KR102134954B1

KR102134954B1 - siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof

Info

Publication number: KR102134954B1
Application number: KR1020180002350A
Authority: KR
Inventors: 이옥준; 손승명
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-08
Filing date: 2018-01-08
Publication date: 2020-07-16
Also published as: KR20190084517A

Abstract

본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 발현 억제를 위한 siRNA 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)를 포함하는 siRNA 전달 복합체에 관한 것으로, 본 발명의 siRNA 전달 복합체를 이용하면 산성 미세환경의 종양세포에서 CEACAM6를 효과적으로 억제하므로 선암 치료제로 유용하게 이용할 수 있다. The present invention relates to an siRNA delivery complex comprising siRNA and a pHLIP (low pH-induced transmembrane structure) for inhibiting CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) expression, the acidic microparticles using the siRNA delivery complex of the present invention Since it effectively suppresses CEACAM6 in tumor cells in the environment, it can be useful as a therapeutic agent for adenocarcinoma.

Description

CEACAM6 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 선암 치료제{siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof}SiRNA for inhibiting CEACAM6 expression and adenocarcinoma therapeutic agent comprising the same {siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof}

본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 선암 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to siRNA for suppressing the expression of CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) and a therapeutic agent for adenocarcinoma comprising the same.

암은 선진국에 있어서 사망률의 주요 원인이다. 암치료의 목적으로 많은 화학요법제가 과거 50년간에 개발되었다. 화학요법제의 대부분은 알킬화제, 대사길항제, 안트라사이클린(anthracycline), 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제 및 항종양제로 분류할 수 있다. 이들 약제 모두가 세포분열 또는 DNA의 합성에 영향을 미쳐 어떠한 형태로 기능하는 메커니즘을 통해 치료효과를 초래한다.Cancer is a major cause of mortality in developed countries. For the purpose of cancer treatment, many chemotherapy agents have been developed in the past 50 years. Most chemotherapeutic agents can be classified into alkylating agents, metabolic antagonists, anthracyclines, plant alkaloids, topoisomerase inhibitors, and anti-tumor agents. All of these agents affect cell division or the synthesis of DNA, resulting in a therapeutic effect through a mechanism that functions in some form.

선암(adenocarcinoma)은 특히 선(gland)을 구성하고 있는 세포에서 발생하는 암으로서 위 ·장 ·기관지 ·자궁(체부) ·담낭 등의 점막을 비롯하여, 전립선·난소 ·갑상선 ·이자의 선 조직이나 배설관에서 발생한다. 암 중에서 가장 많이 발생하는 위암의 대부분이 선암을 나타내지만, 자궁경부암의 대부분은 편평상피암이고 선암은 드물다. 양성인 선종과 비슷하며 악성을 나타내는 것도 있는데 이것은 특히 악성선종이라 한다. Adenocarcinoma is a cancer that occurs especially in the cells that make up the gland, including the mucous membranes of the stomach, intestines, bronchi, uterus (body), and gallbladder, as well as the glandular tissue or excretion of the prostate, ovaries, thyroid, and interest. Occurs in the coffin. Most of the most common gastric cancers represent adenocarcinoma, but most of cervical cancers are squamous cell carcinomas and adenocarcinomas are rare. It is similar to a benign adenoma and has a malignancy, which is especially called a malignant adenoma.

이러한 선암종이 진행됨에 따라 암의 단계를 확인할 수 있으며 수술, 화학요법 및 방사선을 이용하여 치료를 하게 된다. As the adenocarcinoma progresses, the stage of the cancer can be confirmed and treatment is performed using surgery, chemotherapy, and radiation.

종래의 화학요법제 대신에 최근 들어 암세포에 특이적으로 발현하는 분자를 표적으로 하는 분자 표적약의 개발이 진행되고 있다. 이러한 분자 표적약의 등장에 의해 종래의 화학요법제에 고유의 부작용이 회피되어 암환자의 삶의 질(QOL)에 기여하는 암치료가 가능해져 있다. 이러한 분자 표적약에는 저분자(small molecule)의 약제 외에 항체 등의 고분자의 약제도 포함되며, 치료 항체는 생체내에 선천적으로 존재하는 분자로 생체에 미치는 독성이 낮다는 이점 외에, 이펙터 기능을 매개로 한 작용 메커니즘에 의해 표적 세포를 특이적으로 상해하여 치료효과를 발휘하는 이점도 갖기 때문에, 최근 많은 치료 항체가 시판되고 있으나 아직까지 암 종류에 따라 고형암 표적 치료제는 시도된 바 없다. In recent years, instead of conventional chemotherapeutic agents, the development of molecular targeting drugs targeting molecules specifically expressed in cancer cells has been developed. With the advent of these molecular target drugs, side effects inherent in conventional chemotherapeutic agents are avoided, and cancer treatments contributing to the quality of life (QOL) of cancer patients are possible. In addition to the small molecule drug, such a molecular target drug includes a drug such as an antibody, and a therapeutic antibody is a molecule inherently present in the living body, and besides the advantage of low toxicity to the living body, the effector function is mediated. Since it also has the advantage of exerting a therapeutic effect by specifically injuring a target cell by an action mechanism, many therapeutic antibodies are commercially available, but solid cancer targeted therapeutics have not been tried depending on the type of cancer.

(0001) 대한민국 공개 특허 KR10-2017-0128567(0001) Republic of Korea Patent KR10-2017-0128567 (0002) 대한민국 공개 특허 KR10-2009-0111299(0002) Republic of Korea Patent KR10-2009-0111299

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하며, 서열번호 1로 표기되는 염기서열 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)을 포함하는 것인 siRNA 전달 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다. In order to solve the above object, the present invention suppresses the expression of CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) gene, and includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a low pH-induced transmembrane structure (pHIP) Phosphorus siRNA delivery complex and to provide a method for producing the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하며, 서열번호 1로 표기되는 염기서열 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)을 포함하는 것인 siRNA 전달 복합체를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention inhibits the expression of CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) gene, and includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a low pH-induced transmembrane structure (pHIP) A siRNA delivery complex is provided.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 시스테인(Cys)을 포함하는 PNA 올리고머를 m-크레졸 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단하는 단계;In addition, the present invention comprises the steps of cutting a PNA oligomer comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and cysteine (Cys) from a resin using an m-cresol solution;

TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 서열번호 1로 표시되는 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합하여 역상 고속 액체 크로마토 그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 합성된 PNA 올리고머를 정제하는 단계; 및Reverse-phase high-speed liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) by binding TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine) to the amino acid (N) terminal of the PNA represented by SEQ ID NO: 1 Purifying the PNA oligomer synthesized by; And

PNA 올리고머의 C-말단에 서열번호 3으로 표시되는 PHIP 서열을 상기 PNA 올리고머의 C-말단과 이황화 결합을 형성시키는 단계를 포함하는 CEACAM6 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 전달 복합체의 제조방법을 제공한다. It provides a method for producing a siRNA delivery complex that inhibits the expression of the CEACAM6 gene, comprising the step of forming a disulfide bond with the C-terminus of the PNA oligomer at the PHIP sequence represented by SEQ ID NO: 3 at the C-terminus of the PNA oligomer.

또한, 본 발명은 상기 siRNA 전달 복합체를 포함하는 선암(adenocarcinoma)을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating adenocarcinoma containing the siRNA delivery complex.

본 발명의 CEACAM6 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 전달 복합체는 CEACAM6를 조절하는 siRNA를 산성 미세환경을 이용한 pHLIP로 정밀 주입하는 표적치료제로서 정상 조직에 일어나는 부작용을 최소화하면서 선암을 예방 및 치료하는데 유용하게 이용할 수 있다.The siRNA delivery complex that inhibits the expression of the CEACAM6 gene of the present invention is a targeted therapeutic agent that precisely injects siRNA regulating CEACAM6 into pHLIP using an acidic microenvironment, and is usefully used to prevent and treat adenocarcinoma while minimizing side effects occurring in normal tissue Can.

