KR102133893B1 - 분변을 이용한 대사성 비만 질환 모니터링 방법 - Google Patents

분변을 이용한 대사성 비만 질환 모니터링 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분변을 이용한 대사성 비만 질환 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈액을 이용하지 않고 손쉽게 얻을 수 있는 분변으로부터 대사성 비만 질환을 모니터링할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 혈액을 이용하지 않고 샘플 채취가 용이한 분변을 이용하여 대사성 비만을 진단하기 때문에 혈액 채취가 어려운 대상으로부터 다량의 샘플을 쉽게 입수할 수 있으며, 용이하게 대사성 비만 질환을 발명 가능성을 예측할 수 있다.

Description

분변을 이용한 대사성 비만 질환 모니터링 방법{Method for Monitoring Metabolic Obesity Disease Using Feces}
본 발명은 분변을 이용한 대사성 비만 질환 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈액을 이용하지 않고 손쉽게 얻을 수 있는 분변으로부터 대사성 비만 질환을 모니터링할 수 있는 방법에 관한 것이다.
근래에 와서 식생활이 개선되고 생활양식이 편리해짐에 따라 비만 환자가 증가하고 있다. 비만의 대부분은 섭취한 에너지 중에서 소모되고 남은 부분이 지방으로 전환되어 체내의 여러 부분, 특히 피하조직 및 복강 내에 축적되는 현상이다.
비만은 지방 조직의 기능에 필요한 지방량보다 훨씬 많은 지방이 체내에 축적되어 정상적인 생화학 및 생리적 기능에 장애를 줄 뿐만 아니라 여러 가지 질환, 특히 당뇨병, 고혈압 및 관상동맥질환의 원인이 되므로 예방과 조기 치료에 많은 노력을 기울여야 한다.
특히, 고지방식이(high-fat diet, HFD)에 의해 유도된 비만은 당뇨병, 동맥경화증, 만성 간 질환, 관동맥성 심장병, 지방간 및 고혈압의 발달에 가장 중요한 위험 인자이므로, 이들의 예방 및 치료는 건강한 생활 방식의 연장선에서 고려되어야 한다.
최근에는 비만에 대하여 경각심을 갖고 비만의 원인을 이해하며 이에 대응하고자 지구적으로 노력하고 있지만, 그러한 노력에도 불구하고 비만은 가속적으로 증가하는 추세이다.
대사성 비만의 진단은 지금까지는 대부분 혈액을 이용한 방법을 사용하였다. 예를 들어, 대한민국 등록특허공보 제10-1759786호, 제10-1556403호, 제10-1256928호 등에서 혈액 샘플로부터 비만을 진단하기 위한 방법을 제공한 바 있다.
그러나, 혈액을 채취하여 검사하는 방법은 채혈 가능한 양이 약 1mL 이하로 한정되어 있으며, 환자에 따라서는 혈액 채취가 어려운 경우도 있어, 보다 효율적인 방법으로 대사성 비만 질환을 진단하고 모니터링할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.
한편, 마이크로알엔에이(miRNA)는 단백질 번역에 직접 관여하지 않는 21-23 뉴클레오타이드 크기의 작은 단일가닥 RNA로 1993년 처음 발견된 이래 그 생리작용이 연구되어 왔으며, RNA 간섭 현상을 일으켜 생체 내 단백질 번역과정을 조절하는 것으로 밝혀졌다.
MiRNA를 이용하면 암 등 여러 질병과 관련된 유전자의 발현을 조절할 수 있으므로 암을 비롯한 질병 치료의 수단 중 하나로 사용될 수 있다. 또한, 질병 치료의 수단 뿐만 아니라 종류와 진행 양상에 따라 조직에서 검출되는 miRNA의 종류와 양이 상이하므로 조기 진단을 위해서도 miRNA를 활용하고 있다.
본 발명의 발명자들은 분변 샘플로부터 miRNA를 추출하여 대사성 비만의 생화학적 바이오마커로서 활용할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 혈액을 채취하지 않고도 분변으로부터 대사성 비만을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 분변으로부터 대사성 비만을 모니터링하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 대사성 비만의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 대상자의 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을 기준치와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 비교 결과로부터 대사성 비만의 진단에 관한 정보를 제공하는 단계.
