KR102132276B1 - Mutated dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 유전자 및 이에 의하여 코딩되는 돌연변이 디하이드린 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질을 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증가시켜 환경 스트레스 저항성 작물 개발, 분자생물학 및 유전자 조작기법을 이용한 미생물 및 식물체의 형질 개선에 관한 기초 연구를 비롯한 식물생명공학 분야 전반에 널리 활용될 수 있다.The present invention is an arctic point herb ( Cerastium) arcticum ) and a mutant dihydrin protein encoded thereby. In addition, the present invention relates to a composition for enhancing abiotic stress tolerance, comprising the mutant dihydrin protein derived from the arctic point nadonace. The present invention significantly increases resistance to abiotic stress by regulating the dimerization of CaDHN, an intrinsically disordered protein, to develop environmental stress-resistant crops, and to transform microorganisms and plants using molecular biology and genetic manipulation techniques. It can be widely used throughout plant biotechnology, including basic research on improvement.

Description

북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질 및 이의 용도{Mutated dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof}Mutant dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof}

본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 유전자 및 이에 의하여 코딩되는 돌연변이 디하이드린 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 단백질을 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.The present invention is an arctic point herb ( Cerastium) arcticum ) and a mutant dihydrin protein encoded thereby. In addition, the present invention relates to a composition for enhancing abiotic stress tolerance, comprising the mutant dihydrin protein derived from the arctic point nadonace.

식물은 다양한 생물적 및 비생물적 스트레스에 항상 노출되는데, 특히 토양의 수분 부족, 높은 염분 농도, 냉해, 중금속, 열충격 및 오존과 같은 비생물적 스트레스(abiotic stress)는 육상식물의 생장과 발달을 저해하며 품질을 감소시키는 주요 요인이 된다고 알려져 있다. 지금까지 이러한 비생물적 스트레스에 대한 기능연구가 이뤄져 왔지만, 냉해(저온) 스트레스를 비롯한 비생물학적 스트레스에 대한 내성이나 민감성에 관여하는 스트레스 관련 유전자들의 생물학적 기능들에 대한 지식은 여전히 부족한 상태이다. 이에, 식물의 저항성을 증가시키고 작물의 수확량을 증진시키기 위한 연구가 중요한 과제가 되고 있다. Plants are always exposed to a variety of biological and abiotic stresses, especially abiotic stresses such as lack of moisture in the soil, high salinity levels, cold seas, heavy metals, thermal shocks, and ozone, which contribute to the growth and development of terrestrial plants. It is known to be a major factor in inhibiting and reducing quality. Functional studies on abiotic stress have been conducted so far, but knowledge of the biological functions of stress-related genes involved in resistance or sensitivity to abiotic stress, including cold sea (cold) stress, is still lacking. Accordingly, research to increase the resistance of plants and to improve crop yields has become an important task.

한편, 식물은 비생물적 스트레스에 직면했을 때 특이적이고 독특한 스트레스 반응을 활성화시킨다. 예를 들어, 저온 환경에서 수분이 충분하지 않을 때 식물은 LEA(Late embryogenesis Abundant) 단백질을 만드는 유전자를 활성화시켜 자신을 방어한다. 상기 LEA 유전자는 비생물적 스트레스에 의해 유의하게 유도되며, 과발현시 형질전환 식물의 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. LEA 단백질들의 공통적인 특징은 높은 글리신(glycine) 함량 및 높은 친수성에 따라 본질적으로 내재적 비정형(intrinsically disordered) 단백질 구조를 갖는 것이며, 서열 유사성에 따라 LEAⅠ, LEAⅡ 및 LEAⅢ의 세 가지 그룹으로 분류된다. 또한, 디하이드린 단백질 DHN(dehydrins)은 다양한 식물, 조류 및 시아노박테리아에 존재하는 9~200kDa의 친수성, 열안정성 단백질로, 글리신 잔기가 매우 풍부하고 시스테인(cysteine)과 트립토판(tryptophan)은 결핍되어 있거나 또는 극소량 존재한다. 디하이드린 단백질의 구조적 특징은 K-, S- 및 Y- 세그먼트로 명명된 고도로 보존된 서열 모티프의 존재이다. 상기 고도로 보존된 도메인 외에도 디하이드린 단백질은 Y-, S- 및 K- 세그먼트 사이에 위치한 φ- 세그먼트를 가지며, φ- 세그먼트의 서열 및 길이는 다른 세그먼트들과 비교하여 매우 불규칙하다는 특징이 있다.Meanwhile, plants activate specific and unique stress responses when faced with abiotic stress. For example, when there is insufficient moisture in a cold environment, plants defend themselves by activating genes that make the Late embryogenesis Abundant (LEA) protein. The LEA gene is significantly induced by abiotic stress and is known to increase resistance of transgenic plants to abiotic stress when overexpressed. A common feature of LEA proteins is that they have an intrinsically disordered protein structure according to high glycine content and high hydrophilicity, and are classified into three groups according to sequence similarity: LEAI, LEAII and LEAIII. In addition, the dihydrin protein DHN (dehydrins) is a hydrophilic, thermostable protein of 9-200 kDa present in various plants, algae, and cyanobacteria. It is very rich in glycine residues and lacks cysteine and tryptophan. Or very small amount. The structural feature of the dihydrin protein is the presence of highly conserved sequence motifs named K-, S- and Y- segments. In addition to the highly conserved domain, the dihydrin protein has a φ-segment located between the Y-, S- and K-segments, and the sequence and length of the φ-segment are very irregular compared to other segments.

식물 중에서도, 극지 식물은 혹독한 환경 조건에도 적응할 수 있게 해주는 독특한 생리학적 메커니즘을 가지고 있다. 북극점나도나물(Cerastium arcticum , Arctic mouse-ear chickweed 또는 Arctic mouse-ear)은 북극 지방의 툰드라에서 번성하는 식물이다. 북극점나도나물 유래 스트레스 반응성 디하이드린 유전자(dehydrin gene)인 CaDHN(Arctic Cerastium arcticum Lange)은 SK5 타입(type)에 속하는 디하이드린 유전자로, 대부분의 디하이드린 단백질에 시스테인 잔기가 없는 것과 달리 특이하게도 시스테인 잔기를 단일 잔기로 포함한다.Among plants, polar plants have unique physiological mechanisms that enable them to adapt to harsh environmental conditions. Arctic Point Cannabis ( Cerastium arcticum , Arctic mouse-ear chickweed or Arctic mouse-ear ) is a plant that thrives in tundra in the Arctic. CaDHN (Arctic), a stress-reactive dehydrin gene derived from the North Pole sprouts Cerastium arcticum Lange) is a dihydrin gene belonging to the SK 5 type, and unlike most dihydrin proteins do not have a cysteine residue, it specifically includes a cysteine residue as a single residue.

Graether SP, Boddington KF. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family. Front Plant Sci. 2014;5. Graether SP, Boddington KF. Disorder and function: a review of the dehydrin protein family. Front Plant Sci. 2014;5. Cuevas-Velazquez CL, Rendon-Luna DF, Covarrubias AA. Dissecting the cryoprotection mechanisms for dehydrins. Front Plant Sci. 2014;5. Cuevas-Velazquez CL, Rendon-Luna DF, Covarrubias AA. Dissecting the cryoprotection mechanisms for dehydrins. Front Plant Sci. 2014;5. Kovacs D, Kalmar E, Torok Z, Tompa P. Chaperone activity of ERD10 and ERD14, two disordered stress-related plant proteins. Plant Physiol. 2008;147(1):381-90. Kovacs D, Kalmar E, Torok Z, Tompa P. Chaperone activity of ERD10 and ERD14, two disordered stress-related plant proteins. Plant Physiol. 2008;147(1):381-90.

본 발명자들은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 재조합 CaDHN이 단량체(monomer) 및 이량체(dimer)의 두 가지 형태로 공존함을 확인하고, 상기 이합체화(dimerization)에 주목하여 저온 스트레스 등의 비생물적 스트레스에 대한 내성에 관여하는 메커니즘을 규명하고자 노력하였다. 그 결과, CaDHN의 이합체화(dimerization)는 시스테인 분자 간의 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)의 결과임을 확인하고, CaDHN의 단일 시스테인 잔기가 CaDHN의 이합체화를 조절하며 비생물적 스트레스에 대한 내성 강화의 타겟이 될 수 있음을 확인하였다. The inventors of the North Pole ( Cerastium) arcticum ) confirms that the recombinant CaDHN coexists in two forms, a monomer and a dimer, and pays attention to the dimerization to participate in resistance to abiotic stress such as low temperature stress. I tried to identify the mechanism. As a result, it is confirmed that dimerization of CaDHN is a result of intermolecular disulfide bonds between cysteine molecules, and that a single cysteine residue of CaDHN regulates dimerization of CaDHN and enhances resistance to abiotic stress. It was confirmed that it can be a target.

따라서, 본 발명의 목적은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.Therefore, the object of the present invention is the Arctic point sprouts ( Cerastium arcticum ) to provide a mutant dihydrin peptide and a polynucleotide encoding the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing abiotic stress resistance comprising the peptide or polynucleotide.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for enhancing abiotic stress tolerance, comprising introducing the polynucleotide into a host cell.

본 발명의 또 다른 목적은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 야생형 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물, 단백질 항상성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is the North Pole sprouts ( Cerastium arcticum ) to provide a composition for promoting high temperature stress resistance, and a composition for enhancing protein homeostasis, comprising a wild-type dihydrin peptide or a polynucleotide encoding the same.

본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. The present invention is an arctic point herb ( Cerastium) arcticum ), and a polynucleotide encoding the mutant dihydrin peptide.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector comprising the polynucleotide.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포를 제공한다.In addition, the present invention provides a host cell having enhanced abiotic stress resistance transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for enhancing abiotic stress resistance comprising the peptide or polynucleotide.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for enhancing abiotic stress resistance, comprising introducing the polynucleotide into a host cell.

또한, 본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 야생형 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is an arctic point sprout ( Cerastium) arcticum ) It provides a composition for promoting high temperature stress resistance comprising a wild-type dihydrin peptide or a polynucleotide encoding the same.

또한, 본 발명은 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 야생형 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단백질 항상성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is an arctic point sprout ( Cerastium) arcticum ) provides a composition for enhancing protein homeostasis comprising a wild-type dihydrin peptide or a polynucleotide encoding the same.

본 발명은 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증가시켜 환경 스트레스 저항성 작물 개발, 분자생물학 및 유전자 조작기법을 이용한 미생물 및 식물체의 형질 개선에 관한 기초 연구를 비롯한 식물생명공학 분야 전반에 널리 활용될 수 있다.The present invention significantly increases resistance to abiotic stress by regulating the dimerization of CaDHN, an intrinsically disordered protein, to develop environmental stress-resistant crops, and to transform microorganisms and plants using molecular biology and genetic manipulation techniques. It can be widely used throughout plant biotechnology, including basic research on improvement.