도 1은 폐 선암에서 CEACAM6 발현의 Kaplan-Meier 생존 분석결과를 나타낸 그래프이다(log-rank test, P = 0.0262).
도 2는 비표적 siRNA, GAPDH siRNA 및 4가지 siCEACAM6 서열로 형질 감염된 A549 세포주에서 CEACAM6 mRNA 발현양을 RT-PCR 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 PNA(siCEACAM6)와 pHLIP의 반응 혼합물(pHLIP-PNA)을 HPLC를 사용하여 정제한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 pH 6.2에서 pHLIP-siCEACAM6(100, 250, 500nM) 및 pHLIP-scr과 48 시간 동안 배양한 A549 세포의 웨스턴 블럿 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 pH 7.4(청색) 또는 6.2(적색)에서 48시간 동안 pHLIP-siCEACAM6 및 pHLIP-scr(500nM)으로 배양된 A549 세포의 유동 세포 계측 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 중성 및 산성 pH 값에서 A549 세포 생존 능력에 대한 CEACAM6 억제 효과를 나타낸 그래프이다: ANOVA로 수행된 통계 분석 및 데이터는 평균 ± S.D; n = 3인 화합물; *** P <0.001.
도 7은 (왼쪽)~44.8 mm³ A549 종양이 있는 누드 마우스에게 pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴을 정맥 주사하고 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다: Student 's t-test로 수행된 통계 분석 및 데이터는 평균 ± S.D로 표시됨 n = 5 인 경우; *** P <0.001.
(오른쪽)pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴 주입 3주 후 마우스의 폐 종양을 나타낸 사진이다.
도 8은 pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴이 처리된 폐 종양에서 Ki-67의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 9는 pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴이 처리된 폐 종양에서 아폽토시스 세포(CC3)의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 10은 부형제(vehicle), pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴으로 처리된 마우스의 폐 종양에 대한 조직학 및 면역 조직 화학 염색한 것을 확인한 사진이다.
도 11은 pHLIP-siCEACAM6(4 mg/kg)으로 처리된 마우스의 폐 종양을 공초점 현미경으로 찍은 사진이다: PNA-TAMRA(적색), 핵(파란색).
도 12A는 siCEACAM6와 cisplatin 병용 요법의 병용 치료한 실험적 설계한 것을 나타낸 모식도이다.
도 12B는 ~44.8 mm³ A549 종양이 있는 마우스에게 지시된 시간(화살표)에 pHLIP-siCEACAM6 또는 시스플라틴을 정맥 내 주사하여 종양 체적을 측정한 것을 나타낸 그래프이다: Student 's t-test로 수행된 통계 분석 및 데이터는 평균 ± S.D로 표시됩니다. n = 5인 경우; ** P <0.01, *** P <0.001.
도 13은 부형제(vehicle), pHLIP-siCEACAM6, 시스플라틴 및 pHLIP-siCEACAM6와 시스플라틴 병용처리한 폐 종양에서 Ki-67의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 14는 부형제(vehicle), pHLIP-siCEACAM6, 시스플라틴 및 pHLIP-siCEACAM6와 시스플라틴 병용처리한 폐 종양에서 아폽토시스 세포(CC3)의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 15는 부형제(vehicle), pHLIP-siCEACAM6, 시스플라틴 및 pHLIP-siCEACAM6와 시스플라틴 병용처리한 마우스의 폐 종양을 공초점 현미경으로 찍은 사진이다: PNA-TAMRA(적색), 핵(파란색).
도 16은 본 발명에서 제작한 pHLIP-scr 및 pHLIP-siCEACAM6에 대한 구조를 나타낸 도이다.1 is a graph showing the results of Kaplan-Meier survival analysis of CEACAM6 expression in lung adenocarcinoma (log-rank test, P = 0.0262).
2 is a graph showing the results of RT-PCR measurement of CEACAM6 mRNA expression levels in A549 cell lines transfected with non-target siRNA, GAPDH siRNA and four siCEACAM6 sequences.
3 is a graph showing the results of purifying the reaction mixture (pHLIP-PNA) of PNA (siCEACAM6) and pHLIP using HPLC.
4 is a graph showing the results of Western blot analysis of A549 cells cultured for 48 hours with pHLIP-siCEACAM6 (100, 250, 500 nM) and pHLIP-scr at pH 6.2.
5 is a graph showing the results of flow cytometry analysis of A549 cells cultured with pHLIP-siCEACAM6 and pHLIP-scr (500nM) at pH 7.4 (blue) or 6.2 (red) for 48 hours.
6 is a graph showing the effect of CEACAM6 inhibition on A549 cell viability at neutral and acidic pH values: statistical analysis and data performed with ANOVA mean ± SD; n=3; *** P <0.001.
FIG. 7 is a graph showing the results of intravenous injection of pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin and measurement of tumor volume in nude mice with (left) to 44.8 mm ³ A549 tumors: statistical analysis and data performed with Student's t-test Is expressed as mean±SD when n=5; *** P <0.001.
(Right) Photo showing lung tumors of mice 3 weeks after injection of pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin.
8 is a graph quantifying the cell number of Ki-67 in lung tumors treated with pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin: Error bars are SD (n = 5 tumors per group).
9 is a graph quantifying the cell number of apoptotic cells (CC3) in lung tumors treated with pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin: Error bars are SD (n = 5 tumors per group).
10 is a photograph confirming histological and immunohistochemical staining of lung tumors of mice treated with vehicle, pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin.
11 is a photograph of lung tumors of mice treated with pHLIP-siCEACAM6 (4 mg/kg) under a confocal microscope: PNA-TAMRA (red), nucleus (blue).
12A is a schematic diagram showing the experimental design of a combination treatment of siCEACAM6 and cisplatin combination therapy.
12B is a graph showing the measurement of tumor volume by intravenous injection of pHLIP-siCEACAM6 or cisplatin at the indicated time (arrow) in mice with ˜44.8 mm ³ A549 tumors: statistics performed with Student's t-test Analysis and data are presented as mean ± SD. when n=5; ** P <0.01, *** P <0.001.
13 is a graph quantifying the number of cells of Ki-67 in lung tumors treated with vehicle, pHLIP-siCEACAM6, cisplatin and pHLIP-siCEACAM6 with cisplatin: Error bars are SD (n = 5 tumors per group).
14 is a graph quantifying the number of cells of apoptotic cells (CC3) in lung tumors treated with vehicle, pHLIP-siCEACAM6, cisplatin and pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin: Error bars are SD (n = 5 tumors per group ).
FIG. 15 is a confocal microscope photograph of lung tumors of mice treated with vehicle, pHLIP-siCEACAM6, cisplatin and pHLIP-siCEACAM6 with cisplatin: PNA-TAMRA (red), nucleus (blue).
16 is a view showing the structure of the pHLIP-scr and pHLIP-siCEACAM6 prepared in the present invention.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

이에 본 발명자들은 선암에서 과발현하는 CEACAM6를 억제하기 위하여 산성환경에서만 작용하는 펩티드벡터(pHLIP)와 CEACAM6에 대한 siRNA(siCEACAM6)를 peptide nucleic acid(PNA) 형태로 제작한 것을 연결하여 새로운 siRNA 전달 복합체를 제조하여 종양 특이 산성 미세환경을 표적으로 펩티드에 연결된 siRNA(siCEACAM6)가 암 세포막을 통과하게 하였으므로 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors linked the production of a new siRNA delivery complex by connecting a peptide vector (pHLIP) that works only in an acidic environment and siRNA (siCEACAM6) for CEACAM6 in the form of peptide nucleic acid (PNA) to suppress CEACAM6 overexpressing in adenocarcinoma. The present invention was completed because a siRNA (siCEACAM6) linked to a peptide targeting a tumor-specific acidic microenvironment was passed through a cancer cell membrane.

본 발명은 siRNA(small-interfereing RNA) 전달 복합체로서, 하기의 구조식을 갖고, CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하며, 하기 구조식은 서열번호 1로 표기되는 염기서열 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)을 포함하는 것인 siRNA 전달 복합체를 제공한다.The present invention is a siRNA (small-interfereing RNA) delivery complex, has the following structural formula, inhibits the expression of CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) gene, the following structural formula is the sequencing sequence represented by SEQ ID NO: 1 It provides a siRNA delivery complex comprising a pHLIP (low pH-induced transmembrane structure).

[구조식 1][Structural Formula 1]

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표기되는 염기서열은 서열번호 2로 CEACAM6 유전자의 siRNA를 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 제작한 것이다(도 16 참조). In one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a siRNA of the CEACAM6 gene with SEQ ID NO: 2 produced in the form of peptide nucleic acid (PNA) (see FIG. 16).

