KR102134947B1 - METHOD FOR QUICK-DETECTING HLA ALLELES ASSOCIATED WITH ADVERSE DRUG REACTION USING tSNP - Google Patents
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Abstract
본 발명은 약물 부작용 (adverse drug reaction, ADR)과 관련된 특정 HLA 대립 유전자의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 약물 부작용과 관련된 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 특정 HLA 대립 유전자의 존재여부를 표지 SNP (tagging SNP, tSNP)를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 과민 증후군, 중증 간 손상 등의 약물 부작용의 발병 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting specific HLA alleles associated with adverse drug reactions (ADR), and more specifically HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502 related to drug side effects , HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07, the presence or absence of specific HLA alleles is quickly determined using a labeled SNP (tagging SNP, tSNP) and It relates to the use of these methods to assess the risk of developing adverse drug side effects such as Stevens-Johnson syndrome, toxic epidermal necrolysis, irritability syndrome, and severe liver damage.
Description
본 발명은 약물 부작용 (adverse drug reaction, ADR)과 관련된 특정 HLA(human leukocyte antigen, HLA) 대립 유전자의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 약물 부작용과 관련된 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 특정 HLA 대립 유전자의 존재 여부를 tSNP를 이용하여 신속하게 결정하는 방법 및 이러한 방법을 이용하여 약물 부작용의 발병 위험 여부를 평가하는 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting a specific human leukocyte antigen (HLA) allele associated with adverse drug reaction (ADR), and more specifically HLA-A*3101, HLA-A* related to drug side effects Method to quickly determine the presence of specific HLA alleles of 3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 using tSNP and It relates to the use of these methods to evaluate the risk of developing adverse drug reactions.
다양한 약물과민반응 (drug hypersensitivity reactions, HSRs) 또는 약물부작용 (adverse drug reaction, ADR)은 치료 또는 진단을 위해 사용되는 약물 선정 및 복용량 등에 있어서 발생한다.Various drug hypersensitivity reactions (HSRs) or adverse drug reactions (ADRs) occur in drug selection and dosage used for treatment or diagnosis.
널리 인용된 메타 분석에 의하면, ADR은 흔한 사망 원인 중 4위부터 6위까지를 차지하고 있고 (문헌[Lazarou et al., JMA, 279(15):1200-1205, 1998] 참조), 이 중, 피부 ADR은 전체 병원 입원의 약 2~3%를 차지한다 (문헌[Bigby et al., JAMA, 256(24):3358-3363, 1986] 참조). 이는 그 중증도를 더해가는 경증성 반점구진 (mild maculopapular, MPE)으로, 과민 증후군 (hypersensitivity syndrome, HSS), 스티븐-존슨 증후군 (Steven-Johnson syndrome, SJS) 및 독성 표피 괴사 용해(toxic epidermal necrolysis, TEN; Lyells syndrome) 등의 생명을 위협하는 ADR에까지 이르고, 후자의 치사율은 40%에 달할 수 있다.According to a widely cited meta-analysis, ADR accounts for 4 to 6 of the most common causes of death (Lazarou et al., JMA, 279(15):1200-1205, 1998), of which Skin ADR accounts for about 2-3% of all hospital admissions (see Bigby et al., JAMA, 256(24):3358-3363, 1986). This is a mild maculopapular (MPE) that adds to its severity, hypersensitivity syndrome (HSS), Steven-Johnson syndrome (SJS) and toxic epidermal necrolysis (TEN). ; Lyells syndrome) and other life-threatening ADRs. The latter mortality rate can reach 40%.
HSS는 피부발진에 더하여 전신 소견(예, 열, 관절염, 호산구증가증 및 림프절병증)을 동반하는 다기관 병발(예, 간 또는 신장)이 특징이다 (문헌[Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 331:1272-1285, 1994] 참조). SJS 및 TEN, 자반성 반점의 수포성 발진과, 반점 병발 및 피부 박리를 동반하는 과녁 징후 (target-like lesion)의 속발을 특징으로 하는, 면역 복합체 매개성 과민 질환이다 (문헌[Roujeau et al., J InvestDermatol, 1994, 102:28S-30S] 참조). 이들은 대부분 술폰아미드, 항경련제, 알로퓨리놀 (allopurinol), 비스테로이드성 소염제 및 항말라리아제 등의 약물에 기인한다 (문헌[Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 333(24):1600-1607, 1995] 참조). 항경련제 (예. 카바마제핀, 페니토인 및 페노바르비탈)와 알로퓨리놀은 SJS/TEN을 일으키는 가장 흔한 약물이다.HSS is characterized by multicenter involvement (eg, liver or kidney) with systemic findings (eg, fever, arthritis, eosinophilia and lymphadenopathy) in addition to skin rash (Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 331:1272-1285, 1994). SJS and TEN, an immune complex mediated hypersensitivity disorder characterized by blistering rashes of purpura, and target-like lesions accompanied by spotting and skin detachment (Roujeau et al. , J Invest Dermatol, 1994, 102:28S-30S). These are mostly attributed to drugs such as sulfonamides, anticonvulsants, allopurinol, nonsteroidal anti-inflammatory agents and antimalarial agents (Roujeau et al., N. Engl. J. Med., 333(24):1600- 1607, 1995). Anticonvulsants (eg carbamazepine, phenytoin and phenobarbital) and allopurinol are the most common drugs that cause SJS/TEN.
최근 약리게놈학의 발전에 따라, 다양한 약물과민반응 (HSRs) 또는 약물부작용 (ADR)에 대한 감수성이 특정의 대립유전자와 관련되어 있음이 암시되었다. 예를 들면, 티오퓨린 메틸트랜스퍼라제 유전자의 유전자 다형 (genomic polymorphism)은 류마티스 질환 또는 암에 대한 약물인 아자티오프린 (azathioprine)에 의해 유발되는 ADR에 밀접하게 관련되어 있음이 밝혀졌다 (문헌[Yates et al., Ann. Intern. Med., 126(8):608-614, 1997] 참조).With recent developments in pharmacological genomics, it has been suggested that susceptibility to various drug hypersensitivity reactions (HSRs) or drug side effects (ADRs) is associated with specific alleles. For example, it has been found that the genomic polymorphism of the thiopurine methyltransferase gene is closely related to ADR caused by azathioprine, a drug for rheumatoid disease or cancer (Yates et al., Ann.Intern. Med., 126(8):608-614, 1997).
어떤 약물에 의해 유발되는 SJS/TEN/HSS에 대한 감수성은 유전적으로 결정된다는 것도 시사되었다 (문헌[Gennis MA. Am. J. Med., 91(6):631-634, 1991]; 및 [Edwards SG, Postgrad. Med. J., 75(889):680-681, 1999] 참조). 특히, 인간백혈구항원 (HLA)과 연관되어 있음이 최근 많은 연구들을 통해 밝혀지고 있다.It has also been suggested that the susceptibility to SJS/TEN/HSS caused by certain drugs is genetically determined (Gennis MA. Am. J. Med., 91(6):631-634, 1991); and [Edwards] SG, Postgrad.Med. J., 75(889):680-681, 1999). In particular, it has been revealed through many studies in recent years that it is associated with human leukocyte antigen (HLA).
현재, HLA 등의 유전자 검사를 위하여 가장 일반적으로 많이 사용되는 방법은 풀 시퀀싱 (full sequencing)인데, 이를 이용하여 각각의 서브타입 (subtype)을 확인하는 것은 시간이 많이 소요되고 임상적 치료를 시작하기 전 이용하기에는 시간상으로 적절하지 않았다. 뿐만 아니라 각각의 서브타입을 선별하기 위해서는 고가의 특정 소프트웨어가 필요로 하여 최종 HLA 타입을 결정하기 위해 높은 비용이 요구되었다. 현재 RT-PCR (real time PCR) 방법 및 대립 유전자 특이적 (allele specific PCR) 방법 등이 사용되고 있지만 이는 위양성 (false positive) 결과를 도출하는 위험성도 가지고 있다.Currently, the most commonly used method for genetic testing such as HLA is full sequencing, and identifying each subtype using this is time-consuming and initiates clinical treatment. It wasn't timely appropriate to use it before. In addition, expensive specific software was required to select each subtype, which required a high cost to determine the final HLA type. Currently, RT-PCR (real time PCR) method and allele specific PCR method are used, but this also has a risk of producing a false positive result.
그러므로 약물 과민성을 나타내는 특정 HLA 서브타입을 보다 빠르고 저렴하게 확인할 수 있는 방법의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.Therefore, there is a need for a method of identifying a specific HLA subtype that exhibits drug hypersensitivity faster and cheaper.
이에 본 발명자들은 한국인을 포함한 아시아인에게서 약물 과민 반응을 나타내는 HLA-A, B, DRB1 및 DQA1 유전자의 서브타입들을 신속하고 효과적으로 진단하기 위해, 특정 HLA-A, B, DRB1 및 DQA1의 표지 SNP (tagging SNP, tSNP)를 이용함으로써 약물 과민반응을 보이는 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07 타입을 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have quickly and effectively diagnosed subtypes of the HLA-A, B, DRB1 and DQA1 genes showing drug hypersensitivity in Asians, including Koreans, in order to quickly and effectively diagnose specific HLA-A, B, DRB1 and DQA1 labeled SNPs ( tagging SNP, tSNP), HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA -The present invention was completed after confirming that the DRB1*07 type can be detected quickly and accurately.
본 발명의 목적은 HLA-A, B, DRB1 및 DQA1의 특정 tSNP를 이용하여 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 서브타입을 신속하게 검출하는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는데 있다.The object of the present invention is HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, using specific tSNPs of HLA-A, B, DRB1 and DQA1, It is to provide a method for quickly detecting subtypes of HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 and a kit for the same.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 약물 부작용에 대한 위험도 예측 및 진단 정보를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide risk prediction and diagnostic information for drug side effects using the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for identifying a drug causing drug side effects using the above method.
본 발명은 다양한 약물과민반응 (drug hypersensitivity reactions, HSRs) 또는 약물부작용 (adverse drug reaction, ADR)이, 특히 인간백혈구항원 (HLA)과 연관되어 있는 사실을 근거로, HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 특정 서브타입, 즉, HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 특정 대립유전자의 존재를 신속하고 정확하게 분석하는 방법 및 이에 따른 약물 부작용 위험 평가방법을 제공한다. The present invention is based on the fact that various drug hypersensitivity reactions (HSRs) or adverse drug reactions (ADR) are associated with human leukocyte antigens (HLA), HLA-A, HLA-B, A method for quickly and accurately analyzing the presence of specific alleles of HLA-DQA1 and HLA-DRB1, i.e., HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1, and thus a method for evaluating the risk of drug side effects Gives
특히, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 확인하는 중요 서열 (표지 서열 (tagging sequence))을 찾고 세부 타입들을 다시 결정하기 위해 SNP 표지자 (tagger)를 이용하여 tSNP를 선별하여 사용한다.In particular, important sequences identifying HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 (labels) In order to find the tagging sequence and re-determine the detailed types, tSNP is selected and used using an SNP marker.