도 1은 본 발명의 CaDHN의 보존된 부위를 모식화한 것으로, CaDHN의 독특한 단일 시스테인 잔기를 Cys143으로 표시하였다. K: K- 세그먼트(segment), S: S- 세그먼트, Φ: Φ- 세그먼트이다.
도 2는 야생형 CaDHN 및 돌연변이 C143A 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다. WT: 야생형 CaDHN, M: 돌연변이 C143A 단백질, β-ME: 10mM β-mercaptoethanol 처리, BC: TEV 단백질 분해효소(protease)에 의한 N-말단 태그의 절단 전, AC: N-말단 태그 절단 후.
도 3은 정제된 CaDHN의 이황화결합을 통한 이합체화(dimerization) 여부를 확인하기 위한 야생형 CaDHN 및 돌연변이 C143A 단백질의 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 A는 야생형 CaDHN 및 C143A을 다양한 농도의 DTT 및 CuSO4로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 B는 야생형 CaDHN을 DTT(0-20mM)로 처리한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 GFP(green fluorescent protein) 단백질 리폴딩(refolding)에 대한 CaDHN의 샤페론(chaperone) 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 산-변성된 GFP는 야생형 CaDHN(주황색) 또는 돌연변이 C143A(파란색)를 포함하는 재생 버퍼에서 리폴딩되었다. 10mM DTT로 처리된 야생형 CaDHN(녹색) 역시 샤페론 활성 분석에 사용되었다. GFP 단백질의 자발적인 리폴딩(검정색)을 대조군으로 사용하였다.
도 5는 금속 이온 친화성 크로마토그래피(metal ion affinity chromatography)(도 5의 A) 및 SDS-PAGE(도 5의 B)를 수행하여 야생형 CaDHN 및 돌연변이 C143A의 금속결합능을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 산화 스트레스에 대한 형질전환 효모 세포의 내성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 빈 벡터(EV)로 형질전환된 효모 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 7 및 도 8은 저온 및 고온 스트레스에 대한 형질전환 효모 세포의 내성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 빈 벡터(EV)로 형질전환된 효모 세포를 대조군으로 사용하였다.
도 9는 형질전환 효모 세포의 금속 이온 항상성 실험 결과를 나타낸 도이다. 빈 벡터(EV)로 형질전환된 효모 세포를 대조군으로 사용하였다.1 is a schematic diagram of a conserved site of the CaDHN of the present invention, and a unique single cysteine residue of CaDHN is represented by Cys143. K: K-segment, S: S-segment, Φ: Φ- segment.
2 is a diagram showing the results of SDS-PAGE of wild-type CaDHN and mutant C143A proteins. WT: wild-type CaDHN, M: mutant C143A protein, β-ME: 10 mM β-mercaptoethanol treatment, BC: before cleavage of the N-terminal tag by TEV protease, AC: after cleavage of the N-terminal tag.
3 is a diagram showing the results of electrophoresis of wild-type CaDHN and mutant C143A proteins to confirm whether dimerization through purified disulfide bonds of CaDHN occurs. 3A is a diagram showing the results of treatment of wild-type CaDHN and C143A with various concentrations of DTT and CuSO 4 . FIG. 3B is a diagram showing the results of treating wild-type CaDHN with DTT (0-20mM).
4 is a view showing the results of analyzing the chaperone (chaperone) activity of CaDHN against green fluorescent protein (GFP) protein refolding. The acid-modified GFP was refolded in regeneration buffer containing wild type CaDHN (orange) or mutant C143A (blue). Wild-type CaDHN (green) treated with 10 mM DTT was also used for the analysis of chaperone activity. Spontaneous refolding of GFP protein (black) was used as a control.
5 is a view showing the results of analyzing the metal binding capacity of wild-type CaDHN and mutant C143A by performing metal ion affinity chromatography (A in FIG. 5) and SDS-PAGE (B in FIG. 5). .
6 is a diagram showing the results of analyzing the resistance of transformed yeast cells to oxidative stress. Yeast cells transformed with an empty vector (EV) were used as a control.
7 and 8 are diagrams showing the results of analyzing the resistance of transformed yeast cells to cold and hot stress. Yeast cells transformed with an empty vector (EV) were used as a control.
9 is a diagram showing the results of a metal ion homeostasis experiment of transformed yeast cells. Yeast cells transformed with an empty vector (EV) were used as a control.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 북극점나도나물 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.The present invention provides a polynucleotide encoding a mutant dihydrin peptide derived from an arctic agonist and the same.

디하이드린(dehydrin, DHN)이란 저온 또는 가뭄 스트레스 조건 하의 식물에서 발현하는 단백질 군으로, 친수성을 띄며, 내열 활성을 갖는다.Dehydrin (DHN) is a group of proteins expressed in plants under conditions of low temperature or drought stress, has hydrophilicity, and has heat resistance.

본 발명의 돌연변이 디하이드린 펩타이드는 한국 다산 북극 기지(Dasan Korean Arctic Research Station)로부터 수득한 북극점나도나물(세라스티움 아크티큠; Cerastium arcticum L.; Caryophyllaceae)로부터 유래한 디하이드린 펩타이드에 돌연변이를 유발시킨 것으로, 야생형 디하이드린 펩타이드 CaDHN의 143번째 아미노산인 시스테인(cysteine)이 알라닌(alanine)으로 치환된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.The mutant dihydrin peptide of the present invention is an arctic point-nadenum ( Cerastium ; Cerastium ) obtained from Dasan Korean Arctic Research Station. arcticum L.; Caryophyllaceae) derived from mutations in the dihydrin peptide, characterized in that the 143 th amino acid of the wild type dihydrin peptide CaDHN (cysteine) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 substituted with alanine (alanine) do.

또한, 본 발명의 야생형 디하이드린 펩타이드는 돌연변이를 유발시키지 않은 상기 북극점나도나물 유래 펩타이드로서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 한다.In addition, the wild-type dihydrin peptide of the present invention is a peptide derived from the arctic point-nadonum that does not cause mutation, and is characterized by comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.

본 발명에서, 용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다. In the present invention, the term “polynucleotide” is a deoxyribonucleotide or a polymer of ribonucleotides present in single-stranded or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom, and includes analogs of natural polynucleotides unless otherwise specified.

상기 돌연변이 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 야생형 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 사용한 야생형 디하이드린 펩타이드, 돌연변이 디하이드린 펩타이드의 아미노산 서열 및 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 하기 표 1에 나타내었다.The polynucleotide encoding the mutant dihydrin peptide may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. In addition, the polynucleotide encoding the wild-type dihydrin peptide may preferably consist of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:4. The amino acid sequences of the wild-type dihydrin peptides and mutant dihydrin peptides used in the present invention and the polynucleotide sequences encoding each are shown in Table 1 below.

서열order 서열번호Sequence number 돌연변이 Mutation
디하이드린Dihydrin 펩타이드 Peptide
(( C143AC143A , M), M) MSNLHPTGGETETTNTDRGLFGFGKKTETPVATPTEPPHKPTLTEKLHRSGSSSSSSSDEEVIENGAKIRKPRRKGIAGKIKDKLPGGHKDEYETATPIAAGEYYHQEPNKHASDRGVAEKIKEKLPGGHKDEYGTAPTGDH A HQEQNKHASEMGAAEKIKDKLPGGQKDEYGTAPTGDHYHRDQNKHTAAGNTHYPEGNKGFVGNVKDKLPGNQTDVNHHQQQQQHPAVHVSQQAVQEPHHEKKGLLDNIKDKMPGGHKDDADKAHKGYMSNLHPTGGETETTNTDRGLFGFGKKTETPVATPTEPPHKPTLTEKLHRSGSSSSSSSDEEVIENGAKIRKPRRKGIAGKIKDKLPGGHKDEYETATPIAAGEYYHQEPNKHASDRGVAEKIKEKLPGGHKDEYGTAPTGDH A HQEQNKHASEMGAAEKIKDKLPGGQKDEYGTAPTGDHYHRDQNKHTAAGNTHYPEGNKGFVGNVKDKLPGNQTDVNHHQQQQQHPAVHVSQQAVQEPHHEKKGLLDNIKDKMPGGHKDDADKAHKGY 1One 돌연변이 Mutation
디하이드린유전자Dihydrin gene ATGTCGAACTTACACCCAACCGGAGGCGAAACCGAGACCACTAATACTGATAGAGGCCTGTTTGGCTTCGGTAAGAAGACGGAAACCCCCGTCGCCACCCCGACTGAGCCACCACACAAGCCTACTCTCACGGAGAAGCTTCACCGCTCGGGCAGTAGTAGCTCTAGCTCGTCAGATGAGGAGGTAATAGAAAATGGTGCGAAGATTAGGAAGCCGAGGAGGAAGGGAATAGCAGGGAAAATCAAGGACAAGCTTCCGGGTGGTCACAAGGATGAATACGAGACTGCGACTCCTATTGCTGCGGGTGAGTACTATCACCAGGAGCCGAACAAGCACGCTTCAGACAGGGGAGTAGCGGAGAAGATCAAGGAAAAGTTACCAGGCGGTCACAAGGATGAATACGGGACAGCGCCTACCGGTGACCAC GCC CACCAGGAGCAGAACAAGCACGCTTCTGAGATGGGTGCGGCGGAGAAAATCAAGGACAAGTTGCCAGGCGGACAGAAGGATGAATACGGGACTGCGCCTACTGGCGACCACTACCACCGGGACCAGAACAAGCATACTGCGGCAGGAAACACGCATTACCCCGAGGGAAACAAGGGGTTTGTTGGCAATGTTAAGGATAAATTGCCGGGAAATCAGACAGACGTGAACCATCACCAGCAGCAGCAACAGCACCCGGCTGTTCATGTTTCACAACAGGCGGTCCAGGAGCCGCATCATGAGAAGAAAGGGCTCTTAGACAACATTAAGGACAAGATGCCCGGCGGCCACAAGGATGATGCTGATAAAGCTCACAAGGGTTACTAAATGTCGAACTTACACCCAACCGGAGGCGAAACCGAGACCACTAATACTGATAGAGGCCTGTTTGGCTTCGGTAAGAAGACGGAAACCCCCGTCGCCACCCCGACTGAGCCACCACACAAGCCTACTCTCACGGAGAAGCTTCACCGCTCGGGCAGTAGTAGCTCTAGCTCGTCAGATGAGGAGGTAATAGAAAATGGTGCGAAGATTAGGAAGCCGAGGAGGAAGGGAATAGCAGGGAAAATCAAGGACAAGCTTCCGGGTGGTCACAAGGATGAATACGAGACTGCGACTCCTATTGCTGCGGGTGAGTACTATCACCAGGAGCCGAACAAGCACGCTTCAGACAGGGGAGTAGCGGAGAAGATCAAGGAAAAGTTACCAGGCGGTCACAAGGATGAATACGGGACAGCGCCTACCGGTGACCAC GCC CACCAGGAGCAGAACAAGCACGCTTCTGAGATGGGTGCGGCGGAGAAAATCAAGGACAAGTTGCCAGGCGGACAGAAGGATGAATACGGGACTGCGCCTACTGGCGACCACTACCACCGGGACCAGAACAAGCATACTGCGGCAGGAAACACGCATTACCCCGAGGGAAACAAGGGGTTTGTTGGCAATGTTAAGGATAAATTGCCGGGAAATCAGACAGACGTGAACCATCACCAGCAGCAGCAACAGCACCCGGCTGTTCATGTTTCACAACAGGCGGTCCAGGAGCCGCATCATGAGAAGAAAGGGCTCTTAGACAACATTAAGGACAAGATGCCCGGCGGCCACAAGGATGATGCTGATAAAGCTCACAAGGGTTACTAA 22 야생형 Wild type
디하이드린Dihydrin 펩타이드 Peptide
(( CaDHNCaDHN , WT), WT) MSNLHPTGGETETTNTDRGLFGFGKKTETPVATPTEPPHKPTLTEKLHRSGSSSSSSSDEEVIENGAKIRKPRRKGIAGKIKDKLPGGHKDEYETATPIAAGEYYHQEPNKHASDRGVAEKIKEKLPGGHKDEYGTAPTGDH C HQEQNKHASEMGAAEKIKDKLPGGQKDEYGTAPTGDHYHRDQNKHTAAGNTHYPEGNKGFVGNVKDKLPGNQTDVNHHQQQQQHPAVHVSQQAVQEPHHEKKGLLDNIKDKMPGGHKDDADKAHKGYMSNLHPTGGETETTNTDRGLFGFGKKTETPVATPTEPPHKPTLTEKLHRSGSSSSSSSDEEVIENGAKIRKPRRKGIAGKIKDKLPGGHKDEYETATPIAAGEYYHQEPNKHASDRGVAEKIKEKLPGGHKDEYGTAPTGDH C HQEQNKHASEMGAAEKIKDKLPGGQKDEYGTAPTGDHYHRDQNKHTAAGNTHYPEGNKGFVGNVKDKLPGNQTDVNHHQQQQQHPAVHVSQQAVQEPHHEKKGLLDNIKDKMPGGHKDDADKAHKGY 33 야생형 Wild type
디하이드린Dihydrin 유전자 gene ATGTCGAACTTACACCCAACCGGAGGCGAAACCGAGACCACTAATACTGATAGAGGCCTGTTTGGCTTCGGTAAGAAGACGGAAACCCCCGTCGCCACCCCGACTGAGCCACCACACAAGCCTACTCTCACGGAGAAGCTTCACCGCTCGGGCAGTAGTAGCTCTAGCTCGTCAGATGAGGAGGTAATAGAAAATGGTGCGAAGATTAGGAAGCCGAGGAGGAAGGGAATAGCAGGGAAAATCAAGGACAAGCTTCCGGGTGGTCACAAGGATGAATACGAGACTGCGACTCCTATTGCTGCGGGTGAGTACTATCACCAGGAGCCGAACAAGCACGCTTCAGACAGGGGAGTAGCGGAGAAGATCAAGGAAAAGTTACCAGGCGGTCACAAGGATGAATACGGGACAGCGCCTACCGGTGACCAC TGC CACCAGGAGCAGAACAAGCACGCTTCTGAGATGGGTGCGGCGGAGAAAATCAAGGACAAGTTGCCAGGCGGACAGAAGGATGAATACGGGACTGCGCCTACTGGCGACCACTACCACCGGGACCAGAACAAGCATACTGCGGCAGGAAACACGCATTACCCCGAGGGAAACAAGGGGTTTGTTGGCAATGTTAAGGATAAATTGCCGGGAAATCAGACAGACGTGAACCATCACCAGCAGCAGCAACAGCACCCGGCTGTTCATGTTTCACAACAGGCGGTCCAGGAGCCGCATCATGAGAAGAAAGGGCTCTTAGACAACATTAAGGACAAGATGCCCGGCGGCCACAAGGATGATGCTGATAAAGCTCACAAGGGTTACTAAATGTCGAACTTACACCCAACCGGAGGCGAAACCGAGACCACTAATACTGATAGAGGCCTGTTTGGCTTCGGTAAGAAGACGGAAACCCCCGTCGCCACCCCGACTGAGCCACCACACAAGCCTACTCTCACGGAGAAGCTTCACCGCTCGGGCAGTAGTAGCTCTAGCTCGTCAGATGAGGAGGTAATAGAAAATGGTGCGAAGATTAGGAAGCCGAGGAGGAAGGGAATAGCAGGGAAAATCAAGGACAAGCTTCCGGGTGGTCACAAGGATGAATACGAGACTGCGACTCCTATTGCTGCGGGTGAGTACTATCACCAGGAGCCGAACAAGCACGCTTCAGACAGGGGAGTAGCGGAGAAGATCAAGGAAAAGTTACCAGGCGGTCACAAGGATGAATACGGGACAGCGCCTACCGGTGACCAC TGC CACCAGGAGCAGAACAAGCACGCTTCTGAGATGGGTGCGGCGGAGAAAATCAAGGACAAGTTGCCAGGCGGACAGAAGGATGAATACGGGACTGCGCCTACTGGCGACCACTACCACCGGGACCAGAACAAGCATACTGCGGCAGGAAACACGCATTACCCCGAGGGAAACAAGGGGTTTGTTGGCAATGTTAAGGATAAATTGCCGGGAAATCAGACAGACGTGAACCATCACCAGCAGCAGCAACAGCACCCGGCTGTTCATGTTTCACAACAGGCGGTCCAGGAGCCGCATCATGAGAAGAAAGGGCTCTTAGACAACATTAAGGACAAGATGCCCGGCGGCCACAAGGATGATGCTGATAAAGCTCACAAGGGTTACTAA 44

