KR102135614B1 - Gnf-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
Gnf-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 GNF-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 본 발명에 근거하면 미세아교세포주 및 성상세포 혼합 배양에서, GNF-2는 LPS-유도된 산화질소 생산 및 염증성 사이토카인 생성을 상당히 감소시켰다. 또한, 당뇨병성 신경병증(STZ) 동물모델과 염증성 통증(CFA) 동물모델에서도, GNF-2는 신경염증 보호 효과 및 염증성 통증 개선 효과를 나타냈다. 이에, 본 발명의 GNF-2는 신경염증성 질환 환자에서 염증반응을 억제함으로써 신경염증 질환의 예방 및 치료제 또는 신경염증 질환 개선을 위한 건강기능식품으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 GNF-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
GNF-2는 새로운 클래스의 항암제로서, 내성 만성 골수성 백혈병을 치료하기 위해 개발되었다. 말초신경에서 척수로 올라가는 신경염증을 촉발시키기 위해서는 몇몇 경로가 관여하고 있는데, 주로 비-효소성 당화(glycation)/당산화(glycoxidation) 및 최종 당화 산물의 형성, 산화/질산화적(nitrosative) 스트레스, 단백질 키나제 C, 전사인자 NF-κB, 미토젠-활성화 단백질 키나제(MAPK) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 활성화로 인한 전-염증 반응과, 최종적으로 비정상 Ca2+ 항상성/신호전달이다. 이 중에서, 활성 산소종(ROS)에 의해 유도되는 산화 스트레스는 당뇨 합병증 및 만성 신경병증성 통증의 발생 및 진행에 있어 주요 원인이다.
당뇨병성 신경병증(Diabetic neuropathy; DN)은 당뇨병의 주요 합병증 중 하나인데, 자발통증, 통각 과민 및 이질통증을 나타낸다. 염증은 당뇨병성 신경병증의 중요한 발병 기작이다. 염증과 당뇨병성 신경병증 발생 간의 관련성을 나타내는 보고가 증가하고 있다. 주요 염증성 분자들(염증성 사이토카인, 부착 분자, 케모카인) 및 경로들(핵 인자 카파 B, JUN N-말단 키나제)이 당뇨병성 신경병증의 발생 및 진행에 관련되어 있다. 당뇨병성 신경병증에서 주요 염증성 분자들 및 경로들의 역할에 대한 활발한 연구는 신경병증의 발생을 억제하기 위한 잠재적인 항-염증 접근법의 개발을 촉진할 수 있다. 따라서, 최근에 신경염증을 조절하는 소분자들의 개발이 통증 병리생물학에서 주목받고 있으나, GNF-2와 신경염증 질환과의 관련성에 대해서는 밝혀진 바 없다.
이에, 본 발명에서는 GNF-2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
본 발명은 GNF-2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GNF-2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 GNF-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것으로, 본 발명에 근거하면 미세아교세포주 및 성상세포 혼합 배양에서, GNF-2는 LPS-유도된 산화질소 생산 및 염증성 사이토카인 생성을 상당히 감소시켰다. 또한, 당뇨병성 신경병증(STZ) 동물모델과 염증성 통증(CFA) 동물모델에서도, GNF-2는 신경염증 보호 효과 및 염증성 통증 개선 효과를 나타냈다. 이에, 본 발명의 GNF-2는 신경염증성 질환 환자에서 염증반응을 억제함으로써 신경염증 질환의 예방 및 치료제 또는 신경염증 질환 개선을 위한 건강기능식품으로 활용될 수 있다.