본 발명의 일실시예에서, 상기 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)는 서열번호 3으로 표시되는 암의 산성환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터인 것이다.In one embodiment of the present invention, the pHLIP (low pH-induced transmembrane structure) is a peptide vector that selectively functions as a nanosyringe in the acidic environment of cancer represented by SEQ ID NO: 3.

본 발명의 "pHLIP"는 암의 산성 미세환경을 이용한 펩티드 벡터(peptide vector)이다. 암세포는 생존을 위해 정상세포보다 많은 양의 포도당을 소모하며, 산소 농도에 관계없이 대부분을 젖산으로 대사하며 이렇게 형성된 젖산과 수소 이온은 암세포 밖으로 배출되어 종양의 세포외 환경은 산성화가 된다. 암 산성환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터(low pH-induced transmembrane structure, pHLIP)가 Reshetnyak 등에 의해 개발되었고, 이를 이용해 분자량이 작은 물질을 세포 내부로 주입할 수 있으며, 펩티드 벡터는 산성 환경에서만 세포막을 통과하며 안정적인 나선구조를 형성하여 시린지 역할을 하게 된다. 펩티드 벡터의 C 말단에 운반 물질을 연결하면 세포질 내에서 이황화결합이 풀리며 작용하므로 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 PNA 올리고머의 C 말단과 연결하였다."PHLIP" of the present invention is a peptide vector using an acidic microenvironment of cancer. Cancer cells consume more glucose than normal cells to survive, and most of them metabolize to lactic acid regardless of oxygen concentration, and the lactic acid and hydrogen ions thus formed are released outside the cancer cells, and the extracellular environment of the tumor becomes acidified. A peptide vector (low pH-induced transmembrane structure, pHLIP) that selectively functions as a nanosyringe in a cancerous acidic environment was developed by Reshetnyak, and can be used to inject a substance with a small molecular weight into the cell. It passes through the cell membrane only in an acidic environment and forms a stable spiral structure, acting as a syringe. When a carrier is connected to the C-terminal of the peptide vector, disulfide bonds are released and function in the cytoplasm, and thus, in the present invention, the C-terminal of the PNA oligomer comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was linked.

본 발명의 "CEACAM6"는 CEA family에 속하는 당단백질로 대부분의 선암에서 과발현되며, 정상세포에서는 매우 낮게 발현된다."CEACAM6" of the present invention is a glycoprotein belonging to the CEA family, which is overexpressed in most adenocarcinomas and expressed very low in normal cells.

본 발명의 "PNA(peptide nucleic acid)"는 펩디드유사인 백본(backbone) 곁사슬에 핵산염기가 결합한 구조를 갖춘 DNA 또는 RNA와 결합할 수 있는 중성인 유전자제어분자이고, PNA/DNA 2중사슬 쪽이 DNA/DNA 결합보다 열안정성이 크며, DNA 2중사슬에 대해 어느 쪽 사슬 염기배열의 일부와 상보적인 염기를 갖춘 PNA분자는 DNA 2중 사슬에 대해 강제적으로 2중 사슬을 풀어 기의 한쪽과 DNA-PNA 2중 사슬을 외가닥으로 하는 강력한 결합능력을 갖고 있다. PNA를 제작하기 위하여, 고상 합성(Solid Phase Synthesis) 방법 등을 사용한 커플링-캡핑-디프로텍팅(Coupling-Capping-Deprotecting)를 이용하여 원하는 염기서열을 갖도록 제조할 수 있다. 상기 PNA의 염기서열의 길이는 크게 제한되지는 않으나, 약 5 내지 30개, 바람직하게는 약 10 내지 20개의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다."PNA (peptide nucleic acid)" of the present invention is a neutral gene control molecule capable of binding to a DNA or RNA having a structure in which a nucleic acid base is bonded to a backbone side chain that is a peptide-like, PNA/DNA double chain PNA molecules with a base complementary to a portion of either chain nucleotide sequence for the DNA double chain have a greater thermal stability than the DNA/DNA bond, and forcibly unwind the double chain to the DNA double chain. And DNA-PNA double chain with strong binding ability. In order to produce PNA, it can be prepared to have a desired nucleotide sequence by using coupling-capping-deprotecting using a solid phase synthesis method or the like. The length of the base sequence of the PNA is not greatly limited, but it is preferred to have about 5 to 30 bases, preferably about 10 to 20 base sequences.

아울러 PNA로 제작하면 극성을 띠지 않아 안정적이고 생체 내에서 쉽게 분해되지 않으며 표적 DNA 혹은 RNA와 매우 강하게 결합하는 특징으로 인해 세포 내부로 주입하기 적합하므로 본 발명에서는 pHLIP를 통해 주입할 물질로 siRNA를 PNA 형태로 제작하였다.In addition, since it is made of PNA, it is stable because it does not have polarity, and is not easily degraded in vivo, and is suitable for injecting into cells due to its very strong binding to target DNA or RNA. In the present invention, PNA siRNA is injected as a material to be injected through pHLIP. It was produced in the form.

상기 구조식 1의 "AEEEA"는 친수성 링커(hydrophilic linker)의 역할을 위해 PNA 서열의 앞과 뒤에 추가하였다."AEEEA" of the structural formula 1 was added before and after the PNA sequence for the role of a hydrophilic linker.

또한, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 시스테인(Cys)을 포함하는 PNA 올리고머를 m-크레졸 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단하는 단계;In addition, the PNA oligomer comprising the base sequence and cysteine (Cys) represented by SEQ ID NO: 1 using m-cresol solution to cut from the resin (resin);

TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 서열번호 1로 표시되는 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합하여 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 합성된 PNA 올리고머를 정제하는 단계; 및Reverse-phase high-speed liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) by binding TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine) to the amino acid (N) terminus of the PNA represented by SEQ ID NO: 1 Purifying the PNA oligomer synthesized by; And

또한, 본 발명은 하기의 siRNA 전달 복합체를 포함하는 선암(adenocarcinoma)을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating adenocarcinoma comprising the following siRNA delivery complex.

[구조식 1][Structural Formula 1]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 선암(adenocarcinoma)은 폐 선암, 위 선암, 대장암, 자궁경부선암 및 췌장암으로 이루어진 군 중 하나 이상의 선암을 예방 및 치료할 수 있으며, 보다 바람직하게는 폐 선암을 예방 및 치료할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the adenocarcinoma may prevent and treat one or more adenocarcinomas of the group consisting of lung adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, colorectal cancer, cervical adenocarcinoma, and pancreatic cancer, and more preferably lung adenocarcinoma. It can be prevented and treated.

또한, 본 발명의 siRNA 전달 복합체에 시스플라틴과 같은 물질을 병용 요법(combination therapy)과 같이 상승적인 효과를 거둘 수 있다.In addition, a substance such as cisplatin in the siRNA delivery complex of the present invention can have a synergistic effect such as combination therapy.

본 발명의 조성물에는 상기의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-mentioned active ingredient. The pharmaceutically acceptable carrier should be compatible with the active ingredient of the present invention, and may include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these ingredients. It can be used in combination, and if necessary, other conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents can be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions. In particular, it is preferable to provide a formulation in a lyophilized form. For the preparation of a lyophilized formulation, a method commonly known in the art to which the present invention pertains may be used, and a stabilizer for lyophilization may be added. Furthermore, it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using methods disclosed in Remington's pharmaceutical Science (Mack Publishing company, Easton PA) by appropriate methods in the art.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.The content and method of administration of the active ingredients contained in the composition of the present invention can be determined by a person skilled in the art based on the symptoms and severity of the disease in a typical patient. It can also be formulated in various forms such as powders, tablets, capsules, liquids, injections, ointments, syrups, and can also be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.The composition of the present invention can be administered orally or parenterally. The route of administration of the composition according to the present invention is not limited to these, for example, oral cavity, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual Or topical administration is possible. The dosage amount of the composition according to the present invention varies in range depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, method, excretion rate, or disease severity, and is easy for a person skilled in the art. Can decide. In addition, the compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques for clinical administration.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 siRNA 전달 복합체를 폐 선암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 폐 선암의 예방 및 치료방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing and treating lung adenocarcinoma, comprising administering a siRNA delivery complex according to the present invention to a patient in need thereof.

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following implementations are provided for illustrative purposes only to aid understanding of the present invention, and the scope and scope of the present invention are not limited thereto.