본 발명에 있어서, 대사성 비만의 진단에 관한 정보는 대사성 비만의 발병 여부을 진단하거나, 발병 위험성을 예측하거나, 발병 후 경과를 판단하기 위한 정보일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기준치는 건강한 대상의 miR-129-5p 발현 수준일 수 있다.
상기 (c) 단계는 miR-129-5p의 발현 수준이 기준치보다 낮으면 대사성 비만에 해당하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 대사성 비만의 모니터링 방법을 제공한다:
(a) 대상자의 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을 대상자의 이전의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 비교 결과로부터 대사성 비만의 상태를 모니터링 하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 miR-129-5p의 발현 수준이 이전의 발현 수준보다 높으면 대사성 비만이 완화된 것으로 판단하고, 이전의 발현 수준보다 낮으면 대사성 비만이 악화된 것으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 혈액을 이용하지 않고 샘플 채취가 용이한 분변을 이용하여 대사성 비만을 진단하기 때문에 혈액 채취가 어려운 대상으로부터 다량의 샘플을 쉽게 입수할 수 있으며, 용이하게 대사성 비만 질환을 발명 가능성을 예측할 수 있다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 대상자의 분변으로부터 대사성 비만을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 용어 "발현 수준"은 예를 들어 관심 핵산의 발현의 측정된 수준을 언급한다. 발현 수준은 또한 상이한 조직, 환자 대 건강한 대조군 등에서의 발현에 관하여 평가될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "유전자"는 기능성 RNA 생성물을 제어된 방식으로 생산하는 데 필요한 정보를 함유하는 핵산 절편의 세트이다.
본 발명에서, 용어 "유전자 생성물"은 유전자의 전사 또는 발현을 통해 생산된 생물학적 분자, 예를 들어 miRNA 또는 번역된 단백질이다.
본 발명에서, 용어 "miRNA"는 짧은 자연 발생 RNA 분자이며 당업자에 의하여 이해되는 통상의 의미를 갖는다.
본 발명에서, 용어 "어레이"는 소자, 예를 들어 칩 소자 상의 어드레스 가능한 위치의 배열을 언급한다. 위치의 개수는 수개 내지 적어도 수백개 또는 수천개 범위일 수 있다. 각각의 위치는 독립된 반응 부위를 나타낸다. 어레이는 핵산 어레이, 단백질 어레이 및 항체 어레이를 포함하며 이들에 한정되지 않는다. "핵산 어레이"는 핵산 프로브, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 보다 큰 부분을 함유하는 어레이를 언급한다. 어레이상의 핵산은 바람직하게는 단일 가닥이다. "마이크로어레이"는 바이오칩 또는 생물학적 칩, 즉 적어도 약 100/cm2의 고정화 프로브를 지닌 불연속 영역의 밀도를 갖는 영역의 어레이를 언급한다.
본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 대사성 비만의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:
(a) 대상자의 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을 기준치와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 비교 결과로부터 대사성 비만의 진단에 관한 정보를 제공하는 단계.
상기 (a) 단계는 대상자의 분변 샘플로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계이다. 상기 분변 샘플은 마이크로어레이 분석에 의하여 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명은 분변으로부터 발현될 수 있는 miRNA 중에서 miR-129-5p가 대사성 비만 질환의 발명과 예후를 진단할 수 있는 마커로서 활용될 수 있다는 것을 발견하였다.
구체적으로, 대사성 비만 질환이 완화된 대상체의 경우 대사성 비만 질환을 앓고 있는 대상체의 miR-129-5p 발현 수준보다 약 2배의 miR-129-5p 발현 수준을 나타낼 수 있다.
따라서, 상기 (b) 단계에 있어서, miR-129-5p의 발현 수준을 측정한 결과가 기준치와 비교할 때 더 낮은 수준을 나타내면 대사성 비만에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.
상기 기준치는 건강한 대상자의 miR-129-5p 발현 수준을 의미하며, 문헌상의 수치일 수 있으며, 또는 대상자가 건강했을 때 측정해 놓은 miR-129-5p 발현 수준일 수 있다.