도 1은 c-Abl의 억제제(GNF-2)가 미세아교세포에서 LPS-유도된 산화질소 및 TNF-α 생산을 억제한다는 것을 나타낸다. LPS (100 ng/ml) 처리 유무 및 GNF-2 처리 농도에 따른 (A) 산화질소(nitric oxide; NO) 생산 측정 결과, (B) 세포 독성 측정 결과 및 (C) TNF-α 방출 결과를 나타낸다. (D) LPS (100 ng/ml) 및/또는 GNF-2 (10 uM) 처리한 BV-2 세포에서의 IL-1β 발현을 실시간 PCR로 측정한 결과이다. (E) LPS (100 ng/ml) 및/또는 GNF-2 (10 uM) 처리한 BV-2 세포에서의 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 2는 c-Abl siRNA에 의한 c-Abl 발현 녹다운이 미세아교세포에서 LPS-유도된 산화질소 및 TNF-α 생산을 억제한다는 것을 나타낸다. (A) BV-2 녹다운의 실험모식도를 나타낸다. (B) siRNA 형질감염에 의해 Abl1 발현이 상당히 감소한다는 결과를 나타낸다. (C) siRNA 형질감염 후 LPS로 처리한 세포에서 측정된 NO 생산 결과를 나타낸다. (D) siRNA 형질감염 후 LPS로 처리한 세포에서 실시간 RT-PCR로 TNF-α mRNA를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 1차 미세아교세포 및 성상세포에서 GNF-2의 직접적인 표적으로서 c-Abl에 대한 기능적 검증 결과를 나타낸다. (A) LPS (1 ㎍/ml) 또는 TNF-α (10 ㎍/ml)에 의해 유도되는 산화질소 생산이 GNF-2 처리에 의해 상당히 감소된다는 결과를 나타낸다. (B) LPS (1 ㎍/ml) 및 IFNγ (50 U/ml)에 의해 유도되는 IL-1β 생산이 GNF-2 처리에 의해 상당히 감소된다는 결과를 나타낸다. (C) LPS (1 ㎍/ml) 및 IFNγ (50 U/ml)에 의해 유도되는 산화질소 생산이 GNF-2 처리에 의해서는 상당히 감소되지만, 메틸화된 GNF-2에 의해서는 감소되지 않는다는 결과를 나타낸다. (D) GNF-2 전처리를 통해 NFκB 활성화가 감소된다는 결과를 나타낸다. MGC에서 Abl1 유전자 발현의 siRNA 매개 녹다운이 LPS/IFNγ-유도된 NO 생산(E) 및 TNF-α mRNA 발현(F)을 상당히 감소시킨다는 결과를 나탄낸다. (G) Abl1 발현의 녹다운 및 IkB의 인산화를 웨스턴 블랏팅을 통해 분석한 결과이다.
도 4는 STZ-투여 동물 척수에서 c-Abl의 아교세포 발현을 나타낸다. (A) STZ 투여 1주일 후에 실시간 RT-PCR을 통해 측정된 척수에서의 Abl1 mRNAs 발현 결과를 나타낸다. (B) 면역염색을 통해 확인한 척수에서 c-Abl의 세포 위치를 나타낸다. (C) 면역형광분석을 통해, STZ-투여 마우스 척수에서 투여 3주 후에 아교세포 c-Abl의 강한 발현이 확인되었으나, 비히클(vehicle) 처리된 대조군 동물에서는 확인되지 않는다는 결과를 나타낸다. (D) 척수 내 TNF-α 및 IL-1β의 상대적 mRNA 발현을 실시간 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 당뇨병성 신경병증 통증을 GNF-2가 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 당뇨-유도된 통증 과민에 있어서, GNF-2의 역할을 확인하기 위한 실험 모식도를 나타낸다. GNF-2 투여 6 시간, 1 일, 2 일, 3 일 및 5 일 후에 측정한, 열적 자극에 대한 뒷발 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간(B) 및 기계적 자극에 대한 뒷발 회피반응 역치(C)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 GNF-2가 CFA-유도된 염증성 통증을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) CFA-유도된 염증성 통증에 있어서, GNF-2의 역할을 확인하기 위한 실험 모식도를 나타낸다. (B) CFA 투여 15분 전 뒷발에 GNF-2를 투여한 후, 발 부종을 측정한 결과를 나타낸다. GNF-2 투여에 따른 열적 자극에 대한 뒷발 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간(C) 및 기계적 자극에 대한 뒷발 회피반응 역치(D)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 c-Abl siRNA에 의한 c-Abl 발현 녹다운이 미세아교세포에서 LPS-유도된 산화질소 및 TNF-α 생산을 억제한다는 것을 나타낸다. (A) BV-2 녹다운의 실험모식도를 나타낸다. (B) siRNA 형질감염에 의해 Abl1 발현이 상당히 감소한다는 결과를 나타낸다. (C) siRNA 형질감염 후 LPS로 처리한 세포에서 측정된 NO 생산 결과를 나타낸다. (D) siRNA 형질감염 후 LPS로 처리한 세포에서 실시간 RT-PCR로 TNF-α mRNA를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 1차 미세아교세포 및 성상세포에서 GNF-2의 직접적인 표적으로서 c-Abl에 대한 기능적 검증 결과를 나타낸다. (A) LPS (1 ㎍/ml) 또는 TNF-α (10 ㎍/ml)에 의해 유도되는 산화질소 생산이 GNF-2 처리에 의해 상당히 감소된다는 결과를 나타낸다. (B) LPS (1 ㎍/ml) 및 IFNγ (50 U/ml)에 의해 유도되는 IL-1β 생산이 GNF-2 처리에 의해 상당히 감소된다는 결과를 나타낸다. (C) LPS (1 ㎍/ml) 및 IFNγ (50 U/ml)에 의해 유도되는 산화질소 생산이 GNF-2 처리에 의해서는 상당히 감소되지만, 메틸화된 GNF-2에 의해서는 감소되지 않는다는 결과를 나타낸다. (D) GNF-2 전처리를 통해 NFκB 활성화가 감소된다는 결과를 나타낸다. MGC에서 Abl1 유전자 발현의 siRNA 매개 녹다운이 LPS/IFNγ-유도된 NO 생산(E) 및 TNF-α mRNA 발현(F)을 상당히 감소시킨다는 결과를 나탄낸다. (G) Abl1 발현의 녹다운 및 IkB의 인산화를 웨스턴 블랏팅을 통해 분석한 결과이다.