일 구체예로서, 본 발명은 HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2)의 368번째 뉴클레오티드, 536번째 뉴클레오티드, 593번째 뉴클레오티드 및 954번째 뉴클레오티드, HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1)의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드 및 2156번째 뉴클레오티드, HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 91번째 뉴클레오티드 및 HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 8240번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 뉴클레오티드를 확인하는 것을 특징으로 하고, 약물 부작용 (ADR) 관련 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자의 SNP 검출 방법을 제공한다.In one embodiment, the present invention is HLA-A gene (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2) 368 th nucleotide, 536 th nucleotide, 593 th nucleotide and 954 th nucleotide, HLA-B gene (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1 ) 384 nucleotides, 667 nucleotides and 2156 nucleotides, HLA-DQA1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1) 91 nucleotides and HLA-DRB1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1) to 8240 nucleotides Characterized by identifying one or more nucleotides selected from the group consisting of, drug side effects (ADR) related genes HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B A method for detecting SNP of one or more HLA alleles selected from the group consisting of *58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 is provided.
특히, 신속하고 정확한 검출을 위해, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자의 다형성 검출용 표지 서열 및 tSNP를 이용하는 것을 특징으로 한다.In particular, for fast and accurate detection, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 Characterized in that using a label sequence and tSNP for polymorphism detection of one or more HLA alleles selected from the group consisting of.
바람직하게는, HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2)의 368번째 뉴클레오티드, 536번째 뉴클레오티드, 593번째 뉴클레오티드 및 954번째 뉴클레오티드의 확인을 위한 tSNP는 HLA-A*3001.4, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-A*3001.7 및 이외의 다른 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합을 사용한다.Preferably, tSNP for identification of 368th nucleotide, 536th nucleotide, 593th nucleotide, and 954th nucleotide of HLA-A gene (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2) is HLA-A*3001.4, HLA-A*3101 , HLA-A*3303, HLA-A*3001.7, and any other combination selected from the group consisting of other haplotypes.
HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1)의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드 및 2156번째 뉴클레오티드의 확인을 위한 tSNP는 HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합일 수 있다.TSNPs for identification of 384 nucleotides, 667 nucleotides, and 2156 nucleotides of the HLA-B gene (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1) are HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58 haplotype It may be any one combination selected from the group consisting of.
HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 91번째 뉴클레오티드의 확인을 위한 tSNP는 HLA-DQA1*02 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합일 수 있다.The tSNP for identification of the 91st nucleotide of the HLA-DQA1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1) may be any combination selected from the group consisting of a combination of HLA-DQA1*02 haplotypes.
HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 8240번째 뉴클레오티드의 확인을 위한 tSNP는 HLA-DRB1*07 일배체의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 조합일 수 있다. HLA-DRB1 유전자의 tSNP는 대립유전자 특이적 증폭 프라이머를 사용하여 증폭 정도 관리 tSNP로 HGF 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11)의 473번째 뉴클레오티드를 함께 사용할 수 있다.The tSNP for identification of the 8240 nucleotide of the HLA-DRB1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1) may be any combination selected from the group consisting of a combination of HLA-DRB1*07 haplotypes. The tSNP of the HLA-DRB1 gene can be used together with the 473 th nucleotide of the HGF gene (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11) as an amplification control tSNP using an allele specific amplification primer.
본 발명의 상기 방법은 스냅샷 (SNaPshot) 분석법에 의해 수행될 수 있다. 이 때, 스냅샷 분석법 이용 시 서열번호 13 내지 22의 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용할 수 있다.The method of the present invention may be performed by a SNAPshot analysis method. In this case, when using the snapshot analysis method, one or more primer pairs selected from the group consisting of primers of SEQ ID NOs: 13 to 22 may be used.
HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 각 서브타입은 각각 별도로, 혹은 함께 검출 가능하다.Each subtype of HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1 can be detected separately or together.
또한 본 발명은 다른 구체예로써, 상기 방법을 수행하기 위한, 서열번호 1 내지 12로 구성된 군에서 선택되는 프라이머 쌍을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용 (ADR) 관련 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자의 SNP 검출용 키트를 제공한다.In addition, the present invention is another embodiment, for performing the above method, characterized in that it comprises at least one primer pair selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 12, drug side effects (ADR) related gene HLA-A* SNP detection of one or more HLA alleles selected from the group consisting of 3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 Kit.
상기 키트는 DNA 중합효소 및 dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 형광물질 등의 표지 물질을 추가로 더 함유할 수 있다.The kit may further contain a labeling material such as a DNA polymerase and dNTP (dATP, dCTP, dGTP and dTTP), fluorescent material.
또한, 본 발명은 다른 구체예로써, 약물 부작용 위험도 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention, as another embodiment, provides a method for providing information for predicting the risk of drug side effects.
이는 앞서 설명한 방법을 이용하여 약물 부작용 (ADR) 관련 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자의 존재를 확인하는 단계; 및 상기 HLA 대립유전자가 존재할 때 약물 부작용 위험이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함한다.These are the drug side effects (ADR) related genes HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and Identifying the presence of one or more HLA alleles selected from the group consisting of HLA-DRB1*07; And determining that there is a risk of drug side effects when the HLA allele is present.
이 때, 상기 약물은 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀, 라파티닙, 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종일 수 있고, 약물 부작용은 스티븐존슨 증후군 (Steven-Jhonson syndrome), 독성 표피괴사 (toxic epidermal necrolysis) 및 중증 간손상이 대표적인 예시이다.In this case, the drug may be one selected from the group consisting of abacavir, allopurinol, carbamazepine, lapatinib, and similar drugs, and side effects of the drug include Steven-Jhonson syndrome and toxic epidermal necrosis ( Toxic epidermal necrolysis) and severe liver damage are typical examples.
또한, 유사한 관점에서, 본 발명은 약물 부작용과 관련된 HLA 대립 유전자를 보유하는 환자의 시료로부터 상기 SNP 검출 방법에 의해 HLA-A*3101, HLA-*3303, HLA-B1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자의 존재를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 부작용 유발 약물을 동정하는 방법도 제공할 수 있다.In addition, in a similar aspect, the present invention provides HLA-A*3101, HLA-*3303, HLA-B1502, HLA-B*57, by the SNP detection method from a sample of a patient holding an HLA allele associated with drug side effects. A method for identifying a drug causing adverse drug reaction, comprising the step of confirming the presence of one or more HLA alleles selected from the group consisting of HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 Can provide.
이와 같이, 본 발명은 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 신속 정확한 검출 방법 및 이러한 결과를 활용할 수 있는, 약물 부작용 평가, 약물 동정 등을 포함하는 모든 용도를 포함한다.As such, the present invention provides rapid and accurate HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07. Includes all uses including detection methods and drug side effects assessment, drug identification, etc. that can utilize these results.
본 발명에 따른 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 대립유전자를 결정하는 진단방법은 특히 한국인을 포함한 아시아인에 대해 높은 정확성을 나타내며, 신속하고 간편하게 진단할 수 있어, 약물성 과민 반응을 사전에 예방하고 대체 약물투여로, 치료의 효과 및 성공률을 높이는데 유용하게 사용될 수 있다.Determining alleles of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 according to the present invention This diagnostic method is particularly accurate for Asians, including Koreans, and can be quickly and easily diagnosed to prevent drug hypersensitivity reactions in advance and to be used to increase the effectiveness and success rate of treatment with alternative drug administration. Can.
도 1은 본 발명의 방법에 따른 HLA-A*3101 및 HLA-A*3303 검출 결과 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 2는 HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58 검출 결과 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 3은 HLA-DQA1*02 검출 결과 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 4는 HLA-DRB1*07 검출 결과 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 5는 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58을 동시에 검출한 결과 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 6은 HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 동시에 검출한 결과 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 7 내지 10은 본 발명의 방법에 따른 HLA-A*3101 및 HLA-A*3303 검출 정보 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이며, 각 SNP의 위치는 진한 빨간색으로 표시하였다.
도 11 내지 13은 본 발명의 방법에 따른 HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58 검출 정보 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.
도 14 내지 15는 HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07 검출 정보 및 이를 위한 tSNP의 조합을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the combination of the results of HLA-A*3101 and HLA-A*3303 detection according to the method of the present invention and tSNP therefor.
2 shows the results of HLA-B*1502, HLA-B*57 and HLA-B*58 detection and a combination of tSNP for this.
3 shows the HLA-DQA1*02 detection result and the combination of tSNP for this.
Figure 4 shows the combination of HLA-DRB1*07 detection results and tSNP for this.
5 shows the results of simultaneously detecting HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57 and HLA-B*58 and a combination of tSNPs therefor.
6 shows the result of simultaneously detecting HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 and the combination of tSNP for this.
7 to 10 show the combination of HLA-A*3101 and HLA-A*3303 detection information and tSNP for this according to the method of the present invention, and the position of each SNP is shown in dark red.
11 to 13 show HLA-B*1502, HLA-B*57 and HLA-B*58 detection information according to the method of the present invention, and a combination of tSNPs therefor.
14 to 15 show the combination of HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07 detection information and tSNP for this.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.Definitions of terms used in the present invention are as follows.
‘유전적 다형성 (genetic polymorphism)’은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP)이라고 한다. 'Genetic polymorphism' refers to a case where a genetic variation occurs at a frequency of at least 1% or more in a population. The insertion, loss, or substitution of a single nucleotide in DNA is called single nucleotide polymorphism (SNP).
‘다형성’이라는 용어는 군집 내에서 변하는 유전자의 서열에서의 배치를 지칭한다. 다형성은 상이한 “대립유전자”로 구성된다. 이러한 다형성의 배치는 유전자에서의 그의 위치 및 그에서 발견되는 상이한 아미노산 또는 염기에 의해 확인될 수 있다. 이러한 아미노산 변이는 2개의 상이한 대립유전자인, 2개의 가능한 변이체 염기, C 및 T의 결과이다. 유전자형은 2개의 다른 별개의 대립유전자로 구성되기 때문에, 여러 가능한 변이체 중 임의의 변이체가 어느 한 개체에서 관찰될 수 있다 (예를 들어, 이 예에서, CC, CT 또는 TT), 개개의 다형성은 또한 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, NCBI 웹사이트 상에서 이용 가능한 뉴클레오티드 염기 변이의 단일 뉴클레오티드 다형성 데이터베이스 (Sigle Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation)에서 사용되는 것인, 지정된 독특한 식별자 (“기준 SNP”, “refSNP” 또는 “rs#)이다. The term'polymorphism' refers to the arrangement in the sequence of genes that change within a cluster. Polymorphism is made up of different “alleles”. The placement of this polymorphism can be confirmed by its position in the gene and the different amino acids or bases found therein. This amino acid variation is the result of two different alleles, two possible variant bases, C and T. Since the genotype consists of two different distinct alleles, any of several possible variants can be observed in any one individual (e.g., CC, CT or TT in this example), individual polymorphisms Also designated unique identifiers, which are known to those skilled in the art and are used, for example, in the Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) of Nucleotide Sequence Variation of nucleotide base variants available on the NCBI website. SNP”, “refSNP” or “rs#).