상기 (c) 단계에서, 대사성 비만의 진단에 관한 정보는 대사성 비만의 발병 여부을 진단하거나, 발병 위험성을 예측하거나, 발병 후 경과를 판단하기 위한 정보일 수 있다.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 대사성 비만의 모니터링 방법을 제공한다:
(a) 대상자의 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을 대상자의 이전의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 비교 결과로부터 대사성 비만을 모니터링 하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계는 miR-129-5p의 발현 수준이 이전의 발현 수준보다 높으면 대사성 비만이 완화된 것으로 판단하고, 이전의 발현 수준보다 낮으면 대사성 비만이 악화된 것으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 대사성 비만 환자가 매번 채혈을 하지 않고도 분변을 이용하여 간단한 방법으로 대사성 비만의 경과를 모니터링하는 것이 가능하다. 상기 모니터링은 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하여, 이전의 발현수준과 비교함으로써 대사성 비만의 예후를 판단할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 물질 및 방법
1.1 동물 및 식이
4주령 수컷 C57BL/6J 실험쥐를 오리엔트 바이오社로부터 구매하여 1주일간 실험실 환경에 적응시켰다. 실험쥐를 10마리씩 두 그룹으로 나눈 다음 8주 동안 표 1에 나타낸 고지방식이(HFrD) 또는 고지방식이 + 5wt% 포도씨가루(chardonnay grape seed, ChrSd) 식이를 자유 식이로 섭취하도록 하였다. 체중을 매주 측정하고, 섭취량은 주 2회 모니터링 하였다.
성분 HFrD HFrD + 5% ChrSd
Lard Fat 225 225
Soybean Oil 27 23
Cholesterol 0.8 0.8
MCC(microcrystalline cellulose) 50 21.4
ChrSd 0 50
Casein 200 199
Corn Starch 91.2 74.8
Fructose 355 355
L-Cystine 3 3
Choline Bitartrate 3 3
Mineral Mix 35 35
Vitamin Mix 10 10
Total Diet(g) 1000 1000
Fat % 46.7 46.7
Protein % 16.7 16.7
Carbohydrate % 36.6 36.1
1.2 샘플 채취
실험쥐를 12시간 굶긴 후 마취하였다. 혈액 샘플을 심장 천자 방법을 이용하여 수집하였다. 혈액을 4,500rpm에서 10분간 원심분리한 후 지방 분석을 위해 저장되었다. 무게를 측정한 후, 간과 부고환의 지방 세포를 수집하고, 포르말린으로 고정한 후 추가적인 분석을 위해 액체 질소에서 얼렸다.
분변 샘플은 자연 배변으로부터 채취하였다.
1.3 생화학적 검사
크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 사용하여 혈장 지방단백질 콜레스테롤을 분석하였다.
또한, 생화학자동분석기(7020, HITACHI)를 이용하여 트리글리세라이드(triglyceride; TG, mg/dL), 총콜레스테롤(total cholesterol; T.C, mg/dL), 글루코오즈(glucose, mg/dL), 인슐린(Insulin, ng/mL)을 측정하였다.
1.4 miRNA 마이크로어레이 발현 분석
분변의 총 RNA는 분변 키트(Power Microbiome RNA Isolation Kit, MoBio)를 이용하여 추출하였다.
혈액과 분변으로부터 추출된 총 RNA의 순도는 spectrophotometer(ND-1000, NanoDrop)을 이용하여 분석하였으며, 무결성(integrity)은 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto)를 이용하여 분석하였다.
총 RNA 745ng을 Affymetrix Genechip miRNA 4.0 Array 및 Genechip Fluidics Station 450(Affymetrix, Santa Clara)를 이용하여 분석하였다.
2. 실험 결과
2.1 포도씨 가루의 체중, 장기 무게 및 혈중 콜레스테롤 농도에의 영향
고지방식이(HFrd)와 고지방식이+5%포도씨가루 식이를 8주간 섭취한 실험쥐의 몸무게, 식이섭취량, 지방조직 무게, 혈중 당, 지질, 콜레스테롤 변화를 표 2에 나타내었다.