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다. 이는 당업계에 공지된 가혹 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.The polynucleotide includes not only the nucleotide sequence encoding the dihydrin peptide, but also a sequence complementary to the sequence. The complementary sequence includes not only perfectly complementary sequences, but also substantially complementary sequences. This means a sequence that can hybridize under stringent conditions known in the art, for example, with a polynucleotide sequence encoding the amino acid of SEQ ID NO: 1.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열인 것을 의미한다. 한편, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(gap)를 포함할 수 있다.In addition, the polynucleotide can be modified. Such modifications include addition, deletion or non-conservative substitutions or conservative substitutions of nucleotides. It is understood that the polynucleotide encoding the amino acid sequence also includes a nucleotide sequence showing substantial identity to the nucleotide sequence. The substantial identity is 70% or more when aligning the nucleotide sequence with any other sequence as much as possible and analyzing the aligned sequence using an algorithm commonly used in the art. It means that the base sequence is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more. . Meanwhile, a part of the polynucleotide sequence in the comparison region may include addition or deletion (gap) compared to a reference sequence (not including addition or deletion) for optimal alignment of the two sequences.

또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.In addition, the present invention provides a recombinant vector comprising a polynucleotide.

본 발명에서, 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드(cosmid) 벡터, 박테리오파지(bacteriophage) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들어, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 및 p426GPD 등), 파아지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들어, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. In the present invention, the term "vector" means a means for expressing a gene of interest in a host cell. For example, viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors and adeno-associated virus vectors. Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (e.g., pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14) , pGEX series, pET series, pUC19 and p426GPD, etc.), phage (e.g., λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (e.g., CMV, SV40, etc.) It is not limited thereto. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, "plasmid" and "vector" are sometimes used interchangeably in the context of the present invention.

상기 재조합 벡터에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 본 발명에서, 용어 "작동적으로 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.In the recombinant vector, the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be operably linked to a promoter. In the present invention, the term "operably linked" means that the promoter sequence and the gene sequence to initiate and mediate the transcription of the polynucleotide encoding the protein of interest of the present invention are functionally linked.

상기 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.The recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or for expression. The expression vector can be used in the art, conventional ones used to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms. The recombinant vector can be constructed through various methods known in the art.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고 원핵 세포를 숙주로 하는 경우, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, CMV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 가진다.The recombinant vector can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. For example, when the vector used is an expression vector and a prokaryotic cell is a host, a strong promoter (eg, pLλ promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.) capable of undergoing transcription, translation It is common to include a ribosome binding site for the initiation and transcriptional/detox termination sequences. When eukaryotic cells are used as a host, replication origins that operate on eukaryotic cells included in vectors include f1 replication origin, SV40 replication origin, pMB1 replication origin, adeno replication origin, AAV replication origin, CMV replication origin, and BBV replication origin. However, it is not limited thereto. In addition, a promoter derived from the genome of a mammalian cell (eg, a metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, Cytomegalovirus (CMV) promoter and HSV's tk promoter) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포를 제공한다. In addition, the present invention provides a host cell having enhanced abiotic stress resistance transformed with the recombinant vector.

상기 숙주 세포는 동물세포, 식물세포, 진균, 세균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 재조합 벡터로 효모를 형질전환시켜 비생물적 스트레스 내성이 증진됨을 확인하였다.The host cell may be selected from the group consisting of animal cells, plant cells, fungi, bacteria, and viruses, but is not limited thereto, and any host cell known in the art may be used. Prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus thuringiensis , Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium , Serratia marsense marcescens), and when an jangnaegyun and the like, and strains such as various Pseudomonas (Pseudomonas) species, transformed with a eukaryotic cell as a host cell, yeast (Saccharomyce cerevisiae ), insect cells, plant cells and animal cells, e.g. SP2/0, Chinese hamster ovary (CHO) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3 , RIN and MDCK cell lines can be used. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that yeast was transformed with the recombinant vector according to the present invention to improve abiotic stress resistance.

폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 삽입은, 당업계에 널리 알려진 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, 칼슘 클로라이드(CaCl2) 방법 또는 전기천공법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. E. coli 등의 미생물을 이용하는 경우 생산성은 동물세포 등에 비하여 높은 편이나, 당화(glycosylation) 문제로 인해 온전한(intact) Ig 형태의 항체 생산에는 적당하지 않고, Fab 및 Fv와 같은 항원 결합 단편의 생산에는 사용될 수 있다.For insertion of a polynucleotide or a recombinant vector containing the same into a host cell, methods well known in the art can be used. For the transport method, for example, when the host cell is a prokaryotic cell, a calcium chloride (CaCl 2 ) method or an electroporation method may be used, and when the host cell is a eukaryotic cell, a micro-injection method, a calcium phosphate precipitation method, and electricity Perforation, liposome-mediated transfection and gene bombardment may be used, but are not limited thereto. When using microorganisms such as E. coli , productivity is higher than that of animal cells, but due to glycosylation problems, it is not suitable for producing intact Ig type antibodies, and production of antigen-binding fragments such as Fab and Fv Can be used for

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.The method for selecting the transformed host cell can be easily performed according to a method well known in the art using a phenotype expressed by a selection label. For example, when the selection marker is a specific antibiotic resistance gene, the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.

또한, 본 발명은 상기 디하이드린 펩타이드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a composition for promoting abiotic stress resistance comprising the dihydrin peptide or a polynucleotide encoding the same.

상기 스트레스는 수분, 염분, 저온, 삼투압, 산화, 환원, 알코올 및 기아 (starvation)로 이루어지는 군으로부터 선택된 비생물적 스트레스일 수 있다.The stress may be abiotic stress selected from the group consisting of moisture, salt, low temperature, osmotic pressure, oxidation, reduction, alcohol and starvation.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.In the present specification, the term “plant (body)” is understood to mean not only a mature plant but also a plant cell, a plant tissue, and a plant seed capable of developing into a mature plant.

본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.Plants subject to transformation in the present invention include rice, wheat, barley, corn, soybeans, potatoes, wheat, red beans, oats and food crops including sorghum; Vegetable crops including Arabidopsis, Chinese cabbage, radish, pepper, strawberry, tomato, watermelon, cucumber, cabbage, melon, pumpkin, green onion, onion and carrot; Special crops including ginseng, tobacco, cotton, sesame, sugar cane, beet, perilla, peanut and rapeseed; Fruit trees, including apple trees, pears, date palms, peaches, spears, grapes, tangerines, persimmons, plums, apricots and bananas; Flowers including roses, gladiolus, gerbera, carnation, chrysanthemum, lily and tulip; And feed crops, including, but not limited to, ryegrass, red clover, orchardgrass, alpha alpha, tolpescu, and perennial lyegrass.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 디하이드린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 효모의 경우, H2O2 및 저온 스트레스 존재 하에서 야생형 CaDHN이 발현된 효모에 비해 비생물적 스트레스에 대한 증진된 내성을 나타냄을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, in the case of the yeast transformed with the polynucleotide encoding the dihydrin of the present invention, enhancement of abiotic stress compared to yeast expressing wild-type CaDHN in the presence of H 2 O 2 and cold stress It was confirmed that the exhibited resistance.