‘유전자형’이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립 유전자를 지칭한다. ‘표현형’은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적, 또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다. The term “genotype” refers to a specific allele of a specific gene in a cell or tissue sample. 'Phenotype' refers to the morphological, physiological, or biochemical characteristics of an individual determined by a genotype. The genotype is distinct from the phenotype, and refers to the individual's genetic makeup. In a narrower sense, it refers to alleles present on one gene.
‘대립인자’또는 ‘대립 유전자’란 같은 염색체 위치 (same chromosomal locus)를 점유하는 한 유전자의 둘 또는 그 이상의 선택적인 형태 (alternative forms) 중 하나를 뜻한다. 대립유전자의 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다. “Allele” or “allele” means one or more alternative forms of a gene that occupy the same chromosomal locus. The equivalent genetic marker of an allele is a genetic marker associated with the allele of interest, ie, it exhibits a linkage disequilibrium with the allele of interest.
‘대립유전자 빈도’는 대립유전자가 개체 내, 계통 내, 또는 계통의 집단 내에 존재하는 빈도 (비율 또는 백분율)를 지칭한다. 계통 또는 집단 내에서의 대립 유전자 빈도 또는 계통 또는 집단으로부터 개체들의 샘플의 대립유전자 빈도를 평균화함으로써 추정할 수 있다. 'Allele frequency' refers to the frequency (percentage or percentage) in which an allele exists in an individual, within a lineage, or within a population of lineages. It can be estimated by averaging the allele frequency within a lineage or population or the allele frequency of a sample of individuals from a lineage or population.
‘위험’은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다. 'Risk' indicates that the incidence of a disease or condition in an individual with a specific polymorphic allele is statistically high compared to the frequency of occurrence of a disease or condition in a member of an individual without a specific polymorphic allele.
‘핵산’은 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적절하다면 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체 (예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된대로, 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 ‘핵산’이라는 용어와 ‘뉴클레오티드’가 병용하여 쓰이고 있다. “Nucleic acid” refers to a polynucleotide or oligonucleotide such as deoxyribonucleic acid (DNA), and ribonucleic acid (RNA), if appropriate. The term also equally refers to analogs of either RNA or DNA prepared from nucleotide analogs (eg, peptide nucleic acids), and single (sense or antisense) and double helix polynucleotides, as applied to the described embodiments. Includes. In the present invention, the term'nucleic acid' and'nucleotide' are used in combination.
‘프라이머’는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 'Primers' are oligonucleotide sequences that hybridize to complementary RNA or DNA target polynucleotides and serve as a starting point for the stepwise synthesis of polynucleotides from mononucleotides, for example by the action of nucleotidyltransferases that occur in polymerase chain reactions. Means
“기능적 등가물”이라는 용어는 예를 들어, 기준 (reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준 서열과 실험 (subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과 (net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가진다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 함성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다. The term “functional equivalent” refers to, for example, one or more substitutions, deletions or additions from a reference sequence, a net effect that does not result in various functional dissimilarities between the reference sequence and the subject sequence. Etc. It means both the nucleotide and nucleic acid sequences of the changed mutant sequence. Preferably, the nucleotide sequence has at least about 65% identity, more preferably at least about 75% identity, and most preferably about 95% identity. For the purposes of the present invention, sequences having shout characteristics that are substantially equivalent to biologically equivalent biological activity are treated as substantial equivalents.
‘대상’ 또는 ‘환자’는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다. “Subject” or “patient” refers to any single individual in need of treatment, including humans, cattle, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, and insects. In addition, the subject includes any subject who participated in a clinical study trial that did not show any disease clinical findings, or who participated in epidemiological studies or used as a control. In one embodiment of the present invention, a human was targeted.
‘조직 또는 세포 샘플’은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. “Tissue or cell sample” means a collection of similar cells obtained from a subject or patient's tissue. Sources of tissue or cell samples may include fresh, frozen and/or preserved organ or tissue samples or solid tissue from biopsies or aspirates; Blood or any blood component; It can be a cell at any time in the subject's pregnancy or development. The tissue sample can also be primary or cultured cells or cell lines.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. All technical terms used in the present invention, unless defined otherwise, are used in the sense as commonly understood by those skilled in the art in the relevant field of the present invention. In addition, although a preferred method or sample is described herein, similar or equivalent ones are included in the scope of the present invention. The contents of all publications described by reference herein are incorporated into the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
HLA-ADR 관련성HLA-ADR relevance
약물유전체학의 최근 발전에 따라, 약물 부작용 (ADR)에 대한 감수성이 특정의 대립유전자와 관련되어 있음이 밝혀졌고, 이에 환자에 있어서 ADR-관련 대립유전자 검출이 그 환자의 ADR 발병의 위험 여부를 평가함에 유용한 접근 방식임을 시사한다. With recent advances in pharmacogenomics, it has been found that susceptibility to adverse drug reactions (ADRs) is associated with specific alleles, whereby the detection of ADR-related alleles in patients assesses their risk of developing ADR. Suggests that this is a useful approach to ships.
본 발명은 다양한 약물과민반응 (HsRs) 또는 약물 부작용 (ADR)이, 특히 인간백혈구항원 (HLA)과 연관되어 있는 사실을 근거로, HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 특정 서브타입, 즉, HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 특정 대립유전자의 존재를 신속하고 정확하게 분석하는 방법 및 이에 따른 약물 부작용 위험 평가방법에 관한 것이다. The present invention is based on the fact that various drug hypersensitivity reactions (HsRs) or drug side effects (ADR) are associated with human leukocyte antigens (HLA), in particular HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1 It relates to a method for rapidly and accurately analyzing the presence of a specific allele of a specific subtype, HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1, and thus a method for evaluating the risk of drug side effects.
HLA의 유전자 특성상 HLA-A는 3900여개, HLA-B는 4800개, HLA-DQA1는 90여개, HLA-DRB1은 2100여개 이상의 서브타입 (subtype)이 존재하며 이들은 1개 이상의 서로 다른 HLA 서열의 변화를 가지고 타입을 결정하게 된다 (http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html 참조).Due to the genetic properties of HLA, there are over 3900 HLA-A, 4800 HLA-B, over 90 HLA-DQA1, and over 2100 HLA-DRB1 subtypes, and these changes in one or more different HLA sequences To determine the type (see http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html).
(i) HLA-A*3101은 카바마제핀 (carbamazepine, CBZ) 유도 스티븐존슨 증후군/독성 표피괴사 (carbamazepine-induced Stevens-Jhonson syndrome/toxic epidermal necrolysis, SJS/TEN)의 표지자 역할을 한다. (i) HLA-A*3101 acts as a marker for carbamazepine (CBZ)-induced Steven Johnson-induced Stevens-Jhonson syndrome/toxic epidermal necrolysis (SJS/TEN).
(ii) HLA-A*3303은 HLA-B*58의 반수체형의 등가 유전 표지로서, 알로퓨리놀 (allopurinol) 복용 시 HLA-B*58을 가지지 않는 환자에서 HLA-A*3303 서브타입을 가지는 군에서 약물 과민반응이 관찰된다. (ii) HLA-A*3303 is a haploid equivalent genetic marker of HLA-
(iii) HLA-B*1502는 카바마제핀 (carbamazepine, CBZ) 유도 스티븐존슨 증후군/독성 표피괴사 (carbamazepine-induced Stevens-Jhonson syndrome/toxic epidermal necrolysis, SJS/TEN)의 표지자 역할을 한다. (iii) HLA-B*1502 serves as a marker for carbamazepine (CBZ)-induced Steven Johnson-induced Stevens-Jhonson syndrome/toxic epidermal necrolysis (SJS/TEN).
(iv) HLA-B*57은 아바카비어 (abacavir)의 과민반응을 유발한다. (iv) HLA-B*57 causes hypersensitivity to abacavir.
(v) HLA-B*58은 알로퓨리놀 유도 스티븐존슨 증후군/독성표피괴사 (allopurinol induced SJS/TEN)와 밀접한 관련을 가진 타입이다. 특히, HLA-B*58은 한국인에서 발현율이 6.5% 정도로 발현빈도가 높은 유전자이며, HLA-B*58은 임상적으로 면역적 표현형 (phenotype)의 중요한 예측 인자 중의 하나로써, 고요산혈증 (hyperuricemia)과 재발성 통풍 (recurrent gout)의 치료에 쓰이는 알로퓨리놀 (allopurinol)의 고감수성 (hypersensitivity)과 연관되어 있다. HLA-B*58 양성인 사람은 음성인 환자에 비해 알로퓨리놀 투여시 스티븐존슨 증후군이나 독성 표피괴사 같은 심각한 피부의 약물 부작용을 초래할 가능성이 현저하게 높아진다. (v) HLA-
(vi) HLA-DQA*02는 HER2 (ERBB2)가 과발현하는 유방암 환자를 대상으로 처방하는 약제인 라파티닙 (Lapatinib) 유도 간독성을 유발과 연관되어 있다. HLA-DQA1*02 양성인 사람은 음성인 환자에 비해 라파티닙 투여시 중증 간 손상과 같은 약물 부작용을 초래할 가능성이 현저하게 높아진다. (vi) HLA-DQA*02 is associated with inducing Lapatinib-induced hepatotoxicity, a drug prescribed for breast cancer patients overexpressing HER2 (ERBB2). People who are positive for HLA-
(vii) HLA-DRB1*07은 ER2 (ERBB2)가 과발현하는 유방암 환자를 대상으로 처방하는 약제인 라파티닙 유도 간독성을 유발과 연관되어 있다. HLA-DRB1*07 양성인 사람은 음성인 환자에 비해 라파티닙 투여시 중증 간 손상과 같은 약물 부작용을 초래할 가능성이 현저하게 높아진다. (vii) HLA-
이처럼, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 타입은 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀, 라파티닙 등의 약물 관련 부작용과 밀접한 관련을 나타내는 마커로서 기능하기 때문에, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 분석을 통해 상기 약물들의 부작용 위험을 평가할 수 있는 지표로 사용할 수 있는 것이다. 예를 들어, HLA-B*58의 존재는 알로퓨리놀 화합물, 알로휴리놀에 구조적으로 유사한 다른 화합물, 또는 그 대사물에 의해 유발되는 SJS/TEN 또는 HSS의 위험의 지표이다. As such, the types of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
분석방법Method of analysis
본 발명은 일 관점에서 약물 부작용 (ADR)과 관련된 인간백혈구항원 (HLA)의 상기 특정 대립유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 신속하고 정확하게 검출하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention provides the specific alleles HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
대립 유전자는 예를 들면 혈액, 타액, 소변 또는 모발 등의 생체 시료로부터 마련된 게놈 DNA를 사용하여 대립유전자 내의 영역/뉴클레오티드를 직접적으로 검출함으로써 검출할 수 있다. 대립유전자는 예를 들면 혈청학적 방법 또는 미세세포독성법에 의해서도 검출할 수 있다. Alleles can be detected, for example, by directly detecting regions/nucleotides in alleles using genomic DNA prepared from biological samples such as blood, saliva, urine, or hair. Alleles can also be detected by, for example, serological methods or microcytotoxicity.