HFrD HFrD + 5%ChrSD
Body weight gain 12.4 ± 0.76 6.37 ± 0.49
Food intake 2.94 ± 0.33 2.82 ± 0.33
Liver weight 1.01 ± 0.03 0.96 ± 0.03
Adipose tissue weight 1.34 ± 0.09 0.49 ± 0.06
Blood Glucose 203 ± 18.6 224 ± 20.6
Triglyceride 93.9 ± 8.88 74.3 ± 3.55
HDL 78.7 ± 2.88 71 ± 4.12
LDL 17 ± 0.69 14 ± 1.06
Total-Cholesterol 136 ± 5.61 115 ± 7.30
표 2에서, 고지방식이를 5중량% 포도씨 가루와 함께 8주간 섭취한 실험쥐 군은 포도씨 가루를 섭취하지 않은 군에 비하여 49% 더 적은 체중과 5% 더 적은 간 무게를 나타내었다. 또한, 5중량% 포도씨 가루는 실험쥐의 지방 세포의 무게도 63% 감소하도록 하였으며, 지질과 콜레스테롤 수치도 감소한 것으로 나타났다.
2.2 분변 miRNA 마이크로어레이 발현 분석
두 군의 실험쥐의 분변으로부터 채취한 miRNA의 발현을 miRNA 발현 마이크로어레이 분석을 이용하여 분석하였다. miRNA의 발현을 통계학적으로 분석하여 대조군에 비하여 5% ChrSd 식이에서 통계학적으로 유의하게 1.5배 이상 차이를 나타내는(|FC|≥1.5, FC: fold change) miRNA를 결정하였다. 아래의 표 3에 나타낸 것과 같은, 총 82개의 miRNA가 결정되었다.
Figure 112018082288023-pat00001
2.3 혈액 miRNA 마이크로어레이 발현 분석
혈액으로부터 채취된 miRNA에 대한 miRNA 마이크로어레이 분석 결과도 비교하여 분석하였다.
마찬가지로 miRNA의 발현을 분석하여 대조군에 비하여 5% ChrSd 식이에서 통계학적으로 유의하게 1.5배 이상 차이를 나타내는 miRNA를 결정하였다. 아래의 표 4에 나타낸 것과 같은, 총 53개의 miRNA가 결정되었다.
Figure 112018082288023-pat00002
2.4 miRNA 발현과 대사성 비만 생리학적 바이오마커 사이의 상관관계 분석
분변과 혈액 내의 miRNA 결과가 대사성 비만 생리학적 바이오마커와의 상관관계가 있는지를 결정하기 위해, 발현된 miRNA와 7가지 대사성 비만의 생물학적 바이오마커들(체중, 간 무게, 지방 세포 무게, 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤 및 HDL) 사이의 상관관계를 분석하였다.
그 결과, 분변으로부터 추출된 miRNA 중 23개가 대사성 비만 바이오마커와 상관관계가 있으며(표 5 및 표 6), 혈액으로부터 추출된 miRNA 중 31개가 대사성 비만 마커와 상관관계가 있는 것으로(표 7 및 표 8) 확인되었다(p<0.05 또는 p<0.01).
대사성 비만 바이오마커와 상관관계가 있는 miRNA 중 분변과 혈액 모두에서 검출된 miRNA는 miR-129-5p가 분변과 혈액 모두에서 발현된다는 것을 확인하였다.
Figure 112018082288023-pat00003
상기 표에서,
* : Significantly (p<0.05) different from HFrD
# : Significantly (p<0.01) different from HFrD
BW: body weight gain
HDL: high density lipoprotein
Figure 112018082288023-pat00004
Figure 112018082288023-pat00005
Figure 112018082288023-pat00006
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 다음의 단계를 포함하는 대사성 비만의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 대상자의 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을 기준치와 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 비교 결과로부터 대사성 비만의 진단을 위한 정보를 제공하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 대사성 비만의 진단을 위한 정보는 대사성 비만의 발병을 진단하거나, 발병 위험성을 예측하거나, 발병 후 경과를 판단하기 위한 정보인 것을 특징으로 하는, 대사성 비만의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 기준치가 건강한 대상자의 miR-129-5p 발현 수준인 것을 특징으로 하는, 대사성 비만의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 miR-129-5p의 발현 수준이 기준치보다 낮으면 대사성 비만에 해당하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 대사성 비만의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는 대사성 비만의 모니터링 방법:
    (a) 대상자의 분변으로부터 miR-129-5p의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 발현 수준을 대상자의 이전의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 비교 결과로부터 대사성 비만의 상태를 모니터링 하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 miR-129-5p의 발현 수준이 이전의 발현 수준보다 높으면 대사성 비만이 완화된 것으로 판단하고, 이전의 발현 수준보다 낮으면 대사성 비만이 악화된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 대사성 비만의 모니터링 방법.
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