또한, 본 발명은 상기 디하이드린 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법을 제공한다. 상기 스트레스는 수분, 염분, 저온, 삼투압, 산화, 환원, 알코올 및 기아 (starvation)로 이루어지는 군으로부터 선택된 비생물적 스트레스일 수 있다. 상기 도입은 상기 디하이드린을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 전달할 수 있는 방법이면 그 방법을 제한하지 않으며, 그 예는 상기한 바와 같다.In addition, the present invention provides a method for enhancing abiotic stress resistance, comprising introducing a polynucleotide encoding the dihydrin peptide into a host cell. The stress may be abiotic stress selected from the group consisting of moisture, salt, low temperature, osmotic pressure, oxidation, reduction, alcohol and starvation. The introduction does not limit the method as long as it is a method capable of delivering the polynucleotide encoding the dihydrin to a host cell, and examples thereof are as described above.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 고온 스트레스 내성은 분자 샤페론(chaperone) 활성에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 야생형 CaDHN은 단백질 접힘(folding) 과정에 관한 샤페론 활성을 나타내고, 상기 샤페론 활성에는 야생형 CaDHN의 독특한 단일 시스테인 잔기에 의한 분자간 이황화결합을 통한 이합체화가 결정적인 역할을 수행함을 확인하였다.In addition, the present invention is a dihydrin peptide derived from Arctic point nadonum ( Cerastium arcticum ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or it provides a composition for promoting high temperature stress resistance comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 encoding the peptide. The high temperature stress resistance may be due to molecular chaperone activity, and in one embodiment of the present invention, wild type CaDHN exhibits chaperone activity related to protein folding, and the chaperone activity is a unique single cysteine of wild type CaDHN. It was confirmed that dimerization through intermolecular disulfide bonds by residues plays a decisive role.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단백질 항상성 증진용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention is a dihydrin peptide derived from Arctic point nadonum ( Cerastium arcticum ) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or it provides a composition for enhancing protein homeostasis comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 encoding the peptide.

본 명세서에서, 용어 “단백질 항상성(proteostasis)”이란 정상 단백질의 부족을 초래하거나, 비정상적 단백질을 축적시킴으로써 독성을 증가시키는 단백질의 오폴딩(misfolding) 등을 억제하여 외적 및 내적 환경의 변화에도 불구하고 생리적 상태를 일정하게 유지하는 조절능을 의미한다.In the present specification, the term “proteostasis” results in a lack of normal proteins, or suppresses misfolding of proteins that increase toxicity by accumulating abnormal proteins, and thus despite changes in external and internal environments. It means the regulating ability to keep the physiological state constant.

상기 조성물은 오폴딩된 단백질(misfolded proteins)의 축적 또는 단백질 항상성 장애와 관계된 질병에 사용할 수 있는 등 전반적인 단백질 품질제어(protein quality control) 조절에 활용할 수 있다. 용어 “단백질 품질제어(Protein Quality Control)”란 생물체가 외부 스트레스로 인해서 변성된 단백질을 제거하거나 원상태로 돌리는 메커니즘을 의미한다. 상기 단백질 항상성은 분자 샤페론(chaperone) 활성에 의한 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 산-변성된 GFP를 사용한 실험 결과, 야생형 CaDHN은 열 변성에 대한 보호 효과를 가질 뿐만 아니라 변성된 단백질의 리폴딩을 가능하게 함을 확인하였다.The composition can be used to control overall protein quality control, such as accumulation of misfolded proteins or use in diseases associated with protein homeostasis disorders. The term “Protein Quality Control” refers to the mechanism by which organisms remove or denature proteins denatured by external stress. The protein homeostasis may be due to molecular chaperone activity, and in one embodiment of the present invention, as a result of experiments using acid-modified GFP, wild-type CaDHN not only has a protective effect against thermal denaturation, but also of denatured proteins. It was confirmed that refolding is possible.

따라서, 본 발명은 CaDHN에 존재하는 독특한 단일 시스테인 잔기가 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 극지방의 극한 환경에 적응하기 위한 방어 시스템을 구축하고, 이를 통해 비생물적 스트레스에 대한 내성을 강화시킴을 확인한 것에 가장 큰 특징이 있다. Accordingly, the present invention establishes a defense system for adapting to extreme environments in the polar regions by controlling the dimerization of CaDHN, a unique single cysteine residue present in CaDHN, which is an intrinsically disordered protein, through which abiotic stress The biggest characteristic is that it is confirmed that it strengthens resistance to.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 모든 실험은 최소 3회 독립적으로 수행하였으며, 결과는 평균 및 표준편차로 나타내었다. 스포팅(spotting) 분석은 동일한 조건하에서 독립적으로 최소 2회 실시하였다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples. All experiments were performed independently at least 3 times, and the results were expressed as mean and standard deviation. Spotting analysis was conducted at least twice independently under the same conditions.

실시예 1. CaDHN 유전자의 클로닝 및 분석Example 1. Cloning and analysis of CaDHN gene

한국 다산 북극 기지(Dasan Korean Arctic Research Station)의 스발바르 제도의 Brogger-Halvoya(N75 55″, E11 54″)로부터 C. arcticum L.(Caryophyllaceae)를 수득하였다. 총 RNA는 RNeasy Plant Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 C. arcticum의 잎으로부터 분리하였다. cDNA 프로브는 RT-PCR(reverse transcription- PCR) 프리믹스 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 합성하였다. CaDHN 코딩부위는 PCR로 cDNA로부터 증폭하였고, PCR 산물은 정제 후 pET-30a(+)(Novagen, USA) 벡터 EcoRI 및 XhoI 제한효소 부위에 삽입하였다. TEV 단백질 분해효소 인식 서열(TEV protease recognition sequence)은 CaDHN 유전자 앞에 삽입하였다. 본 발명에서 사용한 모든 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다(F: 정방향, R: 역방향). C. arcticum L. ( Caryophyllaceae ) was obtained from Brogger-Halvoya (N75 55″, E11 54″) of Svalbard Islands at Dasan Korean Arctic Research Station in Korea. Total RNA was isolated from the leaves of C. arcticum using an RNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). The cDNA probe was synthesized using an RT-PCR (reverse transcription-PCR) premix kit (Bioneer, Daejeon, Korea). The CaDHN coding region was amplified from cDNA by PCR, and the PCR product was purified and inserted into the pET-30a(+)(Novagen, USA) vector EcoRI and XhoI restriction sites. The TEV protease recognition sequence was inserted before the CaDHN gene. All primer sequences used in the present invention are shown in Table 2 below (F: forward, R: reverse).

프라이머primer 서열order 제한효소 부위Restriction enzyme site 서열번호Sequence number pET30a/WT(F)pET30a/WT(F) CTGATATCGGATCC GAATTC ATGTCGAACTTACACCCAACCTGATATCGGATCC GAATTC ATGTCGAACTTACACCCAAC EcoRIEcoRI 55 pET30a/WT(R)pET30a/WT(R) TGGTGGTGGTGGTG CTCGAG TTAGTAACCCTTGTGAGCTTTGGTGGTGGTGGTG CTCGAG TTAGTAACCCTTGTGAGCTT XhoIXhoI 66 pGPD426/WT(F)pGPD426/WT(F) CCCCCGGGCTGCAG GAATTC ATGTCGAACTTACACCCAACCCCCCGGGCTGCAG GAATTC ATGTCGAACTTACACCCAAC EcoRIEcoRI 77 pGPD426/WT(R)pGPD426/WT(R) AACTAATTACATGA CTCGAG TTAGTAACCCTTGTGAGCTTAACTAATTACATGA CTCGAG TTAGTAACCCTTGTGAGCTT XhoIXhoI 88 C143A(F)C143A(F) CCTACCGGTGACCACGCCCACCAGGAGCAGCCTACCGGTGACCAC GCC CACCAGGAGCAG -- 99 C143A(R)C143A(R) CTGCTCCTGGTGGGCGTGGTCACCGGTAGGCTGCTCCTGGTG GGC GTGGTCACCGGTAGG -- 1010

한편, cDNA에 대하여 시퀀싱 반응을 통한 염기서열 확인 결과, 다른 디하이드린 단백질들과 달리, 북극점나도나물(세라스티움 아크티큠; Cerastium arcticum L.; Caryophyllaceae)로부터 유래 디하이드린 단백질을 코딩하는 유전자인 CaDHN은 특이하게 단일 시스테인 잔기(Cys143)를 가지는 것을 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 시스테인 잔기는 두번째와 세번째 K-세그먼트 사이의 φ-세그먼트에 위치하고, 구체적으로는 143번째 잔기임을 확인하였다.On the other hand, as a result of confirming the base sequence through the sequencing reaction with respect to cDNA, unlike other dihydrin proteins, the arctic point nadonamul ( Cerastium Arcticum; Cerastium) arcticum L.; It was confirmed that CaDHN, a gene encoding a dihydrin protein derived from Caryophyllaceae), has a single cysteine residue (Cys143). As shown in FIG. 1, the cysteine residue was located in the phi-segment between the second and third K-segments, and specifically, was confirmed to be the 143th residue.

실시예 2. CaDHN 단백질의 발현 및 정제Example 2. Expression and purification of CaDHN protein

CaDHN 단백질의 발현 및 정제를 위하여, 실시예 1에서 제작한 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. 세포 펠릿을 20mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl 및 10 mM imidazole에 부유시키고 초음파 처리(sonication)하여 파쇄하였다. 세포 잔해물 제거를 위해 상기 파쇄액을 원심분리 후, 상등액을 회수하여 Ni-NTA 친화 레진(Qiagen, Hilden, Germany)을 포함하는 컬럼에 중력을 이용하여 로딩시켰으며, 상기 컬럼은 리소자임이 없는 용해 버퍼로 선균질화(preequilibrate) 시켰다. 그 다음 컬럼을 세척 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 30 mM imidazole)로 세척하고, Ni-NTA 레진에 결합된 CaDHN 단백질을 용출 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 300 mM imidazole)를 이용하여 용출시켰다. 그 다음, TEV 단백질 분해효소를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 여과 버퍼(dialysis buffer)를 사용하여 용출된 CaDHN 단백질을 여과하였다. 절단되지 않은 CaDHN 및 N-말단 펩타이드 태그(tag)를 제거하기 위하여 니켈 어피니티 레진 크로마토그래피(Nickel-charged affinity chromatograpy)를 다시 한 번 수행하였다. CaDHN 단백질의 분자량은 29,509 Da(약 29.5 kDa)로 예측되었다.For the expression and purification of CaDHN protein, the recombinant plasmid prepared in Example 1 was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain. Cell pellets were suspended in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl and 10 mM imidazole and disrupted by sonication. After centrifugation of the lysate to remove cellular debris, the supernatant was recovered and loaded using gravity to a column containing Ni-NTA affinity resin (Qiagen, Hilden, Germany), and the column was lysine-free lysis buffer. It was pre- homogenized with (preequilibrate). Then, the column was washed with a washing buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 30 mM imidazole), and the CaDHN protein bound to the Ni-NTA resin was eluted with a buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200). Elution with mM NaCl, 300 mM imidazole). Then, TEV protease was added and the eluted CaDHN protein was filtered using a dialysis buffer at 4°C overnight. Nickel-charged affinity chromatograpy was performed once again to remove uncleaved CaDHN and N-terminal peptide tags. The molecular weight of the CaDHN protein was predicted to be 29,509 Da (about 29.5 kDa).