또한 그 대립유전자의 등가 유전 표지 (equivalent genetic marker)의 검출에 의해 결정할 수도 있으며, 상기 등가 유전 표지는, 예를 들면, 단일 염기 다형 (SNP), 마이크로새털라이트 표지 (microsatellite marker) 또는 다른 종류의 유전자 다형이다. 본 발명에서는 SNP의 사용이 바람직하다. 대립유전자의 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자에 연관된 유전 표지로서, 즉, 그것은 관심 대상의 대립유전자와 연관불균형을 나타낸다. 즉, 대립유전자 그 자체뿐만 아니라 HLA-B*58 또는 HLA-B*57 반수체형 (haplotype)의 존재가 약물 부작용의 지표가 될 수도 있다. 예를 들어, HLA-B*58의 등가 유전 표지 예로는 HLA-A*3303, HLA-Cw*0302, 및 MICA*00201를 들 수 있다. It can also be determined by the detection of the equivalent genetic marker of the allele, the equivalent genetic marker being, for example, a single base polymorphism (SNP), a microsatellite marker or other type of It is a genetic polymorphism. In the present invention, the use of SNP is preferred. The equivalent genetic marker of an allele is a genetic marker associated with the allele of interest, ie, it exhibits a linkage disequilibrium with the allele of interest. That is, the presence of the allele itself as well as the HLA-B*58 or HLA-B*57 haplotype may be an indicator of drug side effects. For example, examples of equivalent genetic labels of HLA-B*58 include HLA-A*3303, HLA-Cw*0302, and MICA*00201.
HLA 대립 유전자 등의 유전 표지의 존재는 그 내부의 표지 또는 특정 영역의 직접적인 검출에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면, 리얼 타임 (Real time) PCR 시스템을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통해 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법 (allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법 (allele-specific amplification), 서열 분석법 (sequencing), 5’뉴클레아제 분해법 (5’nuclease digestion), 분자 비콘에세이법 (molecular becon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 에세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법 (size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법 (single-strand conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행될 수 있다. The presence of genetic markers, such as the HLA allele, can be determined by direct detection of a marker or specific region therein. For example, SNP analysis may be performed using a real-time PCR system, or may be performed through determination of a nucleotide sequence of a direct nucleic acid by a dideoxy method, or a probe comprising a sequence of an SNP site, or The nucleotide sequence of the polymorphic site is determined by hybridizing a probe complementary thereto with the DNA and measuring the degree of hybridization obtained therefrom, or an allele-specific probe hybridization method, an allele-specific amplification method (allele- specific amplification, sequencing, 5'nuclease digestion, molecular becon assay, oligonucleotide ligation assay, size analysis And single-strand conformation polymorphism.
PCR로부터 얻어진 DNA 산물은 예를 들면, 가수분해 프로브 (Taqman, Becons, Scorpions), 부합화 프로브와 같은 서열 특이적 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 이들 프로브는 예를 들면 HLA-B*58의 관심 대상의 영역에 결합하도록 설계된다. 상기 PCR 산물은 DNA-결합제에 의해서도 검출될 수 있다. DNA products obtained from PCR can be detected using sequence specific probes such as, for example, hydrolysis probes (Taqman, Becons, Scorpions), conformation probes. These probes are designed to bind to the region of interest, for example HLA-
관심 대상의 대립유전자의 존재는 그 대립유전자의 등가 유전 표지의 검출에 의해서도 결정할 수 있다. 관심대상의 대립유전자에 가까운 유전 표지는 그 대립유전자와 공 분리 (co-segregate)하거나 또는 연관 불균형을 나타내는 경향이 있다. 따라서 이들 표지 (등가 유전 표지)의 존재는 관심 대상의 대립유전자의 존재의 지표이며, 따라서 ADR 발병 위험의 지표이다. The presence of the allele of interest can also be determined by detection of the equivalent genetic marker of the allele. Genetic markers close to the allele of interest tend to co-segregate with the allele or show linkage imbalance. Therefore, the presence of these markers (equivalent genetic markers) is an indicator of the presence of the allele of interest, and thus an indicator of the risk of developing ADR.
유용한 등가 유전 표지는 관심 대상의 대립유전자로부터 보통 약 200kb 또는 그 미만 (예, 100kb, 80kb, 60kb, 40kb 또는 20kb)에 있으며. 상술한 방법 또는 당 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 등가 유전 표지의 존재나 부재를 검출할 수 있다.Useful equivalent genetic markers are usually about 200 kb or less from the allele of interest (eg, 100 kb, 80 kb, 60 kb, 40 kb or 20 kb). The presence or absence of equivalent genetic labels can be detected using the methods described above or methods known in the art.
또한, 관심 대상 대립유전자의 RNA, cDNA, 또는 단백질 산물을, 그 대립유전자의 존재나 부재의 결정을 위해 검출할 수 있다. In addition, RNA, cDNA, or protein products of alleles of interest can be detected to determine the presence or absence of the allele.
tSNP 이용Use tSNP
이처럼, 관심 대상 HLA 대립유전자의 존재를 다양한 공지의 방법에 서열 기반 유전자형 분석방법 (Sequence Based Typing (SBT)) 또는 대립 형질 특이적 PCR 등에 의해 검출할 수 있지만, SBT 방법은 판독 시간이 많이 소요되고, 판독에 특별한 프로그램을 요구하며, 대립 형질 특이적 PCR에 의한 오류 가능성을 내포한다. 하지만, 본 발명에서 검출하고자 하는 특정 대립 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 서브 타입은 tSNP를 이용하여 분석하는 것으로, SBT를 축소한 방법이며, 따라서 정확도 및 시간단축에 있어 효율적이다. As described above, the presence of the HLA allele of interest can be detected by sequence-based genotyping (SBT) or allele-specific PCR in various well-known methods, but the SBT method takes a long time to read. , Requires a special program for reading, and implies the possibility of errors by allele-specific PCR. However, certain alleles to be detected in the present invention HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
유전자 내 일배체형의 구조 및 각각의 일배체형을 대표하는 SNP를 파악하여 효과적인 전유전체 (genome-side) 연관 구조를 분석하는데 사용한다. It is used to analyze the structure of haplotypes in genes and SNPs representing each haplotype, and to analyze effective genome-side related structures.
그러므로 본 발명은 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 tSNP를 이용하는 것을 특징으로 하는, 상기 HLA 대립 유전자를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 제공한다. Therefore, the present invention uses the tSNP of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
본 발명의 고속 분석 방법은 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 유전형 (다형성)을 특이적으로 검출할 수 있는 표지 서열 (tagging sequence)을 이용하여, HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2)의 368번째 뉴클레오티드, 536번째 뉴클레오티드, 593번째 뉴클레오티드 및 954번째 뉴클레오티드, HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1)의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드 및 2156번째 뉴클레오티드, HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 91번째 뉴클레오티드 및 HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 8240번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형을 확인하여 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07 보유 여부를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다. The high-speed analysis methods of the present invention are genotypes of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
이 때, HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2)의 368번째 뉴클레오티드, 536번째 뉴클레오티드, 593번째 뉴클레오티드 및 954번째 뉴클레오티드의 유전형 확인에 의해 HLA-A*3101, HLA-A*3303의 단일 염기 다형성 (SNP) 보유 여부를 결정할 수 있고, HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1)의 384번째 뉴클레오티드, 667번째 뉴클레오티드 및 2156번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형 확인에 의해 HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58의 단일 염기 다형성 (SNP) 보유 여부를 결정 할 수 있다. 또한 HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 91번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형을 확인에 의해 HLA-DQA1*02의 단일 염기 다형성 (SNP) 보유 여부를 결정할 수 있고, HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 8240번째 뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 위치에서의 뉴클레오티드의 유전형을 확인에 의해 HLA-DRB1*07의 단일 염기 다형성 (SNP) 보유 여부를 결정할 수 있다. HLA-DRB1 유전자의 tSNP는 대립유전자 특이적 증폭 프라이머를 사용하여 증폭 정도 관리 tSNP로 HGF 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11)의 473번째 뉴클레오티드를 함께 사용할 수 있다.At this time, a single HLA-A*3101, HLA-A*3303 was identified by genotyping of the 368th nucleotide, 536th nucleotide, 593th nucleotide, and 954th nucleotide of the HLA-A gene (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2). Whether the polymorphism (SNP) is retained, and the nucleotide at one or more positions selected from the group consisting of 384 nucleotides, 667 nucleotides, and 2156 nucleotides of the HLA-B gene (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1) By genotyping, it is possible to determine whether HLA-B*1502, HLA-
상기 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07 보유 여부는 각각 별도로 또는 함께 검출 할 수 있다. The HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
따라서 본 발명은, HLA 대립유전자의 SNP(단일염기 다형성)를 검출하는 방법으로서, (a) HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 SNP를 확정하는 단계; (b) HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1을 증폭하기 위해 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; (c) 다중 단일염기 프라이머를 사용하여 스냅샷 (SNaPshot) 분석법을 수행하여 생성산물에 대한 SNP를 분석하여 유전형을 확인하는 단계를 포함하고, 이때 상기 (b)단계에서 다중 중합효소 연쇄반응은 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍을 이용하여 HLA-A를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 3 내지 6의 프라이머 쌍을 이용하여 HLA-B를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 HLA-DQA1를 특이적으로 증폭하고, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 이용하여 HLA-DRB1을 특이적으로 증폭하며, 상기 (c) 단계에서 다중 단일염기 프라이머는 서열번호 13 내지 22로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 프라이머를 이용하고, 상기 (c) 단계에서 유전형 확인은, HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2)의 368번째 뉴클레오티드에서 *3101의 대립인자가 G 또는 A, 536번째 뉴클레오티드에서 *3101, *3301, *3303의 대립인자가 G 또는 A, 593번째 뉴클레오티드에서 *3001, *3002, *3004의 대립인자가 T, C 또는 A, 및 954번째 뉴클레오티드에서 *3301, *3307의 대립인자가 T 또는 C; HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1)의 384번째 뉴클레오티드에서 *57, *58의 대립인자가 C 또는 G, 667번째 뉴클레오티드에서 *57, *58의 대립인자가 G 또는 A, 및 2156번째 뉴클레오티드에서 *1502의 대립인자가 A 또는 T; HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 91번째 뉴클레오티드에서 *02의 대립인자가 A 또는 G; 및 HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 8240번째 뉴클레오티드에서 *07의 대립인자가 G 또는 A인지를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.Therefore, the present invention is a method for detecting the SNP (single base polymorphism) of the HLA allele, (a) HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
일 구체예로서 상기 방법은 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있다. In one embodiment, the method may be performed as follows.
