후 얻은 투과전자현미경 이미지이다. 노란색 화살표는 곡률 스트레스에 의해 생긴 모서리 부분을 보여준다.
도 3에서 위쪽 칼럼은 DOPC, 알파 토코페롤, 콜레스테롤의 혼합물 29. 6 mg에 크릴 오일을 0, 6, 18, 27, 54 또는 108 mg 혼합하여 단순동결건조 후 얻은 혼합물의 물리적 상태를 보여주는 이미지이며 아랫쪽 칼럼은 이중 크릴 오일을 0, 18, 27 또는 54 mg 섞은 혼합액에 수상을 가하여 제조한 리포좀의 분산 상태를 보여주는 이미지이다.
도 4에서 (A)는 DOPC, 알파 토코페롤, 콜레스테롤의 혼합물 29.6 mg에 크릴 오일을 0, 6, 18, 27, 또는 54 mg 혼합하여 제조한 리포좀의 제타 전위 값의 그래프이며 (B)는 (A)의 리포좀 중 크릴 오일을 0, 6, 18 mg 함유하는 리포좀의 상온 보관시 입자 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 DOPC, 알파 토코페롤, 콜레스테롤로 제조한 통상적인 리포좀, 상기 조성의 지질 총량 29.6 mg에 크릴오일 18 mg을 혼합시켜 제조한 리포좀 (KO liposome), 크릴오일 자체에 알파 토코페롤만을 용해시켜 제조한 크릴오일 에멀젼 (KO emulsion) 3 종을 각각 pH 7.4의 인산염완충액, pH 1.2의 인공위액, pH 6.5의 인공장액에 넣어 37oC에서 0, 2, 4, 8 및 24 시간 방치 후 입자크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6에서 (A)는 DOPC, 알파 토코페롤, 콜레스테롤의 27.6 mg 혼합물에 크릴 오일 18 mg을 혼합시켜 제조한 리포좀 분산액을 동결건조하여 얻은 리포좀파우더 (좌) 및 리포좀 파우더에 물을 가해 재복원시킨 리포좀 분산액 (우)의 이미지이며 (B)는 크릴오일 삽입 리포좀의 동결건조 전후 입자경 및 다분산도를 나타내는 표이다.
도 7은 분화되어 단층의 막장벽을 형성한 CaCO-2 세포를 전염증성 사이토카인이 풍부한 대식세포 상층액 (RAW264.7 soup)과 인큐베이션하였을 때의 TEER 감소도와 통상의 리포좀 (oil-free liposome), 크릴오일 리포좀 (KO liposome) 또는 크릴오일 용액을 처리시의 TEER 변화를 나타내는 그래프이다. RAW264.7 soup 처리시와 비교하여 유의성있는 변화는 별표 (p<0.01, *; p<0.005, **; p<0.001, ***)로 표시하였다.
도 8은 배양한 마우스 RAW264.7 대식세포에 통상의 리포좀, 크릴오일 리포좀, 크릴오일 용액 또는 부데소니드(BDS)를 전처리 후 LPS와 인큐베이션 후 염증성 사이토카인 (A) IL-6와 (B) TNF-a의 생성농도 측정치를 그래프로 표시한 것이다. 전처리 없이 LPS와 인큐베이션한 경우와 비교하여 유의성있는 변화는 별표 (p<0.01, *; p<0.005, **; p<0.001, ***)로 표시하였다.
도 9는 DSS투여에 의해 마우스에 급성대장염을 유도 후 크릴오일 리포좀 또는 부데소니드를 경구투여시 장점막 장벽능(intestinal barrier permeability)의 손상 및 회복 정도를 평가하기 위해 혈청 내독소 LPS의 농도를 측정한 결과를 그래프화한 것이다.
도 10은 DSS투여에 의해 마우스에 급성대장염을 유도 후 크릴 오일 삽입 리포좀 또는 부데소니드를 경구투여시 염증반응의 정도를 평가하기 위해 혈청중 사이토카인 (IL-6, IFN-g, TNF-a, IL12p70, IL-10) 및 chemokine (MCP-1)의 농도를 측정하여 얻은 그래프이다.1 is a liposome over time as an index of the effect of the insertion of various omega-3-fatty acids into liposomes made by adding DOPC or DSPC as a main component and adding cholesterol to improve the stability of the antioxidant alpha tocopherol and liposome membrane. It shows the change in the average particle size. Significant changes compared to immediately after the preparation of each liposome (week 0) are indicated by asterisks (p<0.01, *; p<0.005, **; p<0.001, ***).
In FIG. 2, (A) is a schematic diagram of a double layer consisting only of PCs from left to right, a double layer of PC sandwiched between omega-3-fatty acids between PC molecules, and a double layer of PC sandwiched with krill oil between PC molecules. (B) is a transmission electron microscope image obtained immediately after the preparation of liposomes prepared by adding EPA and krill oil and after storage for 3 weeks at room temperature. The yellow arrow shows the corners caused by curvature stress.
3, the upper column is an image showing the physical state of the mixture obtained after simple freezing and drying by mixing 0, 6, 18, 27, 54, or 108 mg of krill oil with 29.6 mg of a mixture of DOPC, alpha tocopherol, and cholesterol. The column is an image showing the dispersion state of liposomes prepared by adding an aqueous phase to a mixture solution of 0, 18, 27 or 54 mg of double krill oil.
In Figure 4 (A) is a graph of the zeta potential value of the liposomes prepared by mixing 0, 6, 18, 27, or 54 mg of krill oil with 29.6 mg of a mixture of DOPC, alpha tocopherol, and cholesterol (B) is (A) ) Is a graph showing changes in particle size when stored at room temperature of liposomes containing 0, 6, and 18 mg of krill oil in the liposomes.
Figure 5 is a conventional liposomes made of DOPC, alpha tocopherol, cholesterol, liposomes prepared by mixing 18 mg of krill oil with 29.6 mg of lipid total amount of the composition (KO liposome), prepared by dissolving only alpha tocopherol in krill oil itself Three kinds of Krill oil emulsion (KO emulsion) were added to phosphate buffer solution at pH 7.4, artificial gastric juice at pH 1.2, and artificial intestinal fluid at pH 6.5, and the particle size was changed at 37 o C for 0, 2, 4, 8 and 24 hours. It is a graph showing.
In FIG. 6, (A) is a liposome powder (left) obtained by lyophilizing a liposome dispersion prepared by mixing 18 mg of krill oil with a 27.6 mg mixture of DOPC, alpha tocopherol, and cholesterol, and liposomes restored by adding water to liposome powder. Image of dispersion (right) and (B) is a table showing particle diameter and polydispersity before and after lyophilization of krill oil-inserted liposomes.
FIG. 7 shows TEER reduction and normal liposome (oil-free liposome) when incubated CaCO-2 cells differentiated to form a monolayer membrane barrier with macrophage supernatant rich in pro-inflammatory cytokines (RAW264.7 soup). , It is a graph showing the change in TEER when treating a krill oil liposome (KO liposome) or a krill oil solution. Significant changes compared to RAW264.7 soup treatment are indicated by asterisks (p<0.01, *; p<0.005, **; p<0.001, ***).
Figure 8 is a inflammatory cytokine (A) IL-6 and (B) TNF- after incubation with LPS after pre-treatment with conventional liposomes, krill oil liposomes, krill oil solution or budesonide (BDS) in cultured mouse RAW264.7 macrophages. It is a graph showing the measured concentration of a. Significant changes compared to those incubated with LPS without pretreatment were indicated by asterisks (p<0.01, *; p<0.005, **; p<0.001, ***).
9 is a result of measuring the concentration of serum endotoxin LPS to evaluate the degree of damage and recovery of intestinal barrier permeability upon oral administration of krill oil liposome or budesonide after induction of acute colitis in mice by DSS administration. Is graphed.
FIG. 10 shows cytokine (IL-6, IFN-g, TNF-a, IL12p70) in serum to evaluate the degree of inflammatory response when oral administration of krill oil-injected liposome or budesonide after induction of acute colitis in mice by DSS administration. , IL-10) and chemokine (MCP-1).

본 발명은 리포좀을 포함하는 염증성 장 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 포스파티딜콜린 및 상기 포스파티딜콜린 사이에 개재된 크릴오일을 포함하며, 상기 포스파티딜콜린 23 내지 32 중량부에 대하여 상기 크릴오일을 6 내지 40 중량부로 포함하는 리포좀을 함유함으로써, 항염 및 항산화 효과가 있고, 리포좀 내 활성 물질을 함유하더라도 저장 안정성이 뛰어나고, 리포좀 내 활성 물질의 장내 염증 부위로의 전달은 매우 우수한 효율로 할 수 있고, 리포좀의 지질 이중층 내 활성 물질이 포함되더라도 리포좀의 구조가 장시간 안정하게 유지되고, 리포좀을 동결건조시키더라도 항염, 항산화 효과가 유지되며 구조 안정성, 활성물질 저장 안정성이 낮아지지 않고, 구강 투여가 가능하여 복용이 편리하고, 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능할 수 있고, 본 발명의 리포좀을 포함한 약학 조성물, 건강기능식품은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료가 가능할 수 있는, 본 발명은 리포좀을 포함하는 염증성 장 질환 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and a health functional food for preventing, improving or treating an inflammatory bowel disease containing liposomes, and comprises krill oil interposed between phosphatidylcholine and the phosphatidylcholine, with respect to 23 to 32 parts by weight of the phosphatidylcholine. By containing liposomes containing 6 to 40 parts by weight of krill oil, it has anti-inflammatory and antioxidant effects, and even if it contains an active substance in the liposome, it has excellent storage stability, and the delivery of the active substance in the liposome to the inflammatory site in the intestine is very effective. It can be, even if the active substance in the lipid bilayer of the liposome is contained, the structure of the liposome remains stable for a long time, and even if the liposome is lyophilized, the anti-inflammatory and antioxidant effects are maintained, and the structural stability and storage stability of the active substance are not lowered, and the oral cavity It is possible to administer it, it is convenient to take, and it can be prevented, improved or treated with inflammatory bowel disease, and the pharmaceutical composition including the liposome of the present invention and the health functional food can prevent, improve or treat inflammatory bowel disease, The present invention relates to pharmaceutical compositions and health functional foods for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease, including liposomes.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 "리포좀(liposome)"은 활성 약물을 봉입할 수 있는 인지질 이중막(bilayer)이다.In the present invention, "liposome" is a phospholipid bilayer that can encapsulate an active drug.

본 발명에서 활성 성분은 살아있는 생물체 내 생리적인 활성을 제어 또는 활성화시킬 수 있는 물질이면 제한없이 사용될 수 있으며, 다만, 상기 물질은 살아있는 생물체의 건강을 해칠 수 있는 물질은 사용할 수 없다.In the present invention, the active ingredient may be used without limitation as long as it is a substance capable of controlling or activating physiological activity in the living organism, however, the substance cannot use a substance that may harm the health of the living organism.

본 발명에서 포스파티딜콜린 사이에 어떤 물질이 개재되어 있다는 것은 포스파티딜콜린, 물질, 포스파티딜콜린이 순차적으로 배열되어 있는 것을 의미하며, 여기서 포스파티딜콜린이 여러 개 연속으로 배열 후 물질이 개재된 후 다시 포스파티딜콜린이 여러 개 연속으로 배열되는 것을 반복하는 형상일 수 있으며, 임의의 개수의 포스파티딜콜린이 배열 후 임의의 개수의 물질이 배열된 다음 다시 임의의 개수의 포스파티딜콜린이 배열되는 형상일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.In the present invention, the presence of a substance interposed between phosphatidylcholines means that phosphatidylcholines, substances, and phosphatidylcholines are sequentially arranged, wherein phosphatidylcholines are sequentially arranged in multiple successive stages and then phosphatidylcholines are successively arranged in multiple successive arrangements. It may be a shape that repeats, and an arbitrary number of phosphatidylcholines may be arranged, followed by an arbitrary number of substances, and then an arbitrary number of phosphatidylcholines may be arranged, but is not limited thereto.

본 발명의 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 포스파티딜콜린 및 상기 포스파티딜콜린 사이에 개재된 크릴오일을 포함하며, 상기 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부에 대하여 상기 크릴오일이 6 내지 40중량부로 포함되는 리포좀을 함유한다. 구체적으로 도 1에 따르면, 리포좀을 구성하는 둘 이상의 포스파티딜콜린 사이에 크릴오일이 위치할 수 있다. 상기 비율로 크릴오일과 포스파티딜콜린이 포함되면, 크릴오일의 항염 효과, 항산화 효과가 온전히 장 내 염증부위에서 작용될 수 있으며, 리포좀의 구조 안정성 및 저장 안정성을 향상시켜 활성 물질을 리포좀 내 포함시키더라도 목적하는 위치에서 상기 활성 물질의 방출을 유도할 수 있다. 상기 범위를 벗어나면, 포스파티딜콜린이 크릴오일에 용해되어 손상된 막부위를 메우는 효과가 감소되거나 리포좀의 보관, 위장관계 및 동결건조시 구조적 안정성이 나빠지는 문제가 발생할 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease of the present invention includes liposomes interposed between phosphatidylcholine and the phosphatidylcholine, and the liposomes containing 6 to 40 parts by weight of the krill oil relative to 23 to 32 parts by weight of the phosphatidylcholine. do. Specifically, according to FIG. 1, krill oil may be located between two or more phosphatidylcholines constituting liposomes. When krill oil and phosphatidylcholine are included in the above ratio, the anti-inflammatory and anti-oxidative effects of krill oil can be fully acted on the inflamed area of the intestine, and even improve the structural stability and storage stability of liposomes to include the active substance in liposomes. It can induce the release of the active substance at a location. Outside the above range, phosphatidylcholine may be dissolved in krill oil to reduce the effect of filling the damaged membrane area, or a problem that structural stability may deteriorate during storage, gastrointestinal system, and lyophilization of liposomes.