<< 실시예Example 1> 실험재료 및 방법 1> Experimental materials and methods

<1-1> PNA-<1-1> PNA- pHLIP의pHLIP 합성 synthesis

PANAGENE(Daejeon, Korea)로부터 모든 PNA 올리고머(siCEACAM6, TAMRA-ooo-GATCACAGTCTCTGGAAGT-ooo-Cys; scrambled siRNA(scr), TAMRA-ooo-TGGTTTACATGTCGACTAA-ooo-Cys)를 구매하였다. -ooo- (11-amino-3,6,9-trioxaundecanoic acid, 친수성 링커) 및 시스테인을 포함하는 PNA 올리고머 서열은 BAG PNA 단량체를 갖는 자동 합성기를 사용하여 고상 합성을 통해 합성되었었다(PANAGENE의 PNA 올리고머 합성 기술 이용). 올리고머는 m-크레졸 : TFA(1 : 4) cocktail 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단되었다. 단일 이성질체인 5-carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)은 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합되었다. 역상 고속 액체 크로마토 그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 PNA 올리고머를 정제하였다. 2 개의 PNA 올리고머는 각각 79℃ 및 75℃의 용융 온도(Tm)를 갖는다. pHLIP-PNA 구조물을 생성하기 위해, 다음의 PHIP 서열이 합성되었다: AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLDLVDADEGTCG(서열번호 3). PNA 올리고머의 C- 말단을 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 pHLIP와 접합시켰다. pHLIP-PNA 구조를 합성하기 위하여, pHLIP 및 PNA(펩타이드: PNA 1.5:1)를 어두운 곳에서 DMF/Tris(pH 7.5)의 혼합물에서 밤새 반응시켰다. 결합한 후, pH-LIP-PNA를 RP-HPLC로 정제하고 MALDI-TOF를 특정하였다. 13,700 M^-1cm^-1 (A), 6,600 M^-1cm^-1 (C), 11,700 M^-1cm^-1 (G), 8,800 M^-1cm^-1 (T), 200 M^-1cm^-1(F, Phenylalanine) and 32,300 M^-1cm^-1(TAMRA)의 순으로 건조시킨 다음 동결 건조시켰다(도 16).All PNA oligomers (siCEACAM6, TAMRA-ooo-GATCACAGTCTCTGGAAGT-ooo-Cys; scrambled siRNA (scr), TAMRA-ooo-TGGTTTACATGTCGACTAA-ooo-Cys) were purchased from PANAGENE (Daejeon, Korea). The PNA oligomer sequence comprising -ooo- (11-amino-3,6,9-trioxaundecanoic acid, hydrophilic linker) and cysteine was synthesized through solid phase synthesis using an automatic synthesizer with BAG PNA monomer (PNAGENE's PNA oligomer) Using synthetic techniques). The oligomer was cleaved from the resin using m-cresol: TFA (1: 4) cocktail solution. The single isomer, 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), was only bound to the amino acid (N) terminus of PNA. PNA oligomers were purified by reverse phase high speed liquid chromatography (RP-HPLC) and MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight). The two PNA oligomers have a melting temperature (Tm) of 79°C and 75°C, respectively. To generate the pHLIP-PNA construct, the following PHIP sequence was synthesized: AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLDLVDADEGTCG (SEQ ID NO: 3). The C-terminus of the PNA oligomer was conjugated to pHLIP by disulfide bonds. To synthesize the pHLIP-PNA structure, pHLIP and PNA (peptide: PNA 1.5:1) were reacted overnight in a mixture of DMF/Tris (pH 7.5) in the dark. After binding, pH-LIP-PNA was purified by RP-HPLC and MALDI-TOF was characterized. ^{^{13,700 M -1 cm -1 (A)}} , 6,600 M -1 cm -1 (C), 11,700 M -1 cm -1 (G), 8,800 M -1 cm -1 (T), 200 M -1 cm - ^It was dried in the order of ¹ (F, Phenylalanine) and 32,300 M ^-1 cm ^-1 (TAMRA) and then lyophilized (FIG. 16).

<1-2> 세포 배양<1-2> Cell culture

인간 폐암 세포주(A549)는 American Type으로부터 구입하였다. 배양물에 L- 글루타민(2 mM), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토 마이신(100 g/ml) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI을 넣고 37℃로 5% CO₂에서 유지시켰다. 모든 pH 조절 세포 배양 실험에서, 세포를 HEPES 또는 pH 6.2와 MES로 pH 7.4로 완충된 RPMI 중의 10% FBS와 함께 배양하였다. The human lung cancer cell line (A549) was purchased from American Type. RPMI containing L-glutamine (2 mM), penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 g/ml) and 10% FBS was added to the culture and maintained at 37°C at 5% CO ₂ . In all pH controlled cell culture experiments, cells were cultured with HEPES or 10% FBS in RPMI buffered to pH 7.4 with pH 6.2 and MES.

<1-3> <1-3> CEACAM6CEACAM6 siRNAsiRNA 형질전환 Transformation

siRNA 이중 가닥은 Dharmacon Research, Inc(Lafayette, CO)에서 구입하였다. 저해의 특이성을 확인하기 위해 대조군인 비표적 siRNA를 음성 대조군으로 사용하였다.siRNA double strands were purchased from Dharmacon Research, Inc (Lafayette, CO). In order to confirm the specificity of the inhibition, a non-target siRNA as a control was used as a negative control.

CEACAM6 siRNA 실험에 사용된 siRNA 서열은 다음과 같습니다:The siRNA sequences used in the CEACAM6 siRNA experiment are as follows:

대조군(Negative control): UGGUUUACAUGUCGACUAA(서열번호 7) Control (Negative control): UGGUUUACAUGUCGACUAA (SEQ ID NO: 7)

Seq #1: GAUCACAGUCUCUGGAAGU(서열번호 2),Seq #1: GAUCACAGUCUCUGGAAGU (SEQ ID NO: 2),

Seq #2: GAACAUGGCUAAAUACAAU(서열번호 4),Seq #2: GAACAUGGCUAAAUACAAU (SEQ ID NO: 4),

Seq #3: GAGGGUAACUUAACAGAGU(서열번호 5),Seq #3: GAGGGUAACUUAACAGAGU (SEQ ID NO: 5),

Seq #4: CUACAUACUCCAACUGAAA(서열번호 6).Seq #4: CUACAUACUCCAACUGAAA (SEQ ID NO: 6).

인간 폐암 세포주(A549)는 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 10 nM siRNA 이중 가닥으로 형질 감염시켰다. 48시간 후, 실시간 RT-PCR에 의해 CEACAM6 유전자가 억제된 것을 확인하였다.The human lung cancer cell line (A549) was transfected with 10 nM siRNA double strands using Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions. After 48 hours, it was confirmed that the CEACAM6 gene was inhibited by real-time RT-PCR.

<1-4> Quantitative real-time RT-<1-4> Quantitative real-time RT- PCRPCR

TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 총 RNA를 분리하고 iScript^TM cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 정량 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)은 iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: GAPDH (forward, 5'-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3'(서열번호 8), reverse, 5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT(서열번호 9)); CEACAM6(forward, 5'-GACAGTTCCATGTATACCCG-3'(서열번호 10), reverse, 5'-ACAGCATCCTTGTCCTCC-3'(서열번호 11)). 열 사이클링(Thermal cycling) 및 형광 검출은 S1000 Thermal cycler 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 수행되었다. 반응은 다음 열 조건을 사용하여 CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad)에서 실행하였다 : 95℃에서 3분간의 초기 변성 단계 및 40 사이클의 변성 95℃에서 10초 및 어닐링/신장(extension) 55℃에 30초. 상대적 유전자 발현 수준은 GAPDH 발현에 대한 비율로 평가하였다. Total RNA was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) and cDNA was synthesized according to the manufacturer's protocol using the iScript ^™ cDNA synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) was performed using iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad). Primer sequences are as follows: GAPDH (forward, 5'-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3' (SEQ ID NO: 8), reverse, 5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT (SEQ ID NO: 9)); CEACAM6 (forward, 5'-GACAGTTCCATGTATACCCG-3' (SEQ ID NO: 10), reverse, 5'-ACAGCATCCTTGTCCTCC-3' (SEQ ID NO: 11)). Thermal cycling and fluorescence detection were performed using the S1000 Thermal cycler real-time PCR system (Bio-Rad). The reaction was performed in a CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad) using the following thermal conditions: initial denaturation step at 95°C for 3 minutes and denaturation at 40 cycles for 10 seconds at 95°C and annealing/extension 55 30 seconds at ℃. Relative gene expression levels were evaluated as a ratio to GAPDH expression.