(a) 표지 서열을 확정한다.(a) The label sequence is confirmed.
http://hla.alleles.org/alleles/index.html 등의 공지 게놈 DNA 서열을 참조하여 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 표지서열을 확정한다.Refer to known genomic DNA sequences such as http://hla.alleles.org/alleles/index.html HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
(b) 그리고, 목적하는 HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 특정 부위를 증폭한다.(b) Then, specific regions of desired HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1 are amplified.
본 발명의 일 실시예에서는 특정 HLA-A의 엑손 2 내지 4번, HLA-B의 엑손 2 내지 4 및 6 내지 7번, HLA-DQA1의 엑손 1번, HLA-DRB1의 엑손 2번, HGF의 엑손 2번만을 증폭 시켰다. 이때, 적절한 공지의 방법을 선택하여 사용할 수 있는데, 예를 들어, 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR) 등의 방법을 사용할 수 있다. In one embodiment of the present invention,
본 발명의 실시예에서는 상기 증폭을 위해 하기와 같은 서열번호 1 내지 12의 프라이머 세트를 사용하였다. In the examples of the present invention, primer sets of SEQ ID NOs: 1 to 12 as described below were used for the amplification.
HLA-A_F: 5’- CGCCGAGGATGGCCGTC -3’ (정방향: 서열번호 1)HLA-A_F: 5'- CGCCGAGGATGGCCGTC -3' (Forward: SEQ ID NO: 1)
HLA-A_R: 5’- GGAGAACYAGGCCAGCAATGATGCCC 3’ (역방향: 서열번호 2)HLA-A_R: 5'- GGAGAACYAGGCCAGCAATGATGCCC 3'(reverse direction: SEQ ID NO: 2)
HLA-B_E2F: 5’- GGGCGCACGACCYGRGGA 3’ (정방향: 서열번호 3)HLA-B_E2F: 5'- GGGCGCACGACCYGRGGA 3'(Forward: SEQ ID NO: 3)
HLA-B_E4R: 5’- GAAAGGAGGGGAAGATGAGG 3’ (역방향: 서열번호 4)HLA-B_E4R: 5'- GAAAGGAGGGGAAGATGAGG 3'(reverse: SEQ ID NO: 4)
HLA-B_E6F: 5’- TCCCTGCCTCATTACTGGGAAGCAG 3’ (정방향: 서열번호 5)HLA-B_E6F: 5'- TCCCTGCCTCATTACTGGGAAGCAG 3'(Forward: SEQ ID NO: 5)
HLA-B_E7R: 5’- TGGTTAGTCATGGTAAGCGATG 3’ (역방향: 서열번호 6)HLA-B_E7R: 5'- TGGTTAGTCATGGTAAGCGATG 3'(reverse direction: SEQ ID NO: 6)
HLA-DQA1_F: 5’- GCAGGGTTTGGTTTGGGTG 3’ (정방향: 서열번호 7)HLA-DQA1_F: 5'- GCAGGGTTTGGTTTGGGTG 3'(Forward: SEQ ID NO: 7)
HLA-DQA1_R: 5’- TCTGGTTTCCTGAAGGAGRAACA 3’ (역방향: 서열번호 8)HLA-DQA1_R: 5'- TCTGGTTTCCTGAAGGAGRAACA 3'(reverse direction: SEQ ID NO: 8)
HLA-DRB1_F: 5’- CCTGTGGCAGGGTAAGTATA 3’ (정방향: 서열번호 9)HLA-DRB1_F: 5'- CCTGTGGCAGGGTAAGTATA 3'(Forward: SEQ ID NO: 9)
HLA-DRB1_R: 5’- CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC-3’ (역방향: 서열번호 10)HLA-DRB1_R: 5'- CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC-3' (reverse direction: SEQ ID NO: 10)
HGF_F: 5’- CAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTA 3’ (정방향: 서열번호 11)HGF_F: 5'- CAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTA 3'(Forward: SEQ ID NO: 11)
HGF_R: 5’- ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC 3’ (역방향: 서열번호 12)HGF_R: 5'- ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC 3'(reverse direction: SEQ ID NO: 12)
상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 HLA-A 특이적 프라이머이고, 서열번호 3 내지 6 프라이머 쌍은 HLA-B 특이적 프라이머이다. 또한 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍은 HLA-DQA1 특이적 프라이머이고, 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍은 HLA-DRB1 특이적 프라이머이며, 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍은 HGF 특이적 프라이머이다. The primer pairs of SEQ ID NOs: 1 and 2 are HLA-A specific primers, and the primer pairs of SEQ ID NOs: 3 to 6 are HLA-B specific primers. In addition, primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8 are HLA-DQA1 specific primers, primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10 are HLA-DRB1 specific primers, and primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12 are HGF specific primers.
본 발명은 이러한 프라이머 세트 및 이에 대한 용도를 포함한다. The present invention includes such primer sets and uses thereof.
(c) 다중 단일염기 프라이머 확장을 통한 스냅샷 분석법을 수행하여 SNP를 분석한다. (c) SNP is analyzed by performing a snapshot analysis method through multiple single-base primer extension.
이 단계에서 사용할 프라이머를 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07이 구별될 수 있는 tSNP의 앞쪽에 정렬되도록 설계하고 다중 단일염기 다형성 (SNP) 부위에 상기 프라이머를 이용하여 확장반응을 수행한다. HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
본 발명의 일 실시예에서 사용한 다중 단일 염기 프라이머는 서열번호 13 내지 22로서, 이들의 서열 및 용도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. The multiple single base primers used in one embodiment of the present invention are SEQ ID NOs: 13 to 22, and their sequence and use are also included in the scope of the present invention.
HLA-A_368F: 5’- GTGGATAGAGCAGGAG 3’ (정방향: 서열번호 13)HLA-A_368F: 5'- GTGGATAGAGCAGGAG 3'(Forward: SEQ ID NO: 13)
HLA-A_5376R: 5’- TTTTTTTTTGGATCTCGGACCCGGAGACTGTGGG 3’ (역방향: 서열번호 14)HLA-A_5376R: 5'- TTTTTTTTTGGATCTCGGACCCGGAGACTGTGGG 3'(reverse direction: SEQ ID NO: 14)
HLA-A_593R: 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGG 3’ (역방향: 서열번호 15)HLA-A_593R: 5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAGGCGCCTGGGCCTCTCCCGGG 3'(reverse direction: SEQ ID NO: 15)
HLA-A_954R: 5’- TTTTGCAGCGTCTCCTTCCCGTTCTCCAGGT 3’ (역방향: 서열번호 16)HLA-A_954R: 5'- TTTTGCAGCGTCTCCTTCCCGTTCTCCAGGT 3'(Reverse: SEQ ID NO: 16)
HLA-B_384F: 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAC 3’ (정방향: 서열번호 17)HLA-B_384F: 5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGAC 3'(Forward: SEQ ID NO: 17)
HLA-B_667F: 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTTGAGGCCAAAATCCCCGCGGGTTGGTC -3’ (정방향: 서열번호 18)HLA-B_667F: 5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTTGAGGCCAAAATCCCCGCGGGTTGGTC -3' (Forward: SEQ ID NO: 18)
HLA-B_2156F: 5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGGTCCCAGGCTGCGTTAGCCCCTGTG 3’ (정방향: 서열번호 19)HLA-B_2156F: 5'- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGGTCCCAGGCTGCGTTAGCCCCTGTG 3'(Forward: SEQ ID NO: 19)
HLA-DQA1_91F:5’- GGCATTGTGGGTGAGTGC 3’ (정방향: 서열번호 20)HLA-DQA1_91F:5'- GGCATTGTGGGTGAGTGC 3'(Forward: SEQ ID NO: 20)
HLA-DRB1_8240F:5’- GAGTACCGGGCGGTGACGGAGCT 3’ (정방향: 서열번호 21)HLA-DRB1_8240F:5'- GAGTACCGGGCGGTGACGGAGCT 3'(Forward: SEQ ID NO: 21)
HGF_473F:5’-TTTTTTTTGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGAC-3’ (정방향: 서열번호 22)HGF_473F:5'-TTTTTTTTGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGAC-3' (Forward: SEQ ID NO: 22)
그리고 생성 산물에 대한 단일 염기 다형성 (SNP)에 대한 최고점을 분석하여 유전형을 확인함으로써 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 각 대립 유전자 여부를 결정한다. And by analyzing peaks for single base polymorphism (SNP) for the product, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
본 발명의 일 실시예에서는 하기와 같은 결과를 수득하였다. In one embodiment of the present invention, the following results were obtained.
HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2) 중 368번째 뉴클레오티드에서 *3101의 대립인자 G 또는 A; 536번째 뉴클레오티드에서 *3101, *3301, *3303의 대립인자 T 또는 G 또는 A; 593번째 뉴클레오티드에서 *3001, *3002, *3004의 대립인자 T, C 또는 A; 954번째 뉴클레오티드에서 *3301, *3307의 대립인자 T 또는 C가 확인되었다.Allele G or A of *3101 at 368th nucleotide of the HLA-A gene (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2); Alleles T or G or A of *3101, *3301, *3303 at 536th nucleotide; Alleles T, C or A of *3001, *3002, *3004 at 593 nucleotides; Alleles T or C of *3301 and *3307 were identified at 954th nucleotide.
HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1) 중 *57, *58에서 384번째 뉴클레오티드 대립인자 C 또는 G및 667번째 뉴클레오티드 대립인자 G 또는 A가 확인되었고, 2156번째 뉴클레오티드에서 *1502의 대립인자 A 또는 T가 확인되었다. Of the HLA-B gene (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1), the 384th nucleotide allele C or G at *57, *58, and the 667th nucleotide allele G or A were identified, and the *1502 allele at the 2156th nucleotide A or T was identified.
HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1) 91번째 뉴클레오티드에서 *02의 대립인자 A 또는 G가 확인되었다. Allele A or G of *02 was identified in the 91st nucleotide of the HLA-DQA1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1).
HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1) 8240번째 뉴클레오티드에서 *07의 대립인자 G 또는 A가 확인되었고, 내부 대조물질 유전자 HGF 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11)의 473번째 뉴클레오티드에서 대립인자 T가 확인되었다. HLA-DRB1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1) at 8240 nucleotides allele G or A of *07 was identified, and at 473 nucleotides of the internal control gene HGF gene (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11) Factor T was confirmed.
이처럼, HLA-A 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2), HLA-B 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1), HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1), HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1) 및 HGF 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11) 중의 상기 특정 위치에서의 유전형을 확인함으로써 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 보유 여부 또는 존재 여부를 결정할 수 있다. As such, HLA-A gene (NCBI Reference Sequence: NG_029217.2), HLA-B gene (NCBI Reference Sequence: NG_023187.1), HLA-DQA1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1), HLA-DRB1 gene (NCBI HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B by identifying the genotype at the specific position in the Reference Sequence: NG_029921.1) and the HGF gene (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11) *57, HLA-
그리고 HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1의 각 특이적인 엑손 영역에 존재하는 상기의 특정 대립 유전자 (다형성 마커)의 존재는 해당하는 약물 부작용의 판단 기준이 될 수 있다. In addition, the presence of the specific allele (polymorphic marker) present in each specific exon region of HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1 may serve as a criterion for determining a corresponding drug side effect.