크릴 오일은 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부에 대하여 상기 6 내지 40중량부로 포함될 수 있고, 바람직하게는 10 내지 35중량부, 보다 바람직하게는 10 내지 30중량부 포함될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 15 내지 25중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 크릴오일 함량이 상기 범위를 초과하여 과다하게 포함되는 경우, 지질이 크릴 오일에 용해되어 지질 응집체가 형성되고, 리포좀이 형성되지 않는다.Krill oil may be included in the above 6 to 40 parts by weight based on 23 to 32 parts by weight of phosphatidylcholine, preferably 10 to 35 parts by weight, more preferably 10 to 30 parts by weight, more preferably 15 to 25 parts by weight It may be included by weight, but is not limited thereto. When the krill oil content is excessively included beyond the above range, lipids are dissolved in krill oil to form lipid aggregates, and liposomes are not formed.

본 발명에서 리포좀은 세포막과의 형태적 유사성이 있어 세포 내로의 흡수가 용이하며, 본 발명의 리포좀의 경우 전하를 띠는 성분을 포함한 크릴오일이 포스파티딜콜린 사이에 개재되어 있음으로써 염증 부위와 정전기적 인력을 통해 항염, 항산화 효과를 가진 리포좀이 염증 부위에 축적 및 흡수되기 용이할 수 있다. 본 발명의 리포좀은 1겹, 2겹 또는 3겹 또는 그 이상으로 겹겹이 층을 이룰 수 있으며, 층이 많아질수록 리포좀 내 활성 성분을 포함시킬 경우 이의 배출을 효과적으로 제어할 수 있는 이점이 있을 뿐만 아니라, 리포좀 자체적으로 항염, 항산화효과를 갖기 때문에 적은 층으로 둘러 쌓여있을때 보다 항염, 항산화 효과가 더욱 향상되는 효과가 발생할 수 있다.In the present invention, the liposome has a morphological similarity with the cell membrane, so it is easily absorbed into the cell, and in the case of the liposome of the present invention, krill oil containing a charged component is interposed between phosphatidylcholine, and thus an inflammatory site and electrostatic attraction. Through it, liposomes having anti-inflammatory and antioxidant effects may be easily accumulated and absorbed in the inflammatory site. The liposomes of the present invention can form a single layer, two layers, or three layers or more layers, and as the number of layers increases, the inclusion of the active ingredient in the liposomes has the advantage of effectively controlling the discharge thereof. , Since liposomes have anti-inflammatory and anti-oxidant effects, the anti-inflammatory and anti-oxidant effects can be improved even more when surrounded by a small layer.

포스파티딜콜린은 탄소수가 5 내지 30개, 바람직하게는 탄소수가 12 내지 22개이면서 상전이온도가 실온 이하여서 실온에서 유동성이 우수한 PC가 바람직하나, 이로 제한되지는 않는다.Phosphatidylcholine is preferably a PC having 5 to 30 carbon atoms, preferably 12 to 22 carbon atoms, and having a phase transition temperature of less than or equal to room temperature, and thus excellent fluidity at room temperature, but is not limited thereto.

포스파티딜콜린의 예로는 난황 레시틴, 대두레시틴, 리소레시틴 등의 천연 레시틴; 및 디스테아로일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜콜린 등의 합성지질 중에서 한쪽 사슬에 이중 결합이 1개 이상 존재하는 PLPC(1-팔미토일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-palmitoyl2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SLPC(1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-포스포콜린, 1-stearoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-phosphocholine), SAPC(1-스테아로일-2-아랑키도노일-sn-글리세로-포스포콜린, 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-phosphocholine) 등을 들 수 있다.Examples of phosphatidylcholine include natural lecithin such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, and lysolecithin; And one or more double bonds on one chain among synthetic lipids such as distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, and eleostearoylphosphatidylcholine (1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero) -3-phosphocholine, 1-palmitoyl2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), SLPC (1-stearoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-phosphocholine, 1-stearoyl-2 -linoleoyl-sn-glycero-phosphocholine), SAPC (1-stearoyl-2-arancidonoyl-sn-glycero-phosphocholine, 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-phosphocholine), etc. Can be lifted.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 포스파티딜콜린은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DMPC), 1,2-디펙사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DHPC), 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DHPC), 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,2-dinonanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-diundecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilauroyl-snglycero-3-phosphocholine, DLPC), 1,2-디트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-ditridecanoyl-snglycero-3-phosphocholine), 1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero3-phosphocholine), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2-디노나 데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디아라키도일-sn글리세로-3-포스포콜린(1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디헤나라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디트리코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-ditricosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 하이드로제네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine) 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.According to an embodiment of the present invention, phosphatidylcholine is 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine, DMPC), 1, 2-dipexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dihexanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DHPC), 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phos Phocholine (1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DHPC), 1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dioctanoyl-sn-glycero-3 -phosphocholine, 1,2-dinonanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ), 1,2-diundecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-diundecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-dilauroyl-sn-glycero -3-phosphocholine (1,2-dilauroyl-snglycero-3-phosphocholine, DLPC), 1,2-ditridecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-ditridecanoyl-snglycero- 3-phosphocholine), 1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dipentadecanoyl-sn-glycero3-phosphocholine), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero -3-phosphocholine (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-diheptadecanoyl- sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 1,2- Dino Decanoyl-sn-Written Lycero-3-phosphocholine (1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-diarachidoyl-snglycero-3-phosphocholine (1,2-diarachidoyl-sn -glycero-3-phosphocholine), 1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dihenarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-dibehe Noyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dibehenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-ditricosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1, 2-ditricosanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-dilignoseroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (1,2-dilignoceroyl-sn-glycero-3-phosphocholine), hydro It may be at least one selected from the group consisting of a phosphatidylcholine (hydrogenated phosphatidylcholine) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC).

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 리포좀 내 활성 성분을 포함할 경우, 이의 저장 안정성 및 리포좀의 구조 안정성 향상을 위해, 포스파티딜콜린은 eggPC, soyPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC), hydrogenated eggPC, hydrogenated soyPC, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC), 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DMPC) 및 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 더 구체적인 일 실시예에 따르면, 포스파티딜콜린은 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC)일 수 있다. DOPC를 포스파티딜콜린으로 사용할 경우 활성 성분의 저장 안정성이 매우 우수하다.According to a specific embodiment of the present invention, when including the active ingredient in the liposome, to improve its storage stability and structural stability of the liposome, phosphatidylcholine is eggPC, soyPC, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), hydrogenated eggPC, hydrogenated soyPC, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2-dimyristoyl- sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC). According to a more specific embodiment, the phosphatidylcholine may be 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC). When DOPC is used as phosphatidylcholine, the storage stability of the active ingredient is very good.

크릴은 새우처럼 생긴 갑각류로, 남극해에서 시식하며 식물성 플랑크톤을 먹고 생활한다. 상기 크릴로부터 오일을 얻을 수 있는데, 상기 오일에는 오메가-3-지방산 (예컨대, DHA, EPA가 포스파티딜콜린의 머리그룹에 결합되어 있는 형태), 아스타잔틴, 비타민 A 및 E가 포함되어 있다. 상기 물질들은 항염증 효과, 항산화 효과를 지니고 있어, 염증 부위에 작용 시 염증 완화 효과를 가져올 수 있다. 다만, 크릴오일을 단순 섭취할 경우, 염증 부위로의 전달이전에 화학적으로 불안정화되거나 위장관액내에서 에 의해 자가형성된 크릴오일의 에멀젼이 응집되어 염증완화효과가 크게 감소할 수 있다. 그러나, 리포좀을 이용할 경우 인지질의 종류에 따라 타겟 염증부위에서 선택적으로 흡수를 유도하여 염증 부위로의 전달률을 크게 향상시킴과 동시에 PC와 크릴오일이 동시 전달됨에 의해 PC의 장점막 장벽능 수복 효과와 크릴오일의 항염효과가 동시에 발휘되어 염증완화 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 오메가-3-지방산을 리포좀에 삽입시키는 경우 구조적 불안정성을 초래할 수 있어 이러한 동반효과를 기대하기 어려우나, 본 발명의 리포좀의 일부를 크릴오일로 형성시키는 경우 위장관내 불안정화가 현저히 감소되어 크릴오일이 온전히 염증부위에서 항염, 항산화 작용할 수 있다.Krill is a shrimp-like crustacean, tasting in the Antarctic Ocean and eating phytoplankton. Oil can be obtained from the krill, which includes omega-3-fatty acids (e.g., DHA, EPA in a form bound to the phosphatidylcholine head group), astaxanthin, vitamins A and E. The substances have anti-inflammatory and antioxidant effects, and may have an effect of alleviating inflammation when acting on an inflammatory site. However, when simple intake of krill oil, chemically destabilized before delivery to the site of inflammation, or emulsions of krill oil self-formed by in the gastrointestinal tract can be aggregated, thereby significantly reducing inflammation. However, when liposomes are used, the absorption rate at the target inflammatory site is selectively induced depending on the type of phospholipids, thereby significantly improving the transfer rate to the inflammatory site, and at the same time, PC and krill oil are simultaneously delivered, thereby improving the membrane barrier function and krill of PC. The anti-inflammatory effect of oil can be exerted at the same time, greatly improving the anti-inflammatory effect. When omega-3-fatty acid is inserted into liposomes, it may cause structural instability, so it is difficult to expect such an accompanying effect, but when a part of the liposomes of the present invention is formed with krill oil, destabilization in the gastrointestinal tract is significantly reduced, and krill oil is completely inflamed. It can act as an anti-inflammatory and antioxidant at the site.

전술한 오메가-3-지방산은 오메가-3 지방산, ω-3 지방산 또는 N-3 지방산이라고도 불리며, 탄소 사슬의 끝에서 세 번째 탄소에서부터 이중 결합(C=C)이 시작되는 필수 불포화 지방산이다. 본원에서 지칭하는 오메가-3-지방산은 지방산 사슬 n (1 이상의 정수)가닥일 수 있고, 지방산 3개가 글리세롤에 결합되어 있는 트리글리세라이드 형태일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 오메가-3-지방산은 오메가-3 지방산 3개가 글리세롤에 결합되어 있는 트리글리세라이드 형태일 수 있다. 후술하는 EPA, DHA, ALA 또한 지방산 1가닥 또는, EPA, DHA, ALA 각각의 3가닥이 글리세롤에 결합되어 있는 트리글리세라이드 형태일 수 있다 (즉, EPA 3가닥과 글리세롤, DHA 3가닥과 글리세롤, ALA 3가닥과 글리세롤). 또는 EPA, DHA 및 ALA 중 어느 2 또는 3개가 혼용되어 글리세롤에 결합되어 있는 형태일 수 있다.The aforementioned omega-3-fatty acid is also called omega-3 fatty acid, ω-3 fatty acid or N-3 fatty acid, and is an essential unsaturated fatty acid in which a double bond (C=C) starts from the third carbon at the end of the carbon chain. The omega-3-fatty acid referred to herein may be a fatty acid chain n (an integer greater than or equal to 1) strand, and may be in the form of triglycerides in which three fatty acids are attached to glycerol. According to an embodiment of the present invention, omega-3-fatty acid may be in the form of triglycerides in which three omega-3 fatty acids are attached to glycerol. EPA, DHA, and ALA, which will be described later, may also be in the form of triglycerides in which one strand of fatty acids or three strands of EPA, DHA, and ALA are attached to glycerol (i.e., three strands of EPA and glycerol, three strands of DHA and glycerol, ALA 3 strands and glycerol). Or, any two or three of EPA, DHA, and ALA may be mixed to be bound to glycerol.