도 4는 STZ-투여 동물 척수에서 c-Abl의 아교세포 발현을 나타낸다. (A) STZ 투여 1주일 후에 실시간 RT-PCR을 통해 측정된 척수에서의 Abl1 mRNAs 발현 결과를 나타낸다. (B) 면역염색을 통해 확인한 척수에서 c-Abl의 세포 위치를 나타낸다. (C) 면역형광분석을 통해, STZ-투여 마우스 척수에서 투여 3주 후에 아교세포 c-Abl의 강한 발현이 확인되었으나, 비히클(vehicle) 처리된 대조군 동물에서는 확인되지 않는다는 결과를 나타낸다. (D) 척수 내 TNF-α 및 IL-1β의 상대적 mRNA 발현을 실시간 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 당뇨병성 신경병증 통증을 GNF-2가 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) 당뇨-유도된 통증 과민에 있어서, GNF-2의 역할을 확인하기 위한 실험 모식도를 나타낸다. GNF-2 투여 6 시간, 1 일, 2 일, 3 일 및 5 일 후에 측정한, 열적 자극에 대한 뒷발 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간(B) 및 기계적 자극에 대한 뒷발 회피반응 역치(C)를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 GNF-2가 CFA-유도된 염증성 통증을 감소시킨다는 결과를 나타낸다. (A) CFA-유도된 염증성 통증에 있어서, GNF-2의 역할을 확인하기 위한 실험 모식도를 나타낸다. (B) CFA 투여 15분 전 뒷발에 GNF-2를 투여한 후, 발 부종을 측정한 결과를 나타낸다. GNF-2 투여에 따른 열적 자극에 대한 뒷발 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간(C) 및 기계적 자극에 대한 뒷발 회피반응 역치(D)를 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명은 GNF-2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 약학조성물은 미세아교세포(microglia) 및 성상세포(astrocytes) 내 염증 반응을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 신경염증 질환은 통증, 루게릭병, 다발성경화증 또는 헌팅턴병일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 통증은 당뇨병성 신경병증(Diabetic neuropathy; DN)에 의한 통증 또는 염증성 통증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "GNF-2"는 3-(6-(4-(trifluoromethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide[3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드]로서, 아래 화학식으로 표시되는 화합물이다.
[화학식]
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 GNF-2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 신경염증 질환은 통증, 루게릭병, 다발성경화증 또는 헌팅턴병일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 통증은 당뇨병성 신경병증(Diabetic neuropathy; DN)에 의한 통증 또는 염증성 통증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 세포배양
불멸화된 쥐 미세아교세포주(microglial cell line)인 BV-2 세포를 5% 열-불활성화된 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 50 mg/ml 젠타마이신이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)로 37℃에서 유지시켰다. 마우스 1차 미세아교세포 및 성상세포는 10% FBS, 10 U/ml 페니실린 및 10 mg/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Gibco, Grand Island, NY, USA)으로 37℃에서 5% CO2 습윤 대기 조건하에서 유지시켰다. 모든 동물들 및 실험 과정은 경북대학교 의과대학 연구윤리심의위원회의 승인을 받았고, 실험동물의 사용과 관리에 대한 NIH 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물들은 온도- 및 습도-조절되는 조건하에서 12시간 낮/12시간 밤 주기로 관리하였다. 마우스 1차 미세아교세포 및 성상세포 혼합 배양액은 이전에 공지된 방법을 약간 변형하여 마일드 트립신 처리를 통해 제조하였다(Saura, Glia 2003, 44, 183-189). 간단히 설명하면, 3-5일령 C57BL/6 마우스의 전뇌를 잘게 썰고, 나일론 메쉬를 이용하여 기계적인 파쇄를 통해 분해하였다. 상기 세포들은 폴리-L-리신-코팅된 플라스크에 접종하였다.
2. 산화질소 생산 측정
산화질소(nitric oxide; NO)의 생산은 안정적인 NO 대사체인 아질산염(nitrite)의 양을 측정함으로써 평가하였다. 라이브러리 유래 화합물의 존재 유무에 따라, BV-2 세포(40,000 cells/well in 96-well plates)는 LPS (100 ng/ml)로 처리하였다. 24 h 배양 기간 후에, 50 ul 세포 배양 배지를 동일 부피의 Griess reagent (0.1% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 및 5% 인산에 녹인 1% 설파닐아미드)와 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 혼합하였다. 흡광도는 540 nm에서 측정하였고, 아질산나트륨(sodium nitrite)을 표준곡선을 위해 사용하였다.