따라서 임의의 이용 가능한 방법에 의한 이러한 tSNP 마커의 검출이 진단 목적, 예컨대, 약물 부작용에 대한 감수성의 조기 검출, 환자에 대한 예후, 진단 및 치료를 보조하는데 사용될 수 있다. Thus, detection of such tSNP markers by any available method can be used to aid diagnostic purposes, such as early detection of susceptibility to drug side effects, prognosis for patients, diagnosis and treatment.
상기 방법에 의한 본 발명의 또 다른 측면은 약리게놈학 프로파일링의 방법이다. “약리게놈학 프로파일링”은 질병 또는 의학적 상태, 특히 약물에 대한 부작용과 관련된, 대상자 (subject)에 존재하는 유전 인자의 결정을 의미한다. 이 방법은 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 HLA 대립유전자의 존재를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 필요에 따라 다른 유전 인자 (genetic factor)의 결정을 포함할 수 있다. 그러한 다른 유전 인자는 ADR을 포함하는 어떤 질병 또는 의학적 상태의 소인과도 관련될 수 있다. Another aspect of the invention by the above method is the method of pharmacogenomic profiling. “Pharmacogenomic profiling” refers to the determination of a genetic factor present in a subject, which is associated with a disease or medical condition, particularly adverse effects on the drug. The method is at least selected from the group consisting of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
키트Kit
한편, 본 발명은 다른 관점에서, 상기의 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 특정 HLA 대립유전자 분석 방법 및 이들의 존재 여부를 결정하는 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. On the other hand, the present invention in another aspect, the HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
상기 키트는 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 하나 이상의 HLA 대립 유전자 검출을 위한 프로브를 포함한다.The kit comprises one or more from the group consisting of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
프로브는 본원에서 “다른 물질을 검출하는데 유용한 임의의 물질”을 의미한다. 따라서 프로브는 관심 대상의 대립 유전자 내의 특정 영역에 특이적으로 부합화 (hybridization)하는, 올리고뉴클레오티드 또는 접합 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 접합 올리고뉴클레오티드는 발색단 또는 리간드 함유 분자 (예, 항원)에 공유적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 이는 수용체 분자에 고도로 특이적이다 (예, 항원 특이적인 항체). 프로브는 다른 프라이머와 함께 관심 대상의 대립유전자 내의 특정 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머일 수 있다. 나아가, 상기 프로브는 관심 대상의 대립유전자나 그 대립유전자의 단백질 산물을 인식하는 항체일 수 있다. Probe means "any substance useful for detecting other substances" herein. Thus, the probe can be an oligonucleotide or a conjugated oligonucleotide that specifically hybridizes to a specific region within the allele of interest. Conjugated oligonucleotides refer to oligonucleotides that covalently bind chromophores or ligand-containing molecules (eg, antigens), which are highly specific to receptor molecules (eg, antigen-specific antibodies). The probe can be a PCR primer to amplify a specific region in the allele of interest, along with other primers. Furthermore, the probe may be an antibody that recognizes the allele of interest or the protein product of the allele.
상기 키트는 환자로부터 생체 시료를 수집하기 위한 도구 및/또는 시약 뿐 아니라 그 시료로부터 게놈 DNA, RNA, cDNA 또는 단백질을 준비하기 위한 도구 및/ 또는 시약을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 게놈 DNA의 관련 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약리게놈학적 프로파일링에 유용한 유전 인자용의 프로브를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석 중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등이 있다. The kit may further include tools and/or reagents for collecting a biological sample from a patient, as well as tools and/or reagents for preparing genomic DNA, RNA, cDNA or protein from the sample. For example, PCR primers for amplifying a region of interest in genomic DNA may be included. The kit can include probes for genetic factors useful for pharmacogenomic profiling. In addition, in the use of such kits, labeled oligonucleotides can be readily identified during analysis. Examples of labels that can be used include radioactive labels, enzymes, fluorescent compounds, streptavidin, avidin, biotin, magnetic moieties, metal binding moieties, antigen or antibody moieties, and the like.
특히, 본 발명에서는 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 하나 이상의 HLA 대립유전자의 tSNP 및 표지 단일 염기 다형성 영역의 증폭을 위한 프라이머 세트, 예를 들어 서열 번호 1 내지 12로 표시되는 프라이머 세트들을 포함하는 것이 바람직하다. In particular, in the present invention, in the group consisting of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
ADR 평가ADR evaluation
또한, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 환자로부터 생체 시료를 사용하여 HLA 형 결정 (typing)을 포함하는, 약물에 반응하여 환자에서 약물 부작용을 일으킬 위험을 평가하는 방법에 관한 것이다. In addition, in another aspect, the present invention relates to a method for evaluating the risk of causing drug side effects in a patient in response to a drug, including HLA type typing using a biological sample from a patient by the above method.
즉, 상기 유전 표지, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 존재 또는 부재에 기초하여 환자의 약물 부작용 (예, 스티븐스-존슨 증후군, 독성 표피 괴사 용해, 또는 과민 증후군 등)의 발병 위험 여부를 평가하는 방법을 제공한다. 이때 대립유전자의 존재는 약물부작용의 위험의 지표이다. That is, the presence of the genetic markers, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
그 약물은 바람직하게는 아바카비어, 알로퓨리놀, 카바마제핀, 라파티닙 및 이들 유사 약물로 이루어지는 군에서 선택된다. The drug is preferably selected from the group consisting of abacavir, allopurinol, carbamazepine, lapatinib and these similar drugs.
본원에서 약물 화합물은, 상기 약물 화합물 그 자체, 또는 그 약물 중의 적어도 하나의 수소가 할로, 히드록시, 아실아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴옥시, 아릴, 아릴옥시아릴, 카복시, 카복시알킬, 카복시-치환된 알킬, 카복시-사이클로알킬, 카복시 치환된 사이클로알킬, 카복시아릴, 카복시-치환된 아릴, 카복시헤테로아릴, 카복시-치환된 헤테로아릴, 카복시헤테로사이클릭, 카복시-치환된 헤테로사이클릭, 사이클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 알콕시, 치환된 아릴, 치환된 아릴옥시, 치환된 아릴옥시아릴, 치환된 사이클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 또는 치환된 헤테로사이클릭기로 치환된 것을 제외하고는 그 약물과 같은 화합물을 의미한다. 상기 치환기가 함유하는 탄소수는 0 내지 10, 0 내지 6, 0 내지 4, 또는 0 내지 2일 수 있다. The drug compound herein, the drug compound itself, or at least one hydrogen in the drug, halo, hydroxy, acylamino, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryloxy, aryl, aryloxyaryl, carboxy, Carboxyalkyl, carboxy-substituted alkyl, carboxy-cycloalkyl, carboxy substituted cycloalkyl, carboxyaryl, carboxy-substituted aryl, carboxyheteroaryl, carboxy-substituted heteroaryl, carboxyheterocyclic, carboxy-substituted hetero Between cyclic, cycloalkyl, substituted alkyl, substituted alkoxy, substituted aryl, substituted aryloxy, substituted aryloxyaryl, substituted cycloalkyl, heteroaryl, substituted heteroaryl, heterocyclic or substituted hetero It means the same compound as the drug except that it is substituted with a click group. The number of carbon atoms contained in the substituent may be 0 to 10, 0 to 6, 0 to 4, or 0 to 2.
상기 약물에 대해 ADR 발병 확률이 일반집단 (general population)의 ADR 발병 확률보다 높으면 그 환자는 ADR의 “위험”이 있다. If the probability of developing ADR for the drug is higher than that of the general population, the patient is at risk of ADR.
그 환자의 ADR 발명 확률은 일반집단의 ADR 발병 확률의 적어도 약 1.5배, 더 바람직하게는 적어도 약 2배, 그보다 더 바람직하게는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9배, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 10배이다. 그 확률은, 위험 인자의 발생 수 (incidence)를 이용하는 등의, 당 기술 분야에 알려진 어떤 방법을 사용하여 결정하여도 좋다. The patient's probability of developing ADR is at least about 1.5 times, more preferably at least about 2 times, even more preferably at least about 3, 4, 5, 6, 7, 8 or 9 times the probability of developing ADR in the general population, And most preferably at least about 10 times. The probability may be determined using any method known in the art, such as using the incidence of risk factors.
ADR의“위험” 인자는 ADR과 관련된 인자이다. 위험 인자의 감도는 바람직하게는 적어도 약 40%, 더 바람직하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%이다. 가장 바람직하게는, 그 감도는 적어도 95%이다. ADR을 예측하기 위한 위험 인자의 “감도 (sensitivity)”는 그 위험 인자를 보유한 ADR 환자의 백분율이다. 예를 들어, 만일 모든 SJS 환자가 대립유전자 A를 가지면, SJS를 예측하기 위한 그 대립 유전자 A의 감도는 100%이다. 만일 40명의 SJS 환자 중 20명이 대립유전자 B를 갖는다면, 그때의 SJS를 예측하기 위한 그 대립유전자 B의 감도는 50%이다. ADR's “risk” factor is ADR-related. The sensitivity of the risk factor is preferably at least about 40%, more preferably at least about 50%, 60%, 70%, 80%, 85% or 90%. Most preferably, the sensitivity is at least 95%. The “sensitivity” of a risk factor to predict ADR is the percentage of ADR patients who have that risk factor. For example, if all SJS patients have allele A, the sensitivity of the allele A to predict SJS is 100%. If 20 of the 40 SJS patients have allele B, then the sensitivity of allele B to predict SJS at that time is 50%.
적어도 약 40%의 감도로, ADR과 관련된 HLA 대립 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07은 본 발명에 있어서의 위험 인자로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 그 위험 인자의 감도는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90%이다. 더 바람직하게는, 그 감도는 적어도 95%이다. HLA alleles associated with ADR, HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
본 발명은 또한, ADR과 관련된 HLA 대립유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 보유하는 환자에 있어서 ADR (예, SJS/TEN, HSS, 중증 간 손상 등)을 유발하는 유사 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. The present invention also relates to HLA alleles associated with ADR HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
약물은 T 림프구를 활성화하여 그 결과로서 ADR을 유발하는 어떤 HLA 복합체에 의해 제시될 수 있음이 시사되어 있다. 이들 약물에 반응성인 T 세포는 이들 약물에 의해 유발되는 ADR의 발병에 연루되어 있음이 시사되어 있다. 따라서 이들 T 세포를 활성화할 수 있는 화합물은 이들 ADR과 관련된 하나 또는 그 이상의 HLA 대립 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 보유하는 환자에 있어서 ADR을 유발하는 후보 화합물이다. 결과적으로, 이 방법을 신약 개발에 있어 스크리닝법으로 사용하여 그러한 ADR을 유발할 수 있는 약물 화합물을 찾아낼 수 있다. It is suggested that the drug can be presented by any HLA complex that activates T lymphocytes and as a result induces ADR. It has been suggested that T cells responsive to these drugs are involved in the development of ADRs caused by these drugs. Thus, compounds capable of activating these T cells are one or more HLA alleles associated with these ADRs HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
이와 같이, 본 발명은 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 신속 정확한 검출 방법 및 이러한 결과를 활용할 수 있는, 약물 부작용 평가, 약물 동정 등을 포함하는 모든 용도를 포함한다. As such, the present invention provides rapid and accurate HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
<실시예><Example>
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5‘->3’ 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.Unless otherwise indicated, nucleic acids are recorded in a 5'->3' orientation from left to right. Numeric ranges listed within the specification include numbers defining the ranges, and include each integer or any non-integer fraction within the defined ranges.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in practice to test the present invention, preferred materials and methods are described herein.