오메가-3-지방산은 항염증 효과를 가져 염증성 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있는 물질이나, 이의 화학적 안정성, 염증부위 도달 및 항염효과를 증가시키기 위한 방안으로 리포좀에 삽입 시 리포좀의 곡률 스트레스(curvature stress)를 증가시켜 상기 지방산 삽입 리포좀이 응집 및 융합되는 문제가 발생한다. 그러나, 크릴오일의 경우에서처럼 대부분의 오메가-3-지방산이 포스파티딜콜린의 머리그룹에 결합되어 있는 형태로 존재하는 경우 리포좀에 삽입 시에는 리포좀의 응집·융합 현상이 발생하지 않고, 리포좀의 구조적 안정화를 도모할 수 있고, 이를 통해 리포좀에 포집된 활성 물질이 타겟 부위가 아닌 부위에서의 방출을 방지할 수 있어 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료의 효과 발생을 극대화 시킬 수 있다. 또한, 오메가-3-지방산이 포스파티딜콜린의 머리그룹에 붙어있음으로써 리포좀을 형성하는 포스파티딜콜린 사이에 곡률스트레스 유발없이 위치할 수 있으며 (도 2), 포스파티딜콜린에 결합되어 있음에 따라 염증 부위로의 흡수 용이성을 크게 증가시키는 효과도 가져올 수 있다. 즉, 염증 부위로의 흡수 용이성을 증진시킴으로써 염증 완화 효과를 극대화할 수 있다. 본 발명에서 오메가-3-지방산으로는 Eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA) 또는 Alpha-linolenic acid (ALA) 등을 들 수 있다.Omega-3-fatty acid has an anti-inflammatory effect and can prevent, treat, or improve inflammatory diseases.However, as a way to increase its chemical stability, reach to inflammatory sites and increase anti-inflammatory effects, the curvature stress of liposomes when inserted into liposomes ( Curvature stress) is increased to cause the fatty acid insertion liposomes to aggregate and fuse. However, as in the case of krill oil, when most omega-3-fatty acids are present in a form bound to the head group of phosphatidylcholine, aggregation and fusion of liposomes does not occur when inserted into liposomes, and structural stability of liposomes is promoted. Through this, it is possible to prevent the release of the active substance trapped in the liposome at a site other than the target site, thereby maximizing the occurrence of the effect of preventing, improving or treating inflammatory bowel disease. In addition, the omega-3-fatty acid is attached to the head group of phosphatidylcholine so that it can be located without causing curvature stress between phosphatidylcholines forming liposomes (FIG. 2), and as it is bound to phosphatidylcholine, it is easy to absorb into the inflammatory site. It can also have a greatly increasing effect. That is, it is possible to maximize the effect of alleviating inflammation by enhancing the ease of absorption into the inflammatory site. The omega-3-fatty acid in the present invention includes Eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA) or Alpha-linolenic acid (ALA).

전술한 아스타잔틴, 비타민 A 및 E는 강력한 항산화 기능을 가지고 있어 염증 부위에 작용 시 염증을 완화시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 오메가-3-지방산만 리포좀에 포함된 경우에 비해 아스타잔틴, 비타민 A 및 E이 더 포함되어 있는 크릴오일이 리포좀에 포함된 경우 항염증 약물인 부데소니드의 봉입효율이 높고 봉입에 의한 리포좀의 크기 변화가 적어 리포좀의 구조적 안정성이 향상된 것으로 나타나 (표 1), 아스타잔틴, 비타민 A 및 E는 리포좀의 구조적 안정성을 향상시키는 요인으로도 역할하는 것으로 보인다. 다만, 본 이론으로 한정하여 해석되지 않고, 다른 이론이 있는 경우 그로도 본 실시예가 설명될 수 있다.The above-mentioned astaxanthin, vitamins A and E have strong antioxidant properties, so that they can alleviate inflammation when acting on the inflammatory site. In addition, according to an embodiment of the present invention, compared to the case where only omega-3-fatty acid is contained in the liposome, when the krill oil containing astaxanthin, vitamins A and E is further included in the liposome, the anti-inflammatory drug budesonide It has been shown that the encapsulation efficiency is high and the size of liposomes is small due to encapsulation, resulting in improved structural stability of liposomes (Table 1), and astaxanthin, vitamins A and E appear to also play a role in improving the structural stability of liposomes. . However, it is not limited to the present theory and is interpreted, and if there is another theory, the present embodiment may be described.

본 발명에서 염증성 장 질환 (Inflammatory bowel disease, IBD)은 통증, 출혈 및 설사의 증상을 갖는 위장관의 전형적인 만성 염증성 질환으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, IBD는 궤양염 (ulcerative colitis, UC) 또는 크론병 Crohn's disease, CD)일 수 있다.Inflammatory bowel disease (IBD) in the present invention is a typical chronic inflammatory disease of the gastrointestinal tract with symptoms of pain, bleeding, and diarrhea. According to an embodiment of the present invention, IBD is ulcerative colitis (UC). Or Crohn's disease (CD).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 포스파티딜콜린 사이에 스테롤계 화합물 또는 토코페롤이 더 개재될 수 있다. 스테롤계 화합물 또는 토코페로를 리포좀 내로 함유할 경우 리포좀의 구조를 더욱 안정화시킬 수 있어, 구조 안정성, 저장 안정성을 향상시킬 수 있다.According to an embodiment of the present invention, a sterol-based compound or tocopherol may be further interposed between phosphatidylcholines. When the sterol-based compound or tocophero is contained in the liposome, the structure of the liposome can be further stabilized, thereby improving structural stability and storage stability.

스테롤계 화합물은 콜레스테롤, 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바밀}콜레스테롤(3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-cabamyl]cholesterol, DC-Chol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 캄페스테롤 (campesterol), 시토스테롤(sitosterol), 에르고스테롤(ergosterol), 라노스테롤(lanosterol), 디노스테롤 (dinosterol), 고르고스테롤(gorgosterol), 아베나스테롤(avenasterol), 사린고스테롤(saringosterol), 퓨코스테롤(fucosterol), 콜레스테릴 헤미석시네이트(cholesteryl hemisuccinate), 콜레스테릴 벤조에이트 (cholesteryl benzoate), 콜레스테릴 올레이트(cholesteryl oleate), 콜레스테릴 올레일 카보네이트 (cholesteryl oleyl carbonate), 콜레스테릴 이소스테아레이트(cholesteryl isostearate), 콜레스테릴 리놀레 이트(cholesteryl linoleate), 콜레스테릴 아세테이트(cholesteryl acetate), 콜레스테릴 팔미테이트 (cholesteryl palmitate), 콜레스테릴 스테아레이트(cholesteryl stearate), 콜레스테릴 클로라이드 (Cholesteryl chloride), 콜레스테릴 노나노에이트(Cholesteryl nonanoate) 및 콜레스테릴 아라키도네이트 (Cholesteryl arachidonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 스테롤계 화합물은 콜레스테롤일 수 있다.The sterol-based compound is cholesterol, 3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamil} cholesterol (3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethane)-cabamyl]cholesterol, DC-Chol ), stigmasterol, campesterol, sitosteol, ergosterol, lanosterol, dinosterol, gorgosterol, avenasterol, Saringosterol, fucosterol, cholesteryl hemisuccinate, cholesteryl benzoate, cholesteryl oleate, cholesteryl oleate Cholesteryl oleyl carbonate, cholesteryl isostearate, cholesteryl linoleate, cholesteryl acetate, cholesteryl palmitate, cholesteryl palmitate It may be at least one selected from the group consisting of cholesteryl stearate, cholesteryl chloride, cholesteryl nonanoate and cholesteryl arachidonate. . According to a specific embodiment of the present invention, the sterol-based compound may be cholesterol.

토코페롤은 비타민 E 활동성을 가지는 화합물의 일종으로, 토코페롤에는 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤 등이 있으며, 천연 토코페롤뿐만 아니라 합성 토코페롤도 포함할 수 있다.Tocopherol is a type of compound having vitamin E activity, and tocopherol includes alpha-tocopherol, beta-tocopherol, gamma-tocopherol, delta-tocopherol, and may include not only natural tocopherol, but also synthetic tocopherol.

구체적인 실시예에 따르면, 스테롤계 화합물 및 토코페롤이 본 발명의 리포좀에 포함될 수 있으며, 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부, 스테롤계 화합물 0.4 내지 2중량부 및 토코페롤 0.2 내지 1.5중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부, 스테롤계 화합물 0.8 내지 1.4중량부 및 토코페롤 0.6 내지 1.2중량부로 포함될 수 있다.According to a specific embodiment, the sterol-based compound and tocopherol may be included in the liposome of the present invention, phosphatidylcholine 23 to 32 parts by weight, sterol-based compound 0.4 to 2 parts by weight, and tocopherol 0.2 to 1.5 parts by weight may be included, preferably Phosphatidylcholine may be included in 23 to 32 parts by weight, 0.8 to 1.4 parts by weight of the sterol-based compound, and 0.6 to 1.2 parts by weight of tocopherol.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 포스파티딜콜린 사이에 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나가 더 개재될 수 있다. 또한, 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항체 중 수용성 물질의 경우는 리포좀의 내부 수상에 포함될 수도 있다.According to an embodiment of the present invention, at least one selected from the group consisting of immunosuppressants, anti-inflammatory agents, steroids, immunomodulators, cytokines, and tumor necrosis factor (TNF) antagonists between phosphatidylcholines. Can be intervened. In addition, in the case of water-soluble substances among immunosuppressants, anti-inflammatory agents, steroids, immunomodulators, cytokines, and tumor necrosis factor (TNF) antagonists, they may be included in the internal aqueous phase of liposomes.

상기 면역억제제는, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 시클로스포린, 타크롤리무스(Tacrolimus) (FK506), 라파미신, 및 미오페놀레이트모페틸로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.The immunosuppressive agent may be selected from the group consisting of azathioprine, methotrexate, cyclosporine, tacrolimus (FK506), rapamicin, and myophenolate mofetil.

상기 항-염증제는, 부데소니드, 5-아미노살리실산, 설파살라진, 및 올살라진으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.The anti-inflammatory agent may be selected from the group consisting of budesonide, 5-aminosalicylic acid, sulfasalazine, and olsalazine.

상기 스테로이드는, 코르티코스테로이드류, 글루코코르티코스테로이드류, 프레드니손, 프레드니솔론, 하이드로코르티손, 메틸프레드 니솔론, 덱사메타손, 및 아드레노코르티코트로픽 호르몬(Adrenocorticotropic hormone)(ACTH)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.The steroid may be selected from the group consisting of corticosteroids, glucocorticosteroids, prednisone, prednisolone, hydrocortisone, methylpred nisolone, dexamethasone, and adrenocorticotropic hormone (ACTH).

상기 면역조절제는, 디글리코리피드된, 디글리코리피드된 마이코박테리움바캐 (deglycolipidated, deglycolipidated Mycobacterium vcacce)(PVAC), 항-종양괴사인자 수용체 상과 요소 5(항-CD40) 리간드, 항-종양괴사인자 수용체 상과 요소 5 (항-CD40), 나탈리주마브, 항-맥관유착분자-1(항-VCAM1) 및 항-세포간유착분자-1(항-ICAM1)로 구성 되는 군으로부터 선택될 수 있다.The immunomodulators are diglycolipid, deglycolipidated, deglycolipidated Mycobacterium vcacce (PVAC), anti-tumor necrosis factor receptor superfamily factor 5 (anti-CD40) ligand, anti-tumor Necrosis factor receptor superfamily 5 (anti-CD40), Natalizumab, anti-angiogenic molecules-1 (anti-VCAM1) and anti-intercellular adhesion molecule-1 (anti-ICAM1) Can.

상기 사이토카인은, 인터류킨-10(IL-10)인, 조성물. 청구항 15 제 9항에 있어서, 상기 종양괴사인자(TNF) 길항체는, 인플리시마브, 에타너셉트, 아달리무마브, 및 세르톨리주마브패골(Certolizumab Pegol)(CDP870)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.The cytokine is interleukin-10 (IL-10), composition. 15. The method of claim 9, wherein the tumor necrosis factor (TNF) antagonist is selected from the group consisting of infliximab, etanercept, adalimumab, and Certolizumab Pegol (CDP870). Can.

상기 외에도 포스파티딜콜린 사이에 항산화 또는 항염증 작용이 있는 것으로 공지된 성분들이 더 포함될 수 있다. 예를 들면 커큐민, 코엔자임 큐텐, 레스베라트롤, 비타민A,quercetin,astaxanthin, 비타민 E, 베타카로텐, 루테인,lycopene, 플라보노이드, 카테킨, 이소플라본 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition to the above, components known to have an antioxidant or anti-inflammatory action between phosphatidylcholines may be further included. Examples include, but are not limited to, curcumin, coenzyme cutene, resveratrol, vitamin A, quercetin, astaxanthin, vitamin E, beta-carotene, lutein, lycopene, flavonoids, catechins, isoflavones, and the like.

본 발명의 일 실시예에 따른 리포좀은 그 표면에 장용성 코팅층을 더 포함할 수 있다.The liposome according to an embodiment of the present invention may further include an enteric coating layer on its surface.