3. 세포
생존능
측정
세포 생존능은 변형된 3-(4,5 디메틸티아졸-2-일)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드[3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide; MTT] 분석을 사용하여 측정하였다. 화합물의 존재 유무에 따라 24시간 LPS 처리 후, 배양 배지를 흡입시켰다. MTT (0.5 mg/ml in PBS)를 세포에 첨가한 후, 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 잔여 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 이용하여 570 nm에서 측정하였다.
4.
TNF
-α에 대한 ELISA
GNF-2 존재 유무에 따라, BV-2 세포 또는 1차 세포를 LPS로 처리하였다. 배양 24시간 후, 포획 항체로서 랫트 단일클론 항-마우스 TNF-α항체 및 검출 항체로서 염소 비오틴화된 다중클론 항-마우스 TNF-α 항체(ELISA development reagent; R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 배양 배지 내 TNF-α 수준을 측정하였다. 재조합 TNF-α 단백질은 대조군으로 사용하였다.
5. 전통적인
PCR
및 실시간 RT-
PCR
전체 RNA는 TRIZOL reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 처리된 세포로부터 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) 및 an oligo (dT) primer를 시용하여, 역전사(reverse transcription; RT)를 수행하였다. 특이적인 프라이머 세트를 사용하여, 55 내지 60℃의 결합 온도에서 20 내지 30회, 전통적인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 증폭을 수행하였고, C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad, Richmond, CA, USA)를 사용하였다. PCR 산물 분석을 위해, 10 ml의 PCR 반응물 각각을 1% 아가로스 젤에서 전기영동시켰고, 에티디움 브로마이드 염색 후 자외선 하에서 검출하였다. 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)를 내부 대조군으로 사용하였다. Perfect Real-Time One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio, Otsu, Shiga, Japan)을 사용하여, 제조사의 지시에 따라 실시간 PCR을 수행하였다. 이후, ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, California, CA, USA)를 사용하여 검출하였다. GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였다. 프라이머 서열은 공개된 cDNA 서열을 기초로 디자인하였다.
6.
abl1
유전자 발현의
siRNA
-매개 녹다운
Lipofectamine ™(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여, 제조사의 지시에 따라 siRNAs로 세포들을 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 처리한 세포를 사용하였다. Abl1 siRNA (siRNA #2 and #3) 및 대조군 siRNA는 Genolution Pharmaceuticals (Seoul, Korea)로부터 구입하였다. siCont- 5'-CCUCGUGCCGUUCCAUCAGGUAGUU-3', siAbl1-#2, 5'-GCAACAAGCCCACUAUCUAUU-3', siAbl1-#3, 5'-UGAUGAAGGAGAUCAAACAUU-3'.
7. 동물 및 관리
모든 실험은 경북대학교 실험동물 관리 위원회에서 승인된 동물 프로토콜 및 가이드라인에 따라 수행하였다(Approval KNU-2018-0019). 사용된 동물의 수 및 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 다하였다. 8-10 주령의 수컷 야생형 마우스를 사용하였다. 동물들은 12시간 명암 주기 하에서 사육되었고(lights on 07:00-19:00), 23 ± 2℃의 일정한 환경 온도를 유지시켰으며, 음식 및 물은 자유롭게 제공하였다. 단일 실험 목적에 따라 각각의 개별적인 동물을 사용하였다.
8. CFA-유도 만성 염증
만성 염증은 CFA 투여를 통해 유도하였다. 간단히 설명하면, 마우스는 이소플루란(마취 유도를 위해 5% 및 마취 유지를 위해 2%)으로 조심스럽게 마취시킨 후, 왼쪽 뒷발(동측성 발)에 30 ul CFA (0.5 mg/ml; Sigma-Aldrich)를 피하 주사로 주입하였다. 대조군으로 분류된 마우스는 왼쪽 뒷발에 30 ul 식염수를 주입하였다. CFA 투여 전 및 투여 5일 후에, 기계적 발 회피반응 역치(paw withdrawal thresholds; PWTs) 및 열적 발 회피반응 시간(paw withdrawal latencies; PWLs)을 측정하였다.
9. CFA-유도된 발 부종 측정
CFA-유도된 발 부종(염증 정도 측정)은 발 두께 및/또는 너비로 정량화하였다. 처리 조건을 알지 못하는 한 명의 실험자가 모든 동물을 처리하고 시험하였다. 캘리퍼(caliper)를 사용하여, 발 중간 부위의 등쪽 두께 및 측면 너비를 측정하였다. 발 부위는 두께 및 너비로 계산하였다.