실시예 1: 표지 서열의 확정Example 1: Confirmation of the label sequence
http://hla.alleles.org/alleles/index.html를 이용하여 한국인에서 확인되는 HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 및 HLA-DRB1 서열 (HLA-A: Release 3.11.0, 18th January 2013, HLA-B: Release 3.7.0, 12th January 2012, HLA-DQA1: Release 3.26.0, 14th October 2016, 및 HLA-DRB1: Release 3.20.0, 17th April 2017)을 정렬 (alignment)하여 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 표지 서열을 확정하였으며, 그 결과를 도 7 내지 15에 진한 빨간색 글씨로 표시하였다.HLA-A, HLA-B, HLA-DQA1 and HLA-DRB1 sequences identified in Korean using http://hla.alleles.org/alleles/index.html (HLA-A: Release 3.11.0, 18 th Alignment (January 2013, HLA-B: Release 3.7.0, 12 th January 2012, HLA-DQA1: Release 3.26.0, 14 th October 2016, and HLA-DRB1: Release 3.20.0, 17 th April 2017) ) To specifically detect genotypes of HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
실시예 2: 다중 중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)Example 2: multiplex polymerase chain reaction (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)
특정 HLA-A 엑손 2 내지 4번, HLA-B 엑손 2 내지 4번, 6 내지 7번, HLA-DQA1 엑손 1번, HLA-DRB1 엑손 2번, HGF의 엑손 2번의 부위만을 증폭하기 위하여 여러 가지 HLA 클래스들과 구별할 수 있는 HLA-A 특이적 프라이머인 HLA-A_F 프라이머 (5’- CGCCGAGGATGGCCGTC 3’, 서열번호 1)와 HLA-A_R 프라이머 (5’- GGAGAACYAGGCCAGCAATGATGCCC 3‘, 서열번호 2)를 사용하였고, HLA-B 특이적 프라이머인 HLA-B_E2F 프라이머 (5’- GGGCGCACGACCYGRGGA 3‘, 서열번호 3), HLA-B_E4R 프라이머 (5’- GAAAGGAGGGGAAGATGAGG 3’, 서열번호 4), HLA-B_E6F 프라이머 (5’- TCCCTGCCTCATTACTGGGAAGCAG 3’, 서열번호 5), HLA-B_E7R 프라이머 5’- TGGTTAGTCATGGTAAGCGATG 3‘, 서열번호 6)를 사용하였다. 또한, HLA-DQA1 특이적 프라이머인 HLA-DQA1_F 프라이머 (5’- GCAGGGTTTGGTTTGGGTG 3‘, 서열번호 7)와 HLA-DQA1_R 프라이머 (5’- TCTGGTTTCCTGAAGGAGRAACA 3‘, 서열번호 8)를 사용하였고, HLA-DRB1의 특이적인 프라이머인 HLA-DRB1_F 프라이머 (5’- CCTGTGGCAGGGTAAGTATA 3‘, 서열번호 9)와, HLA-DRB1_R 프라이머 (5’- CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC-3‘, 서열번호 10)를 사용하였으며, HGF의 특이적인 프라이머인 HGF_F 프라이머 (5’- CAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTA 3‘, 서열번호 11)와 HGF_R 프라이머 (5’- ATCCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTT1C 3‘, 서열번호 12)를 사용하였다. 중합효소연쇄반응은 ABI 9700 (Applied Biosystems, Foster, USA)를 이용하여 실시하였다. Various HLA-
HLA-A 유전자의 경우 총 50 ul의 반응액은, 의뢰검체 100 ng, 10X EF 태그 반응 버퍼 5 ul, 5 pmol/ul의 1번과 2번 프라이머 각 0.5 ul, 5X 밴드 닥터 (Band Doctor) 1 ul, 2.5 mM의 dNTP 혼합물 (2.5 m</각각) 2 ul, 2.5 U/ul의 EF-태그 DNA 폴리머라제 0.2 ul, 뉴클레아제가 제거된 물 (Nucelase free water)로 최종 50 ul를 맞추어 구성하였다. 95℃에서 2분간 처리한 후에, 95℃ 20초, 62℃ 40초, 72℃ 1분 40초씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다. For the HLA-A gene, a total of 50 ul of the reaction solution is 100 ng of the request sample, 5 ul of the 10X EF tag reaction buffer, 0.5 ul of 5 pmol/ul of
HLA-B 유전자의 경우 총 30 ul의 반응액은, 의뢰검체 100 ng, 10X EF 태그 반응 버퍼 3 ul, 5 pmol/ul의 3번과 4번 프라이머 각 0.4 ul, 5 pmol/ul의 5번과 6번 프라이머 각 0.6 ul, 5X 밴드 닥터 2 ul, 2.5 mM의 dNTP 혼합물 (2.5 m</각각) 2 ul, 2.5 U/ul의 EF-태그 DNA 폴리머라제 0.2 ul, 뉴클레아제가 제거된 물로 최종 30 ul를 맞추어 구성하였다. 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃ 20초, 63℃ 30초, 72℃ 1분 30초씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다.For the HLA-B gene, a total of 30 ul of the reaction solution is 100 ng of the request sample, 3 ul of the 10X EF tag reaction buffer, 3 and 4 of 5 pmol/ul and 4 primers of 0.4 ul and 5 pmol/ul of 5, respectively.
HLA-DQA1, HLA-DRB1, HGF 유전자의 경우 총 30 ul의 반응액은, 의뢰검체 100 ng, 10X EF 태그 반응 버퍼 3 ul, 5 pmol/ul의 7번과 8번 프라이머 각 0.4 ul, 5 pmol/ul의 9번과 10번 프라이머 각 0.6 ul, 5 pmol/ul의 11번과 12번 프라이머 각 0.3 ul, 5X 밴드 닥터 2 ul, 2.5 mM의 dNTP 혼합물 (2.5 m</각각) 2 ul, 2.5 U/ul의 EF-태그 DNA 폴리머라제 0.2 ul, 뉴클레아제가 제거된 물로 최종 30 ul를 맞추어 구성하였다. 94℃에서 5분간 처리한 후에, 98℃ 20초, 58℃ 30초, 72℃ 25초씩 35회 반응시켰고, 최종연장 반응은 72℃에서 5분간 수행하였다.For HLA-DQA1, HLA-DRB1, and HGF genes, a total of 30 ul of the reaction solution is 100 ng of the request sample, 3 ul of the 10X EF tag reaction buffer, and 7 and 8 primers of 0.4 pul/5 pmol, respectively /
다음으로 중합효소 연쇄반응이 끝난 산물을 얼음 수조로 옮긴 후, 파라필름 (parafilm) 위에 PCR 산물 2 ul, 6X 로딩 버퍼 1 ul를 섞어, 1% 아가로오스 겔에 100 bp와 1 kb의 믹스드 DNA 래더 (Mixed DNA ladder) 2 ul를 0.5X TBE 버퍼를 섞어서 100V, 30분간 전기영동을 실시하였다. Next, after transferring the polymerase chain reaction finished product to an ice bath,
이후, 1% 아가로오스 겔을 형광 물질을 함유한 겔 레드 (gel red)를 염색하여 DNA 크기를 확인하였다. PCR 산물 크기를 확인한 후 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58을 확인하기 위해 샘플 내의 프라이머와 dNTP를 제거하기 위한 ExoSAP-IT (USB corp., Cleveland, USA) 2.2 ul 및 HLA-A PCR 산물 1.9 ul 및 HLA-B PCR 산물 1.4 ul를 섞어 37℃ 30분, 80℃ 15분간 반응시켰다. 또한 HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 확인하기 위해 샘플 내의 프라이머와 dTNP를 제거하기 위해한 ExoSAP-IT 2.2 ul 및 HLA-DQA1 PCR 산물 1.5 ul, HLA-DRB1 PCR 산물 1.5 ul 및 HGF PCR 산물 1.5 ul를 섞어 37℃ 30분, 80℃ 15분간 반응시켰다.Thereafter, a 1% agarose gel was stained with gel red containing a fluorescent material to confirm DNA size. ExoSAP- to remove primers and dNTPs in samples to identify HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
실시예Example 3: 다중 단일염기 3: Multiple single base 프라이머primer 확장 반응 (multiplex single based primer extension, Extension reaction (multiplex single based primer extension, SNaPshotSNaPshot assay)을 이용한 유전자형 검사 assay)
3-1. 유형별 프라이머 설계3-1. Primer design by type
다중 단일염기 프라이머 확장반응 (multiplex single based primer extension, SNaPshot assay)을 위한 유형별 프라이머는 서열번호 13 내지 22의 프라이머를 사용하였다. Primers of SEQ ID NOs: 13 to 22 were used as primers for each type for multiplex single based primer extension (SNaPshot assay).