장용성 코팅층은 장용성 고분자를 포함하는 것일 수 있다. 용어 "장용성 고분자(enteric polymer)"는 위 내용물들(gastric contents)로부터 리보좀을 보호하는 고분자, 예를들면 산성 pH에서 안정한 고분자, 그러나 더 높은 pH에서는 빠르게 분해할 수 있는 고분자 또는 그것의 수화(hydration) 또는 부식(erosion)의 속도가, 상기 소화 효소들과 위 내용물들(gastric contents)의 접촉이, 위장관(gastro-intestinal tract)의 잔부에 대하여 반대되는 바로서, 그것이 상기 위 내부에 있는 동안 상대적으로 미미한 것을 보장하기에 충분히 느린 고분자를 의미한다.The enteric coating layer may include an enteric polymer. The term “enteric polymer” refers to a polymer that protects ribosomes from gastric contents, for example a polymer that is stable at acidic pH, but a polymer that can degrade rapidly at higher pH or its hydration. ) Or the rate of erosion, as the contact of the digestive enzymes with gastric contents is opposite to the remainder of the gastro-intestinal tract, it is relative while inside the stomach It means a polymer that is slow enough to ensure that it is insignificant.

장용성 고분자들의 비-제한적인 예들은, 본 기술 분야에서 알려져 있는 것들, 예를 들면 변형된 또는 비변형된 자연적 고분자들, 예를 들면 셀룰로오스 프탈산 아세테이트(cellulose acetate phthalate), 하이드록시프로필 메틸룰로오스 프탈레이트(hydroxypropyl methylcellulose phthalate), 하이드록시프로필 메틸룰로오스 숙신산 아세테이트(hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate), 및 셀락(shellac); 또는 합성 고분자들, 예를 들면 아크릴성 중합체들 또는 공중합체들(acrylic polymers or copolymers), 메타크릴산 중합체들 및 공중합체들(methacrylic acid polymers and copolymers), 메틸메타크릴레이트 공중합체들(methylmethacrylate copolymers), 및 메타크릴산/메틸메타크릴레이트 공중합체들(methacrylic acid/methylmethacrylate copolymers) (예를들면, EUDRAGIT® L 또는 S)을 포함한다.Non-limiting examples of enteric polymers are those known in the art, such as modified or unmodified natural polymers, such as cellulose acetate phthalate, hydroxypropyl methylcellulose Hydroxypropyl methylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, and shellac; Or synthetic polymers, for example acrylic polymers or copolymers, methacrylic acid polymers and copolymers, methylmethacrylate copolymers ), and methacrylic acid/methylmethacrylate copolymers (e.g., EUDRAGIT® L or S).

장용성 코팅층의 두께는 예를 들면 10 ㎛ 내지 800 ㎛, 구체적으로, 10 ㎛ 내지 500 ㎛, 10 ㎛ 내지 300 ㎛일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The thickness of the enteric coating layer may be, for example, 10 μm to 800 μm, specifically, 10 μm to 500 μm, 10 μm to 300 μm, but is not limited thereto.

본 발명의 리포좀은 구조적 안정성이 뛰어나기 때문에 동결건조가 가능하며, 동결건조 후 사용 시 재수화시키더라도 리포좀 내 내재되어 있는 활성 물질 또는 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항체 등의 방출 조절능이 감소되지 않을 수 있다.Since the liposome of the present invention has excellent structural stability, lyophilization is possible, and the active substance or immunosuppressive agent, anti-inflammatory agent, steroid, immunomodulatory agent, cytokine, and cytokine that are inherent in the liposome even when rehydrated after use after lyophilization The ability to regulate the release of tumor necrosis factor (TNF) antagonists may not be reduced.

본원 명세서 내"예방"은 동물의 병리학적 세포의 발생 또는 세포의 손상, 소실의 정도의 감소를 의미한다. 예방은 완전 할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생 또는 신경세포의 사멸이 나 손실 등이 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미 할 수 있다. 또한, 본원 명세서 내 "치료"는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일 시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 즉, 상기 치료는 상기 약학 조성물에 의해 염증성 장질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포괄하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다."Prevention" as used herein refers to a decrease in the degree of pathogenesis or damage or loss of cells in an animal. Prevention can be complete or partial. In this case, the occurrence of pathological cells in the individual or the death or loss of neurons, etc. may mean a phenomenon that is reduced compared to a case in which a composition for preventing or treating inflammatory bowel disease is not used. In addition, "treatment" in the present specification refers to all acts of clinical intervention in order to change the natural process of a subject or cell to be treated, and may be performed during or while preventing a clinical pathology. The desired therapeutic effect prevents the occurrence or recurrence of the disease, alleviates symptoms, reduces all direct or indirect pathological consequences of the disease, prevents metastasis, reduces the rate of disease progression, or disease It may include alleviating or temporarily alleviating the condition, or improving the prognosis. That is, the treatment may be interpreted as encompassing all actions in which symptoms of inflammatory bowel disease are improved or cured by the pharmaceutical composition, but is not particularly limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 염증성 장질환은 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 장형 베체트병 (intestinal Bechet's disease)으로 구성된 군으로부터 하나 이상인 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.According to an embodiment of the present invention, the inflammatory bowel disease may be one or more from the group consisting of Chron's disease, ulcerative colitis and intestinal Bechet's disease, but is not limited thereto. .

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 염증성 장질환 치료용 약학 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 즉, 상기 염증성 장질환 치료용 약학 조성물은 전신 또는 국소 투여할 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비 경구 투여를 포함할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있다. 상기 염증성 장질환 치료용 약학 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 염증성 장질환 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다. 상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 적소두 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다. 상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.According to one embodiment of the invention, the pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory bowel disease may be administered in the form of oral delivery, parenteral delivery. That is, the pharmaceutical composition for treating inflammatory bowel disease may be administered systemically or topically, and the administration may include oral administration and non-oral administration. The parenteral method of administration is not limited to this, but intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration. Can. The pharmaceutical composition for treating inflammatory bowel disease may be formulated with an appropriate amount of a pharmaceutically acceptable vehicle or carrier to provide an appropriate dosage form. Therefore, the pharmaceutical composition for treating inflammatory bowel disease may further include a carrier, excipients and diluents used in the manufacture of pharmaceutical compositions. The carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil, but is not limited thereto. In addition, the composition may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions. The solid preparation for oral administration includes tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparation includes at least one excipient in the red bean extract and its fractions, such as starch, calcium carbonate, sucrose, It can be prepared by mixing lactose, gelatin, or the like. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to the excipients. As a liquid preparation for oral administration, a suspension, an intravenous solution, an emulsion, and a syrup may be used. In addition to simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, may be included. have. The formulation for parenteral administration may be a sterilized aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, a lyophilized preparation, or a suppository, but is not limited thereto. As the non-aqueous solvent and suspension agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used. As a base for the suppository, witepsol, macrogol, tween61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used, but is not limited thereto.

본 발명의 다른 측면은 다른 양태로 전술한 리포좀을 함유하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a health functional food for preventing or improving inflammatory bowel disease containing the liposome described above in another aspect.

상기 건강기능식품은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미할 수 있으며, 상기 기능성은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조 절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미할 수 있으나, 건강의 개선을 위한 목적으로 섭취하는 식품이라면 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다.The health functional food may refer to food manufactured and processed using ingredients or ingredients having useful functionality for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6727, and the functionality is a nutrient for the structure and function of the human body It may mean to ingest for the purpose of obtaining a useful effect for health purposes such as adjusting or physiological action, but the type of food ingested for the purpose of improving health is not particularly limited.

일 실시예에 있어서, 상기 건강기능식품은 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 건강보조식품은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 엑스, 또는 음료 등으로 제조될 수 있으며, 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제는 당해 기술분야 에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.In one embodiment, the dietary supplement may be prepared in any one formulation selected from the group consisting of tablets, granules, powders, capsules, liquid solutions and pills. For example, the dietary supplement may be prepared as a powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, liquid, ex, tea, jelly, ex, or beverage, and the food acceptable carrier or additive Any carrier or additive known to be usable in the art may be used.

상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 식품 첨가물은 다른 규정이 없는 한 식품의 약품 안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 적합성 여부를 판단할 수 있다. 상기 식품 첨가물 공전에 기재된 품목은 예컨대 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연 첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류를 들 수 있다. 상기 건강기능식품은 면역결핍질환, 세균성 및 바이러스성 감염 질환, 종양 등을 포함하는 면역 관련 질환 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있다.The dietary supplement may include ordinary food additives, and the food additives are in accordance with the standards and standards related to the food additives according to the General Regulations and General Test Methods of Food Additives approved by the Food and Drug Administration unless otherwise specified. The suitability can be judged. Items described in the food additives revolution include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamonic acid, natural additives such as licorice extract, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigments, guar gum, L-sodium glutamate preparation, and noodles And mixed preparations such as added alkalis, preservatives, and tar colorants. The health functional food may be variously used in foods and beverages for preventing or improving immune-related diseases including immunodeficiency diseases, bacterial and viral infection diseases, tumors, and the like, and various foods, beverages, gums, teas, and vitamins It can be used in combinations, health functional supplements, and food additives.

또한, 본 발명은 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료용 리포좀의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preparing liposomes for preventing, improving or treating inflammatory bowel disease.

본 발명의 제조방법은 포스파티딜콜린 23 내지 32 중량부에 대하여 상기 크릴오일을 6 내지 40 중량부를 혼합하는 단계를 포함한다. 포스파티틸 콜린과 크릴오일은 전술한 바와 같으며, 상기 비율로 크릴오일과 포스파티딜콜린이 포함되면, 크릴오일의 항염효과, 항산화효과가 온전히 장 내 염증부위에서 작용될 수 있으며, 제조된 리포좀의 구조 안정성 및 저장 안정성을 향상시켜 활성 물질을 리포좀의 리포좀에 포함하더라도 목적하는 위치에서 상기 활성 물질의 방출을 유도할 수 있다. 상기 범위를 벗어나면, 크릴오일 내 포스파티딜콜린이 녹아버리거나, 제조된 리포좀에 구조적으로 이상이 생겨 리포좀이 끈적끈적해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.The manufacturing method of the present invention includes the step of mixing 6 to 40 parts by weight of the krill oil with respect to 23 to 32 parts by weight of phosphatidylcholine. Phosphatidyl choline and krill oil are the same as described above, and when krill oil and phosphatidylcholine are included in the above ratio, the anti-inflammatory and antioxidant effects of krill oil can be fully acted on the inflammatory site in the intestine, and the structure of the prepared liposome By improving the stability and storage stability, even if the active substance is included in the liposome of the liposome, it is possible to induce the release of the active substance at a desired position. If it is out of the above range, problems such as phosphatidylcholine in the krill oil may be dissolved, or a structural abnormality may occur in the prepared liposome, such that the liposome becomes sticky.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 포스파티딜콜린 23 내지 32중량부, 스테롤계 화합물 0.4 내지 2중량부 및 토코페롤 0.2 내지 1.5중량부를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 범위 내로 포함 시 제조된 리포좀의 구조 안정성 및 저장 안정성이 더욱 향상될 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the phosphatidylcholine may include mixing 23 to 32 parts by weight, 0.4 to 2 parts by weight of a sterol-based compound, and 0.2 to 1.5 parts by weight of tocopherol. When included within the above range, structural stability and storage stability of the prepared liposomes may be further improved.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 부데소니드를 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 부데소니드를 리포좀에 함유할 경우 염증성 장 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 리포좀 자체의 것에 비해 더욱 향상될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the step of mixing budesonide may be further included. When the budesonide is contained in the liposome, the prevention, improvement, or treatment effect of inflammatory bowel disease may be further improved compared to that of the liposome itself.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 리포좀을 동결건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 리포좀은 구조적 안정성이 뛰어나기 때문에 동결건조가 가능하며, 동결건조 후 사용 시 재수화시키더라도 리포좀 내 내재되어 있는 활성 물질의 방출에 영향이 미미할 수 있어 동결건조 공정을 거칠 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the liposome may further include a step of lyophilization. The liposomes prepared by the preparation method of the present invention have excellent structural stability, and thus can be freeze-dried. Even after re-hydration after lyophilization, the effect of the release of the active substance contained in the liposomes may be minimal, and thus the freeze-drying process is performed. It can be rough.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. Hereinafter, examples will be described in detail to specifically describe the present invention.