한편, PCR을 이용하여 CaDHN의 단일 시스테인(Cys143)에 위치 선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 유발시켜 시스테인이 알라닌(alanine)으로 치환된 C143A의 돌연변이 유전자를 얻었다. 그 후, 전술한 것과 동일한 방법으로 재조합 플라스미드를 제조하여 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다. E. coli BL21(DE3) 세포에 발현된 돌연변이 단백질에 대하여, 전술한 야생형(wild-type, WT) 단백질에서와 같이 단백질 정제를 수행하였다. Meanwhile, site-directed mutagenesis was induced in a single cysteine (Cys143) of CaDHN using PCR to obtain a C143A mutant gene in which cysteine was substituted with alanine. Then, a recombinant plasmid was prepared in the same manner as described above, and transformed into an E. coli BL21 (DE3) strain. For the mutant protein expressed in E. coli BL21 (DE3) cells, protein purification was performed as in the wild-type (WT) protein described above.

실시예 3. SDS-PAGEExample 3. SDS-PAGE

3-1. 야생형 CaDHN(WT) 및 돌연변이 C143A(M)의 이량체 형성 여부 확인3-1. Confirmation of Dimer Formation of Wild-type CaDHN(WT) and Mutant C143A(M)

실시예 2에서 정제한 야생형 CaDHN(WT)에 대하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 구체적으로, 단백질 정제 후 TEV 단백질 분해효소를 사용하여 재조합 CaDHN의 N-말단 태그를 제거하고, 야생형 CaDHN(WT) native gel 전기영동을 수행하였다. 전기영동은 10% 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤, 전기영동 버퍼(25mM Tris base, 19mM 글리신)를 사용하여 수행하였고, 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.SDS-PAGE was performed on the wild-type CaDHN (WT) purified in Example 2. Specifically, after protein purification, the N-terminal tag of recombinant CaDHN was removed using TEV protease, and wild-type CaDHN(WT) native gel electrophoresis was performed. Electrophoresis was performed using 10% polyacrylamide gel and electrophoresis buffer (25 mM Tris base, 19 mM glycine), and the gel electrophoresis was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250. . The results are shown in FIG. 2.

도 2에 나타낸 바와 같이(WT lane), SDS-PAGE 결과 두 종류의 단백질 밴드를 확인할 수 있었는데(-β-ME), 위쪽 밴드는 80kDa 정도로 환원제인 β-ME(β-mercaptoethanol) 처리 후 사라졌고, 반면 40kDa에 해당하는 아래쪽 밴드는 β-ME 처리 전후로 이동하지 않음을 확인하였다(+β-ME). 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 CaDHN의 시스테인 잔기가 용액 내의 단백질들 사이에서 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)를 형성했을 것으로 추측하였다.As shown in FIG. 2 (WT lane), two types of protein bands were identified as a result of SDS-PAGE (-β-ME), and the upper band disappeared after treatment with β-ME (β-mercaptoethanol), a reducing agent of about 80 kDa, On the other hand, it was confirmed that the lower band corresponding to 40 kDa did not move before and after β-ME treatment (+β-ME). Through the above results, the present inventors speculated that the cysteine residue of CaDHN formed an intermolecular disulfide bond between proteins in solution.

상기 추측을 구체적으로 확인하기 위해, 실시예 2에서 정제한 시스테인 대신에 알라닌 잔기가 도입된 돌연변이(mutant) C143A(M)에 대하여 SDS-PAGE를 수행하고, 마찬가지로 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이(M lane), 돌연변이 C143A는 비환원성 SDS-PAGE 젤에서 단일 단백질 밴드만이 나타났고, 80kDa의 단백질 밴드는 발견되지 않음을 확인하였다(-β-ME). 상기 결과를 통해, 아생형 CaDHN은 단 하나의 시스테인 잔기만을 가짐에 따라 단량체(monomer), 두 단량체사이에서 이황화결합을 갖는 이량체(dimer)의 두가지 형태로 공존함을 확인하였다.To specifically confirm the above speculation, SDS-PAGE was performed on mutant C143A(M) in which alanine residue was introduced instead of the cysteine purified in Example 2, and the results are similarly shown in FIG. 2. As shown in FIG. 2 (M lane), mutant C143A showed only a single protein band in the non-reducing SDS-PAGE gel, and it was confirmed that no protein band of 80 kDa was found (-β-ME). Through the above results, it was confirmed that the sub-type CaDHN coexists in two forms, a monomer and a dimer having a disulfide bond between the two monomers, as it has only one cysteine residue.

3-2. 야생형 3-2. Wild type CaDHNCaDHN (WT) 및 (WT) and C143A(M)의C143A(M) 이량체Dimer 형성에 대한 금속 이온의 영향 확인 Determine the effect of metal ions on formation

Citrus 디하이드린 단백질의 경우 히스티딘(histidine) 잔기와 금속 이온의 상호작용이 보고되어 있고(Hara M et al, J Exp Bot. 2005;56(420):2695-703), Opuntia streptacantha Lem 유래 OpsDHN1(SK3 타입) 디하이드린 단백질의 경우 이합체화가 보고되어 있다. 이 중 OpsDHN1의 경우, 첫번째와 두번째 K-세그먼트 사이에 있는 비보존된 세그먼트에 위치한 히스티딘-풍부 모티프(histidine-rich motif)가 이량체 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Hernandez-Sanchez IE et al, Front Plant Sci. 2014, 5:520; Rahman LN et al, Biochim Biophys Acta. 2013, 1828(3):967-80). 이에, 야생형 CaDHN(WT) 및 C143A(M)의 이합체 형성에 대하여 금속 이온이 미치는 영향을 조사하기 위해 실시예 3-1과 동일한 방법으로 SDS-PAGE를 수행하였으며, 분자간 이황화결합의 존재를 확인하기 위해, 두 단백질 모두에 서로 다른 농도의 DTT(dithiothreitol) 및 구리 이온(CuSO4)을 첨가하였다(DTT는 시스테인 잔기 사이의 이황화결합 형성을 방지하는 환원제로, 산화 구리 이온은 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화결합을 형성시키는 용도로 사용하였다). 그 결과를 도 3에 나타내었다.For Citrus dihydrin protein, the interaction of histidine residues and metal ions has been reported (Hara M et al, J Exp Bot. 2005;56(420):2695-703), OpsDHN1 from Opuntia streptacantha Lem ( In the case of SK 3 type) dihydrin protein, dimerization has been reported. Among them, in the case of OpsDHN1, a histidine-rich motif located in an unconserved segment between the first and second K-segments has been reported to play an important role in dimer formation (Hernandez-Sanchez IE et. al, Front Plant Sci. 2014, 5:520; Rahman LN et al, Biochim Biophys Acta. 2013, 1828(3):967-80). Thus, to investigate the effect of metal ions on the formation of dimers of wild-type CaDHN(WT) and C143A(M), SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 3-1 to confirm the presence of intermolecular disulfide bonds. To this end, different concentrations of dithiothreitol (DTT) and copper ions (CuSO 4 ) were added to both proteins (DTT is a reducing agent that prevents the formation of disulfide bonds between cysteine residues, and copper oxide ions are between two cysteine residues). It was used for the purpose of forming disulfide bonds). The results are shown in FIG. 3.

도 3에 나타낸 바와 같이, 야생형 CaDHN(WT)과 C143A(M)는 서로 다른 크기의 단백질 밴드로 나타남을 확인하였다. 구체적으로, WT의 경우 DTT 농도가 증가함에 따라 위쪽 밴드가 농도의존적으로 감소하였고, 8mM 이상에서는 단백질 대부분이 아래쪽 밴드로 이동하였음을 확인하였다(도 3의 B). 반면, 구리 이온의 농도가 증가하는 경우 아래쪽 밴드 일부가 위쪽 밴드로 이동하였고, 이를 통해 구리 이온은 야생형 CaDHN의 이황화결합 형성을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 3의 A, 좌측 패널).As shown in Figure 3, it was confirmed that the wild-type CaDHN (WT) and C143A (M) appear as protein bands of different sizes. Specifically, in the case of WT, as the DTT concentration increased, the upper band decreased in a concentration-dependent manner, and it was confirmed that most of the proteins migrated to the lower band above 8 mM (FIG. 3B). On the other hand, when the concentration of copper ions increased, some of the lower bands moved to the upper bands, and it was confirmed that copper ions can induce disulfide bond formation of wild-type CaDHN (A in FIG. 3, left panel).

반면, 시스테인 잔기가 없는 C143A의 경우, 구리 이온의 존재에도 불구하고 아래쪽 밴드는 이동하지 않았으며, 이를 통해 CaDHN은 이황화결합에 따라 이량체를 형성하는 것이지, 히스티딘과 같은 아미노산 잔기를 통해 단백질 분자 간에 구리 이온에 의해 매개되는 이량체 형성을 하는 것이 아님을 확인하였다(도 3의 A, 우측 패널). 또한, C143A는 DTT에 의한 밴드 이동도 전혀 없음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 야생형 CaDHN는 독특한 단일 시스테인 잔기가 매개하는 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)에 의한 이량체 형태로 존재함을 확인하였다.On the other hand, in the case of C143A without a cysteine residue, despite the presence of copper ions, the lower band did not move, and through this, CaDHN forms a dimer according to disulfide bonds, and between protein molecules through amino acid residues such as histidine It was confirmed that the dimer formation mediated by copper ions was not performed (A in FIG. 3, right panel). In addition, it was confirmed that C143A has no band shift due to DTT. Through the above results, it was confirmed that the wild type CaDHN exists in a dimer form by an intermolecular disulfide bond mediated by a unique single cysteine residue.

실시예 4. CaDHN의 샤페론 활성 분석Example 4. Analysis of the chaperone activity of CaDHN

CaDHN의 이합체화(dimerization)가 CaDHN의 샤페론 활성(chaperone activity)에 미치는 영향을 조사하기 위해, 산-변성(acid-denatured)된 GFP를 모델 기질로 사용하여 야생형 CaDHN(WT)과 C143A의 샤페론 활성을 측정하였다. 구체적으로, 약 100μM의 GFP(green fluorescent protein)를 120mM HCl에서 60분 동안 변성시켰다. 재생 버퍼(20mM Tris-Hcl, pH 8.0, 200mM NaCl)로의 100배 희석에 의해 자발적 리폴딩(refolding)이 개시되었다. 그 후, 3μM의 야생형 CaDHN(WT) 또는 C143A 단백질을 재생 버퍼 내 변성된 GFP에 첨가하여 GFP 리폴딩이 시작되었다. GFP 리폴딩은 20분 동안 모니터링하였다(400nm excitation, 510nm emissioin). 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.To investigate the effect of dimerization of CaDHN on the chaperone activity of CaDHN, acid-denatured GFP was used as a model substrate, and wild-type CaDHN(WT) and C143A chaperone activity Was measured. Specifically, about 100 μM of green fluorescent protein (GFP) was denatured in 120 mM HCl for 60 minutes. Spontaneous refolding was initiated by 100-fold dilution with regeneration buffer (20 mM Tris-Hcl, pH 8.0, 200 mM NaCl). GFP refolding was then initiated by adding 3 μM of wild-type CaDHN (WT) or C143A protein to the denatured GFP in regeneration buffer. GFP refolding was monitored for 20 minutes (400 nm excitation, 510 nm emissioin). All experiments were performed at 25°C. The results are shown in FIG. 4.