프라이머들의 3‘ 끝이 각 HLA 유전자에 있는 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 구별할 수 있는 tSNP들의 직전 뉴클레오티드와 정렬되도록 설계하였다. The 3'ends of the primers are HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
3-2. 스냅샷 분석법3-2. Snapshot method
스냅샷 분석을 위해 중합효소연쇄반응 산물을 주형으로 하여 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58의 경우, 서열번호 13 내지 19의 프라이머를 사용하여 7개의 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 7개의 유형별 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응을 시행하였다.For HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
또한, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 경우, 서열번호 20 내지 22의 프라이머를 사용하여 3개의 단일염기다형성 부위에 대해 길이를 다르게 설계한 3개의 유형별 프라이머를 이용하여 다중 단일염기 프라이머 확장반응을 시행하였다.In addition, in the case of HLA-
다중 단일염기 프라이머 확장반응은 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58의 경우, SNaPshot 멀티플렉스 레디 리액션 믹스 1 ul, 1/2 텀 (term) 버퍼, ExoSAP-IT 산물 5.5ul, 2X 프리 믹스 (서열번호 13 내지 19의 프라이머의 혼합: 예를 들어 100 ul의 2X 프라이머 믹스를 만든다고 한다면, 100 pmol/ul의 HLA-A 368G>A seqF(T0) 25 ul, 100 pmol/ul의 HLA-A 954T>C seqR(T4) 0.4 ul, 100 pmol/ul의 HLA-A 536G>A seqR(T9) 1.5 ul, 100 pmol/ul의 HLA-A 593T>C/A seqR(T18) 1.5 ul, 100 pmol/ul의 HLA-B 384C>G seqF(T23) 0.8 ul, 100 pmol/ul의 HLA-B 667G>A seqF(T23) 1.3 ul 및 100 pmol/ul의 HLA-B 2156A>T seqR(T27) 15 ul를 섞고, 멸균된 3차 증류수 54.5 ul를 넣어 최종 100 ul가 되게 하여 만든다.) 0.5 ul로 구성하였다. Multiple single-base primer extension reactions are SNaPshot multiplex
또한, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 경우, 스냅샷 멀티플렉스 레디 리액션 믹스 (SNaPshot Multiplex Ready Reaciotn Mix 1ul, 1/2 텀 버퍼, ExoSAP-IT 산물 6.7 ul, 2X 프라이머 믹스 (서열번호 20 내지 22의 프라이머의 혼합: 예를 들어 100 ul의 2X Primer mix를 만든다고 한다면, 100 pmol/ul의 HLA-DQA1 91A>G seqF(T0) 3 ul, 100 pmol/ul의 HLA-DRB1 8240G>A seqF(T0) 3 ul 및 100 pmol/ul의 HGF 473T seqF(T4) 4 ul를 섞고, 멸균된 3차 증류수 90 ul를 넣어 최종 100 ul가 되게 하여 만든다.) 0.5 ul로 구성하였다. In addition, for HLA-
준비한 산물들은 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 30초를 40회 반응 시킨 뒤, SAP을 1.2 ul (1 U/ul)를 첨가하여 37℃ 60분, 65℃ 15분간 반응시켜 남아있는 ddNTP를 제거하였다.The prepared products were reacted 40 times at 96°C for 10 seconds, 50°C for 5 seconds, and 60°C for 30 seconds, followed by adding 1.2 ul (1 U/ul) of SAP to react at 37°C for 60 minutes and for 65 minutes for 15 minutes ddNTP was removed.
반응 산물 1 ul에 GeneScan-120 LIZ 사이즈 스탠다드 0.3 ul 및 Hi-Di 포름아미드 8.7 ul를 넣어 ABI 3130 유전자 분석기 (Applied biosystems, Foster, USA)를 이용하여 분석하였다.In the
3-3. 단일 염기 다형성 (SNP) 분석3-3. Single base polymorphism (SNP) analysis
각 단일염기 다형성 위치에 상보적인 형광을 붙인 ddNTP가 각 프라이머 3‘ 끝에 오도록 조합하여 확장 반응 산물을 얻어, 각 SNP에 대한 각각의 최고점을 분석하였다. 소프트웨어는 GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하였으며 분석결과에 따라 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07의 존재 여부를 확인하였다. DdNTP with complementary fluorescence at each single-base polymorphic site was combined to come to the end of each 3′ primer to obtain an extended reaction product, and each peak for each SNP was analyzed. The software used GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Foster, USA). HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
그리고 실험으로 통해 얻어진 결과를 표준검사법 (gold standard, Sequencing)으로 얻어진 유전자 서열 정보 (sequencing data)와 비교하였다. And the results obtained through the experiment were compared with the genetic sequence information (sequencing data) obtained by the standard test (gold standard, sequencing).
HLA-A*3101 및 HLA-A*3303 결과는 도 1에 도시하였고, HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58 결과는 도 2에 도시하였으며, HLA-DQA1*02는 도 3, HLA-DRB1*07은 도 4에 각각 도시하였다. HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58을 동시에 검사한 결과는 도 5에 도시하였으며, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07을 동시에 검사한 결과는 도 6에 도시하였다. The results of HLA-A*3101 and HLA-A*3303 are shown in FIG. 1, and HLA-B*1502, HLA-
도 7 내지 10은 서열상의 HLA-A*3101 및 HLA-A*3303 검출 정보를, 도 11 내지 13은 서열상의 HLA-B*1502, HLA-B*57 및 HLA-B*58 검출 정보를, 도 14 내지 15는 서열상의 HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07 검출 정보를 나타낸 것이며, 각 SNP의 위치는 진한 빨간색으로 표시하였다.7 to 10 are HLA-A*3101 and HLA-A*3303 detection information in sequence, and FIGS. 11 to 13 are HLA-B*1502, HLA-
이러한 결과를 통해, 약물 부작용 (ADR) 관련 유전자 HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-B*57, HLA-B*58, HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립 유전자의 존재 여부를 빠르고 정확하게 확인할 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명을 이용하여 상기 특정 HLA 대립 유전자의 타입을 고속으로 검출하여 약물 부작용과 관련된 위험도 예측 및 진단 방법에 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.Through these results, the drug side effects (ADR) related genes HLA-A*3101, HLA-A*3303, HLA-B*1502, HLA-
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far, the present invention has been focused on the preferred embodiments. Those skilled in the art to which the present invention pertains will understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in terms of explanation, not limitation. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the foregoing description, and all differences within the equivalent range should be construed as being included in the present invention.
<110> SPMED Co., Ltd. <120> METHOD FOR QUICK-DETECTING HLA ALLELES ASSOCIATED WITH ADVERSE DRUG REACTION USING tSNP <130> DPP170165KR <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_F primer <400> 1 cgccgaggat ggccgtc 17 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_R primer <400> 2 ggagaacyag gccagcaatg atgccc 26 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E2F primer <400> 3 gggcgcacga ccygrgga 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E4R primer <400> 4 gaaaggaggg gaagatgagg 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E6F primer <400> 5 tccctgcctc attactggga agcag 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E7R primer <400> 6 tggttagtca tggtaagcga tg 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DQA1_F primer <400> 7 gcagggtttg gtttgggtg 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DQA1_R primer <400> 8 tctggtttcc tgaaggagra aca 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DRB1_F primer <400> 9 cctgtggcag ggtaagtata 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DRB1_R primer <400> 10 cccgtagttg tgtctgcaca c 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF_F primer <400> 11 cagtgccttc ccaaccattc cctta 25 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF_R primer <400> 12 atccactcac ggatttctgt tgtgtttc 28 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_368F primer <400> 13 gtggatagag caggag 16 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_536R primer <400> 14 tttttttttg gatctcggac ccggagactg tggg 34 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_593R primer <400> 15 tttttttttt ttttttttaa aggcgcctgg gcctctcccg gg 42 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_954R primer <400> 16 ttttgcagcg tctccttccc gttctccagg t 31 <210> 17 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_384F primer <400> 17 tttttttttt tttttttttt tttcaggagg ggccggagta ttgggac 47 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_667F primer <400> 18 tttttttttt tttttttttt tttagttgag gccaaaatcc ccgcgggttg gtc 53 <210> 19 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_2156F primer <400> 19 tttttttttt tttttttttt tttttttagg gtcccaggct gcgttagccc ctgtg 55 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DQA1_91F primer <400> 20 ggcattgtgg gtgagtgc 18 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DRB1_8240F primer <400> 21 gagtaccggg cggtgacgga gct 23 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF_473F primer <400> 22 ttttttttgc tgggaaataa gaggaggaga c 31 <110> SPMED Co., Ltd. <120> METHOD FOR QUICK-DETECTING HLA ALLELES ASSOCIATED WITH ADVERSE DRUG REACTION USING tSNP <130> DPP170165KR <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_F primer <400> 1 cgccgaggat ggccgtc 17 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_R primer <400> 2 ggagaacyag gccagcaatg atgccc 26 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E2F primer <400> 3 gggcgcacga ccygrgga 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E4R primer <400> 4 gaaaggaggg gaagatgagg 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E6F primer <400> 5 tccctgcctc attactggga agcag 25 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_E7R primer <400> 6 tggttagtca tggtaagcga tg 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DQA1_F primer <400> 7 gcagggtttg gtttgggtg 19 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DQA1_R primer <400> 8 tctggtttcc tgaaggagra aca 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DRB1_F primer <400> 9 cctgtggcag ggtaagtata 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DRB1_R primer <400> 10 cccgtagttg tgtctgcaca c 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF_F primer <400> 11 cagtgccttc ccaaccattc cctta 25 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF_R primer <400> 12 atccactcac ggatttctgt tgtgtttc 28 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_368F primer <400> 13 gtggatagag caggag 16 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_536R primer <400> 14 tttttttttg gatctcggac ccggagactg tggg 34 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_593R primer <400> 15 tttttttttt ttttttttaa aggcgcctgg gcctctcccg gg 42 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A_954R primer <400> 16 ttttgcagcg tctccttccc gttctccagg t 31 <210> 17 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_384F primer <400> 17 tttttttttt tttttttttt tttcaggagg ggccggagta ttgggac 47 <210> 18 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_667F primer <400> 18 tttttttttt tttttttttt tttagttgag gccaaaatcc ccgcgggttg gtc 53 <210> 19 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B_2156F primer <400> 19 tttttttttt tttttttttt tttttttagg gtcccaggct gcgttagccc ctgtg 55 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DQA1_91F primer <400> 20 ggcattgtgg gtgagtgc 18 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-DRB1_8240F primer <400> 21 gagtaccggg cggtgacgga gct 23 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HGF_473F primer <400> 22 ttttttttgc tgggaaataa gaggaggaga c 31
Claims (13)
상기방법은 HLA-DQA1*02 및 HLA-DRB1*07로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 대립유전자의 다형성 검출용 표지 서열 (tagging sequence)을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1,
The method is characterized by using a tagging sequence for detecting polymorphism of one or more HLA alleles selected from the group consisting of HLA-DQA1*02 and HLA-DRB1*07.
HLA-DQA1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1)의 91번째 뉴클레오티드 확인을 위한 tSNP는 HLA-DQA1*02 일배체인 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1,
A method characterized in that tSNP for identification of the 91st nucleotide of the HLA-DQA1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_032876.1) is a HLA-DQA1*02 haplotype.
HLA-DRB1 유전자 (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1)의 8240번째 뉴클레오티드 및 HGF 유전자 (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11)의 473번째 뉴클레오티드 확인을 위한 tSNP는 HLA-DRB1*07 일배체인 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1,
The tSNP for identifying the 8240 nucleotide of the HLA-DRB1 gene (NCBI Reference Sequence: NG_029921.1) and the 473 nucleotide of the HGF gene (NCBI Reference Sequence: NC_000017.11) is characterized by a HLA-DRB1*07 haplotype. Way.
상기 스냅샷 분석법 이용 시 서열번호 20 내지 22의 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 7,
Method using at least one primer pair selected from the group consisting of the primers of SEQ ID NO: 20 to 22 when using the snapshot analysis method.
상기 약물은 라파티닙인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10,
The method of claim 1, wherein the drug is lapatinib.
상기 약물 부작용은 중증 간 손상인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10,
The method of claim 1, wherein the drug side effect is severe liver damage.
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