실시예Example 1. One. 리포좀의Liposome 제조 Produce

3차 부틸 알코올에 PC, 콜레스테롤 및 알파 토코페롤을 적당한 중량비로 혼합하고 이에 a-linolenic acid (ALA, 18:3n-3), 피쉬 유래의 eicosapentaenoic acid(EPA, 20:5n-3), docosahexaenoic acid(DHA, 22:6n-3 또는 크릴 오일 등의 오메가-3-지방산을 섞어 모두 용해시켜 혼합용액을 얻었다. 이를 신속히 -80℃에서 얼리고, 동결건조기(EYELA FDU-1200, 일본)에서 동결 건조를 시행하였다. 24시간 동안 동결 건조하여 지질 파우더의 케이크를 얻었다. 얻은 케이크에 5% 덱스트로오스 1 ml을 가해 수화시켰다. 3,000 rpm에서 30초 교반하여 수화에 의해 자발적으로 형성된 리포좀 분산액을 37℃에서 1시간 동안 수조 형식의 초음파 분산기에서 130 W로 균질화, 다시 수조 형식의 세포 파쇄용 초음파 분산기 (Bioruptor)에서 7 분간 250 W 세기의 초음파 처리하여 오메가-3-지방산 또는 크릴 오일이 삽입된 리포좀을 얻었다.PC, cholesterol and alpha tocopherol are mixed in tertiary butyl alcohol in a suitable weight ratio, and a-linolenic acid (ALA, 18:3n-3), eicosapentaenoic acid from fish (EPA, 20:5n-3), docosahexaenoic acid ( Omega-3-fatty acids such as DHA, 22:6n-3 or krill oil were mixed and dissolved to obtain a mixed solution, which was quickly frozen at -80°C and freeze-dried in a freeze dryer (EYELA FDU-1200, Japan). Freeze-dried for 24 hours to obtain a cake of lipid powder Hydrated by adding 1 ml of 5% dextrose to the obtained cake, stirred for 30 seconds at 3,000 rpm and the liposome dispersion spontaneously formed by hydration at 37°C 1 Homogenization at 130 W in a water tank type ultrasonic disperser for a period of time, followed by ultrasonic treatment at 250 W intensity for 7 minutes in a water tank type ultrasonic disperser (Bioruptor) to obtain liposomes containing omega-3-fatty acid or krill oil.

실시예Example 2. 제조한 2. Manufactured 리포좀의Liposome 물성 분석 Physical property analysis

제조한 리포좀의 평균입자경을 fiber-optics particle analyzer(FPAR-1000, Otsuka Electronics, Japan)를 이용하여 동적광산란법으로 측정하였다. 측정 전 샘플을 여과한 5% 덱스트로스 용액으로 100배 희석하였다. The average particle diameter of the prepared liposomes was measured by a dynamic light scattering method using a fiber-optics particle analyzer (FPAR-1000, Otsuka Electronics, Japan). Before measurement, the sample was diluted 100-fold with a filtered 5% dextrose solution.

리포좀의 표면 하전값의 척도가 되는 제타 전위는 리포좀 분산액 소량을 탈이온수로 100배 희석하여 제타전위 측정기(Zen600 zetasizer, Malvern, England)를 이용해 자동측정 방식으로 측정하여 측정하였다. The zeta potential, which is a measure of the surface charge value of liposomes, was measured by diluting a small amount of the liposome dispersion liquid 100 times with deionized water and measuring by an automatic measurement method using a zeta potential meter (Zen600 zetasizer, Malvern, England).

투과형 전자현미경을 이용한 리포좀의 크기 및 형상의 관찰을 위해서, 제조한 리포좀 분산액 소량을 5% 덱스트로오스 용액으로 70배 희석 후 탄소로 코팅한 200 메쉬 구리 격자판에 떨어뜨렸다. 이어서 2% uranyl acetate 용액으로 음성 염색 후 건조시켜 Tecnai G2 spirit (FEI company, Hillsboro, Oregon, USA) 로 120 kV에서 이미지를 촬영하였다. 이미지 사진은 11,000 ~ 42,000 배로 확대하였다.To observe the size and shape of the liposomes using a transmission electron microscope, a small amount of the prepared liposome dispersion was diluted 70-fold with a 5% dextrose solution and then dropped onto a 200 mesh copper grid plate coated with carbon. Subsequently, the result was negatively stained with 2% uranyl acetate solution and dried to take an image at 120 kV with Tecnai G2 spirit (FEI company, Hillsboro, Oregon, USA). Image The photograph was enlarged from 11,000 to 42,000 times.

실시예Example 3. 3. 리포좀의Liposome 분산 안정성 평가 Dispersion stability evaluation

제조한 리포좀을 원액 상태로 상온에서 6주까지 보관하며 일정한 시간 간격으로 평균입자경의 변화를 측정하여 리포좀 분산액 보관시의 분산 안정성을 평가하였다. The prepared liposomes were stored in the stock solution at room temperature for up to 6 weeks, and the change in average particle size was measured at regular time intervals to evaluate dispersion stability during storage of the liposome dispersion.

위장관계에서의 리포좀의 분산 안정성을 평가하기 위해서는, 2 g의 NaCl을 1 L 3차 증류수에 녹여 HCl로 pH를 1.2로 맞춘 인공 위액 950 ㎕에 실시예 1의 방법으로 제조한 리포좀 50 μl를 넣어 잘 섞은 후 37℃ 에 보관하며 24 시간까지의 입자 크기 변화를 실시예 2의 방법으로 측정하였다. 또한 6.8 g의 KH2PO4를 1 L 3차 증류수에 녹여 NaOH로 pH를 6.8로 맞춘 인공 장액과 pH 7.4의 인산염완충액 용액에서도 인공 위액과 같은 실험조건으로 리포좀의 입자 크기 변화를 측정하였다.To evaluate the dispersion stability of liposomes in the gastrointestinal tract, 2 g of NaCl was dissolved in 1 L tertiary distilled water and 50 μl of the liposome prepared in the method of Example 1 was added to 950 μl of artificial gastric juice adjusted to pH 1.2 with HCl. After mixing well, 37℃ And the particle size change up to 24 hours was measured by the method of Example 2. Also, 6.8 g of KH 2 PO 4 was dissolved in 1 L tertiary distilled water to measure the change in particle size of liposomes under the same experimental conditions as artificial gastric juice in artificial intestinal fluids adjusted to pH 6.8 with NaOH and phosphate buffer solutions at pH 7.4.

제조한 리포좀을 동결건조하여 분말화 후 물을 가해 재분산시 안정성을 평가하기 위해서는, 8.2% 농도의 sucrose 용액과 리포좀 용액을 1:1로 잘 섞은 뒤 -80℃ 냉장고에서 6시간 동안 얼린 후 다시 액체 질소에서 1분간 얼린 샘플을 하루 동안 동결건조 하였다. 얻어진 동결건조 파우더는 동결건조 전 리포좀 분산액의 원부피의 증류수를 넣은 후 수초간 vortex하여 리포좀분산액을 얻은 후 그 사이즈를 실시예 2의 방법으로 측정하였다.To evaluate the stability when redispersed by lyophilizing the prepared liposomes and powdering them, adding water, mix the 8.2% concentration of the sucrose solution and the liposome solution 1:1 and freeze it in a refrigerator at -80°C for 6 hours, and then again Samples frozen in liquid nitrogen for 1 minute were lyophilized for one day. The obtained freeze-dried powder was vortexed for a few seconds after adding distilled water of the original volume of the liposome dispersion before freeze-drying to obtain a liposome dispersion, and its size was measured by the method of Example 2.

실시예Example 4. 4. IBDIBD 치료용 약물 Therapeutic drugs 부데소니드Budesonide 봉입 Enclosure 리포좀의Liposome 제조 및 Manufacturing and 봉입농도Encapsulation concentration 평가 evaluation

실시예 1의 3차 부틸 알코올에 지질과 각종 오메가-3-지방산을 혼합하여 용해시키는 단계에서 IBD 치료에 흔히 쓰이는 스테로이드 약물인 부데소니드를 일정량 같이 녹인 후 동결건조를 수행한 후 실시예 1의 방법에 의해 부데소니드 봉입 리포좀을 제조하였다. 제조가 끝난 후, 리포좀에 봉입되지 않은 부데소니드의 분리는 리포좀과 미봉입 부데소니드의 혼합액을 즉시 0.8 mm 셀룰로우즈 아세테이트 재질의 멤브레인 필터 (Toyo ADVANTEC, Otowa, Bunkyo-ku, Japan)로 여과하여 분리하였다. 부데소니드 봉입 리포좀의 평균 입자경을 실시예 2의 방법으로 측정하였으며 봉입된 부데소니드의 농도는 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 이용하여 분석하였다. 분석 전 50 ㎕의 리포좀 분산액을 동결 건조하여 얻은 분말을 메탄올 0.5ml에 녹인 후 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액 20 ㎕를 Nanospace SI-2 HPLC system (Shiseido, japan)에 주입했다. 메탄올과 물의 혼합물 (72:28, v/v)으로 제조한 이동상을 800 μl/min의 유속으로 흘려 주었다. 역상 칼럼인 Capcell pak C18 컬럼 (Shiseido, japan)을 사용하였으며 오븐의 온도는 40℃로 설정하였다. 부데소니드의 검출은 243 nm에서 수행하였다. In the step of dissolving tertiary butyl alcohol in Example 1 by mixing lipids and various omega-3-fatty acids, after dissolving a certain amount of budesonide, a steroid drug commonly used in IBD treatment, after lyophilization, the method of Example 1 was performed. The budesonide-encapsulated liposome was prepared by this. After the production was completed, the separation of budesonide not encapsulated in liposomes was immediately filtered by mixing a mixture of liposomes and unencapsulated budesonide with a 0.8 mm cellulose acetate membrane filter (Toyo ADVANTEC, Otowa, Bunkyo-ku, Japan). . The average particle diameter of the budesonide-encapsulated liposomes was measured by the method of Example 2, and the concentration of the encapsulated budesonide was analyzed using a high performance liquid chromatography method. The powder obtained by freeze-drying the 50 µL liposome dispersion before analysis was dissolved in 0.5 ml of methanol and centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes. 20 μl of the supernatant was injected into a Nanospace SI-2 HPLC system (Shiseido, japan). The mobile phase prepared with a mixture of methanol and water (72:28, v/v) was flowed at a flow rate of 800 μl/min. A reverse phase column, a Capcell pak C18 column (Shiseido, Japan), was used and the oven temperature was set to 40°C. Detection of budesonide was performed at 243 nm.

실시예Example 5. in 5. in vitro 막장벽능vitro membrane barrier function 평가 시험 Evaluation test

분화된 상피세포로 구성된 단층의 막강도는 단층을 Hank's Balanced Salts Solution (HBSS, Welgene, Daegu, Korea)으로 10분간 부드럽게 씻어준 다음 epithelial volt-ohm meter (EVOM; World precision Instruments, Berlin, Germany)를 이용하여 TEER (transepithelial electrical resistance (TEER; Ω cm2) 값을 구하여 비교 평가하였다. 먼저, 6-well plate에 장착한 24 mm 폴리카보네이트 트랜스웰 필터 (6-well plate, pore size 0.4 μm, 표면적 4.67 cm2, corning, NY, USA)상에 표준 조건 (5% CO2 및 37℃를 포함하는 가습 분위기) 하에서 10% 열 비활성화된 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM에서 배양해온 인간 대장암 CaCO-2 세포주를 3.75 x 105 cells/well의 밀도로 접종하였다. 3 일마다 배지 (DMEM, 10% 소혈청 함유)를 교체하면서 일정시간 간격으로 EVOM을 사용해 제시된 측정법에 따라 TEER을 측정하였다. TEER 값이 점차적으로 증가하여 ₃1200 Ω㎠ 에 도달하면 (₃3주) 세포가 완전히 분화되어 막장벽이 완성되었다 판단하고 이후 실험을 진행하였다. For monolayer membrane strength composed of differentiated epithelial cells, the monolayer was gently washed with Hank's Balanced Salts Solution (HBSS, Welgene, Daegu, Korea) for 10 minutes, and then the epithelial volt-ohm meter (EVOM; World precision Instruments, Berlin, Germany) was used. The value of TEER (transepithelial electrical resistance (TEER; Ω cm 2 )) was calculated and evaluated. First, a 24 mm polycarbonate transwell filter mounted on a 6-well plate (6-well plate, pore size 0.4 μm, surface area 4.67 cm 2, corning, NY, USA) Human colon cultured in DMEM with 10% heat inactivated FBS and 1% penicillin/streptomycin under standard conditions (humidified atmosphere containing 5% CO 2 and 37°C). The cancer CaCO-2 cell line was inoculated at a density of 3.75 x 10 5 cells/well TEER was measured according to the presented measurement method using EVOM at regular time intervals while replacing the medium (containing DMEM, 10% bovine serum) every 3 days. When the TEER value gradually increased and reached ₃1200 Ω㎠ (₃3 weeks), it was judged that the cells were completely differentiated and the membrane barrier was completed.

CaCO-2 단층이 완전히 분화되었을 때, 이와는 별도로 쥐의 대식세포 RAW 264.7 세포주를 6-well plate에 8.5 x 105 cells/well로 파종하였다. 24 시간 후, 리포폴리사카라이드 (LPS) 100 ng/ml를 5 시간 동안 처리하여 염증반응을 유도한 후 전염증성 사이토카인이 생성되어 함유되어 있는 배양 상등액을 수집하여 이를 완전히 분화된 Caco-2 단층에 3 시간 처리하여 막 손상을 유도하였으며 이때 막손상의 정도는 CaCO-2 단층을 HBSS로 10 분간 헹군 후 TEER을 측정하여 평가하였다. When the CaCO-2 monolayer was completely differentiated, a rat macrophage RAW 264.7 cell line was seeded at 8.5 x 10 5 cells/well in a 6-well plate. After 24 hours, 100 ng/ml of lipopolysaccharide (LPS) was treated for 5 hours to induce an inflammatory reaction, and then a culture supernatant containing proinflammatory cytokines was collected and collected, thereby completely differentiated Caco-2 monolayer The treatment was performed for 3 hours to induce membrane damage. At this time, the degree of membrane damage was evaluated by measuring the TEER after rinsing the CaCO-2 monolayer with HBSS for 10 minutes.