<1-4> <1-4> 웨스턴Western 블랏Blot

인간 폐암 세포주(A549)를 MES로 HEPES 또는 pH 6.2로 pH 7.4로 완충된 RPMI 중의 1% FBS와 배양하고, 반응 완충액에 48시간 동안 현탁시킨 pHLIP-PNA로 처리하였다. 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동으로 분리하고 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 다음 마우스 anti-CEACAM6 모노클로 날 항체(9A6, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 또는 마우스 항-GAPDH 모노클로 날 항체(6C5, Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 loading control로 배양하였다. 단백질 복합체는 향상된 화학 발광 시약(Thermo Fisher Scientific)으로 검출되었다.The human lung cancer cell line (A549) was incubated with HEPES with MES or 1% FBS in RPMI buffered to pH 7.4 with pH 6.2, and treated with pHLIP-PNA suspended for 48 hours in reaction buffer. Proteins were separated by electrophoresis on SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel) and transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). The membrane was blocked with 5% skim milk and then mouse anti-CEACAM6 monoclonal antibody (9A6, Santa Cruz Biotechnology Inc.) or mouse anti-GAPDH monoclonal antibody (6C5, Santa Cruz Biotechnology Inc.) was incubated with loading control. . Protein complexes were detected with enhanced chemiluminescent reagents (Thermo Fisher Scientific).

<1-5> 유동세포 분석<1-5> Flow cell analysis

유동 세포 계측법을 위해, 인간 폐암 세포주(A549)는 HEPES 또는 pH 6.2와 MES로 pH 7.4에서 완충된 RPMI 중의 10% FBS로 배양하고, 48시간 동안 반응 완충액에 현탁된 pHLIP-PNA로 처리하였다. 세포를 세척하여 유리된 pHLIP-PNA를 제거한 후, 500㎕ PBS(pH 7.4)에 다시 현탁하고 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다.For flow cytometry, the human lung cancer cell line (A549) was incubated with HEPES or pH 6.2 and MES with 10% FBS in RPMI buffered at pH 7.4 and treated with pHLIP-PNA suspended in reaction buffer for 48 hours. After washing the cells to remove the free pHLIP-PNA, it was suspended again in 500 μl PBS (pH 7.4) and analyzed by flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose, CA).

<1-6> 세포 생존율 분석<1-6> Cell viability analysis

인간 폐암 세포주(A549)에 대한 CEACAM6 억제 효과를 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석법(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 사용하였다. 인간 폐암 세포주(A549)(5 x 10⁴cells/ml)를 96- 웰 플레이트에서 0, 100, 250, 500 또는 1,000 nM의 투여량으로 pHLIP-siCEACAM6으로 48시간 동안 처리하고, pHLIP-scr을 대조군으로 사용하였다. 지시된 pH에서 모든 처리를 수행하였다. 48시간 후에, CCK-8 분석(Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하여 세포 성장의 정도를 평가하였다. CCK-8 용액(10㎕)을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 450nm에서의 흡광도를 다중선 판독기(Lambda Bio-20, Beckman)로 측정하였다. 세포 생존력은 대조군 세포의 백분율로 표시하였다.The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) was used to measure the inhibitory effect of CEACAM6 on human lung cancer cell line (A549). The human lung cancer cell line (A549) (5 x 10 ⁴ cells/ml) was treated with pHLIP-siCEACAM6 for 48 hours at a dose of 0, 100, 250, 500 or 1,000 nM in a 96-well plate, and the control of pHLIP-scr It was used as. All treatments were performed at the indicated pH. After 48 hours, the degree of cell growth was evaluated using CCK-8 analysis (Dojindo, Kumamoto, Japan). CCK-8 solution (10 μl) was added to each well and incubated at 37° C. for 2 hours. Absorbance at 450 nm was measured with a multi-line reader (Lambda Bio-20, Beckman). Cell viability was expressed as a percentage of control cells.

<1-7> 생체 내 종양 이종 이식 실험<1-7> Tumor xenograft experiment in vivo

모든 동물 실험은 한국 생명 공학 연구원 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다. 5주령의 BALB/c athymic nude mice(5 마리 마우스 1.2 x 10⁷ cells/mouse)의 오른쪽 측면에 인간 폐암 세포주(A549)를 주사하였다. 종양 성장은 캘리퍼스로 길이(L), 폭(W) 및 높이(H)를 측정하고 식 V =(L × W × H) × 0.5를 사용하여 측정하였다. 종양 형성시(∼44.8 mm³), 마우스에게 pHLIP-PNA을 근육내(i.v.) 및 시스플라틴을 정맥내(i.p.) 주입하였다, All animal experiments were conducted according to a protocol approved by the Korea Institute of Biotechnology, Institutional Animal Care and Use Committee. A human lung cancer cell line (A549) was injected into the right side of 5-week-old BALB/c athymic nude mice (5 mice 1.2 x 10 ⁷ cells/mouse). Tumor growth was measured using a caliper to measure length (L), width (W) and height (H) and using the formula V = (L × W × H) × 0.5. Upon tumor formation (~44.8 mm ³ ), mice were injected intramuscularly (iv) with pHLIP-PNA and intravenously (ip) with cisplatin,

<1-7> <1-7> 공초점Confocal 레이저 현미경(Confocal microscopy) Laser microscopy

획득한 종양 조직의 공초점(confocal) 준비를 위해 종양을 OCT에서 플래시 동결시킨 다음 2μm 절편으로 자른다. 조직 절편을 차가운 아세톤으로 고정시키고, PBS로 세척하고, 과산화수소와 반응시켜 내인성 퍼록시다아제를 비활성화시키고, PBS로 세척하였다. DAPI를 첨가하여 세포핵을 염색하였다. 모든 세척은 표면 결합 된 pHLIP를 세척하기 위해 pH 7.4의 PBS를 사용하여 수행하였다. confocalmicroscope(Zeiss LSM 710 META, Jena, Germany)를 사용하여 이미지를 수집하고 Zensoftware(버전 8.0, Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 처리하였다.To prepare for confocal preparation of the obtained tumor tissue, the tumor is flash frozen in the OCT and then cut into 2 μm sections. Tissue sections were fixed with cold acetone, washed with PBS, reacted with hydrogen peroxide to inactivate endogenous peroxidase, and washed with PBS. Cell nuclei were stained by adding DAPI. All washes were performed using PBS at pH 7.4 to wash the surface bound pHLIP. Images were collected using a confocalmicroscope (Zeiss LSM 710 META, Jena, Germany) and processed using Zensoftware (version 8.0, Zeiss, Jena, Germany).

<1-8> 조직학 및 기타 분석 기술 <1-8> Histology and other analytical techniques

생쥐는 이산화탄소 질식시켜 죽였다. 염색은 포르말린 고정하고, 파라핀으로 고정된 종양 절편(두께 4㎛)에서 수행하였다. 면역염색은 BenchMark XT 자동 염색기(Ventana MedicalSystems Inc., Tucson, AZ, USA)를 사용하였다. anti-cleaved caspase 3(1:100, BioCare Medical) 및 anti-cleaved caspase 3 항체(9A6, 1:4000, Santa Cruz Biotechnology Inc., 미국 텍사스 달라스 소재) Ki67(1: 100, VP-K452, 벡터 실험실)를 사용하였다. 종양 부위 당 양성 세포의 수를 정량화하였다.Mice were killed by choking carbon dioxide. Staining was performed on formalin-fixed, paraffin-fixed tumor sections (4 μm thick). For immunostaining, BenchMark XT automatic staining machine (Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ, USA) was used. anti-cleaved caspase 3 (1:100, BioCare Medical) and anti-cleaved caspase 3 antibody (9A6, 1:4000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) Ki67 (1: 100, VP-K452, vector laboratory ) Was used. The number of positive cells per tumor site was quantified.