도 4에 나타낸 바와 같이, 재생 버퍼(renaturing buffer) 내 야생형 CaDHN(WT) 존재시 산-변성된 GFP의 리폴딩(refolding)이 40% 정도 증가됨을 확인하였다. 반면, C143A 존재시 산-변성된 GFP의 리폴딩 활성에는 아무런 변화가 없었고, 나아가 CaDHN(WT) 및 DTT를 동시에 포함하는 재생 버퍼를 처리한 경우에도 CaDHN의 리폴딩 활성에는 아무런 변화가 없음을 확인하였다. 한편, CuSO4를 포함하는 재생 버퍼의 경우 GFP의 감소된 형광 때문에 CaDHN의 샤페론 활성 측정이 불가능하였다. 상기 결과를 통해, 야생형 CaDHN의 이량체(dimer) 형태만이 변성된 단백질을 리폴딩하는 샤페론 활성을 나타냄을 확인하였다.As shown in FIG. 4, it was confirmed that refolding of the acid-modified GFP increased by about 40% in the presence of wild-type CaDHN(WT) in a regeneration buffer. On the other hand, in the presence of C143A, there was no change in the refolding activity of the acid-modified GFP, and further, when the regeneration buffer containing CaDHN(WT) and DTT was simultaneously processed, there was no change in the refolding activity of CaDHN. Did. On the other hand, in the case of the regeneration buffer containing CuSO 4 , it was impossible to measure the chaperone activity of CaDHN due to the reduced fluorescence of GFP. Through the above results, it was confirmed that only the dimer form of wild-type CaDHN exhibits chaperone activity to refold the denatured protein.

상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 야생형 CaDHN이 열 변성에 대한 보호 효과를 가질 뿐만 아니라 변성된 단백질의 리폴딩을 가능하게 함을 확인하였다. 즉, 야생형 CaDHN은 단백질 접힘(folding) 과정에 관한 진정한 샤페론 활성을 나타내고, CaDHN의 샤페론 활성에는 분자간 이황화결합을 통한 이합체화가 결정적인 역할을 수행함을 확인하였다.As can be seen from the above results, the present inventors confirmed that wild-type CaDHN not only has a protective effect against thermal denaturation, but also enables refolding of the denatured protein. That is, it was confirmed that the wild-type CaDHN exhibits true chaperone activity with respect to the protein folding process, and the dimerization through intermolecular disulfide bonds plays a decisive role in the chaperone activity of CaDHN.

실시예 5. CaDHN의 금속 이온 결합능 분석Example 5. Analysis of CaDHN metal ion binding capacity

일부 디하이드린 단백질은 금속 촉매 반응에 의해 야기되는 세포 독성 하이드록실 라디칼(cytotoxic hydroxyl radical)에 대한 소거 활성을 갖는 금속 이온 결합능을 나타낸다고 알려져 있다(Hara M et al, J Exp Bot. 2005;56(420):2695-703). 이에, CaDHN(WT) 및 돌연변이 C143A의 금속 결합능 및 이에 따른 ROS 소거 활성을 조사하기 위해, 금속 이온 친화성 크로마토그래피(metal ion affinity chromatography)를 수행하였다. 컬럼에 100mM의 각 금속 이온(Fe3 +, Co2 +, Ni2 +, Cu2+, Zn2 +, Mg2 +, Ca2 + 및 Mn2 +)을 충전시킨 후 약 200μg의 CaDHN(WT) 또는 돌연변이 C143A를 평형 버퍼(20mM Tris-HCl, pH 8.0 및 200mM NaCl; equilibration buffer, EQ)로 평형시킨 컬럼에 로딩하여 금속 결합 활성(metal-binding activity, MBA)을 분석하였다. 평형 버퍼로 컬럼을 충분히 세척하여 결합되지 않은 단백질들을 제거한 후, 결합된 단백질을 100mM EDTA로 용출시켰다. 용출된 단백질을 수집하고, SDS-PAGE를 수행한 뒤 전기영동이 끝난 젤은 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue R-250)로 염색하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.It is known that some dihydrin proteins exhibit the ability to bind metal ions with scavenging activity against cytotoxic hydroxyl radicals caused by metal catalytic reactions (Hara M et al, J Exp Bot. 2005;56( 420):2695-703). Thus, in order to investigate the metal binding capacity of CaDHN(WT) and mutant C143A and thus ROS scavenging activity, metal ion affinity chromatography was performed. After filling the column with 100mM of each metal ion (Fe 3 + , Co 2 + , Ni 2 + , Cu 2+ , Zn 2 + , Mg 2 + , Ca 2 + and Mn 2 + ), about 200 μg of CaDHN (WT ) Or mutant C143A was loaded onto a column equilibrated with an equilibration buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 200 mM NaCl; equilibration buffer, EQ) to analyze metal-binding activity (MBA). After washing the column sufficiently with an equilibration buffer to remove unbound proteins, the bound proteins were eluted with 100 mM EDTA. The eluted protein was collected, SDS-PAGE was performed, and the electrophoretic gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250. The results are shown in FIG. 5.

도 5의 A에 나타낸 바와 같이, CaDHN 및 C143A 모두 Fe3 +, Co2 +, Ni2 +, Cu2 + 및 Zn2+ 이온에 완전히 결합되었지만, Mg2 +, Ca2 + 및 Mn2 + 에는 결합하지 않음을 확인하였다. 또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, Cu2 + 이온을 제외한 7개 금속 이온 모두에서 밴드의 크기 변화가 없음을 확인하였다. 상기 결과를 통해, CaDHN은 Cu2 +에 대한 결합 활성을 가지고 있지만, 이와 같은 Cu2 +에 대한 결합능은 CaDHN의 이합체화와 관련이 없음을 확인하였다.As it is shown in A of Fig 5, and C143A CaDHN all Fe 3 +, Co 2 +, Ni 2 +, Cu 2 + , and Zn 2+ ion has been completely bonded to, Mg + 2, Ca + 2 and Mn + 2 is It was confirmed that it did not bind. Also,, it was confirmed that no change in size of the band from all seven metal ions other than the Cu + 2 ion, as shown in Fig. 5 B. Through the above results, CaDHN confirmed that binding is not related to the dimerization of CaDHN for Cu + 2 such as this has a binding activity to Cu 2 +, but.

실시예 6. CaDHN 유전자 발현 형질전환 효모의 제작Example 6. Preparation of CaDHN gene expression transformed yeast

PCR을 이용하여 증폭한 CaDHN 유전자를 GPD1(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 글리세알데하이드-3-인산 탈수소효소) 프로모터(Euroscarf, Germany) 및 CYC(cytochrome-c-oxidase) 종결자(terminator)가 포함되어 있는 p426GPD 벡터에 연결시켜 효모 발현 벡터를 제작하였다. 클로닝된 플라스미드는 E.coli DH5α를 이용하여 플라스미드 DNA를 증폭한 다음, CYC 종결자(terminator) 프라이머를 이용하여 시퀀싱하였다. 결과 플라스미드를 p426GPD::CaDHN_WT로 명명하였다. The amplified CaDHN gene using PCR contains GPD1 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) promoter (Euroscarf, Germany) and CYC (cytochrome-c-oxidase) terminator. Yeast expression vector was constructed by linking to the p426GPD vector. The cloned plasmid was amplified by plasmid DNA using E.coli DH5α, and then sequenced using a CYC terminator primer. The resulting plasmid was named p426GPD::CaDHN_WT.

Figure 112018116922969-pat00001
Figure 112018116922969-pat00001

그 다음, p426GPD::CaDHN_WT 및 PCR-의존적 선택적 돌연변이 키트(PCR-dependent Site-Directed Mutagenesis kit; New England Biolabs)를 이용하여 CaDHN_C143A의 돌연변이를 유도하고, 상기 C143A 돌연변이 유전자를 벡터 내에 삽입함으로써 효모 발현 벡터 p426GPD::CaDHN_C143A를 제작하였다. 각각의 플라스미드 DNA를 플라스미드 분리 키트 (Nucleogen, Siheung, Korea)를 이용하여 분리하고, 상기 플라스미드를 S. cerevisiae BY4741 균주(Euroscarf)에 형질전환시켰다. 한편, 본 발명에 사용된 균주의 정보를 하기 표 3에 나타내었다.Then, p426GPD::CaDHN_WT and PCR-dependent site-directed mutagenesis kit (New England Biolabs) were used to induce the mutation of CaDHN_C143A and insert the C143A mutant gene into the vector to express the yeast expression vector. p426GPD::CaDHN_C143A was produced. Each plasmid DNA was isolated using a plasmid separation kit (Nucleogen, Siheung, Korea), and the plasmid was transformed into S. cerevisiae BY4741 strain (Euroscarf). Meanwhile, the strain information used in the present invention is shown in Table 3 below.

StrainStrain GenotypeGenotype SourceSource GenbankGenbank
accession numberaccession number E. coli BL21 E. coli BL21 fhuA2fhuA2 [lon] [lon] ompTompT gal (λ DE3) [ gal (λ DE3) [ dcmdcm ] ] ΔhsdSΔhsdS
λ DE3 = λ λ DE3 = λ sBamHIosBamHIo ΔEcoRIΔEcoRI -B int::(lacI::PlacUV5::T7 -B int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1gene1 ) i21) i21
Δnin5Δnin5 NEBNEB CP001509.3CP001509.3 S. cerevisiae BY4741 S. cerevisiae BY4741 MATaMATa his3Δ1his3Δ1 leu2Δ0leu2Δ0 met15Δ0met15Δ0 ura3Δ0ura3Δ0 EuroscarfEuroscarf JRIS00000000JRIS00000000

구체적으로, S. cerevisiae BY4741 세포들을 28℃에서 하룻밤 동안 YPD 브로스(1 % yeast extract, 2 % peptone 및 2 % dextrose)에서 배양 후, 신선한 YPD 브로스에 접종하고, 600nm (A600)에서의 배양물의 광밀도가 약 1.0(1 × 107 cells mL-1)에 도달할 때까지, 교반(180 rpm)과 함께, 4시간 동안 28 ℃에서 인큐베이션 시켰다. 그 뒤, 상기 세포를 PEG/LiCl 방법에 따라 타겟 플라스미드인 p426GPD::CaDHN_WT 및 p426GPD::CaDHN_C143A 플라스미드로 각각 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 아미노산이 없으며, 황산암모늄을 포함하는 0.67% 효모 니트로겐 베이스(Yeast Nitrogen Base), 우라실이 없는 0.192% 효모 합성 드롭아웃 배지 보충물(yeast synthetic dropout medium supplement; Sigma, St. Louis, USA), 2% 글루코스 및 2% 아가를 포함하는 효모 합성 드롭아웃 아가 배지(yeast synthetic dropout agar medium)에 위치시켰다. 샘플을 28℃에서 3일간 인큐베이션 하였다. 양성 콜로니는 우라실이 없는 배지에서 성장하였고, 이어지는 실험에 사용하였다.Specifically, S. cerevisiae BY4741 cells were incubated in YPD broth (1% yeast extract, 2% peptone and 2% dextrose) overnight at 28° C., followed by inoculation into fresh YPD broth and culture at 600 nm (A 600 ). Incubated at 28° C. for 4 hours with stirring (180 rpm) until the light density reached about 1.0 (1×10 7 cells mL -1 ). The cells were then transformed with the target plasmids p426GPD::CaDHN_WT and p426GPD::CaDHN_C143A plasmids according to the PEG/LiCl method, respectively. The transformed cells are free of amino acids and contain 0.67% Yeast Nitrogen Base containing ammonium sulfate, 0.192% Yeast Nitrogen Base without uracil (yeast synthetic dropout medium supplement; Sigma, St. Louis) , USA), 2% glucose and 2% agar was placed in a yeast synthetic dropout agar medium. Samples were incubated at 28°C for 3 days. Positive colonies were grown in uracil-free medium and used in subsequent experiments.