실시예Example 6. 염증성 사이토카인 전구체 (IL-6, 6. Inflammatory cytokine precursor (IL-6, TNFTNF -a) 분석 (ELISA) -a) Analysis (ELISA)

IL-1 검출을 위해, 마우스 유래의 RAW 264.7 대식세포를 2.5Х105 cells/well로 24-well 조직 배양 플레이트에 접종하고 밤새 배양하였다. 부데소니드 용액 또는 리포좀의 항염증 효과를 평가하기 위해 이들을 2시간 동안 세포에 적용하였다. 그 후 신선한 배지를 다시 공급한 후 LPS를 100 ng/ml의 농도로 가해 6시간 동안 처리하였다. 세포 상등액 중 IL-6 농도는 R&D Systems Inc.의 murine IL-6 Quantikine® enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit를 사용해 제조사의 지침에 따라 정량하였다. For IL-1 detection, mouse-derived RAW 264.7 macrophages were inoculated into a 24-well tissue culture plate at 2.5Х10 5 cells/well and cultured overnight. To evaluate the anti-inflammatory effect of budesonide solution or liposomes, they were applied to cells for 2 hours. Thereafter, fresh medium was fed again, and LPS was added at a concentration of 100 ng/ml and treated for 6 hours. The concentration of IL-6 in the cell supernatant was quantified using the murine IL-6 Quantikine ® enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit from R&D Systems Inc. according to the manufacturer's instructions.

TNF-α 검출을 위해, RAW 264.7 세포를 106 cells/well로 6-well plate에 접종하고 부데소니드, 리포좀 분산액을 각각 처리하여 2시간 방치하였다. 이어서 세포를 떼어 DMEM 배지로 세척 후 다시 104 cells/well 로 96-well plate에 재접종하고 LPS를 100 ng/ml의 농도로 처리하였다. 24시간 후 상등액을 취하여 R&D Systems Inc.의 TNF-α ELISA kit를 이용해 제조사의 지침에 따라 각 군의 TNF-α 생성량을 측정하였다. For TNF-α detection, RAW 264.7 cells were inoculated into 6-well plates at 10 6 cells/well, and treated with budesonide and liposome dispersions, respectively, and allowed to stand for 2 hours. Subsequently, the cells were separated, washed with DMEM medium, and re-inoculated into a 96-well plate with 10 4 cells/well and treated with LPS at a concentration of 100 ng/ml. After 24 hours, the supernatant was taken and the TNF-α production amount of each group was measured according to the manufacturer's instructions using R&D Systems Inc.'s TNF-α ELISA kit.

실시예Example 7. 급성 대장염 마우스 모델에서의 염증 완화 효과 평가 7. Evaluation of inflammation relief effect in acute colitis mouse model

마우스 (웅성 C57BL/6NCrljOri mice, 7 주령) 24 마리를 4 군으로 나누고 그룹 2-4군에는 급성 대장염(colitis)를 유도시키기 위해 멸균한 음용수에 2%로 녹인 dextran sulfate sodium (DSS, MP Biomedicals, Solon, OH)를 실험 0일부터 실험 4일째 되는 날까지 5 일간 공급하였으며 동기간 동안 그룹 1 (음성 대조군)에는 DSS를 넣지 않은 멸균 음용수를 공급하였다. 그룹 1-4 모두 day 6부터는 다시 정상 멸균 음용수를 공급하였다. 실험 3일째되는 날부터 시작하여 7일째 되는 날까지 그룹 1, 2는 5% 덱스트로즈 용액, 그룹 3은 부데소니드, 그룹 4는 리포좀을 위관영양법으로 1일 1회, 총 5회 투여하였다. 실험 9일째 되는 날 각 마우스로부터 안와채혈법에 의해 얻은 혈청을 -20℃에 보관하였다. 24 mice (male C57BL/6NCrljOri mice, 7 weeks old) were divided into 4 groups, and in groups 2-4, dextran sulfate sodium (DSS, MP Biomedicals, dissolved in 2% in sterile drinking water to induce acute colitis) Solon, OH) was supplied for 5 days from the 0th day of the experiment to the 4th day of the experiment, and during the same period, Group 1 (negative control) was supplied with sterile drinking water without DSS. In group 1-4, normal sterilized drinking water was supplied again from day 6. Group 1 and 2 were 5% dextrose solution, group 3 was budesonide, and group 4 was administered liposomes once a day, a total of 5 times, starting from the 3rd day of the experiment to the 7th day. Serum obtained by orbital sampling from each mouse on the 9th day of the experiment was stored at -20°C.

혈청 중 존재하는 내독소 (endotoxin)의 농도를 측정함에 의해 장점막 장벽능(intestinal barrier permeability)의 손상 및 회복 정도를 평가하였다. 내독소 검출시험은 Pierce LAL chromogenic endotoxin quantitation kit (Thermo scientific, USA)를 이용하여 제조사의 상세한 지침에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 냉동 보관한 혈청을 꺼내 내독소가 없는 물에 50 배 희석한 뒤 microplate well에 50 ㎕ 씩 분주하였다. 37℃ 에서 5 분간 방치 후 Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 시약을 50 ㎕ 첨가하고 10 분 후 발색용 기질 100 ㎕ 을 첨가하였다. 다시 6분 후 반응 종말 시약 100 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 순차 희석한 LPS 표준용액으로 얻은 표준검량선과 비교하여 샘플 중 LPS 농도를 평가하였다. The extent of damage and recovery of the intestinal barrier permeability was evaluated by measuring the concentration of endotoxin present in the serum. The endotoxin detection test was performed according to the detailed instructions of the manufacturer using a Pierce LAL chromogenic endotoxin quantitation kit (Thermo scientific, USA). Briefly, the stored serum was taken out, diluted 50 times in endotoxin-free water, and then dispensed at 50 µl each in a microplate well. After standing at 37° C. for 5 minutes, 50 μl of the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) reagent was added, and after 10 minutes, 100 μl of the substrate for color development was added. After 6 minutes, 100 µl of the reaction end reagent was added, mixed well, and absorbance was measured at 405 nm. The LPS concentration in the sample was evaluated by comparing with a standard calibration curve obtained with a serially diluted LPS standard solution.

혈청 중 전염증성 사이토카인 검출 시험에 의해 염증반응의 정도를 평가하였다. BD biosciences사의 CBA (cytometric bead array-mouse inflammation kit)를 이용하여 혈청중 사이토카인 (IL-6, IFN-g, TNF-a, IL12p70, IL-10) 및 chemokine (MCP-1)을 검출하였다. 간단히 설명하면, 혈청시료를 제조사가 제공한 희석 용액으로 2 배 희석 후 상온에서 사이토카인 anti-beads와 2시간 배양했다. 그 후 BD bioscience사의 BD FACSARIA Ⅲ를 이용해 CBA 데이터를 얻고 FCAP array 소프트웨어를 이용해 각 샘플의 사이토카인 및 chemokine을 정량하였다.The degree of inflammatory response was evaluated by a pro-inflammatory cytokine detection test in serum. Cytokines (IL-6, IFN-g, TNF-a, IL12p70, IL-10) and chemokine (MCP-1) were detected in serum using BD biosciences CBA (cytometric bead array-mouse inflammation kit). Briefly, serum samples were diluted 2-fold with a dilution solution provided by the manufacturer, and incubated with cytokine anti-beads at room temperature for 2 hours. Thereafter, CBA data was obtained using BD FACSARIA III of BD bioscience, and cytokines and chemokine of each sample were quantified using FCAP array software.

실험예Experimental Example 1. 오메가-3-지방산 삽입이 1. The insertion of omega-3-fatty acid 리포좀의Liposome 입자경Particle diameter 및 보관시 크기 변화에 미치는 영향 And the effect on size change during storage

DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)또는 DSPC (1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 27.5 mg, 콜레스테롤 1.2 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg의 3차 부틸 알코올 용액에 a-linolenic acid(ALA, 18:3n-3), eicosapentaenoic acid(EPA, 20:5n-3), docosahexaenoic acid(DHA, 22:6n-3) 또는 크릴 오일 (Neptune Technologies & Bioressources Inc., Quebec, Canada) 을 6 mg 씩 넣어 실시예 1의 방법으로 리포좀을 제조하였다. 제조한 리포좀의 입자경 및 입도 분포를 실시예 2의 방법으로 측정하였다. 또한 제조한 리포좀을 원액 그대로 상온에서 6주까지 보관하며 일정한 시간 간격으로 평균입자경의 변화를 측정하였다. A tertiary butyl alcohol solution of 27.5 mg DOC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) or DSPC (1,2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 27.5 mg, cholesterol 1.2 mg, alpha tocopherol 0.9 mg A-linolenic acid (ALA, 18:3n-3), eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3), docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) or krill oil (Neptune Technologies & Bioressources Inc., Quebec , Canada) 6 mg each to prepare liposomes according to the method of Example 1. The particle diameter and particle size distribution of the prepared liposomes were measured by the method of Example 2. In addition, the prepared liposomes were stored at room temperature for 6 weeks as they were in the stock solution, and changes in the average particle size were measured at regular time intervals.

그 결과, 오메가-3-지방산을 삽입하지 않은 리포좀의 경우 주요 PC 성분의 종류에 관계없이 <200 nm의 나노사이즈가 보관기간 내내 일정하게 유지되었지만 오메가-3-지방산 ALA, EPA, DHA 삽입 리포좀의 경우는 시간경과에 따라 리포좀의 입자크기 증대 양상을 보였다. DSPC 리포좀의 경우 ALA, EPA, DHA 삽입시 상온 6주 보관 후 리포좀의 입자크기는 각각 3.9, 6.3 및 9.2배 증가하였다. 상전이온도가 낮은 PC인 DOPC 리포좀 보다는 상전이온도가 높은 PC인 DSPC 리포좀의 경우, 오메가-3-지방산 중에서는 이중결합의 숫자가 증가할 수록 (ALA 3개, EPA 5개, DHA 6개) 더 현저한 입자크기 양상을 보였다 (도 1). 대조적으로, 크릴오일을 동량 삽입시킨 리포좀의 경우는 초기 입자경도 다른 오메가-3-지방산 삽입 리포좀에 비해 매우 작았으며 또한 동일한 보관 조건에서 PC의 종류에 관계없이 리포좀의 크기 증가가 관찰되지 않았다 (도 1). As a result, in the case of liposomes without insertion of omega-3-fatty acid, regardless of the type of the main PC component, the nanosize of <200 nm was kept constant throughout the storage period, but the omega-3-fatty acid ALA, EPA, DHA insertion liposomes In the case, the particle size of liposomes increased with time. In the case of DSPC liposomes, the particle size of liposomes increased by 3.9, 6.3, and 9.2 times, respectively, after storage for 6 weeks at room temperature when ALA, EPA, and DHA were inserted. In the case of DSPC liposomes, which are PCs with high phase transition temperature, rather than DOPC liposomes, which are PCs with low phase transition temperature, the higher the number of double bonds among omega-3-fatty acids (3 ALA, 5 EPA, 6 DHA) The particle size was observed (FIG. 1). In contrast, in the case of liposomes in which the same amount of krill oil was inserted, the initial particle size was very small compared to other omega-3-fatty acid insertion liposomes, and an increase in the size of liposomes was not observed regardless of the type of PC under the same storage conditions (Fig. One).

헤드 그룹이 상대적으로 작은 오메가-3-지방산의 꼬깔형 분자 구조로 인해 오메가-3-지방산의 PC 분자 사이에의 삽입은 PC 이중층의 곡률 스트레스 (curvature stress)를 증가시켜 모서리(edge)를 가진, 융합되기 쉬운 리포좀을 형성한다고 생각된다. 한편 크릴 오일의 경우는 DHA, EPA외 DHA 결합형 PC, EPA 결합형 PC, 아스타잔틴 등 여러가지 지용성 성분이 혼합되어 존재하므로 이들의 PC 막중 오메가-3-지방산과 PC 분자 사이의 빈 공간을 적절히 채워주어 곡률 스트레스를 완화시키는 역할을 하는 것으로 생각된다 (도 2A 모식도). EPA 삽입 리포좀 및 크릴오일 삽입 리포좀의 전자현미경 이미지를 얻은 결과 EPA 삽입의 경우에만, 모서리를 가지는 리포좀의 형성과 시간 경과에 따른 이들의 융합(fusion)을 확인하여 이러한 가설이 뒷받침되었다 (도 2B). Due to the small molecular structure of the omega-3-fatty acid in the small group of heads, the insertion between the omega-3-fatty acid and the PC molecule increases the curvature stress of the PC bilayer and has edges. It is thought to form liposomes that are likely to fuse. On the other hand, in case of krill oil, various fat-soluble components such as DHA, EPA, DHA-bound PC, EPA-bound PC, and astaxanthin exist in mixture, so the empty space between omega-3-fatty acid and PC molecules in their PC membranes is appropriate. It is thought that it serves to relieve curvature stress by filling it (Fig. 2A schematic diagram). As a result of obtaining electron microscopic images of EPA-inserted liposomes and krill oil-inserted liposomes, this hypothesis was supported by confirming the formation of liposomes having corners and their fusion over time (FIG. 2B). .