10. 당뇨 유도
C57BL/6J 마우스를 당뇨 유도에 사용하였다. 당뇨 마우스 모델은 이전에 보고된 대로 제작하였다. 간단히 설명하면, 0.1 M 시트레이트 완충액(pH 4.5)에 녹인 STZ (Sigma-Aldrich; 150 mg/kg 몸무게)를 복막 주사하여 제1형 당뇨를 유도하였다. 투여 1일 후, 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였고, SD CodeFreeTM glucometer (SD Biosensor Inc., Suwon, Korea)를 사용하여 당혈증(glycemia)을 측정하였다. 공복혈당 수치가 >260 mg/dl인 동물은 당뇨로 판단하였다. 본 발명에서는 모든 STZ-유도 동물들이 당뇨로 확인되었다.
11. 행동 시험
동물 실험 장소에 도착 후, 동일한 실험일의 실제 실험 전에 마우스들이 실험실, 장치 및 실험자에 1주일 동안 적응하도록 하였다. 동물 유전형 또는 처리 조건을 알지 못하는 한 명의 실험자가 모든 동물을 처리하고 시험하였다. 통증 행동의 측정 전에, 본 발명자들은 오픈 필드 테스트(open field test)를 수행하였다. 당뇨병성 신경병증과 관련된 기계적 이질통은 발 회피반응 역치(paw withdrawal threshold; PWT)를 측정하여 평가하였다. STZ 투여 전 및 이후 여러 시간 포인트에서, PWT를 측정하였다. 교정된 Von Frey filaments (BiosebTM, Chaville, France)를 사용하여 기계적 민감도를 시험하였다. 간단히 설명하면, 뒷발의 앞면을 확인하기 위해서, 마우스를 철망 실험대 위에 거꾸로 설치된 각각의 아크릴 상자에서 20분 동안 적응시켰다. Von Frey filaments를 발바닥 표면에 수직으로 접촉시키고, 약간 휘어질 정도의 충분한 힘으로 5초 이내로 자극하였다. 적어도 3분 간격으로 발 당 2번의 실험을 수행하였다. 갑작스러운 발 회피반응을 보이면 양성 반응으로 판단하였다. 양성 반응을 나타내면 약한 필라멘트로 자극하고, 반응이 없으면 강한 필라멘트를 사용하였다. Dixon's up-down method을 사용하여, 5번의 연속적인 반응으로부터 PWT를 정량화하였다. 유해한 열적 자극에 대한 PWL의 감소를 CFA에 의해 유도된 열적 통각 과민으로 판단하였다. Hargreaves' Plantar Test Analgesy-Meter (Ugo Basile)를 사용하여 PWLs를 측정하였다. 30℃로 유지되는 유리판 위에 거꾸로 놓은 투명 플라스틱 챔버에서 실험 전 30분 동안 마우스를 적응시켰다. 그 후, 전기적으로 발생된 열 자극(5.0 A로 셋팅)에 각각의 뒷발 발바닥 표면을 노출시켰다. 마우스가 자극으로부터 발 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간(PWL)은 자동적으로 기록되었다. 방사열의 세기는 기본 PWL이 9 내지 12초 사이, 20초의 컷오프가 되도록 조정하였는데, 이는 조직에 손상을 입는 것을 방지하기 위함이다. 평균 PWL 수치를 얻기 위해서, 실험은 3번 반복하여 수행하였고, 열적 자극 유도 민감화를 피하기 위해서 실험 사이에 5분의 간격을 두었다.
12. 면역조직화학 및 조직병리학 분석
마우스를 깊게 마취시킨 후, 0.1 M 포스페이트 완충 식염수(phosphate-buffered saline; PBS)로 동맥을 관류시키고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. L4, L5 및 L6 수준에서 요추부 척수 절편을 잘라냈고, 동일한 파라포름알데히드로 밤새도록 후-고정시켰으며, 0.1 M PBS에 녹인 30% 수크로스로 4℃에서 밤새도록 저온-보관하였다. 척수 조직의 30-μm-두께 절편을 제작하기 위해, 저온유지장치(cryostat)를 사용하였다. 척수 절편은 0.1 M PBS에 두었다. 그 후, 절편들은 0.3% Triton X-100에 녹인 4% 정상 혈청으로 90분 동안 상온에서 차단시켰다. 면역형광염색을 위해, 절편들을 C-abl (rabbit, 1:100; Santa Cruz), Iba-1 (goat, 1:200; Novus Biologicals, Littleton, CO) 또는 GFAP (mouse, 1:500; BD Biosciences)에 대한 1차 항체로 4℃에서 밤새도록 반응시킨 후, FITC- 또는 Cy3-접합 2차 항체(1:200; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 반응시켰다. 슬라이드를 씻어냈고, Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 커버슬립하였고, 형광현미경 하에서 가시화하였다.