<1-9> 암 유전체 지도(<1-9> Cancer genome map ( TCGATCGA ) 분석) analysis

폐 선암 515명의 환자의 임상 병리학 적 보고서와 결합 된 다차원 게놈 데이터를 포함하는 TCGA data set(http://tcga-data.nci.nih.gov/)는 cBioPortal 도구(http://www.cbioportal.org)를 통해 분석되었다. CEACAM6의 mRNA 발현 분석을 위해 TCGA의 폐 선암종 환자의 RNA 서열 데이터를 사용하였다. 단일 변량 생존 분석을 위해 alog-rank test를 사용하여 Kaplan-Meier plots을 폐암 선암 환자의 전체 생존 데이터를 사용하여 나타내었다. A TCGA data set (http://tcga-data.nci.nih.gov/) containing multidimensional genomic data combined with a clinical pathological report of 515 patients with lung adenocarcinoma was cBioPortal tool (http://www.cbioportal. org). RNA sequence data of TCGA lung adenocarcinoma patients was used for mRNA expression analysis of CEACAM6. For univariate survival analysis, Kaplan-Meier plots using alog-rank test were presented using the overall survival data of lung cancer adenocarcinoma patients.

<1-10> 통계 분석<1-10> Statistical Analysis

세포 생존률 분석에서 세 그룹의 비교를 위해 양방향 분산 분석(ANOVA)을 수행하였다. 동물 실험을 위해서, 각 그룹에 대한 마우스 및 종양 무게를 Student t-test를 사용하여 비교하였다. Student t-test를 이용하여 각 군의 면역 염색 결과를 비교하였다. Kaplan-Meier 방법을 이용하여 생존 곡선을 추정하고 log rank test를 사용하여 비교하였다. P 값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 모든 통계 테스트는 양면 분석되었으며 SPSS 통계 패키지, 버전 18.0 (IBM, NY, USA)을 사용하여 수행되었다.Two-way ANOVA was performed to compare the three groups in cell viability analysis. For animal experiments, mouse and tumor weights for each group were compared using the Student t-test. Immunostaining results of each group were compared using Student t-test. Survival curves were estimated using the Kaplan-Meier method and compared using the log rank test. P value ≤ 0.05 was judged to be statistically significant. All statistical tests were analyzed on both sides and performed using the SPSS statistical package, version 18.0 (IBM, NY, USA).

<< 실시예Example 2> 실험 결과 2> Experimental results

<2-1> <2-1> TCGATCGA 데이터 분석 결과 Data analysis results

cBioPortal tool(http://www.cbioportal.org)로 분석 한 515명의 폐 선암 환자의 TCGA data set에 따르면, 515명의 환자 중 50명이 CEACAM6 mRNA 과발현을 보였다. Kaplan-Meier 생존 분석에서 높은 수준의 CEACAM6 mRNA 발현은 전체 생존율이 낮았다(P = 0.0262)(도 1).According to the TCGA data set of 515 lung adenocarcinoma patients analyzed with the cBioPortal tool (http://www.cbioportal.org), 50 of the 515 patients showed overexpression of CEACAM6 mRNA. In Kaplan-Meier survival analysis, high level of CEACAM6 mRNA expression was low in overall survival (P = 0.0262) (FIG. 1).

<2-2> <2-2> pHLIPpHLIP -PNA -PNA siCEACAM6의siCEACAM6 활성 분석 결과 Active assay results

pHLIP-PNA siCEACAM6를 제작하기 위하여 CEACMA6 발현의 효율적인 4개의 siRNA 서열을 스크리닝하였다. 인간 폐암 세포주(A549)는 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 비표적 siRNA, GAPDH siRNA 및 4가지 siCEACAM6 서열로 형질전환시켰다. 모든 4개의 서열은 비표적 siRNA(도 2)와 비교하여 10 nM 농도에서 트랜스펙션 후 48시간 후에 유사한 수준에서 CEACAM6 mRNA 발현을 억제하는 것으로 확인하였으며, siCEACAM6 서열 #1을 pHLIP로 테더링하기 위해 선택하였다.Efficient four siRNA sequences of CEACMA6 expression were screened to construct pHLIP-PNA siCEACAM6. Human lung cancer cell line (A549) was transformed with non-target siRNA, GAPDH siRNA and four siCEACAM6 sequences as described in Examples 1-3. All four sequences were found to inhibit CEACAM6 mRNA expression at similar levels 48 hours after transfection at 10 nM concentration compared to non-target siRNA (FIG. 2 ), to tether siCEACAM6 sequence #1 to pHLIP Selected.

pHLIP-PNA siCEACAM6 구조는 PNA 올리고머의 카르복시(C)-말단을 pHLIP와 결합시켜 합성하였으며, 대조군으로서 pHLIP-scr을 사용하였다. PHLIP-PNA는 PNA에 부착된 TAMRA 표지로 변형되었다. pHLIP-PNA의 제조는 RP-HPLC 및 질량 분광법에 의해 입증하였다(도 3).The pHLIP-PNA siCEACAM6 structure was synthesized by combining the carboxy(C)-terminus of the PNA oligomer with pHLIP, and pHLIP-scr was used as a control. PHLIP-PNA was modified with the TAMRA label attached to the PNA. The preparation of pHLIP-PNA was verified by RP-HPLC and mass spectrometry (Fig. 3).

또한, pHLIP-PNA 접합체가 인간 폐암 세포주(A549)에 siCEACAM6을 전달하고 CEACAM6 단백질을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 인간 폐암 세포주 (A549)를 pH 6.2에서 pHLIP-siCEACAM6(100, 250, 500nM) 및 pHLIP-scr과 함께 48시간 동안 배양하였다. 웨스턴 블랏 분석은 낮은 pH에서 pHLIP-siCEACAM6을 과발현하는 인간 폐암 세포주(A549)가 pHCE-siCEACAM6의 투여량에 따라 내인성(endogenous) CEACAM6의 단백질 발현 수준이 유의하게 낮으므로 siCEACAM6의 세포 내 전달 및 활성을 억제하였다(도 4).In addition, to investigate whether the pHLIP-PNA conjugate can deliver siCEACAM6 to the human lung cancer cell line (A549) and reduce the CEACAM6 protein, the human lung cancer cell line (A549) was pHLIP-siCEACAM6 (100, 250, 500 nM) at pH 6.2. ) And pHLIP-scr for 48 hours. Western blot analysis showed that the human lung cancer cell line (A549) overexpressing pHLIP-siCEACAM6 at low pH significantly lowered the protein expression level of endogenous CEACAM6 according to the dose of pHCE-siCEACAM6, thus intracellular delivery and activity of siCEACAM6. Inhibited (Figure 4).

또한, 인간 폐암 세포주(A549) 연관성을 중성 및 산성 pH 값에서 유동 세포 계측법으로 측정한 결과, 인간 폐암 세포주(A549)를 pH 7.4 또는 6.2에서 48 시간 동안 pHLIP-siCEACAM6 및 pHLIP-scr(500nM)과 함께 배양하였다. pHLIP-siCEACAM6 인간 폐암 세포주(A549)는 낮은 pH에서 관찰되었다. 부착된 PNA 서열은 pHLIP-PNA 구조물의 결합에 거의 영향을 미치지 않았다(도 5).In addition, the human lung cancer cell line (A549) association was measured by flow cytometry at neutral and acidic pH values, and the human lung cancer cell line (A549) was mixed with pHLIP-siCEACAM6 and pHLIP-scr (500 nM) for 48 hours at pH 7.4 or 6.2. Cultured together. The pHLIP-siCEACAM6 human lung cancer cell line (A549) was observed at low pH. The attached PNA sequence had little effect on the binding of the pHLIP-PNA construct (Figure 5).

또한, 중성 및 산성 pH 값에서 세포 생존능 분석을 수행한 결과, pHLIP-siCEACAM6에 의한 CEACAM6의 저해는 투여량에 따라 pH 6.2에서 인간 폐암 세포주 (A549)의 생존력을 감소시켰고(도 6), 이 결과를 통하여 PNA에 대한 pHLIP 펩타이드의 연결이 CEACAM6 mRNA를 표적으로하고, 전달된 siRNA에 의한 CEACAM6 단백질의 발현을 억제함을 알 수 있었다.In addition, as a result of performing cell viability analysis at neutral and acidic pH values, inhibition of CEACAM6 by pHLIP-siCEACAM6 reduced the viability of the human lung cancer cell line (A549) at pH 6.2 depending on the dose (FIG. 6). Through it, it was found that the connection of the pHLIP peptide to PNA targets CEACAM6 mRNA and inhibits the expression of CEACAM6 protein by the delivered siRNA.