실험예Experimental Example 2. 2. 크릴오일의Krill 삽입량이 Insertion amount 리포좀의Liposome 물리화학적 특성에 미치는 영향 Effects on physicochemical properties

실시예 1의 리포좀 제조 과정 첫 단계에서 3차 부틸 알코올에 지질로서 DOPC과 콜레스테롤 및 알파 토코페롤을 27.5:1.2:0.9의 중량비로 혼합하고 이에 크릴 오일을 지질 총량 29.6 mg 당 0, 6, 18, 27, 54, 108 mg 섞어 모두 용해시켜 혼합용액을 얻었다. 이어서 동결건조 하여 3차 부틸 알코올을 증발시킨 후 얻은 지질+크릴 오일 혼합물의 물리적 상태를 일단 관찰한 후, 이어서 실시예 1의 방법으로 수상을 가하여 분산 및 균질화 공정을 거쳐 리포좀을 제조하였다. 제조한 리포좀의 평균 입자경 및 표면 하전을 실시예 2의 방법으로 측정하였다. In the first step of the liposome preparation process of Example 1, as a lipid in tertiary butyl alcohol, DOPC and cholesterol and alpha tocopherol were mixed in a weight ratio of 27.5:1.2:0.9, and krill oil was added to 0, 6, 18, 27 per 29.6 mg of total lipid. , 54, 108 mg, and all dissolved to obtain a mixed solution. Subsequently, after physically observing the physical state of the lipid + krill oil mixture obtained by evaporating tertiary butyl alcohol by lyophilization, the aqueous phase was then added by the method of Example 1 to prepare liposomes through a dispersion and homogenization process. The average particle diameter and surface charge of the prepared liposomes were measured by the method of Example 2.

단순동결건조 후 얻은 지질+크릴 오일 혼합물을 관찰한 결과, 크릴 오일을 27 mg 첨가시까지는 크릴오일 고유의 붉은 색으로 적셔진 지질 파우더의 고체 케이크가 관찰되었으나 54 mg 이상 첨가시는 붉은 색을 띄는 뿌연 액체의 형태로 변화되어 108 mg에서는 지질이 크릴 오일에 모두 용해된 투명한 액체로 관찰되었다. 이어서 리포좀을 제조한 결과, 크릴오일을 27 mg 혼합시까지는 리포좀이 생성되었으나 54 mg 이상 혼합한 경우, 즉 크릴오일에 지질이 용해된 형태로 존재하였던 경우는 지질의 응집체가 형성되었다 (도 3). 제조된 리포좀의 제타전위를 측정한 결과, 크릴오일의 삽입량이 0 ~ 18 mg까지는 제타전위값이 음성으로 절대값이 증가하다가, 18~27 mg에서는 더 이상의 증가는 없었다. 이는 리포좀의 PC막에 끼어들어갈 수 있는 크릴오일의 양이 한정되어 있으며 18~27 mg에서 포화됨을 의미한다 (도 4A). 크릴오일을 0, 6, 또는 18 mg 삽입한 리포좀의 경우 초기 입자크기가 비슷하였고 실온 보관 중 입자 크기 증가 양상도 관찰되지 않아 (도 4B) 이 범위에서의 크릴오일 리포좀의 분산 안정성을 확인하였다. As a result of observing the lipid + krill oil mixture obtained after simple freezing and drying, a solid cake of lipid powder moistened with krill oil's own red color was observed until 27 mg of krill oil was added. It was changed to a cloudy liquid, and at 108 mg, lipid was observed as a clear liquid dissolved in krill oil. Subsequently, as a result of preparing liposomes, liposomes were generated until krill oil was mixed with 27 mg, but when 54 mg or more was mixed, that is, when lipid was dissolved in krill oil, aggregates of lipids were formed (FIG. 3). . As a result of measuring the zeta potential of the prepared liposome, the absolute value of the zeta potential was negatively increased until the insertion amount of krill oil was 0 to 18 mg, but there was no further increase at 18 to 27 mg. This means that the amount of krill oil that can be inserted into the PC membrane of the liposome is limited and saturated at 18-27 mg (Figure 4A). In the case of liposomes in which 0, 6, or 18 mg of krill oil was inserted, the initial particle size was similar, and an increase in particle size during storage at room temperature was not observed (FIG. 4B ), thereby confirming the dispersion stability of krill oil liposomes in this range.

실험예Experimental Example 3. 3. 리포좀의Liposome 위장관액Gastrointestinal fluid 안정성 평가 Stability evaluation

DOPC 27.5 mg, 콜레스테롤 1.2 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg의 3차 부틸 알코올 용액에 크릴 오일을 0 또는 18 mg 넣은 혼합물로부터 실시예 1의 방법으로 리포좀을 제조하였다. 또한 크릴오일 47 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg에 수상 1 ml를 가한 후 자발적으로 형성된 조분산액을 37℃에서 1 시간동안 수조 형식의 초음파 분산기에서 130 W로 균질화, 다시 수조 형식의 세포 파쇄용 초음파 분산기에서 7 분간 250 W 세기의 초음파 처리하여 크릴오일의 에멀젼을 얻었다. 이는 크릴오일이 오일상의 오메가-3-지방산 성분과 PC결합형 오메가-3-지방산 성분을 둘 다 함유하고 있어서 물에 분산시 자체적으로 에멀젼을 형성할 수 있다는 보고에 근거하여 크릴오일 리포좀과의 비교를 위해 대조군으로 제조하였다. Liposomes were prepared by the method of Example 1 from a mixture of 0 or 18 mg of krill oil in a tertiary butyl alcohol solution of DOPC 27.5 mg, cholesterol 1.2 mg, and alpha tocopherol 0.9 mg. In addition, after adding 1 ml of water phase to 47 mg of krill oil and 0.9 mg of alpha tocopherol, homogenize the crude dispersion formed spontaneously at 130°C in a tank-type ultrasonic disperser for 1 hour at 37°C, and again in an ultrasonic disperser for cell disruption Emulsion of krill oil was obtained by ultrasonic treatment of 250 W intensity for 7 minutes. This is based on the report that krill oil contains both the omega-3-fatty acid component in the oil phase and the PC-linked omega-3-fatty acid component, so that it can form an emulsion on its own when dispersed in water. It was prepared as a control for.

제조한 리포좀 2종 (통상의 리포좀, 크릴 오일 18 mg을 삽입시킨 리포좀) 및 크릴오일 에멀젼 1종을 대상으로, 실시예 3의 방법으로 위장관액 안정성을 시험하였다. 그 결과, 통상의 리포좀은 37oC에 24 시간 방치시까지 인산염 완충액, 인공장액, 인공위액 모두에서 뚜렷한 입자크기의 증가를 보이지 않았다. 크릴오일 에멀젼의 경우는 인산염 완충액 및 인공장액에서는 입자크기의 증가를 보이지 않았지만 인공위액의 경우는 1시간 방치 후 4.3배 증가되어 2시간 후에는 응집체(aggregate)의 형성으로 입자크기 측정이 아예 불가능하였다. 크릴오일 리포좀의 경우는 인공위액에 24 시간 방치 후에야 3.5배의 입자 크기 증가 현상을 보여 크릴 에멀젼에 비해 위장관에서 현저히 안정함을 확인하였다 (도 5). Gastrointestinal fluid stability was tested by the method of Example 3 for 2 types of prepared liposomes (normal liposomes, liposomes having 18 mg of krill oil inserted) and 1 krill oil emulsion. As a result, the normal liposomes did not show a significant increase in particle size in phosphate buffer, artificial intestinal fluid, and artificial gastric juice until left at 37 o C for 24 hours. In the case of krill oil emulsion, there was no increase in particle size in phosphate buffer and artificial intestinal fluid, but in case of artificial gastric juice, it increased 4.3 times after 1 hour of standing, and after 2 hours, particle size measurement was impossible due to the formation of aggregates. . In the case of krill oil liposomes, it was confirmed that the particle size increase of 3.5 times was observed in the gastrointestinal tract compared to the krill emulsion only after standing for 24 hours in artificial gastric juice (FIG. 5 ).

실험예Experimental Example 4. 동결건조 후 4. After freeze drying 리포좀Liposome 안정성 평가 Stability evaluation

DOPC 27.5 mg, 콜레스테롤 1.2 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg의 3차 부틸 알코올 용액에 크릴오일을 18 mg 넣은 혼합물로 실시예 1의 방법으로 리포좀을 제조하였다. 제조한 리포좀 분산액을 실시예 3의 방법으로 동결건조하여 동결건조된 리포좀 파우더를 얻었으며, 이에 증류수를 가해 바이얼을 손으로 잘 흔들어 복원시켰다 (도 6A). 동결건조 전 및 복원 후 리포좀의 사이즈를 실시예 2의 방법으로 측정한 결과, 동결건조 후 리포좀의 입자크기 증가가 없었고 다분산도도 0.5 이하여서 나노크기의 균일한 리포좀 형태로 쉽게 복원됨을 확인하였다 (도 6B). Liposomes were prepared by the method of Example 1 with a mixture of 18 mg of krill oil in a tert-butyl alcohol solution of DOPC 27.5 mg, cholesterol 1.2 mg, and alpha tocopherol 0.9 mg. The prepared liposome dispersion was lyophilized by the method of Example 3 to obtain lyophilized liposomal powder, and distilled water was added thereto to shake the vial well by hand to restore it (FIG. 6A ). As a result of measuring the size of the liposomes before and after lyophilization by the method of Example 2, there was no increase in particle size of the liposomes after lyophilization, and the polydispersity was also less than 0.5, confirming that it was easily restored to a nano-sized uniform liposome form. (Figure 6B).

실험예Experimental Example 5. 5. 부데소니드Budesonide 제형으로서의 As a formulation 리포좀Liposome 평가 evaluation

실시예 4의 3차 부틸 알코올에 지질 과 크릴오일을 혼합하여 용해시키는 단계에서 DOPC 27.5 mg, 콜레스테롤 1.2 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg, 부데소니드 1.5 mg 을 크릴오일 18 mg 또는 DHA 6 mg과 같이 녹인 후 리포좀을 제조하고, 미봉입 부데소니드를 분리 후 실시예 2의 방법에 의해 부데소니드 봉입 리포좀의 입자 크기, 다분산도를 측정하고 실시예 4의 방법에 의해 부데소니드 봉입농도를 측정하였다. Liposome after dissolving DOPC 27.5 mg, cholesterol 1.2 mg, alpha tocopherol 0.9 mg, and budesonide 1.5 mg in 18% or DHA 6 mg of krill oil in the step of dissolving and mixing lipid and krill oil in tertiary butyl alcohol of Example 4 To prepare, after separating the unencapsulated budesonide, the particle size and polydispersity of the budesonide encapsulated liposomes were measured by the method of Example 2, and the budesonide encapsulation concentration was measured by the method of Example 4.

다음 표 1은 크릴오일 삽입 리포좀 및 통상적인 리포좀에 부데소니드는 약 95%의 우수한 봉입효율로 봉입되며, 봉입 리포좀의 입자 크기 및 다분산도값은 나노크기의 균일한 리포좀이 형성되었음을 보여준다. 반면 DHA 삽입 리포좀에의 부데소니드 봉입은 약 30%의 낮은 봉입효율을 보였으며 리포좀의 입자 크기도 >500 nm로 현저히 증가하였다. 이상의 결과는 크릴오일 리포좀이 부데소니드 제형으로서 적합함을 보여준다.The following Table 1 shows that the budesonide is encapsulated in a krill oil insertion liposome and a conventional liposome with an excellent encapsulation efficiency of about 95%, and the particle size and polydispersity value of the encapsulated liposome form a nano-sized uniform liposome. On the other hand, encapsulation of budesonide into DHA-embedded liposomes showed a low encapsulation efficiency of about 30%, and the particle size of liposomes was significantly increased to >500 nm. The above results show that krill oil liposome is suitable as a budesonide formulation.