13.
웨스턴
블랏팅
분석
세포들은 차갑게 한 PBS로 씻어냈고, HaltTMprotease inhibitor (1×) 및 phosphatase protease inhibitor mixtures (1×) (Thermo Scientific)가 포함된 300 μl 용해 완충액(150 mM 소듐 클로라이드, 1% Triton X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM EDTA) (GenDEPOT, Barker, TX)에 놓았다. 검체는 각각 균질화시킨 후, 13,400 × g 로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 단백질 농도는 Bio-Rad protein assay kit로 측정하였고, 소 혈청 알부민을 표준으로 사용하였다. 8 또는 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 상에서 각 샘플로부터 단백질(20-30 ㎍)을 분리하였고, 반건조 전자블랏팅 방법(semidry electroblotting method)을 통해 PVDF 멤브레인(Bio-Rad)으로 옮겼다. 상기 멤브레인은 5% 스킴 밀크로 차단시켰고, C-abl (rabbit monoclonal antibody, 1:1000; Santa Cruz), p-ERK, ERK, p-p65, p-IKB, IkB (rabbit monoclonal antibody, 1:1000; Cell Signaling) 또는 α-tubulin (mouse monoclonal antibody, 1:2000; Sigma-Aldrich)에 대한 1차 항체 및 겨자무 퍼록시다제 접합 2차 항체(anti-rabbit and anti-mouse IgG antibody; Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 연속적으로 반응시켰으며, 향상된 화학발광 검출(Amersham Biosciences)을 수행하였다. 웨스턴 블랏팅은 각 조건에 대해 3번 반복하였다(n = 3).
14. 정량화 및 통계학적 분석
면역조직화학 분석을 위해, 3-4 조직 절편/동물에서 현미경 이미지를 얻었다(×40 대물렌즈 사용). 유사하게, 3-4 조직 절편/동물에서 L4-L6 부위로부터 척수 후각(dorsal horn)의 현미경 이미지를 얻었다(×20 대물렌즈 사용). 면역염색된 조직의 이미지를 Olympus DP70 camera 및 DP Controller software (Olympus)로 포획하였다. 통계학적 분석을 위해 적어도 3개의 현미경 이미지들이 임의적으로 선택되었는데, 이는 전체 조직을 더 잘 대표하는 이미지를 얻기 위함이다. 면역형광 세기의 측정을 위해, 전체 이미지 영역이 선택되었고, 평균 세기는 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 측정하였다. 마찬가지로, 웨스턴 블랏팅을 통해 얻은 밴드의 세기도 ImageJ를 사용하여 정량화하였다. 또한, 밴드의 배경 세기도 측정하였고, 이를 얻어낸 수치에서 뺐다. 그래프는 모든 이미지의 평균을 나타낸다. 모든 결과는 평균 ± S.E로 나타냈다. 통계학적 비교는 Student's t test 또는 one-way analysis of variance (ANOVA) with Dunnett's multiple-comparison 또는 two-way ANOVA test by using SPSS version 22.0K (SPSS Inc., Chicago, IL) 중 하나로 수행하였다. Mann-Whitney test 및 one-way ANOVA with Dunnett's multiple-comparison tests는 단일 구간에서 von Frey filaments with the up-down paradigm에 의해 측정된 PWTs를 비교하기 위해 사용되었다. 확률 수치가 0.05 미만(p < 0.05)의 차이를 나타내면, 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
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실시예
1> 시험관 내에서(in vitro)
LPS
-유도 신경염증을 억제하는
GNF
-2
c-Abl 과발현은 마우스 전뇌의 신경 감소 및 신경염증을 유도한다. 또한, c-Abl은 산화스트레스 및 염증 반응에 의해 활성화되고, 이의 활성화는 NF-κB 활성화를 증가시킨다. 우선, c-Abl 억제제가 미세아교세포 활성화를 억제하는지 확인하였다. 불멸화된 마우스 미세아교세포인 BV-2 세포를 GNF-2 전처리 후, LPS로 자극하였다. GNF-2는 LPS-유도된 산화질소 생산 및 TNF-α을 상당히 억제하였다(도 1A 및 도 1C). 또한, 전염증 사이토카인인 IL-1β 발현은 LPS 처리에 의해 상향조절되었고, GNF-2는 LPS-유도된 IL-1β mRNA 발현을 상당히 감소시켰다(도 1D). 다음으로, GNF-2가 BV-2에서 LPS-유도된 NF-κB 활성화를 감소시키는지 확인하였다. 명백하게, 본 발명자들은 미세아교세포에서 LPS에 의해 유도된 NF-κB 활성화가 GNF-2 처리로 인해 상당히 감소하는 것을 관측하였다(도 1E).