<2-3> <2-3> CEACAM6의CEACAM6 발현억제 동물 모델에서 폐 종양 억제 분석 결과 Analysis of lung tumor inhibition in expression-suppressing animal models

siCEACAM6이 생체 내에서 CEACAM6 발현은 억제할 수 있는지 분석하였다. 생체 내 분석을 위해, BALB/c 누드 마우스에 1.2×10⁷A549 세포를 피하 주사하였다. 종양이 시작된 지 2주 후에, pHLIP-siCEACAM6와 음성 대조군으로서 생리 식염수를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. pHLIP-siCEACAM6 투여의 최적 양을 확인하기 위해, 3주간의 치료 기간 동안 두 그룹의 마우스(n = 5 mice/group)에게 1일 2 회 투여량 (2mg/kg 및 4mg/kg)을 주입하였다. 또한, 시스플라틴은 폐암 치료의 중추이기 때문에, 시스플라틴 처리 마우스는 양성 대조군으로 사용되었다. 시스플라틴 2mg/kg을 주 2회 또는 3회 복강 내 투여하였다. It was analyzed whether siCEACAM6 can inhibit CEACAM6 expression in vivo. For in vivo analysis, BALB/c nude mice were injected subcutaneously with 1.2×10 ⁷ A549 cells. Two weeks after tumor initiation, physiological saline as a negative control with pHLIP-siCEACAM6 was injected through the tail vein of the mouse. To determine the optimal amount of pHLIP-siCEACAM6 administration, two groups of mice (n = 5 mice/group) were dosed twice daily (2 mg/kg and 4 mg/kg) over a three-week treatment period. In addition, since cisplatin is the backbone of lung cancer treatment, cisplatin-treated mice were used as a positive control. Cisplatin 2 mg/kg was administered intraperitoneally twice or three times a week.

또한, 폐 종양 발생에 대한 pHLIP-siCEACAM6 전달의 영향을 평가하기 위해, 종양 성장은 2 또는 3일마다 조사하였다. pHLIP-siCEACAM6 치료는 pHLIP-scr(pHLIP-siCEACAM6 2 mg/kg: 23.0%, pHLIP-siCEACAM6 4 mg/kg: 35.5%, 모든 P <0.001)로 치료 한 대조 마우스에 비해 종양 성장을 유의하게 억제하였다.In addition, to evaluate the effect of pHLIP-siCEACAM6 delivery on lung tumor development, tumor growth was examined every 2 or 3 days. Treatment with pHLIP-siCEACAM6 significantly inhibited tumor growth compared to control mice treated with pHLIP-scr (pHLIP-siCEACAM6 2 mg/kg: 23.0%, pHLIP-siCEACAM6 4 mg/kg: 35.5%, all P <0.001). .

부형제(vehicle)와 비교하여 시스플라틴 치료군에서도 종양 성장의 유의한 감소가 관찰되었다(시스플라틴 2 회/주: 35.0%, 시스플라틴 3회/주: 46.7%, 모두 P <0.001)(도 7).Significant reduction in tumor growth was also observed in the cisplatin treated group compared to vehicle (2 cisplatin/week: 35.0%, cisplatin 3/week: 46.7%, all P <0.001) (FIG. 7 ).

또한, 종양 퇴행의 메커니즘을 더 연구하기 위해, 폐 종양을 수확하고 증식 및 세포 사멸 표지로 염색하였다. pHLIP-scr 군과 비교하여, pHLIP-siCEACAM6으로 처리한 종양의 증식이 감소된 것을 확인하였다(pHLIP-scr: 21%, pHLIP-siCEACAM6: 15%, P = 0.004)(도 8).In addition, to further study the mechanism of tumor regression, lung tumors were harvested and stained with proliferation and apoptosis markers. Compared to the pHLIP-scr group, it was confirmed that the proliferation of tumors treated with pHLIP-siCEACAM6 was reduced (pHLIP-scr: 21%, pHLIP-siCEACAM6: 15%, P=0.004) (FIG. 8 ).

시스플라틴 처리는 또한 증식의 감소를 가져왔다(vehicle 27%, 시스플라틴 11%, P <0.001)(도 9)Cisplatin treatment also resulted in a reduction in proliferation (vehicle 27%, cisplatin 11%, P <0.001) (Figure 9)

이러한 데이터는 종양에서의 CEACAM6의 생체 내 침묵이 증식 억제를 유도한다는 것을 나타낸다. 세포사멸(apoptosis)의 표지자인 cleaved caspase 3(CC3) 염색은 pHLIP-siCEACAM6 군에서만 증가였으므로 siCEACAM6이 폐 종양 성장을 억제한 것을 확인했다(P = 0.025)(도 8, 도 9 및 도 10).These data indicate that in vivo silencing of CEACAM6 in tumors leads to inhibition of proliferation. Cleaved caspase 3 (CC3) staining, a marker of apoptosis, was only increased in the pHLIP-siCEACAM6 group, thus confirming that siCEACAM6 inhibited lung tumor growth (P=0.025) (FIGS. 8, 9 and 10 ).

또한, 생체 내 폐 선암에서 siCEACAM6을 전달하는 pHLIP-siCEACAM6의 능력을 조사한 결과, 종양 조직은 공 초점 영상 분석을 위해 분리되었다.In addition, as a result of examining the ability of pHLIP-siCEACAM6 to deliver siCEACAM6 in lung adenocarcinoma in vivo, tumor tissues were isolated for confocal imaging analysis.

TAMRA로 표지된 pHLIP-siCEACAM6에서, 강한 형광 신호가 pHLIP-siCEACAM6 처리된 동물의 종양 세포 표면에서 관찰되었으며, 이것은 생체 내 siCEACAM6의 효율적인 세포 내 전달하는 것을 나타낸다(도 11).In pHLIP-siCEACAM6 labeled with TAMRA, a strong fluorescence signal was observed on the tumor cell surface of pHLIP-siCEACAM6 treated animals, indicating efficient intracellular delivery of siCEACAM6 in vivo (FIG. 11 ).

<2-4> <2-4> ss iCEACAM6과iCEACAM 6 시스플라틴Cisplatin 동시 처리에 따른 폐 종양 억제 분석 결과 Analysis results of lung tumor inhibition according to simultaneous treatment

화학 요법과 CEACAM6 표적화가 항종양 효과를 향상시킬 수 있는지 분석하기 위하여, 1.2 × 10⁷ A549 세포를 피하 주사한 다음 2주 후에 마우스를 무작위로 선택하였다(n = 5 mice/group): (i) vehicle, (ii) pHLIP-siCEACAM6, (iii) 시스플라틴 및 (iv) pHLIP-siCEACAM6 + 시스플라틴.To analyze whether chemotherapy and CEACAM6 targeting could enhance the anti-tumor effect, mice were randomly selected 2 weeks after subcutaneous injection of 1.2 x 10 ⁷ A549 cells (n = 5 mice/group): (i) vehicle, (ii) pHLIP-siCEACAM6, (iii) cisplatin and (iv) pHLIP-siCEACAM6 + cisplatin.

iCEACAM6과 시스플라틴을 병행하여 치료를 위해 각각 pHLIP-siCEACAM6을 2 mg/kg로 최적용량을 결정하였다. 세포주 주사 2주 후에 pHLIP-siCEACAM6을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 2회 주사하고, 시스플라틴을 3주간의 치료 기간동안 1주일에 2 회 주사하였다(도 12A).The optimal dose of pHLIP-siCEACAM6 was determined to be 2 mg/kg each for treatment with iCEACAM6 and cisplatin. Two weeks after the injection of the cell line, pHLIP-siCEACAM6 was injected twice into the mouse through the tail vein, and cisplatin was injected twice a week for a three-week treatment period (FIG. 12A).