리포좀의 조성
(중량비) Composition of liposomes
(Weight ratio) budesonide 봉입 농도
(mg/ml)budesonide encapsulation concentration
(mg/ml) 봉입 효율 (%) Encapsulation efficiency (%) 평균 입자경 (nm)Average particle diameter (nm) 다분산도 Polydispersity DOPC:CHOL:TOCO
(27.5:1.2:0.9 ) DOPC:CHOL:TOCO
(27.5:1.2:0.9) 1.44 ± 0.111.44 ± 0.11 96.0±7.3 96.0±7.3 203±64203±64 0.205±0.079 0.205±0.079 DOPC:CHOL:TOCO:Krill ( 27.5:1.2:0.9:18) DOPC:CHOL:TOCO:Krill (27.5:1.2:0.9:18) 1.41 ± 0.091.41 ± 0.09 94.0±6.0 94.0±6.0 178±22178±22 0.130±0.021 0.130±0.021 DOPC:CHOL:TOCO:DHA (27.5:1.2:0.9:6 ) DOPC:CHOL:TOCO:DHA (27.5:1.2:0.9:6) 0.45 ± 0.010.45 ± 0.01 30.0±1.0 30.0±1.0 630±14630±14 0.300±0.023 0.300±0.023

실험예Experimental Example 6. 6. 리포좀의Liposome in vitro in vitro 막장벽능Barrier function 수복 효과 평가 시험 Restoration effect evaluation test

DOPC 27.5 mg, 콜레스테롤 1.2 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg의 3차 부틸 알코올 용액에 크릴 오일을 0 또는 18 mg 넣어 실시예 1의 방법으로 통상의 리포좀 및 크릴오일 리포좀 두 종을 제조하였다. 실시예 5의 방법에 따라 CaCO-2의 단층막을 염증성 사이토카인을 함유하는 배지에 의해 막손상을 유도한 직후 배지 1 ml 당 각 리포좀을 2.8 ㎕ 또는 5.6 ㎕ 씩 가하였다. 비교를 위해 배지로 희석한 크릴 오일 DMSO 용액을 크릴 오일 리포좀 2.8 ㎕ 중 크릴 오일 량에 해당하는 크릴 오일량 (50 mg)으로 따로 처리 후 TEER를 측정하였다. Two or more conventional liposomes and krill oil liposomes were prepared by the method of Example 1 by adding 0 or 18 mg of krill oil to a tertiary butyl alcohol solution of DOPC 27.5 mg, cholesterol 1.2 mg, and alpha tocopherol 0.9 mg. According to the method of Example 5, immediately after inducing membrane damage by a medium containing an inflammatory cytokine, a monolayer membrane of CaCO-2 was added with 2.8 μl or 5.6 μl of each liposome per 1 ml of the medium. For comparison, the TEER was measured after treating the krill oil DMSO solution diluted with the medium with a krill oil amount (50 mg) corresponding to the krill oil amount in 2.8 μl of krill oil liposomes.

그 결과, 염증반응이 유도된 대식세포 상층액 처리는 단층막을 손상시켜 TEER 값을 원래 값의 40% 이하로 감소시켰고, 통상의 리포좀 및 크릴오일 리포좀은 둘다 각각 TEER 값을 리포좀 용량 의존적으로 회복시켰으며, 두 종의 리포좀 중에서는 크릴오일 리포좀의 TEER 회복 효과가 더 우수하였다. 이러한 TEER 회복 효과는 크릴 오일 용액의 경우에도 일부 관찰되어, 막장벽능 수복 효과가 리포좀의 PC 및 크릴 오일 둘다에 의해서 이루어짐을 확인하였다 (도 7). As a result, the macrophage supernatant treatment in which the inflammatory response was induced damaged the monolayer to reduce the TEER value to 40% or less of the original value, and both conventional liposomes and krill oil liposomes respectively recovered TEER values depending on the liposome dose. , Among the two types of liposomes, the effect of recovering TEER of krill oil liposomes was better. This TEER recovery effect was partially observed even in the case of the krill oil solution, and it was confirmed that the membrane barrier function repair effect was achieved by both PC and krill oil of liposomes (FIG. 7 ).

실험예Experimental Example 7. 7. 크릴오일Krill oil 리포좀의Liposome in vitro 항염증효과 비교 평가 Comparative evaluation of in vitro anti-inflammatory effects

실험예 6에서와 같은 조성으로 실시예 1의 방법으로 통상의 리포좀 (oil-free)및 크릴오일 리포좀 2 종을 제조하였다. 실시예 6의 방법으로 실험을 실시하되 250 nM 부데소니드, 통상의 리포좀 분산액 5.6 ml 또는 크릴오일 리포좀 분산액 5.6 ㎕을 각각 2시간 전처리한 후, RAW 264.7 대식세포에 LPS를 100 ng/ml의 농도로 6시간 처리한 후 전염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 생성농도를 측정한 결과, 도 8에 나타난 것처럼 크릴오일 리포좀은 부데소니드와 유사한 정도로 IL-6 및 TNF-α의 생성량을 감소시켰다. 통상의 리포좀은 같은 농도에서 IL-6 생성농도에 영향을 미치지 않아 이러한 전염증성 사이토카인 생성 억제 효과는 리포좀에 삽입된 크릴오일에 의한 것임을 확인 할 수 있었다. Two types of conventional liposomes (oil-free) and krill oil liposomes were prepared by the method of Example 1 with the same composition as in Experimental Example 6. After performing the experiment by the method of Example 6, 250 nM budesonide, 5.6 ml of a conventional liposome dispersion or 5.6 µl of a krill oil liposome dispersion was pretreated for 2 hours, respectively, and RAPS 264.7 macrophages were treated with LPS at a concentration of 100 ng/ml 6 As a result of measuring the concentrations of pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α after a time treatment, as shown in FIG. 8, krill oil liposomes reduced IL-6 and TNF-α production to a similar degree as budesonide. Since the normal liposome does not affect the IL-6 production concentration at the same concentration, it was confirmed that this pro-inflammatory cytokine production inhibitory effect is due to krill oil inserted into the liposome.

실험예Experimental Example 8. 염증성 장질환 마우스 모델에서의 크릴 오일 8. Krill oil in a mouse model of inflammatory bowel disease 리포좀의Liposome 염증반응 완화 효과 평가 Evaluation of inflammatory response mitigation effect

DOPC 27.5 mg, 콜레스테롤 1.2 mg, 알파 토코페롤 0.9 mg, 크릴 오일 18 mg 의 혼합물로부터 실시예 1의 방법으로 크릴오일 리포좀을 총지질 29.6 mg/ml, 크릴 오일 18 mg/ml의 농도로 제조하였다. 또한 부데소니드 용액의 단독투여를 위해 수상으로 5% 덱스트로스를, 계면활성제로 1% CMC(carboxymethylcellulose), 유상으로 0.05 %의 대두유를 사용하여 부데소니드 수중유형 유탁액 (0.53 ㎍/ml)을 제조하였다. From the mixture of DOPC 27.5 mg, cholesterol 1.2 mg, alpha tocopherol 0.9 mg, and krill oil 18 mg, krill oil liposomes were prepared at a concentration of 29.6 mg/ml total lipid and 18 mg/ml krill oil by the method of Example 1. In addition, for the sole administration of the budesonide solution, 5% dextrose as the aqueous phase, 1% CMC (carboxymethylcellulose) as the surfactant, and 0.05% soybean oil as the oil phase were used to prepare a budesonide oil-in-water emulsion (0.53 μg/ml).

실시예 7의 방법으로 2% DSS에 의해 급성대장염을 유도한 마우스(female C57BL/6NCrljOri mice, 7 주령)에 day 3부터 day 7까지 그룹 1, 그룹 2은 5% 덱스트로즈 용액, 그룹 3은 부데소니드로 0.4 mg /kg의 부데소니드 유탁액, 그룹 4는 크릴 리포좀을 7.6 ml/kg을 위관영양법으로 1일 1회 투여하였다. Group 1, Group 2, 5% dextrose solution, Group 3 from day 3 to day 7 in mice inducing acute colitis by 2% DSS by the method of Example 7 (female C57BL/6NCrljOri mice, 7 weeks old) 0.4 mg/kg of budesonide emulsion as budesonide, group 4 was administered krill liposome 7.6 ml/kg once a day by gavage.

Day 9에 마우스들로부터 얻은 혈청시료를 대상으로, 내독소혈증 테스트를 수행한 결과, DSS에 의해 급성 대장염이 유도되지 않은 정상군 (음성대조군)에서는 혈청 중 LPS가 검출되지 않았으나 DSS에 의해 급성 대장염이 유도된 2군 (양성 대조군)에서는 검출되어 장점막 손상에 의한 내독소 유입을 확인할 수 있었다. 크릴 오일 리포좀을 경구투여한 군에서는 혈청 중 LPS 농도가 현저히 감소되어 나타났고 (p<0.001) 그 감소된 정도는 부데소니드 투여군보다도 더 컸다(도 9). 이는 크릴오일 리포좀의 경구투여가 염증에 의해 손상된 장점막능을 수복시키는 효과가 있음을 시사한다. As a result of performing an endotoxemia test on serum samples obtained from mice on Day 9, LPS in serum was not detected in the normal group (negative control) in which acute colitis was not induced by DSS, but acute colitis by DSS This induced group 2 (positive control) was detected and was able to confirm the influx of endotoxin due to damage to the mesentery. In the group orally administered with krill oil liposomes, the LPS concentration in serum was significantly decreased (p<0.001), and the reduced degree was greater than that of the budesonide administration group (FIG. 9 ). This suggests that oral administration of krill oil liposomes has the effect of restoring the membranous ability damaged by inflammation.

각 혈청샘플 중 사이토카인(IL-6, IFN-g, TNF-a, IL12p70, IL-10) 및 chemokine (MCP-1)을 정량한 결과, 크릴오일 리포좀 투여군에서의 IL-6 와 TNF-a의 혈청 중 농도는 양성 대조군에서의 그것과 비교시 유의성있게 감소하였으며 부데소니드 투여군과 비교시 감소 정도는 유사하거나 더 컸다. MCP-1, IFN-g 의 경우도 유의성은 없었으나 크릴오일 리포좀 투여군에서 감소되었다 (도 10). 이상의 결과는 크릴오일 삽입 리포좀을 경구투여시 염증성장질환에 의해 나타나는 각종 염증 반응을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 시사한다. As a result of quantifying the cytokines (IL-6, IFN-g, TNF-a, IL12p70, IL-10) and chemokine (MCP-1) in each serum sample, IL-6 and TNF-a in the krill oil liposome administration group The serum concentration of was significantly decreased compared to that in the positive control group, and the degree of reduction was similar or greater when compared with the budesonide administration group. MCP-1 and IFN-g also had no significance, but decreased in the krill oil liposome-administered group (FIG. 10 ). The above results suggest that oral administration of krill oil-embedded liposomes can effectively alleviate various inflammatory reactions caused by inflammatory growth diseases.

Claims (12)

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) 및 상기 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) 사이에 삽입된 크릴오일, 콜레스테롤 및 토코페롤을 포함하며, 상기 DOPC 23 내지 32 중량부에 대하여 크릴오일 15 내지 25 중량부, 콜레스테롤 0.4 내지 2 중량부 및 토코페롤 0.2 내지 1.5 중량부를 포함하는 리포좀을 함유하는 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and the 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) inserted between krill oil, cholesterol and tocopherol, and including the DOPC Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory bowel disease, containing liposomes containing 15 to 25 parts by weight of krill oil, 0.4 to 2 parts by weight of cholesterol and 0.2 to 1.5 parts by weight of tocopherol relative to 23 to 32 parts by weight.
삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양염 또는 크론병인, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
The pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease according to claim 1, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative or Crohn's disease.
삭제delete 삭제delete 청구항 1에 있어서, 상기 리포좀 내에 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나가 삽입되는, 염증성 장 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
The method according to claim 1, wherein the at least one selected from the group consisting of immunosuppressants, anti-inflammatory agents, steroids, immunomodulators, cytokines, and tumor necrosis factor (TNF) antagonists is inserted into the liposome, inflammatory Pharmaceutical composition for preventing or treating bowel disease.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) 및 상기 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DOPC) 사이에 삽입된 크릴오일, 콜레스테롤 및 토코페롤을 포함하며, 상기 DOPC 23 내지 32 중량부에 대하여 크릴오일 15 내지 25 중량부, 콜레스테롤 0.4 내지 2 중량부 및 토코페롤 0.2 내지 1.5 중량부를 포함하는 리포좀을 함유하는 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and the 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) inserted between krill oil, cholesterol and tocopherol, and including the DOPC Health functional food for preventing or improving inflammatory bowel disease, containing liposomes containing 15 to 25 parts by weight of krill oil, 0.4 to 2 parts by weight of cholesterol and 0.2 to 1.5 parts by weight of tocopherol relative to 23 to 32 parts by weight.
삭제delete 청구항 7에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양염 또는 크론병인, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
The method according to claim 7, The inflammatory bowel disease is ulceritis or Crohn's disease, inflammatory bowel disease prevention or improvement health functional food.
삭제delete 삭제delete 청구항 7에 있어서, 상기 리포좀 내에 면역억제제, 항-염증제, 스테로이드, 면역조절제, 사이토카인, 및 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor)(TNF) 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나가 삽입되는, 염증성 장 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.The method according to claim 7, wherein at least one selected from the group consisting of immunosuppressants, anti-inflammatory agents, steroids, immunomodulators, cytokines, and tumor necrosis factor (TNF) antagonists is inserted into the liposome, inflammatory Health functional food for prevention or improvement of bowel disease.
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