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실시예
2> 시험관 내에서(in vitro)
LPS
-유도된 신경염증을 억제하는 c-
Abl
발현 녹다운
성체 마우스 전뇌 뉴런에서 활성 c-Abl의 발현은 특히, 해마의 CA1 부위에서 심각한 신경퇴행을 야기시킨다. 상당한 미세아교세포화(microgliosis) 및 성상세포화(astrocyctosis)에 의해 신경 감소가 선행되었고, 동반되었다. 하지만, 미세아교세포에서의 c-Abl 기능은 여전히 밝혀지지 않았다. 미세아교세포에서 c-Abl 발현의 역할을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 BV-2 세포를 siAbl1로 형질감염시켰고, 미세아교세포에서 c-Abl 발현을 확인하였다(도 2A 및 도 2B). c-Abl의 녹다운(50% KD 이상)은 LPS-유도된 산화질소 생산을 상당히 억제하였다(도 2C). 또한, 전염증 사이토카인인 TNF-α mRNA 발현은 LPS 처리에 의해 상향조절되었고, c-Abl에 대한 siRNA는 LPS-유도된 TNF-α mRNA 발현을 상당히 감소시켰다(도 2D).
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실시예
3> 1차 미세아교세포 및
성상세포에서
GNF
-2의 항-신경염증 효과 검증
다음으로, 미세아교세포 및 성상세포가 신경염증에서 주요 인자이므로, 본 발명자들은 1차 혼합 아교세포에서 GNF-2의 항-염증 효과를 확인하였다. 세포들은 96-웰 플레이트 상에 접종하였고, LPS 및 INFγ와 함께 GNF-2로 처리하고 24시간 후에 NO 방출을 확인하였다. BV-2 세포에서와 같이, GNF-2는 LPS-유도 NO 방출을 상당히 억제하였다(도 3A). 다음으로, 본 발명자들은 TNF-α 처리와 같은 다른 염증 자극을 이용하여 항-염증 효과를 확인하였다. 역시, 아교세포에서 GNF-2는 TNF-α-유도된 NO 생산을 상당히 억제하였다(도 3C). 이후, 본 발명자들은 1차 아교세포에서 GNF-2가 LPS-유도된 전-염증 매개체들의 생산을 억제하는지 확인하였다. IL-1β 생산 및 NF-κB 활성화는 GNF-2 전처리에 의해 크게 억제되었다(도 3B 및 도 3D). 또한, c-Abl의 녹다운은 1차 아교세포에서 LPS-유도된 산화질소 생산(도 3E), TNF-α mRNA 발현(도 3F) 및 NF-κB 활성화(도 3G)를 상당히 억제시켰다.
<
실시예
4> 척수 아교세포에서 c-
Abl의
발현 및
STZ
-유도된 DM 모델 마우스에서 전염증 사이토카인의 발현
다음으로, 본 발명자들은 STZ 투여 1 주일 후, 마우스에서 STZ-유도된 당뇨가 척수 내 상당한 c-abl 발현 증가를 동반한다는 것을 확인하였다(도 4). 척수에서 c-Abl 발현을 확인하기 위해서, 면역염색 및 RT-PCR을 수행하였다. STZ-유도 DM 마우스의 요추부 척수 절편에서, 척수 후각(dorsal horn) 내 GFAP-양성 성상세포 수가 상당히 증가하는 것을 관측하였는데, 여기서 미세아교세포는 형태학적 반응성 변화를 가진 향상된 Iba-1 면역반응성을 나타냈다. 마찬가지로, GFAP-양성 성상세포의 수는 WT 마우스의 척수 후각에서도 눈에 띄게 증가하였는데, 이는 두꺼워지는 과정으로 GFAP 면역반응성 및 비대 형태 증가를 동반하였다. 또한, STZ-투여한 마우스의 GFAP 양성 세포에서 c-Abl 발현이 크게 상향조절되었다.
<
실시예
5> 당뇨-유도된 통증 과민을 감소시키는 c-
Abl의
약학적 억제 효과
본 발명자들은 시험관 내(in vitro) 연구에서, GNF-2의 처리가 신경염증을 보호한다는 것을 명백하게 확인하였다. 이러한 결과를 기초로, STZ-유도된 DM 마우스 모델에서 염증성 말초 통증에 대한 약학적 효과를 검증하였다(도 5).