실시예 7. 산화 및 저온 스트레스 내성 실험Example 7. Oxidation and low temperature stress tolerance experiment

돌연변이 CaDHN 단백질 즉, C143A의 발현이 산화 및 저온 스트레스에 대한 형질전환 효모 세포의 내성을 향상시키는지 여부를 확인하기 위하여, 중간-로그기(A600=2.5) 효모 세포를 신선한 YPD 브로스로 10-9배 단계희석하였다. 그 후, 과산화수소를 포함하는 YPD 아가플레이트에 로딩시킨 뒤 각각 40℃(Heat shock)에서 6일간 인큐베이션, 15℃(Chilling)에서 10일간 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.In order to confirm the mutations CaDHN protein, that is, whether an expression of C143A improve transgenic resistance in yeast cells to oxidative and low temperature stress, medium-10 logs group (A 600 = 2.5) yeast cells with fresh YPD broth - It was diluted 9 times. Then, after loading on a YPD agar plate containing hydrogen peroxide, they were incubated at 40°C (Heat shock) for 6 days, and at 15°C (Chilling) for 10 days. The results are shown in FIGS. 6 and 7.

도 6에 나타낸 바와 같이, 형질전환 효모 세포가 장시간 및 단시간 동안 과산화수소(H2O2)에 노출된 경우, 두 가지 형질전환 효모 세포(WT, C143A) 모두 빈 벡터만 있는 세포(EV)보다 내성이 있었고, 특히 C143A의 경우 WT에 비해 산화 스트레스에 대한 내성이 현저히 향상됨을 확인하였다.As shown in FIG. 6, when the transformed yeast cells were exposed to hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) for a long time and a short time, both transformed yeast cells (WT, C143A) were more resistant than the empty vector-only cells (EV). In particular, it was confirmed that the resistance to oxidative stress was significantly improved in the case of C143A compared to WT.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 고온 스트레스에 대한 내성은 CaDHN(WT)가 C143A보다 높고, 저온 스트레스에 대한 내성은 C143A가 CaDHN(WT)보다 높음을 확인하였다. In addition, as shown in FIG. 7, the resistance to high temperature stress was higher in CaDHN(WT) than C143A, and the resistance to low temperature stress was higher in C143A than CaDHN(WT).

한편, 다양한 냉각 조건 하에서의 저온 스트레스 내성을 실험하기 위하여 중간-로그기(A600=2.5) 형질전환 효모 세포를 신선한 YPD 브로스로 10-9배 단계희석한 후, 과산화수소를 포함하는 YPD 아가플레이트에 로딩시킨 뒤 각각 다음과 같은 조건으로 처리하였다: ⅰ) 15℃(Chilling)에서 11일간 인큐베이션, ⅱ) 15℃(Chilling)에서 10일간 인큐베이션, ⅲ) 4℃에서 7일간 인큐베이션 후 28℃에서 3일간 인큐베이션. 그 결과를 도 8에 나타내었다. Meanwhile, in order to test low temperature stress resistance under various cooling conditions, medium-log phase (A 600 =2.5) transformed yeast cells were diluted 10 -9 times with fresh YPD broth, and then loaded onto a YPD agar plate containing hydrogen peroxide. After treatment, each was treated under the following conditions: iv) incubated at 15°C (Chilling) for 11 days, ii) incubated at 15°C (Chilling) for 10 days, iv) incubated at 4°C for 7 days, and then incubated at 28°C for 3 days. . The results are shown in FIG. 8.

도 8에 나타낸 바와 같이, 다양한 냉각 조건 하에서 실험한 결과, 모든 처리조건에서 C143A의 저온 스트레스에 대한 내성은 CaDHN(WT)보다 현저히 향상됨을 확인하였다.As shown in FIG. 8, as a result of experiments under various cooling conditions, it was confirmed that the resistance to low temperature stress of C143A under all treatment conditions was significantly improved over that of CaDHN(WT).

실시예 8. 금속 이온 항상성 실험Example 8. Metal ion homeostasis experiment

중간-로그기(A600=2.5)까지 YPD 브로스에서 성장한 형질전환 효모 세포를 1시간 동안 교반(180 rpm)과 함께, 20 및 25mM 과산화수소(H2O2), 100mM 염화 아연(ZnCl2), 20mM 황산 구리(CuSO4), 80mM 염화 코발트(CoCl2), 80mM 황산 니켈(CoSO4), 80mM 염화 철(FeCl2), 80mM 염화 망간(manganese chloride), 250mM 염화 칼슘(CaCl2) 및 250 mM 염화 마그네슘(MgCl2)에 노출시켰다. 그 뒤 신선한 YPD 브로스로 10-4배 단계희석하였다. 그 다음, 희석된 용액 5㎕를 YPD 아가(2% 아가+YPD) 플레이트에 로딩시킨 뒤, 28℃에서 3일간 인큐베이션한 후, 촬영하였다. 한편, 저온 스트레스를 모니터하기 위하여, 동일한 중간-로그기(A600=2.5) 형질전환 효모 세포를 신선한 YPD 브로스로 10-9배 단계희석하고, 과산화수소를 포함하지 않는 YPD 아가플레이트에 로딩시킨 뒤 각각 40℃에서 6일간 인큐베이션, 15℃에서 10일간 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.Transduced yeast cells grown in YPD broth to mid-log phase (A 600 =2.5) with stirring (180 rpm) for 1 hour, 20 and 25 mM hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), 100 mM zinc chloride (ZnCl 2 ), 20mM copper sulfate (CuSO 4 ), 80mM cobalt chloride (CoCl 2 ), 80mM nickel sulfate (CoSO 4 ), 80mM iron chloride (FeCl 2 ), 80mM manganese chloride, 250mM calcium chloride (CaCl 2 ) and 250mM Magnesium chloride (MgCl 2 ). It was then diluted 10 -4 fold steps with fresh YPD broth. Then, 5 μl of the diluted solution was loaded onto a YPD agar (2% agar+YPD) plate, followed by incubation at 28° C. for 3 days, and then photographed. On the other hand, in order to monitor the low temperature stress, the same medium-log phase (A 600 =2.5) transformed yeast cells were diluted 10 -9 fold step with fresh YPD broth, loaded into YPD agar plates not containing hydrogen peroxide, respectively. Incubation was performed at 40°C for 6 days, and at 15°C for 10 days. The results are shown in FIG. 9.

도 9에 나타낸 바와 같이, Co2 +, Ni2 +, Fe3 + 및 Zn2 + 이온을 포함한 다양한 금속 이온에 의해 유도된 스트레스에 대한 내성은 CaDHN(WT) 발현 세포가 EV 세포의 금속 이온 내성에 비해 우수하였다. 반면, Mg2 +, Ca2 + 및 Mn2 +을 처리한 경우는 CaDHN(WT) 발현 세포와 EV 세포의 금속 이온 내성이 유사하게 나타나 이러한 결과는 상기 실시예 5의 in vitro 실험 결과와 일치함을 확인하였다. 특이하게도 Cu2 + 스트레스 하에서는 C143A 세포가 CaDHN(WT) 세포보다 스트레스 내성을 나타내었다. 상기 결과를 통해, CaDHN에 의한 금속 이온 항상성은 Cu2 +를 제외하고는 CaDHN의 이합체화와 무관함을 다시 한 번 확인하였다.As shown in FIG. 9, the resistance to stress induced by various metal ions, including Co 2 + , Ni 2 + , Fe 3 + and Zn 2 + ions, is that CaDHN(WT) expressing cells are resistant to metal ions of EV cells. It was excellent compared to. On the other hand, when treated with Mg 2 + , Ca 2 + and Mn 2 + , the metal ion resistance of CaDHN(WT) expressing cells and EV cells is similar, and these results are consistent with those of the in vitro experiment of Example 5 above. Was confirmed. Specifically, under Cu 2 + stress, C143A cells showed more stress tolerance than CaDHN(WT) cells. Through the above results, the metal ion homeostasis by CaDHN was identified and is once again that regardless of the dimerization of CaDHN except for Cu + 2.

본 발명은 내재적 비정형 단백질로 알려진 디하이드린 단백질의 일종인 CaDHN에 돌연변이를 유도하고, 상기 돌연변이 CaDHN(C143A)가 효모 내에서 발현되는 경우 효모의 비생물적 스트레스에 대한 내성이 현저하게 향상됨을 확인한 것에 가장 큰 의미가 있다. The present invention induces a mutation in CaDHN, a type of dihydrin protein known as an intrinsic atypical protein, and confirms that when the mutant CaDHN (C143A) is expressed in yeast, resistance to abiotic stress of yeast is significantly improved. It has the greatest significance.

구체적으로, 본 발명자들은 CaDHN은 분자간 이황화결합에 의한 이합체화(dimerization)에 중요한 역할을 하는 독특한 단일 시스테인 잔기를 가지고 있으며, CaDHN의 이합체화는 다른 디하이드린 단백질과 달리 금속 이온과는 무관함을 최초로 규명하였다. 나아가, 본 발명자들은 이와 같은 CaDHN의 단일 시스테인 잔기에 주목하여, 시스테인을 다른 아미노산(알라닌)으로 치환한 돌연변이를 유도하고, SDS-PAGE, 산화 및 저온 스트레스 내성, 금속 이온 항상성 등의 실험을 수행함으로써, CaDHN의 구조적 변화를 통해 생물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 동시에, 야생형 CaDHN의 경우 CaDHN 단백질의 독특한 단일 시스테인 잔기가 매개하는 이황화결합에 의해 CaDHN이 이량체로 존재하며, 돌연변이 C143A에 비해 고온 스트레스 내성 및 단백질 항상성이 우수함을 규명하였다.Specifically, the present inventors found that CaDHN has a unique single cysteine residue that plays an important role in dimerization by intermolecular disulfide bonds, and that dimerization of CaDHN is independent of metal ions unlike other dihydrin proteins. It was first identified. Furthermore, the present inventors pay attention to such a single cysteine residue of CaDHN to induce a mutation in which cysteine is substituted with another amino acid (alanine), and perform experiments such as SDS-PAGE, oxidation and cold stress resistance, and metal ion homeostasis. , It was confirmed that the structural resistance of CaDHN can significantly improve the resistance of an organism to abiotic stress. At the same time, in the case of wild-type CaDHN, it was found that CaDHN exists as a dimer by a disulfide bond mediated by a unique single cysteine residue of the CaDHN protein, and that it has excellent high temperature stress resistance and protein homeostasis compared to the mutant C143A.

따라서, 본 발명은 내재적 비정형 단백질(intrinsically disordered protein)인 CaDHN의 이합체화를 조절함으로써 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 현저하게 증가시켜 환경 스트레스 저항성 작물 개발, 분자생물학 및 유전자 조작기법을 이용한 미생물 및 식물체의 형질 개선에 관한 기초 연구를 비롯한 식물생명공학 분야 전반에 널리 활용될 수 있다.Accordingly, the present invention significantly increases resistance to abiotic stress by controlling dimerization of CaDHN, an intrinsically disordered protein, to develop environmental stress-resistant crops, microorganisms and plants using molecular biology and genetic manipulation techniques It can be widely used in the field of plant biotechnology, including basic research on the improvement of traits.