종양의 부피는 2 또는 3일마다 측정되었으며, 3주간의 전신 치료 후, vehicle과 비교하여 pHLIP-siCEACAM6 치료군의 마우스는 체적이 21.8% 감소했다(P = 0.004). 시스플라틴 치료로 종양 감소의 29.9%(P <0.001)를 보였다. pHLIP-siCEACAM6과 시스플라틴을 동시에 처리한 군은 종양 부피의 47%의 성장 감소를 확인했다(P <0.001)(도 12B). siCEACAM6s는 원발성 종양에 현저한 치료 활성을 나타내었고 세포 독성 화학 요법으로 효과가 증진되었다.Tumor volume was measured every 2 or 3 days, and after 3 weeks of systemic treatment, mice in the pHLIP-siCEACAM6 treated group had a 21.8% volume reduction compared to the vehicle (P = 0.004). Cisplatin treatment showed 29.9% of tumor reduction (P <0.001). The group treated with pHLIP-siCEACAM6 and cisplatin at the same time confirmed a 47% growth reduction in tumor volume (P<0.001) (FIG. 12B ). siCEACAM6s showed remarkable therapeutic activity in primary tumors and enhanced effectiveness with cytotoxic chemotherapy.

siCEACAM6 처리의 생물학적 효과를 더 평가하기 위해, 증식 및 세포사멸에 대한 종양 샘플을 염색한 결과, siCEACAM6과 시스플라틴을 병용 투여한 종양에서 siCEACAM6 (P= 0.121) 또는 시스플라틴 단독(P= 0.271)(siCEACAM6: 19.8%, 시스플라틴: 18.4, pHLIP-siCEACAM6: 16.6%)에 비해 세포 증식은 유의하게 감소하지 않았다. 그러나 병용 치료된 종양은 siCEACAM6(P= 0.022) 또는 시스플라틴 단독 (P= 0.016)과 비교하여 CC3 양성 세포 수가 증가했다(도 13, 14 및 15).To further evaluate the biological effects of siCEACAM6 treatment, tumor samples for proliferation and apoptosis were stained, resulting in siCEACAM6 (P=0.121) or cisplatin alone (P=0.271) (P=0.271) in tumors administered with siCEACAM6 and cisplatin in combination (siCEACAM6: 19.8%, cisplatin: 18.4, pHLIP-siCEACAM6: 16.6%). However, the combination treated tumors increased CC3 positive cell numbers compared to siCEACAM6 (P=0.022) or cisplatin alone (P=0.016) (FIGS. 13, 14 and 15).

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof <130> PN1711-425 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Converting CEACAM6 siRNA to PNA <400> 1 gatcacagtc tctggaagt 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA <400> 2 gaucacaguc ucuggaagu 19 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pHLIP(low pH-induced transmembrane structure) <400> 3 Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15 Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Asp Leu Val Asp Ala Asp 20 25 30 Glu Gly Thr Cys Gly 35 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #2 <400> 4 gaacauggcu aaauacaau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #3 <400> 5 gaggguaacu uaacagagu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #4 <400> 6 cuacauacuc caacugaaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA Negative control <400> 7 ugguuuacau gucgacuaa 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 8 cctgcaccac caactgctta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 9 gtcttctggg tggcagtgat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 forward primer <400> 10 gacagttcca tgtatacccg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 reverse primer <400> 11 acagcatcct tgtcctcc 18 <110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof <130> PN1711-425 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Converting CEACAM6 siRNA to PNA <400> 1 gatcacagtc tctggaagt 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA <400> 2 gaucacaguc ucuggaagu 19 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pHLIP (low pH-induced transmembrane structure) <400> 3 Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15 Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Asp Leu Val Asp Ala Asp 20 25 30 Glu Gly Thr Cys Gly 35 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #2 <400> 4 gaacauggcu aaauacaau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #3 <400> 5 gaggguaacu uaacagagu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #4 <400> 6 cuacauacuc caacugaaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA Negative control <400> 7 ugguuuacau gucgacuaa 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 8 cctgcaccac caactgctta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 9 gtcttctggg tggcagtgat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 forward primer <400> 10 gacagttcca tgtatacccg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 reverse primer <400> 11 acagcatcct tgtcctcc 18

Claims

CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하는 하기 구조식의 siRNA(small-interfereing RNA) 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐 선암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서,
하기 구조식의 siRNA 전달 복합체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PNA(peptide nucleic acid) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)가 포함되고,
상기 pHLIP는 산성 환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터이고,
상기 siRNA 전달 복합체는 선암에서 과발현하는 CEACAM6를 억제하기 위하여 산성환경에서만 작용하는 펩티드벡터(pHLIP)와 CEACAM6에 대한 siRNA(siCEACAM6)를 peptide nucleic acid(PNA) 형태로 제작한 것을 연결한 siRNA 전달 복합체이고, 종양 특이 산성 미세환경을 표적으로 펩티드에 연결된 siRNA(siCEACAM6)가 암 세포막을 통과하고,
상기 서열번호 1로 표기되는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 CEACAM6 유전자의 siRNA를 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 제작한 것이고,
siRNA 전달 복합체는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 시스테인(Cys)을 포함하는 PNA 올리고머를 m-크레졸 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단하고, TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 서열번호 1로 표시되는 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합하여 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 합성된 PNA 올리고머를 정제하고, PNA 올리고머의 C-말단에 서열번호 3으로 표시되는 pHLIP 서열을 상기 PNA 올리고머의 C-말단과 이황화 결합을 형성하도록 반응시켜 제조된 것이고,
상기 siRNA 전달 복합체는 siRNA가 10nM 농도에서 트랜스펙션 48시간 후에 폐선암에서 과발현 하는 CEACAM6 mRNA 발현을 억제하고, 폐 선암 세포에서 세포증식능(Ki-67 index)을 낮추고 세포사(cleaved caspase 3)를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 폐 선암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물:

.As a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma comprising a small-interfereing RNA (siRNA) delivery complex of the following structural formula to suppress the expression of CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) gene,
The siRNA delivery complex of the following structural formula includes a peptide nucleic acid (PNA) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a low pH-induced transmembrane structure (pHIP) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
The pHLIP is a peptide vector that selectively functions as a nanosyringe in an acidic environment,
The siRNA delivery complex is a siRNA delivery complex in which a peptide vector (pHLIP) that acts only in an acidic environment and a siRNA for CEACAM6 (siCEACAM6) in the form of peptide nucleic acid (PNA) are used to inhibit CEACAM6 overexpressing in adenocarcinoma. , SiRNA (siCEACAM6) linked to the peptide targeting the tumor-specific acidic microenvironment passes through the cancer cell membrane,
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a siRNA of the CEACAM6 gene represented by SEQ ID NO: 2 produced in the form of peptide nucleic acid (PNA),
In the siRNA delivery complex, a PNA oligomer containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and cysteine (Cys) is cut from a resin using an m-cresol solution, and TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine) is represented by SEQ ID NO: 1. The PNA oligomer synthesized by reverse phase high-speed liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) is purified by binding only to the amino acid (N) terminal of the PNA to be obtained, and the PNA oligomer is purified. It was prepared by reacting the pHLIP sequence represented by SEQ ID NO: 3 on the C-terminus of the PNA oligomer to form a disulfide bond with the C-terminus,
The siRNA delivery complex inhibits CEACAM6 mRNA expression, which siRNA overexpresses in lung adenocarcinoma 48 hours after transfection at a concentration of 10 nM, lowers cell proliferation capacity (Ki-67 index) and increases cell death (cleaved caspase 3) in lung adenocarcinoma cells. Characterized in that, to prevent and treat lung adenocarcinoma pharmaceutical composition:

.

CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cel l adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하는 하기 구조식의 s iRNA(small-interfereing RNA) 전달 복합체, 및 시스플라틴을 유효성 분으로 포함하는 폐 선암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서,
하기 구조식의 siRNA 전달 복합체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PNA(peptide nucleic acid) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)가 포함된 것을 특징으로 하는 폐 선암의 예 방 및 치료용 약제학적 조성물:

Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma comprising s iRNA (small-interfereing RNA) delivery complex of the following structural formula that suppresses the expression of CEACAM6 (Carcinoembryonic antigen-related cel l adhesion molecule 6) gene, and cisplatin as an active ingredient as,
The siRNA delivery complex of the structural formula below is an example of lung adenocarcinoma characterized in that it contains a peptide nucleic acid (PNA) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a low pH-induced transmembrane structure (pHIP) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Pharmaceutical compositions for room and treatment:

제 2 항에 있어서,
상기 pHLIP는 산성 환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
According to claim 2,
The pHLIP is a composition characterized in that it is a peptide vector that functions as a nanosyringe (nanosyringe) selectively in an acidic environment.

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