통증성 당뇨병성 신경병증의 발병 기작에 있어, c-Abl 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 c-Abl의 약학적 억제를 통해 확인하였다. 통증성 당뇨병성 신경병증을 가진 마우스에서 GNF-2 (10 mg/kg)의 단일 복막 투여(STZ 주입 2주 후)는 당뇨 유도 이질통 뿐만 아니라 열성 통각과민도 투여 후 6시간 내지 1일 내에 상당히 감소시켰다. 하지만, 비히클(vehicle) 단독군에서는 기계적 자극에 대한 회피반응 역치 및 열적 자극에 대한 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간에 있어 변화는 없었다.
다음으로, 본 발명자들은 STZ-투여 3주 후 척수에서 GNF-2의 발현 및 역할을 조사하였다.
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실시예
6> 생체 내(in
vivo
) CFA-투여 모델에서 염증성 통증을 개선하는 GNF-2의 효과
이전 연구들과 동일하게, CFA-투여 마우스 모델은 뒷발 부종, 뒷발 및 척수에서의 전염증 사이토카인 방출 및 통증 과민과 같은 표현형을 포함하는 여러 주요 말초 염증성 통증을 되풀이하여 나타냈다. 이에 본 발명자들은 마우스 모델에서 GNF-2의 투여가 통증 과민을 억제할 수 있는지 확인하였다.
염증 유래 만성 통증 발병 기작에 있어 c-Abl의 중심 역할을 더 확인하기 위해서, 본 발명자들은 CFA-유도된 염증성 통증에 있어 c-Abl의 약학적 억제 효과를 조사하였다. CFA 주입 후 마우스 뒷발에 c-Abl 억제제인 GNF-2를 투여하면, 발 부종 형성을 상당히 감소시켰고(도 6B), 기계적 이질통 뿐만 아니라 열성 통각과민의 증상도 상당히 감소시켰다(도 6C 및 도 6D).
또한, GNF-2의 척수 내 단일 주입은 GNF-2 투여 후 1일 이내에 기계적 이질통 및 열성 통각과민을 상당히 억제시켰으나, GNF-2의 항-이질통 효과는 용량 의존적 방식에 있어 말초 통증 보호가 가역적인 것으로 나타났다(도 6D). CFA 및 GNF-2 처리 후, 반대측 뒷발에서의 기계적 자극에 대한 회피반응 역치 및 열적 자극에 대한 회피반응을 나타내는데 걸리는 시간은 변화가 없었다. 상기 결과들은 GNF-2 처리된 마우스를 통해, 만성 염증성 통증에 있어 c-Abl이 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침한다. 또한, 상기 결과들은 염증성 통증에 있어서 중추 또는 말초 c-Abl 모두 중요하다는 것을 나타내고 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (7)
- 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드[3-(6-(4-(trifluoromethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide; GNF-2] 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 신경병증(Diabetic neuropathy; DN)에 의한 통증 또는 신경염증성 통증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약학조성물은 미세아교세포(microglia) 및 성상세포(astrocytes) 내 염증 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병성 신경병증(Diabetic neuropathy; DN)에 의한 통증 또는 신경염증성 통증 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 삭제
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- 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤즈아미드[3-(6-(4-(trifluoromethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide; GNF-2] 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병성 신경병증(Diabetic neuropathy; DN)에 의한 통증 또는 신경염증성 통증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180127530A KR102135614B1 (ko) | 2018-10-24 | 2018-10-24 | Gnf-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180127530A KR102135614B1 (ko) | 2018-10-24 | 2018-10-24 | Gnf-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200046410A KR20200046410A (ko) | 2020-05-07 |
| KR102135614B1 true KR102135614B1 (ko) | 2020-07-22 |
Family
ID=70733638
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|---|---|---|---|
| KR1020180127530A KR102135614B1 (ko) | 2018-10-24 | 2018-10-24 | Gnf-2를 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR102135614B1 (ko) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004089286A2 (en) | 2003-04-04 | 2004-10-21 | Irm Llc | Novel compounds and compositions as protein kinase inhibitors |
| WO2016114655A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Ry Pharma B.V. | Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation |
| WO2017065602A1 (en) * | 2015-10-13 | 2017-04-20 | Ry Pharma B.V. | Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101548803B1 (ko) | 2013-09-09 | 2015-09-01 | 경북대학교병원 | ３（６（４（트리플루오로메톡시）페닐아미노）피리미딘４일）벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
-
2018
- 2018-10-24 KR KR1020180127530A patent/KR102135614B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004089286A2 (en) | 2003-04-04 | 2004-10-21 | Irm Llc | Novel compounds and compositions as protein kinase inhibitors |
| WO2016114655A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Ry Pharma B.V. | Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation |
| WO2017065602A1 (en) * | 2015-10-13 | 2017-04-20 | Ry Pharma B.V. | Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation |
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| Publication number | Publication date |
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| KR20200046410A (ko) | 2020-05-07 |
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