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Mutated dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof <130> KOPRI1-2 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated dehydrin C143A from Cerastium arcticum <400> 1 Met Ser Asn Leu His Pro Thr Gly Gly Glu Thr Glu Thr Thr Asn Thr 1 5 10 15 Asp Arg Gly Leu Phe Gly Phe Gly Lys Lys Thr Glu Thr Pro Val Ala 20 25 30 Thr Pro Thr Glu Pro Pro His Lys Pro Thr Leu Thr Glu Lys Leu His 35 40 45 Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Val Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Ala Lys Ile Arg Lys Pro Arg Arg Lys Gly Ile Ala Gly Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Tyr Tyr His Gln Glu Pro Asn Lys His 100 105 110 Ala Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly 115 120 125 Gly His Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asp His Ala His 130 135 140 Gln Glu Gln Asn Lys His Ala Ser Glu Met Gly Ala Ala Glu Lys Ile 145 150 155 160 Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly Gln Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Thr Gly Asp His Tyr His Arg Asp Gln Asn Lys His Thr Ala Ala Gly 180 185 190 Asn Thr His Tyr Pro Glu Gly Asn Lys Gly Phe Val Gly Asn Val Lys 195 200 205 Asp Lys Leu Pro Gly Asn Gln Thr Asp Val Asn His His Gln Gln Gln 210 215 220 Gln Gln His Pro Ala Val His Val Ser Gln Gln Ala Val Gln Glu Pro 225 230 235 240 His His Glu Lys Lys Gly Leu Leu Asp Asn Ile Lys Asp Lys Met Pro 245 250 255 Gly Gly His Lys Asp Asp Ala Asp Lys Ala His Lys Gly Tyr 260 265 270 <210> 2 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence encoding mutated dehydrin C143A from Cerastium arcticum <400> 2 atgtcgaact tacacccaac cggaggcgaa accgagacca ctaatactga tagaggcctg 60 tttggcttcg gtaagaagac ggaaaccccc gtcgccaccc cgactgagcc accacacaag 120 cctactctca cggagaagct tcaccgctcg ggcagtagta gctctagctc gtcagatgag 180 gaggtaatag aaaatggtgc gaagattagg aagccgagga ggaagggaat agcagggaaa 240 atcaaggaca agcttccggg tggtcacaag gatgaatacg agactgcgac tcctattgct 300 gcgggtgagt actatcacca ggagccgaac aagcacgctt cagacagggg agtagcggag 360 aagatcaagg aaaagttacc aggcggtcac aaggatgaat acgggacagc gcctaccggt 420 gaccacgccc accaggagca gaacaagcac gcttctgaga tgggtgcggc ggagaaaatc 480 aaggacaagt tgccaggcgg acagaaggat gaatacggga ctgcgcctac tggcgaccac 540 taccaccggg accagaacaa gcatactgcg gcaggaaaca cgcattaccc cgagggaaac 600 aaggggtttg ttggcaatgt taaggataaa ttgccgggaa atcagacaga cgtgaaccat 660 caccagcagc agcaacagca cccggctgtt catgtttcac aacaggcggt ccaggagccg 720 catcatgaga agaaagggct cttagacaac attaaggaca agatgcccgg cggccacaag 780 gatgatgctg ataaagctca caagggttac taa 813 <210> 3 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Dehydrin CaDHN from Cerastium arcticum <400> 3 Met Ser Asn Leu His Pro Thr Gly Gly Glu Thr Glu Thr Thr Asn Thr 1 5 10 15 Asp Arg Gly Leu Phe Gly Phe Gly Lys Lys Thr Glu Thr Pro Val Ala 20 25 30 Thr Pro Thr Glu Pro Pro His Lys Pro Thr Leu Thr Glu Lys Leu His 35 40 45 Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Val Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Ala Lys Ile Arg Lys Pro Arg Arg Lys Gly Ile Ala Gly Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Tyr Tyr His Gln Glu Pro Asn Lys His 100 105 110 Ala Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly 115 120 125 Gly His Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asp His Cys His 130 135 140 Gln Glu Gln Asn Lys His Ala Ser Glu Met Gly Ala Ala Glu Lys Ile 145 150 155 160 Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly Gln Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Thr Gly Asp His Tyr His Arg Asp Gln Asn Lys His Thr Ala Ala Gly 180 185 190 Asn Thr His Tyr Pro Glu Gly Asn Lys Gly Phe Val Gly Asn Val Lys 195 200 205 Asp Lys Leu Pro Gly Asn Gln Thr Asp Val Asn His His Gln Gln Gln 210 215 220 Gln Gln His Pro Ala Val His Val Ser Gln Gln Ala Val Gln Glu Pro 225 230 235 240 His His Glu Lys Lys Gly Leu Leu Asp Asn Ile Lys Asp Lys Met Pro 245 250 255 Gly Gly His Lys Asp Asp Ala Asp Lys Ala His Lys Gly Tyr 260 265 270 <210> 4 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence encoding dehydrin CaDHN from Cerastium arcticum <400> 4 atgtcgaact tacacccaac cggaggcgaa accgagacca ctaatactga tagaggcctg 60 tttggcttcg gtaagaagac ggaaaccccc gtcgccaccc cgactgagcc accacacaag 120 cctactctca cggagaagct tcaccgctcg ggcagtagta gctctagctc gtcagatgag 180 gaggtaatag aaaatggtgc gaagattagg aagccgagga ggaagggaat agcagggaaa 240 atcaaggaca agcttccggg tggtcacaag gatgaatacg agactgcgac tcctattgct 300 gcgggtgagt actatcacca ggagccgaac aagcacgctt cagacagggg agtagcggag 360 aagatcaagg aaaagttacc aggcggtcac aaggatgaat acgggacagc gcctaccggt 420 gaccactgcc accaggagca gaacaagcac gcttctgaga tgggtgcggc ggagaaaatc 480 aaggacaagt tgccaggcgg acagaaggat gaatacggga ctgcgcctac tggcgaccac 540 taccaccggg accagaacaa gcatactgcg gcaggaaaca cgcattaccc cgagggaaac 600 aaggggtttg ttggcaatgt taaggataaa ttgccgggaa atcagacaga cgtgaaccat 660 caccagcagc 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<120> Mutated dehydrin from the Arctic mouse-ear chickweed Cerastium arcticum and use thereof <130> KOPRI1-2 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated dehydrin C143A from Cerastium arcticum <400> 1 Met Ser Asn Leu His Pro Thr Gly Gly Glu Thr Glu Thr Thr Asn Thr 1 5 10 15 Asp Arg Gly Leu Phe Gly Phe Gly Lys Lys Thr Glu Thr Pro Val Ala 20 25 30 Thr Pro Thr Glu Pro Pro His Lys Pro Thr Leu Thr Glu Lys Leu His 35 40 45 Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu Val Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Ala Lys Ile Arg Lys Pro Arg Arg Lys Gly Ile Ala Gly Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Tyr Tyr His Gln Glu Pro Asn Lys His 100 105 110 Ala Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly 115 120 125 Gly His Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asp His Ala His 130 135 140 Gln Glu Gln Asn Lys His Ala Ser Glu Met Gly Ala Ala Glu Lys Ile 145 150 155 160 Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly Gln Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Thr Gly Asp His Tyr His Arg Asp Gln Asn Lys His Thr Ala Ala Gly 180 185 190 Asn Thr His Tyr Pro Glu Gly Asn Lys Gly Phe Val Gly Asn Val Lys 195 200 205 Asp Lys Leu Pro Gly Asn Gln Thr Asp Val Asn His His Gln Gln Gln 210 215 220 Gln Gln His Pro Ala Val His Val Ser Gln Gln Ala Val Gln Glu Pro 225 230 235 240 His His Glu Lys Lys Gly Leu Leu Asp Asn Ile Lys Asp Lys Met Pro 245 250 255 Gly Gly His Lys Asp Asp Ala Asp Lys Ala His Lys Gly Tyr 260 265 270 <210> 2 <211> 813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> the sequence encoding mutated dehydrin C143A from Cerastium arcticum <400> 2 atgtcgaact tacacccaac cggaggcgaa accgagacca ctaatactga tagaggcctg 60 tttggcttcg gtaagaagac ggaaaccccc gtcgccaccc cgactgagcc accacacaag 120 cctactctca cggagaagct tcaccgctcg ggcagtagta gctctagctc gtcagatgag 180 gaggtaatag aaaatggtgc gaagattagg aagccgagga ggaagggaat agcagggaaa 240 atcaaggaca agcttccggg tggtcacaag 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Ser Ser Ser Asp Glu Glu Val Ile Glu 50 55 60 Asn Gly Ala Lys Ile Arg Lys Pro Arg Arg Lys Gly Ile Ala Gly Lys 65 70 75 80 Ile Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly His Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Ala 85 90 95 Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Tyr Tyr His Gln Glu Pro Asn Lys His 100 105 110 Ala Ser Asp Arg Gly Val Ala Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly 115 120 125 Gly His Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Asp His Cys His 130 135 140 Gln Glu Gln Asn Lys His Ala Ser Glu Met Gly Ala Ala Glu Lys Ile 145 150 155 160 Lys Asp Lys Leu Pro Gly Gly Gln Lys Asp Glu Tyr Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Thr Gly Asp His Tyr His Arg Asp Gln Asn Lys His Thr Ala Ala Gly 180 185 190 Asn Thr His Tyr Pro Glu Gly Asn Lys Gly Phe Val Gly Asn Val Lys 195 200 205 Asp Lys Leu Pro Gly Asn Gln Thr Asp Val Asn His His Gln Gln Gln 210 215 220 Gln Gln His Pro Ala Val His Val Ser Gln Gln Ala Val Gln Glu Pro 225 230 235 240 His His Glu Lys Lys Gly Leu Leu Asp Asn Ile Lys Asp Lys Met Pro 245 250 255 Gly Gly His Lys Asp Asp Ala Asp Lys 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Claims (13)

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린 펩타이드.
A mutant dihydrin peptide derived from Cerastium arcticum consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
제1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
A polynucleotide encoding the peptide of claim 1.
제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
According to claim 2, The polynucleotide is characterized in that consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, polynucleotide.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
Recombinant vector comprising the polynucleotide of claim 2.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
A host cell having enhanced abiotic stress resistance transformed with the recombinant vector of claim 4.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 동물세포, 식물세포, 진균, 세균 및 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
The host cell of claim 5, wherein the host cell is selected from the group consisting of animal cells, plant cells, fungi, bacteria, and viruses.
제6항에 있어서, 상기 진균은 효모인 것을 특징으로 하는, 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
The host cell of claim 6, wherein the fungus is yeast.
제1항의 디하이드린 펩타이드 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
A composition for promoting abiotic stress resistance, comprising the dihydrin peptide of claim 1 or the polynucleotide of claim 2.
제8항에 있어서, 상기 스트레스는 수분, 염분, 저온, 삼투압, 산화, 환원, 알코올 및 기아(starvation)로 이루어지는 군으로부터 선택된 비생물적 스트레스인 것을 특징으로 하는, 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
The composition of claim 8, wherein the stress is abiotic stress selected from the group consisting of moisture, salt, low temperature, osmotic pressure, oxidation, reduction, alcohol, and starvation. .
제2항의 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진방법.
A method for promoting abiotic stress resistance, comprising introducing the polynucleotide of claim 2 into a host cell.
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 고온 스트레스 내성 증진용 조성물로서,
상기 고온 스트레스 내성은 분자 샤페론 활성에 의해 증진되며;
대조군으로서 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 돌연변이 디하이드린보다 고온 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 것을 특징으로 하는,
고온 스트레스 내성 증진용 조성물.
A dihydrin peptide derived from Arcastum arcticum consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or as a composition for promoting high temperature stress resistance comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 encoding the peptide,
The high temperature stress resistance is enhanced by molecular chaperone activity;
Characterized in that it enhances resistance to high-temperature stress than a mutant dihydrin derived from the arctic point nadonum ( Cerastium arcticum ) consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 as a control,
A composition for enhancing high temperature stress resistance.
서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 북극점나도나물(Cerastium arcticum) 유래 디하이드린 펩타이드; 또는 상기 펩타이드를 코딩하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단백질 항상성 증진용 조성물.
A dihydrin peptide derived from Cerastium arcticum consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; Or a composition for enhancing protein homeostasis comprising a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 encoding the peptide.
제12항에 있어서, 상기 단백질 항상성은 분자 샤페론 활성에 의한 것임을 특징으로 하는, 조성물.13. The composition of claim 12, wherein the protein homeostasis is due to molecular chaperone activity.
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